JPH07132077A - 固相合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 モノマー（ヌクレオチド又はアミノ酸）を固
相上の被反応物と反応させる際に、該モノマーと反応す
べき被反応物（モノマー又はポリマー）を容易に選択で
き、且つ生成したポリマーないし中間生成物の、固相に
固定されていない末端の選択が容易な固相合成装置を提
供する。 【構成】 複数の孔を有する有孔部材からなる第１の固
相と、該有孔部材の孔中に配置された第２の固相（ビー
ズ状担体）８とからなる固相反応部１を含み、更に、有
孔部材の複数の孔のうち、所定の数の孔を選択的に塞ぐ
ための閉塞手段９を有する固相合成装置。上記第１の固
相は、上記第２の固相８がその孔５ａ中に配置された第
１の有孔部材５と、該有孔部材５の両側に配置され、且
つ有孔部材５と同数の孔を有する第２の有孔部材６およ
び第３の有孔部材４とからなり；該第２および第３の有
孔部材の孔６ａおよび４ａの大きさは、第１の有孔部材
の孔５ａより小さく設定されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリヌクレオチド、ポ
リペプチド（いずれも「オリゴマー」を包含する趣旨で
用いる。）等の固相合成に好適に使用可能な固相合成装
置に関し、より具体的には、複数の孔を有する有孔部材
からなる第１の固相と、該有孔部材の孔中に配置された
第２の固相とからなる固相反応部を含むことにより、い
わゆるマルチ合成（一回の合成操作で複数種類の生成物
を合成すること）を可能とした固相合成装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】１９６３年Merrifieldによって開発され
た固相合成法は、一連の合成操作を各合成ステップの機
械的な繰り返しで行うことができ、過剰の試薬等の不要
物を簡単な洗浄操作で除去することができ、しかも機械
による自動合成法への応用が容易であるため、ポリヌク
レオチド、ポリペプチド等の固相合成に広く用いられて
いる（例えば、丹羽峰雄「ＤＮＡの化学合成法」１８〜
４８頁、廣川書店、１９９２年；日本生化学会編、新生
化学実験講座「タンパク質VI；合成および発現」１８〜
４４頁、東京化学同人、１９９２年を参照）。

【０００３】近年、遺伝子（ＤＮＡ）の発現部位や、抗
原（ペプチド）の発現部位の探索研究（例えば、エピト
ープマッピング、多種類抗原用ペプチドの調製、生理活
性ペプチドの構造活性相関の研究）等を容易とする観点
から、固相合成を用いて一回の合成操作で複数種類の生
成物を合成する所謂「マルチ合成」法が注目を集めてい
る。このようなマルチ合成技術としては、袋の中に樹脂
を詰めてアミノ酸の縮合と最終保護以外の操作はすべて
同一の反応容器内で行うティーバッグ法；９６ウェル−
マイクロタイター プレー トに対応する９６本のポリエチ
レンピン上でペプチド鎖の構築と最終脱保護を行うリッ
プスティック法；マイクロタイター プレー ト内で反応を
行う方法が知られている（ペプチド合成に関して、前掲
「タンパク質VI；合成および発現」第２０頁）。

【０００４】このようなマルチ合成技術の一つとして、
最近、光リソグラフィーを応用し固相担体（ガラス）平
面上の特定の位置に、アミノ酸や核酸塩基を任意の配列
に同時並列的に重合させていく方法が提案されてい
る（”Light-Directed, Spatially Addressable Parall
el Chemical Synthesis ”, Stephen P.A.Fodor, et a
l.,Science, 251 , 767-773, 1991 参照；以下この方法
を「ＬＤ−ＳＡＣＰＳ」と略す）。このＬＤ−ＳＡＣＰ
Ｓにおいては、アミノ酸や核酸塩基の重合端を光によっ
て重合能が活性化されるようにしておき、光リソグラフ
ィーの方法を用いて支持担体（ガラス）の微細な特定の
領域のみに光を照射することで、所望の配列を有する生
体高分子（この場合には、ポリヌクレオチド又はポリペ
プチド）を固相担体平面上に並列に配置させようとして
いる。

【０００５】現在、いわゆる“ＤＮＡ Ｃｈｉｐ”（基
板上に配置された、既知の配列を有する短いＤＮＡ断片
の集合）を作成するためにこの方法が用いられており、
８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを６５, ５３６種類平面
上に配置することに成功している（“Will‘DNA Chip’
Speed Genome Initiative ？”, Marcia Barinaga, Sci
ence, 251 , 1489, 1991）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た従来のマルチ合成技術においては、ある１種類のモノ
マー（ヌクレオチド、又はアミノ酸）を固相上にある程
度構築された特定のポリマーと反応させる際において、
該モノマーと反応すべき所望のポリマーを選択すること
が、必ずしも容易ではなかった。

【０００７】また、従来のマルチ合成技術においては、
ポリヌクレオチドないしポリペプチドの伸張反応の方向
が一方に限られてしまうという不都合があった。より具
体的には、例えば上記したＬＤ−ＳＡＣＰＳにおいて
は、ポリヌクレオチドの化学合成のステップが従来のホ
スホアミダイト法に依存しており、化学合成ではポリヌ
クレオチドを３′→５′方向に行う方法しかないので、
固相担体平面上に３′端が固定されてしまっていた。従
って、固定されていない３´端を利用する反応が必要な
場合（例えば、後述するSolid-Phase Minisequencing
（以下「ＳＰＭ」という）に用いる酵素的重合反応にお
いては、重合の開始点となる固定されていない３′端が
必要となる）には、上記ＬＤ−ＳＡＣＰＳによる「ＤＮ
Ａ Ｃｈｉｐ」は不適当であった。

【０００８】したがって本発明の目的は、あるモノマー
を固相上の被反応物と反応させる際に、該モノマーと反
応すべき被反応物を容易に選択することが可能な固相合
成装置を提供することにある。

【０００９】本発明の他の目的は、生成したポリマーな
いし中間生成物の、固相に固定されていない末端の選択
が容易な固相合成装置を提供することにある。

【００１０】本発明の更に他の目的は、生成したポリマ
ーないし中間生成物の精製が容易な固相合成装置を提供
することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、複数の孔を有する有孔部材からなる第１の固相と、
該複数の孔中に配置された第２の固相とを固相合成用の
担体として用いることが、上記目的の達成に極めて効果
的であることを見出した。

【００１２】本発明の固相合成装置は上記知見に基づく
ものであり、より詳しくは、複数の孔を有する有孔部材
からなる第１の固相と、該有孔部材の孔中に配置された
第２の固相とからなる固相反応部を含むことを特徴とす
るものである。

【００１３】本発明の固相合成装置においては、前記第
１の固相は、前記第２の固相をその孔中に含む第１の有
孔部材と、該第１の有孔部材を挟んで両側に配置された
第２および第３の有孔部材とからなり；該第２および第
３の有孔部材は第１の有孔部材と同数の孔を有し、且
つ、第２および第３の有孔部材の孔の大きさが、第１の
有孔部材の孔より小さいことが、第２の固相を第１の固
相中に容易に保持可能な点から好ましい。

【００１４】本発明の固相合成装置は、前記有孔部材の
複数の孔のうち、所定の数の孔を選択的に塞ぐための閉
塞手段を更に有することが、ポリマーのマルチ合成を容
易とする点から好ましい。

【００１５】本発明の固相合成装置においては、前記閉
塞手段は球状の部材からなることが、前記有孔部材の所
望の数の孔を簡便且つ可逆的に閉塞可能な点から好まし
い。

【００１６】本発明の固相合成装置においては、前記第
１の固相の外側に、更に第４の有孔部材が配置され、該
第４の有孔部材は第１の有孔部材と同数の孔を有し、且
つ、該第４の有孔部材の孔は、その外側に前記球状部材
を通過させることなく受容可能なテーパー形状を有する
ことが、反応部における溶媒の流れの方向に応じて、前
記有孔部材の所望の数の孔を可逆的に閉塞可能な点から
好ましい。

【００１７】

【作用】本発明の固相合成装置においては、複数の孔を
有する有孔部材からなる第１の固相と、該複数の孔中に
配置された第２の固相とを固相合成用の担体として用い
ているため、あるモノマー（ヌクレオチド、アミノ酸
等）を固相上の被反応物（モノマー又は中間生成物たる
ポリマー）と反応させる際に、上記モノマーが反応すべ
き孔（の位置および／又は数）を容易に選択することが
でき、したがって該モノマーが反応すべき所望の被反応
物が固定された固相を容易に選択することできる。

【００１８】更に、本発明の固相合成装置においては、
例えば、第１の固相上でポリマー（ないし中間生成物）
を生成させ、該ポリマーの他方の端を必要に応じて第２
の固相と結合ないし脱離させるこができる。更に、必要
に応じて該ポリマーと第１の固相とも結合ないし脱離さ
せることができる。したがって、上記ポリマーと第１の
固相および／又は第２の固相との結合および／又は脱離
を組合わせることにより、固相に固定されていないポリ
マーの末端が容易に選択できる。

【００１９】更に、本発明の固相合成装置においては、
上記したポリマーと第１の固相ないし第２の固相との結
合／脱離を組合わせることにより、生成したポリマーな
いし中間生成物が（例えば洗浄操作により）容易に精製
できる。

【００２０】

【実施例】

（固相合成装置）図１は、本発明の一実施例に用いる反
応槽（固相反応部）の構成の一例を示す模式斜視図およ
び模式断面図であり、図２は、本発明の固相合成装置の
一実施例を示す模式図である。

【００２１】図１を参照して、この実施例において反応
槽１は、内部にテーパ状の空洞を有する第１のプレート
保持部材２と、該プレート保持部材２上に配置された複
数のプレート（有孔部材）３〜６と、該プレート３〜６
上に配置され、且つ内部にテーパ状の空洞を有する第２
のプレート保持部材７とからなる。複数の孔５ａを有す
るプレート５（第１の固相）内の孔５ａ中には、ビーズ
８からなる所望の数（１以上）の第２の固相が配置され
ている。ビーズ８は、必要に応じて、磁性を有する磁性
ビーズであってもよい。

【００２２】（反応槽）上記プレート３〜６は、第２の
プレート保持部材７側から、プレート３、４、５および
６の順に配置されている。これらのうち、プレート３
（プレートＡ；第４の有孔部材）は、内径にテーパーを
有する空洞３ａを有しており、且つ、個々の空洞３ａを
必要に応じて塞ぐ機能を有するビーズ（閉塞手段）９
を、このプレート３ａ内の空洞に保持可能な構造を有し
ている。後述するようなビーズリザーバー６１〜６４の
操作によるオリゴヌクレオチド配列のコントロールを容
易とする点からは、プレート３の空洞３ａの大きさは、
閉塞手段たるビーズ９が１個入る（２個以上は入らな
い）程度であることが好ましい。

【００２３】一方、プレート４（プレートＢ；第３の有
孔部材）およびプレート６（プレートＤ；第２の有孔部
材）は、その内径４ａおよび６ａはプレート５（第１の
有孔部材）内に収納されたオリゴヌクレオチド合成用ビ
ーズ担体８の外径よりも小さく設定され、プレート５内
に該ビーズ担体８が保持可能なように構成されている。
また、プレート５（プレートＣ）は、その空洞５ａ内で
オリゴヌクレオチドの合成および固定を行うためのプレ
ートである。ビーズ担体８上で生成させたオリゴヌクレ
オチドの他方の端をプレート５内の管壁に容易に固定可
能な点からは、プレート５内の管壁は、例えばMercapto
propyltrimethoxysiane 等のイオウ官能基を含有する処
理剤で処理されていることが好ましい。

【００２４】上述したように、第２の固相は球状ないし
ビーズ状の形態を有することが、該固相の移送ないし保
管が容易な点から好ましい。このような態様において
は、ビーズ状担体８のプレート５中での保持が容易な点
からは、該ビーズ状担体８の平均粒径（相対比）を１０
とした場合、プレート５の孔５ａの大きさ（直径）は１
８〜３０（更には２２〜２５）程度であることが好まし
く、プレート４（ないしプレート６）の孔４ａ（６ａ）
の大きさは９〜５程度であることが好ましく、ビーズ９
（閉塞手段）の平均粒径は１４〜２０（更には１６〜１
７．５）程度であることが好ましい。

【００２５】プレート５の孔５ａの実際の大きさは特に
限定されないが、合成反応の効率および多種類のポリマ
ー（オリゴマーを包含する趣旨で用いる）の合成を可能
とする点からは、孔５ａの直径は６〜２５μｍ程度であ
ることが好ましい。孔５ａの長さ（プレート５の厚さ）
は特に限定されないが、合成反応の効率の点からは、孔
５ａの長さは０．４〜２ｍｍ程度であることが好まし
い。孔５ａの密度は、特に限定されないが、合成反応の
効率の点からは、１ｃｍ² 当たり１０² 〜１０⁶個程度
（更には１０⁵ 〜１０⁶ 個程度）であることが好まし
い。プレート５の大きさ（直径）も特に制限されない
が、合成反応の効率と固相合成装置全体のサイズとのバ
ランスの点からは、２〜８ｃｍ程度（更には２．５〜４
ｃｍ程度）であることが好ましい。

【００２６】プレート５の材質は、固相合成反応用の固
相として使用可能である限り特に制限されず、ガラス等
の無機物、プラスチック（例えばポリスチレン）等の有
機物、あるいは有機物／無機物の複合材料のいずれも可
能である。寸法精度および加工の容易性の点からは、ガ
ラスが特に好ましく用いられる。プレート３、４ないし
６の材質としては、プレート５と同様のものを用いるこ
とが可能である。

【００２７】より具体的には例えば、プレート５（およ
び／又はプレート３、４、６）としては、内径６〜３０
μｍ程度のガラスパイプ多数を束ねた板状構造を有する
いわゆる「キャピラリープレート」（このキャピラリー
プレートに関しては、「キャピラリープレートの原理と
その応用（技術資料）、１９９２年６月、浜松ホトニク
ス株式会社発行」を参照することができる）が好ましく
用いられる。

【００２８】一方、上記閉塞手段たるビーズ９の材質
は、閉塞手段として使用可能である限り特に制限され
ず、ガラス等の無機物、プラスチック（例えばポリスチ
レン）等の有機物、あるいは有機物／無機物の複合材料
のいずれも可能である。寸法精度および加工の容易性の
点からは、ガラスが特に好ましく用いられる。

【００２９】（他の構成）上述した反応槽１を含む固相
合成装置の構成の一例を模式的に図２に示す。図２を参
照して、この固相合成装置は、以下の構成を有してい
る。

【００３０】バルブ２１（バルブNo.1）：反応試薬およ
び反応基質を切り替えるための８流路選択バルブ； バルブ２２（バルブNo.2）：反応試薬および反応基質を
切り替えるための８流路選択バルブ； バルブN ２３（バルブNo.3）：廃液流路切り替えのため
の２流路選択バルブ； バルブ２４（バルブNo.4）：反応槽（合成カラム）１内
の溶媒の流れを反転させるためのスイッチングバルブ； バルブ２５（バルブNO.5）：ビーズリザーバーを選択す
るための８流路選択バルブ； バルブ２６（バルブNo.6）：ビーズリザーバーを選択す
るための８流路選択バルブ； ボトル３１（ボトル A）：0.1M 2-cyanoethyl deoxyade
nosine phosphoamidite monomer /0.5M tetrazole in a
cetonitrile を収容するボトル； ボトル３２（ボトルC ）：0.1M 2-cyanoethyl deoxycyt
osine phosphoamidite monomer /0.5M tetrazole in ac
etonitrileを収容するボトル； ボトル３３（ボトル G）：0.1M 2-cyanoethyl deoxygua
nosine phosphoamidite monomer /0.5M tetrazole in a
cetonitrile を収容するボトル； ボトル３４（ボトル T）：0.1M 2-cyanoethyl deoxythy
midine phosphoamidite monomer /0.5M tetrazole in a
cetonitrile を収容するボトル； ボトル３５（ボトル X）：TFA-Aminolinker Amidite in
acetonitrile (100-250mg in 2-5ml)を収容するボト
ル；（*TFA-Aminolinker Amidite：［6-（N-trifluoroa
cetyl-amino ）hexyl-β-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-
phosphoramidite ］）； ボトル３６（ボトル Y）：二価性試薬（SMCC, GMBS等）
を収容するボトル（*GMBS ：N-(4-maleimidobutyrylox
y)succinimide、SMCC：succinimidyl trans-4（N-malei
midylmethyl）cyanohexane-1-carboxylate ）； ボトル３７（ボトルTz）：Tetrazole を収容するボト
ル； ボトル４３（ボトル No.4 ）：洗浄試薬：acetonitrile
を収容するボトル； ボトル４４（ボトル No.5 ）：Detritylate 試薬：3% t
richloroacetic acid (TCA) in dichloromethaneを収容
するボトル； ボトル４５（ボトル No.6 ）：Cap 試薬：acetic anhyd
ride/lutidine/THF (1/1/8) 17.6% w/v N-methyl imida
zole in THF を収容するボトル；（*THF：tetrahydrofr
an） ボトル４６（ボトル No.7 ）：Oxidise 試薬：0.1M iod
ine in water/ pyridine/ THF (2/20/80) を収容するボ
トル； ボトル４８（ボトル WASTE）：廃液回収用ボトル； モニター５１：Dimethoxytrtylを連続的にモニターする
ためのモニター装置；反応槽（合成カラム）１：図１の
構成を有する反応槽； ポンプ５２：各種の送液を行うためのポンプ； ビーズリザーバー６１〜６４：ビーズの回収を目的とし
た構造を有するビーズリザーバー（図３、図４）。

【００３１】（ビーズリザーバー）ビーズリザーバー６
１〜６４の構成を図３および図４の模式斜視図に示す。
図３を参照して、ビーズリザーバー６１は、図の上下方
向（液体の移動方向）に移動可能とした円錐体状の開閉
部材（バルブエレメント）７１と、該開閉部材７１に対
向して配置され、その内部に開閉部材７１の円錐体形状
に対応するテーパー状の中空部を有するバルブシート７
２とからなる。

【００３２】ビーズリザーバー６１内には、所定量のビ
ーズ９（閉塞手段）が収容されている。また、開閉部材
７１内部にはテーパー状の中空部が形成され、該テーパ
ー状の中空部には、溶媒の流れ方向とほぼ垂直方向にな
るようにフィルター７４が配置されている。該フィルタ
ー７４のメッシュは、溶媒は通すが上記ビーズ９は通さ
ないサイズに設定されている。

【００３３】ビーズリザーバー６１内には、更に、誘電
力泳動でビーズ９を可逆的にビーズリザーバー６１内に
保持可能とするための一対の電極７５が配置され、該電
極７５には、これに高周波電力を供給するための電源７
６が接続されている。

【００３４】図４を参照して、溶媒の流路が順方向（バ
ルブ２５からバルブ２６の方向）である場合には、リザ
ーバー６１内の開閉部材７１が図面下方に移動し、ビー
ズ９を誘導力泳動で保持するための電極７５への通電が
停止される。このとき、開閉部材７１からバルブシート
７２の管壁に沿って流れる溶媒が、ビーズ９をバルブ２
６へ完全に送出することが可能となる。

【００３５】一方、溶媒の流路が逆方向（バルブ２６か
らバルブ２５の方向）である場合には、リザーバー６１
内の開閉部材７１が図面上方に移動し、ビーズ９を保持
する電極７５に通電される。このとき、開閉部材７１と
バルブシート７２の管壁との連絡は遮断され、バルブ２
６からリザーバー６１内へ流入するビーズ９は、電極７
５に誘導されて、バルブシート７２の管壁に蓄積され
る。

【００３６】本実施例においては、各ビーズリザーバー
６１〜６４には、以下に記す数のビーズ９があらかじめ
仕込まれている。

【００３７】ビーズリザーバー６１（リザーバーＡ）：
プレート５の孔の数の３／４の数のビーズ。

【００３８】ビーズリザーバー６２（リザーバーＢ）：
プレート５孔の数の２／３の数のビーズ。

【００３９】ビーズリザーバー６３（リザーバーＣ）：
プレート５孔の数の１／２の数のビーズ。

【００４０】ビーズリザーバー６４（リザーバーＤ）：
ビーズは仕込まれていない。

【００４１】（第２の固相）第１の固相たるプレート
（有孔部材）５の孔５ａ内に配置可能である限り、第２
の固相８の材質、形状等は特に制限されないが、移送、
保管等の操作が容易な点からは第２の固相８は球状（ビ
ーズ状）の形状を有することが好ましい。この第２の固
相８の材質は、上記したプレート５（第１の固相）と同
様の材料から選択して用いることが可能である。第２の
固相８の平均の大きさ（球状の場合は、平均粒径）は、
合成反応の効率の点から２〜１０μｍ程度（更には２〜
４μｍ程度）であることが好ましい。本実施例において
は、第２の固相８は、平均粒径２．８μｍのガラスビー
スからなる。

【００４２】より具体的には、本実施例においては、オ
リゴヌクレオチド合成用ビーズ担体８として、通常Cont
rolled Pore Glass （ＣＰＧ）として市販化されている
ガラスビーズ（例えば、商品名：Nucleoside-CPGキット
として米国ＣＰＧ Inc. 社から市販されているもの）に
化学合成用のモノヌクレオチドを固定したものが好まし
く用いられる。

【００４３】（ビーズ担体の充填）本実施例において
は、ビーズ担体８のプレート５の複数の孔５ａへの充填
は、例えば図５の模式平面図に示すように行うことがで
きる。

【００４４】図５を参照して、プレート５の開口面の４
分の３を覆うことのできるマスク８１を用意し、このマ
スク８１をプレート５の上に配置する。一方、該プレー
ト５のマスク８１の配置面と反対側の面（下面）には、
プレート６を配置して充填されたビーズ担体８が流出し
ないようにしておく。この状態で、まずデオキシアデノ
シン（ｄＡ）を固定したビーズ担体８（ｄＡ−ＣＰＧ；
図５には図示せず）を溶媒とともにプレート５に通過さ
せ、プレート５の開口面の１／４に対応する孔５ａ内に
ｄＡ−ＣＰＧを充填する。次に、プレート５上で該マス
ク８１を９０度回転させた後、デオキシグアノシン（ｄ
Ｇ）を固定したビーズ担体８（ｄＧ−ＣＰＧ）を溶媒と
ともにプレート５に通過させ、プレート５の開口面の１
／４に対応する孔５ａ内にｄＧ−ＣＰＧを充填する。同
様の操作をデオキシシチジン（ｄＣ）を固定したビーズ
担体８（ｄＣ−ＣＰＧ）およびデオキシチミジン（ｄ
Ｔ）を固定したビーズ担体８（ｄＴ−ＣＰＧ）について
も繰り返しすことにより、ヌクレオチド組成（Ａ、Ｇ、
Ｃ、Ｔ）の異なる４種類のビーズを順次プレート５の複
数の孔５ａ内に充填する。これにより、プレート５の複
数の孔５ａ内には、開口面の面積として１／４ずつ、上
記した異なる４種類のヌクレオチドが固定されたビーズ
８（ｄＡ−ＣＰＧ、ｄＧ−ＣＰＧ、ｄＣ−ＣＰＧ、ｄＴ
−ＣＰＧ）が充填される。

【００４５】（オリゴヌクレオチドの合成ステップ）次
に、上述したような本実施例の固相合成装置を用いて、
オリゴヌクレオチドのマルチ合成を行う場合の操作につ
いて述べる。

【００４６】本実施例において、オリゴヌクレオチドの
化学合成は、広く用いられているホスホアミダイト法に
則って、上記した第２の固相たるControled Pore Glass
( ＣＰＧ) 上で行う（Modern machine-aided methods o
f oligodeoxyribonucleotidesynthesis, Oligonucleoti
des and Analogues. A Practical Approach, IRL Pres
s, 1-23, 1991 を参照) 合成に用いる試薬および反応時間は下記（表１）に示す
通りであり、合成反応の過程は図６に示す通りである。

【００４７】

【表１】

【００４８】図６を参照して、まず、化学合成の種とな
る１つの塩基の３´端が固定された担体ビーズ８を用意
する。このビーズ８は、上述したようにガラス（ＣＰ
Ｇ）からなり、その表面にはサブマイクロモルから１０
マイクロモル程度の１種類のモノヌクレオチドが固定さ
れている。オリゴヌクレオチドの合成に際しては、２種
類の異なる保護基が核酸（ヌクレオチド）に結合してい
ることが重要であるが、ここでは、一つの保護基は塩基
の側鎖の部分に結合しており、他の一つの保護基は、糖
の５´端の水酸基の部分に結合している。

【００４９】化学合成のステップは、以下の通りであ
る。

【００５０】1.Detritylation （Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ
ｉｏｎ） ビーズ上に固定されたモノヌクレオチドの５´端に結合
しているジメトキシトリチル（Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒ
ｉｔｙｌ ）を３％のＴＣＡで分離する。

【００５１】2.Wash 上記反応により遊離したDimethoxytrityl を、アセトニ
トリル（acetonitrile）で洗い流す。この際に遊離した
Dimethoxytrityl をモニター５１で検出することによ
り、化学反応の進行の程度をモニターすることができ
る。

【００５２】3.Activation テトラゾール（Tetrazole ）と、新たに重合させるべき
モノヌクレオチドとを混合し、該モノヌクレオチドの３
´端にTetrazole を結合させて活性化させる。

【００５３】4.Coupling 上記反応により活性化させたモノヌクレオチドと、上記
（１）によりDimethoxytrityl を分離したヌクレオチド
とを混合して、これらを連結（重合）させる。

【００５４】5.Wash 上記（４）において重合しなかった過剰のヌクレオチド
モノマーを洗い流す。

【００５５】6.Capping （４）のCouplingで重合しなかったヌクレオチド（ビー
ズに固定された側）の５´端に無水酢酸を反応させて遊
離の水酸基をアセチル基で塞いで、以降の重合反応がそ
のヌクレオチドにおいて進まないようにする。

【００５６】7.Wash 上記Capping に用いた試薬を洗い流す。

【００５７】8.Oxidation ヌクレオチド間をつなぐリンを酸化させて、リン酸骨格
を形成する。

【００５８】9.Wash 上記Oxidation に用いた試薬を洗い流す。

【００５９】（装置の操作手順）プレート５上で１塩基
を連結するステップを図７に示す。以下、図７を参照し
つつ、本発明の固相合成装置の操作手順を説明する。

【００６０】本発明の固相合成装置においては、上記し
たホスホアミダイト法に加えてビーズの操作を行うた
め、合成反応槽１内での送液方向の反転を行う。したが
って、本発明の装置においては、ポジショニングバルブ
２５および２６(Valve No.5, Valve No.6)とスイッチン
グバルブ(Valve4)を用いる。

【００６１】この装置における送液方向とバルブポジシ
ョンとの関係は、図８（Ｂ. １方向）、図９（Ｂ. ２方
向）、および図１０（Ｂ. ３方向）である。ここに、図
８（Ｂ. １）においては順方向、図９（Ｂ. ２）におい
ては逆方向、図１０（Ｂ. ３）においてはビーズリザー
バー６１〜６４に送液しない流路をとる。

【００６２】操作手順 （１塩基分の連結） 1.流路を図１０のＢ. ３（ビーズリザーバーに送液しな
い流路）にとる。(*) 2.ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選択し送液する。

【００６３】3.ボトル４４（No. ５）のDetritylate 試
薬を選択し送液する。

【００６４】4.流路を図８のＢ. １( 順方向）にとる。

【００６５】5.バルブ２５（No. ５）をポートNo. ６の
ポジションに、バルブ２６（No. ６）をポートNo. ８の
ポジションにしてビーズリザーバー６１（リザーバー
Ａ）を選択し、該リザーバーのビーズ回収用回路への通
電は行わない。

【００６６】6.ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選択
し送液する。（**） 7.ボトル３７（Tz）のTetrazole を選択し送液する。

【００６７】8.ボトル３１（A ）のアミダイト-dA （第
１番目の種類のモノヌクレオチド）を選択し送液する。

【００６８】9.ボトル４３（No.4）の洗浄試薬を選択し
送液する。

【００６９】10. ボトル４５（No. ６）のCap 試薬を選
択し送液する。

【００７０】11. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【００７１】12. ボトル４５（No. ６）のOxidise 試薬
を選択し送液する。

【００７２】13. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【００７３】14. 流路を図９のＢ. ２（逆方向）にと
る。（*** ） 15. ビーズリザーバー６１（リザーバーA ）のビーズ回
収用回路に通電する。

【００７４】16. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【００７５】17. 送液を停止して、バルブ２５をポート
No. ５のポジションとし、バルブ２６をポートNo. １の
ポジションにしてビーズリザーバー６２（リザーバーB
）を選択し、該リザーバーのビーズ回収用回路の通電
は行わない。

【００７６】18. 流路を図８のＢ. １（順方向）にと
る。

【００７７】19. 上記ステップ６（**）へ戻りステップ
１４（*** ）までの操作を繰り返す。ただしアミダイト
としては、ボトル３２（C ）のアミダイト-dC （第２番
目の種類のモノヌクレオチド）を使用する。

【００７８】20. ビーズリザーバー６２（リザーバーB
）のビーズ回収用回路に通電する。

【００７９】21. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【００８０】22. 送液を停止して、バルブ２５をポート
No. ４のポジションとし、バルブ２６をポートNo. ２の
ポジションにしてビーズリザーバー６３（リザーバーC
）を選択し、該リザーバーのビーズ回収用回路への通
電は行わない。

【００８１】23. 流路を図８のＢ. １（順方向）にと
る。

【００８２】24. 上記ステップ６（**）へ戻りステップ
１４（*** ）までの操作を繰り返す。ただしアミダイト
としては、ボトル３３（G ）のアミダイト-dG （第３番
目の種類のモノヌクレオチド）を使用する。

【００８３】25. ビーズリザーバー６３（リザーバー
Ｃ）のビーズ回収用回路に通電する。

【００８４】26. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【００８５】27. 送液を停止して、バルブ２５をポート
No. ３のポジションとし、バルブ２６をポートNo. ３の
ポジションにしてビーズリザーバー６４（リザーバーD
）を選択し、該リザーバーのビーズ回収用回路への通
電は行わない。

【００８６】28. 流路を図８のＢ. １（順方向）にと
る。

【００８７】29. 上記ステップ６（**）へ戻りステップ
１４（*** ）までの操作を繰り返す。ただしアミダイト
としては、ボトル３４（T ）のアミダイト-T（第４番目
の種類のモノヌクレオチド）を使用する。

【００８８】30. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【００８９】31. 上記(*) に戻って、新たな１塩基の化
学的な連結（重合）反応が終了する(****)。

【００９０】上述した１塩基分の連結反応において、ビ
ーズリザーバー６１〜６４の操作により、以下のように
してプレート５の複数の孔５ａの選択が行われる。

【００９１】ビーズリザーバー６１（A ）には、プレー
ト５に含まれる孔５ａの数の３／４のビーズ９（閉塞手
段）が配置されている。これにより、ビーズリザーバー
６１からビーズ９が放出された場合には、（プレート５
上の孔５ａのうち３／４の数の孔５ａは放出されたビー
ズ９により塞がれるため）プレート５上の開口部は孔５
ａの総数の１／４の数となる（すなわち、孔５ａの総数
の１／４の数の孔５ａ内において、第１番目のモノヌク
レオチドが第２の固相たるビーズ８上に連結される）。
このように開口した孔５ａで核酸塩基を連結させ、且
つ、１塩基連結のステップが終了するまでDetritylate
しないので、個々の孔５ａ内では、１塩基合成の操作に
より２塩基以上の連結が生じることはない。

【００９２】一方、ビーズリザーバー６２（B ）には孔
５ａの総数の２／３の数のビーズ９が配置されている。
これにより、ビーズリザーバー６２からビーズ９が放出
された場合には、（プレート５上の孔５ａのうち２／３
の数の孔５ａは放出されたビーズ９により塞がれるた
め）プレート５上の開口部は孔５ａの総数の１／３の数
となる。このように開口した孔５ａで核酸塩基を連結さ
せれば、孔５ａの総数の１／３の数の孔５ａ内におい
て、第２番目のモノヌクレオチドがビーズ８上に連結さ
れることとなる。しかしながら、上述したように、既に
第１番目のモノヌクレオチドが連結した孔５ａ内では、
第２番目のモノヌクレオチドの連結は生じないので、実
際には、第１番目のモノヌクレオチドが連結していない
孔５ａ（総数の３／４）のうちの１／３（すなわち３／
４×１／３＝１／４）の孔５ａ内でのみ、新たに第２番
目のモノヌクレオチドが連結する。

【００９３】更に、ビーズリザーバー６３（C ）には孔
５ａの総数の１／２の数のビーズ９が配置されている。
これにより、ビーズリザーバー６３からビーズ９が放出
された場合には、（プレート５上の孔５ａのうち１／２
の数の孔５ａは放出されたビーズ９により塞がれるた
め）プレート５上の開口部は孔５ａの総数の１／２の数
となる。このように開口した孔５ａで核酸塩基を連結さ
せれば、既に第１番目又は第２番目のモノヌクレオチド
が連結した孔５ａ内では、第３番目のモノヌクレオチド
の連結は生じないので、第１番目又は第２番目のモノヌ
クレオチドが連結していない孔５ａ（総数の１／２）の
うちの１／２（すなわち１／２×１／２＝１／４）の孔
５ａ内でのみ、新たに第３番目のモノヌクレオチドが連
結する。

【００９４】更に、ビーズリザーバー６４（D ）には上
述したように、ビーズ９が配置されていない。これによ
り、ビーズリザーバー６４からビーズ９が放出されるこ
とはないため、開口した孔５ａで核酸塩基を連結させれ
ば、既に第１番目、第２番目又は第３番目のモノヌクレ
オチドが連結した孔５ａ内では、第４番目のモノヌクレ
オチドの連結は生じないので、第１番目、第２番目又は
第３番目のモノヌクレオチドが連結していない孔５ａ
（総数の１−１／４×３＝１／４）内でのみ、新たに第
４番目のモノヌクレオチドが連結する。

【００９５】このようにして、本実施例の装置によれ
ば、１塩基分の連結操作により、４種類の核酸塩基の連
結をほぼ同数の任意の孔５ａ内で（すなわち、ほぼ同じ
確率で）生じさせることができる。

【００９６】＜オリゴヌクレオチド鎖の伸張＞上記した
ステップ３１の操作に続けて、以下の操作を行う。

【００９７】32. ステップ１(*) からステップ３１（**
**) までの操作を、所望のオリゴヌクレオチド鎖長に対
応して行う。

【００９８】上記操作により、例えば、２塩基目の連結
反応においては、ステップ１からステップ３１までの操
作により、（１塩基目の連結反応の場合と同様に）４種
類の核酸塩基の連結をほぼ同じ確率で生じさせることが
できる。また、ある数のビーズがプレート５のどの位置
の孔５ａを塞ぐかは全くランダムであるため、２塩基目
として連結された塩基の種類は、１塩基目として連結さ
れた塩基の種類とは全く無関係にランダムに行われる。
同様に、３塩基目以降の連結も、それ以前に連結された
塩基の種類とは全く無関係にランダムに行われる。

【００９９】＜オリゴヌクレオチド鎖の５´末端へのア
ミノ基の結合＞上記したステップ３２の操作に続けて、
以下の操作を行う。

【０１００】33. 流路を図１０のＢ. ３にとる。

【０１０１】34. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【０１０２】35. ボトル４４（No. ５）のDetritylate
試薬を選択し送液する。

【０１０３】36. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【０１０４】37. ボトル３７（Tz）のTetrazole を選択
し送液する。

【０１０５】38. ボトル３５（X ）のTFA-Aminolinker
Amidite を選択し送液する。

【０１０６】39. ボトル４３（No.4）の洗浄試薬を選択
し送液する。

【０１０７】40. ボトル４５（No. ６）のCap 試薬を選
択し送液する。

【０１０８】41. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【０１０９】（上記ステップ３３から４２により、TFA-
Aminolinker Amidite が化学合成したオリゴヌクレオチ
ドの５´末端に結合され、acetonitrileで洗浄される。
上記TFA-Aminolinker Amidite はトリチル- オフで合成
される（トリチル基がついていない）ため、Detritylat
e は行わない。図１１参照） ＜オリゴヌクレオチド鎖５´末端のプレート管壁への結
合＞上記したステップ４１の操作に続けて、以下の操作
を行う。

【０１１０】42. ボトル４５（No. ６）のOxidise 試薬
を選択し送液する。

【０１１１】43. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【０１１２】44. ボトル３６（Y ）の二価性試薬（SMC
C,GMBS 等）を送液する。

【０１１３】45. ボトル４３（No. ４）の洗浄試薬を選
択し送液する。

【０１１４】（上記ステップ４３から４５により、プレ
ート５の孔５ａ内の管壁と、オリゴヌクレオチド合成用
ビーズ８とを、生成したオリゴヌクレオチドにより連結
することができる。） 以上の操作によりオリゴヌクレオチドが化学合成され
る。次いで、プレート５（プレートC ）を合成装置から
取り出し、アンモニアによる脱保護と、合成したオリゴ
ヌクレオチドのビーズからの分離を行うことにより、所
望のオリゴヌクレオチドが得られる。

【０１１５】（オリゴヌクレオチド）このようにしてオ
リゴヌクレオチドを合成することにより、以下の結果を
得ることができる。

【０１１６】（１）プレート５の１つの孔５ａ（プレー
ト５としてキャピラリープレートを用いた場合には、１
本のキャピラリー）の開口部を、必要に応じてビーズ９
によって塞ぐことで、個々の孔５ａ内で合成される核酸
塩基の種類を限定すること（例えば１種類とすること）
により、該孔５ａに固定されるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を１種類とすることができる。

【０１１７】（２）プレート５内の孔５ａに固定される
オリゴヌクレオチドが孔５ａ毎に相互で異なる配列を有
するように、ビーズ９の数を設定できる。

【０１１８】すなわち、上記したように、ビーズリザー
バー６１（A ）に、プレート５に含まれる孔５ａの数の
３／４のビーズ９を配置することにより、孔５ａの総数
の１／４の数の孔５ａ内において、第１番目の種類のモ
ノヌクレオチドが第１の固相たるビーズ８上に連結され
る。

【０１１９】同様に、上記したように、ビーズリザーバ
ー６２（B ）に孔５ａの総数の２／３の数のビーズ９を
配置することにより、第１番目の種類のモノヌクレオチ
ドが連結していない孔５ａ（総数の３／４）のうちの１
／３（すなわち３／４×１／３＝１／４）の孔５ａ内で
のみ、新たに第２番目のモノヌクレオチドが連結する。

【０１２０】同様に、上記したように、ビーズリザーバ
ー６３（C ）に孔５ａの総数の１／２の数のビーズ９を
配置することにより、第１番目又は第２番目の種類のモ
ノヌクレオチドが連結していない孔５ａ（総数の１／
２）のうちの１／２（すなわち１／２×１／２＝１／
４）の孔５ａ内でのみ、新たに第３番目の種類のモノヌ
クレオチドが連結する。

【０１２１】同様に、上記したように、ビーズリザーバ
ー６４（D ）にビーズ９を配置しないことにより、既に
第１番目、第２番目又は第３番目の種類のモノヌクレオ
チドが連結した孔５ａ内では、第４番目の種類のモノヌ
クレオチドの連結は生じないので、第１番目、第２番目
又は第３番目の種類のモノヌクレオチドが連結していな
い孔５ａ（総数の１−１／４×３＝１／４）内でのみ、
新たに第４番目の種類のモノヌクレオチドが連結する。

【０１２２】このようにして、本実施例の装置によれ
ば、各段階の塩基の連結反応毎に、４種類の核酸塩基の
連結をほぼ同数の任意の孔５ａ内でランダムに生じさせ
ることができる。

【０１２３】（３）プレート５の全ての孔５ａに固定さ
れるオリゴヌクレオチドは、孔５ａの数によって規定さ
れるオリゴヌクレオチドの鎖長を満足する全ての塩基配
列を有することができる。これは、上記した（２）（す
なわち、各段階の塩基の連結反応毎に、４種類の核酸塩
基の連結をほぼ同数の任意の孔５ａ内でランダムに生じ
させる）の必然的な帰結として可能となる。つまり、オ
リゴヌクレオチドの鎖長をＫとすると、任意のオリゴヌ
クレオチド鎖の種類は４^k 通りとなる。プレート５の孔
５ａの数からＫを算出すれば、Ｋ鎖長のオリゴヌクレオ
チドの全ての配列を網羅することができる。

【０１２４】（合成したオリゴヌクレオチドのプレート
５への固定）上記したように化学合成されたオリゴヌク
レオチドは、プレート５の個々の孔５ａの管壁に固定す
ることができる（上記ステップ４３〜４５）。

【０１２５】すなわち、流路を図１０のＢ. ３にとり、
ＳＭＣＣをオリゴヌクレオチド合成カラム１に流す。図
１２に示す反応によりＣＰＧ（第２の固相）上で合成さ
れたオリゴヌクレオチドにおいては、上記したTFA-Amin
olinker Amidite に、ＳＭＣＣが結合する。このＳＭＣ
Ｃは、更に、管壁に固定されたMercaptopropyl trimeth
oxysilane のＳＨ基に結合するため、結果としてＣＰＧ
上のオリゴヌクレオチドはその５´端で管壁に固定され
ることとなる。

【０１２６】化学合成が途中で停止してしまったオリゴ
ヌクレオチドには、上記Aminolinker Amidite が連結し
ないため、このオリゴヌクレオチドの管壁固定操作によ
り、化学合成が途中で停止したオリゴヌクレオチドを排
除することができる。すなわち、このようにして第２の
固相（ビーズ８；ＣＰＧ）と孔５ａの管壁との双方に固
定されたオリゴヌクレオチドにおいて、後述するように
選択的に第１の固相側の固定を切断することにより、
（正常に合成されたオリゴヌクレオチドは管壁にも固定
されているため）化学合成が途中で停止したオリゴヌク
レオチドを簡単な洗浄操作で除去することが可能とな
る。したがって、通常のオリゴヌクレオチドの合成で行
われる精製のステップを省略できる。

【０１２７】（第１の固相からのオリゴヌクレオチドの
分離とリン酸基の脱保護）上記により得られたオリゴヌ
クレオチドは、以下のようにして第２の固相（ＣＰＧ）
から分離され、また核酸塩基およびリン酸基は脱保護さ
れる。

【０１２８】すなわち、オリゴヌクレオチド合成カラム
１から、オリゴヌクレオチドが固定されたプレート５
（C ）を取り出し、高濃度のアンモニア水溶液中に浸漬
して、例えば摂氏５５度で５時間インキュベートする。
これにより、オリゴヌクレオチドとＣＰＧビーズ８間の
結合が選択的に切断されるため、プレート５内に残留す
るＣＰＧビーズ８を排出すれば、目的とするプレート５
（孔５ａ内に多種類のオリゴヌクレオチドが結合した有
孔部材）を得ることができる。

【０１２９】（合成したオリゴマー結合有孔部材の用
途）本発明の固相合成装置をオリゴヌクレオチド合成に
応用した場合、上述したように、各々の管壁に異なる塩
基配列のオリゴヌクレオチドを固定した有孔部材（プレ
ート５）を得ることができる（図１３）。

【０１３０】本発明により得られる合成したオリゴマー
結合有孔部材の用途は、特に制限されない。例えば、上
記の実施例により得られたオリゴヌクレオチド固定の有
孔部材は、所謂Solid-Phase Minisequencingによる塩基
配列決定法と、Sequencing by Hybridization による塩
基配列決定法との組み合わせで行うLarge-Scale DNA塩
基配列決定法用の実際的なオリゴヌクレオチドのマトリ
ックスとして好適に使用することが可能である。

【０１３１】前述した従来のＬＤ−ＳＡＰＣＳを上記の
塩基配列決定法に利用することも可能であるが、ＬＤ−
ＳＡＰＣＳを用いた場合と、本発明の固相合成装置によ
り得られたオリゴマー結合有孔部材を用いた場合とで
は、以下のような差異が生ずる。

【０１３２】1.上記LD-SAPCSの場合にも、原理的には数
百万種類のオリゴヌクレオチドを固相担体平面上に整列
させることが可能であるが、平面上のオリゴヌクレオチ
ドは３´端で固定されている。したがって、Solid-Phas
e Minisequencingのようにプライマーの３´端から酵素
的に核酸塩基を重合させる必要のある場合、考えられる
方法は図１４の模式図に示すように、担体平面上のオリ
ゴヌクレオチドと、読み取りの対象となる１本鎖ＤＮＡ
との間をつなぐ新たなプライマー（このプライマーを以
下「リンカープライマー」という）が必要となる。この
場合、リンカープライマー−１本鎖ＤＮＡ間、プライマ
ー−リンカープライマー間のハイブリダイゼーションの
制約、リンカープライマーの作成の問題が生ずるため、
LD-SAPCSの利点（数百万種類のオリゴヌクレオチドを、
それらの塩基配列を特定しながら固相担体平面上に整列
させることが可能）は意味をなさなくなる。

【０１３３】これに対して、本発明によれば、上述した
ようにオリゴヌクレオチドの５´端の固相担体に固定す
ることが可能であるため、LD-SAPCSを用いた場合のよう
な問題は生じない。

【０１３４】2. Solid-Phase Minisequencingは酵素
的に塩基を付加する反応を数十回繰り返すため、重合反
応をその度毎に観測することが極めて重要となる。従来
のLD-SAPCSを用いた場合には、各マトリックスが各々独
立していないため、重合反応をその度毎に観測すること
が極めて困難となる。これに対して、本発明の場合に
は、プレート５の各々の孔５ａを反応槽として取り扱う
ことが可能であるため、独立した重合反応を同時並列的
に観測することが可能となる。

【０１３５】（Solid-Phase Minisequencing）ここに、
上記したSolid-Phase Minisequencingとは、固相担体上
に１本鎖ＤＮＡを固定し、実験の目的に適合したプライ
マーを該１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズして、プライマ
ーに続く塩基配列の酵素的重合の過程をモニターするこ
とにより、塩基配列を決定する方法である。このような
Solid-Phase Minisequencingの一例として、以下に述べ
るEnzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate D
etection Assay（ELIDA)が挙げられる。

【０１３６】（ＥＬＩＤＡ）核酸塩基のＤＮＡへの重合
を連続的に測定する手段として、蛍光色素を用いた測定
系の他に、重合反応の際に生じるピロリン酸を発光で定
量する方法が提案されている（Pal Nyre'n；Anal.Bioch
em.,167 , 235-238, 1987 ）。

【０１３７】この方法によれば、以下の反応を用いてＡ
ＴＰ分子を１ｎＭから５００ｎＭまで一意的に定量化す
ることが可能である。

【０１３８】PPi analysis for continuous monitorin g of the ＤＮＡ polymerase ac tivity ( ＤＮＡ)n + dNTP → ( ＤＮＡ)n+1 + PPi (n = 残基の数) [1] ＤＮＡ Polymerase PPi + APS → ATP + ＳＯ₄ ^2- [2] ATP-sulfurylase ATP + luciferin + Ｏ₂ → AMP + PPi + oxyluciferin +ＣＯ₂ + h ν [3] Luciferase 発光の減衰は１分あたり1 ％以下であるため、ATP 濃度
の定量化に適している。

【０１３９】Standard Assay Condition 0.1M glycylglycine pH 7.7５ 2mM EDTA 10mM Mg-acetate 0.1 ％ BSA 1mM DTE 0.4ng/ml PVP 360,000 (PVP:polyvinylpyrrolidine) 100mg D-luciferin 4mg L-luciferin ５mM APS 0.3U ATP-sulfurylase luciferase （Sequencing by Hybridization ） 上記したSequencing by Hybridization 法（SBH/SHOM)
には、上記ELIDA と異なり、様々なバリエーションが存
在する。

【０１４０】この方法においては、原理的には全ての塩
基配列を網羅するオリゴヌクレオチドを平面上に配列さ
せる。この際、平面上の固定化されたオリゴヌクレオチ
ドは、その座標と塩基配列が対応していなければならな
い。この平面（以下「オリゴヌクレオチド マトリック
ス」ないし「ＯＭ」と略す）に読み取りの対象となるＤ
ＮＡ鎖のanti-sense鎖をハイブリダイズさせる。ハイブ
リダイズしたＤＮＡ鎖は蛍光色素あるいは放射性同位元
素で標識しておく。標識により、ハイブリダイズしたＤ
ＮＡのＯＭ上での座標を決定でき、その結果読み取りの
対象となるＤＮＡ鎖の部分配列の全てが一挙に決定可能
となる。この部分配列の重なりを計算機上で継ぎはぎし
て、ＤＮＡ鎖の全配列を導き出す。

【０１４１】この方法の最大の利点は、ＯＭに固定化さ
れたオリゴヌクレオチドの鎖長が１塩基長くなる毎に、
決定可能なＤＮＡ鎖長が指数関数的に長くなる点であ
る。

【０１４２】（Large-Scale ＤＮＡ塩基配列決定法）上
記Sequencing by Hybridization 法による塩基配列決定
法であり、オリゴヌクレオチドマトリックスに相当する
部分配列をミニシークエンシングによって決定させる試
みである。

【０１４３】この組み合わせにより、ミニシークエンシ
ングの欠点である、長いＤＮＡ鎖長を連続して判読でき
ない点と、SBH の欠点である、長い部分配列をすべて網
羅したオリゴヌクレオチド マトリックスを構成できな
い点とを克服することができ、従来の電気泳動法では分
離が不可能であったような長鎖長のＤＮＡの連続塩基配
列の決定が可能となる。

【０１４４】（固相合成装置の他の応用）上記において
は、本発明の固相合成装置をポリヌクレオチド合成に適
用した態様について述べたが、本発明の固相合成装置の
用途はこれに限定されるものではない。すなわち、連結
すべきモノマー、使用する反応試薬の種類等を変えるこ
とにより、固相合成が可能な他の物質（例えば、オリゴ
ペプチド）の合成に本発明の固相合成装置を適用するこ
とが可能である。

【０１４５】

【発明の効果】上述したように本発明によれば、複数の
孔を有する有孔部材からなる第１の固相と、有孔部材の
該複数の孔中に配置された第２の固相とからなる固相反
応部を含む固相合成装置が提供される。

【０１４６】本発明においては、複数の孔を有する有孔
部材からなる第１の固相と、該複数の孔中に配置された
第２の固相とを固相合成用の担体として用いているた
め、あるモノマー（ヌクレオチド、アミノ酸等）を固相
上の被反応物（モノマー又は中間生成物たるポリマー）
と反応させる際に、上記モノマーが反応すべき孔（の位
置および／又は数）が容易に選択でき、したがって所望
の被反応物が固定された固相を容易に選択することでき
る。

【０１４７】更に、本発明の固相合成装置を用いれば、
例えば、第１の固相上でポリマー（ないし中間生成物）
を生成させ、該ポリマーの他方の端を必要に応じて第２
の固相と結合させるこができる。したがって、上記ポリ
マーと第１の固相ないし第２の固相との結合／脱離を組
合わせることにより、ポリマーの反応すべき末端（すな
わち、固相に固定されていない末端）が容易に選択でき
る。

【０１４８】更に、本発明の固相合成装置を用いれば、
上記したポリマーと第１の固相ないし第２の固相との結
合／脱離を組合わせることにより、生成したポリマーな
いし中間生成物を容易に精製することができる。

【０１４９】本発明の固相合成装置をポリヌクレオチド
の合成に応用した場合、複数の孔を有する有孔部材の各
々の孔内の管壁に、異なる配列を有するオリゴマーを固
定することが可能となる。

【０１５０】したがって、この場合、所謂Solid-Phase
Minisequencingによる塩基配列決定法とSequencing by
Hybridization による塩基配列決定法との組み合わせで
行うLarge-Scale ＤＮＡ塩基配列決定法に好適に使用可
能な、実用的なオリゴヌクレオチドのマトリックスを作
成することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の固相合成装置の一実施例で用いる反応
槽（オリゴマー合成カラム）の構成の一例を示す模式斜
視図および模式断面図である。

【図２】本発明の固相合成装置の一実施例の構成を示す
模式図である。

【図３】本発明の固相合成装置の一実施例で用いるビー
ズリザーバーの構成の一例を示す模式斜視図である。

【図４】本発明の固相合成装置の一実施例で用いるビー
ズリザーバーの構成の一例を示す模式斜視図である。図
３とは、溶媒の流れの方向が逆となっている。

【図５】第１の固相たる有孔部材に、所定量ずつモノヌ
クレオチド固定ビーズ（第１の固相）を充填する方法の
一例を示す模式平面図である。

【図６】１つのモノマー連結のための１ステップの反応
を示す模式図である。

【図７】本発明の実施例の固相合成装置を用いて、１つ
のモノマーを連結するための１ステップの操作手順を示
すブロック図である。

【図８】本発明の実施例の固相合成装置において、順方
向で溶媒を流す場合のバルブ操作等を説明するための模
式図である。

【図９】本発明の実施例の固相合成装置において、逆方
向で溶媒を流す場合のバルブ操作等を説明するための模
式図である。

【図１０】本発明の実施例の固相合成装置において、ビ
ーズリザーバーを通さずに溶媒を流す場合のバルブ操作
等を説明するための模式図である。

【図１１】合成したオリゴヌクレオチドの５´末端にＴ
ＦＡアミノリンカー・アミダイトを結合させる反応を説
明するための模式図である。

【図１２】合成したオリゴヌクレオチドの５´末端を、
有孔部材の孔の管壁に結合させる反応を説明するための
模式図である。

【図１３】本発明により得られる複数種のオリゴヌクレ
オチド固定有孔部材の一例を示す模式平面図である。

【図１４】固相上に結合されたオリゴヌクレオチドを用
いて、ミニシークエンシングを行う場合の反応を説明す
るための模式図である。

【符号の説明】

１…固相反応部、２，７…プレート保持部材、３…テー
パ付き有孔部材、４，６…有孔部材、５…有孔部材（第
１の固相）、８…モノヌクレオチド固定ビーズ（第２の
固相）、９…閉塞用ビーズ、２１〜２６…バルブ、３１
〜３７…モノヌクレオチド・反応試薬収納ボトル、４１
〜４７…溶媒・反応試薬収納ボトル、５１…モニター、
５２…ポンプ、６１〜６４…ビーズリザーバー。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の孔を有する有孔部材からなる第１
   の固相と、該有孔部材の孔中に配置された第２の固相と
   からなる固相反応部を含むことを特徴とする固相合成装
   置。
2. 【請求項２】 前記第２の固相がビーズ状担体からなる
   請求項１記載の固相合成装置。
3. 【請求項３】 前記第１の固相が、前記第２の固相をそ
   の孔中に含む第１の有孔部材と、該第１の有孔部材を挟
   んで両側に配置された第２および第３の有孔部材とから
   なり；該第２および第３の有孔部材は第１の有孔部材と
   同数の孔を有し、且つ、第２および第３の有孔部材の孔
   の大きさが、第１の有孔部材の孔より小さい請求項１記
   載の固相合成装置。
4. 【請求項４】 前記有孔部材の複数の孔のうち、所定の
   数の孔を選択的に塞ぐための閉塞手段を更に有する請求
   項１記載の固相合成装置。
5. 【請求項５】 前記閉塞手段が、球状の部材からなる請
   求項４記載の固相合成装置。
6. 【請求項６】 前記第１の固相の外側に、更に第４の有
   孔部材が配置され、該第４の有孔部材は第１の有孔部材
   と同数の孔を有し、且つ、該第４の有孔部材の孔は、そ
   の外側に前記球状部材を通過させることなく受容可能な
   テーパー形状を有する請求項５記載の固相合成装置。
7. 【請求項７】 前記反応部における溶媒の移動方向に応
   じて、前記球状部材を選択的に保持可能なリザーバーを
   更に有する請求項５記載の固相合成装置。
8. 【請求項８】 前記リザーバーが複数配置され、且つ、
   該複数のリザーバーに保持可能な前記球状部材の数が互
   いに異なる請求項７記載の固相合成装置。
9. 【請求項９】 前記反応部における溶媒の流れ方向を反
   転させるための切り換えバルブを更に有する請求項７記
   載の固相合成装置。
10. 【請求項１０】 溶媒を流すべきリザーバーを、前記複
    数のリザーバーから選択するための流路選択バルブを更
    に有する請求項８記載の固相合成装置。