WO2022205578A1 - 一种基于簇式阵列的高通量自动化基因合成装置 - Google Patents
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Abstract
一种基于簇式阵列的高通量自动化基因合成装置。所述高通量基因合成装置包括基板和微孔板；基板上设有若干簇微孔（1）；微孔（1）的侧壁表面经化学修饰后作为核酸合成的固相载体，或微孔（1）内填充固相载体；若干簇微孔（1）呈簇式阵列排布，每簇微孔（1）与微孔板上的每个孔（2）的大小一致，且位置对应。利用所述装置合成寡核苷酸时，通过将合成的寡核酸自动回收到该装置下面对应大小的标准SBS板(96孔板、384孔板、1536孔板等)中，形成每个基因需要的寡核苷酸池，寡核苷酸的产量是pmoL级，该产量可以满足不经扩增直接进行后续的通过聚合酶介导(PCA)或连接酶介导(LCR)的基因组装，经过错误校正后的寡核苷酸进而完成基因全长的拼接，实现基因的高通量自动化合成。
Description
本发明涉及合成生物学和微电子机械系统(MEMS)，特别是涉及一种使用簇式阵列的高通量自动化的基因合成装置。
寡核苷酸合成和基因组装作为合成生物学的有力工具，在分子生物学(文库构建、测序、基因编辑等)、蛋白质工程、代谢工程、生物医学工程和遗传诊断等领域应用广泛。
传统的商业化固相合成方法，每个寡核苷酸是在单独一个合成管或在合成板中的一个孔中合成的，每个核酸的产量高，一般为nmol量级，但合成中消耗的试剂量多成本也高，基因合成时，需要将寡核苷酸混合成寡核苷酸池，再进行后续的基因组装。需要复杂的手工混合寡核苷酸池过程(pooling问题)。基于微阵列的高通量合成方法被广泛研究，合成的通量高(一张芯片上可以合成高达上百万种不同的寡核苷酸序列)成本低，但单个寡核苷酸合成的产量比较低，一般为fmol量级(一般10
5～10
12个分子/序列，甚至不足以引发PCR反应)，后续基因组装前需要先进行多次PCR扩增。当一张芯片上合成的全部核酸序列需要切割下来成为一种混合物时，为了避免混合物中多种序列间的相互作用，每种核酸的序列和合成的量需要精心设计，而且在基因合成时，需要将寡核苷酸混合物用通用引物等方法将混合物拆分出若干个寡核苷酸亚池，再进行后续的基因组装，操作比较复杂(depooling问题)。有文献报道基于微流控的核酸合成方法，无交叉污染，节约试剂消耗量，且100pmol的合成量级不需要扩增可以直接进行基因组装，但装置本身需要引入微泵微阀等使得其结构相对复杂操作麻烦效率降低，并没有得到主流商业化应用。另外已经有公司商业化报道基于半导体硅芯片的DNA合成平台，独特的蜂巢式微井设计，将反应体积减少100万倍，但该方法需要相对复杂的基底加工工艺、独特的液体处理技术和基底固定装置使得合成核酸的成本较高，虽然不需要手工混合或拆分的过程，但是产量依然不足够高，需要更高的PCR循环进行弥补。因此，需要继续开发合成的寡核苷酸产量合适、简单低成本、高通量而又适合商业化自动化基因组装的核酸合成技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于簇式阵列的高通量基因合成装置，可以实现 同一板上的不等长寡核苷酸合成，更有利于寡核苷酸的PCA拼接，或者使用短引物与长寡核苷酸组合的连接酶介导组装。
本发明所提供的基于簇式阵列的高通量基因合成装置，包括基板和微孔板；
所述基板上设有若干簇微孔；所述微孔的内壁表面经化学修饰后作为核酸合成的固相载体，或所述微孔内填充固相载体；
若干簇所述微孔呈簇式阵列排布，每簇所述微孔与所述微孔板上的每个孔的大小一致，且位置对应。
上述的基因合成装置中，所述微孔为漏斗状微孔或筒形微孔；
所述漏斗状微孔的开口为大口端。
上述的基因合成装置中，所述基板可为硅片，可采用MEMS微纳加工的方法制备所述微孔。
上述的基因合成装置中，所述基板可为高分子塑料板，可采用3D打印或注塑的方式制备所述微孔。
上述的基因合成装置中，所述固相载体可为玻璃微球或聚苯乙烯微球；
通过如下方式将所述固相载体固定于所述微孔内：
将所述固相载体与高密度聚乙烯球混合，进行烧结；
所述固相载体表面和内部纳米孔表面修饰有连接臂，可作为寡核苷酸合成延伸的起点。
上述的基因合成装置中，每簇所述微孔包括4～68个所述微孔；
所述微孔板为标准SBS板，如96孔板、384孔板或1536孔板等，相应地，所述基板上布置96簇微孔、384簇微孔或1536簇微孔；
所述基板上每簇微孔与所述微孔板上每个孔的对应布置，便于进行后续的自动化基因拼接合成：簇式阵列的每一簇对应下面SBS标准规格微孔板的一个孔，每一簇内所有孔合成的寡核苷酸可以满足一个基因全长拼接的需求。
利用本发明基因合成装置合成寡核苷酸时，可按照下述步骤进行：
采用分液装置将亚磷酰胺单体或辅助试剂加入至所述基因合成装置中的所述微孔中，在所述固相载体上进行反应得到寡核苷酸；
将所述基板与所述微孔板配合，将每簇所述微孔中得到的所述寡核苷酸回收至所述微孔板中的通孔中；
所述分液装置为微纳分液头，其不同于已有的工业喷墨打印喷头，它可以进行纳升和微升级的多通道飞行式液体分配，比喷墨打印头的皮升级分液体积大一个数量级，更适用于基因合成为目的的寡核苷酸合成时的分液。
在合成过程施以正压和/或负压使各类合成所需的辅助化学溶液逐步通过固相载体表面，合成结束后氨解，合成的长度从15个碱基到350个碱基不等。
本发明装置能够实现同一板上的不等长寡核苷酸合成，更有利于寡核苷酸的PCA拼接，或者使用短引物与长寡核苷酸组合的连接酶介导组装。使用超长寡核苷酸作为起始拼接元件，与传统短寡核苷酸的多步拼接法相比，可用一步拼接法完成基因组装，更容易实现自动化。
利用本发明装置合成寡核苷酸时，通过将合成的寡核酸自动回收到该装置下面对应大小的标准SBS板(96孔板、384孔板、1536孔板等)中，形成每个基因需要的寡核苷酸池，寡核苷酸的产量是pmoL级，该产量可以满足不经扩增直接进行后续的通过聚合酶介导(PCA)或连接酶介导(LCR)的基因组装，经过错误校正后的寡核苷酸进而完成基因全长的拼接，实现基因的高通量自动化合成。
图1为硅片上簇式排布的漏斗状微孔的加工工艺流程。
图2为硅片上的漏斗状微孔SEM形貌图(图2A)和孔内装载微球的图像(图2B)。
图3为基于硅片上簇式分布漏斗状微孔的核酸合成装置(标准96孔板回收时)。
图4为基于硅片上簇式分布漏斗状微孔的核酸合成装置(标准384孔板回收时)。
图5为基于硅片上簇式分布漏斗状微孔的核酸合成装置(标准1536孔板回收时)。
图6为基于高分子塑料板上簇式漏斗状微孔阵列的核酸合成装置(标准96孔板回收时)。
图7为基于高分子塑料板上簇式漏斗状微孔阵列的核酸合成装置(标准384孔板回收时)。
图8为基于微纳分液头的分液装置。
图9为基因合成总体工艺流程图。
图10为寡核苷酸合成后的毛细管电泳检测图(150nt)。
图11为PCA产物毛细管电泳检测图。
图12为PCR产物毛细管电泳检测图。
图13为错误校正产物的毛细管电泳检测图。
图14为菌株1的测序结果(包括图14-A、图14-B和图14-C)。
图15为菌株2的测序结果(包括图15-A、图15-B和图15-C)。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、硅片上簇式排布的漏斗状微孔的制备、微球装载
硅片上成簇分布的漏斗状微孔的加工工艺流程如图1所示：
(1)在厚度为400μm的双面抛光的8英寸硅片的两面，化学气相沉积一层厚度为20nm氮化硅，如图1A。
(2)在硅片的正面涂覆光刻胶，掩膜板下进行光刻，如图1B。
(3)反应离子刻蚀掉氮化硅层，如图1C。
(4)用氢氧化钾溶液湿法刻蚀硅至底部的氮化硅层，刻蚀角度为54.7°，如图1D。
(5)超声(或反应离子刻蚀)去除硅片背面倒楔形孔小开口处的氮化硅层，做成通孔，如图1E。
图2A示例了漏斗状微孔上方开口边长为605μm的扫描电子显微镜(SEM)图像。
(6)上述加工得到的漏斗状微孔即为寡核苷酸的反应腔，向漏斗状微孔内装载聚苯乙烯微球或玻璃微球(固相载体)，微球与高密度聚乙烯球按照一定的比例(根据具体需要，如1:1)混合均匀，140℃下烧结45min，用高密度聚乙烯球实现固相载体之间以及固相载体与漏斗状微孔内壁间的物理性粘结，从而将固相载体固定于通孔内，如图1F。向漏斗状微孔内装载固相载体后的图像，如图2B。后续的寡核苷酸化学合成反应在固相载体上进行，载体表面连接有中间体，可以作为核酸合成的起点。
实施例2、基于硅片上簇式分布漏斗状微孔的核酸合成装置
图3、图4和图5表示了三种不同通量的基因合成为目的的核酸合成装置。
如图3所示，硅片上13个漏斗状微孔1(寡核苷酸合成孔)为一簇，硅片结合下方的96孔通孔板，用基于微纳分液头的分液系统，在漏斗状微孔1内的固相载体上进行寡核苷酸的化学合成，13个漏斗状微孔1内合成的寡核苷酸被自动回收到96孔板的一个大孔2(基因拼接孔)中，进行后续的自动化一步拼 接合成一个基因。
图4和图5分别为合成384和1536个基因时的装置示意图，分别为7个和4个漏斗状微孔1为一簇。每一簇漏斗状微孔的排布方式和密度，可根据待合成基因的长度、硅片晶向和厚度、漏斗状微孔上下开口的大小等来调整。
实施例3、基于高分子塑料板上簇式漏斗状微孔阵列的核酸合成装置
图6和图7示例了两种不同通量的基因合成为目的的核酸合成装置。
如图6所示，高分子塑料板上，排布有1536个上大下小的漏斗状微孔1(寡核苷酸合成孔)，漏斗状微孔1中装载由固相载体与高密度聚乙烯球烧结而成的熔块，用基于微纳分液头的分液系统，在孔内的固相载体上合成寡核苷酸，16个孔为一簇，孔内合成的16种寡核苷酸被自动回收到96孔板的一个大孔2(基因拼接孔)中，即可在一个大孔2中完成一个基因的组装，可同时完成96个基因的组装。
如图7所示，4个孔为一簇，可以同时组装384个基因。
实施例4、寡核苷酸合成
在硅片上漏斗状微孔内或高分子塑料板中微孔内的固相载体上进行核酸合成反应：可采用标准的化学合成法(脱保护、偶联、加帽和氧化)。
具体的化学合成实施方法为：用不同的微纳分液头对四或多种不同的(脱氧/修饰)核苷酸单体溶液和活化剂和/或辅助试剂，根据每个合成孔内要合成的序列信息，自动化控制分液头的液体种类、位置和液体量，完成核酸的化学合成。
合成过程中采用的分液装置为微纳分液头，如图8所示，整体框架采用高精度大理石平台作为安装基准面，龙门式4轴伺服定位传动，X轴、Y1轴、Y2轴选用高精度直线电机驱动，搭配Z轴精密丝杠传动模组。核心分液元件为微纳分液头，具有高速响应精度。分液过程辅助以工位视觉定位；合成过程中产生的废液通过真空发生负压收集至废液瓶。其中，Y方向设置两个完全相同的平行工位Y1和Y2，两轴交替进行分液，以提高合成通量和效率；Y1/Y2轴夹具上可安装4块上述簇式阵列板，Y轴方向驱动阵列板至零点，Z轴上安装5个微纳分液头和辅助定位相机，X轴驱动Z轴相机定位合成分液原点后，X轴在位置控制模式下连续定位，驱动微纳分液头选择性分液至第1行对应的微孔中，X轴回归零点。接着，Y轴驱动夹具递进一行，X轴飞行模式下选择性分液第2行，如此依次进行，以完成4块簇式阵列板的1个碱基的自动化合成。
经过纯化后的150nt的寡核苷酸产物进行2100生物分析仪的RNA Pico 6000 Kit毛细管电泳试剂盒(Agilent，货号5067-1513)进行检测。
实施例5、基因合成
基因合成总体工艺流程，如图9所示。
每一簇漏斗状微孔合成的寡核苷酸回收到对应多孔板(96孔、384孔、1536孔)的一个孔中，并在对应孔中直接进行基因拼接和组装，实现96或384或1536个基因的自动化平行合成。
例如，合成甲基胞嘧啶双加氧酶(Tet1，mouse)基因的1546碱基的CDS序列(N端带有用于蛋白纯化的27个碱基的标签序列)，序列如下(序列表中序列1)：
基因合成过程如下：
(1)根据目标基因的DNA序列设计寡核苷酸序列
利用DNAWorks将目标DNA序列，进行密码子优化，拆分成首尾相连的12个序列片段，每段长度约150nt，重叠区平均碱基数约为20bp，Tm值为62℃。设计扩增1546nt片段的首尾引物Pa和Pb，12个片段序列和首尾引物序列如表1所示：
表1 序列1-12和首尾引物序列
(2)合成寡核苷酸
在上述基于簇式阵列漏斗状微孔中的固相载体上合成设计好的寡核苷酸，氨解后的每一簇寡核苷酸用对应的96孔板/384孔板的一个孔回收，回收后的寡核苷酸池(Seq1-Seq12)不需进一步的纯化步骤，直接用于基因组装。对寡核苷酸池(Seq1-Seq12)用安捷伦2100生物分析仪进行毛细管电泳检测，结果见图10。
(3)用聚合酶方法进行基因的一步组装
基于聚合酶的组装方法包括两个步骤，首先是聚合酶链式组装(Polymerase Cycling Assembly,PCA)，12个寡核苷酸片段互为引物和模板，进行一步法拼接，然后利用首尾引物Pa和Pb，对拼接好的目的片段进行PCR扩增，并用安捷伦2100生物分析仪进行毛细管电泳检测。
PCA反应体系是2×HiFi HotStart ReadyMix(Roche，货号KK2602)，oligomix各4pmoL，加无核酸酶水补足至4μL(最小反应体积为2μL，最大体积为50μL)
表2 PCA反应体系
执行如下反应程序：
表3 PCA反应程序
用首尾引物Pa和Pb，对拼接好的目的片段进行PCR扩增，反应体系为：
表4 PCR反应体系
执行如下PCR反应程序：
表5 PCR反应程序
经上述PCA反应，得到片段融合后的Smear产物，然后对PCA产物执行PCR反应利用两侧引物将基因全长片段进行得到1546bp的目的片段，PCR产物利用CorrectASE酶(Thermo Fisher货号A14972)进行错误校正得到最终用于下游克隆的产物。PCA产物、PCR产物和错误校正后产物一起进行2100生物分析仪的High Sensitivity DNA Kit毛细管电泳试剂盒(Agilent，货号5067-4626)进行检测的片段分析结果见图11、图12和图13。
基于一步组装的基础上，还可将PCA的体系降低到2～5μL，将PCR反应体系的组分直接加入到PCA反应管中，进行一管法组装。
(4)克隆测序
将步骤(3)得到的PCR产物与错误校正后产物与T载体连接后，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，每挑取10～16个阳性克隆进行一代测序，所用测序仪为ABI 3730XL，发现所有的序列结果都显示目标长度的片段已成功合成，其中可以确保至少有1个菌株含有完全正确的序列，而其他序列则含有1～2个突变位点，测序结果如图14-图19所示，其中，图14为菌株1的测序结果(包含图14-A、图14-B和图14-C，三个Sanger测序片段测通)，图15为菌株2的测序结果(包含图15-A、图15-B和图15-C，三个Sanger测序片段测通)，菌株1的测序结果是正确的，菌株2的测序结果有1个碱基错误。上述结果为安捷伦2100生物分析仪检测结果，显示了未校正的基因的宽尾峰，测序显示出约1/500～1/1000的错误率。
随后使用CorrectASE进行两轮错误校正，在第一轮和第二轮校正之后的2100生物分析仪检测，出现了更为尖锐的峰，表示了更低的错误率，将步骤(3)得到的错误校正后产物挑取2～4个菌落进行测序即可得到完全正确的基因克隆，测序结果表明，经过错误校正后，测序显示出约1/3000-1/10000的错误率。
工业应用
基于簇式阵列的高通量自动化基因合成系统通过簇式漏斗状孔结构完成高通量寡核苷酸的合成，进而这些簇式阵列与标准SBS板的孔进行一一对应的自动回收，形成用于后续基因拼接组装的寡核苷酸池。寡核苷酸产量达到pmoL级， 无需扩增即可正好满足基因拼接的需求。
相比传统基因合成方式，避免了大量混合寡核苷酸的手工操作，也避免了传统寡核苷酸合成的nmol级产量造成的大量浪费。相比基于微阵列芯片合成的寡核苷酸，单个寡核苷酸产量更高，不需要扩增即可直接用于后续的基因拼接。无需进行高通量寡核苷酸亚池的PCR拆分步骤。同时可以有效减少扩增带来的错误，从而降低错误率。
同时的采用超长寡核苷酸可以实现一步法拼接，简化操作步骤。每条寡核苷酸的合成量刚好满足基因拼接的pmol级别，降低合成成本。同时利用独特的寡核苷酸的簇式合成与下游基因拼接的标准微孔板创新性的衔接起来，与传统多步拼接相比实现了更高度的自动化。
本发明解决了目前基因合成领域中的低通量、手动操作繁琐等瓶颈，最终实现商业化低成本高通量自动化基因合成。
Claims (14)
- 一种基于簇式阵列的高通量基因合成装置，包括基板和微孔板；所述基板上设有若干簇微孔；所述微孔的内壁表面经化学修饰后作为核酸合成的固相载体，或所述微孔内填充核酸合成的固相载体；若干簇所述微孔呈簇式阵列排布，每簇所述微孔与所述微孔板上的每个孔的大小一致，且位置对应。
- 根据权利要求1所述的基因合成装置，其特征在于：所述微孔为漏斗状微孔或筒形微孔；所述漏斗状微孔的开口为大口端。
- 根据权利要求2所述的基因合成装置，其特征在于：所述基板为硅片。
- 根据权利要求3所述的基因合成装置，其特征在于：采用MEMS微纳加工的方法制备所述微孔。
- 根据权利要求2所述的基因合成装置，其特征在于：所述基板为高分子塑料板。
- 根据权利要求5所述的基因合成装置，其特征在于：采用3D打印或注塑的方式制备所述微孔。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的基因合成装置，其特征在于：所述固相载体为玻璃微球或聚苯乙烯微球。
- 根据权利要求1-7中任一项所述的基因合成装置，其特征在于：通过如下方式将所述固相载体固定于所述微孔内：将所述固相载体与高密度聚乙烯球混合，进行烧结。
- 根据权利要求1-8中任一项所述的基因合成装置，其特征在于：每簇所述微孔包括4～68个所述微孔。
- 根据权利要求1-9中任一项所述的基因合成装置，其特征在于：所述微孔板为标准SBS板。
- 一种寡核苷酸合成的方法，包括如下步骤：采用分液装置将亚磷酰胺单体或辅助试剂加入至权利要求1-10中任一项所述基因合成装置中的所述微孔中，在所述固相载体上进行反应得到寡核苷酸；将所述基板与所述微孔板配合，将每簇所述微孔中得到的所述寡核苷酸回收至所述微孔板中的孔中。
- 根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述分液装置为微纳分液头。
- 一种核酸合成的方法，包括如下步骤：在权利要求1-10中任一项所述基因合成装置中的所述微孔中合成得到寡核苷酸；将簇里所有所述微微孔中的寡核苷酸收集到所述微孔板的一个所述孔内，直接进行拼接，得到合成的核酸。
- 权利要求1-10中任一项所述基因合成装置在合成寡核苷酸和基因中的应用。
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| NENP | Non-entry into the national phase |
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