CN117070597B - 一种用于dna序列合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因合成技术领域，具体涉及一种用于DNA序列合成的方法。该方法包括以下步骤：S1、在待合成DNA序列两端加上通用序列作为目标DNA序列，根据该序列设计用于组装的短DNA单链；S2、对DNA单链进行溶解、混合、PCR等处理；S3、利用固定相进行PCR扩增；S4、利用通用引物进行PCR扩增。该方法操作简单，成本低，合成效率高，具有特异性，适合基于自动化移液工作站以及微流控芯片的操作。
Description
技术领域
本发明属于基因合成技术领域，具体涉及一种用于DNA序列合成的方法。
背景技术
基因序列合成是指将短的DNA序列通过PCR、等温聚合或者连接的方法连接起来，形成长的、完整的基因序列，是合成生物学领域不可或缺的关键技术。基于连接的方法是将端部带有粘末端的两段或多段DNA连接起来。粘末端可由多种方式产生，例如限制性内切酶切割、T5核酸外切酶酶切，即Gibson组装等。近年来对于两端引物序列的改造和依赖于CRISPR体系的切割也越来越多地得到应用。但使用粘末端连接方式进行基因合成需面临一些问题，例如多酶体系共同作用、或者带有修饰的寡核苷酸链的应用所带来的成本增加；常温发挥作用的酶在自动化仪器不理想的且长时间的保存条件下活性的维持。这些问题使得基于连接的基因组装方式更适合在高难度序列、长序列组装领域有很好的应用，但是对于长度＜20k的序列组装来说，连接的组装方式其成本、稳定性和操作复杂程度决定了其并不是一个很好的工业生产方式。
基于PCR方法的DNA合成弥补了连接合成方式的一些短板，例如：（1）反应温度高，有利于减少DNA二级结构的干扰；（2）试剂体系成熟，反应各组分都预先混合到一起，操作方便；（3）Taq酶活性高且不易失活，不需要严格的保存条件，有利于应用到自动化设备上；（4）短DNA序列不需要特殊修饰，成本低廉。但是PCR合成方式自身也有着较为明显的缺点需要克服：（1）在PCR反应中容易产生副产物，且副产物种类较复杂；（2）反应中解为单链，相似序列或者高GC序列容易形成二级结构或错配，降低组装效率；（3）热循环条件根据序列复杂程度和长度会有相应变化，导致PCR反应条件需要经常摸索，无法固定下来，难以进行标准的批量合成。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种用于DNA序列合成的方法。该方法快速、高特异、反应条件固定，可用于自动化、高通量的DNA合成。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供用于DNA序列合成的方法，具体包括如下步骤：
S1、将待合成DNA序列的5'端和3'端分别加入通用序列作为目标DNA序列，根据所述通用序列设计PCR引物UF和UR；根据目标DNA的序列信息设计2n个DNA单链，依次编号为D-1、D-2…D-2n，n大于等于1，相邻的两条DNA单链之间分别各有一段重叠序列，每条DNA单链上重叠序列的总长度小于该DNA单链的长度；
S2、合成S1所述DNA单链，分别以无核酸酶水溶解，执行以下任一种方案：
a、将所述DNA单链溶液预混，得到至少一个预混体系；
b、将所述DNA单链溶液分组预混后进行PCR扩增，所述分组预混为D-1与D-2预混，D-3与D-4预混，以此类推，经PCR扩增后共得到n个扩增产物体系；
c、根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向DNA单链，共n-1个，依次编号为P-2、P-4…P-(2n-2)；将所述DNA单链溶液和重叠区反向DNA单链分组预混；所述分组预混包括D-1、D-2与P-2预混，D-3、D-4与P-4预混，以此类推，D-(2n-1)、D-2n与通用引物预混，共得到n个预混体系；
d、根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向DNA单链，共n-1个，依次编号为P-2、P-4…P-(2n-2)；将所述DNA单链溶液和重叠区反向DNA单链分组预混；所述分组预混包括D-1、D-2与P-2预混，D-3、D-4与P-4预混，以此类推，D-(2n-1)、D-2n与通用引物预混，共得到n个预混体系；将所述预混体系进行PCR扩增，得到n个扩增产物体系；
S3、利用已修饰连接序列的固定相将S2所得预混体系或扩增产物体系进行DNA合成；
S4、用所述引物UF和UR对S3所得PCR扩增产物进行PCR扩增，得到所述目标DNA的完整序列。
本发明提供的上述用于DNA序列合成的方法在合成过程中不易产生无产物，具有高特异性；不易形成二级结构或错配，组装效率高；反应条件固定，易于进行批量合成，可用于自动化、高通量的DNA合成。
结合第一方面，所述重叠反向互补序列为：对于相邻两条DNA单链，如前一条为对应目标DNA序列的第a到b号碱基，a小于b；后一条对应目标DNA序列的第c到d号碱基，c小于d；且c小于b，则c到b号碱基序列为重叠区域。
结合第一方面，所述DNA单链的长度为15~300nt。
结合第一方面，所述重叠反向互补序列的长度小于≤40bp。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S2中所述PCR扩增的反应条件为：90~95℃，1~300s高温预变性；90~95℃，1~60s高温变性，50℃~68℃，10~120s退火，72℃，10~300s延伸，共进行1~20个循环；72℃，60~600s的后延伸。
结合第一方面，S3中所述PCR扩增的反应条件为：90~95℃，1~300s高温预变性；90~95℃，1~60s高温变性，50℃~68℃，10~120s退火，72℃，10~300s延伸，共进行1~40个循环；72℃，60~600s的后延伸。
结合第一方面，所述固定相为不溶于水的固体或胶体材料。固定相材料可以是以硅、玻璃、塑料、PDMS、磁珠等常用固相材质，也可以是通过蒸镀、溅射方法形成的可修饰表面。固定相材料活性基团可以与带有醛基、氨基、羟基、叠氮基、炔基、羧基等常见的化学交联基团的DNA单链连接。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S1中编号为D-1、D-3…D-(2n-1)的DNA单链为正向DNA单链，编号为D-2、D-4…D-2n的DNA单链为反向DNA单链；相邻的两条DNA单链5'端有一段重叠反向互补序列，即所述重叠序列；所述正向DNA单链的序列从5'端到3'端与所述目标DNA序列从5'端到3'端的一部分相同，所述反向DNA单链的序列从3'端到5'端与所述目标DNA序列从5'端到3'端的一部分互补。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S2的a方案中所述预混的具体操作包括：将所述DNA单链按编码顺序分为至少两组，每组含有连续编码的偶数个DNA单链，将各组中正向DNA单链和反向DNA单链按照1:m的摩尔比预混，m大于等于1，分别得到各组的预混体系。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S2的a方案中所述预混的具体操作包括：将一对相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:m的摩尔比混合，m大于等于1，形成n个预混体系；各预混体系中DNA单链的浓度相等。
优选地，在该实现方式中，S3的具体操作包括：根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一个预混体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个预混体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成PCR扩增。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S2的b方案中所述预混的具体操作包括：将一对相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:m的摩尔比混合，m大于等于1，获得n个预混体系；各预混体系中DNA单链的浓度相等。
优选地，在该实现方式中，S3的具体操作包括：根据DNA单链的编号顺序，将S2中经PCR扩增所得第一个产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成PCR扩增。
优选地，在该实现方式中，S3还可采用以下具体操作：将S2各预混体系经PCR扩增所得产物体系根据DNA单链的编号顺序分为至少两组，将各组产物体系按照等摩尔DNA单链的比例混合后，分别得到混合产物体系；根据DNA单链的编号顺序，将第一组混合产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组混合产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有混合产物体系并完成PCR扩增。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S2的c方案和d方案中获得所述预混体系的具体操作包括：根据除最后一个反向DNA单链之外的每个所述反向DNA单链5'端的所述重叠反向互补序列的信息设计重叠区反向DNA单链，共n-1个；合成各重叠区反向DNA单链，分别以无核酸酶水溶解；将相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链以及与该正反向DNA单链的重叠反向互补序列对应的重叠区反向DNA单链或通用序列按照1:1:m的摩尔比混合，所述通用序列在最后一对正反向DNA单链的混合体系中加入，m大于等于1，共获得n个预混体系。
优选地，所述重叠区反向DNA单链的序列包含部分或全部对应的重叠反向互补序列。
优选地，当S2为c方案时，S3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：将所述预混体系按DNA单链的编号依次分为k组，k小于n，将各组的预混体系混合；根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一组预混体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组预混体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成PCR扩增。
优选地，当S2为c方案时，S3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一个预混体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个预混体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成PCR扩增。
优选地，当S2为d方案时，S3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：将各预混体系经PCR扩增所得产物体系按DNA单链的编号依次分为k组，k小于n，将各组的产物体系混合；根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一组产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成PCR扩增。
优选地，当S2为d方案时，S3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一个产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成PCR扩增。
结合第一方面，在一种可能的实现方式中，S1中所述DNA单链均为反向DNA单链。
优选地，在该实现方式中，S2的a方案中所述预混的具体操作包括：将DNA单链按照顺序排列并分成k组，每组里至少包含一个DNA单链，且k小于n；将各组中的DNA单链等摩尔混合。
优选地，在该实现方式中，S2的a方案中所述预混的具体操作包括：将DNA单链等摩尔混合。
第二方面，本发明提供上述用于DNA序列合成的方法在合成长度＜20k的DNA序列中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：（1）可实现单步合成，在PCR实验体系上基本达到理论上特异性最高的上限；（2）利用固定相进行合成，大量PCR副产物随着液相的抽离而带走，DNA序列组装特异性高；（3）对于较为复杂的序列，例如高GC含量、短重复序列等，可以将DNA单链独立预先反应，再加入到固定相上组装，进一步避免了多序列体系的非特异性交叉反应；（4）待合成DNA短片段可以混合后直接加入到含有固定相的PCR管中反应，操作简便；（5）产物纯净，无需额外的切胶回收等繁琐的人工步骤，可以用于自动化仪器。
附图说明
图1为实施例1、2、3、4中短DNA单链序列设计方法示意图；
图2为实施例5、6、7、8中短DNA单链序列设计方法示意图；
图3为实施例9、10中短DNA单链序列设计方法示意图；
图4为实施例1中DNA合成方式示意图；
图5为实施例2中DNA合成方式示意图；
图6为实施例3中DNA合成方式示意图；
图7为实施例4中DNA合成方式示意图；
图8为实施例5中DNA合成方式示意图；
图9为实施例6中DNA合成方式示意图；
图10为实施例7中DNA合成方式示意图；
图11为实施例8中DNA合成方式示意图；
图12为实施例9中DNA合成方式示意图；
图13为实施例10中DNA合成方式示意图；
图14为实施例1中最终合成序列的电泳图；
图15为实施例2中最终合成序列的电泳图；
图16为实施例3中最终合成序列的电泳图；
图17为实施例4中最终合成序列的电泳图；
图18为实施例5中最终合成序列的电泳图；
图19为实施例6中最终合成序列的电泳图；
图20为实施例7中最终合成序列的电泳图；
图21为实施例8中最终合成序列的电泳图；
图22为实施例9中最终合成序列的电泳图；
图23为实施例10中最终合成序列的电泳图；
图24为实施例1中最终序列单克隆sanger测序图；
图25为实施例2中最终序列单克隆sanger测序图；
图26为实施例3中最终序列单克隆sanger测序图；
图27为实施例4中最终序列单克隆sanger测序图；
图28为实施例5中最终序列单克隆sanger测序图；
图29为实施例6中最终序列单克隆sanger测序图；
图30为实施例7中最终序列单克隆sanger测序图；
图31为实施例8中最终序列单克隆sanger测序图；
图32为实施例9中最终序列单克隆sanger测序图；
图33为实施例10中最终序列单克隆sanger测序图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中的试剂如无特殊说明，均来源于市售或按照本领域公知方法取得；以下实施例中的方法如无特殊说明，均为本领域公知方法。
实施例1
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示：
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：设计方法规则如图1所示，设计26个单链片段，其中包含13个正向DNA单链和13个反向DNA单链。按照前后顺序DNA单链D-1、D-2 … … D-26命名分别（分别如SEQ ID No.2~SEQ ID No.27所示）。其中奇数编号（D-1，D-3 … … D-25）链为正向DNA单链，偶数编号（D-2，D-4 … … D-26）链为反向DNA单链。相邻的两条DNA单链有一段重叠的反向互补序列。具体序列如表1所示。
表1 DNA单链序列
（2）DNA单链预混合：DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将DNA单链分成A、B两组，其中A组包括D-1到D-14，B组包括D-15到D-26。A组DNA单链中，奇数编号单链各取5μL加入到1.5mL预混A管中，偶数编号单链各取15μL到1.5mL预混A管中。B组DNA单链中，奇数编号单链各取5μL加入到1.5mL预混B管中，偶数编号单链各取15μL到1.5mL预混B管中。预混A管和预混B管涡旋混匀超过30s，短暂离心。
（3）DNA组装体系配置：从预混A管中取出10μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-A管。向PCR-A管中加入20μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。从预混B管中取出10μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-B管。向PCR-B管中加入20μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（4）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图4所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-A管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行20个循环；72℃，120s。固定相上连接序列（如SEQ ID No.28所示）如表2所示。
表2 固定相上连接的序列
（5）第二步DNA序列组装：第一步DNA序列组装程序运行完成后，取出DNA组装管，将内部液体吸出。向DNA组装管中加入100μL无核酸酶水，浸泡30s后将水移除，将PCR-B管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行20个循环；72℃，120s。
（6）组装产物扩增：第二步DNA序列组装程序运行完成后，取出DNA组装管，将内部液体吸出。向DNA组装管中加入100μL无核酸酶水，浸泡30s后将水移除。向DNA组装管内加入28μL无核酸酶水，UL（10pmol/μL）（如SEQ ID No.29所示）、UR（10pmol/μL）（如SEQ ID No.30所示）通用引物各1μL，30μL 2x PrimeStar PCR Mix。运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s，60℃，15s，72℃，120s，共进行28个循环；72℃，120s。引物UL和UR的序列如表3所示。
表3 引物UL和UR序列
琼脂糖凝胶电泳图如图14所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图24。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例2
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）DNA单链预反应：DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:3的摩尔比混合，加入5μL正向DNA单链溶液和15μL反向DNA单链溶液到PCR管中，D-1与D-2预混，D-3与D-4预混，以此类推，按照顺序得到13个混合体系。向13个混合体系中各加入20μL 2x PrimeStar PCR Mix，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s，60℃，15s，72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。
（3）DNA单链预混合：将13个混合体系分成A、B两组，其中A组包括第1到第7个，B组包括第8到第13个。将A组混合体系全部加入到1.5mL预混A管中进行二次混合。将B组混合体系全部加入到1.5mL预混B管中进行二次混合。预混A管和预混B管涡旋混匀超过30s，短暂离心。
（4）DNA组装体系配置：从预混A管中取出20μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-A管。向PCR-A管中加入20μL无核酸酶水，20μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。从预混B管中取出20μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-B管。向PCR-B管中加入20μL无核酸酶水，20μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（5）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图5所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-A管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s，60℃，15s，72℃，20s，共进行20个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（3）第二步DNA序列组装：同实施例1步骤（5）。
（4）组装产物扩增：同实施例1步骤（6）。
琼脂糖凝胶电泳图如图15所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图25。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例3
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）DNA单链预混合：DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:3的摩尔比混合，加入5μL正向DNA单链溶液和15μL反向DNA单链溶液到PCR管中，D-1与D-2预混，D-3与D-4预混，以此类推，按照顺序得到13个混合体系。
（3）DNA组装体系配置：从13个混合体系中取出5μL液体分别转移至13个200μL PCR管中，标记为PCR-1、PCR-2 … … PCR-13管。分别向各管中加入25μL无核酸酶水，30μL 2xPrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（4）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图6所示。取出修饰DNA单链的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-1管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（5）第二步DNA序列组装：第一步DNA序列组装程序运行完成后，取出DNA组装管，将内部液体吸出。向DNA组装管中加入100μL无核酸酶水，浸泡30s后将水移除，将PCR-2管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s，60℃，15s，72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。
（6）重复上述步骤，依次将PCR-3至PCR-13管中液体加入到DNA组装管中反应。
（7）组装产物扩增：第（6）步程序运行完成后，按实施例1步骤（6）进行组装产物扩增。
琼脂糖凝胶电泳图如图16所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图26。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例4
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）DNA单链预反应：同实施例2步骤（2）。
（3）DNA组装体系配置：从13个混合体系中取出10μL液体分别转移至13个200μLPCR管中，标记为PCR-1、PCR-2 … … PCR-13管。分别向各管中加入25μL无核酸酶水，25μL2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（4）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图7所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-1管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（5）第二步DNA序列组装：同实施例3步骤（5）。
（6）重复上述步骤，依次将PCR-3至PCR-13管中液体加入到DNA组装管中反应。
（7）组装产物扩增：第（6）步程序运行完成后，按实施例1步骤（6）进行组装产物扩增。
琼脂糖凝胶电泳图如图17所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图27。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例5
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）根据每个反向DNA单链5'端的重叠反向互补序列信息设计一条重叠区反向DNA单链，最后一条（D-26）除外；共设计12条这种重叠区反向DNA单链，用P-2、P-4 … … P-24表示（如SEQ ID No.31~42所示）。具体序列如表4所示。
表4 重叠区反向DNA单链
（3）DNA单链预混合：所有DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将DNA单链分成A、B两组，其中A组包括D-1到D-14，P2到P14。B组包括D-15到D-26，P16到P24以及UR（如SEQ ID No.42所示）。A组DNA单链中，D开头奇数编号单链、D开头偶数编号单链各取5μL加入到1.5mL预混A管中，P开头DNA单链各取15μL到1.5mL预混A管中。B组DNA单链中，D开头奇数编号单链、D开头偶数编号单链各取5μL加入到1.5mL预混B管中，P开头DNA单链各取15μL到1.5mL预混B管中，并取15μL DNA单链UR加入到1.5mL预混B管中。预混A管和预混B管分别涡旋混匀超过30s，短暂离心。
（4）DNA组装体系配置：从预混A管中取出10μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-A管。向PCR-A管中加入20μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。从预混B管中取出10μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-B管。向PCR-B管中加入20μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（5）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图8所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-A管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s，60℃，15s，72℃，20s，共进行20个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（6）第二步DNA序列组装：同实施例1步骤（5）。
（7）组装产物扩增：同实施例1步骤（6）。
琼脂糖凝胶电泳图如图18所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图28。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例6
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）根据每个反向DNA单链5'端的重叠反向互补序列信息设计一条重叠区反向DNA单链：同实施例5步骤（2）。
（3）DNA单链预反应：所有DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将相邻3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:1的摩尔比混合，加入1μL正向DNA单链和1μL反向DNA单链到PCR管中，按照顺序得到13个混合体系。将P开头DNA单链按照顺序分别依次加入到前12个混合体系中，每个对应加入5μL。向第13个混合体系加入5μL的UR。向13个混合体系中各加入7μL 2x PrimeStar PCR Mix，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s，60℃，15s，72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。
（4）DNA单链预混合：将13个混合体系分成A、B两组，其中A组包括第1到第7个，B组包括第8到第13个。将A组混合体系全部加入到1.5mL预混A管中进行二次混合。将B组混合体系全部加入到1.5mL预混B管中进行二次混合。预混A管和预混B管涡旋混匀超过30s，短暂离心。
（5）DNA组装体系配置：从预混A管中取出20μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-A管。向PCR-A管中加入20μL无核酸酶水，20μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。从预混B管中取出20μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-B管。向PCR-B管中加入20μL无核酸酶水，20μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（7）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图9所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-A管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行20个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（8）第二步DNA序列组装：同实施例1步骤（5）。
（9）组装产物扩增：同实施例1步骤（6）。
琼脂糖凝胶电泳图如图19所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图29。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例7
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）根据每个反向DNA单链5'端的重叠反向互补序列信息设计一条重叠区反向DNA单链：同实施例5步骤（2）。
（3）DNA单链预混合：所有DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将相邻3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:1的摩尔比混合，加入1μL正向DNA单链和1μL反向DNA单链到PCR管中，按照顺序得到13个混合体系。将P开头DNA单链按照顺序分别依次加入到前12个混合体系中，每个对应加入5μL。向第13个混合体系加入5μL的UR。
（4）DNA组装体系配置：从13个混合体系中取出5μL液体分别转移至13个200μL PCR管中，标记为PCR-1、PCR-2 … … PCR-13管。分别向各管中加入25μL无核酸酶水，30μL 2xPrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（5）第一步DNA序列组装。DNA序列组装方法如图10所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-1管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（6）第二步DNA序列组装：同实施例3步骤（5）。
（7）重复上述步骤，依次将PCR-3至PCR-13管中液体加入到DNA组装管中反应。
（8）组装产物扩增：第（7）步程序运行完成后，按实施例1步骤（6）进行组装产物扩增。
琼脂糖凝胶电泳图如图20所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图30。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例8
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例1。
（2）根据每个反向DNA单链5'端的重叠反向互补序列信息设计一条重叠区反向DNA单链：同实施例5步骤（2）。
（3）DNA单链预反应：同实施例6步骤（3）。
（4）DNA组装体系配置。从13个混合体系中取出10μL液体分别转移至13个200μLPCR管中，标记为PCR-1、PCR-2 … … PCR-13管。分别向各管中加入25μL无核酸酶水，25μL2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（5）第一步DNA序列组装。DNA序列组装方法如图11所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-1管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行10个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（6）第二步DNA序列组装：同实施例3步骤（5）。
（7）重复上述步骤，依次将PCR-3至PCR-13管中液体加入到DNA组装管中反应。
（8）组装产物扩增：第（7）步程序运行完成后，按实施例1步骤（6）进行组装产物扩增。
琼脂糖凝胶电泳图如图21所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图31。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例9
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：设计方法规则如图3所示，设计26个单链片段，全部为反向DNA单链。按照前后顺序DNA单链DAS-1、DAS-2 … … DAS-26命名（如SEQ ID No.44~SEQ ID No.69所示）。相邻的两条DNA单链有一段重叠的序列。具体序列如表5所示。
表5 短DNA单链的具体序列
（2）DNA单链预混合：DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。将DNA单链分成A、B两组，其中A组包括DAS-1到DAS-13，B组包括DAS-14到DAS-26。A组DNA单链中，各取5μL加入到1.5mL预混A管中。B组DNA单链中，各取5μL加入到1.5mL预混B管中。预混A管和预混B管涡旋混匀超过30s，短暂离心。
（3）DNA组装体系配置：从预混A管中取出10μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-A管。向PCR-A管中加入20μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。从预混B管中取出10μL液体转移至200μL PCR管中，标记为PCR-B管。向PCR-B管中加入20μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStar PCR Mix，移液器吹打混匀。
（4）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图12所示。取出修饰连接序列的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-A管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行30个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（5）第二步DNA序列组装：同实施例1步骤（5）。
（6）组装产物扩增：同实施例1步骤（6）。
琼脂糖凝胶电泳图如图22所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图32。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
实施例10
本发明实施例提供一种用于DNA序列合成的方法，合成序列长度为1008碱基。
目标DNA序列（最终合成序列）如SEQ ID No.1所示。
合成过程如下：
（1）根据目标DNA序列设计用于合成的短DNA单链：同实施例9。
（2）DNA组装体系配置：DNA单链合成后使用无核酸酶水将其溶解，终浓度为20pmol/μL。从26个DNA单链溶液中取出5μL液体分别转移至26个200μL PCR管中，标记为PCR-1、PCR-2 … … PCR-26管。分别向各管中加入25μL无核酸酶水，30μL 2x PrimeStarPCR Mix，移液器吹打混匀。
（3）第一步DNA序列组装：DNA序列组装方法如图13所示。取出修饰DNA单链的玻片，放置到一200μL PCR管中，标记为DNA组装管。将PCR-1管中所有液体转移至DNA组装管，运行PCR反应程序：95℃，120s；95℃，20s、60℃，15s、72℃，20s，共进行5个循环；72℃，120s。固定相上连接序列同实施例1中的表2。
（4）第二步DNA序列组装：同实施例3步骤（5）。
（5）重复上述步骤，依次将PCR-3至PCR-26管中液体加入到DNA组装管中反应。
（6）组装产物扩增：第（5）步程序运行完成后，按实施例1步骤（6）进行组装产物扩增。
琼脂糖凝胶电泳图如图23所示，图中1为Marker，2为DNA序列组装结果。序列全长1008bp。将组装出的DNA序列与Puc57载体进行Gibson组装，平板培养后挑单克隆进行sanger测序，测序结果见图33。以上结果说明本实施例组装出了目标DNA序列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于DNA序列合成的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、将待合成DNA序列的5'端和3'端分别加入通用序列作为目标DNA序列，根据所述通用序列设计PCR引物UF和UR；根据目标DNA的序列信息设计2n个DNA单链，依次编号为D-1、D-2…D-2n，n大于等于1，相邻的两条DNA单链之间分别各有一段重叠序列，每条DNA单链上重叠序列的总长度小于该DNA单链的长度；所述DNA单链的长度为15~300nt；所述重叠序列的长度小于≤40bp；编号为D-1、D-3…D-(2n-1)的DNA单链为正向DNA单链，编号为D-2、D-4…D-2n的DNA单链为反向DNA单链；所述正向DNA单链的序列从5'端到3'端与所述目标DNA序列从5'端到3'端的一部分相同，所述反向DNA单链除所述重叠序列外的序列从3'端到5'端与所述目标DNA序列从5'端到3'端的一部分互补；所述重叠序列为：对于相邻两条DNA单链，如前一条为对应目标DNA序列的第a到b号碱基，a小于b，后一条对应目标DNA序列的第c到d号碱基，c小于d，且c小于b，则c到b号碱基序列为所述重叠区域；所述重叠序列为重叠反向互补序列；
S2、合成S1所述DNA单链，分别以无核酸酶水溶解，然后执行以下任一种方案：
a、将所述DNA单链溶液预混，得到至少一个预混体系；所述预混的具体操作包括：将所述DNA单链按编码顺序分为至少两组，每组含有连续编码的偶数个DNA单链，将各组中正向DNA单链和反向DNA单链按照1:m的摩尔比预混，m大于等于1，分别得到各组的预混体系；或将一对相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:m的摩尔比混合，m大于等于1，形成n个预混体系；
b、将所述DNA单链溶液分组预混后进行PCR扩增，所述分组预混为D-1与D-2预混，D-3与D-4预混，以此类推，经PCR扩增后共得到n个扩增产物体系；所述预混的具体操作包括：将一对相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链按照1:m的摩尔比混合，m大于等于1，获得n个预混体系，各预混体系中DNA单链的浓度相等；
c、根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向DNA单链，共n-1个，依次编号为P-2、P-4…P-(2n-2)；将所述DNA单链溶液和重叠区反向DNA单链分组预混；所述分组预混包括D-1、D-2与P-2预混，D-3、D-4与P-4预混，以此类推，D-(2n-1)、D-2n与通用引物预混，共得到n个预混体系；
d、根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向DNA单链，共n-1个，依次编号为P-2、P-4…P-(2n-2)；将所述DNA单链溶液和重叠区反向DNA单链分组预混；所述分组预混包括D-1、D-2与P-2预混，D-3、D-4与P-4预混，以此类推，D-(2n-1)、D-2n与通用引物预混，共得到n个预混体系；将所述预混体系进行PCR扩增，得到n个扩增产物体系；
c方案和/或d方案中获得所述预混体系的具体操作包括：根据除最后一个反向DNA单链之外的每个所述反向DNA单链5'端的所述重叠反向互补序列的信息设计重叠区反向DNA单链，共n-1个；合成各重叠区反向DNA单链，分别以无核酸酶水溶解；将相邻的3'端反向互补的正反向DNA单链以及与所述重叠区反向DNA单链或通用序列按照1:1:m的摩尔比混合，所述通用序列在最后一对正反向DNA单链的混合体系中加入，m大于等于1，共获得n个预混体系；
S3、利用已修饰连接序列的固定相将S2所得预混体系或扩增产物体系进行DNA合成；所述连接序列与S1中所述通用序列反向互补；
当S2为a方案时，S3的具体操作包括：
根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一组/第一个预混体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组/下一个预混体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成PCR扩增；
当S2为b方案时，S3的具体操作包括：
根据DNA单链的编号顺序，将S2中经PCR扩增所得第一个产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成PCR扩增；或
将S2各预混体系经PCR扩增所得产物体系根据DNA单链的编号顺序分为至少两组，将各组产物体系按照等摩尔DNA单链的比例混合后，分别得到混合产物体系；根据DNA单链的编号顺序，将第一组混合产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组混合产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有混合产物体系并完成PCR扩增；
当S2为c方案时，S3的具体操作包括：
将所述预混体系按DNA单链的编号依次分为k组，k小于n，将各组的预混体系混合；根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一组预混体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组预混体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成PCR扩增；或
根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一个预混体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个预混体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成PCR扩增；
当S2为d方案时，S3的具体操作包括：
将各预混体系经PCR扩增所得产物体系按DNA单链的编号依次分为k组，k小于n，将各组的产物体系混合；根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一组产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一组产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成PCR扩增；或根据DNA单链的编号顺序，将S2所得第一个产物体系加入含有固定相的PCR管中，加入PCR反应试剂进行PCR扩增，反应后吸走反应液，加入下一个产物体系和PCR反应试剂进行PCR扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成PCR扩增；
S4、用所述引物UF和UR对S3所得PCR扩增产物进行PCR扩增，得到所述目标DNA的完整序列；
其中，所述DNA序列的长度＜20k。
2.根据权利要求1所述的用于DNA序列合成的方法，其特征在于，S2中所述PCR扩增的反应条件为：90~95℃，1~300s高温预变性；90~95℃，1~60s高温变性，50℃~68℃，10~120s退火，72℃，10~300s延伸，共进行1~20个循环；72℃，60~600s的后延伸；和/或
S2中每个预混体系中DNA单链总浓度为0.001pmol/μL~50pmol/μL；和/或
S3中所述PCR扩增的反应条件为：90~95℃，1~300s高温预变性；90~95℃，1~60s高温变性，50℃~68℃，10~120s退火，72℃，10~300s延伸，共进行1~40个循环；72℃，60~600s的后延伸。
3.根据权利要求1所述的用于DNA序列合成的方法，其特征在于，所述重叠区反向DNA单链的序列包含部分或全部对应的重叠反向互补序列。
4.根据权利要求1或2任一项所述的用于DNA序列合成的方法，其特征在于，S1中所述DNA单链均为反向DNA单链时，则所述重叠序列的序列是相同的，S2执行a方案，S2的a方案中所述预混的具体操作包括：
将DNA单链按照顺序排列并分成k组，每组里至少包含一个DNA单链，且k小于n；将各组中的DNA单链等摩尔混合；或
将每个所述DNA单链溶液各自预混，得到预混体系。
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Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
| CN102321612A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-18 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 工业化的基因合成方法 |
| CN104178477A (zh) * | 2013-05-28 | 2014-12-03 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种基因合成的方法 |
| CN110551802A (zh) * | 2019-10-10 | 2019-12-10 | 周口师范学院 | 一种快速合成全基因序列的方法及其应用 |
| CN113262730A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-08-17 | 上海迪赢生物科技有限公司 | 一种基于簇式阵列的高通量自动化基因合成装置 |
| CN113481194A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-08 | 北京擎科生物科技有限公司 | 一种dna的合成方法 |
| CN116426559A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-07-14 | 南京工业大学 | 一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法 |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| EP1180547A3 (en) * | 2000-07-28 | 2004-01-28 | Nisshinbo Industries, Inc. | Method for producing DNA |
| WO2010132019A1 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Agency For Science, Technology And Research | Gene synthesis method |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321612A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-18 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 工业化的基因合成方法 |
| CN104178477A (zh) * | 2013-05-28 | 2014-12-03 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种基因合成的方法 |
| CN110551802A (zh) * | 2019-10-10 | 2019-12-10 | 周口师范学院 | 一种快速合成全基因序列的方法及其应用 |
| CN113262730A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-08-17 | 上海迪赢生物科技有限公司 | 一种基于簇式阵列的高通量自动化基因合成装置 |
| CN113481194A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-08 | 北京擎科生物科技有限公司 | 一种dna的合成方法 |
| CN116426559A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-07-14 | 南京工业大学 | 一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| An improved method of gene synthesis based on DNA works software and overlap extension PCR;Bingxue Dong等;Mol Biotechnol;第37卷(第3期);第195-200页 * |
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