CN100408697C - 将生物分子非共价固定到固体基质上的方法和微阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法，包括：提供附着有第一官能团的固体基质，该第一官能团具有氢键供给能力；以及使具有氢键接受能力的化合物和用第二官能团进行功能化的生物分子的混合物与基质的表面进行反应，该第二官能团具有氢键供给能力，以便于将生物分子非共价地固定到基质上。

Description

将生物分子非共价固定到固体基质上的方法和微阵列
技术领域
本发明涉及将生物分子固定到固体基质上的方法，更特别地涉及将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法。
相关技术的说明
术语“微阵列(microarray)”指一种基质，其将特异的生物分子密集地固定在预定区域中。微阵列的实例包括，例如，多核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。术语“多核苷酸微阵列”指将多核苷酸密集地固定在其上的每个预定区域中的基质。微阵列是本领域众所周知的，例如，美国专利号5,445,934和5,744,305。
通过在基质上直接合成多核苷酸，或通过将预先合成的多核苷酸固定到基质上的预定位置(定点法(spotting method))来将多核苷酸固定到固体基质上。多核苷酸微阵列及其产生方法在美国专利号5,744,305，5,143,854和5,424,186中有描述，其所公开的内容在此全部引入作为参考。定点法广泛用于将生物分子共价地固定到固体基质上。例如，通常通过用氨基等亲核官能团活化固体基质的表面，在所述该官能团上偶联已被优良的离去基团(leavinggroup)活化的生物分子，例如多核苷酸，然后从所述基质除去未反应的反应物，从而将生物分子固定到所述基质上。将生物分子非共价地固定到基质上的方法还不是本领域已知的。
已经将亲水化合物聚乙二醇用于微阵列。聚乙二醇通过共价键附着于DNA链的两个末端，并且将DNA链固定到基质上以获得微阵列[实验血液学杂志(Journal of Experimental hematology)2003：11(4)：393-397]。US-2003-0108917-A1描述了通过将探针多核苷酸固定到水凝胶上来产生微阵列的方法，所述水凝胶由末端具有环氧基的星状聚乙二醇衍生物组成。
然而，在这些方法中，生物分子被共价固定到基质上。即，基质或生物分子应具有附着于其上的反应官能团。此外，共价键可在严格的反应条件下形成。进一步的，很难控制反应条件并且操作很复杂。此外，在反应完成后必须除去未反应的反应物质。
本发明人进行了研究并且发现了将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法，该方法提供可有效用于靶分子分析的高品质微阵列。
发明概述
本发明提供将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法。
本发明也提供根据上述方法产生的微阵列。
根据本发明的一个方面，提供了将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法，包括：提供附着有第一官能团(first functional group)的固体基质，该第一官能团具有氢键供给能力；以及使具有氢键接受能力的化合物和用第二官能团进行功能化(functionalize)的生物分子的混合物，与基质的表面进行反应，该第二官能团具有氢键供给能力，以便于将生物分子非共价地固定到基质上。
附图简述
通过详细描述其例证性的实施方案，并参考下列附图，上述的和本发明的其他特征和优点将更为明显，其中：
图1至3是说明分别利用浓度为0.4mM和0.6mM的聚乙二醇(PEG)所产生的微阵列的荧光测量结果的图像；以及
图4是说明根据本发明实施方案的方法所产生的在硅晶片(silicon wafer)上固定有探针多核苷酸的微阵列和对照微阵列的荧光强度的图表。
发明详述
根据本发明的实施方案，提供将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法，包括：提供附着有第一官能团的固体基质，该第一官能团具有氢键供给能力；以及使具有氢键接受能力的化合物和用第二官能团进行功能化的生物分子的混合物，与基质的表面进行反应，该第二官能团具有氢键供给能力，以便于将生物分子非共价地固定到基质上。
具有氢键供给能力的第一官能团与具有氢键供给能力的第二官能团可以是不同或相同的。具有氢键供给能力的第一官能团和具有氢键供给能力的第二官能团可分别选自氨基(amino group)、硫醇基(thiol group)和羟基(hydroxyl group)，但不限于此。具有氨基的化合物的具体实例包括，但不限于γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane，GAPS)、γ-氨基丙基二乙氧基硅烷(aminopropyltdiethoxysilane，GAPDES)、以及氨基己基(aminohexyl group)。可以通过将第一官能团，例如氨基、硫醇基和羟基导入到例如乙酰氯硅烷(acetylchloride silane)、无水硅烷(anhydrous silane)、磺酰氯硅烷(sulfonylchloride silane)和异硫氰酸硅烷(isothiocyanate silane)等涂覆材料中而得到具有第一官能团的化合物。这种导入方法是本领域公知的，并且本领域的普通技术人员可容易地进行这种方法。
在本发明的实施方案中，具有氢键接受能力的化合物指包含高负电性(high electronegativity)原子，例如氮原子、氧原子和硫原子的分子，因此其可供给形成氢键所必需的电子。所述化合物的实例包括聚乙二醇(PEG)或其衍生物以及聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)或其衍生物。此外，PEG或其衍生物，或聚乙烯亚胺或其衍生物各自的使用浓度可为0.4至6.0mM，并且分子量可以是200至1,000,000 Da，优选为200至100,000 Da，更优选为200至10,000 Da。在本发明例证性的实施方案中，PEG的使用浓度为6.0mM并且分子量为10,000Da。
在本发明的实施方案中，不特异地限定固体基质，并且其可以是能提供表面的任何固体基质。固体基质可由塑胶材料形成，例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯(polystyrene)和聚氨脂(polyurethane)、玻璃、硅晶片，及其修饰物。固体基质可本身具有或通过化学或物理处理(例如涂覆)而具有第一官能团。
生物分子是来源于生物体的化合物或其合成化合物。生物分子可选自核酸、蛋白质、多糖，及其组合。优选地，生物分子是核酸。核酸的实例可包括DNA和RNA。通常，待固定于固体基质上的生物分子特异地与待分析的靶分子起反应。例如，核酸可通过杂交反应特异地与具有互补核苷酸序列的靶核酸起反应。蛋白质可通过抗原-抗体反应、配体和受体之间的相互作用或酶和底物之间的相互作用而特异地与靶分子起反应。多糖可特异地被能够识别多糖的抗体或蛋白质(例如凝集素)所识别。利用可检测生物分子和靶分子之间特异的相互作用的检测系统，根据本发明方法产生的微阵列可用于各种分析。
用于固定作用的生物分子的浓度可根据反应条件和所获得数据的类型而不同。即，不特别地限定生物分子的浓度。在本发明例证性的实施方案中，DNA的浓度范围为20至100μM，但不限于此。
根据本发明实施方案的固定化方法可用于产生DNA或蛋白质微阵列的传统方法。一个传统方法是利用光刻法(photolithography)产生微阵列的方法。这种光刻法包括用以可除去的保护基团保护的单体涂覆基质表面，将该表面的预定区域暴露于能量源以除去保护基团，以及将用可除去的保护基团保护的第二单体偶联到第一单体上，并重复上述暴露和偶联，从而产生出多核苷酸微阵列(光刻法)。在该方法中，通过一个接一个地延伸单体来合成多核苷酸，从而实现多核苷酸的固定。在通过定点法产生微阵列的方法中，将预先合成的多核苷酸固定到基质上的预定区域中。这些产生微阵列的方法在例如，美国专利号5,744,305，5,143,854和5,424,186中有描述。这些专利所公开的内容在此全部引入作为参考，其中描述了多核苷酸微阵列及其产生方法。
根据本发明的另一个实施方案，提供根据上述方法产生的微阵列。
通过提供的实施例来更详细地描述本发明。这些实施例只为例证说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过使聚乙二醇和用氨基在其5’端进行功能化的DNA的混合物与用氨基涂覆的玻璃基质的表面起反应来产生DNA微阵列。
在该实施例中，使PEG和用氨基在其5’端进行功能化的DNA的混合物与用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)涂覆的玻璃基质的表面起反应，以产生具有以点(spot)排列的DNAs的DNA微阵列。
首先，使用可购自Dow Coring(www.corning.com)的Cat no.40004作为用GAPS涂覆的玻璃基质。将用氨基己基在其5’端进行功能化的探针核苷酸(SEQ ID Nos.1至10)分别以20μM的浓度溶于在含有50％DMSO的0.1MNaHCO3(pH9)中的6mM PEG(购自Aldrich，Mw10,000)溶液中。待固定的探针多核苷酸由完全匹配的序列(野生型探针)和错配序列(突变型探针)组成，其中完全匹配的序列与年轻人的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of theyoung)基因MODY1的外显子7至10的特定区域互补，而错配序列除了一个核苷酸之外与野生型探针的序列互补。
表1.探针多核苷酸的名称和序列号(SEQ ID No)
  探针位置   野生型探针序列   突变型探针序列
  MO1E07-02rwp1   SEQ ID NO.1   SEQ ID NO.2
  MO1E07-03rwp1   SEQ ID NO.3   SEQ ID NO.4
  MO1E08-01rwp1   SEQ ID NO.5   SEQ ID NO.6
  MO1E09-01rwp1   SEQ ID NO.7   SEQ ID NO.8
  MO1E10-01rwp1   SEQ ID NO.9   SEQ ID NO.10
利用Pix5500spotterTM点样仪(购自Cartesian)，将所获得的探针多核苷酸溶液分别以每点500pl点样(spot)到玻璃基质上。然后，在恒定温度和湿度的室中，以70℃和30％的湿度，进行固定反应1个小时。反应完成后，用蒸馏水洗涤玻璃基质，并且用无水丁二酸(封闭剂)保护基质上残留的氨基。然后用乙醇洗涤玻璃基质，并且旋转干燥以获得具有被固定的探针多核苷酸的微阵列。所获得的微阵列分别具有相互之间以300μm间隔排列的60个点。
实施例2：利用根据本发明实施方案的方法所产生的微阵列来分析靶核酸。
在该实施例中，利用在实施例1中所产生的探针多核苷酸微阵列进行探针多核苷酸和靶核酸之间的杂交反应，然后根据杂交的结果，评估根据本发明实施方案的方法所产生的微阵列的品质。
首先，扩增靶DNAs。利用分别具有SEQ ID Nos.11至24的14个寡核苷酸作为引物，并利用分离自人血液的gDNA作为模板进行PCR，以获得包含MODY1的外显子7至10的多核苷酸。
PCR的条件如下：将0.2μl野生型基因组DNA，各200μM的dATP、dGTP、dCTP，40μM dTTP，160μM Cy3-标记的dUTP(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)，和200nM的相应于外显子和启动子的10个区域的10个多重PCR组(multiple PCR sets)混合在一起。然后，进行40个循环的PCR，每个循环包括在95℃变性30秒，在64℃退火10秒，以及在72℃延伸3分钟。利用Qiagen试剂盒纯化所得到的PCR产物，然后选择A260/A550比率为1.0至3.5的PCR产物用于后续的步骤。
用0.5U的DNase I(Boehringer Mannheim，曼海姆，德国)在37℃将纯化的PCR产物切成片段，反应进行10分钟。然后，向产物加入终止混合物(20mM EDTA，pH8.0-1％SDS-0.2M NaCl)以终止DNase I的消化反应。接着，调节切成片段的产物至浓度为150至187.5nM，在94℃变性5分钟，并在冰上放置2分钟进行冷却。将产物分别与相同量的杂交缓冲液(6×SSPE-0.1％Triton X-100)混合，然后应用于从实施例1获得的微阵列。分别将微阵列在32℃孵育12至16小时，然后用洗涤缓冲液I(6×SSPE-Triton X-1000.005％)洗涤5分钟，再用洗涤缓冲液II(3×SSPE-Triton X-1000.005％)洗涤5分钟。随后，微阵列在室温干燥15分钟，利用GenePix 4000B scannerTM扫描仪(AxonInstruments)在532nm处成像。利用GenePix Pro softwareTM软件(AxonInstruments，Union City，CA)分析所获得的图像。
分析结果如图1和表2所示。对5个微阵列进行实验，每个微阵列上固定有如表1所列出的野生型和突变型探针(每种探针3个点)。所获得的图像和荧光强度数据如图1和表2所示。图1表明，固定有探针多核苷酸的5个微阵列S1到S5(在实施例1中获得)在与靶核酸杂交后，扫描获得的荧光图像，其中在图1的上部分别指出序列号。在图1中，每个微阵列的上一排点和下一排点分别相应于PEG浓度0.4mM和6.0mM。表2显示在532nm处测量的图1中点的荧光强度。利用浓度低至0.4mM的PEG所获得点用作对照，因为很难获得与利用PEG浓度6.0mM所获得的点具有相似的固定探针多核苷酸密度的点。
Figure C20051007412200091
如表2所示，利用PEG浓度6.0mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是6774，而利用PEG浓度0.4mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是2683。此外，利用PEG浓度6.0mM所获得的微阵列上的点的荧光强度与利用PEG浓度0.4mM所获得的微阵列上的点的荧光强度的比率是2.87。因此，当根据本发明的实施方案产生微阵列时，荧光强度是与所使用的PEG浓度直接成比例的。就是说，利用浓度为6.0mM的PEG的情况，可获得比利用浓度为0.4mM的PEG的情况高大约3倍的荧光强度。因此，证实可通过用PEG固定探针来增加荧光强度的灵敏性。PEG浓度和荧光强度之间的比例关系可以维持到PEG浓度8mM，高于此浓度时，在点样期间针孔被堵塞，从而阻碍了实际应用(数据未显示)。
为了证实在利用根据本发明实施方案的方法所产生的微阵列对靶核酸进行的分析中，探针可特异地与靶核酸起反应，获得野生型探针(wp)的荧光强度与突变型探针(mp)的荧光强度的比率。结果显示在表3中。
Figure C20051007412200111
野生型探针(wp)的荧光强度与突变型探针(mp)的荧光强度的比率，即wp/mp，对于利用PEG浓度0.4mM的点是8.05，而对于利用PEG浓度6.0mM的点是11.15，这比前者的比率8.05高出大约1.31倍。这证明当用于固定探针核苷酸的PEG的浓度变高时，可以以增加的特异性检测靶核酸。
根据实施例1和2中，利用将探针核苷酸以简单的方式非共价地固定到玻璃基质上的方法所得到的结果，即使不使用将探针核苷酸共价地固定到玻璃基质上的传统方法，也可以提供具有高分析灵敏性和特异性的微阵列。
实施例3：PEG浓度对微阵列的影响
在该实施例中，以与实施例1和2中相同的方式产生探针核苷酸阵列，并进行杂交反应，不同的是改变了待固定的探针核苷酸的序列。所述探针核苷酸具有SEQ ID No.25，靶多核苷酸具有与SEQ ID No.25完全匹配的多核苷酸序列。
结果是，利用PEG浓度0.4mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是7,700，而利用PEG浓度6.0mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是15,000。图2和3是表明分别利用PEG浓度0.4mM和6.0mM所产生的微阵列的荧光检测结果的图像。
这证明当用于固定探针核苷酸的PEG的浓度变高时，可检测到的荧光强度变高。
实施例4：通过使PEG和用氨基在其5’端进行功能化的DNA的混合物与硅晶片的表面起反应来产生DNA微阵列
在该实施例中，以与实施例1中相同的方式来产生微阵列，不同的是用涂覆了GAPS的硅晶片(购自LG Siltron：用硼浸润的P型硅晶片)作为固体基质。然后在每个微阵列上进行与靶核酸的杂交，并且以与实施例2中相同的方式测量荧光强度。使用与实施例3中相同的探针和靶多核苷酸。
如下进行在硅晶片上涂覆GAPS。利用旋转涂层仪(spincoater)型号CEE70TM(购自CEE)将GAPS的乙醇溶液(20％(v/v))旋转涂覆(spin-coat)到硅晶片上。旋转涂覆过程包括以500rpm/10秒起始涂覆，并且主要在2,000rpm/10秒进行涂覆。完成旋转涂覆后，将基质固定在聚四氟乙烯(Teflon)晶片载体上以在120℃恢复(cure)40分钟。然后将基质在水中浸泡10分钟，超声波洗涤15分钟，并且再次在水中浸泡10分钟。再旋转干燥基质。干燥后，将基质切割成正方形(square)或矩形(rectangular)以用于试验。所有的实验在已经除去大部分尘埃颗粒的净化室-级别1,000中进行。
荧光强度的结果显示在图4中。图4是表明分别利用浓度为0.4mM和6.0mM的PEG将探针多核苷酸固定到硅晶片上的微阵列的荧光强度图表。如图4中所表明的，证实即使利用PEG将探针非共价地固定到基质上也可获得高的荧光强度，并且荧光强度与所使用的PEG的浓度成比例关系。
实施例5：探针多核苷酸的浓度对荧光强度的影响
在该实施例中，以与实施例1和2中相同的方式产生探针核苷酸阵列，并进行杂交反应以及检测荧光强度，不同的是改变了待固定的探针多核苷酸的类型和浓度。在固定化反应中，使用浓度为20μM或100μM并具有SEQ IDNo.26的探针多核苷酸。
在分别利用浓度为20μM或100μM的探针多核苷酸的情况中，荧光强度分别为12,238和8,321。
根据实施例5的结果，证实利用浓度为大约20μM的探针多核苷酸可得到最佳的荧光强度。通常，当探针多核苷酸是共价固定的时，其所使用的浓度高于20μM。因此，根据本发明实施方案的方法可减少在固定中使用的探针多核苷酸的量。
根据本发明实施方案的将生物分子固定到固体基质上的方法，可以在不使用具有强反应官能团的化学物质的情况下，将探针多核苷酸固定到固体基质上。因此，本方法可提供简化的工艺和较低的成本。另外，本方法可提供在反应的灵敏度和特异性方面高品质的微阵列。
虽然，本发明已经参考其例证性的实施方案进行特别地显示和描述，本领域的普通技术人员将理解可在形式或细节中产生各种变化，而不背离如下列权利要求所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.Ltd.)
<120>用于将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法和根据该方法产生的微阵列
<130>PN052697
<160>26
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>野生型探针核苷酸
<400>1
ctcctggaag ggca                                                14
<210>2
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变型探针核苷酸
<400>2
agctcctaga aggg                                                14
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>野生型探针核苷酸
<400>3
aggcatactc attgtca                                            17
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变型探针核苷酸
<400>4
aggcatactg attgtca                                            17
<210>5
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>野生型探针核苷酸
<400>5
ccaaagcggc cac                                                13
<210>6
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变型探针核苷酸
<400>6
ccaaagtggc cac                                                13
<210>7
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>野生型探针核苷酸
<400>7
acgatgacgt tggt                                               14
<210>8
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变型探针核苷酸
<400>8
acgatgatgt tggt                                               14
<210>9
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>野生型探针核苷酸
<400>9
tgggggatgg cag                                                    13
<210>10
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变型探针核苷酸
<400>10
gggggacggc aga                                                    13
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
cagcaacaca acatccccca gagg                                        24
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
tacagcaacc accaaggcca aatct                                        25
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
gggcctgggc agtccgatga t                                            21
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
aggggagggt tcctgggtct gtgta                                        25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
agaatgtttg cagcgagggg tgtcc                                25
(210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
agcggcccta ggatcatctc aaaag                                25
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
atgcccatct ccaacccaca actca                                25
<210>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
gcagggaaaa gtgaccaagc caata                                        25
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
gcagccatga acggcgagga g                                            21
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
aggtaaggcg gccgggtgag aac                                         23
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
aggtaaggcg gccgggtgag aac                                            23
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
tgtggcgacg cgctaaggcc ag                                             22
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggcagggtgg gaggggagaa c                                              21
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
gcgtcagggt gcagtgggat gt                                            22
<210>25
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针核苷酸
<400>25
tgttctcttg tcttg                                                    15
<210>26
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针核苷酸
<400>26
cagctggctc agtt                                                     14

Claims (4)

1. 将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法，包括：
提供附着有第一官能团的固体基质，该第一官能团具有氢键供给能力；以及
使具有氢键接受能力的化合物和用第二官能团进行功能化的生物分子的混合物与所述基质的表面进行反应，以便于将所述生物分子非共价地固定到基质上，其中该第二官能团具有氢键供给能力，
其中所述固体基质是用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)涂覆的，所述具有氢键接受能力的化合物是聚乙二醇，而所述生物分子是用氨基己基在其5’端进行功能化的DNA，其中所述聚乙二醇的浓度范围为0.4至8.0mM。
2. 权利要求1的方法，其中所述聚乙二醇的分子量为200至1,000,000Da。
3. 权利要求1的方法，其中所述DNA的浓度范围为20至100μM。
4. 根据权利要求1的方法所产生的微阵列。
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