JP2001178466A - Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片固定固相担体の製造方法および核酸断片試料の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、予め調製したＤＮＡ断片を
迅速な反応によって安定に結合させることが可能な固定
方法、ＤＮＡ断片固定固相担体、及び核酸断片の検出方
法を提供すること。 【解決手段】 表面に反応性基が導入された固相担体
に、Ｘ¹−Ｌ−Ｘ²［Ｘ¹は、固相担体表面の反応性基と
反応する反応性基を表し；Ｘ²は、固相担体表面の反応
性基には反応性を示さない反応性基を表し；そして、Ｌ
は、二価の連結基を表す］で表される反応性化合物を接
触させることによって、−Ｌ−Ｘ²基を該固相担体表面
に導入する工程；そして、該固相担体上の−Ｌ−Ｘ²基
に、一方の末端に反応性基を有するＤＮＡ断片を接触さ
せることによって、その反応性基と−Ｌ−Ｘ²基とを反
応させて、ＤＮＡ断を−Ｌ−結合基を介して固相担体表
面に結合させる工程を含むことを特徴とするＤＮＡ断片
固定固相担体の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に特に有用な多数のＤＮＡ断片や
オリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高密度アレ
イ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断片の固相
担体表面への固定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでいる。ＤＮＡチップは、
スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列
させたマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多
型性等の同時解析に非常に有用である。このＤＮＡチッ
プを用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子
にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の
開発等に新しい手段を提供するものとして期待されてい
る。

【０００３】ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、
ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーションによって決定する方法（ＳＢＨ：ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が
考案されたことに始まる（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１
９８９））。ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列
決定法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化に
は至らなかった。

【０００４】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００５】しかし、ＤＮＡチップ作製技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの作製技
術が必要とされる。作製されたＤＮＡチップ上のＤＮＡ
断片は、一般的には、標識した試料核酸断片とのハイブ
リダイゼーションによって検出される。

【０００６】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め調製したＤＮＡ断片を固相担
体表面に固定する方法とが知られている。オン・チップ
法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用
と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術
および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリッ
クスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マスキ
ング技術」という。）が代表的である。

【０００７】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法は、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に
応じて下記の方法が知られている。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し、
ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させるのが
一般的である。また、固相担体表面の処理方法として、
アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシラン
カップリング剤を用いる方法も利用されている（Ｇｅ
ｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５（１９９
４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、
共有結合により固相担体表面に導入されるため、ポリ陽
イオンによる場合と比較して安定に固相担体表面に存在
する。

【０００８】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
−クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したス
ライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水
素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に
行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡが固定されることは、ＤＮＡと標識した試料
核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上
に直接繋がる。

【０００９】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５４
６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスライ
ドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネ
ート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応
させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基
導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られてい
る。上記の二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷電を
利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相担体
表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在させる
方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの
反応が遅く、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用
いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低
い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有す
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によって安
定に結合させることが可能な固定方法、ＤＮＡ断片固定
固相担体、および核酸断片の検出方法を提供すること
を、その課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、表面に反応性
基が導入された固相担体に、Ｘ¹−Ｌ−Ｘ²［Ｘ¹は、固
相担体表面の反応性基と反応する反応性基を表し；Ｘ²
は、固相担体表面の反応性基には反応性を示さない反応
性基を表し；そして、Ｌは、二価の連結基を表す］で表
される反応性化合物を接触させることによって、−Ｌ−
Ｘ²基を該固相担体表面に導入する工程；そして、該固
相担体上の−Ｌ−Ｘ²基に、一方の末端に反応性基を有
するＤＮＡ断片を接触させることによって、その反応性
基と−Ｌ−Ｘ²基とを反応させて、ＤＮＡ断片を−Ｌ−
結合基を介して固相担体表面に結合させる工程を含むこ
とを特徴とするＤＮＡ断片固定固相担体の製造方法にあ
る。

【００１２】本発明のＤＮＡ断片固定固相担体の製造方
法の好ましい態様は以下の通りである。 （イ）Ｘ¹およびＸ²が、互いに独立に、マレイミド基、
ハロゲン原子、イソシアン酸エステル基、イソチオシア
ン酸エステル基、スクシンイミドオキシ基、アルデヒド
基、カルボン酸基、および−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³［Ｒ¹、Ｒ
²およびＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が
１乃至６のアルキル基、および炭素原子数が６乃至２０
のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基を
表す］からなる群より選ばれる原子もしくは基である。 （ロ）Ｘ¹が、ビニル基もしくは塩素原子であり、そし
て、Ｘ²が、イソシアン酸エステル基もしくはスクシン
イミドオキシ基である。 （ハ）固相担体上の反応性基が、アミノ基もしくはメル
カプト基であり、そして、ＤＮＡ断片が有する反応性基
が、アミノ基もしくはメルカプト基である。 （ニ）アミノ基もしくはメルカプト基が導入された固相
担体が、固相担体表面に、アミノ基もしくはメルカプト
基を有するシランカップリング剤を接触させることによ
って作製されたものである。 （ホ）ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知である。

【００１３】本発明は、また、上記記載の本発明の製造
方法によって製造されたＤＮＡ断片固定固相担体にもあ
る。

【００１４】本発明は、さらに、本発明のＤＮＡ断片固
定固相担体に、蛍光物質で標識した核酸断片試料を溶解
あるいは分散してなる水性液を点着した後、インキュベ
ートして、該ＤＮＡ断片固定固相担体に固定されている
ＤＮＡ断片と核酸断片試料とで形成されたハイブリッド
ＤＮＡを検出することを特徴とする、該ＤＮＡ断片固定
固相担体に固定されているＤＮＡ断片に対して相補性を
有する核酸断片の検出方法にもある。

【００１５】

【発明の実施の形態】図１に、本発明の代表的なＤＮＡ
断片固定固相担体の製造方法および代表的なＤＮＡ断片
固定固相担体を模式的に示す。本発明のＤＮＡ断片固定
固相担体の製造方法は、（１）固相担体１の表面に反応
性基（Ｒ）が導入された固相担体（Ａ）に、下記一般式
（Ｉ）で表される非対称性の反応性化合物を接触させる
ことによって、−Ｌ−Ｘ²基を固相担体表面に導入する
工程、および（２）固相担体上の−Ｌ−Ｘ²基に、一方
の末端に反応性基（Ｚ）を有するＤＮＡ断片を接触さ
せ、その反応性基と−Ｌ−Ｘ²基とを反応させて、ＤＮ
Ａ断片を固相担体表面に結合させる工程を含む。

【００１６】

【化１】（Ｉ） Ｘ¹−Ｌ−Ｘ²

【００１７】一般式（Ｉ）中、Ｘ¹およびＸ²は、互いに
異なる反応性基を表す。即ち、Ｘ¹は、固相担体表面の
反応性基（Ｒ）と反応する反応性基であって、ＤＮＡ断
片が有する反応性基（Ｚ）とは反応しない反応性基を表
し、Ｘ²は、固相担体上の反応性基（Ｒ）とは反応せ
ず、ＤＮＡ断片が有する反応性基（Ｚ）とのみ反応する
反応性基を表す。Ｘ¹およびＸ²がとり得る基もしくは原
子は、反応性基（Ｒ）とＸ¹との反応の種類、Ｘ²と反応
性基（Ｚ）との反応の種類、およびこれらの組み合わせ
によって決定される。Ｘ¹およびＸ²は、上記で説明した
性質を有する反応性基であるため、固相担体表面上に導
入された−Ｌ−Ｘ²基のＸ²もまた、固相担体上の反応性
基（Ｒ）と結合することがない。即ち、一般式（Ｉ）が
固相担体表面に対して架橋構造を形成することがない。

【００１８】Ｘ¹およびＸ²は、互いに独立に、マレイミ
ド基、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、スルホ
ニルクロリド基、ハロホルミル基、イソシアン酸エステ
ル基、イソチオシアン酸エステル基、スクシンイミドオ
キシ基、アルデヒド基、カルボン酸基、および−ＣＲ¹
＝ＣＲ²Ｒ³基からなる群より選ばれる原子もしくは基で
あることが好ましい。スクシンイミドオキシ基は、−Ｏ
ＳＯ₂−炭素原子数が１乃至６のアルキル基、−ＯＳＯ₂
−炭素原子数が６乃至２０のアリール基、−ＯＳＯ
₃Ｍ、−ＯＣＯ−炭素原子数が１乃至６のアルキル基、
−ＯＣＯ−炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル
基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原
子数が７乃至２６のアラルキル基、−ＮＨ−炭素原子数
が１乃至６のアルキレン基−ＯＳＯ₃Ｍ、および四級ピ
リジニウム基からなる群より選ばれる置換基を有してい
てもよい。四級ピリジニウム基は、さらに置換基を有し
ていてもよい。

【００１９】上記アルキル基、アリール基、アルキレン
基、アラルキル基およびハロゲン化アルキル基は、さら
に置換されていてもよい。四級ピリジニウム基が有して
いてもよい置換基としては、−アルキレン基−ＳＯ₃ ^-お
よび−ＮＨ−アルキレン基−ＳＯ₃ ^- を挙げることがで
きる。これらのアルキレン基としては、メチレン基もし
くはエチレン基であることが好ましい。四級ピリジニウ
ム基は、ハロゲン化酸塩を形成していてもよく、塩酸塩
であることが特に好ましい。Ｍは、水素原子、アルカリ
金属原子（Ｎａ、Ｋ等）および置換基を有していてもよ
いアンモニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは
基を表す。ここで、アンモニウム基とは、一般式（Ｉ）
の化合物がアンモニウム塩として存在する、あるいは水
溶液でアンモニウムイオンとして存在するためのその基
を表し、以下、カチオンを省略して示す。置換基を有し
ていてもよいアンモニウム基としては、 ＮＨ（Ｃ
₂Ｈ₅）₃、ＮＨ（ＣＨ₂ＣＨＯＨＣＨ₃）₃、ＮＨ₃Ｃ
₂Ｈ₅、ＮＨ₃（ｎ−Ｃ₃Ｈ₇）、ＮＨ₃（ｎ−Ｃ₄Ｈ₉）、Ｎ
Ｈ₂（Ｃ₂Ｈ₂ＯＨ）₂ 、ＮＨ₂（Ｃ₂Ｈ₅）₂ 、ＮＨ₂（ｉ−
Ｃ₃Ｈ₇）₂ 、ＮＨ₂（ｎ−Ｃ₃Ｈ₇）₂ 、ＮＨ₂ＣＨ₃（ｎ
−Ｃ₄Ｈ₉） 、ＮＨ₂（ＣＨ₃）₂ 、ＮＨ₂（ｎ−Ｃ₄Ｈ₉）
₂ 、ＮＨＣ₂Ｈ₅（ｉ−Ｃ₃Ｈ₇）₂、もしくはＮＨＣＨ
₃（ｎ−Ｃ₄Ｈ₉）₂ を挙げることができる。Ｍは、ナト
リウム原子、もしくはカリウム原子であることが特に好
ましい。

【００２０】図１の固相担体（Ｂ２）には、Ｘ¹が−Ｃ
Ｒ¹＝ＣＲ²Ｒ³基である場合の反応例を示す。即ち、反
応性基（Ｒ）を−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³基に付加反応するこ
とによって、−Ｌ−Ｘ²基を固相担体１上に導入する。
ここで、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、互いに独立に、水素原
子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素原子
数が６乃至２０のアリール基からなる群より選ばれる原
子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至６のアルキル
基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ
−ブチル基、もしくはｎ−ヘキシル基であることが好ま
しく、メチル基であることが特に好ましい。上記アリー
ル基としては、フェニル基もしくはナフチル基であるこ
とが好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。
Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、共に、水素原子であることが好
ましい。上記アルキル基およびアリール基は、さらに置
換されていてもよい。Ｘ¹およびＸ²は、共に−ＣＲ¹＝
ＣＲ²Ｒ ³基であってもよい。このような場合しては、Ｘ
¹（もしくはＸ²）がビニル基であり、そして、Ｘ²（も
しくはＸ¹）がフェニルビニル基（Ｒ³：フェニル基）で
ある例を挙げることができる。

【００２１】Ｘ¹およびＸ²は、互いに独立に、ビニル
基、ハロゲン原子、イソシアン酸エステル基、置換基を
有していてもよいスクシンイミドオキシ基、アルデヒド
基もしくはカルボン酸基であることが好ましく、ビニル
基、塩素原子、イソシアン酸エステル基もしくは置換基
を有していてもよいスクシンイミドオキシ基であること
が特に好ましい。

【００２２】Ｌは、二価の連結基を表す。二価の連結基
は、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基、炭素原子数
が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子数が３乃至１６
の脂肪族環基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン
基、Ｎ、ＳおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子
を１乃至３個含む炭素原子数が２乃至２０の複素環基、
−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＳＯ₃−、−
ＮＲ¹¹−、−ＣＯ−、−ＣＯ₂−、およびこれらの組み
合わせから群より選ばれる基を一つあるいは複数個組み
合わせてなる基であることが好ましい。Ｒ¹¹は、水素原
子、炭素原子数が１乃至１５のアルキル基、炭素原子数
が６乃至２０のアリール基、および炭素原子数が１乃至
６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２１のアラ
ルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基である
ことが好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至
６のアルキル基であることがさらに好ましく、水素原
子、メチル基もしくはエチル基であることが特に好まし
い。Ｌが−ＮＲ¹¹−、−ＳＯＮＲ¹¹−、−ＣＯＮＲ
¹¹−、−ＮＲ¹¹ＣＯＯ−、および−ＮＲ¹¹ＣＯＮＲ¹¹−
からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせてなる
基である場合には、それらのＲ¹¹同士が結合して環を形
成していてもよい。

【００２３】上記アルキレン基、アルケニレン基、脂肪
族環基、アリーレン基、Ｒ¹¹のアルキル基、Ｒ¹¹のアリ
ール基、およびＲ¹¹のアラルキル基は、置換されていて
もよい。このような置換基としては、水酸基、炭素原子
数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６の
アルケニル基、炭素原子数が２乃至７のカルバモイル
基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が
２乃至７のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のア
リール基、スルファモイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ
塩等）、スルホ基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カ
ルボン酸基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン
原子、炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基、炭素原
子数が６乃至２０のアリーレン基、スルホニル基、およ
びこれらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もし
くは基を挙げることができる。

【００２４】Ｌの好ましい具体例を以下に示す。但し、
ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であること
が好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃
至６の整数であり、２もしくは３であることが好まし
い。ｍ、ｎおよびｐは、それぞれ、１乃至６の整数であ
ることが好ましく、ｋは、０または１であることが好ま
しい。

【００２５】

【化２】

【００２６】

【化３】

【００２７】Ｌとしては、上記記載の二価の連結基の他
に、上記アルキレン基の水素原子がビニルスルホニル基
によって置換された基であることも好ましい。

【００２８】以下、本発明で好ましく用いられる反応性
化合物の具体例を示す。

【００２９】

【化４】

【００３０】

【化５】

【００３１】

【化６】

【００３２】

【化７】

【００３３】

【化８】

【００３４】

【化９】

【００３５】

【化１０】

【００３６】

【化１１】

【００３７】本発明において、一般式（Ｉ）で表される
反応性化合物は、二種類以上を混合して用いてもよい。

【００３８】一方の末端に反応性基（Ｚ）を有するＤＮ
Ａ断片は、図１において、２で表される化合物である。
クロスリンカー（Ｙ）は、必須ではないが、２の調製の
都合上、反応性基（Ｚ）とリン酸エステル基との間に存
在させるのが一般的である。−リン酸エステル基−ＮＮ
ＮＮ・・・ＮＮは、ＤＮＡ断片を表す。Ｒ⁴は、反応性
基（Ｒ）とＸ¹との反応によって、Ｚ¹は、Ｘ²と反応性
基（Ｚ）との反応によってそれぞれ決定される基であ
る。

【００３９】固相担体としては、疎水性の担体、あるい
は親水性の低い板状の担体であることが好ましい。ま
た、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであって
も好ましく用いることができる。固相担体の材質として
は、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしく
はニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、
酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネー
ト、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリ
マー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミ
ックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織
布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物
質などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大き
さは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好まし
く、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好まし
い。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリコンである
ことが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気
化学的方法による解析の容易さによるものである。固相
担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範囲にあるこ
とが好ましい。

【００４０】固相担体は、ＤＮＡ断片を固定させるた
め、その表面がポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等である
ことが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに
好ましい）で被覆処理（この場合、固相担体表面へ導入
される反応性基（Ｒ）は、アミノ基である）、または固
相担体表面へ導入される活性基（Ｒ）を有するシランカ
ップリング剤によって接触処理されていることが好まし
く、反応性基（Ｒ）を有するシランカップリング剤によ
って接触処理されていることが特に好ましい。反応性基
（Ｒ）としては、アミノ基もしくはメルカプト基である
ことが好ましい。ポリ陽イオンによる場合には、アミノ
基が静電結合によって固相担体表面に導入されるのに対
して、シランカップリング剤による場合には、共有結合
によって導入されるため、アミノ基もしくはメルカプト
基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基およびメ
ルカプト基の他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボ
キシル基あるいは水酸基も好ましく導入することができ
る。

【００４１】アミノ基を有するシランカップリング剤と
しては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−
β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシ
ランあるいはＮ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピ
ルメチルジメトキシシランを用いることが好ましく、γ
−アミノプロピルトリエトキシシランを用いることが特
に好ましい。

【００４２】ポリ陽イオンを用いる処理に、シランカッ
プリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。疎
水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片との
静電的相互作用を促進することができる。ポリ陽イオン
処理がされた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する
親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けて
もよい。このような層を設けることによって、ポリ陽イ
オン処理がされた固相担体の凹凸を軽減することができ
る。固相担体の種類によっては、その担体中に親水性高
分子等を含有させることも可能であり、このような処理
を施した固相担体も好ましく用いることができる。

【００４３】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００４４】ＤＮＡ断片の一方の末端には、反応性基
（Ｚ）を導入することが好ましい。前記記載の図１で
は、反応性基（Ｚ）を有するＤＮＡ断片を示した。この
ような反応性基（Ｚ）は、アミノ基、メルカプト基、イ
ミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカ
ルボニル基、もしくはカルボキシイミド基であることが
好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。クロス
リンカー（Ｙ）は、アルキレン基あるいはＮ−アルキル
アミノ−アルキレン基であることが好ましく、ヘキシレ
ン基あるいはＮ−メチルアミノ−ヘキシレン基であるこ
とがさらに好ましく、ヘキシレン基であることが特に好
ましい。

【００４５】ＤＮＡ断片が有する反応性基（Ｚ）および
固相担体表面の反応性基（Ｒ）の種類によって、使用し
うる前記記載の反応性化合物は異なるが、反応性基
（Ｚ）および固相担体表面の反応性基（Ｒ）が何れもア
ミノ基である場合には、前記記載の（Ａ１）乃至（Ａ
３）の内の何れかの反応性化合物を用いることが好まし
く、反応性基（Ｚ）がメルカプト基であって、反応性基
（Ｒ）がアミノ基である場合には、（Ｂ１）乃至（Ｂ１
４）の内の何れかの反応性化合物を用いることが好まし
い。

【００４６】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００４７】図１の固相担体（Ｂ１）もしくは（Ｂ２）
の表面に反応性基（Ｚ）を有するＤＮＡ断片２を点着さ
せると、Ｘ²と該ＤＮＡ断片２との反応が起こるが、固
相担体（Ｂ１）もしくは（Ｂ２）の表面には該ＤＮＡ断
片２が結合していない未反応のＸ²も存在する。このよ
うなＸ²は、標識された核酸断片試料とのハイブリダイ
ゼーションにおいて非特異的な反応を生じる可能性があ
り、結果的に非特異的な結合をも測定してしまうおそれ
が生じるため、予め該Ｘ²をマスク処理しておくことが
好ましい。マスク処理は、固相担体（Ｃ１）もしくは
（Ｃ２）の表面に、アミノ基もしくはメルカプト基を有
するアニオン性化合物を接触させることによって行うこ
とが好ましい。該ＤＮＡ断片２は、負の電荷を有するた
め、固相担体（Ｃ１）もしくは（Ｃ２）の表面にも負の
電荷を発生させることによって、ＤＮＡ断片２が未反応
のＸ²と反応するのを防止することができる。このよう
なアニオン性化合物としては、Ｘ²と反応し、かつ負の
電荷（ＣＯＯ^-、ＳＯ₃ ^-、ＯＳＯ ₃ ^-、ＰＯ₃ ^-、もしくは
ＰＯ₂ ^-）を有するものであれば何れのものも用いること
ができるが、アミノ酸であることが好ましく、グリシン
もしくはシステインであることが特に好ましい。また、
タウリンも好ましく用いることができる。

【００４８】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は、１０³乃至１０⁶の
範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グ
リセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさ
らに好ましく、グリセリンを用いることが特に好まし
い。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、
０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．
５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。ま
た、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相
担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度
範囲の環境に置くことも好ましい。

【００４９】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。これらの後処理は、ポリ陽イオ
ンのみによって固相担体表面を処理した場合には特に有
効である。点着後は、インキュベーションを行うことも
好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗
浄して除去することが好ましい。

【００５０】ＤＮＡ断片は、固相担体表面に対して、１
０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０^-15モルの範囲にあ
り、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にド
ットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好
ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に
好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３
００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、
１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１
乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。

【００５１】本発明のＤＮＡ断片固定固相担体の製造方
法によって製造されたＤＮＡ断片固定固相担体の寿命
は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ固定固相担体で
数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ固
定固相担体ではさらに長期間である。これらのＤＮＡ断
片固定固相担体は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配
列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原
理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダー
ゼーションである。

【００５２】標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍
光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られている
が、本発明では蛍光法を用いる。蛍光物質としては、核
酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いるこ
とができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ Ｄｙｅ^TM
シリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、
Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミノフルオレン（Ａ
ＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使
用することができる。

【００５３】試料核酸断片としては、その配列や機能が
未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用
いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調
べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離
することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除
く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤
血球を除く任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛
髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡなら
ば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出するこ
とが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮ
ＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシ
ン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）である
デオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませ
て標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとして
は、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好
ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮ
Ａ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下
であることが好ましい。尚、ＤＮＡ断片固定固相担体上
のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸
断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細
胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮ
Ａを標識することが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子
の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしく
は標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行っ
て得ることが好ましい。

【００５４】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡ断片固定固相担体上に点着す
ることによって実施することが好ましい。点着の量は、
１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブ
リダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。

【００５５】ＤＮＡ断片固定固相担体を用いるハイブリ
ダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用
量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固
定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類
により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する
必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も
十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーシ
ョンを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短
時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸
断片を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼー
ションに用いることにより、同一のＤＮＡ断片固定固相
担体上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。

【００５６】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定固相担体の作
製、およびＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）アミノ基が導入された固相担体（Ｂ１）の作製 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆固相担体（Ａ）を、クロロスルホニルイソ
シアナート（０．５ｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に
溶解したアセトニトリル溶液に２時間浸した後、取り出
し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、固
相担体（Ｂ１）を得た。 （２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３’末端および５’末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識
試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、アマ
シャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾され
たＤＮＡ断片（３’−ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧ
ＴＣＴＧＡＴＣ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に分散してなる水性液（１×１０ ^-6Ｍ、１μ
Ｌ）を、上記（１）で得た固相担体（Ｂ１）に点着し
た。直ちに、点着後の固相担体を２５℃、湿度９０％に
て１時間放置した後、この固相担体を０．１重量％ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳ
Ｃ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準
食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×
ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄
後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中
に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾
燥させ、ＤＮＡ断片が固定された固相担体（Ｃ１）を得
た。この固相担体（Ｃ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャ
ニング装置で測定したところ、３２１０であった。本発
明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライド
ガラスに固定されたことが分かる。

【００５７】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡ断片固定固相担体の作製 ３’末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定された固相担体（Ｃ１’）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５’末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧ
ＡＴＣ−５’）をハイブリダイゼーション用溶液（４×
ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μ
Ｌ）に分散させたものを、上記（１）で得た固相担体
（Ｃ１’）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保
護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で２０時間イ
ンキュベートした。次いで、このものを０．１重量％Ｓ
ＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと
０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水
溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心
し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を
蛍光スキャニング装置で測定したところ、１０７８であ
った。本発明の固定化方法によって作製されたＤＮＡ断
片固定固相担体を用いることによって、ＤＮＡ断片固定
固相担体に固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する
試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【００５８】［実施例３］ＤＮＡ断片固定固相担体の作
製、およびＤＮＡ断片の固定量の測定 クロロスルホニルイソシアナートの代わりに、スクシン
イミジル（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（０．
５ｇ）を用いる以外は、実施例１の（１）と同様にして
固相担体（Ｂ２）を作製し、これを用いる以外は実施例
１の（２）と同様の操作を行って、ＤＮＡ断片が固定さ
れた固相担体（Ｃ２）を得た。この固相担体（Ｃ２）表
面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したとこ
ろ、３２５０であった。本発明の固定化方法により、Ｄ
ＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定されたことが
分かる。

【００５９】［実施例４］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡ断片固定固相担体の作製 ３’末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例３と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定された固相担体（Ｃ２’）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 上記（１）で得た固相担体（Ｃ２’）を用いる以外は実
施例２と同様にしてスライドガラス表面の蛍光強度を蛍
光スキャニング装置で測定したところ、２３２５であっ
た。本発明の固定化方法によって作製されたＤＮＡ断片
固定固相担体を用いることによって、ＤＮＡ断片固定固
相担体に固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する試
料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【００６０】

【発明の効果】本発明の固定方法によって、固相担体表
面にＤＮＡ断片を安定かつ迅速に固定することができ
る。また、本発明の固定方法は、一般式（Ｉ）で表され
る反応性化合物が非対称型であるため、一般式（Ｉ）の
両方の反応性基が共に固相担体表面の反応性基と反応す
ることがなく、ＤＮＡ断片を効率良く固定することがで
きる。特に、固相担体表面に予めアミノ基やメルカプト
基などの反応性基をシランカップリング剤を用いて導入
した場合には、アミノ基等の固相担体表面への結合、お
よびＤＮＡ断片の結合が共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡ断片固定固相担体の作製
を可能とするものである。その一つの例として、本発明
によって作製されたＤＮＡ断片固定固相担体を用いて、
試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行うことに
より、ＤＮＡ断片固定固相担体に固定されているＤＮＡ
断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よく検出する
ことができる。また、ＤＮＡ断片を点着後、グリシン等
のアニオン性化合物で固相担体表面を処理することによ
って、試料核酸断片の非特的吸着を防ぐことができ、こ
のことは相補性を有する試料核酸断片の高感度の検出に
特に有効となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の代表的なＤＮＡ断片固定固相担体、お
よび本発明の代表的なＤＮＡ断片の固定方法を示す模式
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 須藤 幸夫 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 瀬志本 修 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA09 HA14 4B029 AA07 AA21 BB20 CC03 CC08 FA12 4B033 NA45 NB04 NB25 NB63 NC03 NC12 ND05 ND08 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR55 QR84 QS34

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面に反応性基が導入された固相担体
   に、Ｘ¹−Ｌ−Ｘ²［Ｘ ¹は、固相担体表面の反応性基と
   反応する反応性基を表し；Ｘ²は、固相担体表面の反応
   性基には反応性を示さない反応性基を表し；そして、Ｌ
   は、二価の連結基を表す］で表される反応性化合物を接
   触させることによって、−Ｌ−Ｘ²基を該固相担体表面
   に導入する工程；そして、該固相担体上の−Ｌ−Ｘ²基
   に、一方の末端に反応性基を有するＤＮＡ断片を接触さ
   せることによって、その反応性基と−Ｌ−Ｘ²基とを反
   応させて、ＤＮＡ断片を−Ｌ−結合基を介して固相担体
   表面に結合させる工程を含むことを特徴とするＤＮＡ断
   片固定固相担体の製造方法。
2. 【請求項２】 Ｘ¹およびＸ²が、互いに独立に、マレイ
   ミド基、ハロゲン原子、イソシアン酸エステル基、イソ
   チオシアン酸エステル基、スクシンイミドオキシ基、ア
   ルデヒド基、カルボン酸基、および−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³
   ［Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭
   素原子数が１乃至６のアルキル基、および炭素原子数が
   ６乃至２０のアリール基からなる群より選ばれる原子も
   しくは基を表す］からなる群より選ばれる原子もしくは
   基であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片
   固定固相担体の製造方法。
3. 【請求項３】 Ｘ¹が、ビニル基もしくは塩素原子であ
   り、そして、Ｘ²が、イソシアン酸エステル基もしくは
   スクシンイミドオキシ基であることを特徴とする請求項
   １もしくは２に記載のＤＮＡ断片固定固相担体の製造方
   法。
4. 【請求項４】 固相担体上の反応性基が、アミノ基もし
   くはメルカプト基であり、そして、ＤＮＡ断片が有する
   反応性基が、アミノ基もしくはメルカプト基であること
   を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片固定固相担体
   の製造方法。
5. 【請求項５】 アミノ基もしくはメルカプト基が導入さ
   れた固相担体が、固相担体表面に、アミノ基もしくはメ
   ルカプト基を有するシランカップリング剤を接触させる
   ことによって作製されたものであることを特徴とする請
   求項４に記載のＤＮＡ断片固定固相担体の製造方法。
6. 【請求項６】 ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知
   であるものを用いることを特徴とする請求項１に記載の
   ＤＮＡ断片固定固相担体の製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１乃至６の内の何れかの項に記載
   の方法によって製造されたＤＮＡ断片固定固相担体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のＤＮＡ断片固定固相担
   体に、蛍光物質で標識した核酸断片試料を溶解あるいは
   分散してなる水性液を点着した後、インキュベートし
   て、該ＤＮＡ断片固定固相担体に固定されているＤＮＡ
   断片と核酸断片試料とで形成されたハイブリッドＤＮＡ
   を検出することを特徴とする、該ＤＮＡ断片固定固相担
   体に固定されているＤＮＡ断片に対して相補性を有する
   核酸断片の検出方法。