JP2003212974A - 高分子薄膜、高分子薄膜の製造方法、およびバイオチップ - Google Patents
高分子薄膜、高分子薄膜の製造方法、およびバイオチップInfo
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- JP2003212974A JP2003212974A JP2002011707A JP2002011707A JP2003212974A JP 2003212974 A JP2003212974 A JP 2003212974A JP 2002011707 A JP2002011707 A JP 2002011707A JP 2002011707 A JP2002011707 A JP 2002011707A JP 2003212974 A JP2003212974 A JP 2003212974A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体適合性を付与するための組織適合剤、免
疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用な高分子薄
膜と、その製造方法、および水洗い工程等においてプロ
−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプロ
ーブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチ
ップを提供する。 【解決手段】 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発
させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着
室に導入して基材上に堆積、重合させ高分子薄膜を得る
構成の高分子薄膜の製造方法、これにより得られた高分
子薄膜、およびバイオチップとした。 【化１１】 〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＣＨ2ＮＨ2
基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれ
かは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。〕
疫、生体反応抑制剤の固定化基質として有用な高分子薄
膜と、その製造方法、および水洗い工程等においてプロ
−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプロ
ーブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチ
ップを提供する。 【解決手段】 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発
させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着
室に導入して基材上に堆積、重合させ高分子薄膜を得る
構成の高分子薄膜の製造方法、これにより得られた高分
子薄膜、およびバイオチップとした。 【化１１】 〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＣＨ2ＮＨ2
基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれ
かは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。〕
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体検査分野、医
療分野などに有用な新規な高分子薄膜、およびその製造
方法と、これを利用した遺伝子の発現、遺伝子の変異、
遺伝子の多型等の解析に特に有用なバイオチップに関す
る。
療分野などに有用な新規な高分子薄膜、およびその製造
方法と、これを利用した遺伝子の発現、遺伝子の変異、
遺伝子の多型等の解析に特に有用なバイオチップに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】医療分野等において使用する機器、例え
ばカテーテル等は、生体内に挿入され使用される。この
ように、生体内に異物である医療機器を導入することに
より、生体免疫機構、生体防御機構などとの適合性が問
題となる。
ばカテーテル等は、生体内に挿入され使用される。この
ように、生体内に異物である医療機器を導入することに
より、生体免疫機構、生体防御機構などとの適合性が問
題となる。
【０００３】例えば、血栓症は、血液採集および処理シ
ステムのような医療機器の開発、使用において、最も障
害となる問題の一つである。血液が異質の表面に接触す
るときに、体液および細胞の変化が起こる。このような
材料の生体適合性を改善するために、抗凝固剤の固定化
と、重合体表面上に生物学的に活性な抗凝血性物質を固
定化することが必要とされている。
ステムのような医療機器の開発、使用において、最も障
害となる問題の一つである。血液が異質の表面に接触す
るときに、体液および細胞の変化が起こる。このような
材料の生体適合性を改善するために、抗凝固剤の固定化
と、重合体表面上に生物学的に活性な抗凝血性物質を固
定化することが必要とされている。
【０００４】一方、細胞や組織における遺伝子発現の様
態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調
製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の
遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーショ
ンを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロッ
ト）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用い
たＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調
製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の
遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーショ
ンを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロッ
ト）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用い
たＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
【０００５】一方、遺伝子の研究の進展により解析を必
要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプ
ロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴
って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まって
いる。
要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプ
ロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴
って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まって
いる。
【０００６】このような要望に対して、最近、マイクロ
アレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。
これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異
なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまた
はバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少
量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイ
ゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検
出することである。
アレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。
これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異
なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまた
はバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少
量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイ
ゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検
出することである。
【０００７】上記の方法を用いることによって、ヒト等
のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を
数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標
識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行
うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することに
よって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を
数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標
識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行
うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することに
よって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００８】ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・
チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直
接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、
ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、
次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表
面に固定する。
チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直
接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、
ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、
次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表
面に固定する。
【０００９】図２は、この従来の方法の原理を説明する
図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプロー
ブＤＮＡ１が入っているマイクロプレート２を用意す
る。一方、図２（ｂ）に示すよう、プレート３としてガ
ラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレ
ート３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結
合剤４をコーティングする。この後、マイクロプレート
２に入っているプローブＤＮＡ１をピンに付着させ、表
面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）４がコ
ーテイングしてあるガラスプレート３の上に、ピンに付
着させたプローブＤＮＡ１を接触させてスポットする。
マイクロプレート２に入っている全てのプローブＤＮＡ
をスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２
（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このよう
に、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全
面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮ
Ａチップを製造していた。
図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプロー
ブＤＮＡ１が入っているマイクロプレート２を用意す
る。一方、図２（ｂ）に示すよう、プレート３としてガ
ラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレ
ート３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結
合剤４をコーティングする。この後、マイクロプレート
２に入っているプローブＤＮＡ１をピンに付着させ、表
面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）４がコ
ーテイングしてあるガラスプレート３の上に、ピンに付
着させたプローブＤＮＡ１を接触させてスポットする。
マイクロプレート２に入っている全てのプローブＤＮＡ
をスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２
（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このよう
に、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全
面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮ
Ａチップを製造していた。
【００１０】ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工
程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにス
ポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識した
サンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液
に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーショ
ン溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiu
mcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤ
ＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水な
どからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの
性質により異なる。
程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにス
ポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識した
サンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液
に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーショ
ン溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiu
mcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤ
ＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水な
どからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの
性質により異なる。
【００１１】このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ
上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二
重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でな
ければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプ
ルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残
留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーテ
ィングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残
る場合もある。
上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二
重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でな
ければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプ
ルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残
留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーテ
ィングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残
る場合もある。
【００１２】その後、ガラスのプレート上に残った蛍光
物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗
い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤ
ＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合して
いるサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の
光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起し
て発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出すること
でハイブリダイゼーションの検出を行う。
物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗
い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤ
ＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合して
いるサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の
光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起し
て発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出すること
でハイブリダイゼーションの検出を行う。
【００１３】しかし、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラ
スの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないた
め、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブ
リダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があっ
た。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮ
ＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％
以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプ
ルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
スの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないた
め、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブ
リダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があっ
た。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮ
ＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％
以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプ
ルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
【００１４】このような問題を解消すべく、結合材とし
て種々の材料が検討されているが、未だ有効な材料が得
られていない。
て種々の材料が検討されているが、未だ有効な材料が得
られていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生体
適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑
制剤の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造
方法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サン
プル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプル
を有効に活用することのできるバイオチップを提供する
ことである。
適合性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑
制剤の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造
方法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サン
プル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプル
を有効に活用することのできるバイオチップを提供する
ことである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】すなわち上記目的は、以
下の本発明の構成により達成される。 （１） 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、
加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導
入して基材上に堆積、重合させ高分子薄膜を得る高分子
薄膜の製造方法。
下の本発明の構成により達成される。 （１） 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、
加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導
入して基材上に堆積、重合させ高分子薄膜を得る高分子
薄膜の製造方法。
【００１７】
【化３】
【００１８】〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、
−ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，
Ｒ2 のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。〕 （２） 少なくとも基材上に下記式（II）で表される構
造単位を有する高分子薄膜。
−ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，
Ｒ2 のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。〕 （２） 少なくとも基材上に下記式（II）で表される構
造単位を有する高分子薄膜。
【００１９】
【化４】
【００２０】（３） 基板上に上記（２）の高分子薄膜
を結合剤として有するバイオチップ。 （４） 前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ物質が
結合している上記（２）または（３）のバイオチップ。 （５） 前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸着法に
より形成されている上記（２）〜（４）のいずれかのバ
イオチップ。 （６） 前記結合剤含有層は、マスキングによりパター
ン形成されている上記（２）〜（５）のいずれかのバイ
オチップ。
を結合剤として有するバイオチップ。 （４） 前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ物質が
結合している上記（２）または（３）のバイオチップ。 （５） 前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸着法に
より形成されている上記（２）〜（４）のいずれかのバ
イオチップ。 （６） 前記結合剤含有層は、マスキングによりパター
ン形成されている上記（２）〜（５）のいずれかのバイ
オチップ。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明の高分子薄膜は、下記構造
式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマー
とした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆
積、重合させて製造することができる。
式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマー
とした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基材上に堆
積、重合させて製造することができる。
【００２２】
【化５】
【００２３】上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−
ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2
のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は双
方とも−ＣＨ2ＮＨ2 基であってもよい。
ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2
のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は双
方とも−ＣＨ2ＮＨ2 基であってもよい。
【００２４】このような原料化合物を用い、これを蒸発
させ、基板上に堆積、重合させると、下記構造式（II）
で示されるような構造単位を有する高分子薄膜が得られ
る。
させ、基板上に堆積、重合させると、下記構造式（II）
で示されるような構造単位を有する高分子薄膜が得られ
る。
【００２５】
【化６】
【００２６】上記式（II）において、ｎ，ｍは整数であ
り、ｎ＝０であってもよいが、ｍ＝０となることはな
い。ｍ／ｍ＋ｎは１に近いほどフィルム中の−ＣＨ2Ｎ
Ｈ2 基が多いこととなり、望ましいといえるが、特に限
定されるものではない。
り、ｎ＝０であってもよいが、ｍ＝０となることはな
い。ｍ／ｍ＋ｎは１に近いほどフィルム中の−ＣＨ2Ｎ
Ｈ2 基が多いこととなり、望ましいといえるが、特に限
定されるものではない。
【００２７】上記高分子薄膜を基材上に形成することに
より、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、
生体反応抑制剤の固定化基質として有用に機能し、種々
の生化学物質、タンパク、プローブ等を良好に固定する
ことができる。このため、医療機器の表面にこの高分子
膜を形成し、免疫抑制剤、血液凝固抑制剤等を固定すれ
ば、生体適合性を有する機器が得られる。
より、生体適合性を付与するための組織適合剤、免疫、
生体反応抑制剤の固定化基質として有用に機能し、種々
の生化学物質、タンパク、プローブ等を良好に固定する
ことができる。このため、医療機器の表面にこの高分子
膜を形成し、免疫抑制剤、血液凝固抑制剤等を固定すれ
ば、生体適合性を有する機器が得られる。
【００２８】さらに、この高分子薄膜を適当な基材、基
板上に形成することにより、水洗い工程等においてプロ
−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプロ
ーブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチ
ップを得ることができる。
板上に形成することにより、水洗い工程等においてプロ
−ブ物質、サンプル物質の損失が少なく、これらのプロ
ーブ、サンプルを有効に活用することのできるバイオチ
ップを得ることができる。
【００２９】このようなバイオチップは、基板とプロ−
ブ、特にＤＮＡとをより確実に結合させることができ、
水洗い工程等でもプローブ、サンプルが基板から流れ落
ちることなく、プローブ、サンプルを有効に活用するこ
とができる。
ブ、特にＤＮＡとをより確実に結合させることができ、
水洗い工程等でもプローブ、サンプルが基板から流れ落
ちることなく、プローブ、サンプルを有効に活用するこ
とができる。
【００３０】構造式（Ｉ）で表される化合物は、好まし
くは蒸着法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、
これを基板上に重合・堆積させることで、ガラス等の基
板と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ
基（ＮＨ2 ）がプローブと良好に結合して、プローブを
基板上に強固に固定することができる。特に、プローブ
にＤＮＡを用いた場合、ＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ
4 ）と結合して、プローブＤＮＡを基板上に良好に固定
することができる。
くは蒸着法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、
これを基板上に重合・堆積させることで、ガラス等の基
板と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ
基（ＮＨ2 ）がプローブと良好に結合して、プローブを
基板上に強固に固定することができる。特に、プローブ
にＤＮＡを用いた場合、ＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ
4 ）と結合して、プローブＤＮＡを基板上に良好に固定
することができる。
【００３１】また、アミノ基がメチレン基（−ＣＨ2
−）を介してキシリレン主鎖に結合しているので、アミ
ノ基が直接結合している場合に比べ塩基性が増し、ＤＮ
Ａ等との静電結合が強まる。
−）を介してキシリレン主鎖に結合しているので、アミ
ノ基が直接結合している場合に比べ塩基性が増し、ＤＮ
Ａ等との静電結合が強まる。
【００３２】式（Ｉ）の化合物は、以下の方法により製
造することができる。
造することができる。
【００３３】先ず、［２．２〕−パラシクロファンを、
塩化メチレン等の溶剤中で、鉄、ヨウ素などの触媒の存
在下、臭素を滴下することによって臭素化する。また、
必要によって冷却してもよい。反応の進行状況は、ガス
クロマトグラフィーで追跡し、所定の組成に達したら反
応を終了し、過剰の臭素は亜硫酸ナトリウム水溶液等の
で中和する。その後、溶剤を留去し、残った結晶を再結
晶により生成し、ブロモ−［２，２］−パラシクロファ
ンを得る。
塩化メチレン等の溶剤中で、鉄、ヨウ素などの触媒の存
在下、臭素を滴下することによって臭素化する。また、
必要によって冷却してもよい。反応の進行状況は、ガス
クロマトグラフィーで追跡し、所定の組成に達したら反
応を終了し、過剰の臭素は亜硫酸ナトリウム水溶液等の
で中和する。その後、溶剤を留去し、残った結晶を再結
晶により生成し、ブロモ−［２，２］−パラシクロファ
ンを得る。
【００３４】得られたブロモ−［２，２］−パラシクロ
ファンと、当量よりやや過剰のシアン化銅を、Ｎ−メチ
ルピロリドン等の溶媒中、２００〜２５０℃に加熱反応
する。その後、アンモニア水を加え、銅化合物を溶解す
ると共に目的物を沈殿させる。得られた粗結晶を、再結
晶あるいは昇華、またはこれらの組み合わせにより精製
し、シアノ−［２，２］−パラシクロファンを得る。
ファンと、当量よりやや過剰のシアン化銅を、Ｎ−メチ
ルピロリドン等の溶媒中、２００〜２５０℃に加熱反応
する。その後、アンモニア水を加え、銅化合物を溶解す
ると共に目的物を沈殿させる。得られた粗結晶を、再結
晶あるいは昇華、またはこれらの組み合わせにより精製
し、シアノ−［２，２］−パラシクロファンを得る。
【００３５】次いで、シアノ−［２，２］−パラシクロ
ファンを、接触還元、あるいはテトラヒドロフラン等の
溶媒中で水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用い
て還元し、アミノメチル−［２，２］−パラシクロファ
ンを得る。
ファンを、接触還元、あるいはテトラヒドロフラン等の
溶媒中で水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用い
て還元し、アミノメチル−［２，２］−パラシクロファ
ンを得る。
【００３６】このようにして得られた構造式（Ｉ）のア
ミノメチル−［２，２］−パラシクロファンは、以下の
化学蒸着法を用いて、基材上に高分子膜として成膜する
ことができる。
ミノメチル−［２，２］−パラシクロファンは、以下の
化学蒸着法を用いて、基材上に高分子膜として成膜する
ことができる。
【００３７】先ず、図１に示すように、蒸発部１１、分
解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意する。
なお、図１において、蒸発部１１には蒸発材料を導入す
る開口部シャッタ１１ａを有し、さらに蒸発部１３には
トラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されてい
る。
解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意する。
なお、図１において、蒸発部１１には蒸発材料を導入す
る開口部シャッタ１１ａを有し、さらに蒸発部１３には
トラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されてい
る。
【００３８】図示例の蒸着装置において、先ず蒸発部１
１に固体状の蒸発材料モノアミノメチル−［２，２］−
パラシクロファンを導入する。蒸発部１１の温度を、モ
ノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンが気化
する温度、好ましくは８０〜２００℃、特に１００〜１
８０℃に加熱すると、蒸発材料が気化してダイマーガス
となり、原料ガスが生成する。
１に固体状の蒸発材料モノアミノメチル−［２，２］−
パラシクロファンを導入する。蒸発部１１の温度を、モ
ノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファンが気化
する温度、好ましくは８０〜２００℃、特に１００〜１
８０℃に加熱すると、蒸発材料が気化してダイマーガス
となり、原料ガスが生成する。
【００３９】次いで、原料のダイマーガスを分解部１２
に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガス
をその分解温度、好ましくは６００〜７５０℃、特に６
５０〜７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノ
マーガスとする。
に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガス
をその分解温度、好ましくは６００〜７５０℃、特に６
５０〜７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノ
マーガスとする。
【００４０】次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着
室１３内に導入する。蒸着室１３内は、所定の真空度、
好ましくは１０〜５０mTorr、特に２０〜３５mTorrに保
持されている。そして、導入された原料ガスが基板に接
触すると、その界面で重合し、高分子膜が形成される。
室１３内に導入する。蒸着室１３内は、所定の真空度、
好ましくは１０〜５０mTorr、特に２０〜３５mTorrに保
持されている。そして、導入された原料ガスが基板に接
触すると、その界面で重合し、高分子膜が形成される。
【００４１】このようにして得られた高分子は、下記構
造式（II）で表されるものである。
造式（II）で表されるものである。
【００４２】
【化７】
【００４３】上記式（II）において、ｍ、ｎは整数であ
り、ｎは０であってもよい。
り、ｎは０であってもよい。
【００４４】成膜された、高分子膜はその膜厚が１分子
分でもよいが、通常０．０５〜１０μm 、好ましくは
０．１〜１μm 程度である。なお、この薄膜は、［２，
２］−パラシクロファンあるいはクロロ−［２，２］−
パラシクロファンからのフィルムに積層することもでき
る。
分でもよいが、通常０．０５〜１０μm 、好ましくは
０．１〜１μm 程度である。なお、この薄膜は、［２，
２］−パラシクロファンあるいはクロロ−［２，２］−
パラシクロファンからのフィルムに積層することもでき
る。
【００４５】また、成膜時に所定パターンのマスクを用
い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸
着を行うことにより、精度よく結合剤含有層パターンを
形成することができ、不必要な部分にプローブや試料、
例えばＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎ
を悪化させることを防止することができる。
い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸
着を行うことにより、精度よく結合剤含有層パターンを
形成することができ、不必要な部分にプローブや試料、
例えばＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎ
を悪化させることを防止することができる。
【００４６】本発明の高分子膜は、生体適合性を付与す
るための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基
質として有用である。また、ＤＮＡ等のプローブを固定
したバイオチップの固定化基質として有用である。組織
適合剤、免疫、生体反応抑制剤、プローブとしては具体
的にはタンパク、抗原、レセプター、ＤＮＡ断片、ＲＮ
Ａ断片等を挙げることができる。なかでも、ＤＮＡ等の
遺伝子を固定化すると優れたバイオチップが得られる。
るための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤の固定化基
質として有用である。また、ＤＮＡ等のプローブを固定
したバイオチップの固定化基質として有用である。組織
適合剤、免疫、生体反応抑制剤、プローブとしては具体
的にはタンパク、抗原、レセプター、ＤＮＡ断片、ＲＮ
Ａ断片等を挙げることができる。なかでも、ＤＮＡ等の
遺伝子を固定化すると優れたバイオチップが得られる。
【００４７】本発明で得られた高分子膜の固定化基質、
つまり結着層として有するバイオチップは、プローブと
の結合が良好であり、水洗い工程等においてもプローブ
が剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用すること
ができる。
つまり結着層として有するバイオチップは、プローブと
の結合が良好であり、水洗い工程等においてもプローブ
が剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用すること
ができる。
【００４８】基材の材質は、透明なガラス、シリコンま
たはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビ
スフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、
ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好
ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが
特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャ
ニング装置による解析の容易さによるものである。シリ
カ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚
さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが
好ましい。なお、本発明の結着層と基材との結合性を考
えると、上記ポリマーなどの樹脂材料も好ましく、さら
に結合性を改善するために基材との間にカップリング剤
を介在させてもよい。
たはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビ
スフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、
ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好
ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが
特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャ
ニング装置による解析の容易さによるものである。シリ
カ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚
さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが
好ましい。なお、本発明の結着層と基材との結合性を考
えると、上記ポリマーなどの樹脂材料も好ましく、さら
に結合性を改善するために基材との間にカップリング剤
を介在させてもよい。
【００４９】プローブとして用いられるＤＮＡ断片は、
目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発
現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳ
Ｔ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。こ
れらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であっても
よいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基
にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリー
あるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によっ
て増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。
あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用する
ことができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるに
は、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に
対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使
用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合に
は、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチド
を合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断
片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発
現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳ
Ｔ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。こ
れらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であっても
よいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基
にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリー
あるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によっ
て増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。
あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用する
ことができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるに
は、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に
対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使
用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合に
は、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチド
を合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断
片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００５０】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、プラスチックプレ
ートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用
いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
体に溶解あるいは分散した水性液を、プラスチックプレ
ートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用
いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
【００５１】点着されるＤＮＡ断片は、基板表面に対し
て、１０2 〜１０5 種類／cm2 の範囲にあることが好ま
しい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15 モルの範囲にあ
り、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドット
の形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜
１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜
３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドット
の大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあること
が好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲
にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあ
ることが好ましい。
て、１０2 〜１０5 種類／cm2 の範囲にあることが好ま
しい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15 モルの範囲にあ
り、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドット
の形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜
１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜
３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドット
の大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあること
が好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲
にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあ
ることが好ましい。
【００５２】アミノ基に対するＤＮＡの固定化には、静
電相互作用を利用する方法、ＵＶクロスリンカーを用い
る方法などがあるが、本発明では何れのものを用いても
よい。
電相互作用を利用する方法、ＵＶクロスリンカーを用い
る方法などがあるが、本発明では何れのものを用いても
よい。
【００５３】点着後は、必要に応じて乾燥し、固定され
なかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好まし
い。
なかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好まし
い。
【００５４】前記記載の基板表面上のドットの形状は、
ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子
発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要で
ある。
ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子
発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要で
ある。
【００５５】上記のようにして作製されたＤＮＡチップ
の寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週
間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップでは
さらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子
発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型
解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸と
のハイブリダーゼーションである。
の寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週
間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップでは
さらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子
発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型
解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸と
のハイブリダーゼーションである。
【００５６】サンプルである標的核酸としては、その配
列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断
片試料を用いることが好ましい。
列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断
片試料を用いることが好ましい。
【００５７】標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組
織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く
任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等
であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮ
Ａが発現される組織サンプルから抽出することが好まし
い。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄ
ＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、
グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリ
ボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤ
ＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的
な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１
回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液
量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であること
が好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリ
ゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておく
ことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択
的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ま
しい。
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組
織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く
任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等
であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮ
Ａが発現される組織サンプルから抽出することが好まし
い。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄ
ＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、
グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリ
ボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤ
ＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的
な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１
回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液
量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であること
が好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリ
ゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておく
ことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択
的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ま
しい。
【００５８】標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる
目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む
反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好まし
い。
目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む
反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好まし
い。
【００５９】標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とが
あるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法と
しては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が
挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍
光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであ
れば何れも用いることができるが、シアニン色素（例え
ば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロ
ーダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルア
ミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素
誘導体）などを使用することが好ましい。
あるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法と
しては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が
挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍
光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであ
れば何れも用いることができるが、シアニン色素（例え
ば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロ
ーダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルア
ミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素
誘導体）などを使用することが好ましい。
【００６０】ハイブリダイゼーションは、プラスチック
プレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あ
るいは分散された水性液を、上記で作製したバイオチッ
プ上に点着することが好ましい。点着の量は、１〜１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０
時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼ
ーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用
いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好
ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、
クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス
緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエ
ン酸緩衝液を用いることが好ましい。
プレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あ
るいは分散された水性液を、上記で作製したバイオチッ
プ上に点着することが好ましい。点着の量は、１〜１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０
時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼ
ーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用
いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好
ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、
クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス
緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエ
ン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００６１】バイオチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないこ
とである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長
や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーシ
ョンの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解
析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低
い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うこと
が好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時
間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ま
た、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を
二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーション
に用いることにより、同一のバイオチップ上で発現量の
比較や定量ができる特徴もある。
ョンの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないこ
とである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長
や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーシ
ョンの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解
析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低
い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うこと
が好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時
間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ま
た、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を
二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーション
に用いることにより、同一のバイオチップ上で発現量の
比較や定量ができる特徴もある。
【００６２】
【実施例】〔実施例１〕
＜モノブロモ−［２，２］−パラシクロファンの合成＞
［２．２〕−バラシクロファン７５g と、塩化メチレン
３．７Ｌの溶液に還元鉄３．０g と水０．３g を加え、
３０℃以下で、撹拌下、臭素７３．５g を滴下した。反
応は、ガスクロマトグラフィーで追跡し、未反応の
［２，２］−パラシクロファンが３．０％まで減少した
時点で、８０g チオ硫酸ナトリウム／１．５Ｌ水の溶液
を加えた。
［２．２〕−バラシクロファン７５g と、塩化メチレン
３．７Ｌの溶液に還元鉄３．０g と水０．３g を加え、
３０℃以下で、撹拌下、臭素７３．５g を滴下した。反
応は、ガスクロマトグラフィーで追跡し、未反応の
［２，２］−パラシクロファンが３．０％まで減少した
時点で、８０g チオ硫酸ナトリウム／１．５Ｌ水の溶液
を加えた。
【００６３】次に、塩化メチレン層を分取し、水酸化ナ
トリウム水溶液を加え、塩化メチレンを留去した。析出
した沈殿を濾取、洗浄、乾燥し、１０５．５g の粗結晶
を得た。これを３２０g のトルエンに加熱溶解、熱時濾
過し、不溶物を除去した。さらに、このトルエン溶液を
濃縮し、冷却した。析出した沈殿を濾取、乾燥して、８
１．０g のモノブロモ−［２，２］−パラシクロファン
を得た。
トリウム水溶液を加え、塩化メチレンを留去した。析出
した沈殿を濾取、洗浄、乾燥し、１０５．５g の粗結晶
を得た。これを３２０g のトルエンに加熱溶解、熱時濾
過し、不溶物を除去した。さらに、このトルエン溶液を
濃縮し、冷却した。析出した沈殿を濾取、乾燥して、８
１．０g のモノブロモ−［２，２］−パラシクロファン
を得た。
【００６４】この化合物の、ガスクロマトグラフィー分
析による組成は以下の通りであった。 ［２，２］−パラシクロファン ４．０％ モノブロモ−［２，２］−パラシクロファン ９４．９％ ジブロモ−［２，２］−パラシクロファン １．０％
析による組成は以下の通りであった。 ［２，２］−パラシクロファン ４．０％ モノブロモ−［２，２］−パラシクロファン ９４．９％ ジブロモ−［２，２］−パラシクロファン １．０％
【００６５】＜モノシアノ−［２，２］−パラシクロフ
ァンの合成＞上記化合物３５g に、シアン化銅１６．４
g 、Ｎ−メチルピロリドン２００mlを加え、１９５〜２
０５℃で２０時間撹拌した。その後、１０％アンモニア
水１．０Ｌを加え、析出した沈殿を濾取、洗浄、乾燥
し、３８．９g の粗結晶を得た。これを、３０g のアセ
トンに加熱溶解、熱時濾過して不溶物を除去した。溶液
は蒸発乾固して、２６．４g の粗結晶を得た。これを昇
華精製し、６０g のエタノールで再結晶を行い、２２．
３g のモノシアノ−［２，２］−パラシクロファンを主
成分とする化合物を得た。
ァンの合成＞上記化合物３５g に、シアン化銅１６．４
g 、Ｎ−メチルピロリドン２００mlを加え、１９５〜２
０５℃で２０時間撹拌した。その後、１０％アンモニア
水１．０Ｌを加え、析出した沈殿を濾取、洗浄、乾燥
し、３８．９g の粗結晶を得た。これを、３０g のアセ
トンに加熱溶解、熱時濾過して不溶物を除去した。溶液
は蒸発乾固して、２６．４g の粗結晶を得た。これを昇
華精製し、６０g のエタノールで再結晶を行い、２２．
３g のモノシアノ−［２，２］−パラシクロファンを主
成分とする化合物を得た。
【００６６】この化合物の、ガスクロマトグラフィー分
析による組成は以下の通りであった。 ［２，２］−パラシクロファン ３．０％ モノシアノ−［２，２］−パラシクロファン ９４．５％ ジシアノ−［２，２］−パラシクロファン １．８％
析による組成は以下の通りであった。 ［２，２］−パラシクロファン ３．０％ モノシアノ−［２，２］−パラシクロファン ９４．５％ ジシアノ−［２，２］−パラシクロファン １．８％
【００６７】＜モノアミノメチル−［２，２］−パラシ
クロファンの合成＞氷浴中で冷却した、テトラヒドロフ
ラン５００g 中に水素化リチウムアルミニウム１５ｇを
加え、２で得た化合物１５g をテトラヒドロフラン１０
０g に溶解させた溶液を撹拌しつつ、２０℃以下で滴下
した。
クロファンの合成＞氷浴中で冷却した、テトラヒドロフ
ラン５００g 中に水素化リチウムアルミニウム１５ｇを
加え、２で得た化合物１５g をテトラヒドロフラン１０
０g に溶解させた溶液を撹拌しつつ、２０℃以下で滴下
した。
【００６８】その後、ガスクロマトグラフィーによる分
析で、未反応のモノシアノ−［２，２］−パラシクロフ
ァンが１％以下になるまで、室温で撹拌を継続した。反
応終了後、氷浴中で冷却しながら水１００g を加え、析
出した不溶分を濾別、除去した。溶液は蒸発乾固した。
得られた粗結晶に３００g のメタノールを加え、加熱溶
解、室温まで冷却後、不溶物を濾別、除去した。この溶
液を蒸発乾固して、１３．８g のモノアミノメチル−
［２，２］−パラシクロファンを主成分とする化合物を
得た。
析で、未反応のモノシアノ−［２，２］−パラシクロフ
ァンが１％以下になるまで、室温で撹拌を継続した。反
応終了後、氷浴中で冷却しながら水１００g を加え、析
出した不溶分を濾別、除去した。溶液は蒸発乾固した。
得られた粗結晶に３００g のメタノールを加え、加熱溶
解、室温まで冷却後、不溶物を濾別、除去した。この溶
液を蒸発乾固して、１３．８g のモノアミノメチル−
［２，２］−パラシクロファンを主成分とする化合物を
得た。
【００６９】この化合物の、ガスクロマトグラフィー分
析による組成は以下の通りであった。 ［２，２］−パラシクロファン ３．０％ モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン ９４．１％ ジアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン １．１％
析による組成は以下の通りであった。 ［２，２］−パラシクロファン ３．０％ モノアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン ９４．１％ ジアミノメチル−［２，２］−パラシクロファン １．１％
【００７０】＜高分子薄膜の形成＞図１に示すように、
蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装
置を用意した。
蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装
置を用意した。
【００７１】図示例の蒸着装置において、蒸発部１１
に、式（Ｉ）の構造を有する固体状の蒸着材料モノアミ
ノメチル−［２，２］−パラシクロファンを導入した。
蒸発部１１の温度を、１００〜１５０℃に加熱すると、
蒸発材料が気化して下記構造のダイマーガスとなり、原
料ガスが生成した。
に、式（Ｉ）の構造を有する固体状の蒸着材料モノアミ
ノメチル−［２，２］−パラシクロファンを導入した。
蒸発部１１の温度を、１００〜１５０℃に加熱すると、
蒸発材料が気化して下記構造のダイマーガスとなり、原
料ガスが生成した。
【００７２】
【化８】
【００７３】上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−
ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2
のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は、
双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
ＣＨ2ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2
のいずれかは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は、
双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
【００７４】次いで、原料のダイマーガスを分解部１２
に導入した。この分解部１２では、下記式に示すよう
に、導入された原料ガスを、その分解温度７００℃まで
加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとした。
に導入した。この分解部１２では、下記式に示すよう
に、導入された原料ガスを、その分解温度７００℃まで
加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとした。
【００７５】
【化９】
【００７６】次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着
室１３内に導入した。蒸着室１３内は、最大３０．１mm
Torrの真空度に保持されている。そして、導入された原
料ガスがガラス基板界面で重合し、下記構造の高分子膜
が形成された。なお、このとき高分子膜とガラス基板と
の結合性を改善するために、ガラス基板表面をシランカ
ップリング剤で処理してもよい。
室１３内に導入した。蒸着室１３内は、最大３０．１mm
Torrの真空度に保持されている。そして、導入された原
料ガスがガラス基板界面で重合し、下記構造の高分子膜
が形成された。なお、このとき高分子膜とガラス基板と
の結合性を改善するために、ガラス基板表面をシランカ
ップリング剤で処理してもよい。
【００７７】
【化１０】
【００７８】次に、プローブＤＮＡとして、５’末端に
Ｃｙ３またはＣｙ５が標識された３０mer の合成ＤＮＡ
の１００μＭ水溶液を用意した。マイクロプレート２２
に入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高
分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに
付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。
プローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り
返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造し
た。
Ｃｙ３またはＣｙ５が標識された３０mer の合成ＤＮＡ
の１００μＭ水溶液を用意した。マイクロプレート２２
に入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高
分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに
付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。
プローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り
返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造し
た。
【００７９】アミノ基に対するＤＮＡの固定化は、静電
相互作用を利用する方法と、ＵＶクロスリンカーを利用
する方法の双方を試みた。静電相互作用を利用する場
合、調湿チャンバーにて一晩放置し、その後８０℃で一
晩乾燥し、ＵＶクロスリンカーを用いる場合には、２分
間ＵＶクロスリンカー内に放置した。さらに、各サンプ
ルを蒸留水にて一晩洗浄した。
相互作用を利用する方法と、ＵＶクロスリンカーを利用
する方法の双方を試みた。静電相互作用を利用する場
合、調湿チャンバーにて一晩放置し、その後８０℃で一
晩乾燥し、ＵＶクロスリンカーを用いる場合には、２分
間ＵＶクロスリンカー内に放置した。さらに、各サンプ
ルを蒸留水にて一晩洗浄した。
【００８０】得られた各サンプルについて、ＤＮＡ固定
化前（スポット時）と、固定化／水洗後の蛍光を観察
し、プローブの固定状体を評価した。
化前（スポット時）と、固定化／水洗後の蛍光を観察
し、プローブの固定状体を評価した。
【００８１】本発明サンプルは、スポット後、ＵＶ照射
後に均一なスポットが確認できた。また、洗浄後、過剰
なＤＮＡがスポット部位以外にも付着する場合があり、
この結着層が容易に、しかも極めて強固にＤＮＡと結合
することがわかった。このため、背景の雑音を低減する
ためには、実際の使用にあたって、スポット部位以外に
マスクするか、結着層自体をマスク蒸着するか、蛍光観
察領域をスポット部位だけに限定することが望ましい。
後に均一なスポットが確認できた。また、洗浄後、過剰
なＤＮＡがスポット部位以外にも付着する場合があり、
この結着層が容易に、しかも極めて強固にＤＮＡと結合
することがわかった。このため、背景の雑音を低減する
ためには、実際の使用にあたって、スポット部位以外に
マスクするか、結着層自体をマスク蒸着するか、蛍光観
察領域をスポット部位だけに限定することが望ましい。
【００８２】
【発明の効果】以上のように本発明によれば、生体適合
性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤
の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造方
法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプ
ル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを
有効に活用することのできるバイオチップを提供するこ
とができる。
性を付与するための組織適合剤、免疫、生体反応抑制剤
の固定化基質として有用な高分子薄膜と、その製造方
法、および水洗い工程等においてプロ−ブ物質、サンプ
ル物質の損失が少なく、これらのプローブ、サンプルを
有効に活用することのできるバイオチップを提供するこ
とができる。
【図１】本発明のバイオチップを製造するための装置の
概略構成を示したブロック図である。
概略構成を示したブロック図である。
【図２】バイオチップの製造工程を示した模式図であ
る。
る。
１１ 蒸発部
１２ 分解部
１３ 蒸着部
１４ トラップ
１５ 真空ポンプ
２１ ＤＮＡ
２２ マイクロプレート
２３ 基板
２４ 結合剤含有層
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 柴山 健一
東京都中央区日本橋本町４丁目11番２号
岸本産業株式会社内
(72)発明者 丸山 宏
千葉県市原市五井南海岸50番５ 第三化成
株式会社内
(72)発明者 井上 崇
千葉県市原市五井南海岸50番５ 第三化成
株式会社内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 HA08
4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC03
CC08 FA15
4J032 CA06 CB01 CB04 CC01 CE01
Claims (6)
- 【請求項１】 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発
させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着
室に導入して基材上に堆積、重合させ高分子薄膜を得る
高分子薄膜の製造方法。 【化１】 〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＣＨ2ＮＨ2
基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれ
かは−ＣＨ2ＮＨ2 基である。〕 - 【請求項２】 少なくとも基材上に下記式（II）で表さ
れる構造単位を有する高分子薄膜。 【化２】 - 【請求項３】 基板上に請求項２の高分子薄膜を結合剤
として有するバイオチップ。 - 【請求項４】 前記バイオチップの結合剤にはプロ−ブ
物質が結合している請求項２または３のバイオチップ。 - 【請求項５】 前記バイオチップ用結合剤含有層は、蒸
着法により形成されている請求項２〜４のいずれかのバ
イオチップ。 - 【請求項６】 前記結合剤含有層は、マスキングにより
パターン形成されている請求項２〜５のいずれかのバイ
オチップ。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002011707A JP4106215B2 (ja) | 2002-01-21 | 2002-01-21 | 高分子薄膜、高分子薄膜の製造方法、およびバイオチップ |
| DE2002618568 DE60218568T2 (de) | 2001-05-16 | 2002-05-16 | Dünne Polymer-Schicht, Herstellungsverfahren, Bindemittel für Bio-Chip, Bio-Chip und Verfahren zu seiner Herstellung |
| EP20020253423 EP1260542B1 (en) | 2001-05-16 | 2002-05-16 | Polymer thin film, its production method, binder for bio chip, bio chip, and its production method |
| US10/145,738 US6855419B2 (en) | 2001-05-16 | 2002-05-16 | Polymer thin film, its production method, binder for bio chip, bio chip, and its production method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002011707A JP4106215B2 (ja) | 2002-01-21 | 2002-01-21 | 高分子薄膜、高分子薄膜の製造方法、およびバイオチップ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003212974A true JP2003212974A (ja) | 2003-07-30 |
| JP4106215B2 JP4106215B2 (ja) | 2008-06-25 |
Family
ID=27649125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002011707A Expired - Lifetime JP4106215B2 (ja) | 2001-05-16 | 2002-01-21 | 高分子薄膜、高分子薄膜の製造方法、およびバイオチップ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4106215B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006010565A (ja) * | 2004-06-28 | 2006-01-12 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | バイオチップおよびその製造方法、ならびにポリホルミルパラキシリレン膜およびその製造方法 |
| JP2007520704A (ja) * | 2004-01-20 | 2007-07-26 | ビオメリュー | 少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合、及び、タンパク質リガンド以外のリガンドを用いるプリオンタンパク質の検出方法 |
| JP2007322219A (ja) * | 2006-05-31 | 2007-12-13 | Univ Of Tokyo | アミノ基を有する被膜を表面に有する基体の製造方法 |
| WO2008012921A1 (fr) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | Daisankasei Co., Ltd. | Appareil et procédé de dépôt chimique en phase vapeur |
| WO2012176908A1 (ja) | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Ｋｉｓｃｏ株式会社 | 細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及び細胞培養用基材の製造方法 |
-
2002
- 2002-01-21 JP JP2002011707A patent/JP4106215B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007520704A (ja) * | 2004-01-20 | 2007-07-26 | ビオメリュー | 少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合、及び、タンパク質リガンド以外のリガンドを用いるプリオンタンパク質の検出方法 |
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| JP2013005761A (ja) * | 2011-06-24 | 2013-01-10 | Kisco Ltd | 細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及び細胞培養用基材の製造方法 |
| US9492842B2 (en) | 2011-06-24 | 2016-11-15 | Kisco Ltd. | Cell culture membrane, cell culture substrate, and method for manufacturing cell culture substrate |
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| Publication number | Publication date |
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| JP4106215B2 (ja) | 2008-06-25 |
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