JP2013005761A - 細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及び細胞培養用基材の製造方法 - Google Patents
細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及び細胞培養用基材の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 細胞接着層として下記式(I)で表される重合体膜を膜厚0.2μm以上となるように細胞培養用基材の基体上に形成する。
【化1】
(但し、式中、R1、R2は、−(CH2)n−NH2基(nは1以上10以下の整数を表す。)又はHを表し、少なくともR1、R2のいずれかは−(CH2)n−NH2基である。また、l、mは重合度を表す正の整数である。)
【選択図】 なし
Description
[実施例1]
(細胞接着層を有する基材の作製)
(1)基体の準備
基体として市販されているポリスチレン製の24WELL細胞培養用マルチウェルプレート(TC(Tissue Culture)処理品,BECTON DICKINSON社製)を準備し、細胞接着層の原材料として、下記構造式(II)で表される化合物であってR1が−CH2NH2、R2がHを表す化合物であるモノアミノメチル(2,2)パラシクロファン(diX AM 第三化成(株)製)を準備した。
次いで、図1に示したような蒸着装置1において、蒸発部11に、準備した固体状の蒸着原料であるモノアミノメチル(2,2)パラシクロファン8gを蒸着原料投入口11aから導入した。また、蒸着部13に、基体であるポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレートを導入した。その後、真空ポンプ15を使用し、装置系内を1.7Paの真空度に保ち、110℃〜115℃に徐々に加熱した。すると、蒸着原料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。
上述のようにして得られた細胞培養用基材について、70%エタノールを24WELLプレートの各ウェルにつき2mlを入れ、15分間クリーンベンチ内に静置した。その後、滅菌水にてウェルを洗浄し、乾燥させることでアルコール殺菌した後、ヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。培養条件としては、24WELLプレートに、1WELLにつき8.0×104の細胞を播種し、10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンB懸濁液、1%非必須アミノ酸を添加したDMEM(低グルコース)を培地として、5%CO2大気下にて培養を行った。
(他のポリパラキシリレン誘導体での細胞培養用基材の作製・HepG2 細胞の培養)
比較例1では、蒸着原料として、ジクロロ(2,2)パラシクロファン(商品名 diX C 第三化成(株)製)、(2,2)パラシクロファン(商品名 diX N 第三化成(株)製)、オクタフルオロ(2,2)パラシクロファン(商品名 diX SF 第三化成(株)製)、モノアミノ(2,2)パラシクロファン(商品名 diX A 第三化成(株)製)、モノホルミル(2,2)パラシクロファン(商品名 diX H 第三化成(株)製)の5種類を準備し、実施例1と同様の手法にて重合体膜の形成を行い、細胞培養用基材を作製した。
(一般的に用いられている細胞培養用基材でのHepG2 細胞の培養)
比較例2では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート(TC(Tissue Culture)処理品)を用いて、実施例1と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養試験を実施した。
(コラーゲンコートされた細胞培養用基材でのHepG2 細胞の培養)
参考例1として、一般的に細胞培養に使用されているコラーゲンコートされたポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレートを用いて、実施例1と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養試験を実施した。
[実施例2]
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから、それぞれ膜厚0.1μm、0.2μm、0.3μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、実施例1と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。
[実施例3]
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚0.6μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、無酸素環境下で12kGyの電子線を照射することによって滅菌を行って、実施例1と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。
[実施例4]
ポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレートの表面に膜厚2.4μmのポリモノクロロパラキシリレンの重合体膜を形成した後に、実施例1と同様の手法に従ってモノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚1.1μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製した。すなわち、ポリモノクロロパラキシリレンを下地として形成した後に、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンにより重合体膜を形成した。
[実施例5]
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚1.0μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト肝癌由来 HepG2 細胞の最長11日間の長期培養試験を行った。
(一般的に使用されている細胞培養用基材でのHepG2 細胞の長期培養)
比較例3では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート(TC処理品)、コラーゲンコートされたポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート、及び市販品(BD社製 PureCoat Amine)を用いて、実施例5と同様の培養条件にてヒト肝癌由来 HepG2 細胞の長期培養試験を実施した。
[実施例6]
(ヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVECの培養)
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚0.2μm、0.3μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVECの培養を行った。
(ヒト胎児腎由来HEK293細胞の培養)
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚0.2μm、0.3μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト胎児腎由来HEK293細胞の培養を行った。培養条件、培養手法は、実施例6の手法に従って同様に行った。
(ヒト乳癌由来MCF-7細胞の培養)
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚0.2μm、0.3μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト乳癌由来MCF-7細胞の培養を行った。培養条件、培養手法は、実施例6の手法に従って同様に行った。
(ヒト結腸癌由来Caco-2細胞の培養)
実施例1と同様の手法に従って、モノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚0.7μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト結腸癌由来Caco-2細胞の培養を行った。培養条件、培養手法は、実施例6の手法に従って同様に行った。
(一般的に用いられている細胞培養用基材での細胞培養)
比較例4では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート(TC処理品)、コラーゲンコートされたポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート、及び市販品(BD社製 PureCoat Amine)を用いて、上述した実施例6〜9と同様の手法にてヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVEC、ヒト胎児腎由来HEK293細胞、ヒト乳癌由来MCF-7細胞、及びヒト結腸癌由来Caco-2細胞の培養を実施した。
[実施例10]
実施例1と同様の手法に従ってモノアミノメチル(2,2)パラシクロファンから膜厚0.5μmの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、実施例5と同様の手法に従ってHepG2細胞の培養を行った。次いで、培養したHepG2細胞から、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて全RNAの抽出・精製を行い、全RNAをタカラバイオ社に送付し、マイクロアレイ解析を委託した。その後、得られた解析データの品質管理を行い、通常のTC処理プレートでの培養時に比べて2倍以上上昇した遺伝子を抽出し、Cluster 3を用いてクラスタ解析を行った。また、可視化にはJava TreeViewを使用した。
(一般的に用いられている細胞培養用基材でヒト肝癌由来 HepG2 細胞を培養した場合のマイクロアレイ解析)
比較例5では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート(TC処理品)、コラーゲンコートされたポリスチレン製24WELL細胞培養用マルチウェルプレート、及び市販品(BD社製 PureCoat Amine)を用いて、上述した実施例10と同様の手法にて培養したHepG2細胞のマイクロアレイ解析を実施した。
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