CN114921407B - 一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法。本发明利用液液界面处较强的界面能制备出了一种单分子层的蛋白质纳米薄膜，该蛋白质纳米薄膜的组成成分均一明确，且可自定义；同时，在上述蛋白质纳米薄膜上培养间充质干细胞，不仅能在生长数量和速度等方面与传统的培养皿培养方法相当，并且具备维持并增强间充质干细胞干性的功能；此外，用交联剂(如京尼平)对上述单分子层蛋白质纳米薄膜进行交联处理后，还可以得到更坚硬的单层蛋白质纳米薄膜，该蛋白质纳米薄膜不易被细胞牵引力所影响而发生形变，并且在细胞融合度达到90％及以上数量时还可继续支撑细胞持续生长数天。
Description
技术领域
本发明属于间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell)因具有向骨、软骨、神经和脂肪等多方向分化的潜能，具有免疫调节功能，以及免疫原性低等众多优点而在组织工程和再生医学等领域越来越受到广泛关注。同时，间充质干细胞在临床应用也较多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于脐带血、脂肪、牙髓等各个组织中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。
目前，虽然关于间充质干细胞的临床应用越来越多，但仍因为一些原因而受到一定限制。比如，间充质干细胞的组织提取效率仅有0.001％～0.01％，而临床应用的用量为1～2百万细胞/公斤体重。此外，常规的间充质干细胞体外扩增培养是在塑料培养皿中进行的，自我更新速度慢，容易分化，且其干性和多分化潜能会随扩增代数的增加而快速衰减。因此，发展一种能使间充质干细胞在体外大量扩增并维持其自身多分化潜能的培养方法对其临床应用至关重要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，该方法不仅可以保证干细胞具有与常规细胞培养皿法相当的增殖速度，而且也具备了可以维持并增强干细胞干性的功能。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，具体为：往细胞培养器皿中先加入FC40为下层油相，再加入蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液为上层水相，孵育后形成蛋白质纳米薄膜，再用PBS清洗上层水相，并将上层水相置换为培养基，随后将间充质干细胞接种于上层水相中进行培养。
本发明还提供了另一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，往细胞培养载体中先加入FC40为下层油相，再加入蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液为上层水相，孵育后形成蛋白质纳米薄膜，再用PBS清洗上层水相，然后往向上层水相中加入交联剂，并经孵育交联蛋白质纳米薄膜，再用PBS清洗上层水相，并将上层水相置换为培养基，最后将间充质干细胞接种于上层水相中进行培养。
优选地，所述蛋白质包括溶菌酶、牛血清白蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、I型胶原。具体地，所述蛋白质为溶菌酶。
优选地，所述生物相容性聚合物包括明胶、聚赖氨酸。
优选地，所述交联剂包括京尼平。
本发明提供一种液液界面间充质干细胞培养体系，在液液界面自组装得到成分明确且均一的单分子层蛋白质纳米薄膜，同时该蛋白质纳米薄膜强度还可使用交联剂处理得到强化，最重要的是，在上述的单层蛋白质薄膜上培养间充质干细胞可实现细胞的体外大量扩增及其自身多能性的维持与增强。
优选地，所述蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液的浓度为0.1-1.5mg/mL，且需事先过0.22μm滤膜过滤。具体地，所述蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液的浓度为1mg/mL。
优选地，所述交联剂溶液的浓度为1-3mg/mL，且需事先过0.22μm滤膜过滤。具体地，所述交联剂溶液的浓度为2mg/mL。
优选地，PBS清洗上层水相的方法为：先去除一半体积的上层水相(即蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液)，再往上层水相加入PBS，再去除与加入的PBS相同体积的上层水相，重复3-5次，清洗完毕后上层水相剩余体积为原先孵育时蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液体积的一半。
优选地，往上层水相加入培养基，再去除与加入的培养基相同体积的上层水相，重复3-5次，清洗完毕后上层水相剩余体积为蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液添加量的一半。
优选地，所述间充质干细胞包括人骨髓间充质干细胞，人脐带血间充质干细胞。具体地，所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
优选地，加入蛋白质溶液或生物相容性聚合物溶液后的孵育为置于37℃，5％CO2培养箱内孵育1-3小时。
优选地，加入交联剂后的孵育为置于37℃，5％CO2培养箱内孵育2-3小时。
优选地，所述细胞培养器皿包括24孔板。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，利用液液界面处的较强的界面能制备出了一种单分子层的蛋白质纳米薄膜，该蛋白质纳米薄膜的组成成分均一明确(薄膜的成分组成仅来源于上层水溶液所含的成分)，且可自定义(用什么蛋白质或聚合物溶液，就相应得到什么薄膜)；同时，在上述蛋白质纳米薄膜上培养间充质干细胞，不仅能在生长数量和速度等方面与传统的培养皿培养方法相当，并且具备维持并增强间充质干细胞干性的功能；此外，用交联剂(如京尼平)对上述单分子层蛋白质纳米薄膜进行交联处理后，还可以得到更坚硬的单层蛋白质纳米薄膜，该蛋白质薄膜不易被细胞牵引力所影响而发生形变，并且在细胞融合度达到90％及以上数量时还可继续支撑细胞持续生长数天。
附图说明
图1为通过制备液液界面单分子层蛋白质纳米薄膜培养间充质干细胞的工艺图；
图2为液液界面单层蛋白质薄膜处的细胞铺展形态图；
图3为液液界面单层蛋白质薄膜的厚度测量结果；
图4为间充质干细胞倍增时间的测试结果；
图5为MSC干性基因表达水平的测试结果；
图6为MSC干性蛋白表达水平的免疫荧光图及荧光强度定量图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1通过液液界面组(Liquid-Liquid，L-L)培养间充质干细胞的方法
根据图1的工艺流程图，所述方法包括以下步骤：
(1)形成蛋白质纳米薄膜：向24孔板内先加入1mL FC40(一种全氟碳，密度≈1.85g/mL，即为下层油相)，再加入1mL事先经过0.22μm滤膜过滤且浓度为1mg/mL的溶菌酶溶液(酶来源于鸡蛋白，货号：L105521-5g；溶液所用的溶剂为生理盐水，即为上层水相)，然后将该24孔板放入37℃，5％CO2培养箱内孵育2小时左右；
(2)PBS清洗上层水相：孵育结束后，除去0.5mL上层溶菌酶溶液，然后用1mL PBS清洗3次上层水相(即往上层水相加入1mL PBS，随之再去除上层水相1mL，重复此操作3次)，清洗完毕后上层水相剩余0.5mL；
(3)将上层水相置换为培养基：用0.5mL培养基[MEM-α培养基(GIBCO)+10％FBS(GIBCO)]3次置换上层水相(即往上层水相加入0.5mL培养基，随之再去除上层水相0.5mL，重复此操作3次)，操作完毕后上层水相剩余0.5mL；
(4)接种细胞：用培养基[MEM-α培养基(GIBCO)+10％FBS(GIBCO)]配制浓度为1×104cells/mL的人骨髓间充质干细胞混悬液，然后将0.5mL人骨髓间充质干细胞混悬液加入上层水相中，之后将孔板移入37℃，5％CO2培养箱内培养。细胞在界面处的铺展形态如图2d如示。
实施例2通过制备液液界面交联组(Liquid-Liquid-Genipin，L-L-G)培养间充质干细胞的方法
根据图1的工艺流程图，所述方法包括以下步骤：
(1)形成蛋白膜：向24孔板内先加入1mL FC40(一种全氟碳，密度≈1.85g/mL，即为下层油相)，再加入1mL事先经过0.22μm滤膜过滤且浓度为1mg/mL的溶菌酶溶液(酶来源于鸡蛋白，货号：L105521-5g；溶液所用的溶剂为生理盐水，即为上层水相)，然后将该24孔板放入37℃，5％CO2培养箱内孵育2小时左右；
(2)PBS清洗上层水相：孵育结束后，除去0.5mL上层溶菌酶溶液，然后用1mL PBS清洗3次上层水相(即往上层水相加入1mL PBS，随之再去除上层水相1mL，重复此操作3次)，清洗完毕后上层水相剩余0.5mL；
(3)京尼平交联蛋白膜：向上层水相中加入0.5mL事先经过0.22μm滤膜过滤且浓度为2mg/mL的京尼平溶液(溶剂为生理盐水)，之后放入37℃，5％CO2培养箱内孵育2.5小时左右；
(4)PBS清洗上层水相：方法同步骤(2)；
(5)将上层水相置换为培养基：用0.5mL培养基3次置换上层水相(即往上层水相加入0.5mL培养基，随之再去除上层水相0.5mL，重复此操作3次)，操作完毕后上层水相剩余0.5mL；
(6)接种细胞：用培养基[MEM-α培养基(GIBCO)+10％FBS(GIBCO)]配制浓度为1×104cells/mL的人骨髓间充质干细胞混悬液，然后将0.5mL人骨髓间充质干细胞混悬液加入上层水相中，之后将孔板移入37℃，5％CO2培养箱内培养。
实施例1、2提供一种液液界面间充质干细胞培养体系，在液液界面自组装得到成分明确且均一的单分子层蛋白质纳米薄膜，该蛋白质纳米薄膜强度可使用交联剂处理得到强化，然后在上述所得的单层蛋白质薄膜上培养间充质干细胞。
使用Bruker Dimension Icon原子力显微镜对实施例1、2液液界面的蛋白质薄膜进行扫描。图3中的左两图为液液界面蛋白质纳米薄膜的形貌图，颜色由深到浅代表对应高度由低到高，右两图则为左图中白线所跨部分的高度分布形貌图。说明单层蛋白质薄膜经京尼平交联处理后更厚更强韧，不易受到细胞牵引力影响而发生形变。并且在培养过程中还发现，当细胞融合度达到90％及以上数量时，液液界面交联组还可继续支撑细胞持续生长数天。
实施例3通过液液界面组(Liquid-Liquid，L-L)培养间充质干细胞的方法
具体方法同实施例1，不同之处在于：将溶菌酶替换为明胶。细胞在界面处的铺展形态如图2b如示。
实施例4通过液液界面组(Liquid-Liquid，L-L)培养间充质干细胞的方法
具体方法同实施例1，不同之处在于：将溶菌酶替换为牛血清白蛋白。细胞在界面处的铺展形态如图2c如示。
对比例1采用传统的培养皿培养间充质干细胞
用培养基[MEM-α培养基(GIBCO)+10％FBS(GIBCO)]配制浓度为1×104cells/mL的人骨髓间充质干细胞混悬液，然后将0.5mL人骨髓间充质干细胞混悬液加入培养板中，之后将孔板移入37℃，5％CO2培养箱内培养。细胞的铺展形态如图2a如示。
实验例1间充质干细胞培养效果测试
(1)细胞增殖情况考察
以实施例1、2为例，以对比例1为对照(Control)，分别在第3天、第5天收集细胞，在Nikon相差显微镜下用血细胞计数法统计各组细胞个数，计算得细胞增殖分裂一次所需时长，(测试方法可见文献Large-Area Aligned Fullerene Nanocrystal Scaffolds asCulture Substrates for Enhancing Mesenchymal Stem Cell Self-Renewal andMultipotency,ACS AppliedNano Materials 2020Vol.3Issue 7Pages 6497-6506)。
如图4所示，说明通过本发明方法在单分子层蛋白质纳米薄膜上所生长的间充质干细胞倍增时间与传统的塑料培养皿相当。
(2)干性基因表达水平研究
以实施例1、2为例，以对比例1为对照(Control)，利用RT-qPCR法在罗氏荧光定量PCR仪中测得各组细胞生长6天后其干性基因SOX2、NANOG的mRNA表达量(测量方法可见文献Large-AreaAligned Fullerene Nanocrystal Scaffolds as Culture Substrates forEnhancing Mesenchymal Stem Cell Self-Renewal and Multipotency,ACS AppliedNano Materials 2020Vol.3Issue 7Pages 6497-6506)。测试结果如图5所示。
同时，利用nikon倒置荧光显微镜进行荧光拍照测得各组细胞的干性蛋白SOX2、NANOG、OCT4的表达量。(具体的免疫荧光法可见文献Large-Area Aligned FullereneNanocrystal Scaffolds as Culture Substrates for Enhancing Mesenchymal StemCell Self-Renewal and Multipotency,ACS Applied Nano Materials 2020Vol.3Issue7Pages 6497-6506)。测试结果如图6所示，左图为免疫荧光染色照片，绿色荧光为干性蛋白，蓝色荧光为细胞核；右图为干性蛋白的荧光强度定量图。
图5、图6说明，与传统的塑料培养皿培养方法相比，通过本发明方法在单分子层蛋白质纳米薄膜上所生长的间充质干细胞干性明显增强。
综上所述，本发明通过液液界面培养间充质干细胞的方法，可在液液界面自组装得到成分明确且均一的单分子层蛋白质纳米薄膜，不仅可以保证干细胞具有与细胞培养皿法相当的增殖速度，而且也具备了可以维持并增强干细胞干性的功能，可实现干细胞的体外大量扩增及其自身多能性的维持与增强。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，往细胞培养器皿中先加入FC40为下层油相，再加入溶菌酶溶液为上层水相，孵育后形成蛋白质纳米薄膜，再用PBS清洗上层水相，并将上层水相置换为培养基，随后将间充质干细胞接种于上层水相中进行培养，所述溶菌酶溶液的浓度为1mg/mL，且需事先过0.22μm滤膜过滤。
2.一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，往细胞培养器皿中先加入FC40为下层油相，再加入溶菌酶溶液为上层水相，孵育后形成蛋白质纳米薄膜，再用PBS清洗上层水相，然后向上层水相中加入交联剂，并经孵育交联蛋白质纳米薄膜，再用PBS清洗上层水相，并将上层水相置换为培养基，最后将间充质干细胞接种于上层水相中进行培养，所述交联剂为京尼平，所述溶菌酶溶液的浓度为1mg/mL，且需事先过0.22μm滤膜过滤。
3.根据权利要求2所述的一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，所述交联剂溶液的浓度为2mg/mL，且需事先过0.22μm滤膜过滤。
4.根据权利要求1或2所述的一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，PBS清洗上层水相的方法为：先去除一半体积的上层水相，再向上层水相加入PBS，再去除与加入的PBS等体积的上层水相，重复3-5次，清洗完毕后上层水相剩余体积为原先孵育时溶菌酶溶液体积的一半。
5.根据权利要求1或2所述的一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，往上层水相加入培养基，再去除与加入的培养基等体积的上层水相，重复3-5次，清洗完毕后上层水相剩余体积为原先孵育时溶菌酶溶液体积的一半。
6.根据权利要求1或2所述的一种体外维持间充质干细胞自我更新和多能性的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括人骨髓间充质干细胞，人脐带血间充质干细胞。
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