CN106771191A - 一种用于人脐血间充质干细胞检测的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于人脐血间充质干细胞检测的试剂盒，其含有能特异性检测人脐血间充质干细胞的核酸适体。利用本发明的试剂盒，可以特异性的分离人脐血间充质干细胞，该试剂盒具有操作简单、方便直接用于人脐血间充质干细胞的分离，便于大规模推广应用。

Description

一种用于人脐血间充质干细胞检测的试剂盒
技术领域
本申请涉及生物检测领域，具体涉及人脐血间充质干细胞的检测。
背景技术
干细胞即为起源细胞。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力(Self-renewing)，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。
干细胞是自我复制还是分化功能细胞，主要由于细胞本身的状态和微环境因素所决定。包括调节细胞周期的各种周期素(Cyclin)和周期素依赖激酶(Cyclin－DependentKinase)、基因转录因子、影响细胞不对称分裂的细胞质因子。微环境因素，包括干细胞与周围细胞，干细胞与外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。人体内的干细胞分两种类型，一种是全功能干细胞，可直接克隆人体；另一种是多功能干细胞，可直接复制各种脏器和修复组织。人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并最终通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗。
最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。
间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在脐血中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
脐血是脐带及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞，其主要包含造血干细胞和间充质干细胞。脐血来源充足，采集方便，免疫原性较弱，能更大程度上耐受HLA配型不符，其间充质干细胞更为原始，扩增能力较脐血间充质干细胞更强，故脐血干细胞的作用越来越突出，可用于各系统疾病的细胞移植治疗和作为基因治疗的载体。脐血来源的造血干细胞已经用于治疗血液系统疾病，如白血病患者造血系统重建，但是脐血来源的间充质干细胞的应用价值始终没有被挖掘。
在使用过程中，如何有效的分离脐血间充质干细胞也是一个难点。因此，如何有效的分离脐血间充质干细胞是本领域技术人员面对的一个难题。CN1878860A中公开了一种分离和培养来自脐带血的间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在体积为大于45ml/单位的脐带血中添加抗凝剂，所述脐带血是在分娩后对小时内获得的纯脐带血；以α-极限必需培养基(αMEM)稀释所得的抗凝剂和脐带血的混合物，随后离心收集单核细胞；以及将获得的单核细胞在αMEM培养基中进行悬浮培养，该培养基中加入干细胞因子、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、IL_3(白细胞介素-3)和IL-6(白细胞介素_6)。由于该方法分离步骤复杂，操作较为困难，因此，并不适宜广泛的推广。
发明内容
本发明提供一种用于快速鉴定人脐血间充质干细胞的试剂盒，以及相应的鉴定用的适配子。
按照CN1878860A中公开的人脐血间充质干细胞分离方法，获得相应的间充质干细胞，作为研究对象。
本发明的目的是提供一种人脐血间充质干细胞的核酸适配体序列。
本发明中，所述的人脐血间充质干细胞的核酸适配体(序列1-5)能够特异结合人脐血间充质干细胞。
本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性分离人脐血间充质干细胞的试剂盒。
从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。中筛选出与人脐血间充质干细胞特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物F(5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’)和R(5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海生工生物公司)，转化DH5a细菌(购自上海生工生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。
本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以人脐血间充质干细胞为正筛靶标，以人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充质干细胞为反筛靶标，筛选与人脐血间充质干细胞特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合人脐血间充质干细胞的序列，本发明中命名为适配体CBMSC-1～5。序列如下：
本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离人成熟的脐血间充质干细胞，所述方法比采用CN1878860A分离的方法具有分离成本低，时间更加简便等优点。
本公开的适配子分子可用作将靶标结合或固定至固相载体的捕获试剂。固相载体可以由具有通常与过滤器、晶片、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组成的基底组成。然而，预期固相载体可由这样的基底组成，其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或任何用于捕获或固定用于诊断、检测或定量研宄的试剂的诊断性检测试剂。
固相载体可以基于所需的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金属表面，以及诸如钢材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的组合。
本发明的有益效果：通过制备特异性的结合人脐血间充质干细胞的适配体以及相应的试剂盒可以用于实现特异性分离纯化人脐血间充质干细胞，所述方法制备简单，成本低廉，可以用于批量制备所述的试剂盒。
具体实施方式
实施例1:人脐血间充质干细胞成熟细胞的制备
按照CN 1878860A中公开的人脐血间充质干细胞分离培养方法，获得相应的的人脐血间充质干细胞，所述细胞为阳性表达:CD29，CD44，而阴性表达:CD34、CD45、CD14。
实施例2核酸适配体筛选
从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。
富集所用引物:
F：5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’
R：5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’
将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥；用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl2,2mg/mL BSA,0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库,取250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速离心。
反筛:将250pmol的文库吸入含有人脂肪来源间充质干细胞和人骨髓来源的间充质干细胞的直径6cm培养皿中，细胞浓度为2.0×106个/ml。用结合缓冲液补足到1mL；4℃摇床振荡3h；取上清液。
正筛:将反筛上清液加入到含有实施例1制备的人脐血间充质干细胞培养皿中，细胞浓度为2.0×106个/ml，4℃摇床振荡1h；弃上清液；用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgC12)洗涤人脐血间充质干细胞细胞三遍；用1mL洗涤缓冲液将人脐血间充质干细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待变冷后，10000rpm离心5min；上清转移到一干净的EP管中。
富集:配置PCR体系(总体积1000ul):H20 740ul，10XPCR缓冲液100ul，dNTP 80ul，引物混合物25ul(F:100uM，100uM),DNA模板(正筛上清)50ul，Taq HS酶5ul。
按如下条件在PCR仪上扩增:94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退火20s，72。。延伸20s,20个循环，72℃延伸4min，4℃保温<lh。
纯化:纯化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗两遍，加入150ul GE的StreptavidinSepharose后PBS洗两遍,加入PCR产物,摇床振荡20min,放出液体,PBS洗两遍后,加0.5mLNaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱盐柱，待液体从脱盐柱几乎流尽时加1mL MilliQ水洗脱，同时开始接洗脱液lmL，该洗脱液即为富集了的寡聚DNA文库。将富集了的寡聚DNA文库进行常规的TA克隆，而后进行菌落PCR与测序。测序结果为SEQ ID NO：1-5所示。
实施例3适配子结合特性验证
取人脐血间充质干细胞分别与不同浓度0、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、500nM、800nM、1000nM)的适配子CBMSC-(1～5)孵育20min，洗涤后进行流式细胞术实验，结果发现，随着适配子浓度的增加，其对靶细胞的结合力就越强，最终结合趋于饱和。当适配子与细胞结合率达到50％时，此时所需的适配子的浓度就是其平衡解离常数Kd，由此我们可以得到适配子各自与细胞的结合力常数分别如下：
适配子名称 解离常数Kd(nM)
CBMSC-1 8.9
CBMSC-2 17.6
CBMSC-3 22.5
CBMSC-4 19.6
CBMSC-5 27.4
实施例4所述适配子特异性分析
将50nM的FITC标记的适配子CBMSC-1～5分别与成熟的人骨髓间充质干细胞、人脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞、红细胞结合20min，洗涤，4％的多聚甲醛固定后进行共聚焦显微镜实验，结果发现，对于人脐血间充质干细胞来说，适配子CBMSC-1～5均能很好的与其结合，且在细胞膜上可以看到很明显的荧光，而对于人脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞、红细胞来说，适配子CBMSC-1～5均没有明显地与其结合，所以在荧光场中基本看不到荧光。
通过上述实验得出以下结论:本发明的适配子序列均能很好的与靶细胞结合，而且靶向性也很好。
实施例5分析细胞实验
将本发明的适配子分别偶联磁珠，将培养的成熟人脐血间充质干细胞到无菌离心管中，取1mL细胞悬浮液经流式细胞仪计数其中的人脐血间充质干细胞个数，其数量为4.9X105。分别将偶联有磁珠的适配子与等量的细胞悬浮液(每mL中加入1000个人红细胞)混合孵育20分钟，而后磁分离，即可获得相应的分离的细胞，通过检测剩余的细胞个数，按照(4.9X 105-剩余的个数)/4.9X 105*100％得到了相应的分离效率如下。
适配子名称 分离效率(100％)
CBMSC-1 99.7
CBMSC-2 98.8
CBMSC-3 99.5
CBMSC-4 99.2
CBMSC-5 99.0
对照未偶联适配子的对照 0.13
分别将每一个分离得到的成熟人脐血间充质干细胞通过流式细胞仪以及电镜分析，发现所述的细胞均为人成熟脐血间充质干细胞。这说明，本发明的适配子可以用于很好的分离人成熟脐血间充质干细胞。
实施例6成像效果检测
按照本领域常规的方法将已经标记有磁珠的适配子CBMSC-1与叠氮-荧光量子点复合物相室温孵育偶联2h，形成相应的复合物。其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的20倍。而后，将所述偶联物与混合有人成熟骨髓间充质干细胞、人脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞和红细胞的细胞混合液混合1h，进行荧光成像，通过成像发现，所述的人成熟脐血间充质干细胞分布比较均匀。通过磁性分离，采用细胞标志物鉴定发现，所述的细胞均为人成熟脐血间充质干细胞。
采用适配子CBMSC-2～5也采用上述的成像效果检测，通过成像发现，其效果与适配子CBMSC-1的效果一致。
实施例7分离的人脐血间充质干细胞分化研究
步骤1:将实施例5分离得到的人成熟脐血间充质干细胞培养在真皮成纤维细胞诱导体系，即含高糖DMEM培养基，5％胎牛血清，15ng/mL转化生长因子β1，20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白，0.1Mmol/L地塞米松，100U/mL青霉素和IOOPg/mL链霉素的真皮诱导条件培养基作用下诱导分化为成纤维细胞；
在完全培养基的基础上添加20ng/mL表皮细胞生长因子，20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，10μg/mL胰岛素，/mL维甲酸，/ml氯化钙进行诱导，使其分化为表皮干细胞，其中所述的完全培养基为LG-DMEM含10％的小牛血清、100U/mL青霉素和100μδ/mL链霉素；
通过向经47℃热休克处理的汗腺细胞中，加入约(1-2)XlO5BrdU标记的人脐带间充质干细胞，置于37℃培养5天，使其诱导分化为汗腺细胞。
采用免疫荧光细胞化学双染法检测共培养诱导的细胞，发现分离的人成熟脐血间充质干细胞能够很好的诱导形成相应的表皮干细胞、成纤维细胞、汗腺细胞，可以作为皮肤组织工程种子细胞。这说明本发明分离得到脐血间充质干细胞具有相应的活性，可以使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉魏乃东
〈120〉一种分离人脐血间充质干细胞的试剂盒
〈210〉1
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CBMSC-1
TGGACAGACGTAAGACGTAACCTCATTACATTCCCTTGTATCAAACAACACTTCATTGAGATGCCAGTAGTGACGA
〈210〉2
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CBMSC-2
TGGACAGACGTAAGACGTAAACCCTTCCTCCCCAAACAAACTTTGTTTACCCTTCATGAGATGCCAGTAGTGACGA
〈210〉3
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CBMSC-3
TGGACAGACGTAAGACGTAAAATAAATCTCTTCTATGTCTTACAACTCCCATACTTTGAGATGCCAGTAGTGACGA
〈210〉4
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CBMSC-4
TGGACAGACGTAAGACGTAAAAATCCTCTCCAGACACTTACTCCCAACCTCACTATTGAGATGCCAGTAGTGACGA
〈210〉5
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CBMSC-5
TGGACAGACGTAAGACGTAACTACACCAATCACACAGACTTAATCCACCACATAAATGAGATGCCAGTAGTGACGA

Claims (6)

1.一种用于人脐血间充质干细胞检测的试剂盒，其含有能特异性检测人脐血间充质干细胞的核酸适体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述适体的一端偶联有磁珠，用于富集分离得到的人脐血间充质干细胞。
3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列如
SEQ ID No：1-5任一所示。
4.一种检测人脐血间充质干细胞的方法，其特征在于利用权利要求1所述的试剂盒。
5. SEQ ID No：1-5任一所示的适体在制备用于人脐血间充质干细胞检测的试剂盒中的应用。
6. 一种核酸适体，其特征在于：序列如SEQ ID No：1-5任一所示。
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