JP2010004870A - 細胞分離装置、細胞分離システム及び細胞分離方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞膜表面に蛍光分子または磁性粒子を結合させず、且つ連続処理が可能な細胞分離装置、細胞分離システム及び細胞分離方法を提供する。
【解決手段】試料入口１２から所望の目的細胞が含まれる試料細胞懸濁液を連続的に供給し、生理食塩水入口１４から生理食塩水を連続的に供給すると、試料細胞懸濁液は生理食塩水とともに液体流路１０を流れ、目的細胞には平面状壁面部２０に形成された帯状吸着領域２２の吸着部から、親和性のある結合による吸着力が作用される。この場合、帯状吸着領域２２が液体流路１０の流路方向に対して非対称に配置されているので、目的細胞に作用する吸着力は、流路方向に直交する成分を有することになる。この結果、図１に示される目的細胞は、液体流路１０を所定距離流れる間に平面状壁面部２０の一方側に集まり、目的外成分と連続的に分離することができる。
【選択図】図１
【解決手段】試料入口１２から所望の目的細胞が含まれる試料細胞懸濁液を連続的に供給し、生理食塩水入口１４から生理食塩水を連続的に供給すると、試料細胞懸濁液は生理食塩水とともに液体流路１０を流れ、目的細胞には平面状壁面部２０に形成された帯状吸着領域２２の吸着部から、親和性のある結合による吸着力が作用される。この場合、帯状吸着領域２２が液体流路１０の流路方向に対して非対称に配置されているので、目的細胞に作用する吸着力は、流路方向に直交する成分を有することになる。この結果、図１に示される目的細胞は、液体流路１０を所定距離流れる間に平面状壁面部２０の一方側に集まり、目的外成分と連続的に分離することができる。
【選択図】図１
Description
本発明は、試料細胞懸濁液から幹細胞等の所望の細胞を分離し、回収するための細胞分離装置、細胞分離システム及び細胞分離方法に関する。
従来より、試料細胞懸濁液に含まれる幹細胞等を分離し、回収する技術が種々提案されている。幹細胞を分離する方法としては、例えば蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）、免疫磁気細胞分離法（ＩＭＣＳ）、免疫吸着法等がある。下記特許文献１には、ＩＭＣＳの例が開示されている。また、下記非特許文献１には、免疫吸着法の例が開示されている。
ADHESION-BASED CELL SORTER WITH ANTIBODY-IMMOBILIZED FUNCTIONALIZED-PARYLENE SURFACE Proc. IEEE Int. Conf. MEMS 2007, Kobe(2007),pp.27-30 Junichi Miwa, et al.
しかし、上記従来の技術において、ＦＡＣＳあるいはＩＭＣＳでは、分離後の細胞の細胞膜表面に蛍光分子または磁性粒子が結合しており、幹細胞のように分離した細胞を生体内に戻すことが前提である場合、蛍光分子または磁性粒子が結合した細胞を生体内に戻すことの安全性が不明であるという問題があった。また、免疫吸着法の場合には、バッチ処理を行う必要があり、高速処理に向かないという問題があった。
本発明は、上記従来の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、細胞膜表面に蛍光分子または磁性粒子を結合させず、且つ連続処理が可能な細胞分離装置、細胞分離システム及び細胞分離方法を提供することにある。
上記目的を達成するために、請求項１記載の細胞分離装置の発明は、所定の細胞が含まれる液体を通過させる液体流路と、前記液体流路の内壁面の少なくとも一部に形成された平面状壁面部と、前記平面状壁面部において、前記所定の細胞の表面との親和性のある結合により前記所定の細胞に対して吸着性を有する吸着部が帯状に形成され、かつ前記液体流路の流れ方向に対して非対称に配置された帯状吸着領域と、を備えることを特徴とする。
請求項２記載の発明は、請求項１記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域が前記平面状壁面部に複数配置されていることを特徴とする。
請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２記載の細胞分離装置において、前記吸着部が前記所定の細胞の細胞膜表面に存在する抗原と特異的に結合する抗体により形成されていることを特徴とする。
請求項４記載の発明は、請求項１から請求項３のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記平面状壁面部には、前記液体流路の流れ方向に対して非対称に複数交互に配置された帯状の凹部及び凸部が形成され、前記吸着部が少なくとも凸部に形成されて前記帯状吸着領域を形成していることを特徴とする。
請求項５記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の形状が直線状であることを特徴とする。
請求項６記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の形状が、階段状であることを特徴とする。
請求項７記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の形状が、波状であることを特徴とする。
請求項８記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の代わりに、前記液体流路の流れ方向に対して非対称に配置される外郭部を有する所定形状の吸着部が１つまたは複数設けられたことを特徴とする。
請求項９記載の細胞分離システムの発明は、請求項１から請求項８のいずれか一項記載の細胞分離装置を複数直列に配列したことを特徴とする。
請求項１０記載の細胞分離方法の発明は、液体流路の内壁面の少なくとも一部に平面状の平面状壁面部を形成し、前記平面状壁面部において、前記所定の細胞の表面との親和性のある結合により前記所定の細胞に対して吸着性を有する吸着部を帯状に形成し、かつ前記液体流路の流れ方向に対して非対称に配置し、前記液体流路に前記所定の細胞が含まれる液体を通過させることを特徴とする。
請求項１から請求項８の発明によれば、細胞膜表面に蛍光分子または磁性粒子を結合させず、且つ連続処理が可能な細胞分離装置を提供できる。
請求項９の発明によれば、複数種類の目的細胞を連続的に分離することができる。
請求項１０の発明によれば、細胞膜表面に蛍光分子または磁性粒子を結合させず、且つ連続処理が可能な細胞分離方法を提供できる。
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施形態という）を、図面に従って説明する。
図１には、本実施形態にかかる細胞分離装置の構成例の概略図が示される。図１において、液体流路１０には試料細胞懸濁液を供給する試料入口１２、生理食塩水を供給する生理食塩水入口１４、目的細胞を取り出す目的細胞取出口１６及び目的細胞以外の成分を排出する目的外成分排出口１８が設けられている。図１の例では、目的細胞が黒丸で示され、目的外成分（細胞等）が白丸で示されている。
また、液体流路１０の内壁面の少なくとも一部には、平面状に構成された平面状壁面部２０が形成されている。この平面状壁面部２０は、必ずしも完全な平面である必要はなく、概ね平面状であればよい。平面状壁面部２０を構成する材料は、表面に抗体等の吸着部を導入するための官能基を有するものであればよい。例えば、ガラス基板の表面にアミノメチル基（−ＣＨ２−ＮＨ２）を有するポリパラキシリレン樹脂（ｄｉＸＡＭ ＫＩＳＣＯ株式会社製）等を一様に蒸着したものを用いることができる。また、上記吸着部は、所定の目的細胞の表面との親和性のある結合により上記所定の細胞に対して吸着性を有するものである。これは、例えば、所定の目的細胞の細胞膜表面に存在する抗原と特異的に結合する抗体により形成することができる。なお、図１に示された液体流路１０では、説明の都合により平面状壁面部２０のみを記載してあるが、平面状壁面部２０を含んで断面が閉じた中空形状となっている。また、断面の一部に開口があってもよい。液体流路１０の断面形状については後述する。
本実施形態においては、平面状壁面部２０に上記吸着部が帯状に固定された帯状吸着領域２２が形成されている。この帯状吸着領域２２は、液体流路１０の流路方向（流れ方向）に対して非対称に、かつ所定間隔毎に複数配置されている。ここで流路方向とは、図１に矢印Ａで示された方向であり、液体流路１０の長手方向である。また、非対称とは、図１に示されるように、流路方向に対して所定角度傾斜されていること等をいう。この場合の傾斜角度は、目的細胞を、液体流路１０を流れる間に流路方向と直交する方向に移動させることができる角度であればよい。また、平面状壁面部２０の幅及び帯状吸着領域２２の幅と相互の間隔は、目的細胞の大きさ等に基づき適宜決定する。
上記吸着部により構成される帯状吸着領域２２は、例えば所定の抗体等を上記平面状壁面部２０の表面に存在する官能基に固定することにより形成する。この場合、平面状壁面部２０に抗体等が所定間隔毎に帯状に固定されるように、平面状壁面部２０の表面の官能基を帯状にパターニングし、しかるのちに官能基に抗体を固定する等の方法により帯状吸着領域２２を形成する。なお、官能基のパターニングには、フォトレジストなどを用いてマスクした後に酸素プラズマによって不要な部分の官能基を除去するなどの方法を用いることができる。
図２には、帯状吸着領域２２における抗体等の固定化方法の説明図が示される。図２において、ポリパラキシリレン樹脂（パリレン）からなる樹脂基板２４の表面にはアミノメチル基（−ＣＨ２−ＮＨ２）が存在しており、このアミノ基にカルボキシ基が結合した抗原（Ａｇ）を酸アミド結合により固定化し、この抗原Ａｇに抗体Ａｂを結合させて固定化している。
図３（ａ），（ｂ），（ｃ）には、液体流路１０の断面形状の例が示される。図３（ａ）の例では、平面状壁面部２０を除く断面が矩形となっており、図３（ｂ）の例では、平面状壁面部２０を除く断面がアーチ状となっており、図３（ｃ）の例では、平面状壁面部２０を除く断面の一部が開口している。ただし、液体流路１０の断面形状は、これらに限られるものではなく、目的細胞、処理量等に応じて適宜決定することができる。
図１に戻り、試料入口１２から所望の目的細胞が含まれる試料細胞懸濁液を連続的に供給し、生理食塩水入口１４から生理食塩水を連続的に供給する。試料細胞懸濁液は生理食塩水とともに液体流路１０を流れ、目的細胞（黒丸）は、平面状壁面部２０に形成された帯状吸着領域２２の吸着部から、親和性のある結合による吸着力が作用される。この親和性のある結合は、例えば抗原抗体相互作用、リガンドとレセプタ間の相互作用、ビオチンとアビジンの相互作用、電荷（正電荷と負電荷）による相互作用、糖鎖とレクチン間の相互作用等に基づくものである。また、上述したように、帯状吸着領域２２が液体流路１０の流路方向に対して非対称に配置され、所定角度傾斜しているので、目的細胞に作用する吸着力は、流路方向に直交する成分を有することになる。この結果、図１に示される目的細胞は、液体流路１０を所定距離流れる間に平面状壁面部２０の一方側に集まる。なお、目的細胞が集まる側が、平面状壁面部２０において試料入口１２とは反対側となるように帯状吸着領域２２の傾斜角度を調整しておくのが、目的細胞の分離上好適である。このようにして平面状壁面部２０の一方側に集められた目的細胞は、同じ側に設けられている目的細胞取出口１６から連続的に取り出される。
一方、目的外成分（白丸）には、帯状吸着領域２２の吸着部からの吸着力が作用せず、試料入口１２から流入した位置のまま、すなわち流路方向に直交する方向に移動しないで液体流路１０中を流れる。この結果、平面状壁面部２０の試料入口１２と同じ側に設けられた目的外成分排出口１８から連続的に排出される。
以上の結果、試料入口１２から供給された試料細胞懸濁液に含まれる目的細胞を、目的外成分から連続的に分離することができる。また、その際に、細胞膜表面に蛍光分子または磁性粒子を結合させる必要がない。
図４には、本実施形態にかかる細胞分離装置の他の構成例の概略図が示され、図１と同一要素には同一符号を付している。図４において、特徴的な点は、平面状壁面部２０に、液体流路１０の流路方向に対して非対称に複数交互に配置された凹部及び凸部が形成されている点にある。なお、本実施形態における平面状壁面部２０は、平らな平面に凹部及び凸部が形成されているという意味で平面状としている。また、少なくとも凸部の頂部平面には所定の抗体等が固定された吸着部が設けられ、帯状吸着領域２２を形成している。なお、凹部底面及び凸部と凹部とを結ぶ側壁にも吸着部が設けられていてもよい。
図４に示された液体流路１０においても、帯状吸着領域２２の傾斜角度は、目的細胞を、液体流路１０を流れる間に流路方向と直交する方向に移動させることができる角度であればよい。また、平面状壁面部２０の幅及び帯状吸着領域２２の凸部の幅と相互の間隔は、目的細胞の大きさ等に基づき適宜決定する。なお、帯状吸着領域２２の凸部の幅と相互の間隔は、通過する目的細胞が凹部の底面に接触しない様に設定される。
図５（ａ），（ｂ），（ｃ）には、以上に述べた帯状吸着領域２２の形状の例が示される。図５（ａ）の例では、矢印で示される流路方向に対して非対称に、すなわち所定角度傾斜した帯状吸着領域２２が直線状に複数形成されており、上述した図１及び図４と同様の形状となっている。なお、本例では、帯状吸着領域２２の形状を単純化して直線のみにより表現しているが、それぞれの直線により挟まれた領域には、吸着部が当該領域のひとつおきに設けられている。また、以下に述べる図５（ｂ），（ｃ）においても同様である。図５（ｂ）の例では、帯状吸着領域２２が階段状に複数形成されており、図５（ｃ）の例では、帯状吸着領域２２が波状に複数形成されている。ただし、帯状吸着領域２２の形状は、これらに限られるものではなく、目的細胞、処理量等に応じて適宜決定することができる。
図６（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）には、帯状吸着領域２２の代わりに使用することができる吸着部の例が示される。いずれも、矢印で示される流路方向が図の横方向となっている。
図６（ａ）では、直角三角形の形状の吸着部３６が複数配置されている。また、直角三角形の外郭部の一部である斜辺が流路方向に対して非対称となるように傾斜して配置されている。なお、本例では、直角三角形の斜辺が流路方向の下流側になるように配置されているが、上流側になるように配置されてもよい。また、吸着部３６が整列して配置されているが、外郭部の一部が流路方向に対して非対称となっていればランダムな配置としてもよい。また、流路方向に対して非対称となる外郭部（例えば斜辺）が流路方向の下流側で目的細胞を分離する側、例えば図１の目的細胞取出口１６が配置された側に向くように配置する。
図６（ｂ）では、弓形の形状の吸着部３６が複数配置されている。また、弓形の外郭部の一部である弦が流路方向に対して非対称となるように傾斜して配置されている。なお、本例では、弦が流路方向の下流側になるように配置されているが、上流側になるように配置されてもよい。また、吸着部３６が整列して配置されているが、外郭部の一部が流路方向に対して非対称となっていればランダムな配置としてもよい。また、流路方向に対して非対称となる外郭部（例えば弦）が流路方向の下流側で目的細胞を分離する側、例えば図１の目的細胞取出口１６が配置された側に向くように配置する。
図６（ｃ）では、長方形の形状の吸着部３６が複数配置されている。また、長方形の外郭部である辺が流路方向に対して非対称となるように傾斜して配置されている。なお、本例では、吸着部３６が整列して配置されているが、外郭部の一部が流路方向に対して非対称となっていればランダムな配置としてもよい。また、流路方向に対して非対称となる外郭部（例えば長辺）が流路方向の下流側で目的細胞を分離する側、例えば図１の目的細胞取出口１６が配置された側に向くように配置する。この場合、短辺は流路方向の下流側で長辺とは異なる方向を向くが、長方形の長辺の方が短辺よりも目的細胞を移動させる距離が長いので、目的細胞を目的外成分から分離する方向に移動させることができる。
図６（ｄ）では、上記各吸着部３６が複数種類混合されて、かつランダムに配置されている。この場合、流路方向に対して非対称となる外郭部のうち、流路方向の下流側で目的細胞を分離する側を向くものの長さの合計が、これとは異なる方向を向くものの長さの合計より長くなるように各吸着部３６を配置する。
図７には、本実施形態にかかる細胞分離システムの構成例の概略図が示される。図７では、上述した細胞分離装置が３段直列に接続されている。ここで、直列とは、ある段の細胞分離装置の目的外成分排出口１８を次段の細胞分離装置の試料入口１２に接続することをいう。このような構成によれば、３種類の目的細胞を分離することができる。また、各細胞分離装置の平面状壁面部２０に形成された帯状吸着領域２２は、各目的細胞に対してそれぞれ吸着性を有するものが使用される。この場合、ある細胞分離装置の帯状吸着領域２２は、当該細胞分離装置の目的細胞に対してのみ吸着性を有し、他の細胞分離装置により分離される目的細胞に対しては吸着性を有しないものを選択するのが好適である。ただし、目的細胞の種類や分離工程の都合によっては、他の細胞分離装置により分離される目的細胞に対しても吸着性を有するものを使用することもできる。
図７において、１段目の細胞分離装置の試料入口１２から複数種類の目的細胞を含む試料細胞懸濁液を供給し、生理食塩水入口１４から生理食塩水を供給すると、平面状壁面部２０に形成された帯状吸着領域２２の作用により、目的細胞１が１段目の細胞分離装置の目的細胞取出口１６から取り出される。また、目的細胞１以外の成分は、目的外成分として１段目の細胞分離装置の目的外成分排出口１８から２段目の細胞分離装置の試料入口１２に供給される。２段目の細胞分離装置でも同様にして、平面状壁面部２０に形成された帯状吸着領域２２の作用により、目的細胞２が２段目の細胞分離装置の目的細胞取出口１６から取り出される。また、目的細胞２以外の成分は、目的外成分として２段目の細胞分離装置の目的外成分排出口１８から３段目の細胞分離装置の試料入口１２に供給される。３段目の細胞分離装置においても同様に分離が行われ、目的細胞３が３段目の細胞分離装置の目的細胞取出口１６から取り出され、これ以外の成分は、目的外成分として３段目の細胞分離装置の目的外成分排出口１８から排出される。
以上の様にして、図７に示された本実施形態にかかる細胞分離システムでは、３種類の目的細胞を分離することができる。なお、細胞分離システムにおける細胞分離装置の段数は３段に限られず、目的細胞の種類数に応じて段数を決定することができる。また、図７に示された例では、帯状吸着領域２２が使用されているが、図６（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）に示された吸着部３６を使用してもよい。
以上に述べた各実施形態によれば、蛍光粒子（分子）あるいは磁性粒子などのマーカーを使用しなくても目的細胞を分離することができる。また、試料細胞懸濁液を細胞分離装置に単に流し込むだけで目的細胞を分離できるので、分離のための周辺機器や外部からの操作を全くと必要としない。このため、大型のＦＡＣＳやＩＭＣＳなどの装置に比べて小型化が極めて容易である。さらに、試料細胞懸濁液や生理食塩水の供給のためのポンプその他の動力も不要である。
以上に述べた実施形態の実施例を以下に説明する。
実施例１．
細胞分離装置の製造
図８（ａ）〜（ｅ）には、本実施形態にかかる細胞分離装置の製造方法の工程図が示される。図８（ａ）おいて、シリコンウェハ２６の両面を熱酸化し、シリコン酸化膜を２００ｎｍ形成する。このシリコン酸化膜上にポジ型フォトレジスト (ＡＺエレクトロニックマテリアルズ製 ＡＺＰ４４００)２８を積層し、流路構造を配置したフォトマスクを使用してフォトリソグラフィーによって液体流路１０をパターニングする。
細胞分離装置の製造
図８（ａ）〜（ｅ）には、本実施形態にかかる細胞分離装置の製造方法の工程図が示される。図８（ａ）おいて、シリコンウェハ２６の両面を熱酸化し、シリコン酸化膜を２００ｎｍ形成する。このシリコン酸化膜上にポジ型フォトレジスト (ＡＺエレクトロニックマテリアルズ製 ＡＺＰ４４００)２８を積層し、流路構造を配置したフォトマスクを使用してフォトリソグラフィーによって液体流路１０をパターニングする。
次に、フォトレジストをマスクにして、高密度プラズマエッチング装置（ＵＬＶＡＣ製 ＣＥ−３００Ｉ）を用いてシリコン酸化膜のドライエッチングを行いパターニングする。このとき、プロセスガスにはＣＨＦ３を用いる。続いて、シリコン酸化膜をマスクにし、シリコンの非等方性ドライエッチングプロセスであるボッシュ法による反応性イオンエッチング（Ｄｅｅｐ−ＲＩＥ）によって、図８（ｂ）に示されるように、液体流路１０となる流路溝を形成する。このプラズマエッチングには、誘導カップリングプラズマ反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）装置（Ａｌｃａｔｅｌ製 ＡＭＳ−１００）を用い、プロセスガスは、エッチングにＳＦ６、側壁保護にＣ４Ｆ８、エッチングの補助ガスとしてＯ２を用いる。
また、図８（ｃ）に示されるように、パイレックス（登録商標）製のガラスウェハ３０上に電子線リソグラフィーによって、帯状吸着領域２２となる幅１μｍ程度の微細凹凸パターンを形成する。この微細凹凸パターンは、帯状に形成され、液体流路１０の流路方向に対して所定角度傾斜されて所定間隔毎に複数配置されている。また、電子線レジストとしては、化学増幅型のポジ型レジスト（富士フィルム社製 ＦＥＰ−１７１）を用い、当該レジストをスピンコート後、導電性高分子（昭和電工社製 エスペイサー３００ＡＸ）をスピンコートする。電子線レジストをパターニングした後、パイレックスガラスのドライエッチング（深さ２５０ｎｍ）を行う。
以上に説明したシリコンウェハ２６及びパイレックス製のガラスウェハ３０は、ともにフォトレジストによって表面を保護した後、ダイシングソー（ディスコ製 ＤＡＤ３４０）を用いて２ｘ２ｃｍ２のチップに切り分けて、図８（ｄ）に示されるように、それぞれシリコン基板２７及びガラス基板３１とする。その後、シリコン基板２７には、超音波加工器（超音波工業製）を用いて、試料入口１２、生理食塩水入口１４、目的細胞取出口１６及び目的外成分排出口１８を設ける。
また、図８（ｄ）において、シリコン基板２７およびガラス基板３１とも入念に洗浄した後、パリレン蒸着装置（日本パリレン製 ＰＤＳ−２０１０）を用いて、パリレン (ポリパラキシリレン樹脂) ３２、３４を表面に一様に蒸着する。シリコン基板２７のパリレン３２にはｄｉＸＣ（ＫＩＳＣＯ株式会社製）を２μｍ、ガラス基板３１のパリレン３４にはアミノメチル基（−ＣＨ２−ＮＨ２）を有するｄｉＸＡＭ（ＫＩＳＣＯ株式会社製）を０．１μｍ蒸着する。パリレン３２、３４を蒸着した両基板２７、３１を顕微鏡で位置合わせした後、ナノインプリント装置（ナノクラフトテクノロジー社製 ＮＩ−２７３）を用いて熱圧着する。このときの熱圧着条件は、圧力１０Ｐａ以下、温度１５０°Ｃ、荷重２０００Ｎ、熱圧着時間３０分とした。これにより、図８（ｅ）に示されるように、平面状壁面部２０を有する液体流路１０が形成される。
次に、以下の手順により平面状壁面部２０に抗体模擬物質であるストレプトアビジンを固定化する。
まず、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンの１ｍｇ／ｍＬジメチルスルホキシド溶液を、ｐＨ８．５に調整したビシン緩衝液１ｍＬに溶解し、シリンジを用いて液体流路１０内に導入し、１時間静置する。次に、液体流路１０内を超純水で洗浄した後、ストレプトアビジン１ｍｇをｐＨ ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ ｍＬに溶解したものを導入し、３０分間静置する。最後にＰＢＳで洗浄する。これにより、平面状壁面部２０の凹凸にビオチンを介してストレプトアビジンが固定化され、帯状吸着領域２２が形成される。
以上の工程により、図１に示されるような細胞分離装置が完成する。
実施例２．
細胞分離試験
目的細胞の模擬粒子としてビオチン付き蛍光粒子（４７５ｎｍ励起）を用い、目的外成分の模擬粒子としてストレプトアビジン付きの蛍光粒子（５２０ｎｍ励起）を用いた。これらの模擬粒子を混合した試料細胞懸濁液を試料入口１２から供給し、生理食塩水入口１４から生理食塩水を供給した。これらの供給には、シリンジポンプ（Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ製 ＣＭＡ４００）を用いた。また、目的細胞取出口１６及び目的外成分排出口１８の付近まで流れた各模擬粒子各１００個を、モノクロ冷却ＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ社製 Ｒｏｌｅｒａ ＸＲ）を用いて撮影し、各模擬粒子の平面状壁面部２０における流路方向と直交する方向の位置及び数を計測した。
細胞分離試験
目的細胞の模擬粒子としてビオチン付き蛍光粒子（４７５ｎｍ励起）を用い、目的外成分の模擬粒子としてストレプトアビジン付きの蛍光粒子（５２０ｎｍ励起）を用いた。これらの模擬粒子を混合した試料細胞懸濁液を試料入口１２から供給し、生理食塩水入口１４から生理食塩水を供給した。これらの供給には、シリンジポンプ（Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ製 ＣＭＡ４００）を用いた。また、目的細胞取出口１６及び目的外成分排出口１８の付近まで流れた各模擬粒子各１００個を、モノクロ冷却ＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ社製 Ｒｏｌｅｒａ ＸＲ）を用いて撮影し、各模擬粒子の平面状壁面部２０における流路方向と直交する方向の位置及び数を計測した。
本実施例では、帯状吸着領域２２の傾斜角度が４５度のものを使用した。また、モノクロ冷却ＣＣＤカメラにより、液体流路１０の平面状壁面部２０を２０ｍｍ流れた地点で撮影を行った。また、平面状壁面部２０の幅は２００μｍとした。
図９には、上記計測結果が示される。図９において、横軸が平面状壁面部２０の幅方向の位置である。幅方向の位置とは、平面状壁面部２０の幅方向（流路方向と直交する方向）において、試料入口１２側からの距離をいう。また、縦軸は粒子数である。
図９に示されるように、目的細胞の模擬粒子（ビオチン付き）は、２０ｍｍ流れた後に、流路方向と直交する方向に１５０μｍ以上の距離まで移動している。一方、目的外成分の模擬粒子（ストレプトアビジン付き）の移動距離は、１４０μｍ以下の距離にとどまっている。従って、本実施例にかかる細胞分離装置により、連続的に細胞の分離が行えることがわかる。
なお、以上に述べた実施例１及び実施例２では、実細胞の代わりにその模擬粒子を使用し、抗体の代わりに抗体模擬物質を使用して細胞分離装置の製造及び効果試験を行ったが、以下に述べる実施例３に示されるように、実細胞及び抗体を使用することもできる。
実施例３．
実細胞による細胞分離試験
実細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞を目的細胞として分離試験を行った。この際に使用した細胞分離装置の製造方法は以下の通りである。
実細胞による細胞分離試験
実細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞を目的細胞として分離試験を行った。この際に使用した細胞分離装置の製造方法は以下の通りである。
まず、上記実施例１の図８（ａ）〜（ｅ）と同様にして、平面状壁面部２０を有する液体流路１０を形成する。次に、実施例１と同様の工程により、平面状壁面部２０の凹凸にビオチンを介してストレプトアビジンを固定化する。
次に、ビオチン標識を行ったヒトＣＤ３１抗体１μｇ／ｍｌを液体流路１０に導入し、３０分間静置する。その後、ＰＢＳで洗浄する。これにより、平面状壁面部２０の凹凸に固定化されたストレプトアビジン上にＣＤ３１抗体を固定することができる。この結果、吸着部をＣＤ３１抗体で構成した帯状吸着領域２２が形成される。
次に、目的細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞に蛍光色素であるＳＹＴＯ２４（４９０ｎｍ励起）で染色する。この染色工程は、目的細胞の分離確認を容易にするためのものであり、本実施例の細胞分離装置により、生体内で使用する目的細胞を分離する際には不要な工程である。
上記染色後のヒト臍帯静脈内皮細胞を、ｐＨ ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に細胞数密度が２ｘ１０６個／ｍｌとなるように分散させて細胞懸濁液とし、試料入口１２から、上記ＣＤ３１抗体により帯状吸着領域２２が形成された細胞分離装置に連続的に導入した。また、ＰＢＳを生理食塩水入り口１４から連続的に導入した。この際の細胞懸濁液とＰＢＳとの流量比は１（細胞懸濁液）：２．５（ＰＢＳ）とした。また、液体流路１０におけるバルクの平均流速は１ｍｍ／ｓであった。なお、試料入口１２及び食塩水入口１４からの各供給には、シリンジポンプ（Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ製 ＣＭＡ４００）を用いた。また、目的細胞取出口１６及び目的外成分排出口１８の付近まで流れた各模擬粒子を、モノクロ冷却ＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ社製 Ｒｏｌｅｒａ ＸＲ）を用いて撮影し、目的細胞である上記染色後のヒト臍帯静脈内皮細胞の平面状壁面部２０における流路方向と直交する方向の位置及び数を計測した。
本実施例では、帯状吸着領域２２の傾斜角度が４５度のものを使用した。また、モノクロ冷却ＣＣＤカメラにより、液体流路１０の平面状壁面部２０を２０ｍｍ流れた地点で撮影を行った。また、平面状壁面部２０の幅は２００μｍとした。
図１０には、上記計測結果が示される。図１０において、横軸が平面状壁面部２０の幅方向の位置である。幅方向の位置とは、平面状壁面部２０の幅方向（流路方向と直交する方向）において、試料入口１２側からの距離をいう。また、縦軸は細胞数である。図１０では、試料入口１２から細胞懸濁液を導入した際の細胞数の分布が実線で示され、上記モノクロ冷却ＣＣＤカメラにより撮影した像から解析した細胞数の分布が斜線の領域で示されている。図１０に示されるように、細胞懸濁液が帯状吸着領域２２が形成された平面状壁面部２０上を流れると、目的細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞が流路方向と直交する方向に移動している。従って、本実施例にかかる細胞分離装置により、連続的に目的細胞の分離が行えることがわかる。
１０ 液体流路、１２ 試料入口、１４ 生理食塩水入口、１６ 目的細胞取出口、１８ 目的外成分排出口、２０ 平面状壁面部、２２ 帯状吸着領域、２４ 樹脂基板、２６ シリコンウェハ、２８ ポジ型フォトレジスト、３０ ガラスウェハ、２７ シリコン基板、３１ ガラス基板、３２、３４ パリレン ３６ 吸着部。
Claims (10)
- 所定の細胞が含まれる液体を通過させる液体流路と、
前記液体流路の内壁面の少なくとも一部に形成された平面状壁面部と、
前記平面状壁面部において、前記所定の細胞の表面との親和性のある結合により前記所定の細胞に対して吸着性を有する吸着部が帯状に形成され、かつ前記液体流路の流れ方向に対して非対称に配置された帯状吸着領域と、
を備えることを特徴とする細胞分離装置。 - 請求項１記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域は前記平面状壁面部に複数配置されていることを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１または請求項２記載の細胞分離装置において、前記吸着部が前記所定の細胞の細胞膜表面に存在する抗原と特異的に結合する抗体により形成されていることを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１から請求項３のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記平面状壁面部には、前記液体流路の流れ方向に対して非対称に複数交互に配置された帯状の凹部及び凸部が形成され、前記吸着部が少なくとも凸部に形成されて前記帯状吸着領域を形成していることを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の形状は、直線状であることを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の形状は、階段状であることを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の形状は、波状であることを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１から請求項４のいずれか一項記載の細胞分離装置において、前記帯状吸着領域の代わりに、前記液体流路の流れ方向に対して非対称に配置される外郭部を有する所定形状の吸着部が１つまたは複数設けられたことを特徴とする細胞分離装置。
- 請求項１から請求項８のいずれか一項記載の細胞分離装置を複数直列に配列したことを特徴とする細胞分離システム。
- 液体流路の内壁面の少なくとも一部に平面状の平面状壁面部を形成し、
前記平面状壁面部において、前記所定の細胞の表面との親和性のある結合により前記所定の細胞に対して吸着性を有する吸着部を帯状に形成し、かつ前記液体流路の流れ方向に対して非対称に配置し、
前記液体流路に前記所定の細胞が含まれる液体を通過させることを特徴とする細胞分離方法。
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Legal Events
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