JP2801818B2 - ラミニンコート細胞培養器具及びその製造方法 - Google Patents
ラミニンコート細胞培養器具及びその製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラミニンをコートした
細胞培養器具及びその製造方法に関するものである。
細胞培養器具及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】シャーレ、フラスコ、マルチプレートな
どの細胞培養器具は、主としてポリスチレン成形品の表
面に低温プラズマ処理、コロナ放電処理等を施し、親水
性を付与したものが市販されている。これらの細胞培養
器具は、足場依存性の細胞では、株化解剖、初代細胞を
問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、角膜
細胞などの培養に広く用いられている。また、血液系細
胞として、株化したリンパ球であるＮＳ−１，ＭＯＬＴ
−４，ＨＵＴ ７８，ＭＴ−４，Jurkatなどのいわゆる
足場非依存性の浮遊細胞等にも広く使用されている。
どの細胞培養器具は、主としてポリスチレン成形品の表
面に低温プラズマ処理、コロナ放電処理等を施し、親水
性を付与したものが市販されている。これらの細胞培養
器具は、足場依存性の細胞では、株化解剖、初代細胞を
問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、角膜
細胞などの培養に広く用いられている。また、血液系細
胞として、株化したリンパ球であるＮＳ−１，ＭＯＬＴ
−４，ＨＵＴ ７８，ＭＴ−４，Jurkatなどのいわゆる
足場非依存性の浮遊細胞等にも広く使用されている。
【０００３】しかし、細胞の種類によって、これらの細
胞培養器具上では細胞の増殖は認められるものの、細胞
の増殖が不十分だったり、細胞の増殖形態が悪かったり
する。特に、初代培養においてはそれが顕著である。そ
こで、コラーゲン、ゼラチンといった細胞外マトリック
スやファイブロネクチン、ラミニン、ヒドロネクチンと
いった接着因子などを培養面にコートし、細胞の接着
性、増殖性を高めることにより対処されることが多い。
胞培養器具上では細胞の増殖は認められるものの、細胞
の増殖が不十分だったり、細胞の増殖形態が悪かったり
する。特に、初代培養においてはそれが顕著である。そ
こで、コラーゲン、ゼラチンといった細胞外マトリック
スやファイブロネクチン、ラミニン、ヒドロネクチンと
いった接着因子などを培養面にコートし、細胞の接着
性、増殖性を高めることにより対処されることが多い。
【０００４】ラミニンは生体由来の細胞外マトリックス
の１つとして広く使用されている。ラミニンをコートす
ることにより、細胞の接着及び伸展が向上する。ＰＣ−
１２などの株化細胞では接着及び伸展度合が良く、又、
血管内皮細胞の初代培養においては、増殖性が向上し、
細胞の形態も良好である。又、ラット肝実質細胞の初代
培養においても接着性が良好である。
の１つとして広く使用されている。ラミニンをコートす
ることにより、細胞の接着及び伸展が向上する。ＰＣ−
１２などの株化細胞では接着及び伸展度合が良く、又、
血管内皮細胞の初代培養においては、増殖性が向上し、
細胞の形態も良好である。又、ラット肝実質細胞の初代
培養においても接着性が良好である。
【０００５】このように、ラミニンは接着系の細胞の培
養に良好な特性を有しているが、難点として不安定なこ
とが挙げられる。そのため、上記の一般の培養器具にコ
ートして滅菌を施すことが出来ない。従って、ラミニン
をコートした培養器具を使用するためには、予め滅菌し
てある培養器具に、無菌的操作という面倒な方法でラミ
ニンをコートしなければならないという欠点があった。
養に良好な特性を有しているが、難点として不安定なこ
とが挙げられる。そのため、上記の一般の培養器具にコ
ートして滅菌を施すことが出来ない。従って、ラミニン
をコートした培養器具を使用するためには、予め滅菌し
てある培養器具に、無菌的操作という面倒な方法でラミ
ニンをコートしなければならないという欠点があった。
【０００６】従来、一般に行われてきたラミニンのコー
トの１例を挙げると次のようになる。まず、無菌的に調
整された市販のラミニンを燐酸緩衝液で希釈して、これ
を培養器具内に表面をカバーする十分量を入れ、１〜２
時間、時によっては２４時間静置し、ラミニン溶液を除
いた後、無菌純水で洗い室温で乾燥させる。
トの１例を挙げると次のようになる。まず、無菌的に調
整された市販のラミニンを燐酸緩衝液で希釈して、これ
を培養器具内に表面をカバーする十分量を入れ、１〜２
時間、時によっては２４時間静置し、ラミニン溶液を除
いた後、無菌純水で洗い室温で乾燥させる。
【０００７】このように、ラミニンを一般の培養器具に
コートしようとした場合、かなり手間がかかる。その理
由の１つが、コート後のラミニンの不安定さであり、こ
れに加えて、操作をクリーンベンチなどの無菌環境下で
行わねばならない煩雑さがあった。従って、ラミニンを
予めコートした細胞培養器具を市販しようとした場合、
上記のような無菌環境下の多くの工程が必要であり、ま
たコート後の保存管理も難しく、コストが高くつくこと
になる。
コートしようとした場合、かなり手間がかかる。その理
由の１つが、コート後のラミニンの不安定さであり、こ
れに加えて、操作をクリーンベンチなどの無菌環境下で
行わねばならない煩雑さがあった。従って、ラミニンを
予めコートした細胞培養器具を市販しようとした場合、
上記のような無菌環境下の多くの工程が必要であり、ま
たコート後の保存管理も難しく、コストが高くつくこと
になる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、主に接着細
胞の培養用として、ラミニンをコートした均一で安価な
細胞培養器具を供給するため、コート後の長期保存及び
滅菌が可能な性能を賦与し、これにより比較的簡単な工
程で、しかも必ずしも無菌的操作を必要としない、ラミ
ニンをコートした細胞培養器具及びその製造方法の開発
を目的とするものである。
胞の培養用として、ラミニンをコートした均一で安価な
細胞培養器具を供給するため、コート後の長期保存及び
滅菌が可能な性能を賦与し、これにより比較的簡単な工
程で、しかも必ずしも無菌的操作を必要としない、ラミ
ニンをコートした細胞培養器具及びその製造方法の開発
を目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに鋭意研究の結果、本発明者らは、基材表面に強い親
水性を付与した後、その表面にラミニンをコートするこ
とにより、安定化し、長期にわたって保存してもラミニ
ンの効果が持続し、かつ、電子線、ガンマー線、エック
ス線などの放射線滅菌を施してもラミニンの効果が失わ
れないことを見いだし、本発明を完成するに至った。
めに鋭意研究の結果、本発明者らは、基材表面に強い親
水性を付与した後、その表面にラミニンをコートするこ
とにより、安定化し、長期にわたって保存してもラミニ
ンの効果が持続し、かつ、電子線、ガンマー線、エック
ス線などの放射線滅菌を施してもラミニンの効果が失わ
れないことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】即ち、本発明は、空気中での水滴滴下によ
り測定した基材表面の接触角が４０度以下である器具、
もしくは表面処理により基材表面の接触角を４０度以下
とした器具の表面に、ラミニンを、0.５〜１０μｇ／cm
2 の範囲でコートしたことを特徴とするラミニンコート
細胞培養器具、及びその製造方法であり、さらには、前
記器具を形成する基材がプラスチックであり、該基材の
表面を低温酸素プラズマもしくは低温空気プラズマで処
理し、基材表面の接触角を４０度以下とする工程や、前
記基材表面にラミニン溶液を接触させ、洗浄、乾燥した
後、さらに放射線照射により滅菌する工程を含む。
り測定した基材表面の接触角が４０度以下である器具、
もしくは表面処理により基材表面の接触角を４０度以下
とした器具の表面に、ラミニンを、0.５〜１０μｇ／cm
2 の範囲でコートしたことを特徴とするラミニンコート
細胞培養器具、及びその製造方法であり、さらには、前
記器具を形成する基材がプラスチックであり、該基材の
表面を低温酸素プラズマもしくは低温空気プラズマで処
理し、基材表面の接触角を４０度以下とする工程や、前
記基材表面にラミニン溶液を接触させ、洗浄、乾燥した
後、さらに放射線照射により滅菌する工程を含む。
【００１１】本発明における細胞培養器具は、ラミニン
コート前の基材表面の、空気中での水滴滴下により測定
した接触角が４０度以下であることが特徴である。接触
角が４０度を越えると、ラミニンの保存や放射線滅菌に
おける安定性が損なわれる。その理由は十分には解明さ
れていないが、親水性化による表面の極性が、コートさ
れたラミニンの構造的な要因に関連するものと推測され
る。また、基材表面の接触角が４０度より大きい場合
は、予め表面処理を施して親水化した後、ラミニンをコ
ートしてもよい。基材表面の親水化処理の方法として
は、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、化学的処理な
どがあるが、接触角４０度以下の親水性が必要なこと、
処理後その親水性を長く維持する必要があること、処理
の簡便性等から低温酸素プラズマ及び低温空気プラズマ
による処理が適当である。
コート前の基材表面の、空気中での水滴滴下により測定
した接触角が４０度以下であることが特徴である。接触
角が４０度を越えると、ラミニンの保存や放射線滅菌に
おける安定性が損なわれる。その理由は十分には解明さ
れていないが、親水性化による表面の極性が、コートさ
れたラミニンの構造的な要因に関連するものと推測され
る。また、基材表面の接触角が４０度より大きい場合
は、予め表面処理を施して親水化した後、ラミニンをコ
ートしてもよい。基材表面の親水化処理の方法として
は、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、化学的処理な
どがあるが、接触角４０度以下の親水性が必要なこと、
処理後その親水性を長く維持する必要があること、処理
の簡便性等から低温酸素プラズマ及び低温空気プラズマ
による処理が適当である。
【００１２】本発明において使用する細胞培養基材の種
類は特に限定しないが、ハンドリングなどを考慮した場
合、プラスチックであることが望ましい。また、細胞培
養の過程で顕微鏡により観察する必要があることから、
透明であることが必要で、このような条件に適したプラ
スチック材料としては、ポリスチレン樹脂、ポリカーボ
ネート樹脂、ポリエステル樹脂、ＴＰＸ樹脂などが挙げ
られる。
類は特に限定しないが、ハンドリングなどを考慮した場
合、プラスチックであることが望ましい。また、細胞培
養の過程で顕微鏡により観察する必要があることから、
透明であることが必要で、このような条件に適したプラ
スチック材料としては、ポリスチレン樹脂、ポリカーボ
ネート樹脂、ポリエステル樹脂、ＴＰＸ樹脂などが挙げ
られる。
【００１３】本発明において使用するラミニンとして
は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来などいずれを用
いても良い。また、ラミニンの溶解に用いる溶媒として
は、特に制限はないが、ラミニンが溶解し、ラミニンを
変質させるものでなければ、何でも使用することができ
るが、コート対象がポリスチレンなどのプラスチックで
あることを考慮すると、水、メチルアルコール、エチル
アルコール、燐酸緩衝液、及びこれらを混合したものが
よい。
は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来などいずれを用
いても良い。また、ラミニンの溶解に用いる溶媒として
は、特に制限はないが、ラミニンが溶解し、ラミニンを
変質させるものでなければ、何でも使用することができ
るが、コート対象がポリスチレンなどのプラスチックで
あることを考慮すると、水、メチルアルコール、エチル
アルコール、燐酸緩衝液、及びこれらを混合したものが
よい。
【００１４】ラミニンのコートの厚さは、0.５〜１０μ
ｇ／cm2 が適切であり、これより薄いと目的表面が十分
にコートされず、ラミニンの効果が不十分でばらつきも
大きくなる。また、この厚さより厚いと基材表面の極性
のラミニン層への効果がおよばなくなり、安定性、耐放
射線滅菌性が得られなくなる。
ｇ／cm2 が適切であり、これより薄いと目的表面が十分
にコートされず、ラミニンの効果が不十分でばらつきも
大きくなる。また、この厚さより厚いと基材表面の極性
のラミニン層への効果がおよばなくなり、安定性、耐放
射線滅菌性が得られなくなる。
【００１５】ラミニン溶液と基材表面の接触時間は特に
限定はしないが、基材表面の接触角が４０度以下であれ
ば数分で十分である。また、ラミニンを基材表面に結合
させた後の洗浄は、ラミニン溶液が溶解するのに用いた
のと同一の溶媒を用いるのが基本であるが、純水を用い
てもよい。洗浄後の乾燥工程は、室温で実施することが
基本であり、４０℃を越えるとラミニンの効果が失活す
る恐れがある。
限定はしないが、基材表面の接触角が４０度以下であれ
ば数分で十分である。また、ラミニンを基材表面に結合
させた後の洗浄は、ラミニン溶液が溶解するのに用いた
のと同一の溶媒を用いるのが基本であるが、純水を用い
てもよい。洗浄後の乾燥工程は、室温で実施することが
基本であり、４０℃を越えるとラミニンの効果が失活す
る恐れがある。
【００１６】最後の滅菌は、ガンマー線滅菌、電子線滅
菌、エックス線滅菌などの放射線による滅菌により実施
する。ＥＯＧ滅菌（エチレン−オキサイドガス滅菌）な
どの化学的滅菌や、高圧蒸気滅菌のような高熱をかける
滅菌法では、ラミニンを変性させる恐れがあるので実施
しないほうがよい。このようにして得られたラミニンコ
ート細胞培養器具は、滅菌後室温保存でも、長期にわた
って、ラミニンの効果を維持することが出来る。
菌、エックス線滅菌などの放射線による滅菌により実施
する。ＥＯＧ滅菌（エチレン−オキサイドガス滅菌）な
どの化学的滅菌や、高圧蒸気滅菌のような高熱をかける
滅菌法では、ラミニンを変性させる恐れがあるので実施
しないほうがよい。このようにして得られたラミニンコ
ート細胞培養器具は、滅菌後室温保存でも、長期にわた
って、ラミニンの効果を維持することが出来る。
【００１７】
【実施例】次に実施例により、本発明をより具体的に説
明する。 実施例１ 射出成形した直径３５mmのポリスチレン樹脂製シャーレ
に低温酸素プラズマ処理を施し、表面の接触角が３５度
のシャーレを得た。これにラミニンを純水に溶解して、
0.005 ％濃度に調製した溶液を１ml入れ、約２時間放置
した。その後、溶液を捨て、純水で１回洗浄し、室温で
乾燥させた後、ガンマー線滅菌を施して、培養試験に供
した。 実施例２ 実施例１で得られたラミニンコートシャーレを、室温で
６ヶ月間保存し試験に供した。
明する。 実施例１ 射出成形した直径３５mmのポリスチレン樹脂製シャーレ
に低温酸素プラズマ処理を施し、表面の接触角が３５度
のシャーレを得た。これにラミニンを純水に溶解して、
0.005 ％濃度に調製した溶液を１ml入れ、約２時間放置
した。その後、溶液を捨て、純水で１回洗浄し、室温で
乾燥させた後、ガンマー線滅菌を施して、培養試験に供
した。 実施例２ 実施例１で得られたラミニンコートシャーレを、室温で
６ヶ月間保存し試験に供した。
【００１８】比較例１ 住友ベークライト(株)製の培養用シャーレ（ＭＳ−１０
３５０、接触角６０度）に、無菌的操作により0.005 ％
ラミニン溶液を２ml入れ、約２時間放置した後、溶液を
あけ、無菌純水により洗浄し、クリーンベンチ内で乾燥
して得たラミニンコートシャーレを、培養試験に供し
た。 比較例２ 比較例１で得られたラミニンコートシャーレを、６ヶ月
間室温保存した後、培養試験に供した。
３５０、接触角６０度）に、無菌的操作により0.005 ％
ラミニン溶液を２ml入れ、約２時間放置した後、溶液を
あけ、無菌純水により洗浄し、クリーンベンチ内で乾燥
して得たラミニンコートシャーレを、培養試験に供し
た。 比較例２ 比較例１で得られたラミニンコートシャーレを、６ヶ月
間室温保存した後、培養試験に供した。
【００１９】比較例３ 比較例１で得られたラミニンコートシャーレに、ガンマ
ー線滅菌を施した後、培養試験に供した。 比較例４ 比較例３で得られたラミニンコートシャーレを、６ヶ月
間室温保存した後、培養試験に供した。 比較例５ 比較例１で使用した、住友ベークライト(株)製の培養用
シャーレ。
ー線滅菌を施した後、培養試験に供した。 比較例４ 比較例３で得られたラミニンコートシャーレを、６ヶ月
間室温保存した後、培養試験に供した。 比較例５ 比較例１で使用した、住友ベークライト(株)製の培養用
シャーレ。
【００２０】上記実施例及び比較例の試料シャーレを用
いて、HeLa 53 細胞について、細胞の初期接着性、及び
増殖形態（伸展度合）を調べた。 １．細胞の初期接着率の測定 ＡＳＦ３０１培地（味ノ素社製）を用い、１×104 個／
mlの濃度で２mlずつ各シャーレに播種し、細胞播種後、
１０分及び３０分での細胞の接着率を測定した。 ２．細胞の伸展度合の観察 ＡＳＦ３０１培地（味ノ素社製）を用い、１×104 個／
mlの濃度で２mlずつ各シャーレに播種し、培養２４時間
での細胞の増殖形態を倒立顕微鏡により観察した。
いて、HeLa 53 細胞について、細胞の初期接着性、及び
増殖形態（伸展度合）を調べた。 １．細胞の初期接着率の測定 ＡＳＦ３０１培地（味ノ素社製）を用い、１×104 個／
mlの濃度で２mlずつ各シャーレに播種し、細胞播種後、
１０分及び３０分での細胞の接着率を測定した。 ２．細胞の伸展度合の観察 ＡＳＦ３０１培地（味ノ素社製）を用い、１×104 個／
mlの濃度で２mlずつ各シャーレに播種し、培養２４時間
での細胞の増殖形態を倒立顕微鏡により観察した。
【００２１】各測定、観察の結果は表１に示した通り
で、本発明におけるラミニンコート細胞培養器具は、コ
ート後にガンマー線滅菌を施してもラミニンの効果は失
活せず、長期間保存してもラミニンの効果が変わらず維
持されていることが明白である。
で、本発明におけるラミニンコート細胞培養器具は、コ
ート後にガンマー線滅菌を施してもラミニンの効果は失
活せず、長期間保存してもラミニンの効果が変わらず維
持されていることが明白である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【発明の効果】本発明に従うと、コート後の滅菌が可能
で、製造工程においては無菌的操作の必要がなく、特別
な無菌的環境をつくる必要がなく、設備的に簡便なもの
ですむため低コストでの生産が可能である。又、室温で
も長期にわたる保存ができるため、輸送や保管の際に冷
蔵庫などの特別な設備を必要とせず、流通的にみてもコ
ストを低く抑えることができ、量産して広く供給できる
ラミニンコート細胞培養器具として好適である。
で、製造工程においては無菌的操作の必要がなく、特別
な無菌的環境をつくる必要がなく、設備的に簡便なもの
ですむため低コストでの生産が可能である。又、室温で
も長期にわたる保存ができるため、輸送や保管の際に冷
蔵庫などの特別な設備を必要とせず、流通的にみてもコ
ストを低く抑えることができ、量産して広く供給できる
ラミニンコート細胞培養器具として好適である。
Claims (4)
- 【請求項１】 空気中での水滴滴下により測定した基材
表面の接触角が４０度以下である器具、もしくは表面処
理により基材表面の接触角を４０度以下とした器具の表
面に、ラミニンを、0.５〜１０μｇ／cm2 の範囲でコー
トしたことを特徴とするラミニンコート細胞培養器具。 - 【請求項２】 空気中での水滴滴下により測定した基材
表面の接触角が４０度以下である器具、もしくは表面処
理により基材表面の接触角を４０度以下とした器具に、
水、メチルアルコール、エチルアルコール、燐酸緩衝
液、もしくはこれらの２種以上からなる混合液にラミニ
ンを溶解させた溶液を注入して基材表面に接触させ、該
溶液を排出し、洗浄した後、４０℃以下の温度で乾燥す
ることを特徴とするラミニンコート細胞培養器具の製造
方法。 - 【請求項３】 請求項２において器具を形成する基材が
プラスチックであり、該基材の表面を低温酸素プラズマ
もしくは低温空気プラズマで処理し、基材表面の接触角
を４０度以下とすることを特徴とするラミニンコート細
胞培養器具の製造方法。 - 【請求項４】 前記基材表面にラミニン溶液を接触さ
せ、洗浄、乾燥した後、さらに放射線照射により滅菌す
ることを特徴とする、請求項２もしくは請求項３に記載
のラミニンコート細胞培養器具の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4252609A JP2801818B2 (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | ラミニンコート細胞培養器具及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4252609A JP2801818B2 (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | ラミニンコート細胞培養器具及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698757A JPH0698757A (ja) | 1994-04-12 |
| JP2801818B2 true JP2801818B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=17239753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4252609A Expired - Fee Related JP2801818B2 (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | ラミニンコート細胞培養器具及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2801818B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005034060A (ja) * | 2003-07-15 | 2005-02-10 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 生化学研究用器具 |
| JP2005110676A (ja) * | 2003-09-17 | 2005-04-28 | Think Engineering Kk | 生細胞培養基材、該基材の製造方法、および該製造方法に用いるエッチング処理装置、並びに生細胞の培養方法 |
| JP4967238B2 (ja) * | 2005-01-31 | 2012-07-04 | 住友ベークライト株式会社 | 細胞培養容器の製造方法および細胞培養容器 |
| US7858142B2 (en) * | 2006-10-17 | 2010-12-28 | Henrich Cheng | Laminin-modified conduit for nerve regeneration and methods of manufacturing the conduit and regenerating nerves using the conduit |
| JP6101351B2 (ja) * | 2013-06-12 | 2017-03-22 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 |
| JP6278324B2 (ja) | 2014-07-16 | 2018-02-21 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントの細胞培養基質活性増強方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63196279A (ja) * | 1987-02-10 | 1988-08-15 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 細胞培養用基材 |
-
1992
- 1992-09-22 JP JP4252609A patent/JP2801818B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0698757A (ja) | 1994-04-12 |
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