CN115845132B - 生物补片及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物补片及其制备方法和用途。生物补片包括具有活性基团的基体，基体上修饰有磷酰胆碱类化合物，其中，磷酰胆碱类化合物源自于如下式(1)所示的化合物：其中，R1表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基；R2、R3相同或不同，各自独立的表示任选被取代的C1～C10的亚烷基或任选被取代的C2～C10的亚烯基；R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基。

Description

生物补片及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种生物补片及其制备方法和用途，具体涉及一种化学修饰的具有抗污和促进血管化功能的SIS基生物补片及其制备方法和用途，属于医用材料领域。
背景技术
糖尿病影响4.25亿人，预计到2045年，全球糖尿病患病率将增至6.29亿。目前，多达25％的糖尿病患者面临终身慢性不愈合伤口的风险，如糖尿病足溃疡(DFUs)，严重时患者将面临截肢的风险；其中至少68％的糖尿病患者在5年内死亡。糖尿病慢性伤口的延迟愈合主要是由于持续性毛细血管出血、慢性炎症、以及潜在的外源性微生物入侵伤口导致的。目前临床采用注射血小板衍生生长因子(PDGF)用于治疗糖尿病慢性伤口损伤，然而注射方式存在的药物分子靶向性以及持续性却受到诸多质疑和挑战，尽管人们开展多种基因、药物的治疗策略，临床报道显示超过50％的DFU患者仍未取得理想治疗效果。由于全球糖尿病患者日益增加以及缺乏有效的突破性治疗手段，开发新型糖尿病慢性炎症伤口损伤治疗方案已成为目前重要的研究性课题。
目前，人们已开发多种负载药物的载体支架用于局部持续性释放药物分子治疗糖尿病伤口损伤。由于软组织再生与血管化高度相关，因此载药体系中常使用活性生长因子(如VEGF)，以及活性金属离子(如Mg2+，Fe3+，Cu2+)用于伤口治疗。尽管在科研领域取得一定理想的伤口修复效果，然而常规的载药体系因为活性因子的价格、稳定性，金属离子的生物毒性等原因限制其在生物医学领域的应用。此外，由于伤口暴露在外界环境存在细菌感染的风险，目前的伤口敷料如Tegaderm，本身不具有抗菌、抗污功能，Tegaderm接触伤口时也不利于伤口周围细胞的迁移和黏附，因此不利于伤口感染的防护以及对慢性炎症的调控。因此，需要研制一种生物相容性好，并且具有抗污功能材料以用于糖尿病型慢性伤口的再生。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在技术问题，本发明的目的在于提供一种生物补片。本发明的生物补片具有优异的抗污和抗细菌黏附的能力，并且本发明的生物补片能够通过快速募集血小板、纤维蛋白发挥止血功效。生物补片中具有的胶原纤维以及其释放出生物活性物质等能够抑制持续的体内炎症反应和加速血管化，促进了伤口的修复与再生。这种具有抗污和促进血管化功能的生物补片，不仅在伤口创伤修复领域，在其它软组织修复领域也具有广阔的应用前景。
进一步地，本发明的生物补片能够用于制备伤口修复制品。在糖尿病型大鼠全层皮肤伤口缺损模型中，本发明的生物补片能够显著促进血管化及促进抗炎的表达，相比现有技术中的商业透明敷料商品，实现了优异的伤口修复效果。本发明的生物补片安全无毒，不会引起免疫反应，是一种性能优异的植入性伤口敷料。
进一步地，本发明还提供一种生物补片的制备方法，该制备方法简单易行，原料易于获取，适合大批量生产。
用于解决问题的方案
[1]、一种生物补片，其包括：具有活性基团的基体，所述基体上修饰有磷酰胆碱类化合物，其中，所述磷酰胆碱类化合物源自于如下式(1)所示的化合物：
其中，R1表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示任选被取代的C1～C10的亚烷基或任选被取代的C2～C10的亚烯基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基。
[2]、根据上述[1]所述的生物补片，其中，在所述活性基团的作用下，所述磷酰胆碱类化合物经反应性单体接枝在所述基体上；优选地，所述反应性单体包括(甲基)丙烯酸类单体、(甲基)丙烯酸酯类单体、(甲基)丙烯酸酐类单体中的一种或两种以上的组合。
[3]、根据上述[1]或[2]所述的生物补片，其中，所述基体源自于生物可降解的生物材料，优选包含有胶原蛋白；和/或，所述活性基团包括羟基和/或氨基。
[4]、根据上述[1]-[3]任一项所述的生物补片，其中，以原子百分比计，所述生物补片包含有60-75at.％的碳元素；15-25at.％的氧元素；8-13at.％的氮元素以及1-5at.％的磷元素。
[5]、一种根据上述[1]-[4]任一项所述的生物补片的制备方法，其包括将式(1)所示的化合物接枝在基体上的步骤。
[6]、根据上述[5]所述的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：在活性基团的作用下，利用反应性单体将所述式(1)所示的化合物接枝在所述基体上。
[7]、根据上述[6]所述的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
使用反应性单体对所述基体进行改性，得到改性产物；
使所述改性产物与式(1)所示的化合物进行迈克尔加成反应，得到修饰有磷酰胆碱类化合物的生物补片。
[8]、根据上述[7]所述的制备方法，其中，将基体和反应性单体置于溶剂中进行改性；其中，基体和反应性单体的质量比为1:10-150。
优选地，所述改性的温度为40-80℃，所述改性的时间为2-6小时。
[9]、根据上述[7]或[8]所述的制备方法，其中，所述迈克尔加成反应是在光引发剂的存在下，在紫外光照射下进行的；优选地，所述紫外光的功率为200-400W，波长为350-400nm。
[10]、根据上述[7]-[9]任一项所述的制备方法，其中，所述式(1)所示的化合物的质量含量为所述基体质量的1-10wt.％；所述基体与所述光引发剂质量比为1:0.05-0.2。
[11]、一种根据上述[1]-[4]任一项所述的生物补片用于制备软组织修复制品、伤口创伤修复制品，特别是制备糖尿病慢性伤口修复制品中的用途。
发明的效果
本发明的生物补片具有优异的抗污和抗细菌黏附的能力，并且本发明的生物补片能够通过快速募集血小板、纤维蛋白发挥止血功效。生物补片中具有的胶原纤维以及其释放出生物活性物质等能够抑制持续的体内炎症和加速血管化，促进了伤口的修复与再生。这种具有抗污和促进血管化功能的生物补片，不仅在伤口创伤修复领域，在其它软组织修复领域也具有广阔的应用前景。
进一步地，本发明的生物补片能够用于制备伤口修复制品。在糖尿病型大鼠全层皮肤伤口缺损模型中，本发明的生物补片能够显著促进血管化及促进抗炎的表达，相比现有技术中的商业透明敷料商品，实现了优异的伤口修复效果。本发明的生物补片安全无毒，不会引起免疫反应，是一种性能优异的植入性伤口敷料。
进一步地，本发明还提供一种生物补片的制备方法简单易行，原料易于获取，适合大批量生产。
附图说明
图1示出糖尿病大鼠慢性伤口条件下组织再生示意图。
图2示出SIS的SEM微观形貌及元素分布情况。
图3示出SIS-MA的SEM微观形貌及元素分布情况。
图4示出实施例1制备的SIS-MPC生物补片的示意图；其中，
图4中a示出制备的SIS-MPC生物补片的化学反应示意图；
图4中b示出SIS-MPC生物补片的总体外观照片；
图4中c示出SIS-MPC生物补片的SEM微观形貌(插图是低分辨下胶原纤维的结构)；
图4中d示出SIS-MPC生物补片的元素分布情况。
图5示出材料的物理化学性能；其中，
图5中a示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片C、N、O、P四种元素的XPS曲线；
图5中b示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片的磷元素的XPS曲线；
图5中c、d、e分别示出SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片氧元素的XPS曲线；
图5中f示出SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片的极限抗拉强度(UTS)；
图5中g、h分别示出SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片的水接触角和水接触角的定量数据；
图5中i示出SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片的蛋白吸附能力示意图(插图图像是用SIS材料预处理后二喹啉甲酸溶液的上清液。
图6示出材料的抗污性能；其中，
图6中a示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片的抗污性能的机制；
图6中b示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌粘附的SEM图像；
图6中c示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上粘附的细菌数量的半定量分析示意图。
图7示出材料的细胞相容性；
图7中a示出细胞相容性评估方案，从分离L929成纤维细胞并将其接种到SIS补片上进行分析；
图7中b示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片使用钙黄绿素-AM/PI和罗丹B/DAPI进行活/死染色和细胞骨架染色的示意图；
图7中的c示出当细胞在SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上生长一天时，使用CCK-8试剂检测L929活性结果示意图；
图7中的d示出H&E染色以显示SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上的细胞。
图8示出材料对糖尿病大鼠全层伤口愈合的评估；
图8中a示出动物评估方案，包括不治疗损伤(对照组)、商业伤口敷料(Tegaderm)、SIS和SIS-MPC；
图8中b示出对照组、Tegaderm、SIS和SIS-MPC生物补片在第0天、第3天、第6天和第12天的伤口照片；
图8中c示出伤口再生的半定量跟踪示意图；
图8中d示出对照组、Tegaderm、SIS和SIS-MPC生物补片的伤口收缩情况对比图；
图8中e示出第12天定位伤口的H&E染色结果示意图；
图8中f示出第12天肉芽组织宽度的对比图；
图8中g示出上皮厚度的定量分析对比图。
图9示出伤口愈合过程机制的研究；
图9中a示出第12天不同组CD31的免疫组织化学染色；
图9中b示出伤口缺陷的代表性免疫荧光图像；红色荧光表示TNF-α的表达，绿色荧光对应于CD163的表达，细胞核用DAPI(蓝色)染色；
图9中c、d以及e分别示出对CD31、TNF-α和CD163的染色图像的归一化强度进行半定量分析。
图10示出SIS-MPC生物补片和Tegaderm对糖尿病大鼠慢性伤口修复作用的基因组学分析；其中，
图10中a示出上调和下调mRNA的差异表达基因的聚类热图；
图10中b示出不同上调和下调mRNA的维恩图；
图10中c示出差异表达基因的火山图；
图10中d示出KEGG富集上调mRNA的分析示意图；
图10中e示出SIS-MPC生物补片的VEGF和ECM受体信号通路的GSEA-KEGG富集图。
图11示出GSEA GO富集分析SIS-MPC生物补片激活细胞化学止血及细胞离子止血信号通路。
图12示出Tegaderm、SIS以及SIS-MPC生物补片的血小板及纤维蛋白沉积情况。
图13中术后12天a示出血液学检查和b示出血清中生化分析指标。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸馏水、高纯水、纯净水等能够使用的任何可行的水。
本说明书中，使用“常温”、“室温”时，其温度可以是10-40℃。
<第一方面>
本发明的第一方面提供一种生物补片，其包括：具有活性基团的基体，所述基体上修饰有磷酰胆碱类化合物，其中，所述磷酰胆碱类化合物源自于如下式(1)所示的化合物：
其中，R1表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基；
R2、R3各自独立的表示任选被取代的C1～C10的亚烷基、或任选被取代的C2～C10的亚烯基；
R4、R5、R6各自独立的表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基。
本发明的生物补片具有优异的抗污和抗细菌黏附的能力。且本发明的生物补片能够通过快速募集血小板、纤维蛋白发挥止血功效。生物补片中所具有的胶原纤维以及其所释放出生物活性物质等能够抑制持续的体内炎症和加速血管化，促进了伤口的修复与再生。这种具有抗污和促进血管化功能的生物补片，不仅在伤口创伤修复领域，在其它软组织修复领域也具有广阔的应用前景。
基体
本发明的基体为包含有活性基团的基体。本发明对基体不作特别限定，可以是本领域常用的一些基体。在本发明中，所述基体源自于生物可降解的生物材料，优选为主要含有胶原蛋白的生物材料，所述胶原蛋白可以是天然来源的、人工合成的、经过改性或交联处理的，包括但不限于粘膜下层、真皮层、心包层、胶原、明胶等。
在本发明的一些实施方式中，所述基体源自于小肠粘膜下层，优选源自于脱细胞的小肠粘膜下层，即可以使用小肠粘膜下层制备得到本发明的基体。在本发明的一些实施方式中，所述基体源自于真皮层，优选源自于脱细胞的真皮层，即可以使用真皮层制备得到本发明的基体。在本发明的一些实施方式中，所述基体源自于膀胱粘膜下层，优选源自于脱细胞的膀胱粘膜下层，即可以使用膀胱粘膜下层制备得到本发明的基体。在本发明的一些实施方式中，所述基体源自于心包层，优选源自于脱细胞的心包层，即可以使用心包层制备得到本发明的基体。所述粘膜下层(例如小肠粘膜下层)、真皮层和心包层等优选来源于哺乳动物，例如猪，牛，羊，狗，猫等。
在本发明的一个实施方式中，所述基体源自于脱细胞的猪小肠粘膜下层。该猪小肠粘膜下层，可以经市售购买得到。猪小肠粘膜下层的来源广泛，经济易得，加工方便，且脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层具有优异的生物相容性，富含胶原蛋白和生长因子，能够诱导细胞向内扩散、粘附、生长、增殖，促进组织缺损处自身组织的修复和再生，其适用于作为制备本发明的生物补片的基体使用。因此，本发明优选使用猪小肠粘膜下层作为原料制备得到的猪小肠粘膜下层材料基体作为基体使用。
对于猪小肠粘膜下层材料基体的制备方法，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的一些制备方法，当然，猪小肠粘膜下层材料基体也可以通过市售购买得到。作为优选，本发明的猪小肠粘膜下层材料基体可以按照CN107007886A中的制备方法进行制备得到。
在本发明的另一种实施方式中，所述基体也可以是采用含有胶原蛋白的化学物质制备得到的纤维膜。对于纤维膜，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的纤维膜，例如：无纺纤维膜或纺丝纤维膜等。
本发明的无纺纤维膜可以使用含有胶原蛋白的化学物质以及任选存在的其它高分子聚合物或其衍生物中的一种或两种以上的组合通过无纺工艺处理得到。本发明的纺丝纤维膜可以使用含有胶原蛋白的化学物质以及任选存在的其它高分子聚合物或其衍生物中的一种或两种以上的组合通过静电纺丝技术、离心力纺丝技术、热熔喷丝技术、熔融电纺技术等工艺处理得到。
其它高分子聚合物或其衍生物可以是本领域中各种常用的高分子聚合物或其衍生物。如可以选自天然高分子聚合物中一种或两种以上的组合。举例而言，常用的高分子聚合物或其衍生物可以是纤维素、硫酸软骨素、壳聚糖、改性壳聚糖、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸、纤维素、海藻酸、淀粉中一种或两种以上的组合。
作为优选，基于本发明的基体，使得本发明的所述生物补片包含有胶原纤维，由于胶原纤维的存在，使得本发明的生物补片的作用能够更好的发挥。
进一步地，在本发明的所述基体上具有一些活性基团，具体地，所述活性基团包括羟基和/或氨基，利用这些活性基团的化学反应，可以使基体上修饰磷酰胆碱类化合物。
式(1)所示的化合物
在本发明的所述基体上修饰有磷酰胆碱类化合物，其中，所述磷酰胆碱类化合物源自于如下式(1)所示的化合物。
其中，R1表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示任选被取代的C1～C10的亚烷基或任选被取代的C2～C10的亚烯基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、任选被取代的C1～C10的烷基、任选被取代的C2～C10的烯基、任选被取代的C2～C10的炔基或任选被取代的C1～C10的烷氧基。
在一些具体的实施方案中，R1表示氢原子、卤素原子、C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C2～C10的炔基或C1～C10的烷氧基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示C1～C10的亚烷基或C2～C10的亚烯基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C2～C10的炔基或C1～C10的烷氧基。
在一些更为具体的实施方案中，R1表示氢原子、卤素原子、C1～C6的烷基、C2～C6的烯基、C2～C6的炔基或C1～C6的烷氧基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示C1～C6的亚烷基或C2～C6的亚烯基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、C1～C6的烷基、C2～C6的烯基、C2～C6的炔基或C1～C6的烷氧基。
在一些更为具体的实施方案中，R1表示氢原子、卤素原子、C1～C4的烷基、C2～C4的烯基、C2～C4的炔基或C1～C4的烷氧基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示C1～C4的亚烷基或C2～C4的亚烯基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、C1～C4的烷基、C2～C4的烯基、C2～C4的炔基或C1～C4的烷氧基。
在一些最为具体的实施方案中，R1表示氢原子、卤素原子、C1～C4的烷基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示C1～C4的亚烷基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、C1～C4的烷基。
本发明中，所述卤素原子可以是氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等，优选为氯原子或溴原子。
反应性单体
在本发明中，所述反应性单体能够与基体的活性基团发生反应，以实现对基体的改性，从而使磷酰胆碱类化合物经反应性单体接枝在所述基体上，得到修饰有磷酰胆碱类化合物的生物补片。
在一些具体的实施方案中，所述反应性单体能够与磷酰胆碱类化合物发生迈克尔加成反应，以使得磷酰胆碱类化合物能够接枝在所述基体上。
优选地，所述反应性单体包括(甲基)丙烯酸类单体、(甲基)丙烯酸酯类单体、(甲基)丙烯酸酐类单体中的一种或两种以上的组合。
具体地，在本发明中，所述反应性单体可以是(甲基)丙烯酸2-羟乙酯、(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸酐等中的一种或两种以上的组合。
元素含量
在本发明中，以原子百分比计，所述生物补片包含有60-75at.％的碳元素，例如：62at.％、65at.％、68at.％、70at.％、72at.％等；15-25at.％的氧元素，例如：18at.％、20at.％、22at.％等；8-13at.％的氮元素，例如：9at.％、10at.％、11at.％、12at.％等；以及1-5at.％的磷元素，例如：2at.％、3at.％、4at.％等。由于本发明的所述生物补片中含有磷元素，可以说明生物补片上引入了磷酰胆碱类化合物。进一步，以猪小肠粘膜下层材料基体为例，对其进行元素含量测试时，以原子百分比计，所述猪小肠粘膜下层材料基体包含有65-75at.％的碳元素，例如：62at.％、65at.％、68at.％、70at.％、72at.％等；13-20at.％的氧元素，例如：15at.％、18at.％、20at.％等；8-14at.％的氮元素，例如：9at.％、10at.％、11at.％、12at.％、13at.％等；以及0.1-1at.％的磷元素，例如：0.3at.％、0.5at.％、0.7at.％等。可见，其中含有的磷元素的含量非常低，从这个角度也可以说明生物补片上引入了磷酰胆碱类化合物。
<第二方面>
本发明的第二方面提供一种根据本发明第一方面所述的生物补片的制备方法，其包括将式(1)所示的化合物接枝在基体上的步骤。本发明中利用基体中富含的多种化学活性基团，例如羟基、氨基等为表面化学改性提供可能性。
本发明通过将式(1)所示的化合物接枝在基体以使得生物补片的功能得到最有效的发挥。
在一些具体的实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：在活性基团的作用下，利用反应性单体将所述式(1)所示的化合物接枝在所述基体上。
进一步，在一些更为具体的实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
使用反应性单体对所述基体进行改性，得到改性产物；
使所述改性产物与式(1)所示的化合物进行迈克尔加成反应，得到修饰有磷酰胆碱类化合物的生物补片。
本发明可以通过迈克尔加成反应使得式(1)所示的化合物接枝在基体上，从而得到修饰有磷酰胆碱类化合物的生物补片。
进一步，将基体和反应性单体置于溶剂中进行改性；其中，基体和反应性单体的质量比为1:10-150，例如：1:20、1:40、1:60、1:80、1:100、1:120、1:140等。当基体和反应性单体的质量比为1:10-150时，所述改性产物上能够获得合适的量的反应性基团，有利于后续迈克尔加成反应的进行。
优选地，所述改性的温度为40-80℃，例如：45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃等；所述改性的时间为2-6小时，例如：2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时等。当所述改性的温度为40-80℃，所述改性的时间为2-6小时时，改性反应能够有效进行，且所获得的改性产物能够适用于继续与式(1)所示的化合物进行迈克尔加成反应。
在一些具体的实施方案中，所述迈克尔加成反应是在光引发剂的存在下，在紫外光照射下进行的；优选地，所述紫外光的功率为200-400W，例如：220W、250W、300W、350W等；波长为350-400nm，例如：360nm、370nm、380nm、390nm等。当紫外光的功率为200-400W，波长为350-400nm时，迈克尔加成反应能够有效进行。
在一些具体的实施方案中，所述式(1)所示的化合物的质量含量为所述基体质量的1-10wt.％，例如：2wt.％、4wt.％、6wt.％、8wt.％等；所述基体与所述光引发剂的质量比为1:0.05-0.2，例如：1:0.08、1:0.1、1:0.12、1:0.15、1:0.18等。当所述式(1)所示的化合物的质量含量为所述基体质量的1-10wt.％时，所获得的产物中磷元素的含量较为合适，能够作为生物补片使用。当所述基体与所述光引发剂的质量比为1:0.05-0.2时，迈克尔加成反应能够有效进行。
进一步，在本发明中，所述光引发剂包括酮类光引发剂，例如：α-酮戊二酸、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、α-羟基环己基苯基甲酮、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮等中的一种或两种以上的组合。
另外，所述光引发剂还可以是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦等其它常用的光引发剂。
<第三方面>
本发明的第三方面提供一种根据本发明第一方面所述的生物补片用于制备软组织修复制品、伤口创伤修复制品中的用途，特别是在制备糖尿病慢性伤口修复制品中的用途。
图1示出糖尿病大鼠慢性伤口条件下组织再生示意图。使用本发明的生物补片附着于伤口时，猪小肠粘膜下层材料基体中的基体将募集血小板和纤维蛋白沉积，第一步诱导止血。本发明的生物补片进而能够排斥外源性细菌入侵，同时释放内源性生物活性因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)，用于组织再生。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在实施例和比较例中，猪小肠粘膜下层材料基体按照下述的制备方法制备得到。
(1)原料的初处理：
取猪小肠粘膜下层组织材料(猪小肠粘膜下层组织材料又称为猪小肠粘膜下层SIS)分割成宽8cm，长15cm的规定尺寸，剔除无用组织(例如淋巴组织)，用自来水冲洗2次，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的猪小肠粘膜下层组织材料置于滤网等滤水装置5分钟以上，将水滤干。取用猪小肠粘膜下层组织材料时，将滤水后的猪小肠粘膜下层组织材料用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)病毒灭活：
采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡猪小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度为1％(体积百分比)、乙醇的浓度为24％(体积百分比)，过氧乙酸-乙醇溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为5︰1，灭活时间2小时，灭活温度(即浸泡猪小肠粘膜下层组织材料的过氧乙酸-乙醇溶液的温度)范围为20℃。
(3)清洗过程：
采用清洗液清洗猪小肠粘膜下层组织材料，清洗液为pH值为7.2-7.4的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30:1，优选清洗3次，每次20分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与猪小肠粘膜下层组织材料比例为30:1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率40kHz，功率3000W。
(4)脱细胞：
脱细胞液为包括质量百分比浓度0.025％胰蛋白酶和浓度为0.5mmol/L的EDTA-2Na的PBS溶液；脱细胞液pH值为7.2-7.4；脱细胞液与猪小肠粘膜下层组织材料混合比例(体积比)为30:1，脱细胞过程在双频超声波装置中进行，包含低频和高频两个频率，其中低频频率为20KHz，高频频率为80KHz，超声功率为5KW，其中低频处理10min，高频处理10min，温度为30℃；超声功率5000W。
(5)清洗过程：
采用清洗液进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，超声波的功率为3000W。清洗液为pH7.2-7.4的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30:1，优选清洗3次，每次20分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与猪小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为30:1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μS/cm终止，频率40kHz，功率为3000W。
(6)固定成型：
在模具上进行，所述模具包括带针底板与压框，需要根据不同的规格尺寸选择不同的模具，将步骤(5)制备的猪小肠粘膜下层基质材料平铺于带针底板上，将所述压框放置于猪小肠粘膜下层基质材料上，压框的尺寸可为最终裁剪的尺寸或更宽，将所述带针底板和所述压框相对固定。
(7)真空冷冻干燥：
在真空冷冻干燥机中进行，产品的冷冻干燥工艺需要根据不同的设备重新确认，将模具平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1分钟，开启压缩机对冻干箱致冷，将步骤(6)的模具连同上面的猪小肠粘膜下层基质材料预冻至-45℃，保温1.5小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，真空冷冻干燥完成；冷冻干燥装置的腔室内的压强为20-25Pa。
甲基丙烯酸酐(MA)和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)购自阿拉丁(中国)。α-酮戊二酸购自Sigma-Aldrich(美国)。除另有说明外，其他试剂均为分析级试剂，由北京化学试剂有限公司(中国)提供。
实施例中，所有数值数据均为平均值±标准差。采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，分析各组之间的差异。使用Student t检验确定两组之间的统计差异，*p<0.05被认为具有统计学显著性，而**p<0.01被认为具有高度显著性，***p<0.001被认为具有非常高度显著性。
实施例1
将猪小肠粘膜下层材料基体(100mg，5cm×5cm)与甲基丙烯酸酐(12mL)一起加入去离子水中(50mL)。反应在50℃下保持4小时，在300rpm恒速下，然后用去离子水冲洗三次，获得的改性产物标记为SIS-MA。
将SIS-MA补片与2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱粉末(5mg)和α-酮戊二酸(10mg)一起加入去离子水中(10mL)。在完全溶解小分子后，将反应在紫外光下保持30分钟(300W，360nm)，然后用去离子水冲洗补片三次后冷冻干燥，获得的生物补片标记为SIS-MPC。
实施例2
将猪小肠粘膜下层材料基体(100mg，5cm×5cm)与甲基丙烯酸酐(4mL)一起加入去离子水中(50mL)。反应在80℃下保持4小时，在300rpm恒速下，然后用去离子水冲洗三次，获得的改性产物标记为SIS-MA。
将SIS-MA补片与2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱粉末(5mg)和α-酮戊二酸(10mg)一起加入去离子水中(10mL)。在完全溶解小分子后，将反应在紫外光下保持30分钟(300W，360nm)，然后用去离子水冲洗补片三次后冷冻干燥，获得的生物补片标记为SIS-MPC。
实施例3
将猪小肠粘膜下层材料基体(100mg，5cm×5cm)与甲基丙烯酸酐(1mL)一起加入去离子水中(50mL)。反应在50℃下保持4小时，在300rpm恒速下，然后用去离子水冲洗三次，获得的改性产物标记为SIS-MA。
将SIS-MA补片与2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱粉末(10mg)和α-酮戊二酸(10mg)一起加入去离子水中(10mL)。在完全溶解小分子后，将反应在紫外光下保持30分钟(300W，360nm)，然后用去离子水冲洗补片三次后冷冻干燥，获得的生物补片标记为SIS-MPC。
实施例4
将猪小肠粘膜下层材料基体(100mg，5cm×5cm)与甲基丙烯酸酐(8mL)一起加入去离子水中(50mL)。反应在40℃下保持4小时，在300rpm恒速下，然后用去离子水冲洗三次，获得的改性产物标记为SIS-MA。
将SIS-MA补片与2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱粉末(10mg)和α-酮戊二酸(10mg)一起加入去离子水中(10mL)。在完全溶解小分子后，将反应在紫外光下保持30分钟(300W，360nm)，然后用去离子水冲洗补片三次后冷冻干燥，获得的生物补片标记为SIS-MPC。
对比例1
取猪小肠粘膜下层材料基体作为对比例1使用，标记为SIS。
对比例2
将猪小肠粘膜下层材料基体(150mg，5cm×5cm)与MA(12mL)一起加入去离子水中(50mL)。反应在50℃下保持4小时，在300rpm恒速下，然后用去离子水冲洗三次，获得的改性产物标记为SIS-MA。
性能测试
对实施例和比较例中获得的样品进行以下测试：
1.实施例和比较例中材料的特性
1.1材料形貌与亲水性
将补片提交给扫描电子显微镜(SEM)(日本日立S4800)以观察形态结构，并使用能量色散光谱(EDS)来表征元素分布。同时，将补片提交给X射线光电子能谱(XPS，ESCLAB250Xi，VG Scientific，MA)以分析原子比。
本发明中选用的基体是SIS，其成分及结构主要是胶原蛋白，如图2所示。由于胶原中富含多种化学活性基团，例如羟基、氨基等，因此为表面化学改性提供可能性。实施例1中，依次使用甲基丙烯酸酐和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱对SIS进行处理，得到SIS-MPC生物补片，对比例1中，仅使用甲基丙烯酸酐对SIS进行处理，得到SIS-MA。其中，甲基丙烯酸酐改性前后材料表面无显著变化，仍然呈现纤维状形貌(图3)，表面接枝上甲基丙烯酸侧基(即SIS-MA)。在光引发剂α-酮戊二酸和紫外光激发下，SIS-MA上不饱和碳碳双键与2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱中碳碳双键发生迈克尔加成反应，使2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱分子化学接枝到SIS材料上(图4a)。由此得到了柔性的SIS-MPC生物补片(图4b)，其表面是纤维状胶原的形貌，并且因为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的引入，使材料中含有一定特异性磷元素(图4(c,d))。以上结果说明成功制备了一种2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱表面改性的SIS薄膜材料，即SIS-MPC生物补片。
图4中a示出制备SIS-MPC生物补片的示意图，在羟基和胺基等化学活性基团存在的前提下，首先使用甲基丙烯酸酐将甲基丙烯酸基团接枝到SIS上得到SIS-MA，然后通过迈克尔加成反应将2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱接枝到SIS-MA生物补片上；图4中b示出SIS-MPC生物补片的总体外观；图4中c示出SIS-MPC生物补片的SEM微观形貌(插图是低分辨下胶原纤维的结构)；图4中d示出SIS-MPC生物补片的元素分布情况。
使用XPS分析材料表面的元素含量，发现2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的引入极大提高了磷元素的含量(含量从0.5％提升到2.87％，表1)。
表1
与此同时，在XPS全谱分析中，SIS-MPC生物补片中检测到磷元素信号，而SIS和SIS-MA则未检出明显的磷元素信号(图5(a,b))。此外，在高分辨率的氧元素XPS谱图中，明显观察到SIS-MPC生物补片的氧原子状态不同于SIS和SIS-MA的氧原子状态，对应的是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱中磷酸根的氧原子，说明2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱成功引入SIS表面(图5(c-e))。
1.2拉伸实验
将SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片切成规则的片(长3cm，宽1cm)，然后将其加载到万能试验机(Instron 5848，中国)上。试验在室温下以10mm·min-1的拉伸速度进行，以测量应力-应变曲线，极限抗拉强度(UTS)对应于断裂伸长率时的拉伸最大值。
测试实施例1中不同材料的力学特性，在拉伸实验中，SIS的极限抗拉强度为3.48±0.42MPa，经过SIS-MA以及SIS-MPC生物补片的抗拉强度提升，分别为5.84±0.36MPa和4.84±0.40MPa，推测是因为50℃浸泡温度促使胶原发生一定程度热交联导致力学强度上升(图5f)。根据实施例2制备的SIS-MPC生物补片的极限抗拉强度为3.16±1.2MPa。根据实施例3制备的SIS-MPC生物补片的极限抗拉强度为3.3±0.6MPa。根据实施例4制备的SIS-MPC生物补片的极限抗拉强度为2.8±0.3MPa。可见，本发明的SIS-MPC生物补片的力学性能优异。
1.3水接触角
由于MPC属于超亲水性小分子，对SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片进行水接触角测试。将一滴水(10μL)滴在补片上，并使用视频接触角仪(JC2000C1，中国)捕获水接触角，直到达到平衡(约10秒)，测试不同材料的亲水性。
测试结果显示，SIS的水接触角为72.28±4.00°，SIS-MA因为MA是疏水的，所以SIS-MA水接触角出现上升(为83.50±1.27°)，SIS-MPC生物补片的水接触角明显下降到31.60±3.70°(图5(g,h))，其亲水表面对于细胞黏附和防止组织粘连具有重要作用。
1.4蛋白吸附实验
在蛋白质吸收测定之前，将SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片浸入去离子水中2小时，以确保完全渗透。然后将收获的补片(1cm×1cm)浸入牛血清白蛋白(BSA，5mL，0.33％w/v)中1小时，并将上清液送至BCA蛋白检测试剂盒(ThermoFisher，USA)以检测吸附的蛋白。
此外，由于蛋白吸附特性决定材料植入体内引发组织粘连效果，因此对材料的蛋白吸附能力进行检测，SIS-MPC生物补片因为MPC的引入，显著降低了材料对牛血清白蛋白的吸附(图5i)，这是因为MPC的两性离子高亲水性阻碍蛋白的吸附，这种抗蛋白吸附能力可有效降低手术中组织粘连的发生。以上结果说明制备得到的SIS-MPC生物补片具有良好的力学强度、亲水性和抗蛋白吸附能力。
2.抗污实验
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌购自北京三耀科技发展公司(中国)。从LuriaBertani(LB)培养基中回收后，将细菌(104CFU·mL-1)与SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片在37℃下共培养24小时，然后用4％多聚甲醛分别固定SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片4小时。使用梯度乙醇将补片脱水，并置于SEM观察粘附的细菌。同时，通过Image J软件随机选择SEM区域，计数粘附的细菌数量。
图6示出材料的抗污性能。图6中a示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片的抗污染性能的机制，即正常SIS补片易受细菌粘附，而SIS-MPC生物补片由于来自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的季铵化而能够阻碍细菌的粘附。图6中b示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌粘附的SEM图像；图6中c示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上粘附的细菌数量的半定量分析示意图。
皮肤或其它软组织出现损伤使用伤口敷料治疗伤口损伤时，由于常规伤口敷料不具有抗菌特性，易导致伤口被外源性微生物(如细菌、病毒)入侵，延迟伤口的修复过程。而2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱具有优异的抗菌特性，源于亲水性的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱可有效阻碍细菌在补片表面的黏附。
在分别与E.coli和S.aureus共培养后，可观察到SIS以及SIS-MA表面附着大量的细菌，而SIS-MPC生物补片表面粘附的细菌数量显著减少(图6b)，说明SIS-MPC对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌均具有优异的抗污水平。根据多张SEM图片进行半定量统计，发现SIS-MPC生物补片对E.coli和S.aureus的抗污能力是普通生物补片的100倍(图6c)，由此可以看出，本发明的生物补片是一种具有超强抗污能力的SIS-MPC生物补片。
3.细胞相容性实验
将SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片用环氧乙烷灭菌。在培养基中添加含有10％马血清和1％青霉素/链霉素(Gibco，美国)的α-MEM，并将小鼠成纤维细胞以每孔5,000的密度分别接种到SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上。培养24小时后，丢弃培养基并分别用钙黄绿素-AM/PI(阿拉丁，中国)、罗丹明B/DAPI(Thermo，美国)和CCK-8(Dojindo，日本)代替，以评估细胞相容性。荧光图像在共焦激光扫描显微镜(CLSM，TCS SP8，德国徕卡)上捕获。钙黄绿素-AM：λex 490nm，λem 515nm；PI：λex 535nm，λem 617nm；罗丹明B：λex 544nm，λem 576nm；DAPI：λex 360nm，λem 460nm。多功能酶标板(BioRad-680，美国)记录450nm的CCK-8光密度(OD)值，生存率(％)计算为：(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％。其中，OD样品指的是在SIS补片上生长的细胞，OD空白指的是CCK-8试剂基线，OD对照指的是组织培养板上的细胞。图7示出材料的细胞相容性。图7中a示出细胞相容性评估方案，从分离L929成纤维细胞并将其接种到SIS补片上进行分析。图7中b示出SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片使用钙黄绿素-AM/PI和罗丹明B/DAPI进行活/死染色和细胞骨架染色的示意图；图7中c示出当细胞在SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上生长一天时，使用CCK-8试剂检测L929活性结果示意图；图7中d示出H&E染色以显示SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上的细胞。
如图7中a所示，选择小鼠成纤维细胞L929共培养的方式，将L929分别接种到SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上，考查材料对细胞的相容性。活死细胞荧光染色结果显示，L929细胞在SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上生长状态良好，没有明显死细胞产生，L929细胞在SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上铺展状态良好，可见明显的丝状伪足，说明材料利于细胞的增殖和黏附(图7b)。此外，在CCK-8细胞活性定量实验中，SIS、SIS-MA和SIS-MPC生物补片之间无显著性差异，均大于90％的细胞存活率(图7c)，说明材料具有良好的细胞相容性。在H&E染色中，也可见细胞在SIS、SIS-MA以及SIS-MPC生物补片上贴附良好(图7d)。
4.糖尿病慢性伤口损伤模型及病理学评价
所有动物实验均符合《天津市医学实验动物护理指南》，动物方案经易生源基因技术(天津)有限公司机构动物护理与使用委员会批准(编号：YSY-DWLL-2022077)。Sprague-Dawley大鼠(8周龄)注射链脲佐菌素(65mg kg-1，体重，腹腔注射)，7天后测定其血糖水平，以确认糖尿病模型的实现。在异氟醚麻醉后，在大鼠背部进行5mm伤口损伤建模，形成全层皮肤缺损，然后将动物模型分为四组。i)不进行进一步治疗，只留下伤口(设为对照组)；ii)伤口被Tegaderm补片覆盖；iii)伤口被SIS补片覆盖；iv)伤口被SIS-MPC生物补片覆盖。在术后3、6和12天，评估伤口再生的大体外观，其中，将收获的定位组织固定在10％福尔马林中，并切片进行H&E染色、CD31(ab182981、Abcam)和TNF-α/CD106/DAPI(ab220210、ab182422、Abcam)。这些图像是在数字切片扫描设备(日本滨松Nanozoomer)上拍摄的。同时，在根据Illumina的配对末端DNA测序协议，在具有配对末端模块的X-Ten系统(Illumna，Inc.)上进行RNA测序之前，在第12天用Trizol裂解组织(1mm×1mm)24小时。从大约300bp长的片段的每侧测序总共150个bp。
图8示出各种材料对糖尿病大鼠全层伤口愈合的评估。图8中a示出动物评估方案，包括不治疗损伤(对照组)、商业伤口敷料(Tegaderm)、SIS和SIS-MPC生物补片；图8中b示出对照组、Tegaderm、SIS和SIS-MPC生物补片在第0天、第3天、第6天和第12天的伤口照片；图8中c示出伤口再生的半定量跟踪示意图。图8中d示出对照组、Tegaderm、SIS和SIS-MPC生物补片的伤口收缩情况对比图；图8中e示出第12天定位伤口的H&E染色结果示意图；图8中f示出第12天肉芽组织宽度的对比图；图8中g示出上皮厚度的定量分析对比图。
在上述动物实验中，选择糖尿病型SD大鼠5mm全层皮肤缺损模型，将SIS、SIS-MPC生物补片以及商业伤口敷料(Tegaderm)植入伤口部位，不同时间段观察伤口修复情况(图8a)。从大体的伤口组织愈合情况来看，空白对照中伤口愈合缓慢，术后12天仍然存在明显伤口(愈合率为52.95±6.19％)，这主要是由于糖尿病疾病的全身慢性炎症所致。Tegaderm伤口修复效果稍优于空白对照，但12天伤口仍较明显(愈合率为66.83±6.67％)，这是因为Tegaderm不具有调控炎症反应以及密封伤口后加剧了局部伤口组织的低氧微环境。由于SIS材料中富含内源性生物活性成分如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等，因此释放的活性因子利于血管化，从而加速了伤口修复，术后12天伤口明显减小(愈合率为83.35±4.30％)。SIS-MPC生物补片在术后12天伤口效果最优，愈合率为96.63±2.44％，已几乎看不见明显伤口(图8(b-d))，一方面是因为SIS-MPC生物补片中富含的内源性活性因子诱导组织生成，另一方面因为SIS-MPC生物补片的疏松纤维结构，以及抗污能力，防止微生物入侵伤口组织，为组织再生提供稳定、适宜的微环境，从而促进了伤口愈合。在12天H&E染色中，SIS-MPC生物补片可见明显的血管和毛囊生成的迹象，并且肉芽组织的宽度远低于SIS、Tegaderm等(SIS-MPC：1.40±0.26mm，SIS：1.77±0.44mm，Tegaderm：2.59±0.18mm，空白：3.08±0.58mm)，表皮厚度高于SIS、Tegaderm(SIS-MPC：69.78±11.77μm，SIS：51.50±9.14μm，Tegaderm：37.37±4.59μm，空白：20.48±6.48μm；图8(e-g))。以上结果说明，对于难愈合的伤口损伤，SIS-MPC生物补片仍具有优异的促进组织修复的作用。
进一步检验了12天局部组织的组织学变化。图9示出伤口愈合过程机制的研究。图9中a示出第12天不同组CD31免疫组织化学染色；图9中b示出伤口缺陷的代表性免疫荧光图像；红色荧光表示TNF-α的表达，绿色荧光对应于CD163的表达，细胞核用DAPI(蓝色)染色；图9中c、d以及e分别示出对CD31、TNF-α和CD163的染色图像的归一化强度进行半定量分析。
由图9可以看出，在CD31免疫组化染色中，可见在SIS-MPC生物补片出现明显的阳性表达，而Tegaderm组的阳性表达较弱(SIS-MPC生物补片的CD31表达程度是Tegaderm组的1.57倍)。此外，12天的TNF-α/CD163组织荧光三色染色中，作为炎症的标志物，TNF-α在空白组中持续表达，而抗炎的标志物CD163则在空白组中表达较弱，说明在糖尿病模型中慢性炎症反应持续时间长，因此组织修复能力弱。在Tegaderm组中，TNF-α的表达强度未见减弱，CD163有一定上升，说明Tegaderm具有一定促伤口愈合的能力。由于SIS中内源性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等活性成分具有抗炎以及促进组织再生的功效，因此在SIS和SIS-MPC生物补片中TNF-a表达下降(SIS和SIS-MPC生物补片的TNF-α是Tegaderm的0.64和0.65倍)，CD163表达上升(SIS和SIS-MPC生物补片的CD163是Tegaderm的1.29和1.47倍)。
此外，还采用Illumina Novaseq6000高通量测序仪深入研究了SIS-MPC生物补片相比Tegaderm促进伤口修复的内在机制，使用RNA测序方法测量组织裂解液中基因表达的水平。图10示出SIS-MPC生物补片和Tegaderm对糖尿病大鼠慢性伤口修复作用的基因组学分析；其中，图10中a示出上调和下调mRNA的差异表达基因的聚类热图；图10中b示出不同上调和下调mRNA的维恩图；图10中c示出差异表达基因的火山图；图10中d示出KEGG富集上调mRNA的分析示意图；图10中e示出SIS-MPC的VEGF和ECM受体信号通路的GSEA-KEGG富集图。
将术后12天的组织进行匀浆和裂解，进行了RNA-seq基因测序，发现了在SIS-MPC生物补片中有772种基因出现特异性表达，通过进一步分析基因数据，其中有340种基因出现明显上调。在KEGG富集分析显示，SIS-MPC生物补片主要激活TGF-β、MAPK、细胞周期等信号通路，其中，TGF-β刺激细胞增殖并调控细胞外基质的合成，MAPK调控血管化进程，因此，SIS-MPC生物补片具备促进组织修复的有利条件。
另外，使用Illumina Novaseq6000高通量测序仪在SIS-MPC生物补片中还检测到VEGF和ECM-受体相互作用的信号通路、止血等信号通路(图11)。采用HITACHI S4800冷场发射扫描电子显微镜在SIS-MPC生物补片中具有明显的血小板及纤维蛋白沉积，而Tegaderm表面血小板数量十分有限(图12)，因此在伤口出现的早期，Tegaderm对于组织出血的止血能力比较有限。
基于以上结果可以看出，SIS-MPC生物补片促进糖尿病慢性炎症伤口愈合的修复过程：在创伤初期，SIS-MPC生物补片募集血小板和纤维蛋白沉积，为愈合提供初步稳定的生理环境；其次，SIS-MPC生物补片中MPC具有抗污功效，抵御外源性微生物入侵伤口组织，SIS中内源性活性成分释放，降低局部炎症表达，最后，SIS中内源性VEGF释放出来，加速血管化，促进胶原蛋白生成，因此利于伤口愈合。
另外，采用迈瑞全自动血液细胞分析仪，型号BC-5000取12天的血液检测其血常规。采用天津微纳芯科技有限公司，全自动生化分析仪，型号PM4进行生化指标测试，植入材料后血液指标均在正常生理范围(图13)，不会引起异常，具有良好的组织相容性。因此，SIS-MPC生物补片在伤口修复领域，具有优异的修复潜力。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (10)

1.一种生物补片，其特征在于，包括：具有活性基团的基体，所述基体上修饰有磷酰胆碱类化合物，其中，所述磷酰胆碱类化合物源自于如下式(1)所示的化合物：
其中，R1表示氢原子、卤素原子、C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C2～C10的炔基或C1～C10的烷氧基；
R2、R3相同或不同，各自独立的表示C1～C10的亚烷基或C2～C10的亚烯基；
R4、R5、R6相同或不同，各自独立的表示氢原子、卤素原子、C1～C10的烷基、C2～C10的烯基、C2～C10的炔基或C1～C10的烷氧基；
所述基体源自于生物可降解的生物材料，且所述基体包含有胶原蛋白；在所述活性基团的作用下，所述式(1)所示的化合物经反应性单体通过迈克尔加成反应接枝在所述基体上，所述反应性单体包括(甲基)丙烯酸类单体、(甲基)丙烯酸酯类单体、(甲基)丙烯酸酐类单体中的一种或两种以上的组合；
使用XPS分析材料表面的元素含量，其中，所述生物补片包含有60-75at.％的碳元素；15-25at.％的氧元素；8-13at.％的氮元素以及1-5at.％的磷元素；
所述迈克尔加成反应是在光引发剂α-酮戊二酸的存在下，在紫外光照射下进行的。
2.根据权利要求1所述的生物补片，其特征在于，所述活性基团包括羟基和/或氨基。
3.一种根据权利要求1或2所述的生物补片的制备方法，其特征在于，包括在活性基团的作用下，利用反应性单体将式(1)所示的化合物通过迈克尔加成反应接枝在基体上；所述迈克尔加成反应是在光引发剂α-酮戊二酸的存在下，在紫外光照射下进行的。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
使用反应性单体对所述基体进行改性，得到改性产物；
使所述改性产物与式(1)所示的化合物进行迈克尔加成反应，得到修饰有磷酰胆碱类化合物的生物补片。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将基体和反应性单体置于溶剂中进行改性；其中，基体和反应性单体的质量比为1:10-150。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述改性的温度为40-80℃，所述改性的时间为2-6小时。
7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述紫外光的功率为200-400W，波长为350-400nm。
8.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述式(1)所示的化合物的质量含量为所述基体质量的1-10wt.％；所述基体与所述光引发剂质量比为1:0.05-0.2。
9.一种根据权利要求1或2所述的生物补片用于制备软组织修复制品、伤口创伤修复制品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述生物补片用于制备糖尿病慢性伤口修复制品中的用途。
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