JP2003520570A - 位置特定可能なアレイによるリガーゼ検出反応を用いた核酸配列差異の検出 - Google Patents

位置特定可能なアレイによるリガーゼ検出反応を用いた核酸配列差異の検出

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、多数の標的ヌクレオチド配列における、一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失又は転座による一つ又は複数の多数の配列の差異を同定する方法を説明する。ライゲーション期は、標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する一つのオリゴヌクレオチドプローブ、並びに標的配列特異的部分及び検出可能な標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブの間のライゲーション検出反応を利用する。ライゲーション期後、固体支持体にライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブを、少なくともその一部が位置特定可能なアレイ特異的部分に対して相補的であるような固定された捕獲用オリゴヌクレオチドアレイへハイブリダイズさせることにより、捕獲期が実施される。捕獲期の完了後、固体支持体にハイブリダイズされたライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブの標識を検出するために、検出期が実施される。ライゲーション期は、増幅法に先行することができる。本発明はまた、本方法を実施するためのキット、固体支持体上にアレイを形成する方法、および支持体それ自身に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、1999年3月19日付けで申請した米国の仮特許出願第60/125,357号に
おける恩典を主張する。
【０００２】 本発明は、国立衛生研究所（NIH）の助成金（GM-41337-06、GM-43552-05、GM-
42722-07およびGM-51628-02）ならびにNISTの助成金（1995-08-0006F）を受け、
政府資金により開発した。米国政府は権利の一部を有するものとする。
【０００３】 発明の分野 本発明は、ライゲーション期（phase）、捕獲期、および検出期からなる核酸
配列差の検出に関する。ライゲーション期では、標的配列に特異的な部分および
位置特定可能な部分を有するオリゴヌクレオチドプローブと、標的配列に特異的
な部分および検出用標識を有する別のオリゴヌクレオチドプローブとの間のライ
ゲーション検出反応を利用する。捕獲期では、ライゲーションしたオリゴヌクレ
オチドプローブと、位置特定可能なアレイに特異的な部分に対して少なくとも一
部が相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドを整然と並べて固定化した固相支持体と
の間でハイブリッドを形成させる。検出期では、固相支持体とハイブリッドを形
成したライゲーションオリゴヌクレオチドプローブの標識を検出する。
【０００４】 発明の背景配列の差異の検出 多型度の高い遺伝子座の大規模多重分析は、実父確定検査および法科学（Reyn
oldsら, Anal.Chem., 63:2〜15（1991））、臓器移植におけるドナーとレシピエ
ントの組み合わせ（Buyseら, Tissue Antigens, 41:1〜14（1993）ならびにGyll
enstenら, PCR Meth.Appl. 1:91〜98（1991））、遺伝病の診断、予後ならびに
出生前カウンセリング（Chamberlainら, Nucleic Acids Res., 16:11141〜11156
（1988）ならびにL.C.Tsui, Human Mutat., 1:197〜203（1992））、および発癌
性変異の研究（Hollsteinら, Science, 253:49〜53（1991））などにおける個人
の同定に役立てるために必要とされている。また、核酸分析による感染症診断の
費用効果は、パネルテストの多重度により大きく変動する。上述の適用の多くで
は、空間的に近接する場合もある様々な遺伝子座における一塩基の差の識別を基
礎としている。
【０００５】 多数の配列からなる領域を含む試料中の一つまたは複数のポリヌクレオチド配
列の存在を検出するには、様々なDNAハイブリダイゼーション法を利用すること
ができる。断片の捕獲および標識に基づく簡単な方法では、特定の配列を含む断
片を、固定化したプローブに対するハイブリダイゼーションで捕獲する。捕獲断
片は、検出用レポーター部分を含む別のプローブとのハイブリダイゼーションで
標識される。
【０００６】 広く用いられている他の方法にはサザンブロット法がある。本方法では、試料
中のDNA断片の混合物をゲル電気泳動で分画した後にニトロセルロースフィルタ
ーに固定する。ハイブリダイゼーション条件下でフィルターを一つまたは複数の
標識プローブと反応させることで、プローブ配列を含むバンドの存在を同定する
ことができる。本方法は、制限酵素によるDNA切断物中の断片（任意のプローブ
配列を含む）の同定、および制限断片長多型（「RFLP」）の分析に特に有用であ
る。
【０００７】 ポリヌクレオチド試料に含まれる任意の配列または配列群の存在を検出する別
の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ムリス（Mullis）らによる米国特許第4,68
3,202号、およびサイキ（R.K.Saiki）らによる論文（Science 230:1350（1985）
））による配列（または配列群）の選択的な増幅がある。本方法では、特定配列
（または配列群）の反対側の端に相補的なプライマーを用いて、プライマーから
開始される連続的な複製を加熱サイクルで進める。増幅後の配列は、種々の方法
で容易に同定することができる。本方法は例えば、体液試料中の病原体配列の検
出といった、ポリヌクレオチド試料に含まれる低コピー配列を検出する際に特に
有用である。
【０００８】 さらに最近では、プローブライゲーション法で既知の標的配列を同定する方法
が、ホワイトリー（N.M.Whiteley）らによる米国特許第4,883,750号、ウー（D.Y
.Wu）らによる論文（Genomics 4:560（1989））、ランデグレン（U.Landegren）
らによる論文（Science 241:1077（1988））、およびウィンディーン（E.Winn-D
een）らによる論文（Clin. Chem. 37:1522（1991））に記載されている。オリゴ
ヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA）として知られている方法では、対
象標的領域にまたがる2本のプローブまたはプローブエレメントと標的領域との
間でハイブリッドを形成させる。プローブエレメントが、隣接する標的塩基と、
プローブエレメントの直面する端で対合する（塩基対を形成する）と、2本のエ
レメントを例えばリガーゼで処理してライゲーションさせることができる。ライ
ゲーションしたプローブエレメントを対象として次にアッセイを行い、標的配列
の存在を明らかにする。
【０００９】 本アプローチの変法では、ライゲーションプローブエレメントを、相補的なプ
ローブエレメント対の鋳型としてはたらかせる。変性、ハイブリダイゼーション
およびライゲーションのサイクルを2通りの相補的なプローブエレメント対の存
在下で続けることで、標的配列は幾何級数的（すなわち指数関数的）に増幅され
て、微量の標的配列が検出および/または増幅される。本方法はリガーゼ連鎖反
応（「LCR」）と呼ばれる（F.Barany 「Genetic Disease Detection and DNA Am
plification Using Cloned Thermostable Ligase」（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
88:189〜93（1991）および、F.Barany, 「The Ligase Chain Reaction（LCR）in
a PCR World」（PCR Methods and Applications, 1:5〜16（1991））。
【００１０】 検出用標識をもち、［電荷］/［並進運動に伴う摩擦抵抗］比が顕著な配列特
異的プローブと標的をハイブリダイズさせて相互にライゲーション可能であるグ
ロスマン（Grossman）らによる米国特許第5,470,705号において、核酸配列差の
多重検出に関する他の方式が開示されている。本方法はグロスマンらによる論文
（「High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid Sequences: Oligonuc
leotide Ligation Assay and Sequence-coded Separation」Nucl.Acids Res. 22
（21）:4527〜34（1994））において、嚢胞性線維症の膜貫通調節遺伝子を対象
とした大規模多重分析に使用されている。
【００１１】 ジョー（Jou）らによる論文（「Deletion Detection in Dystrophin Gene by
Multiplex Gap Ligase Chain Reaction and Immunochromatographic Strip Tech
nology」 Human Mutation 5:86〜93（1995））では、複数のエキソンの特定領域
を増幅して、各エキソンに対するプローブ上の様々なハプテンの差に特異的な抗
体を有する免疫クロマトグラフィー・ストリップ上で増幅産物を読み取る、いわ
ゆる「ギャップリガーゼ連鎖反応」のプロセスの利用について記載されている。
【００１２】 例えば遺伝子スクリーニングの分野において、標的ポリヌクレオチドに含まれ
る多くの配列のそれぞれの有無の検出に有用な方法はますます必要とされている
。例えば嚢胞性線維症には400種もの多様な変異が関与している。この疾患の遺
伝的素因に対するスクリーニングでは、被験者のゲノムDNA中に含まれうる遺伝
子配列上の多様な変異を調べることで「嚢胞性線維症」陽性者を同定することが
最適である。生じうるあらゆる変異部位の有無を1回のアッセイで調べることが
理想的であろう。しかしながら、上述の先行技術の方法を簡便かつ自動化された
1回のアッセイで特定配列群の検出に応用することは困難である。
【００１３】 固相ハイブリダイゼーションアッセイでは、複数の液体処理段階が必要であり
、一部のインキュベーション温度および洗浄温度を注意深く制御して、一ヌクレ
オチドの誤対合を識別するために必要な厳密さを保たなければならない。本方法
の多重化は、最適なハイブリダイゼーション条件がプローブ配列により大きく変
わることから困難である。
【００１４】 対立遺伝子に特異的なPCR産物は一般にサイズが同じであり、任意の増幅用チ
ューブは、各反応チューブと関連するゲル・レーンにおける産物バンドの有無に
より評価される（Gibbsら, Nucleic Acids Res., 17:2437〜2448（1989））。こ
のような方法は、多様なプライマーの組み合わせを用いた複数の反応チューブ中
の試験試料の分離を必要とすることから、アッセイに要する費用は増大する。PC
Rでもまた、競合する対立遺伝子用プライマーに様々な蛍光色素を結合させるこ
とで、1本の反応チューブで対立遺伝子を識別することができる（F.F.Chehabら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:9178〜9182 （1989））が、このような方式によ
る多重分析は、既存の装置および色素化学の知見を利用して経済的な方法でスペ
クトルに分解可能な色素種がそれほど多くないことから規模の拡大は限られる。
大きな側鎖をもつように修飾した塩基の取り込みを、電気泳動の移動度を元に対
立遺伝子のPCR産物を識別する際に利用することができるものの、本方法は、修
飾塩基がポリメラーゼにより良好に取り込まれることと、これらの基の一つのサ
イズが異なる比較的大きなPCR産物を分解する電気泳動の能力による制限を受け
る（Livakら, Nucleic Acids Res., 20:4831〜4837（1989））。各PCR産物は一
つの変異のみを探索するために用いられ、多重化は困難である。
【００１５】 対立遺伝子特異的プローブのライゲーションでは、固相捕獲法（U.Landegren
ら, Science, 241:1077〜1080（1988）；Nickersonら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
. 87:8923〜8927 （1990））またはサイズに依存した分離法（D.Y.Wuら, Genomi
cs, 4:560〜569（1989）および、F.Barany, Proc.Natl.Acad.Sci., 88:189〜193
（1991））を利用して対立遺伝子のシグナルを分解することが一般的である。し
かし後者の方法は、ライゲーション用プローブのサイズ幅が狭いことから多重化
において制限を受ける。ギャップリガーゼ連鎖反応では、追加的なステップ、す
なわちポリメラーゼによる伸長が必要である。より複雑な多重化に対して電荷/
並進運動に伴う摩擦抵抗の比が顕著なプローブを使用する場合は、電気泳動時間
を長くする必要があるほか、別の検出法の利用が求められる。
【００１６】 したがって、ポリヌクレオチド試料に含まれる複数の特定配列の有無を検出す
るための迅速な単回アッセイが必要であることは変わらない。
【００１７】核酸分析のためのオリゴヌクレオチドアレイの利用 固相支持体に固定化したオリゴヌクレオチドが整然と並んだアレイは、DNAの
配列決定、分類（sorting）、単離および操作における利用が提案されている。
任意の長さのあらゆるオリゴヌクレオチドプローブに対する、クローン化された
1本鎖DNA分子のハイブリダイゼーションでは、分子内に存在する対応する相補的
DNAセグメントを理論的に同定可能であることが認められている。このようなア
レイでは、個々のオリゴヌクレオチドプローブは、固相支持体上のあらかじめ決
めた様々な位置に固定化される。DNA分子中のあらゆるオリゴヌクレオチドセグ
メントは、このようなアレイを利用して調べることができる。
【００１８】 オリゴヌクレオチドアレイを用いてDNA分子の配列を決定する手順の一例が、
ドルマナク（Drmanac）らによる米国特許第5,202,231号に開示されている。この
特許は、複数のオリゴヌクレオチドを結合させた固相支持体に対する標的DNAの
利用に関する。配列は、標的DNAセグメントとオリゴヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションおよびハイブリッドを形成したオリゴヌクレオチドの重複セグメン
トの集合により読み取られる。アレイには11〜22程度のヌクレオチドの長さのあ
らゆるオリゴヌクレオチドを利用することができるが、この種のアレイの構築法
に関する情報は極めて少ない。本件に関しては、チェトベリン（A.B.Chetverin
）らによる論文（「Sequencing of Pools of Nucleic Acids on Oligonucleotid
e Arrays」 BioSystems, 30:215〜31（1993））、クラプコ（Khrapko）らによる
国際公開公報第92/16655号、クズネツォバ（Kuznetsova）らによる論文（「DNA
Sequencing by Hybridization with Oligonucleotides Immobilized in Gel. Ch
emical Ligation as a Method of Expanding the Prospects for the Method」
Mol.Biol. 28（20）; 290〜99（1994））、リビッツ（M.A.Livits）らによる論
文（「Dissociation of Duplexes Formed by Hybridization of DNA with Gel-I
mmobilized Oligonucleotides」J.Biomolec.Struct. & Dynam., 11（4）:783〜8
12（1994））も参照されたい。
【００１９】 サザン（Southern）による国際公開公報第89/10977号では、既知の点変異、ゲ
ノムフィンガープリント法、連鎖解析および配列決定に関する核酸試料の分析に
利用するハイブリダイゼーション反応が可能なオリゴヌクレオチドアレイをもつ
支持体の利用について開示されている。ヌクレオチド塩基を、特定のパターンで
支持体上に配してマトリックスを作製することができる。国際公開公報第89/109
77号では、ペンプロッターまたはマスキングにより集合させるオリゴヌクレオチ
ドを有する支持体に水酸基リンカーを利用することができることが記載されてい
る。
【００２０】 キャンター（Cantor）による国際公開公報第94/11530号もまた、ハイブリダイ
ゼーションによる配列決定のプロセスを実施するためのオリゴヌクレオチドアレ
イの利用に関する。オリゴヌクレオチドは突出部分をもつ2本鎖であり、この突
出部分に標的核酸が結合して2本鎖の非突出部分とライゲーションされる。この
ようなアレイは、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドを捕獲するストレプトア
ビジン被覆濾紙を用いて構築され、集合後に結合させる。
【００２１】 チェトベリン（Chetverin）による国際公開公報第93/17126号では、核酸を分
類して調べる目的で区分化した2成分からなるオリゴヌクレオチドアレイを使用
している。このアレイでは、不変ヌクレオチド配列が、可変ヌクレオチド配列に
隣接して結合しており、いずれの配列も共有結合部を介して固相支持体に結合さ
れる。不変ヌクレオチド配列には、ハイブリッドを形成した鎖をPCRで増幅可能
とするプライミング領域がある。次に、可変領域に対するハイブリダイゼーショ
ンによる分類を行う。2成分アレイ上における断片化核酸の、配列決定、単離、
分類、および操作についても開示されている。感度を強化した一つの態様では、
固定化されたオリゴヌクレオチドには、それとハイブリッドを形成して、カバー
されていないオリゴヌクレオチドの部分を残す短い相補的領域がある。このアレ
イを次にハイブリダイゼーション条件下におくと、固定化されたオリゴヌクレオ
チドに相補的な核酸がアニールする。次にDNAリガーゼを用いて、短い相補的領
域と、アレイ上にある相補的な核酸をライゲーションする。オリゴヌクレオチド
アレイの調製法に関してはほとんど開示されていない。
【００２２】 フォドル（Fodor）らによる国際公開公報第92/10588号では、オリゴヌクレオ
チドアレイに対するハイブリダイゼーションによる核酸の配列決定、フィンガー
プリント法、およびマッピングのプロセスが開示されている。オリゴヌクレオチ
ドアレイは、大規模かつ多様なオリゴヌクレオチドの合成が可能な極めて大規模
に固定化された重合体合成により調製される。この手法では、基盤表面を機能状
態とし、オリゴヌクレオチドを基盤上に集合させるためのリンカー基を導入する
。オリゴヌクレオチドを結合させる領域には、選択的に活性化される保護基が（
基盤または各ヌクレオチドサブユニット上に）ある。通常本方法では、曝露領域
を脱保護するための多様な形状のマスクを用いて、光によるアレイの画像化が必
要である。脱保護領域では保護されたヌクレオチドと化学反応が起きて、オリゴ
ヌクレオチド配列が伸長することで画像化される。2成分マスキング法を用いる
ことで、任意の時間内に2種またはそれ以上のアレイを構築することができる。
検出は、ハイブリッドが形成された領域の位置を決めることでなされる。これに
ついては、フォドルらによる米国特許第5,324,633号および第5,424,186号、ピル
ング（Pirrung）らによる米国特許第5,143,854号および5,405,783号、ピルング
による国際公開公報第90/15070号、ピース（A.C.Pease）らによる論文（「Light
-generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA Sequence Analysis」 Proc
.Natl.Acad.Sci USA 91:5022〜26（1994））も参照されたい。ビーティー（K.L.
Beattie）らによる論文（「Advances in Genosensor Research」Clin.Chem., 41
（5）:700〜09（1995））では、集合済みのオリゴヌクレオチドプローブを固相
支持体に結合させる方法について説明されている。
【００２３】 アレイに対するハイブリダイゼーションに基づく上述の配列決定法には欠点が
多い。第一に、極めて多数のオリゴヌクレオチドを合成する必要がある。第二に
、正しくハイブリダイズしたもの、相応に対合した2本鎖、および誤対合したも
の、の識別が困難である。さらに、ある種のオリゴヌクレオチドは、標準的な条
件下でハイブリッドを形成しにくく、オリゴヌクレオチドが同定能力を得るよう
になるためには、詳細なハイブリダイゼーション条件の検討が必要となる。
【００２４】 本発明は、先行技術における欠点を克服することを目的としている。
【００２５】 発明の概要 本発明は、1か所または複数の箇所における塩基の変化が異なる配列群、標的
ヌクレオチド配列群における挿入、欠失、または転移の一つまたは複数を同定す
る方法に関する。本方法は、ライゲーション期、捕獲期、および検出期からなる
。
【００２６】 ライゲーション期には、複数の配列差を有する一種または複数のヌクレオチド
配列を含むと考えられる試料が必要である。ライゲーション期では複数のオリゴ
ヌクレオチドセットを利用する。各セットには、標的特異的な部分および位置特
定可能なアレイに特異的な部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブ、なら
びに、標的特異的な部分および検出用レポーター標識を有する第2オリゴヌクレ
オチドプローブが含まれる。特定セットの第1および第2のオリゴヌクレオチドプ
ローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリッドを形
成することで相互のライゲーションに適した状態となる。しかし、第1および第2
のオリゴヌクレオチドプローブは、試料中に存在する別のヌクレオチド配列とハ
イブリダイズすると、上述のライゲーションと干渉する誤対合を生じる。またリ
ガーゼも利用する。複数のオリゴヌクレオチドプローブのセットである試料およ
び、リガーゼをブレンドして混合物とする。この混合物を対象に、1回の変性処
理および1回のハイブリダイゼーション処理からなる1回または複数回のリガーゼ
検出反応サイクルを行う。変性処理では、ハイブリッドを形成した任意のオリゴ
ヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離される。またハイブリダイゼーシ
ョン処理では、オリゴヌクレオチドプローブセットを、試料中に存在すると想定
される各標的ヌクレオチド配列に対して、隣接する位置において塩基特異的にハ
イブリッドを形成させ、それらを相互にライゲーションして（a）位置特定可能
なアレイ特異的な部分、（b）相互にライゲーションした標的特異的な部分、お
よび（c）検出用レポーター標識、からなるライゲーション産物配列が形成する
。オリゴヌクレオチドプローブセットは、各標的ヌクレオチド配列よりも試料中
のヌクレオチド配列とハイブリッドを形成すると考えられるが、1か所または複
数の箇所に誤対合があるために相互にライゲーションされることはなく、変性処
理中にそれぞれ分離する。
【００２７】 ライゲーション期に続く捕獲期では、捕獲用オリゴヌクレオチドを特定部位に
固定する固相支持体を利用する。捕獲用オリゴヌクレオチドは、位置特定可能な
アレイに特異的な部分と相補的である。ライゲーション期後の混合物を、位置特
定可能なアレイに特異的な部分と捕獲用オリゴヌクレオチドが塩基特異的に効率
的にハイブリッドを形成する条件下で固相支持体に接触させる。この結果、位置
特定可能なアレイに特異的な部分は、相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドと固相
支持体上で捕獲される。
【００２８】 捕獲期に続いて検出期を行う。検出期では、ライゲーション産物配列のレポー
ター標識が、固相支持体上の特定部位で捕獲される。固相支持体に結合したレポ
ーター標識の存在が検出されれば、試料中に一つまたは複数のヌクレオチド配列
が存在することがそれぞれ明らかとなる。
【００２９】 本発明はまた、リガーゼ、複数のオリゴヌクレオチドセットおよび捕獲用オリ
ゴヌクレオチドを固定化した固相支持体を含む、本発明の方法を実施するための
キットに関する。
【００３０】 本発明の別の局面は、固相支持体上でオリゴヌクレオチドアレイを形成させる
方法に関する。本方法では、オリゴヌクレオチドの結合に適したアレイ位置を有
する固相支持体が提供される。各アレイ位置においてオリゴヌクレオチドを固相
支持体にカップリングさせるのに適したリンカーまたは支持体（非加水分解性と
することができる）を固相支持体に結合させる。多量体ヌクレオチドを結合させ
る特定のアレイ位置を活性化し、活性化されたアレイ位置に多量体ヌクレオチド
を結合させる一連のサイクルを介して固相支持体上にオリゴヌクレオチドアレイ
を調製することができる。
【００３１】 さらに本発明の別の局面は、固相支持体それ自体におけるオリゴヌクレオチド
アレイに関する。固相支持体は、オリゴヌクレオチドの結合にそれぞれ適したア
レイ位置を有する。オリゴヌクレオチドを固相支持体にカップリングさせるのに
適したリンカーまたは支持体（非加水分解性とすることができる）を、個々のア
レイ位置で固体支持体に結合させる。オリゴヌクレオチドアレイは、16残基以上
のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドで占められる少なくとも一部のアレ
イ位置を有する固相支持体上に配される。
【００３２】 本発明のある局面では、表面が多孔性である固相支持体を提供する。
【００３３】 本発明の別の局面では、陰電荷を有効にマスクする条件下で混合物と固相支持
体を接触させる。
【００３４】 本発明には、先行技術のシステムを超える多くの利点がある。特に、複雑な遺
伝子系の多重分析を行う能力に優れている。この結果、試料中の多くのヌクレオ
チド配列差を一度に検出することができる。本発明は、例えば癌原性変異、遺伝
性（生殖系列が関与する）変異、および感染症の検出に有用である。この技術は
また、環境モニタリング、法医学、および食品産業と関連して利用することがで
きる。
【００３５】 また本発明は、正常配列が大勢を占める中における変異の定量検出法を提供し
、集中してクラスターを形成した変異の検出が可能であり、位置特定可能なアレ
イを用いた検出が可能であり、自動化になじみやすい。PCRの感度とLDRの特異性
を組み合わせることで、対立遺伝子に特異的なPCRの段階で遭遇する多くの問題-
偽陽性シグナルの発生、多重化によるプライマーどうしの干渉、定量データの入
手限界、および自動化に対する適切さなど-が克服されている。また、一塩基変
異を識別するLDRの特異性を取り込むことで、オリゴヌクレオチドプローブアレ
イに主要な固有の問題（すなわち、ヘテロ接合体試料中のあらゆる位置における
一塩基変化の識別不能）が克服されている。PCR/LDRは、癌の検出に関する現在
のニーズ-クローンマーカーとしての意味をもつ変異の定量化および微小残存病
変ならびに微小転移の検出-に応えている。
【００３６】 様々な試料の分析を実施する際に、アレイを含む固相支持体を再利用すること
ができる。このため、作製する必要がある固相支持体の量が減り、各試料の分析
にかかる費用が軽減される。
【００３７】 本発明はまた、オリゴヌクレオチドの合成および、固相支持体へのオリゴヌク
レオチドの結合に際して自由度が大きい。オリゴヌクレオチドは固相支持体とは
別に合成した後に支持体上の固有の表面に結合させることができる。本方法は、
完全長のオリゴヌクレオチドまたはペプチドヌクレオチド類似体（PNA）の固相
支持体への結合に利用することができる。あるいは、固相支持体上のオリゴマー
の長さを短くする目的で、より短いヌクレオチドまたは類似体のセグメント（二
量体、三量体、四量体など）の濃縮やブロック合成法に利用することができる。
【００３８】 発明及び図面の詳細な説明 本発明は、複数の標的塩基配列中の一つもしくは複数の単一塩基の変化、挿入
、欠失、もしくは転移によって異なる一つもしくは複数の配列の多重性を同定す
る方法に関する。方法は、ライゲーション期、捕獲期、および検出期を含む。
【００３９】 ライゲーション期には、配列の差異の多様性を伴う潜在的に一つもしくは複数
の塩基配列を含む試料の提供が必要である。複数のオリゴヌクレオチドセットを
この段階で用いる。各々のセットは、標的特異的な部位および位置特定可能なア
レイに特異的な部位を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに標的
特異的な部位および検出可能なレポーター標識を有する第2のオリゴヌクレオチ
ドプローブを含む。特定のセットにおける第1および第2のオリゴヌクレオチドプ
ローブは、対応する標的塩基配列上で相互に隣接してハイブリダイズする場合に
、ともにライゲーションすることに関して好適である。しかしながら、第1およ
び第2のオリゴヌクレオチドプローブは、試料中の別の塩基配列にハイブリダイ
ズする際には、このようなライゲーションを阻害するミスマッチを有する。リガ
ーゼも利用する。混合物の調製には、試料、複数のオリゴヌクレオチドプローブ
のセット、およびリガーゼを混ぜる。混合物を、変性処理およびハイブリダイゼ
ーション処理からなる一つもしくは複数のリガーゼによる検出反応サイクルにか
ける。変性処理は、標的塩基配列由来のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド
のいずれをも分離させることを含む。ハイブリダイゼーション処理は、隣接した
位置のオリゴヌクレオチドプローブのセットを塩基特異的な方法で、試料中にそ
れぞれの標的塩基配列が存在する場合には、それにハイブリダイゼーションさせ
ること、およびそれらを互いにライゲーションして、（A）位置特定可能なアレ
イに特異的な部分（B）互いにライゲーションした標的特異的な部分、および（C
）検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物の配列を生成させること
を含む。該オリゴヌクレオチドプローブのセットは、それぞれの標的塩基配列以
外の試料中の塩基配列にハイブリダイズすることもあるが、この場合一つ以上の
ミスマッチの存在によって互いにライゲーションせずに変性処理中に個々に分離
する。
【００４０】 この方法の次の段階は捕獲期である。この段階は、特定部位に固定化した捕獲
オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を提供することを含む。捕獲オリゴヌク
レオチドは、位置特定可能なアレイに特異的な部分に相補的である。混合物は、
ライゲーション期を経た後、位置特定可能なアレイに特異的な部位にハイブリダ
イズさせることに関して有効な条件下で、塩基特異的な方法で捕獲オリゴヌクレ
オチド固体支持体に接触させる。その結果、位置特定可能なアレイに特異的な部
分は、相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有する部位において固体支持体上に捕
獲される。
【００４１】 本発明の1つの局面は、多孔性表面を有する固体支持体を提供することを含む
。
【００４２】 本発明の別の局面は、陰性電荷のマスクに有効な条件下で混合物を固体支持体
と接触させることを含む。
【００４３】 捕獲期の次は検出期である。該方法のこの段階では、ライゲーション産物の配
列のレポーター標識を、固体支持体上の特定部位に捕獲する。固体支持体に結合
したレポーター標識の存在が検出された場合には、試料中に一つ以上の塩基配列
がそれぞれの存在することが示されるのである。
【００４４】 しばしば、複数の異なる単一塩基の変異、挿入、もしくは欠失が、目的配列の
同一ヌクレオチド位置で起こることがある。この方法は、第2のオリゴヌクレオ
チドプローブが共通で検出可能な標識を含み、かつ第1のオリゴヌクレオチドプ
ローブが異なる位置特定可能なアレイに特異的な部分および標的特異的な部分を
有するオリゴヌクレオチドセットの使用を含む。第1のオリゴヌクレオチドプロ
ーブは、ミスマッチなしに被検配列にハイブリダイズする場合には、第1のライ
ゲーション接合部で第2の隣接したオリゴヌクレオチドプローブにライゲーショ
ンさせるために好ましいものである。異なる第1の隣接するオリゴヌクレオチド
プローブは、接合部位に別の識別塩基を含み、ミスマッチを含まないハイブリダ
イゼーションのみが接合部位置でライゲーション可能となるものである。各々の
第1の隣接したオリゴヌクレオチドは、異なる位置特定可能なアレイに特異的な
部分を含み、従って、特異的塩基の変化が異なるアドレスでの捕獲によって識別
される。このスキームでは、少なくとも1つの塩基により、他の核酸と異なる別
の核酸配列の多重検出を行うために、複数の異なる捕獲オリゴヌクレオチドを、
固体支持体上の異なる位置に結合させてある。または、第1のオリゴヌクレオチ
ドプローブは、共通の位置特定可能なアレイに特異的な部分を含み、第2のオリ
ゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能な標識および標的特異的な部分を有す
る。
【００４５】 このような配置により、少なくとも1つの塩基が他の核酸と異なる別の核酸配
列の多重検出が可能となる。このような多重検出を実施する際には、該核酸配列
が同一もしくは異なる対立遺伝子上に存在する。
【００４６】 本発明はまた、リガーゼを含む本発明の方法を実施するためのキット、複数の
異なるオリゴヌクレオチドプローブのセット、および捕獲オリゴヌクレオチドを
固定化した固体支持体に関する。標的塩基配列の予備的増幅に用いるプライマー
もキットに含まれる。増幅をポリメラーゼ連鎖反応で実施する場合には、ポリメ
ラーゼもキットに含まれる。
【００４７】 図1および2には、キャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動/蛍光の定量化
を利用した先行技術のリガーゼによる検出反応と比較した本発明の方法の流れ図
を示す。図1は生殖系列の変異検出に関し、図2は癌の検出を示す。
【００４８】 図1は、リ-フラウメニ症候群（Li-Fraumenisyndrome）の原因となるp53変異等
の生殖系列における点突然変異の検出を示す。段階1において、DNA試料の調製後
、Taq（すなわち、Thermusaquaticus）ポリメラーゼを用いホットスタートの条
件下でエキソン5〜8をPCR増幅した。反応の最後に、100℃で10分間加熱しTaqポ
リメラーゼを失活させる。段階2では、該産物を対立遺伝子特異的および共通のL
DRプローブを含む新しいLDR緩衝液で20倍に希釈する。チューブは、通常、各プ
ライマーを約100〜200フェムトモル含む。段階3では、リガーゼによる検出反応
は、Taqリガーゼの添加によりホットスタート条件下で開始する。LDRプローブは
、接合部部位における完全な相補性を示す標的配列の存在下でのみ隣接したプロ
ーブとライゲーションする。産物は2つの異なる形態で検出される。第1の形態4a
では、当先行技術分野において用いられる、蛍光標識されたLDRプローブは、異
なる長さのポリAもしくは酸化ヘキサエチレン・テールを含む。従って、僅かに
異なる易動度を有する正常DNAに対するライゲーションで生じる各々のLDR産物は
ピークのラダーを与える。生殖系列の突然変異によって、電気泳動像に新たなピ
ークが生成する。新しいピークのサイズは、概ねもとの試料に存在する変異の量
に相当する。ホモ接合体の正常で0％、ヘテロ接合体のキャリアーで50％、ホモ
接合体の変異体では100％である。第2の形態4bにおいては、本発明に従って、各
々の対立遺伝子特異的プローブは、例えば、付加的な24ヌクレオチド塩基をその
5'末端に含む。これらの配列は、位置特定可能なアレイ上で相補的アドレス配列
に特異的にハイブリダイズする単一の位置特定可能な配列である。LDR反応では
、各々の対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在下で隣接する蛍
光標識した共通プローブに対してライゲーションを行うことができる。野生型お
よび変異体の対立遺伝子は、アレイ上の隣接したアドレスに捕獲される。未反応
のプローブを洗い流す。黒いドットは、野性型対立遺伝子に関して100％のシグ
ナルを示す。白いドットは、変異体の対立遺伝子に関して0％のシグナルを示す
。斜線で示されたドットは、生殖系列の突然変異における1つの位置での各々の
対立遺伝子に関して50％のシグナルを示す。
【００４９】 図2は、p53腫瘍抑制性遺伝子における体細胞変異の検出を表すが、いずれも通
常、低感度の変異検出に関するものである。段階1では、DNA試料を調製し、蛍光
PCRプライマーを用いてエキソン5〜9を3つの断片としてPCRで増幅する。これに
より、段階2でのキャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動を用いたPCR産物の
蛍光の定量化が可能となる。段階3では、マーカーDNAの1/100希釈（3つの断片の
各々に対し）で産物が急増する。癌細胞では観察されない変異を含むが、適当な
LDRプローブで容易に検出されること以外は、このDNAは、野性型DNAに相同であ
る。段階4の混合したDNA産物を変異体もしくはマーカー対立遺伝子に対してのみ
特異的な全LDRプローブを含む緩衝液で20倍に希釈する。段階5では、リガーゼ反
応を、Taqリガーゼの添加によりホットスタート条件下で開始した。接合部部位
における完全な相補性を与える標的配列の存在下でのみ、隣接したプローブに対
してLDRプローブのライゲーションが起こる。図1に記載される同一の2つの形態
で、産物が検出される。段階6aの当先行技術分野において用いられる形態では、
産物はキャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動で分離し、蛍光シグナルを定
量する。変異体ピークのマーカーピークに対する比は、100分割したもとの試料
に存在する癌の突然変異量の概算を与える。段階6bの形態では、本発明に基づい
て、位置特定可能なアレイ上の相補的配列に対する特異的ハイブリダイゼーショ
ンで産物を検出する。マーカードットに対する変異体ドットの蛍光シグナル比は
、100分割したもとの試料に存在する癌の突然変異量の概算を与える。
【００５０】 本発明のリガーゼによる検出反応の方法は、図3〜10を参照することによって
最もよく理解される。一般的には、これは、Baranyらの国際公開公報第90/17239
号；F.Baranyらの「耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過
剰発現および塩基配列（Cloning、OverexpressionandNucleotideSequenceofaThe
rmostableDNALigase-encodingGene）」（Gene.109:1-11（1991））、およびF.Ba
ranyらの「クローン化耐熱のリガーゼを用いた遺伝病の検出およびDNA増幅（Gen
eticDiseaseDetectionandDNAAmplificationUsingClonedThermostableLigase）」
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:189-193（1991））等に記載されており、これら
の開示は参照として本明細書に組み入れられる。本発明のリガーゼによる検出反
応には、2セットの相補的オリゴヌクレオチドを用いることができる。これは、
直ぐ上に示した3つの参考文献に記載のリガーゼ連鎖反応として知られるもので
あり、参照として本明細書に組み入れられる。または、リガーゼによる検出反応
は、オリゴヌクレオチドライゲーション・アッセイとして知られる単一サイクル
を含む。Landegrenらの「リガーゼによる遺伝子検出技術（ALigase-MediatedGen
eDetectionTechnique）」Science241:1077-80（1988）;Landegren らの「DNA診
断薬-分子技術と自動化（DNADiagnostics-MolecularTechniquesandAutomation）
」、Science242:229-37（1988）;およびLandegrenらの米国特許第4,988,617号を
参照のこと。
【００５１】 方法のリガーゼによる検出反応期の際、ハイブリダイゼーションは50〜85℃で
起こるが、変性処理は80〜105℃で実施する。各々のサイクルは、変性処理およ
び全体として約1〜5分の加熱ハイブリダイゼーション処理からなる。通常、ライ
ゲーションによる検出反応は、2〜50サイクルの繰り返し変性とハイブリダイゼ
ーションを行うことを含む。該方法のリガーゼによる検出反応段階にかかる全体
の時間は1〜250分である。
【００５２】 オリゴヌクレオチドプローブのセットは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレ
オチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌク
レオチド類縁体、修飾ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾リン酸塩・糖鎖骨格オ
リゴヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、およびその混合物の形態であってもよ
い。
【００５３】 一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブのセットのオリゴヌクレオ
チドは、各々が66〜70℃のハイブリダイゼーションもしくは融解温度（すなわち
、Tm）を有する。これらのオリゴヌクレオチドは20〜28ヌクレオチドの長さであ
る。
【００５４】 DNAアレイ上にライゲーション産物を捕獲する前に位置特定可能なヌクレオチ
ドアレイ特異的な部分を含む未変換のLDRオリゴヌクレオチドプローブを化学的
もしくは酵素的に破壊することが望ましい。これを行わない場合、このような未
変換のプローブは、相補的配列を含む固体支持体のアレイ上のアドレスで、結合
に関してライゲーション産物と競合する。破壊はエキソヌクレアーゼIII等（L-H
GuoandR.Wu、MethodsinEnzymology100:60-96（1985）、これは参照として本明細
書に組み入れられる）のエキソヌクレアーゼを利用し、端でブロックされ、互い
にプローブのライゲーションには含まれないLDRプローブと組み合わせることに
よって達成できる。ブロッキング部分は、レポーター基もしくはホスホロチオエ
ート基を含むことができる（T.T.Nikiforow らの「単一鎖PCR産物の調製のため
のホスホロチオエートプライマーおよびエキソヌクレアーゼ加水分解の利用と固
相ハイブリダイゼーションによる検出（TheUseofPhosphorothioatePrimersandEx
onucleaseHydrolysisforthePreparationofSingle-strandedPCRProductsandtheir
DetectionbySolid-phaseHybridization）」、PCRMethodsandApplications.3:p.2
85-291（1994）、これは参照として本明細書に組み入れられる）。LDR法の後に
、ライゲーションの起こらなかったプローブは、反応混合物をエキソヌクレアー
ゼと反応させて選択的に破壊する。ライゲーションの起こったプローブは、エキ
ソヌクレアーゼ反応の開始に必要なフリーの3'末端の除去により保護される。こ
のアプローチにより、特にLDR反応が少量の産物のみを形成する場合にシグナル
対雑音比の増加が起こる。ライゲーションの起こらなかったオリゴヌクレオチド
は、捕獲に関して捕獲オリゴヌクレオチドと競合するので、このようなライゲー
ションの起こったオリゴヌクレオチドとの競合はシグナルを低下させる。このア
プローチの別の利点は、ハイブリダイズしていない標識を含む配列が分解し、し
たがって、標的に依存しないバックグラウンドシグナルを生じづらくなることで
ある。何故ならば、洗浄によってDNAアレイからより容易に除去され得るからで
ある。
【００５５】 上記のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、検出に好ましいレポーター標
識を有する。有用な標識は、発色基、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プロ
ーブ、色素、燐光基、放射線物質、化学発光部位、および電気化学的検出部位を
含む。捕獲オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチ
ド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオ
チド類縁体、修飾ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾リン酸塩-糖骨格オリゴヌ
クレオチド、ヌクレオチド類縁体、およびその混合物の形態であり得る。本発明
の方法が複数のオリゴヌクレオチドセットの使用を含む場合、第2のオリゴヌク
レオチドプローブは同一でもよいが、第1のオリゴヌクレオチドプローブの位置
特定可能なアレイに特異的な部位は異なっている。または、第1のオリゴヌクレ
オチドプローブの位置特定可能なアレイに特異的な部位は同一でもよいが、第2
のオリゴヌクレオチドプローブのレポーター標識は異なる。
【００５６】 本発明のライゲーションによる検出反応期前に、好ましくは、最初の標的核酸
の増幅法で試料を増幅する。これにより、試料中の標的塩基配列の量が増加する
。例えば、最初の標的核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、配列の自己複製
、もしくはQ-βレプリカーゼによって媒介されるRNA増幅を用いて達成される。
ポリメラーゼ連鎖反応法は、好ましい増幅法であり、H.Erlich らの「ポリメラ
ーゼ連鎖反応における最近の進歩（RecentAdvancesinthePolymeraseChainReacti
on）」（Science252:1643-50（1991）;M.Innisらの「PCRプロトコール:方法と応
用の指針（AGuidetoMethodsandApplications）」（AcademicPress:NewYork（199
0））;および R.Saikiらの「耐熱性DNAポリメラーゼによるDNAのプライマー特
異的な酵素的増幅（Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermos
tableDNAPolymerase）」（Science239:487-91（1988））等に詳細に記載されて
おり、これらは参照として本明細書に組み入れられる。参照として本明細書に組
み入れられるJ.Guatelliらの「レトロウイルスの複製をモデルにしたマルチ酵素
反応による核酸の等熱インビトロ増幅（Isothermal、invitroAmplificationofNu
cleicAcidsbyaMultienzymeReactionModeledAfterRetroviralReplication）」（P roc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-78（1990））には、配列の自己複製法に関して
記載がある。Qβレプリカーゼによって媒介されるRNA増幅は、F.Kramerらの「複
製可能なRNAレポーター（ReplicatableRNAReporters）」（Nature339:401-02（1
989））に開示されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００５７】 本発明のポリメラーゼ連鎖反応法の使用およびその後のリガーゼによる検出法
の使用を図3に示す。ここで二つの多型におけるホモもしくはヘテロ接合性（す
なわち、対立遺伝子としての差異）は、同一遺伝子上にある。または、このよう
な対立遺伝子の差異は異なる遺伝子上にあってもよい。
【００５８】 図3に示されるように、標的核酸が二本鎖DNA分子の形態である場合、変性して
鎖を分離させる。これは、80〜105℃程度の温度に加熱することによって達成す
る。次に、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーを加え、通常、20〜85℃程度の温
度で鎖にハイブリダイズさせる。また、耐熱性ポリメラーゼ（例えば、Thermusa
quaticusポリメラーゼ）を添加し、温度を50〜85℃に調整して、プライマーがハ
イブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長させる。ポリメラーゼ連
鎖反応の伸長の段階後に、得られた二本鎖分子を80〜105℃の温度に加熱し、分
子を変性させ鎖を分離させる。これらのハイブリダイゼーション、伸長、および
変性の段階を、何回も繰り返して標的を適当なレベルに増幅する。
【００５９】 方法のポリメラーゼ連鎖反応期が完了すると、図3に示すライゲーションによ
る検出反応期が開始される。二本鎖DNA分子の状態であれば、80〜105℃の温度、
好ましくは94℃で標的核酸を変性させた後、標的塩基配列の一方の鎖に対するラ
イゲーションによる検出反用のオリゴヌクレオチドプローブをリガーゼ（例えば
、図3に示す耐熱性リガーゼ様のThermusaquaticusリガーゼ）とともに加える。
次に、オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸分子にハイブリダイズさせ、通常
、45-85℃、好ましくは65℃の温度でライゲーションを行う。ライゲーション接
合部に完全な相補性があれば、オリゴヌクレオチドはともにライゲーションする
ことができる。置換可能なヌクレオチドがTまたはAであるとき、標的塩基配列に
Tが存在すれは、位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1を有するオリゴヌクレ
オチドプローブがレポーター標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブにライ
ゲーションし、また標的塩基配列にAが存在すれば、位置特定可能なアレイに特
異的な部位Z2を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Fを有する
オリゴヌクレオチドプローブにライゲーションする。同様に、変化可能なヌクレ
オチドがAまたはGであるときには、標的塩基配列にTが存在すれば、位置特定可
能なアレイに特異的な部位Z4を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター
標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションし、また標的塩基
配列にCが存在すれば、位置特定可能なアレイに特異的な部位Z3を有するオリゴ
ヌクレオチドプローブがレポーター標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブ
とライゲーションする。ライゲーション後に、材料を再び変性させてハイブリダ
イズしている鎖を分離する。ハイブリダイゼーション/ライゲーションおよび変
性の段階は、一つもしくは複数のサイクル（例えば、1〜50サイクル）を経て標
的シグナルを増幅する。蛍光ライゲーション産物（同様に、位置特定可能なアレ
イに特異的な部位を有する、ライゲーションされなかったオリゴヌクレオチドプ
ローブ）は、位置特定可能なアレイ上の特定のアドレスにおけるZ1、Z2、Z3、お
よびZ4部位に相補的な捕獲プローブへのハイブリダイゼーションにより捕獲され
る。次に、オリゴヌクレオチドの一方に前もって存在する標識Fで、ライゲーシ
ョンの起こったオリゴヌクレオチドの存在を検出する。図3において、ライゲー
ション産物の配列は、位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1およびZ3に相補的
な捕獲オリゴヌクレオチドでアレイのアドレスにハイブリダイズするが、ライゲ
ーションの起こらなかった位置特定可能なアレイに特異的な部位Z2およびZ4を有
するオリゴヌクレオチドプローブは、その相補的捕獲オリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイズする。しかしながら、ライゲーション産物の配列のみが標識Fを有す
るので、それらのみの存在が検出される。
【００６０】 図4は、本発明のPCR/LDRの段階に関する流れ図であり、与えらた部位がいずれ
の塩基あっても識別できる。位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1、Z2、Z3、
およびZ4に相補的なアドレスの蛍光シグナルの出現は、標的塩基配列における、
それぞれ、A、G、C、およびT対立遺伝子の存在を示す。ここで、標的塩基配列A
、およびC対立遺伝子の存在は、部位Z1およびZ3にそれぞれ相補的な捕獲オリゴ
ヌクレオチドプローブで固体支持体上のアドレスの蛍光で示される。図4では、
位置特定可能なアレイに特異的な部位が識別オリゴヌクレオチドプローブ上にあ
り、識別塩基がこれらのプローブの3'末端にあることに注目されたい。
【００６１】 図5は、本発明の2カ所の近接部位における可能な塩基の存在の検出に関するPC
R/LDRの段階の流れ図である。ここで、LDRプライマーは重複していてもよいが、
接合部に完全な相補性がある場合にライゲーションが可能である。このことが、
重複プライマーが互いに阻害を起こす対立遺伝子特異的PCR等のほかのアプロー
チと、LDRが異なる点である。図5においては、第1のヌクレオチドの位置は、Aお
よびCの対立遺伝子でヘテロ接合体であるが、第2のヌクレオチドの位置はG、Cお
よびTの対立遺伝子でヘテロ接合体である。図4に示すように、位置特定可能なア
レイに特異的な部位は識別オリゴヌクレオチドプローブ上にあり、識別塩基はこ
れらのプローブの3'末端にある。レポーター基（例えば、蛍光標識）は、共通オ
リゴヌクレオチドプローブの3'末端にある。例えば、各々の個体が、2つの正常
遺伝子および2つの偽遺伝子を有し、2カ所のスプライス部位（ヌクレオチド656
）に3つの可能な単一塩基（G、A、およびC）が存在する場合の21ヒドロキシラー
ゼ遺伝子に関して、これが可能である。また、これを用いて薬剤耐性（例えば、
AZTに対する）株の出現を示すHIV感染における低レベルの変異を検出できる。図
5に戻って、位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7
、およびZ8に相補的なアドレスの蛍光シグナルの出現は、ヘテロ接合体の部位の
AおよびC対立遺伝子における、それぞれ、A、G、C、およびTの存在、およびヘテ
ロ接合体部位のG、C、およびT対立遺伝子における、それぞれA、G、C、およびT
の存在を示す。
【００６２】 図6は、本発明のPCR/LDRの段階に関する流れ図であり、挿入（左上部のプロー
ブセット）および欠失（右下部のプローブセット）を識別する。左では、正常配
列がポリAテールに5つのAを含む。変異体の配列は、さらに2つのAがテール内に
挿入されている。したがって、位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1（正常の
配列を表す）およびZ3（2塩基対の挿入を表す）を有するLDR産物は、共通プライ
マーにライゲーションすることによって蛍光標識されている。LDR法（例えば、
耐熱性リガーゼ酵素を用いる）は、単一ヌクレオチド反複における単一塩基の挿
入もしくは欠失を簡単に識別できるが、対立遺伝子特異的PCRでは、このような
差異を識別できない。なぜならば、3'塩基が両方の対立遺伝子に存在するためで
ある。右では、正常配列は5つの（CA）反復（すなわち、CACACACACA）である。
変異体では、正常配列と比較して2つ少ないCA塩基を含む（すなわち、CACACA）
。これらは、特定位置特定可能なアレイに特異的な部位Z8（正常の配列を表す）
およびZ6（2つのCA欠失を表す）アドレスにおける、蛍光LDR産物として検出され
る。また、さまざまな感染因子の薬剤に対する耐性は、本発明を用いて調べるこ
とができる。図6では、Z1およびZ3に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有する
アドレスにおける蛍光標識Fで示されるライゲーション産物の配列の存在は、正
常および変異体のポリA配列の両方の存在を示す。同様に、Z6およびZ8に相補的
な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスの蛍光標識Fで示されるライゲーシ
ョン産物の配列の存在は、正常なCAの繰り返し配列および繰り返しユニットが1
つ欠失した配列の両方の存在を示す。
【００６３】 図7は、過剰の正常配列の存在における低レベルの変異を検出する位置特定可
能なアレイに特異的な部位を用いた 本発明のPCR/LDRの段階に関する流れ図で
ある。図7は、K-ras遺伝子のグリシン（Gly）をコードするコドン12の配列GGTを
示す。ごく一部の細胞が、アスパラギン酸（Asp）をコードするGATにおけるGか
らAへの変異を含む。野生型のLDRプローブ（すなわち、正常配列）は、反応から
除外される。正常LDRプローブ（識別塩基=Gを有する）を含む場合、これらを共
通プローブに対してライゲーションさることによって、変異体の標的に由来する
シグナルより強めることができる。代わりに、図7に示されるように、蛍光標識F
を有するライゲーション産物の配列の存在は、位置特定可能なアレイに特異的な
部位Z4に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスにおけるアスパラギ
ン酸をコードする変異体の存在を示す。
【００６４】 図8は、本発明のPCR/LDRの段階に関する流れ図であり、位置特定可能なアレイ
に特異的な部位が、共通のオリゴヌクレオチドプローブに配置されおり、識別オ
リゴヌクレオチドプローブはレポーター標識を有する。対立遺伝子の差異は、異
なる蛍光シグナルF1、F2、F3、およびF4で識別される。この方法により、より高
密度なアレイの使用が可能となる。なぜならば、各々の位置は、特定の基で発光
すると予測されるからである。エミッションスペクトルにおいて最小重複を有し
、多重走査が必要な蛍光基を必要とするという不利な点を有する。これは低レベ
ルの対立遺伝子（例えば、癌に関連した変異）の検出に理想的といえるほど好適
ではない。
【００６５】 図9は、本発明のPCR/LDRの段階に関する流れ図であり、隣接および近傍の対立
遺伝子の両方が検出される。隣接した変異は、互いの右隣にあり、1セットのオ
リゴヌクレオチドプローブが接合部の3'末端の塩基を識別する（異なる位置特定
可能なアレイに特異的な部位Z1、Z2、Z3、およびZ4の使用によって）が、もう一
方のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、接合部の5'末端の塩基を識別する
（異なる蛍光レポーター標識F1、F2、F3、およびF4の使用）。図9では、疾患遺
伝子（例えば、嚢胞性線維症CFTR）のGlyおよびアルギニン（Arg）をコードする
コドンが、それぞれ、生殖系列の突然変異の候補である。図9の検出結果は、Gly
（GGA;ライゲーション産物の配列を有する部位Z2および標識F2で示される）がグ
ルタミン酸（Glu）（GAA;部位Z2および標識F1を有するライゲーション産物の配
列で示される）に突然変異を起こしており、Arg（CGG;部位Z7および標識F2を有
するライゲーション産物の配列で示される）がトリプトファン（Trp）（TGG;部
位Z8および標識F2を有するライゲーション産物の配列で示される）に突然変異を
起こしていることを示している。したがって、患者は、複合ヘテロ接合型の個体
である（すなわち、両方の遺伝子に変異体対立遺伝子を有する）。
【００６６】 図10は、本発明のPCR/LDRの段階に関する流れ図であり、単一コドンに関して
可能な単一塩基の変異すべてが検出される。通常アミノ酸のコドンは3番目の塩
基が縮重しているのでこれら可能な変異すべてについて、蛋白質レベルで最初の
2つの位置を決定できる。これらのアミノ酸には、アルギニン、ロイシン、セリ
ン、トレオニン、プロリン、アラニン、グリシン、およびバリンを含む。しかし
ながら、幾つかのアミノ酸については、コドンの3つの塩基すべてを調べるので
、3箇所の隣接した位置の変異を識別するオリゴヌクレオチドプローブが必要と
なる。図10に示すように、3'末端に対する最後から2番目の位置に4種の可能な塩
基を含む4つのオリゴヌクレオチドプローブを設計し、また3'末端に4種の考え得
る塩基を含む別の4つの捕獲オリゴヌクレオチドを設計し、この問題を解決する
。レポーター標識のみを有する共通オリゴヌクレオチドプローブはコドンの縮重
に対応し、同一のアレイアドレスで捕獲され異なるライゲーション産物の配列間
の識別ができる2つの蛍光基を有している。例えば、図10に示されるように、グ
ルタミン（Gln）をコードするコドン（すなわち、CAAおよびCAG）の存在が、部
位Z1および標識F2を含むライゲーション産物の配列の存在によって示される。同
様に、ヒスチジン（His）をコードする変異（コドンCACでコードされる）に対す
るGlnの存在は、部位Z1および標識F2を有するライゲーション産物の配列の存在
ならびに部位Z7および標識F2を有するライゲーション産物の配列の存在によって
示される。プライマーZ1およびZ7が同一の配列を有するという事実に起因し、こ
のアッセイに冗長性が内在する。
【００６７】 本発明の特に重要な局面は、試料中の標的塩基配列の量が定量可能であること
である。内部（すなわち、該試料を用いた増幅・検出により得られる標準材料）
もしくは外部（すなわち、得られる標準物質は増幅されないが該試料を用いて検
出される）標準を得ることによって、これを様々な方法で達成することができる
。
【００６８】 ある定量法に従って、レポーター標識により生成したシグナルは、分析試料よ
り生産されたライゲーション産物の配列の捕獲によって生じ検出されるものであ
る。このシグナル強度は、生成した既知の量の標的塩基配列を有する試料中に存
在するライゲーション産物の配列の捕獲によって生じるシグナルによって得られ
る検量線と比較する。その結果、分析試料中の標的塩基配列の量を調べることが
できる。本技術は、外部標準の使用を含む。
【００６９】 本発明の別の定量法は、内部標準に関する。ここでは、既知の量の一つもしく
は複数のマーカー標的塩基配列を試料に添加する。さらに、複数のマーカー特異
的オリゴヌクレオチドプローブのセットをリガーゼ、上記のオリゴヌクレオチド
プローブのセットおよび試料とともに混合物に添加する。マーカー特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブのセットは、（1）マーカー標的塩基配列に相補的な標的
特異的な部位ならびに支持体上の捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可
能なアレイに特異的な部位を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、（2）マ
ーカー標的塩基配列に相補的な標的特異的な部位ならびに検出可能なレポーター
標識を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定のマーカー特異的
オリゴヌクレオチドセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマ
ーカー標的塩基配列上で相互に隣接してハイブリダイズし、互いにライゲーショ
ンすることにおいて適切である。しかしながら、試料中の他のヌクレオチド配列
または添加したマーカー配列にハイブリダイズする場合には、このようなライゲ
ーションを阻害するミスマッチが存在する。固体支持体上に捕獲されたライゲー
ション産物の配列の存在は、レポーター標識の検出によって同定される。次に、
既知の量のマーカー標的塩基配列から生成し捕獲されたライゲーション産物の量
を捕獲された他のライゲーション産物の配列の量と比較することによって、試料
中の標的塩基配列の量を決定する。
【００７０】 本発明の別の定量法は、複数の配列上の差異を有する2つもしくはそれ以上の
複数の標的塩基配列を含む試料の解析を含む。ここでは、標的塩基配列に対応す
るライゲーション産物の配列が、上記のいずれかの技術によって検出・識別され
る。次に、生成し捕獲されたライゲーション産物の配列の相対量を比較して、試
料中の標的塩基配列の相対量を定量する。これは、試料における標的塩基配列の
相対的レベルの定量的尺度を提供する。
【００７１】 本発明のリガーゼによる検出反応法の段階の前に、リガーゼ連鎖反応法を行い
、オリゴヌクレオチド産物を増幅することもできる。本方法は、F.Baranyらの「
耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配
列（Cloning、OverexpressionandNucleotideSequenceofaThermostableDNALigase
-encodingGene）」,Gene.109:1-11（1991）、およびF.Baranyらの「クローン化
耐熱のリガーゼを用いた遺伝病の検出およびDNA増幅（GeneticDiseaseDetection
andDNAAmplificationUsingClonedThermostableLigase）」（Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:189-93（1991））に完全な記載があり、これらは参照として本明細書に組
み入れられる。増幅にリガーゼ連鎖反応を用いる代わりに、転写に基づく増幅法
を利用することもできる。
【００７２】 好ましい耐熱性リガーゼはThermusaquaticus由来のものである。本酵素はこの
生物から単離できる（M.Takahashiら「好熱性DNAリガーゼ（ThermophillicDNAli
gase）」（J.Biol.Chem.259:10041-47（1984））； これは参照として本明細書
に組み入れられる）。または、リコンビナントで調製することもできる。このよ
うな単離法は、リコンビナントThermusaquaticusリガーゼの産生（およびThermu
sthemophilusリガーゼ）とともに、Baranyらの国際公開公報第90/17239号、およ
びF.Baranyらの「耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰
発現および塩基配列（Cloning、OverexpressionandNucleotideSequenceofaTherm
ostableDNALigase-encodingGene）」（Gene.109:1-11（1991））等に開示されて
おり、参照として本明細書に組み入れられる。これらの文献は、このリガーゼお
よびこれをコードするDNAの完全な配列情報を含む。他の好ましいリガーゼとし
ては、E.coliリガーゼ、T4リガーゼ、Thermussp.AK16リガーゼ、Aquifexaeolicu
sリガーゼ、Thermotogamaritimaリガーゼおよび、Pyrococcusリガーゼを含む。
【００７３】 ライゲーション増幅混合物は、サケ精子DNA等の担体DNAを含んでいてもよい。
【００７４】 好ましくは加熱ハイブリダイゼーション処理であるハイブリダイゼーションの
段階では、ライゲーション接合部における識別ヌクレオチドに基づく塩基配列間
での識別を行う。標的塩基配列間の差異は、例えば、単一核酸塩基の差、核酸の
欠失、再構成である。1塩基以上を含むこのような配列の差異も検出できる。好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブのセットは実質的に同一の長さを有し、
それらを実質的に同様なハイブリダイゼーション条件で標的塩基配列にハイブリ
ダイズする。その結果、本発明の方法は、感染性疾患、遺伝病、および癌を検出
できる。また、環境モニタリング、法医科学、および食品科学においても有用で
ある。
【００７５】 広く多様な感染性疾患は、本発明の方法で検出できる。通常、これらは細菌、
ウイルス、寄生虫、および真菌性の感染因子によっておこる。また、さまざまな
感染因子の薬剤に対する耐性は、本発明を用いて調べることができる。
【００７６】 本発明で検出する細菌性感染因子は、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）、
赤痢菌（Shigella）、クレブシエラ（Klebsiella）、シュードモナス（Pseudomo
nas）、リステリア菌（Listeriamonocytogenes）、結核菌（Mycobacteriumtuber
culosis）、ミコバクテリアアビウム-イントラセルラ（Mycobacteriumavium-int
racellulare）、エルシニア（Yersinia）、フランシセラ（Francisella）、パス
ツレラ（Pasteurella）、ブルセラ（Brucella）、クロストリジウム（Clostridi
a）、百日咳菌（Bordetellapertussis）、バクテロイド（Bacteroides）、黄色
ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）、スタフィロコッカスニューモニア（Stre
ptococcuspneumonia）、B-溶連菌（B-Hemolyticstrep.）、コリネバクテリア（C
orynebacteria）、レジオネラ（Legionella）、ミコプラズマ（Mycoplasma）、
ウレアプラズマ（Ureaplasma）、クラミジア（Chlamydia）、淋菌（Neisseriago
norrhea）、髄膜炎菌（Neisserimeningitides）、ヘモフィルスインフルエンザ
（Hemophilusinfluenza）、エンテロコッカスファエカリス（Enterococcusfaeca
lis）、プロテウスブルガリス（Proteusvulgaris）、プロテウスミラビリス（Pr
oteusmirabilis）、ヘリコバクターピロリ（Helicobacterpylori）、梅毒トレポ
ネーマ（Treponemapalladium）、ボレリアバーグドーフェリ（Borreliaburgdorf
eri）、ボレリアレクレンティス（Borreliarecurrentis）、リケッチア（Ricket
tsial）の病原、ノカルジア（Nocardia）、およびアシトノマイセス（Acitnomyc
etes）を含む。
【００７７】 本発明で検出される真菌性感染因子は、クリプトコッカスネオフォルマンス（
Cryptococcusneoformans）、ブラストミセスデルマティティディス（Blastomyce
sdermatitidis）、ヒストプラズマカプスラタム（Histoplasmacapsulatum）、コ
クシジウムイミティス（Coccidioidesimmitis）、パラコクシシオイデスブラシ
リアンシス（Paracoccicioidesbrasiliensis）、カンジダアルビカンス（Candid
aalbicans）、アスペルギルスフミガーツス（Aspergillusfumigautus）、フィコ
マイセテス（Phycomycetes）（リゾプス(Rhizopus)）、スポロスリックスシェン
キー（Sporothrixschenckii）、クロモミコシス（Chromomycosis）、およびマズ
ロミコシス（Maduromycosis）を含む。
【００７８】 本発明で検出されるウイルス性感染因子は、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトT
細胞リンパ球親和性ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、B型肝炎ウイルスおよびC
型肝炎ウイルス）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト
パピローマウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイ
ルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、バン
ヤウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルス、およびレオウイルスを含む。
【００７９】 本発明で検出される寄生性作用因子は、プラスモジウムファルシパラム（Plas
modiumfalciparum）、プラスモジウムマラリア（Plasmodiummalaria）、プラス
モジウムビバックス（Plasmodiumvivax）、プラスモジウムオーバル（Plasmodiu
movale）、オンコバルバボルブラス（Onchovervavolvulus）、レーシュマニア（
Leishmania）、トリパノソーマ（Trypanosoma）種、住血吸虫（Schistosoma）種
、エンタモエバヒストリチカ（Entamoebahistolytica）、クリプトスポリジウム
（Cryptosporidum）、ギアルディア（Giardia）種、トリチモナス（Trichimonas
）、バラチジウムコーライ（Balatidiumcoli）、ウチェレリアバンクロフティ（
Wuchereriabancrofti）、トキソプラズマ（Toxoplasma）種、エンテロビウスバ
ーミキュラシス（Enterobiusvermicularis）、アスカリスラムブリコイデス（As
carislumbricoides）、トリチュリストリチウラ（Trichuristrichiura）、ドラ
カムクルスメディネシス（Dracunculusmedinesis）、吸虫（trematodes）、ジフ
ィロボツリウムラタン（Diphyllobothriumlatum）、条虫（Taenia）種、ニュー
モシスティスカリニー（Pneumocystiscarinii）、及びネカターアメリカニス（N
ecatoramericanis）を含む。
【００８０】 本発明はまた、感染性因子による薬剤耐性の検出にも有用である。例えば、バ
ンコマイシン耐性エンテロコッカスファエシウム（Enterococcusfaecium）、メ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌（Streptococcuspne
umoniae）、多剤耐性結核菌（Mycobacteriumtuberculosis）、およびAZT耐性ヒ
ト免疫不全ウイルスはいずれも本発明で同定できる。
【００８１】 遺伝性疾患は、本発明の方法で検出できる。これは染色体および遺伝的異常の
出生前スクリーニングもしくは遺伝病の出生後スクリーニングで実施可能である
。検出可能な遺伝病の例としては、21ヒドロキシラーゼ欠損、嚢胞性線維症、脆
弱X症候群、ターナー症候群、デュシェーヌ筋ジストロフィー、ダウン症候群も
しくはその他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、HLAタイピング、フェ
ニルケトン尿症、鎌状細胞貧血、テイ-サックス病、タラセミア、クラインフェ
ルトラー症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、脂肪代謝異常症、肥満症、血
友病、先天性代謝異常、および糖尿病があげられる。
【００８２】 本発明の方法で検出される癌は、通常、癌遺伝子、腫瘍抑制性遺伝子、もしく
はDNA増幅に関与する遺伝子、複製、組換え、もしくは修復を含む。これらの例
は、BRCA1遺伝子、p53遺伝子、家族性大腸ポリポーシス、Her2/Neu増幅、Bcr/Ab
I、K-ras遺伝子、ヒトパピローマウイルスのタイプ16および18、白血病、大腸癌
、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝
癌、骨肉腫およびその他の骨癌、睾丸癌および卵巣癌、耳鼻咽喉科の腫瘍、およ
びヘテロ接合性の消失を含む。
【００８３】 環境モニタリングの分野においては、本発明は、都市廃水浄化システムおよび
貯水器等の天然の、および工学的な生態系ならびに微小生態系もしくは生物的環
境浄化を行っている汚染域における病原性および常在微生物の検出、同定、およ
びモニタリングに用いられる。集団動態研究における特異的標的微生物のモニタ
リング、または環境および工業用植物における改変微生物における遺伝学的検出
、同定、もしくはモニタリングのいずれかのために、非生体物質を代謝する遺伝
子を含むプラスミドの検出をおこなうことも可能である。
【００８４】 本発明は、軍人、および犯罪捜査におけるヒトの識別、父性検査および家族関
係解析、HLA適合性タイピング、および血液、精子、もしくは移植臓器の汚染ス
クリーニングを含む多様な法医学的分野においても用いることができる。
【００８５】 食品および飼料工業においては、本発明は広く多様な応用を有する。例えば、
ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン、その他の産生に関わる酵母等の産
生用微生物の同定および特徴付けに用いることができる。利用に関する別の分野
は、産物の品質管理および検定ならびに工法（例えば、家畜、殺菌、および食肉
加工）における汚染に関する。その他の利用としては、育種目的の植物、球根、
および種子の特徴付け、植物特異的病原体の存在同定、ならびに家畜感染の検出
および同定があげられる。
【００８６】 望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部において
完全な相補性に基づき、対応する標的塩基配列上で相互に隣接してハイブリダイ
ズする場合の、ライゲーション接合部におけるライゲーションに好ましいもので
ある。しかしながら、該セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、試料中
の他のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合には、ライゲーシ
ョンを阻害するライゲーション接合部位置の塩基にミスマッチが存在する。最も
好ましくは、ミスマッチはライゲーション接合部の3'塩基に隣接した位置の塩基
に存在する。または、ミスマッチは、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩
基にあってもよい。
【００８７】 本発明の方法は、第1および第2の塩基配列を100アトモルから250フェムトモル
の量で試料中に検出することができる。LDR段階を第1のポリメラーゼ特異的増幅
段階とカップルさせ、本発明の完全な方法では、単一分子程度を含む試料におい
て標的塩基配列を検出することができる。さらに、ピコモル量であることの多い
PCR増幅産物は上記範囲で容易に希釈できる。このリガーゼによる検出反応では
、ミスマッチライゲーション産物の配列の形成速度は、マッチしたライゲーショ
ン産物の配列の形成速度の0.005より低い。
【００８８】 ライゲーション期が完了すると、捕獲期が開始される。本方法の捕獲期では、
混合物は25〜90℃、好ましくは60℃〜80℃の温度で、かつ10〜180分間、好まし
くは60分までので時間、固体支持体と接触させる。ハイブリダイゼーションは、
ハイブリダイゼーション中にライゲーション混合物を混合すること、または容積
排除、カオトロピック薬剤、テトラメチルアンモニウム塩、もしくはN,N,N,トリ
メチルグリシン（ベタイン一水和物）を添加することによって加速もしくは改善
される。アレイが数十から数百のアドレスからなる場合、正しいライゲーション
産物が適当なアドレスでハイブリダイズする機会を有することが重要である。こ
れは、用いる高い温度におけるオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面と接触
する液体の機械的運動、もしくは電界によるアレイ全域にわたるオリゴヌクレオ
チドの運動によって達成することができる。ハイブリダイゼーショ後にハイブリ
ダイズしていないプローブを除去し、捕獲されたプローブの検出の最適化を図る
ために、アレイを緩衝液で洗浄する。または、アレイを順次洗浄する。
【００８９】 好ましくは、固体支持体は、アクリルアミドとカルボン酸塩、アルデヒド、も
しくはアミノ基を含む機能性のモノマーとの組み合わせで構成される親水性ポリ
マーの多孔性表面を有する。この表面は、支持体を、ポリアクリルアミドをベー
スとしたゲルでコーティングするによって形成する。好ましい配合は、アクリル
アミド/アクリル酸およびN,N-ジメチルアクリルアミド/グリセロールモノメタク
リレートである。クロスリンカーN,N'-メチレンビスアクリルアミドは、50:1以
下のレベル、好ましくは500:1以下のレベルである。
【００９０】 固体支持体をライゲーション混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキン
グに関する一態様は、二価カチオンの利用によって達成される。二価カチオン、
Mg2+、Ca2+、MN2+、もしくはCo2+でよい。通常、二価カチオンによるマスキング
は、カチオンを含むハイブリダイゼーション緩衝液により10mMの最小濃度で室温
で15分間、固体支持体のプレハイブリダイゼーションを行うことによって実施す
る。
【００９１】 固体支持体をライゲーション混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキン
グに関する別の態様は、pH6.0もしくはそれ以下のpHで接触させることによって
実施する。これを固体支持体に接触させる前もしくは接触中にライゲーション混
合物に緩衝液を添加することが効果的である。好ましい緩衝液は、2-（N-モルフ
ォリノ）エタンスルフォン酸（MES）、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウ
ムを含む。
【００９２】 固体支持体をライゲーション混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキン
グに関する別の態様は、ポリマーの親水性を抑えながら遊離のカルボン酸基を中
和剤でキャッピングすることによって実施する。好ましい中和剤は、エタノール
アミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、イ
ソプロパノールアミン、およびジイソプロパノールアミンを含む。通常、中和剤
によるマスキングは、1-[(3-ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミ
ド塩酸塩およびN-ヒドロキシこはく酸イミドを用い固体支持体内でカルボン酸基
を活性化した後、クロロフォルム、ジクロロメタン、もしくはテトラヒドロフラ
ン等の極性非プロトン性溶媒中で中和剤溶液による処理を行うことによって実施
する。
【００９３】 本発明による陰性電荷のマスキングによって、ライゲーションの起こらなかっ
たオリゴヌクレオチドプローブの存在下におけるライゲーションされた産物の存
在の検出が向上する。特に、ライゲーションの起こらなかったオリゴヌクレオチ
ドプローブに対する比が1:300未満、好ましくは1:900未満、さらに好ましくは1:
3000未満、最も好ましくは1:9000未満である場合のライゲーション産物の存在の
検出に、本発明は効果的である。
【００９４】 さらに、本発明による陰性電荷のマスキングによって、非標的ヌクレオチド配
列とは異なる標的塩基配列を有する標的塩基配列の存在を非標的ヌクレオチド配
列から単一塩基の差によって識別検出する能力が向上する。特に、標的塩基配列
の非標的ヌクレオチド配列に対する比が1:20未満、好ましくは1:50未満、より好
ましくは1:100未満、最も好ましくは1:200未満である場合の標的塩基配列の検出
に、本発明は有効である。
【００９５】 安定にハイブリダイズする捕獲オリゴヌクレオチドおよび位置特定可能な塩基
配列の選択が重要である。このために、オリゴヌクレオチドセットおよび捕獲オ
リゴヌクレオチドを、位置特定可能なアレイに特異的な部位に捕獲オリゴヌクレ
オチドがハイブリダイズする温度以下の温度で標的塩基配列にオリゴヌクレオチ
ドセットハイブリダイズするように設計する必要がある。オリゴヌクレオチドを
このように設計しなかった場合、標的にハイブリダイズする同一のオリゴヌクレ
オチドセットから隣接した未反応のオリゴヌクレオチドを捕獲してしまうことで
偽陽性シグナルが生じる。
【００９６】 特定のオリゴヌクレオチドセットのライゲーションが起こり、ライゲーション
が被検試料中の標的塩基配列の有無と相関する場合には、本方法の検出期は走査
と同定を含む。走査は、走査電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、電荷結合素子、走
査トンネル電子顕微鏡法、赤外線顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、電導度、および
蛍光もしくは燐光撮像技術によって実施可能である。相関付けはコンピュータで
行う。
【００９７】 本発明の別の局面は、固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ形成法に関
する。この方法は、各々がオリゴヌクレオチドの付加に適切である部位のアレイ
を有する支持体を提供することを含む。各々のアレイ位置において支持体へのオ
リゴヌクレオチドの結合に好ましいリンカー、もしくは支持体（好ましくは非加
水分解性）は固体支持体に結合している。固体支持体上のオリゴヌクレオチドの
アレイは、多量体ヌクレオチドの付加のための選択されたアレイ位置の活性化お
よび活性アレイ位置における多量体ヌクレオチドの付加の一連のサイクルによっ
て形成される。
【００９８】 本発明のさらに別の局面は、支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイそのもの
に関する。固体支持体は、オリゴヌクレオチドの付加に各々好適である部位のア
レイを有する。オリゴヌクレオチドの固体支持体への結合に好ましいリンカー、
もしくは支持体（好ましくは非加水分解性）は、アレイの各々の位置において固
体支持体に結合している。オリゴヌクレオチドのアレイは、固体支持体上の16ヌ
クレオチド以上を有するオリゴヌクレオチドで占められる少なくとも一部のアレ
イの位置に配置される。
【００９９】 アレイ形成法においては、異なる多量体オリゴヌクレオチドセットに由来する
多量体オリゴヌクレオチドは、固体支持体上の異なるアレイ位置で結合する。そ
の結果、支持体は異なる位置に結合した多量体オリゴヌクレオチドの異なる基を
有する位置のアレイを含む。
【０１００】 異なる1,000のアドレスは、LDRオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的配列
（例えば、約20〜25mer）と共有結合でライゲーションしたユニークな捕獲オリ
ゴヌクレオチド（例えば、24mer）であってもよい。捕獲オリゴヌクレオチドプ
ローブの配列は、試料中に存在するゲノム上の標的配列もしくは他の配列のいず
れかに対して如何なる相同性をも示さないものである。次に、このオリゴヌクレ
オチドプローブを、位置特定可能なアレイに特異的な部位、位置特定可能な固体
支持体アレイ上の捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な配列に捕獲させる。この概
念を、可能な2つの形態で示し、例えば、p53R248変異（図13A-C）の検出があげ
られる。
【０１０１】 図13A〜Cには、p53腫瘍抑制性遺伝子のコドン248における生殖系列変異の存在
を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブの設計に関するほかの2つの形態
を示す。野性型配列はアルギニン（R248）をコードするが、癌の変異では、トリ
プトファン（R248W）をコードする。下部の図は捕獲オリゴヌクレオチドの模式
図である。太い水平の線は位置特定可能なアレイを含むメンブレンもしくは表面
を表す。細い曲線は、柔軟なリンカーアームを示す。さらに太い線は、CからN方
向で固体表面に結合した捕獲オリゴヌクレオチド配列を示す。例示の目的におい
て、部分Bにおけるリンカーアームが「引き延ばされた」ように捕獲オリゴヌク
レオチドを垂直に描いている。アームは柔軟なため、塩基対相補性により捕獲オ
リゴヌクレオチドは各々において5'をCにおよび3'をNにハイブリダイズすること
ができる。オリゴヌクレオチドがN末端においてメンブレンに結合する場合、同
一方向のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが可能となる。この場合、
DNA/PNAハイブリダイゼーションは、通常5'から3'、および3'から5'への逆平行
にある。他の修飾された糖リン酸骨格も同様に用いられる。図13Bは、3'末端に
おける塩基CもしくはTの識別を含むことにより野生型および変異体p53を識別す
るように設計された2つのLDRプローブを示す。正しい標的DNAおよびTthリガーゼ
の存在においては、識別プローブは共有結合で下流の共通オリゴヌクレオチドに
結合する。下流のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識されている。識別オリゴヌク
レオチドは、各々の5'末端における単一の位置特定可能なアレイに特異的な部位
Z1およびZ2の存在によって識別される。黒いドットは、標的依存性のライゲーシ
ョンが起こっていることを示す。ライゲーション後に、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを、アレイ上での単一アドレスにおける相補的な位置特定可能アレイに特異
的な部位によって捕獲してもよい。ライゲーションしたオリゴヌクレオチドプロ
ーブおよび未反応のオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが、オリゴヌクレオ
チドアレイによって捕獲される。未反応の蛍光標識した共通プライマーおよび標
的DNAを、高温（約65℃〜80℃）および低塩濃度で洗い流す。変異シグナルは、
位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドにお
ける蛍光シグナルの検出によって識別するが、野性型シグナルは、位置特定可能
なアレイに特異的な部位Z2に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドに出現する。ヘテ
ロ接合性は、位置特定可能なアレイに特異的な部位Z1およびZ2に相補的な捕獲オ
リゴヌクレオチドにおける同程度のシグナルによって示されるのである。シグナ
ルは蛍光撮影装置を用いて定量される。この形態では各々の対立遺伝子に関して
単一アドレスを用い、低レベルのシグナル（30〜100アトモルのLDR産物）の非常
に正確な検出の達成に好適である。図13Cは、識別シグナルが蛍光撮影装置を用
いて定量できることを示す。この形態では、異なる蛍光基をF1およびF2を5'末端
に有することによってオリゴヌクレオチドプローブを識別する単一アドレスを用
いる。オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが、3'末端に位置特定可能なアレ
イに特異的な部位Z1を含む共通の下流オリゴヌクレオチドプローブにライゲーシ
ョンすることができる。この形態においては、野性型および変異体LDRの両方が
アレイ上の同一のアドレスに捕獲され、異なる蛍光で識別される。この形態では
、アレイのより好ましい利用が可能であり、数百もの潜在する生殖系列の突然変
異を検出する場合には好適である。
【０１０２】 固体支持体は、広く多様な材料から作製することが可能である。基質は、生物
学的、非生物学的、有機、無機、もしくはこれらのいずれの組み合わせでもよく
、粒子、鎖、沈殿、ゲル、シート、管状材料、球状、容器、毛細管、パッド、ス
ライス、フィルム、プレート、スライド、ディスク、メンブレン、その他として
存在するものである。基質は、盤、四角形、円形、その他等の通常の形状を有す
る。基質は、好ましくは平坦なものであるが、様々な異なる表面配置をとっても
よい。例えば、基質は合成の起こる隆起もしくは陥没した領域を有していてもよ
い。基質およびその表面は、好ましくはその上で本明細書に記載の反応を起こさ
せる固い支持体を形成する。また、基質およびその表面は、適当な光吸収特性を
提供するように選択したものである。例えば、基質は、重合LangmuirBlodgettフ
ィルム、機能化ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修飾シリコン、また
は広く多様なゲルのいずれか、もしくは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポ
リ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン
、ポリプロピレン、塩化ポリビニル、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（メチ
ルメタクリレート）、もしくはその組み合わせ等のポリマーでもよい。当業者で
あれば、他の基質材料についても、本開示の記載により容易に理解できる。好ま
しい態様においては、基質は平坦なガラスもしくは単一結晶シリコンである。
【０１０３】 幾つかの態様においては、所望の表面特性を与えるように、基質表面を既知の
技術を用いてエッチングする。例えば、トレンチ、V字溝、丘段構造、切り上が
りプラットフォーム等の方法で形成し、合成領域は蛍光源等からの集光を最大限
にするための反射「鏡」構造で得られる照射光の焦点内により近接して配置する
。
【０１０４】 固体基質上の表面は、常にではないが通常は、基質と同一材料で構成する。従
って、表面は、広汎な材料、例えば、ポリマー、プラスチック、セラミック、多
糖、シリカもしくはシリカをベースにした材料、炭素、金属、無機ガラス、メン
ブレン、もしくはそれらの組み合わせのいずれかで構成される。基質表面にしっ
かりと結合した結合部材で表面を官能基化する。好ましくは、表面の官能基は、
シラノール、オレフィン、アミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ケト、ハロ、ハ
ロゲン化アシルもしくはカルボキシル基等の反応基である。ある場合においては
、このような官能基は予め基質に内在する。例えば、シリカをベースとした材料
はシラノール基を有し、多糖はヒドロキシル基を有し、また合成ポリマーは、そ
れを生じるモノマーに依存して多様な官能基を含む。または、基質が所望の官能
基を含まない場合には、このような基は、1段階もしくは複数の段階において基
質に結合させることができる。
【０１０５】 好適に修飾されたガラス、プラスチック、または炭水化物による表面もしくは
多様なメンブレンを含む多様な市販材料を用いることができる。材料に依存して
、表面の官能基（例えば、シラノール、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ）
は（おそらく、コーティング・ポリマーの一部として）最初から存在する、もし
くは、官能基の導入のために別の方法（例えば、プラズマアニメーション、クロ
ム酸酸化、官能基化側鎖のアルキルトリクロロシランによる処理を必要とする）
。複数の方法でヒドロキシル基を安定なカルバミン酸（ウレタン）結合に組み込
む。アミノ官能基は直接アセチル化することができるが、カルボキシル基は活性
化（例えば、N,N'-カルボジイミダゾールもしくは水溶性カルボジイミド）し、
アミノで官能基化した化合物と反応させる。図11に示すように、固体支持体は出
発官能基Xを有するメンブレンもしくは表面であってもよい。官能基の変換は、
基Y*との共有結合における1つのパートナーを表す基X*を提供する（必要に応じ
て）多様な方法で行うことができる。図11は、PEG（すなわち、ポリエチレング
リコール）のグラフトを具体的に示すが、同一レパートリーの反応を、炭水化物
（ヒドロキシルを有する）、リンカー（カルボキシルを有する）、および/もし
くは好ましい官能基（アミノもしくはカルボキシル）によって伸長したオリゴヌ
クレオチドを付加させるために用いることができる（ただし、必要であれば）。
ある場合においては、基X*もしくはY*は予め活性化される（別の反応で単離可能
な種）。または、活性化はインサイチューで起こる。図11に記載のPEGを参照す
ると、YおよびY*は同一（同一二元官能基）でも異なって（異質二元官能基）い
てもよい。後者の場合、Yはさらに化学的コントロールを行うために保護するこ
とができる。未反応のアミノ基をアセチル化、スクシニル化でブロックし、過剰
のハイブリダイズしていないDNAを「排除する」中性もしくは陰性に荷電した環
境を保つ。負荷レベルは、標準的な分析法で調べることができる。Fieldsらの「
固相ペプチド合成の原理および実施（PrinciplesandPracticeofSolid-PhasePept
ideSynthesis）」（合成ペプチド:ユーザー指針（SyntheticPeptides:AUser'sGu ide） G.Grant、Editor、W.H.FreemanandCo.:NewYork.p.77-183（1992））、これ
は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０６】 シリカをベースとした支持体表面に官能基を付加する一つのアプローチとして
は、所望の官能基（例えば、オレフィン、アミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、
ケト、ハロ、ハロゲン化アシルもしくはカルボキシル）を有する分子、もしくは
所望の官能基を含む別の分子Bに結合することのできる分子Aのいずれかでシラン
化することがあげられる。前者の場合、ガラスもしくはシリカをベースとした支
持体の、例えば、アミノ基による官能基化は、3-アミノプロピルトリエトキシシ
ラン、3-アミノプロピルメチルジエトキシシラン、3-アミノプロピルジメチルエ
トキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-（2-アミノエチル）-3
-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N-（2-アミノエチル-3-アミノプロピ
ル）トリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、4-アミノブチル
ジメチルメトキシシラン、4-アミノブチルトリエトキシシラン、アミノエチルア
ミノメチルフェネチルトリメトキシシラン、もしくはその混合物等のアミン化合
物で実施する。後者の場合には、分子Aは、好ましくはビニル、アクリレート、
メタクリレート、もしくはアリル等のオレフィン基を含むが、分子Bはオレフィ
ン基および所望の官能基を含む。この場合、分子AおよびBは、互いに重合する。
ある場合においては、その性質を修飾するために（例えば、生体適合性を付与す
るおよび機械的安定性を向上させるために）。シラン化した表面を修飾すること
が好ましい。これは、分子A、B、およびCを含むポリマーネットワークを得るた
めに、分子Bとともにオレフィン分子Cを添加することによって達成できる。
【０１０７】 分子Aは、以下の化学式で定義される：
【化１】 式中、R1はHもしくはCH3である。 R2は（C=O）-O-R6で、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換
基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さ
ない脂肪族/芳香族基の混合したものである。 R3はO-アルキル、アルキルもしくはハロゲン基である。 R4は、O-アルキル、アルキルもしくはハロゲン基である。 R5はO-アルキル、アルキルもしくはハロゲン基であり、また R6は、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもし
くは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族/芳
香族基の混合したものである。分子Aの例は、3-（トリメトキシシリル）プロピ
ルメタクリレート、N-[3-（トリメトキシシリル）プロピル]-N'-（4-ビニルベン
ジル）エチレンジアミン、トリエトキシビニルシシラン、トリエチルビニルシシ
ラン、ビニルトリクロロシシラン、ビニルトリメトキシシラン、およびビニルト
リメチルシシランを含む。
【０１０８】 分子Bは、上記の一つもしくは複数の官能基を含むモノマーである。分子Bは、
以下の化学式で定義される：
【化２】 式中、（i）R1はHもしくはCH3であり、 R2は（C=O）、および R3はOHもしくはClである； または （ii）R1はHもしくはCH3、およびR2は（C=O）-O-R4、官能置換基を有するもしく
は有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官
能置換基を有するもしくは有さない脂肪族/芳香族基の混合したものである。ま
た、R3はOH、COOH、NH2、ハロゲン、SH、COC1、もしくは活性エステル等の官能
基、およびR4は官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有
するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂
肪族/芳香族基の混合したものである。分子Bの例は、アクリル酸、アクリルアミ
ド、メタクリル酸、ビニル酢酸、4-ビニル安息香酸、イタコン酸、アリルアミン
、アリルエチルアミン、4-アミノスチレン、2-アミノエチルメタクリレート、塩
化アクリロイル、塩化メタクリロイル、クロロスチレン、ジクロロスチレン、4-
ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、
アリルアルコール、2-ヒドロキシエチルメタクリラート、もしくはポリ（エチレ
ングリコール）メタクリレートを含む。
【０１０９】 分子Cは、分子A、分子B、もしくは両方に重合可能な分子であり、選択的に上
記の一つもしくは複数の官能基を含む。分子Cは、アクリル酸、メタクリル酸、
ビニル酢酸、4-ビニル安息香酸、イタコン酸、アリルアミン、アリルエチルアミ
ン、4-アミノスチレン、2-アミノエチルメタクリレート、塩化アクリロイル、塩
化メタクリロイル、クロロスチレン、ジクロロスチレン、4-ヒドロキシスチレン
、ヒドロキシメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、アリルアルコール、
2-ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレー
ト、アクリル酸メチル、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメ
タクリレート、スチレン、1-ビニルイミダゾール、2-ビニルピリジン、4-ビニル
ピリジン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリルアクリレート、
N,N'-メチレンジアクリルアミド、N,N'-フェニレンジアクリルアミド、3,5-ビス
（アクリロイルアミド）安息香酸、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ト
リメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリ
レート、トリメチロールプロパンエトキシレート（14/3EO/OH）トリアクリレー
ト、トリメチロールプロパンエトキシレート（7/3EO/OH）トリアクリレート、ト
リエチロールプロパンプロポキシレート（1PO/OH）トリアクリレート、もしくは
トリメチロールプロパンプロポキシレート（2PO/PHトリアクリレート）等のモノ
マーもしくはクロスリンカーであってもよい。
【０１１０】 通常、官能基は最終的には支持体に結合するオリゴヌクレオチドのための出発
点として働く。これらの官能基は、固体支持体に結合する有機基に反応性である
か、またはリンカーもしくはハンドルの利用によってこのような基に反応性とな
るように修飾することができる。官能基は、支持体にさまざまな所望の性質を付
与することができる。
【０１１１】 支持体を（必要に応じて）官能基化した後、相補的オリゴヌクレオチド捕獲プ
ローブの担体部位として働く活性化された官能基を含むテーラーメイドのポリマ
ーネットワークを支持体に植え込む。従って、このアプローチの利点としては、
捕獲プローブの負荷容量を有意に増加させることができ、中間体としての固相対
液相の物理的性質が制御しやすくなる。最適化を受けるパラメータは、官能基を
含むモノマーの種類と濃度、および用いるクロスリンカーの種類と相対的濃度を
含む。
【０１１２】 リンカー分子は本発明に必要な要素ではないものと理解されるが、官能基化し
た基質表面は、好ましくはリンカー分子層とともに提供される。作製した基質に
おいてポリマーが基質に暴露された分子と自由に相互作用できるように、リンカ
ー分子は、好ましくは充分な長さのものである。充分に暴露されるように、リン
カー分子は、6〜50原子の長さであることが必要である。リンカー分子、例えば
、アリールアセチレン、2〜10モノマーユニットを含むエチレングリコールオリ
ゴマー、ジアミン類、2価酸、アミノ酸類、もしくはその組み合わせである。
【０１１３】 別の態様においては、リンカー分子をその親水性/疎水性の性質に基づいて選
択し、特定の受容体に対する合成ポリマーの提示について改善する。例えば、親
水性受容体の場合には、親水性リンカー分子は、受容体が合成ポリマーにより近
接して近づくことが可能であることが好ましい。
【０１１４】 もう一つの別の態様においては、リンカー分子は中間位置に光開裂性の基を有
するものとして提供される。光開裂性の基は、保護基とは異なる波長で開裂する
ことが好ましい。これにより、異なる光波長に暴露する方法で合成完了後に、さ
まざまなポリマーの除去を可能にする。
【０１１５】 リンカー分子は、炭素と炭素の間の結合で、例えば、（ポリ）トリフルオロク
ロロエチレン表面を用いて、もしくは、好ましくは、シロキサン結合（例えば、
ガラスもしくは酸化シリコン表面を用いて）で基質に結合できる。基質表面との
シロキサン結合は、一態様においては、トリクロロシリル基を有するリンカー分
子の反応によって形成する。リンカー分子は、選択的に整列アレイ（すなわち、
重合化単層にその頭部が平らに並んだものとして）に結合していてもよい。別の
態様においては、リンカー分子は基質表面に吸着している。
【０１１６】 しばしば、DNAもしくはPNA合成の出発リンカーの付加前に、相補的官能基化を
PEGスペーサーに導入することが望ましい（G.Baranyらの「固相ペプチド合成の
ための新規ポリエチレングリコール-ポリスチレン（PEG-PS）グラフト支持体（N
ovelPolyethyleneGlycol-polystyrene(PEG-PS)GraftSupportsforSolid-phasePep
tideSynthesis）」（ed.C.H.SchneiderandA.N.Eberle.、Leiden、TheNetherland
s:EscomSciencePublishers267-268（1993））;Zaiipskyらの「固相ペプチド合成
のためのポリエチレングリコール-ポリスチレングラフト樹脂支持体の調製およ
び応用（PreparationandApplicationsofPolyethyleneGlycol-polystyreneGraftR
esinSupportsforSolid-phasePeptideSynthesis）」（ReactivePolymers.22:243-
58（1994））;J.M.Harris、ed.「ポリ（エチレングリコール）の化学:生物技術
および生物医学的応用（Poly(EthyleneGlycol)Chemistry:BiotechnicalandBiome
dicalApplications）」（（1992）、PlenumPress:NewYork）；これらは参照とし
て本明細書に組み入れられる）。必要に応じて、同様にデキストラン層を導入す
る（Cassらの「パイロット、新規ペプチドリード最適化技術とその応用-一般的
ライブラリー法として、ペプチド-化学、構造および生物学、第13回米国ペプチ
ドシンポジュウム（Pilot,ANewPeptideLeadOptimizationTechniqueandItsApplic
ationasaGeneralLibraryMethod、inPeptides-Chemistry,StructureandBiology:P
roceeaingsoftheThirteenthAmericanPeptideSymposium）」（R.S.HodgesandJ.A.
Smith、Editor.（1994）、Escom:Leiden、TheNetherlands）;Lofasらの「リガン
ドの迅速かつ高効率の共有結合による固定化のための金表面プラズマ共鳴センサ
ー上の新規ハイドロゲルマトリックス（ANovelHydrogelMatrixonGoldSurfacePla
smaResonanceSensorsforFastandEfficientCovalentImmobilizationofLigands）
」（J.Chem.Soc.、Chem.Commun.,pp.1526-1528（1990））、これらは参照として
本明細書に組み入れられる）。インドール部分で効率的かつ特異的捕獲ができる
ので、特に好ましいリンカーは、酸が希釈された（with dilute acid）トリス（
アルコキシ）ベンジルカルボニウムイオンである。DNAオリゴヌクレオチドは、
アミノ酸のトリプトファン残基で合成しこれを停止することができ、また、トリ
ス（アルコキシ）ベンジルエステル（超感受性酸不安定（「HAL」））もしくは
トリス（アルコキシ）ベンジルアミド（「PAL」）リンカーによる修飾を受けた
支持体に効率的に結合することができる（F.Albericioetal.,J.Org.Chem..55:37
30-3743（1990）;F.AlbericioandG.Barany、TetrahedronLett.、32:1015-1018（
1991））、これらは参照として本明細書に組み入れられる）。他の潜在的に迅速
な化学は、チオールとブロモアセチルもしくはマレイミド官能基との反応を含む
。一つの変法として、アミノ官能基化DNAの末端を無水臭化酢酸で修飾し、ブロ
モアセチル官能基を、支持体上に容易に導入したチオール基で捕獲する。または
、プローブの末端にライゲーションしたN-アセチル、S-トリチルシステイン残基
は、開裂および脱保護の後に、支持体上のマレイミド基で捕獲できる遊離のチオ
ールを与える。図12に示されるように、化学的に合成したプローブをそのいずれ
かの末端に伸長させる。さらに提案される化学のバリエーションは容易に理解で
きる。図12Aは、プローブ上のアミノ基は、無水臭化酢酸で修飾され、ブロモア
セチル官能基は支持体上のチオール基で捕獲されることを示す。図12Bは、プロ
ーブの末端にライゲーションしたN-アセチル、S-トリチルシステイン残基は、開
裂および脱保護の後に、支持体上のマレイミド基で捕獲される遊離のチオールを
与えることを示す。図12Cは、プローブは希酸によるHAL-修飾固体支持体の処理
後に捕獲されるオリゴトリプトファニルのテール（n=1〜3）を含むことを示す。
【０１１７】 本発明のアレイを調製するためにDNAオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマ
ーを固体支持体に付加させることが必要である。これは、前もって合成されたプ
ローブを付加する、もしくは直接組立ててから支持体に側鎖の脱保護（オリゴマ
ーが遊離しないように）を行うことのいずれかのよって達成する。さらに、支持
体の環境としては効率的なハイブリダイゼーションが可能であること等が必要で
ある。このために、2つの要因が存在する。（1）支持体材料が充分に親水性であ
る性質（例えば、PEGもしくは炭水化物部分）および（2）支持体骨格からプロー
ブを隔てる柔軟なリンカーアーム（例えば、酸化ヘキサエチレンもしくはより長
いPEG鎖）。多くの表面上「平坦な表面」は分子レベルでは非常に厚いものであ
ることに注意する。最後に、支持体材料が非特異的結合もしくは固有蛍光による
有意なバックグランドシグナルを与えないことが重要である。
【０１１８】 本明細書において用いられるリンカー分子およびモノマーは、保護基を結合し
た官能基として提供される。好ましくは、保護基は基質と逆側のリンカー分子の
遠位もしくは末端にある。保護基は、陰性保護基（すなわち、保護基は、リンカ
ー分子が暴露されたときのモノマーに対する反応性を弱める）もしくは陽性保護
基（すなわち、保護基は、リンカー分子が暴露されたときのモノマーに対する反
応性を強める）のいずれかである。陰性保護基の場合、別の再活性化段階が必要
である。幾つかの態様においては、これは加熱によって行う。
【０１１９】 リンカー分子の保護基は、好ましくはo-ニトロベンジル誘導体もしくはベンジ
ルスルフォニル等のニトロ芳香族化合物を含む広く多様な光反応性の陽性基から
選択される。好ましい態様においては、6-ニトロベラチルオキシカルボニル（「
NVOC」）、2-ニトロベンジルオキシカルボニル（「NBOC」）、ベンジルオキシカ
ルボニル（「BOC」）、フルオレニルメトキシカルボニル（「FMOC」）、もしく
はα,α-ジメチルジメトキシベンジルオキシカルボニル（「DDZ」）が用いられ
る。ある態様においては、ニトロ基に対してオルソのベンジル水素を含むニトロ
芳香族化合物が用いられる。すなわち、次の式で表される化学物質である:
【化３】 式中、R1はアルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、アルケニル、もしくは水素
;R2はアルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、ニトロ、もしくは水素;R3はアル
コキシ、アルキル、ハロ、ニトロ、アリール、もしくは水素;R4はアルコキシ、
アルキル、水素、アリール、ハロ、もしくはニトロ;およびR5はアルキル、アル
キニル、シアノ、アルコキシ、水素、ハロ、アリール、もしくはアルケニルであ
る。用いられる他の物質としては、o-ヒドロキシ-α-メチルシナモイル誘導体が
あげられる。光除去性の保護基は、例えば、Patchomik、J.Am.Chem.Soc.92:6333
（1970）およびAmitらJ.Org.Chem.39:192（1974）に記載されており、両方とも
参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２０】 別の態様においては、陽性の反応基は溶液中の試薬との反応において活性化さ
れる。例えば、カルボニルに結合した場合には、5-ブロモ-7-ニトロインドリン
基は420nmの光に暴露することによって反応が起こる。
【０１２１】 第2の別の態様においては、リンカー分子の反応基はシナメート基を含む広く
多様な陰性の光反応基から選択される。
【０１２２】 または、反応基は電子線リソグラフィー、X線リソグラフィー、もしくはその
他の照射法によって活性化もしくは不活性化される。電子線リソグラフィーに好
ましい反応基はスルフォニル基である。用いられる他の方法は、例えば、電流源
への暴露を含む。その他の反応基および活性化法が、本開示の図に示されている
。
【０１２３】 結合分子は、好ましくは、例えば、半導体工業で既知であり、例えば、SzeのV
LSITechnology、McGraw-Hill（1983）、およびMeadらのIntroductiontoVLSISyst
ems、Addison-Wesley（1980）、（これらは、すべての目的において参照として
本明細書に組み入れられる）に記載のタイプの光リソグラフィー技術を用いた好
ましいマスク法で光に暴露する。保護基の除去に必要な光の波長に対し透過性で
ある基質であれば、保護基を含む表面もしくは基質の背面のいずれかに光を当て
る。
【０１２４】 マスクは、ある態様においては、不透明材料の層で選択的にでコートされた透
明な支持体材料である。不透明材料部分は、基質表面上の所望の精密パターンに
おける不透明材料を残し、除去される。マスクを基質表面と直接接触させる。マ
スクの「開口部」は、基質から光除去性の保護基を除去することが好ましい基質
上の位置に対応する。並列マークを用い、その前のパターン化段階の順次マスク
を正確に重層する通常の並列化技術を用いて、もしくはより洗練された技術を用
いて並列化を行う。例えば、Flandersら「新規干渉並列化技術（ANewInterferom
etricAlignmentTechnique）」（App.Phys.Lett.31:426-428（1977））（これは
参照として本明細書に組み入れられる）に記載のもの等の干渉技術が用いられる
。
【０１２５】 基質に当てた光のコントラストを向上させるためには、幾つかの態様に従って
コントラストを亢進する材料をマスクおよび基質の間に入れることが好ましい。
このようなコントラストを亢進する層は、キノンジアザイドもしくは目的波長で
一過的に漂白される材料等の光で分解される分子からなる。材料の一過的漂白に
よって、光を当てる場所での浸透がより大きくなり、従ってコントラストが亢進
する。または、コントラストの亢進は被覆ファイバーオプティックス束によって
も得られる。
【０１２６】 光は、通常の白熱光源、レーザー、レーザーダイオード等に由来するものであ
ってもよい。非平行光源を用いる場合には、基質上に光が広がるのを防ぐ厚い、
もしくは多重層のマスクを用いることが好ましい。さらに、幾つかの態様におい
ては、合成を制御するために異なる波長に感応する基を利用することが好ましい
。例えば、異なる波長に感応する基を用いて、ポリマー合成もしくは特定のマス
キング段階を省くように分枝位置を選択することも可能である。
【０１２７】 または、基質は変調レーザーもしくはダイオード光源下で変換される。このよ
うな技術は、例えば、Feyrerらの米国特許第4,719,615号に記載され、参照とし
て本明細書に組み入れられる。別の態様においては、レーザー・ガルバノメトリ
ック・スキャナーを利用する。別の態様においては、通常の液晶（本明細書にお
いて「光バルブ」と称する）またはファイバーオプティックによる光源上もしく
は接触して合成がおこる。適当に調整した液晶によって、光を選択的に制御し、
光が選択された基質領域に接触できるようにする。または、光が選択的にあたる
一連の光ファイバーの端で合成が起こる。光に当てる位置をコントロールする他
の手段については、当業者であれば、理解できる。
【０１２８】 ペプチド合成のリンカーおよびハンドルの開発は、Fieldsらの「固相ペプチド
合成の原理および実際（PrinciplesandPracticeofSolid-PhasePeptideSynthesis
）」SyntheticPeptides:AUser'sGuide.G.Grant、Editor.W.H.FreemanandCo.:New
York.p.77-183（1992）;G.Barany らの「固相ペプチド合成のためのハンドルお
よび支持体における最近の進歩」、ペプチド-化学.構造および生物学、第13回米
国ペプチドシンポジュウム、R.S.HodgesandJ.A.Smith、Editor.EscomSciencePub
lishers:Leiden、TheNetherlandspp.1078-80（1994）に記載されており、これら
は参照として本明細書に組み入れられる。この技術は容易にDNAおよびPNAに利用
可能である。PALの開発（Albericio ら「穏和な条件におけるC末端ペプチドア
ミドの固相合成のための5-（4-（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミ
ノメチル-3,5-ジメトキシフェノキシ）吉草酸（PAL）ハンドルの調製および応用
（PreparationandApplicationofthe5-(4-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)Amino
methyl-3,5-Dimethoxyphenoxy)ValericAcid(PAL)HandlefortheSolid-phaseSynth
esisofC-terminalPeptideAmidesunderMildConditions）」J.Org.Chem..55:3730-
3743（1990）；これは参照として本明細書に組み入れられる；およびエステル（
HAL）（Albericioら.、「保護ペプチドセグメントの固相合成のための超感受性
酸不安定（HAL）トリス（アルコキシ）ベンジルエステルのアンカーリング （H
ypersensitiveAcid-labile(HAL)Tris(alkoxy)BenzylEsterAnchoringforSolid-ph
aseSynthesisofProtectedPeptideSegments）」TetrahedronLett.,32:1015-1018
（1991）；これは参照として本明細書に組み入れられる；C末端のペプチドアミ
ド、および所謂セグメント濃縮法の構築単位として用いることのできる保護され
たペプチド酸をそれぞれ与える酸による開裂で生じる結合は、特に興味深い。PA
LもしくはHAL結合の開裂から酸において生じた安定化カルボニウムイオンは、ト
リプトファニルペプチドによって停止することができる。この反応はペプチド合
成には好ましくはなく、適当なスカンベンジャーの使用によってこれを（部分的
には）防ぐことができるが、HAL修飾表面でオリゴTrp末端標識DNAおよびPNA分子
を化学的に捕獲する有益な応用法がある。
【０１２９】 オリゴヌクレオチドアレイを作製する複数のアプローチが当技術分野で知られ
ている。Southernら「オリゴヌクレオチド配列のアレイに対するハイブリダイゼ
ーションによる核酸配列の分析・比較:実験モデルを用いた評価（AnalyzingandC
omparingNucleicAcidSequencesbyHybridizationtoArraysofOligonucleotides:Ev
aluationusingExperimentalModels）」Genomics.13:1008-1017（1992）;Fodorら
「生物学的チップを用いた多重バイオケミカルアッセイ（MultiplexedBiochemic
aAssayswithBiologicalChips）」、Nature.364:555-556（1993）;Khrapkoら「オ
リゴヌクレオチドマトリックスでのハイブリダイゼーションによるDNAシーケン
シングの方法（AMethodforDNASequencingbyHybridizationwithOligonucleotideM
atrix）」、J.DNASeq.Map.,1:375-388（1991）;VanNessら「オリゴデオキシヌク
レオチドプローブをベースにしたハイブリダイゼーションアッセイのための多目
的固体支持体システム（AVersatileSolidSupportSystemforOligodeoxynucleosid
eProbe-basedHybridizationAssays）」、NucleicAcidsRes.、19:3345-3350（199
1）;Zhangら「膜結合性修飾オリゴヌクレオチドを用いる癌および遺伝病の単一
塩基変異分析（Single-baseMutationalAnalysisofCancerandGeneticDiseasesUsi
ngMembraneBoundModifiedOligonucleotides）」、NucleicAcidsRes.,19:3929-39
33（1991）;K.Beattie、「ゲノセンサー研究における進歩（AdvancesinGenosens
orResearch）」、Clin.Chem.41（5）:700-06（1995）は参照として本明細書に組
み入れられる。これらのアプローチは3つのカテゴリーに分類される。（1）標準
的方法によるオリゴヌクレオチド合成および空間的アレイにおける、ある時間で
のそれらの結合、（2）短いオリゴヌクレオチド合成を可能とするシリコンチッ
プの光リソグラフィーのよるマスキングおよび光化学的脱保護、（Fodorら 生
物学的チップを用いた多重バイオケミカルアッセイ（MultiplexedBiochemicaAss
ayswithBiologicalChips））、Nature.364:555-556（1993）およびR.J.Lipshutz
ら「遺伝的多様性に対するオリゴヌクレオチドプローブアッセイの利用（UsingO
ligonucleotideProbeArraysToAssessGeneticDiversity）」、Biotechniques、19
:442-447（1995）、これは参照として本明細書に組み入れられる）;および（3）
未マスク部位における単一塩基の添加による短いオリゴヌクレオチド合成を可能
とする物理的マスキング（Southernら「オリゴヌクレオチド配列のアレイに対す
るハイブリダイゼーションによる核酸配列の分析・比較:実験モデルを用いた評
価（AnalyzingandComparingNucleicAcidSequencesbyHybridizationtoArraysofOl
igonucleotides:EvaluationusingExperimentalModels）」Genomics.13:1008-101
7（1992）;Maskosら「ガラス支持体上で合成した大型アレイを用いたオリゴヌク
レオチド再会合の研究（AStudyofOligonucleotideReassociationUsingLargeArra
ysofOligonucleotidesSynthesisedonaGlassSupport）」、NucleicAcidsRes.、21
:4663-4669（1993）、は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１３０】 オリゴヌクレオチドアレイの構築に関してはかなりの進歩が見られ、あるもの
は独立の256のアドレスを含むが、ハイブリダイゼーションで特異的DNA配列を検
出することにおいてはこれらの方法はあまり好適ではない。特に、より長いオリ
ゴヌクレオチドを含むアレイは、現在のところ、一度に一箇所のアドレスに付加
することによってしか合成されないので、潜在的サイズにおいて制限を受ける。
現行法では、オリゴヌクレオチドを順次付加するには約1時間かかる。従って、1
,000アドレスのアレイでは、調製に24時間通しで行ったとしても40日以上を要す
る。8merから10merの短いオリゴヌクレオチドを含むアレイは、産業上の応用に
は適さない。なぜならば、単一塩基の違いを効果的に検出するためにより長い分
子が必要となるからである。
【０１３１】 これら従来の方法も、本発明の検出法のオリゴヌクレオチドアレイを有する該
支持体を調製するために依然として有用である。しかしながら、より好ましいア
プローチがある。
【０１３２】 相対的に小さいが、明確に区別される部位のオリゴヌクレオチドもしくはPNA
オリゴマー負荷に好ましい支持体を調製することが望ましい。現在の市販の蛍光
撮影装置では、50平方μmのピクセル当たり3アトモル程度の低いシグナルを検出
することができる。従って、合理的サイズのアドレスもしくはアレイ上の「スポ
ット」は、約4×4ピクセル、もしくは200平方μmである。より小さいアドレスは
CCDで検出することができる。このようなアドレスの検出限界は「スポット」当
たり約48アトモルであり、これは蛍光DNAシークエンシング装置を用いたときの1
00アトモルの検出限界に匹敵する。200平方μm当たり負荷することのできるオリ
ゴヌクレオチドの容量は、潜在的なシグナル対雑音比の指標を与える。20フェム
トモルは約400:1のシグナル対雑音比を与えるが、200フェムトモルは約4000:1の
良好なシグナル対雑音比を可能とする。オリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴ
マーは、ハイブリダイゼーションを容易にするために、柔軟な「リンカーアーム
」および固体支持体の「外側」もしくは「表面」上に存在する必要がある。支持
体は、非蛍光性であり、ハイブリダイゼーションを阻害することなく、また非特
異的結合による高バックグランドシグナルを与えることがないものであることが
必要である。
【０１３３】 固体支持体上の相補的捕獲オリゴヌクレオチドアドレスは、DNAもしくはPNAの
いずれかである。PNAによる捕獲は、DNAによる捕獲より好適である。何故ならば
、PNA/DNAデュプレックスはDNA/DNAデュプレックスよりも約l℃/塩基対強いから
である。M.Egholmら「ワトソン・クリックの水素結合の規則に従って相補的オリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズするPNA（PNAHybridizestoComplementaryOligo
nucleotidesObeyingtheWatson-CrickHydrogen-bondingRules）」、Nature.365:5
66-568（1993）は参照として本明細書に組み入れられる。従って、Tm=72℃であ
る24merのDNA/DNA二重鎖は、「予測される」Tm＝96℃を有する一方がPNAである
二重鎖に対応する（実際の融解点は、上記の「経験則」より僅かに低く、融解点
が80℃を越えるとより不正確になる）。さらに、DNA/DNAとPNA/DNAとの融解の差
は、低塩でさらに低くなる。
【０１３４】 DNA/DNAデュプレックスの融解温度は、[4n（G*C）+2m（A*T）]℃で見積もるこ
とができる。オリゴヌクレオチド捕獲は、形成したデュプレックスと互いにハイ
ブリダイズする相補的位置特定可能なアレイに特異的な部位との間のG*C/A*T含
量の差より生じるTm差を狭めることによって、捕獲オリゴヌクレオチドを最適化
できる。チミンの代わりに5-プロピニル-dUを用いることでDNAデュプレックスの
Tmを、平均置換当たり1.7℃増加させることができる。Froehler ら「2'-デオキ
シウリジンおよび2'-デオキシシチジンのC-5プロピン類縁体を含むオリゴヌクレ
オチド（OligonucleotidesContainingC-5PropyneAnalogsof2'-deoxyuridineand2
'-deoxycytidine）」、TetrahedronLett.,33:5307-5310（1992）およびJ.Sagiら
の TetrahedronLetters.34:2191（1993）は参照として本明細書に組み入れられ
る。捕獲スキームにおける同一置換は、デュプレックス等の成分間のTm差を低め
、全デュプレックスのTmを上げることが必要である。以下の構造を有するS-プロ
ピニル-dUのホスホアミダイト誘導体は、直ぐ上のFroehlerおよびSagiの文献に
従って調製できる。これらは、参照として本明細書に組み入れられる。
【化４】
【０１３５】 Fmocアミノ保護基を有する5-プロピニルウラシルPNAモノマーは、以下の合成
で得られる（ここで、DMFはN,N'-ジメチルホルムアミド、DCCはN,N'-ジクロロヘ
キシルカルボジイミド、HOBtは1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびTHFは
テトラヒドロフランである）:
【化５】
【０１３６】 Egholmら「ペプチド核酸（PNA）.アキラル性のペプチド骨格を有するオリゴヌ
クレオチド類縁体（PeptideNucleicAcids(PNA).OligonucleotideAnalogueswitha
nAchiralPeptideBackbone）」、J.Am.Chem.Soc.、114:1895-1897（1992）及びEg
holmら「シトシンとチミンを含むペプチド核酸（PNA）によるDNA中のグアニンと
アデニンの認識（RecognitionofGuanineandAdenineinDNAbyCytosineandThymineC
ontainingPeptideNucleicAcids(PNA)）」、J.Am.Chem.Soc.,114:9677-9678（199
2）に記載の方法を用いて、これらは参照として本明細書に組み入れられる。上
記の合成スキームには、5-プロピニルウラシル塩基の成分を有するPNAモノマー
の調製を示している。5-ヨードウラシルは、まずヨード酢酸でアルキル化し、次
にプロピニル基をPd/Cu触媒で塩基部分にライゲーションする。スキームの残余
の段階は上記の参考文献による方法に従う。これらモノマーを合成DNAおよびPNA
鎖に組み込むことができる。
【０１３７】 アレイ合成の一般的な好ましいアプローチには2つある。第1のアプローチにお
いては、完全長のDNAオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマーを調製し、次に
共有結合で、固体支持体もしくはメンブレンと結合する。第2のアプローチでは
、支持体に多量体を順に付加し、特異的に設計したPNAオリゴマーもしくはDNAオ
リゴヌクレオチドを構築する。これらの多量体を、固体支持体もしくはメンブレ
ン表面に列もしくは行に特異的付加する。得られた「チェッカーボード」パター
ンが完全長のPNAもしくはDNAの単一の位置特定可能なアレイを生成する。
【０１３８】 図14〜図16に完全長のDNAオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマーの調製、
次に、結鎖固体支持体への完全長の分子への結合に関する異なる方法を示す。
【０１３９】 図14A〜Eには、個々の完全長オリゴヌクレオチドをグリッドの適当な位置にカ
ップリングさせることによるDNAもしくはPNAオリゴヌクレオチドアレイ構築法を
示す。図14Aのアレイは、アレイ表面の200μm×200μmの16の領域にオリゴヌク
レオチドが結合して生成したオリゴヌクレオチドのパターンを示す。各々個々の
200μm×200μmの領域は、表面に結合した単一の配列を含むDNAもしくはPNAを含
む。個々の四角形の領域は、隣接した四角形から200μm離れている。従って、図
14Aのアレイは、3mm×3mmの領域に64（8×8）の異なるオリゴヌクレオチドを支
持する。アレイの構築を多重化するために、800μmの距離離れている16の四角形
に、同時に特異的オリゴヌクレオチドを結合させた。したがって、図14B-14Eに
示されるように、8×8グリッドをたった4段階で構築できる。これらの図におい
て、黒い四角形は、本合成段階における異なる位置を表すが、斜線の四角は、そ
れ以前の段階で合成した領域を表す。最初の段階（図14B）では、同時にAl、El
、I1、Ml、A5、E5、I5、M5、A9、E9、I9、M9、A13、E13、I13、およびM13の位置
でオリゴヌクレオチドを固定化する。次の段階（図14C）では、装置を再並列さ
せ列Cを開始する。行1が完了した後、次の段階（図14D）では行3を開始する。最
後に、8×8グリッドを完成させるために最後の16オリゴヌクレオチドを固定化す
る（図14E）。従って、8×8アレイの構築を、64個の個々のスポッティング反応
段階で行う代わりに4合成段階に減らすことができる。この方法は、容易に拡張
でき、同時に96オリゴマーのスポッティングが可能である装置を用いて、迅速に
より大きなアレイを構築できる。
【０１４０】 図15A〜Eは、図14に記載のアレイの構築法の透視図を表す。図15A〜Eにおいて
は、4つの異なる24merをスポッティング可能である装置を用いた4×4（16）アレ
イの構築が同時に描かれている。第1に、図15Aに示されるように、装置で、Al、
El、A5、およびE5の位置で4つのオリゴマーを結合させる。次に、図15Bで示すよ
うに、装置を水平に移動させて、4つのオリゴマーをC1、G1、C5、およびG5の位
置で結合させる、次に、図15Cで示すように、装置の位置調整をし、A3、E3、A7
、およびE7の位置で4つのオリゴマーを結合させる。最後に、図15Dに示されるよ
うに、装置で残余の4オリゴマーをC3、G3、C7、およびG7の位置で結合させる。
図15Eの透視図に示されるように、完成したアレイは、16の24merを含む。
【０１４１】 図16A〜Cには、図14に示されるアレイグリッドGの異なる位置に同時に16の異
なるオリゴヌクレオチドのカップリングが可能である添加装置2の図を示す。上
面図の黒い四角形（図16A）は、互いに空間的に600μm離れた16個の200μm×200
μmの領域を表す。該装置には、異なるオリゴヌクレオチドを含むチューブでア
レイ上の上記の異なる位置の漏斗形のチェンバーを満たすことが可能な16個の入
力ポートがある。装置の側面図（それぞれ図16Aのライン16B-16Bおよび16C-16C
を含む図16B〜C）は漏斗形のチェンバー4が装置下のアレイ上の適当な領域に並
列していることを示す。さらに、2つのバルブ6および8（図16A〜Cの斜線の四角
形）は、独立した16個の反応チェンバーにおいて液体の流れを制御する。一つの
バルブ6は入力ポート10からの流体の流入を制御し、反応チェンバー4への添加と
除去を行うために、もう一方のバルブ8は減圧ライン12にライゲーションする。
装置はまずアレイの適当な200μm×200μm領域にわたって並列する。次に、全装
置がアレイに確実な加圧を行い、上記各々の位置で密閉反応チェンバーを形成す
る。アレイ上の各々の位置の周りに存在する10μmの隆起堤Rによって、オリゴマ
ーがアレイ上の隣接領域に漏れることを防ぐ密着シールの形成を確保する。次に
、減圧ライン12へのバルブ8を開け、溶液流入ポート10のバルブ10を閉める。こ
れによって反応チェンバー4から空気を除去し、チェンバー内を陰圧にする。次
に、減圧ライン12へのバルブ8を閉め、溶液流入ポート10のバルブ10を開ける。
陰圧により、溶液が反応チェンバーに流れ込む。この段階では、反応チェンバー
4内の気泡形成の可能性を確実に除き、200μm×200μmの領域におけるオリゴヌ
クレオチドの分布を確実にする。オリゴヌクレオチドを活性化アレイ表面に結合
させた後、入力バルブ6を閉め、減圧ライン12へのバルブ8を開ける。過剰な溶液
を反応チェンバーから完全に除去するために装置をアレイ表面から持ち上げる。
今度は第2の装置を再並列させ、次にアレイ上の16個の位置の合成をおこなう。
【０１４２】 図15〜図26には、順に支持体にPNAもしくはDNA多量体を添加することにより、
固体支持体上にPNAオリゴマーもしくはDNAオリゴヌクレオチドを構築するための
異なる方法を示す。
【０１４３】 多量体によるアレイ構築の例として、このような構築を四量体で達成すること
ができる。4塩基を四量体として配置する可能な265（44）通りの方法のうち、単
一の配列を有する36通りのものが選択される。選択された四量体の各々が、他の
すべてのものと少なくとも2塩基異なり、2つの二量体で互いに相補的なものはな
い。さらに、自己対合もしくはアドレス間のヘアピン形成を起こす四量体は除か
れている。
【０１４４】 最終的な四量体は、表1のリストに示してあり、任意に1〜36までの番号付けを
行った。必要となることもある24mer捕獲オリゴヌクレオチドアドレスの配列の
設計モジュールとして、この四量体の単一セットを用いる。段階的に（1度に1塩
基）、もしくは同時（四量体構築単位）合成法で、この構造を組み立てる。四量
体の多くの他のセットは、上記の規則に従って設計される。このセグメント・ア
プローチは四量体のみに限定されるものではなく、他のユニット、すなわち、二
量体、三量体、五量体、もしくは六量体でも用いることができる。
【０１４５】
【表１】 互いに少なくとも2塩基異なる四量体PNA配列および相補的DNA配列の
リスト 四量体の番号付けスキームでは、各々のアドレスが6つの数字で略称されること
に注目すること（例えば、下記の表2第2列）。36の四量体単一セットで設計され
た24merアドレスの概念（表1）から、可能な構造は膨大な数となる（366=2,176,
782,336）。
【０１４６】 図17には、少なくとも2塩基互いに異なる36の四量体で多数の可能な設計のう
ちの1つを示す。チェッカーボード・パターンは、256の可能な全四量体を示す。
四角形は、チェッカーボードにおける左の最初の2塩基とそれに続く上部の2塩基
を表す。各々の四量体は少なくとも互いに2塩基異なる必要があり、非相補的で
ある必要がある。四量体を白いボックスで示し、その相補鎖を（番号）としてリ
ストに載せた。従って、このスキームにおいて、相補的配列GACC（20）およびGG
TC（20'）はお互いに排除的である。さらに、四量体は、非回文構造的でなくて
はならない、例えば、TCGA（黒い対角線のボックス）、および非繰り返しでなく
てはならない、例えば、CACA（黒い対角線のボックス、上部の左から下部右）。
36の四量体とは、僅か1塩基しか異ならないその他の配列はいずれも、明るい灰
色で斜線付けされている。4つの潜在的四量体（白いボックス）は、すべてがA*T
もしくはすべてがG*Cである塩基のいずれかであるために選択されなかった。し
かしながら、下記に示されるように、A*T塩基のTm値をほぼG*C塩基のレベルに上
げることは可能である。従って、すべてがA*TもしくはすべてがG*C塩基である四
量体（白ボックス中のものを含む）は、潜在的に四量体設計用いることができる
。さらに、捕獲オリゴヌクレオチドアドレスの配列内で、およびオリゴヌクレオ
チドプローブの位置特定可能なアレイに特異的な部位であれば、チミンは5-プロ
ピニルウリジンで置換できる。これにより、A*T塩基対のTmは約1.7℃増加する。
従って、個々の四量体のTm値は、約15.1℃から15.7℃となるはずである。完全長
24merのTm値は95℃以上となるはずである。
【０１４７】 この概念を例示する目的で、36の四量体配列のうちで6つからなるサブセット
を用いて、アレイ:1=TGCG;2=ATCG;3=CAGC;4=GGTA;5=GACC;および6=ACCTを構築し
た。所望の24merの位置特定可能なアレイに特異的な部位および24merの相補的捕
獲オリゴヌクレオチドのアドレス配列設計モジュールとして、この単一の四量体
セットを用いることができる。この態様は、5つの位置特定可能なアレイに特異
的な部位（表2のリストに載せた配列）の合成を含む。四量体の番号付けスキー
ムで、各々の部位の略称（「Zip#」と称する）が6つの数字で示されている（「z
ipコード」と称する）ことに注目すること。
【０１４８】
【表２】 5つのDNA/PNAオリゴヌクレオチドアドレス配列の全リスト これらのオリゴマーは各々、5'末端に酸化ヘキサエチレン・リンカーアーム（P.
Grossman らNucl.AcidsRes.、22:4527-4534（1994）は参照として本明細書に組
み入れられる）、およびスライドグラス表面への結合に好適である最終的なアミ
ノ官能基、もしくは別の物質を含む。結合方法は、フリーの表面官能基に依存す
る（Y.Zhangら、NucleicAcidsRes.、19:3929-3933（1991）およびZ.Guoら、Nucl eicAcidsRes.、 34:5456-5465（1994）は参照として本明細書に組み入れられる）
。
【０１４９】 合成オリゴヌクレオチド（正常および相補的方向、捕獲ハイブリダイゼーショ
ンもしくはハイブリダイゼーション/ライゲーションのいずれか）は、天然の塩
基もしくはヌクレオチド類似体のいずれかを有するDNAもしくはPNAのいずれかと
して調製する。このような類似体は完全な相補性で天然の塩基と対をなすが、Tm
値は増加する（例えば、5-プロピニルウラシル）。
【０１５０】 捕獲オリゴヌクレオチドは各々、配列が大きく差なり、交叉反応性の機会を最
小にする。図17および表1を参照のこと。段階的に合成を行い、塩基を1つ1つ導
入するのではなく、保護されたPNA四量体を構築単位として用いることができる
。これらは簡単に調製できる。対応する保護されたオリゴヌクレオチド中間体は
、ヌクレオチド間のリン酸結合を付加的に保護する必要がある。所与の任意のア
ドレスにおいて、24merの構築は、6つの合成段階のみを必要とし、段階的合成と
比較して全体的な収率の改善を伴う。このアプローチは、全体として配列表面に
モノマーを1つ1つ付加する際におこる支持体上の誤った配列の存在を排除する。
従って、従来技術との違いは、擬似シグナルの可能性の減少である。さらに、各
々のアドレスにおける誤った配列は、より短いものであり、少なくとも4塩基少
ないので、これらが正しいハイブリダイゼーションの阻害を起こすリスクはない
。このことは「キャッピング」段階は必要ではないことをも意味する。
【０１５１】 下記の説明のように、マスキング技術によって、同時に複数のアドレスを構築
することが可能となる。アレイ製造段階の直接の結果として、さらに複数の利点
に気づく。各々の24merのアドレスは直ぐ近傍の24merとは3つの四量体もしくは
少なくとも6塩基分異なる。低塩では、PNA/DNAハイブリッドにおける各々の塩基
のミスマッチによって、融解温度が8℃低下する。従って、正しいPNA/DNAハイブ
リダイゼーションのTmは、不正確なハイブリダイゼーションよりも少なくとも48
℃高くなる。また、隣接した24merは、12mer離れており、これはいずれともハイ
ブリダイズせず、検出プロフィールの「デッド」ゾーンを表している。PNAアド
レスは、丈夫で再利用可能なアレイを与える。
【０１５２】 以下の記載では、36の単一PNA四量体の調製について開示し、アレイの機械的/
化学的調製方法を示す。この技術を用い、PNA24merの25アドレスを有する5×5ア
レイを作製することができる。または、36の四量体すべてを組み込んで、1,296
アドレスからなる完全サイズのアレイを作製することができる。
【０１５３】 図18A-Gは、PNA四量体を付加して単一24merアドレスの5×5アレイの作製を示
す模式図である。製造装置では、マルチチェンバー装置もしくは表面を90°回転
させて、列もしくは行のいずれかにPNA四量体を付加することができる。円形の
マニホルドによって四量体付加の円形状による交換が可能となる。従って、複雑
な単一アドレスを、単純なアルゴリズムを用いて組み立てることができる。最初
の四量体付加においては、PNA四量体1、2、3、4、および5は、それぞれ図18Aに
示されるように、5列の各々の表面に結合する。図18Bに示されるように、チェン
バーを90°回転させた後、PNA四量体6、5、4、3、および2を隣接した行に添加す
る。図18Cに示されるように、第3の段階では、四量体3、4、5、6、および1（円
形状交換であることに注意）を列に添加する。第4の段階では、図18Dに示される
ように、四量体2、1、6、5、および4を隣接した行に添加する、等々。この段階
を、下記の図23E〜Gに示す方法で継続する。図の下部は、各々位置における単一
24merを生成する四量体配列を表す。真ん中の行の配列は、1-4-3-6-6-1;2-4-4-6
-1-1;3-4-5-6-2-1;4-4-6-6-3および5-4-1-6-4-1は完全長で表2に示す。円形状交
換による四量体の付加を用いて、より大きなアレイを生成する。四量体付加は、
円形状パターンに制限されるものではなく、他の多数の組み合わせで付加し、少
なくとも3つの四量体が互いに異なり、少なくとも6塩基に変換される単一アドレ
スを形成することができる。
【０１５４】 本発明は、対立遺伝子特異的PCR、ディファレンシャルハイブリダイゼーショ
ンもしくはシークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーションを利用する既存の
変異検出法より特異性が高い。これらの方法は、ハイブリダイゼーションのみに
頼って、他は同一の2つのオリゴヌクレオチドにおける単一塩基の違いを識別す
る。このようなハイブリダイゼーションのシグナル対雑音比は、アレイにおける
最も密接に関連した2つの捕獲オリゴヌクレオチドで達成可能のものよりも顕著
に低い。3つの行および3つの列に別の四量体を付加することによって各々のアド
レスを設計するので、与えらたアドレスは隣接したものから少なくとも3つの四
量体が異なる。各々の四量体は少なくとも2塩基他の四量体のいずれもと異なる
ので、与えらたアドレスは少なくとも6塩基別のアドレスと異なる。しかしなが
ら、実際には、ほとんどのアドレスが、かなり多くの塩基について他のほとんど
のアドレスと異なる。
【０１５５】 この概念を2つのアドレスZip12およびZip14を用いて下記に例示する。これら2
つのアドレスは、図18および図20（下記）に模式図的に表した25アドレスの中で
最も関連している。これらの2つのアドレスは、それぞれ異なる位置（下線で示
す）で共通の四量体を有する。
【０１５６】 さらに、それらは共通に1つながりの12ヌクレオチド、および共通の最後4ヌク
レオチドを含む（下線で示す）。
【０１５７】 それぞれは、オリゴヌクレオチド間で少なくとも8つの差異を含む。下線付け
されたヌクレオチドにおいてZip12もしくはZip14に相補的なオリゴヌクレオチド
を、より低い温度で（例えば、37℃）これらのアドレスの両方にハイブリダイズ
させことができるが、完全に相補的なオリゴヌクレオチドのみが高い温度で（例
えば、70℃）ハイブリダイズする。
【０１５８】 さらに、Zip3等の他の捕獲オリゴヌクレオチドについては、共通ヌクレオチド
数はさらに低い（下線で示す）。
【０１５９】 したがって、ハイブリダイゼーション中にZip3からZip12を識別する能力は、
既存の方法を用いて達成可能なものよりも有意に高い。
【０１６０】 列もしくは行のいずれかにPNA四量体を送る前に、異なるチェンバーと壁（各
々200μm厚）を有するマルチチェンバー装置を、図19Aの修飾ガラスもしくはシ
リコン表面に押しつける。表面は10μmの隆起を生ずる（黒い線）ようにエッチ
ングされ、チェンバー間の漏れを防止する。最初、アレイ表面に柔軟なスペーサ
ー（リンカー）を結合させる。第1の段階では、図19Bに示されるように、PNA四
量体、1、2、3、4、および5はそれぞれ、各々5つの列の表面に結合する。次に、
マルチチェンバー装置を90°回転する。図19Cに示されるように、四量体6、5、4
、3、および2を隣接した行に付加する。24merのPNAオリゴマーを合成するために
、該段階を合計3回繰り返す。与えらた行もしくは列内で各々の完成した24merは
単一のPNA配列を表し、従って所望の位置特定可能なアレイを得ることができる
。より小さいオリゴヌクレオチド配列は、同一方向に3回の合成を行って得られ
るハーフサイズの12merを表す。各々の24merは隣接したものとは3つの四量体が
異なり、各々の四量体は、他のものとは少なくとも2塩基異なるので、各々の24m
erは隣とは少なくとも6塩基異なる（すなわち、25％のヌクレオチドの違い）。
従って、間違ったアドレスではその24塩基において6ミスマッチを有し、したが
って、特に75〜80℃のハイブリダイゼーション条件下では間違ったアドレスには
捕獲されないのである。さらに、特定のより小さな12mer配列は、グリッド上の
いずれかの位置の24mer配列内に見出されるが、位置特定可能なアレイに特異的
な部位は50℃以上の温度では12mer配列にハイブリダイズしないのである。
【０１６１】 出発表面は遊離アミノ基を含み、非開裂性アミド結合を支持体のPNAのC末端に
ライゲーションし、PNA鎖がそのアドレスに保持されるようにセグメント濃縮ア
センブリーを完了し直交側鎖脱保護する必要がある。200μmの空間と200μmバリ
ヤーを含む単純マスキング装置は、異なった列（図20A）において、5つの四量体
の各々が固体支持体に結合できるように設計される。第1の四量体セットの付加
後に、マスキング装置を90°回転し、第2の5つの四量体のセットを付加する（図
20B）。これは行に付加した後に列に付加することと比較することができる。行
および列の交点は、さらに付加を含み、同様に、各々の交点は、単一配列の8mer
を含む。この手順で合計6サイクル繰り返すことによって、単一の24merを含む25
の四角形、および共通12merを含む残余の四角形が生成する（図20Cおよび21A〜F
）。シリコンもしくはガラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μm
の隆起を含み、真空下でチェンバーを満たす。円形のマニホルド（図26）により
、5つの行（もしくは列）に送達する前に6つの四量体の円形状交換が可能となる
。この設計によって、幾つかの配列が隣接した配列の同一の3つの四量体を含む
場合であっても、常に少なくとも3つの四量体が互いに異なる単一の24merが生成
する。このマスキング装置は、アレイがモノマーに対し四量体で作られることを
除けば、概念的にはSouthernら、Genomics.13:1008-1017（1992）およびMaskos
ら、NucleicAcidsRes.21:2267-2268（1993）（参照として本明細書に組み入れら
れる）に開示されるマスキング技術と同様である。
【０１６２】 または、各々の位置を分離するマスクを用いて、不完全な12mer配列の産生を
防止する。第1段階（図19Dに記載の）では、PNA四量体1、2、3、4、および5は、
それぞれ、5つの列の各々において表面に結合させる。次に、マルチチェンバー
装置を90°回転させる。図19Eに示すように、四量体6、5、4、3、および2を隣接
した行に付加する。24merのPNAオリゴマーを合成するために、この段階を合計3
回繰り返えす。与えらた行および列内の各々の完成した24merは、単一のPNA配列
を表し、従って位置特定可能なアレイを得ることができる。さらに、各々の24me
rは、PNAオリゴマーを結合していない200μm領域で隣接したオリゴマーから分離
されている。
【０１６３】 シリコンもしくはガラス表面は光化学的にチェッカーボード・パターンにおい
て10μmの隆起の直交グリッドを生ずるようにエッチングする（図20を参照のこ
と）。四角形（200μm×200μm）を一つおきに活性化し、C18アルキル・スペー
サーおよびPEG親水性リンカー（MW400〜4,000）の付加を可能にすると、側面に
おいて少なくとも1つの空の四角形および2つの隆起で隔てられようになる。
【０１６４】 PNA四量体を用いた通常のアレイの例が得られる。1回につき36の列もしくは行
のいずれかに36の異なる四量体を付加する。いずれかの四量体をいずれかの行に
付加するもっとも単純な方法は、小型バルブにチューブをつないで、36の全四量
体溶液を唯一の開口部を有する円形のマニホルドへ結合させることである。円形
のマニホルドの反対側は、個々の行（もしくは列）に通じる36の小型バルブのい
ずれかに結合する。従って、マニホルドおよび小型バルブをチェンバー（行）の
方へ回転させて、1度につきいずれかの四量体をポンプでいずれかの行に送るこ
とができる。これは、物理的回転を必要とする機械装置でもよく、もしくは一連
の流入（四量体）および流出（行）チャネルと電子マイクロバルブを用いて達成
することもできる。この段階は非常に迅速で（次の使用のためのマニホルドのす
すぎを含め5秒）あり、36行すべてに付加するのに約36×5=180秒かかる。
【０１６５】 行もしくは列を充填する潜在的にさらに迅速な方法は、同時にすべてを充填す
ることである。これを、5×5アレイに関し図20に例示する。シリコンもしくはガ
ラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μmの隆起を含み、上記の真
空技術を用いてチェンバーを満たす。円形のマニホルドにより、5つの行（もし
くは列）に送達する前に6つの四量体の円形状交換が可能となる。図20において
は、第1の段階は5、4、3、2、1である。マルチチェンバー装置を回転させて、順
方向で、もしくは逆方向のいずれかで添加を継続することができる。この例にお
いては、2、3、4、5、6の順方向で第2の段階を行う。第3の段階では、円形状交
換（リバース）1、6、5、4、3で行う。第4の段階では、（フォワード）4、5、6
、1、2である。第5の段階では（リバース）4、3、2、1、6である。第6の段階で
は（フォワード）5、6、1、2、3である。これは、36の四量体を36の行（もしく
は列）に拡張することができる。このアプローチでは、アドレスの作製に関して
、あらゆる位置で366=2,176,782,336から単一位置で366=2,176,782,336であるア
レイの潜在的なバリエーションを第1のアドレスで定められる1,295位置に制限す
る。これは必要な異なるアドレス数を大幅に上回る。さらに、各々のアドレスは
あらゆる他アドレスと少なくとも6ヌクレオチド異なる。
【０１６６】 複数のシリコンチップは同一ウェーハー上に作製できるので、これらのアレイ
いずれもが群として生産されることに注目されたい。与えらた行もしくは列に同
一四量体を添加する必要があるので、このことは四量体の概念では特によく当て
はまる。従って、1つの行で10のアレイ・ラインをカバーし、ゆえに1回に10×10
グリッド=100アレイが作製される。
【０１６７】 または、図20を参照として記載される段階を実施し、1サイクル減らして20mer
オリゴヌクレオチドを作製することができる。捕獲オリゴヌクレオチドは、選択
されたハイブリダイゼーション条件下で相補的位置特定可能なアレイに特異的な
部位を捕獲するのに充分長くなくてはならない。
【０１６８】 図21A〜Fは、位置特定可能なアレイの合成（説明文）模式的断面図を示す。図
21Aは、柔軟なスペーサー（リンカー）のアレイ表面への付加を示す。図21Bは、
第1行のオリゴヌクレオチド四量体の合成を示す。第1の行のみが、四量体1を含
み、可視的である。マルチチェンバー装置を配置し、各々が異なる四量体を含む
付加的な行は、第1の行の後ろに位置する。図21Cは、第1列のオリゴヌクレオチ
ド四量体の合成を示す。マルチチェンバー装置もしくは表面は90°回転されてい
る。四量体9、18、7、および12を隣接チェンバーに添加する。図21Dは、オリゴ
ヌクレオチド行の第2ラウンドの合成を示す。第1行は、四量体2を含む。図21Eは
オリゴヌクレオチド合成の第2ラウンドの合成を示す。四量体34、11、14、およ
び23を第2ラウンドで隣接したチェンバーに添加する。図21Fは、PNA行の第3ラウ
ンドの合成を示す。第1行は四量体16、7、20、および29を付加する四量体3を含
む。与えらた行もしくは列内の24merの全オリゴヌクレオチドは単一で、従って
位置特定可能なアレイを得ることができることに注目されたい。各々の24merは
隣接したものとは3つの四量体分異なるので、四量体は少なくとも2塩基互いに異
なるので、各々の24merは少なくとも6塩基分異なる。各々のミスマッチは有意に
Tmを下げ、24塩基における6ミスマッチの存在によって35℃でのクロスハイブリ
ダイゼーションが起こらないようにする。より小さい12merの配列は互いに同一
であるが、24mer配列とは共通では全くないことに注目されたい。特定の12mer配
列がグリッド上のいずれかの位置の24mer内に見出される場合でも、例えば17-1-
2-3-28-5、オリゴヌクレオチドは、50℃以上の温度で12merにハイブリダイズし
ない。
【０１６９】 図22A〜Cには、図19〜21に記載のアレイグリッドGの構築が可能であるマスキ
ング装置2の設計を示す。図22Aは、装置2およびアレイグリッドGの配置の上面図
であり、側面図22B〜22Cは、それぞれ、図22Aのライン22B-22Bおよびライン22C-
22Cを含む。マスキング装置は200μmの空間および200μmのバリアーを含み、5つ
の四量体の各々を異なった行の固体支持体に結合させることが可能となる。第1
の四量体セットの添加後、マスキング装置を90°回転し、第2の5つの四量体セッ
トを添加する。これは行に付加した後に列に付加することと比較することができ
る。行および列の交点は、さらに付加を含み、同様に、各々の交点は、単一配列
の8merを含む。この手順で合計6サイクル繰り返すことによって、単一24merを含
む空間的に分離した25の四角形、および共通の12merを含む残りの四角形を生成
する。シリコンもしくはガラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μ
mの隆起Rを含み、チェンバー内を陰圧にするためにチェンバー4を減圧ライン12
への開口バルブ8を用いて満たす。緊密シールを形成するためにマルチチェンバ
ー装置をメンブレンもしくは活性化した固体表面に押しつける。1つのチェンバ
ーが隣のチェンバーと相互汚染することを避けるために、バリヤーをゴムもしく
はその他の材料でに被覆した。メンブレンもしくは支持体表面が溶解剤によって
適切に濡らされていることを確かめることも必要である。減圧ライン12へのバル
ブ8を閉じ、次に表面の活性化を行い、脱保護し、開口バルブ6でライン10を通じ
て四量体をチェンバー4に加える。チェンバーを乾かし、メンブレンを90°回転
し、再び固定する。四量体の第2ラウンドでは、上記の真空および四量体添加段
階で、添加を行う。バルブのブロック組立物（図25A〜C）により、適当な行に各
々の四量体を送達する。または、円筒形のマニホルド（図26A〜D）では、5つの
行（または、列）への送達の前に、6つの四量体の円形状交換を可能にする。幾
つかの配列が隣接した配列に同一の3つの四量体を含む場合であっても、この設
計で常に少なくとも3つの四量体分互いに異なっている単一の24merが生成する。
【０１７０】 図23A〜Cは、図19（図19D〜19E）に記載されるアレイ構築法の透視図を表す。
第1の段階では、図23Aに示されるように、PNA四量体1、2、3、4、および5は、そ
れぞれ、5つの列各々の表面に結合している。列の5つの位置各々は隔てられてお
り、オリゴヌクレオチドが結合していないものの間で200μmのギャプがある。次
に、図23Bに示されるように、マルチチェンバー装置を90°回転する。四量体6、
5、4、3および2は、隣接した列で添加する。行の5つの位置の各々は隔てられて
おり、オリゴヌクレオチドが結合していないものの間で200μmのギャプがある。
図23Cに示されるように、完成した各々の24merは、与えらた行および列内で単一
のPNA配列を表す。図19〜22に示される設計とは異なり、分離した位置のマスク
を用いるため、このアレイの設計では各々完全な24mer間にハーフサイズの12mer
を含まない。
【０１７１】 図24A〜Cは、図23に記載のアレイグリッドGの構築が可能であるマスキング装
置2の設計を示す。図24Aは装置2およびアレイグリッドGの配置の上面図であり、
側面図24Bおよび24Cは、それぞれ、図24Aのライン24B-24Bおよびライン24C-24C
を含む。マスキング装置は200μmの空間及び200μmのバリアーを含み、5つの四
量体の各々をアレイグリッドG上の異なった位置の固体支持体に結合させること
が可能となる。第1の四量体セットの添加後、マスキング装置もしくは表面を90
°回転し、第2の5つの四量体セットを添加する。この手順で合計6サイクル繰り
返すことによって、単一24merを含む空間的に分離した25の四角形、および共通
の12merを含む残りの四角形を生成する。シリコンもしくはガラス表面は、緊密
なシールを確実にするために、10μmの隆起Rを含み、チェンバー2内を陰圧にす
るためにチェンバー4を真空を用いて開始する方法によって満たす。この真空は
、減圧ライン12へのバルブ8を開口することによって得られる。緊密シールを形
成するためにマルチチェンバー装置をメンブレンもしくは活性化した固体表面に
押しつける。1つのチェンバーが隣のチェンバーと相互汚染することを避けるた
めに、バリアーをゴムもしくはその他の材料に被覆する。メンブレンもしくは支
持体表面が溶解剤によって適切に濡らされていることを確かめることも必要であ
る。減圧ライン12へのバルブ8を閉じ、次に表面の活性化を行い、脱保護し、開
口バルブ6でライン10を通じて四量体をチェンバー4に加える。チェンバーを乾か
し、メンブレンを90°回転し、再び固定する。四量体の第2ラウンドでは、上記
の真空および四量体添加段階で、添加を行う。バルブのブロック組立物（図25A
〜C）により、適当な行に各々の四量体を送達する。または、円筒形のマニホル
ド（図26A〜D）では、5つの行（または、列）への送達の前に、6つの四量体の円
形状交換を可能にする。この設計で常に少なくとも如何なるオリゴヌクレオチド
も存在しない領域で互いに隔てられた単一の24merが生成する。
【０１７２】 図25A〜Cには、共通のチェンバー18によって6つの入力ポート10が5つの出力ポ
ート16とライゲーションしているバルブブロック組立物14を示す。6つの入力ポ
ート10および5つの出力ポート16の各々は、それぞれ、液体の流れを制御するバ
ルブ6およびバルブ20を含む。6つの入力チューブ10は異なる溶液を含み、バルブ
のブロック組立物14は、一回につき5つの出力ポート16の一つへの入力液体のい
ずれか1つの送液が可能である。入力ポート10の1つのバルブ6および出力ポート1
6のバルブ20の1つを同時に開口し、チェンバー18を液体で満たし、開口バルブ20
にライゲーションした出力ポート16に排出させることのよって、これを達成する
ことができる。バルブブロック組立物14は、バルブ24および8によって、それぞ
れ、溶媒22のソースおよび真空12のソースにライゲーションし、送液間において
中心チェンバー18のクリーニングを行う。溶媒をチェンバー18に満たし、真空を
用いて、全液体をチェンバーから除去する。これによって、次の送液段階で液体
の相互汚染を防ぐようにチェンバー18を準備する。
【０１７３】 図26A〜Dには、入力液体の異なる6本のチューブを異なる5本の出力チューブに
送る円筒形のマニホルド組立物114を示す。マニホルドそれ自体は、それぞれの
半分がそれを軸に独立に回転する共通の中心スポーク134でつながった分離した2
つの半分114Aと114Bを含む。下部の114Bは、それを穿孔する6つのチャネル130を
有する円筒形ブロックである（図26Bのライン26C-26Cを含む図26Bの下面図であ
る図26Cを参照のこと）。6つのチャネル130の各々は、6つの異なる入力チューブ
110に結合している。入力チューブ110は、バルブ124を有するバルブ108および溶
媒ライン122を有する減圧ライン112に至るバルブ136を有するライン138を通じて
試薬、溶媒、もしくは真空のいずれかに至る入力チャネル130にライゲーション
したバルブ106を含む。これにより、異なる液体がマニホルドのチャネル130およ
び132に入り、送液間で過剰液体を含むチャネル130および132を洗浄することが
可能となる。マニホルド上部（図26Bのライン26A-26Aを含む図26Bの上面図であ
る図26Aを参照のこと）も、それを穿孔する5つのチャネル132を有する円筒形の
ブロックである。5つのチャネル132は、各々異なる出力チューブ116にライゲー
ションする。マニホルドの2つの半分114Aと114Bは独立に回転することができ、
異なる入力チャネル130は、異なる出力チャネル132へとライゲーションする。こ
れにより、入力液体の6つのチューブが同時に、5つの出力チューブへと移送する
ことを可能にする。各々の入力ポート110を出力ポート116と並列させるために、
マニホルドの下部半分の114Bは、60°回転する。このようにして、各々入力ポー
ト110を出力ポート116のいずれかと並列させることができる。図26A〜Dの円形の
マニホルドは、入力ポートを出力ポートに接続する5つのチャネルを有している
ので、前者が同時に6つの入力液体のうちの5つを5つの出力ポートへ送液可能で
あることにおいて、図26A〜Cのバルブブロック組立物とは異なる。この概念は、
36の四量体を同時に36の位置へ送達することに、容易に拡張できる。
【０１７４】 本発明は、先行技術のシステムに比べ数々の利点を含む。
【０１７５】 本発明のDNAアレイを含む固体支持体によって、ライゲーション産物の配列を
アレイ上の特異的位置にハイブリダイゼーションさせることによって配列を検出
し、従って捕獲された標識が発するシグナルの位置は配列の存在を示す。特異的
多重LDR産物のハイスループット検出のために、位置特定可能なアレイに特異的
な部位は、固体支持体上の設計したアドレスに各々のLDR産物を導く。他のDNAチ
ップアプローチでは、溶液対表面のハイブリダイゼーションにおける、融解温度
の微妙な差で密接に関連した配列の識別を試みるが、本発明では、溶液をベース
としたLDR反応におけるハイブリダイゼーション前に、所望の特異性を達成する
。従って、本発明では、互いに非常に異なる配列を有する捕獲オリゴヌクレオチ
ドのアレイの設計を可能にする。各々のLDR産物は単一の位置特定可能なアレイ
に特異的な部位を有し、これは固体支持体上の特異的アドレスで捕獲オリゴヌク
レオチドに選択的に捕獲される。固体支持体上の相補的捕獲オリゴヌクレオチド
が修飾DNAもしくはPNAのいずれかであれば、LDR産物はより高い温度でも捕獲す
ることができる。このことはハイブリダイゼーション時間が短縮するおよび非特
異的結合が減少する等付加的な利点を与える。その結果、シグナル対雑音比が改
善される。
【０１７６】 本発明の別の利点は、緊密なクラスターを成す変異、単一塩基の変化、および
短い反複ならびに欠失の検出がPCR/LDRによって可能なことである。これらは、
対立遺伝子特異的PCRもしくはハイブリダイゼーションによる検出法では不可能
である。
【０１７７】 本発明に従えば、DNA合成の誤差による偽ハイブリダイゼーションシグナルを
避けることができる。不正確なアドレスに対するハイブリダイゼーションTm値と
大きく異なるように、アドレスを設計することができる。対照的に、直接ハイブ
リダイゼーションのアプローチは微妙な差に依存する。本発明では、DNA合成の
誤り、バンドの広がり、もしくは偽のバンド易動度のいずれかにより生じるゲル
電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動の誤ったデータの解釈の問題をも排除す
る。
【０１７８】 ライゲーション産物の存在を検出するための捕獲オリゴヌクレオチドの使用に
より、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いたオリゴヌクレオチド
における単一塩基の違いを検出する必要性を排除する。対立遺伝子特異的PCR、
ディファレンシャルハイブリダイゼーションもしくはシークエンシング・バイ・
ハイブリダイゼーション法等に基づく当先行技術分野における他の既存の方法で
は、新しく解析する配列の各々に対し個々に最適化されたハイブリダイゼーショ
ン条件が必要となる。複数の変異を同時に検出しようとするときには、ハイブリ
ダイゼーション条件の最適化は困難もしくは不可能となる。対照的に、本発明は
、標的配列に非依存性で特異性の高い正しいシグナルの検出、および均一なハイ
ブリダイゼーション条件下での一般的な方法である。本発明は、異なるオリゴ塩
基配列間における差を識別し、当先行技術分野の範囲内で現在利用可能な方法に
よるよりも有意に忠実性の高い柔軟な方法を与える。
【０１７９】 本発明のアレイは普遍的であり、癌の変異、遺伝性の（生殖系列）変異、およ
びおよび感染性疾患の検出に有用である。さらに、利点としてはアレイの再使用
を可能にし、試料当たりのコスト削減が可能なことである。
【０１８０】 本発明は、また、オリゴヌクレオチドの合成および支持体への付加において柔
軟性が高い。オリゴヌクレオチドは、支持体で合成し、次に支持体上の単一表面
に結合できる。中間体の骨格保護（例えば、PNA）を必要としないオリゴヌクレ
オチドの多量体セグメントを合成し、固体支持体上に結合する。他の利点は、こ
れらの合成アプローチを捕獲オリゴヌクレオチドのアドレスの設計に組みこめる
ことである。このような固体支持体の生産は、自動生産が可能であり、人間の関
与の必要性およびその結果おこる汚染等を回避するこができる。
【０１８１】 本発明のアレイの重要な利点は、以前に結合した捕獲オリゴヌクレオチドのま
まで再使用可能なことである。このように再使用できるように固体支持体を調製
するためには、固体支持体に捕獲されたオリゴヌクレオチドにライゲーションし
た結合成分を除去することなしに捕獲されたオリゴヌクレオチドを除去する必要
がある。この課題を達成するために、多様な方法を用いることができる。例えば
、固体支持体を95〜100℃で蒸留水中で処理する、室温で0.01NNaOHに曝す、90〜
95℃で50％ジメチルホルムアミドと接触させる、もしくは90〜95℃で50％ホルム
アミドにより処理することができる。通常、この方法を用い、約5分以内に捕獲
されたオリゴヌクレオチド除去できる。これらの条件は、DNA-DNAハイブリダイ
ゼーションを破壊するのに適切なものである。DNA-PNAハイブリダイゼーション
では他の破壊条件が必要となる。
【０１８２】 以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例にのみ限定されるも
のではない。
【０１８３】 実施例実施例１ -捕獲オリゴヌクレオチドの固体支持体への固定化 固定化のための固体支持体は、ガラス、特に顕微鏡スライドであった。空間的
位置特定可能なアレイにおける、ガラス（例えば、顕微鏡スライド）、又はシリ
コン（例えば、チップ）、メンブレン（例えば、ナイロン・メンブレン）、ビー
ズ（例えば、常磁性ビーズもしくはアガロース・ビーズ）、もしくはプラスチッ
ク支持体（例えば、ポリエチレン・シート）のようなその他の支持体への捕獲オ
リゴヌクレオチドの固定化は、5つの段階からなる。
【０１８４】 A.支持体のシラン化 シラン化試薬は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（「APTS」）であった
。又は、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（K.L.Beattieら,「ゲノセ
ンサー研究の進歩（Advances in Genosensor Research）」,Clin.Chem.,41:700-
706(1995); U.Maskosら,「ガラス支持体におけるオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーション：オリゴヌクレオチド合成のための新規なリンカー及びインサイチ
ューで合成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（Oligonuc
leotide Hybridizaions on Glass Supports:a Novel Linker for Oligonucleoti
de Synthesis and Hybridization Properties of Oligonucleotides Synthesize
d in situ）」,Nucleic Acids Res.,20:1679-1684(1992); C.F.Mandeniusら,「
偏光解析法及びその他の関連技術において使用するための生物学的分子のシリコ
ン表面へのカップリング（Coupling of Biomolecules to Silicon Surfaces for
Use in Ellipsometry and Other Related Techniques）」,Methods Enzymol.,3
88-394頁(1988)（参照として本明細書に組み込まれる））又は3-（トリメトキシ
シリル）プロピルメタクリレート（M.Gladら,「ポリシロキサンでコーティング
された多孔性シリカにおける分子インプリンティング及び酵素捕獲のためのシラ
ンモノマーの使用（Use of Silane Monomers for Molecular Imprinting and En
zyme Entrapment in Polysiloxane-coated Porous Silica）」,J.Chromatogr.34
7:11-23(1985); E.Hedborgら,「電解効果装置と組み合わされた分子プリンティ
ングされたポリマー・メンブレンの研究（Some Studies of Molecularly-imprin
ted Polymer Membranes in Combination with Field-effect Devices）」,Senso
rs and Actuators A 37-38:796-799(1993);及びM.Kempeら,「酵素リボヌクレア
ーゼAを使用した表面インプリンティング法（An Approach Towards Surface Imp
rinting Using the Enzyme Ribonuclease A）」,J.Mol.Recogn.8:35-39(1995)
（参照として本明細書に組み込まれる））も、初期シラン化試薬として使用され
うる。シラン化の前に、支持体を清浄化し、支持体の表面を疎水性にした。ガラ
ススライド（Fisher Scientific,Extra thick microslides,frosted cat.#12-55
0-11）を、濃NH4OH水-H2O2-H2O（1：1：5、v/v/v）中で80℃で5分間インキュベ
ートし、蒸留水で濯いだ。次いで、文献に記載されたようにして（C.F.Mandeniu
sら,「 偏光解析法及びその他の関連技術において使用するための生物学的分子
のシリコン表面へのカップリング（Coupling of Biomolecules to Silicon Surf
aces for Use in Ellipsometry and Other Related Techniques）」,Methods En
zymol.,388-394頁(1988); Grahamら,「ファイバー・オプティック・エバネッセ
ント波バイオセンサーにおける遺伝子プローブ・アッセイ（Gene Probe Assay o
n a Fibre-Optic Evanescent Wave Biosensor）」,Biosensors & Bioelectronic
s,7:487-493(1992); Jonssonら,「よく特徴決定されたシリカ表面におけるフィ
ブロネクチンの吸収挙動（Adsorption Behavior of Fibronectin on Well Chara
cterized Silica Surfaces）」,J.Colloid Interface Sci.,90:148-163(1982)
（参照として本明細書に組み込まれる））、支持体を蒸留水、エタノール、及び
アセトンで洗浄した。2％（v/v）3-アミノプロピルトリエトキシシラン（Sigma,
St.Louis,MO）を含む無水アセトン（99.7％）溶液中で、室温で、一夜、支持体
をシラン化した（Z.Guoら,「ガラス支持体上のオリゴヌクレオチドアレイとのハ
イブリダイゼーションによる遺伝子多型の直接蛍光分析（Direct Fluorescence
Analysis of Genetic Polymorphisms by Hybridization with Oligonucleotide
Arrays on Glass Supports）」,Nucl.Acids Res.,22:5456-65(1994) （参照とし
て本明細書に組み込まれる））。次いで、支持体を無水アセトンで十分に洗浄し
、真空デシケーターで80℃で乾燥させた。
【０１８５】 B.官能基（例えば、カルボキシル基又はアミノ基）によるシラン化固体支持体の
誘導体化 シラン化試薬がAPTSである場合には、所望のアミノ官能性が直接導入された。
官能基（例えば、重合可能アクリレートで表面を官能化するための3-（トリメト
キシシリル）プロピルメタクリレート（M.Gladら,「 ポリシロキサンでコーティ
ングされた多孔性シリカにおける分子インプリンティング及び酵素捕獲のための
シランモノマーの使用（Use of Silane Monomers Imprinting and Enzyme Entra
pment in Polysiloxane-coated Porous Silica）」,J.Chromatogr.347:11-23(19
85); E.Hedborgら,「 電解効果装置と組み合わされた分子プリンティングされた
ポリマー・メンブレンの研究（Some Studies of Molecularly-imprinted Polyme
r Membranes in Combination with Field-effect Devices）」,Sensors and Act
uators A 37-38:796-799(1993);及びM.Kempeら,「 酵素リボヌクレアーゼAを使
用した表面インプリンティング法（An Approach Towards Surface Imprinting U
sing the Enzyme Ribonuclease A）」,J.Mol.Recogn.8:35-39(1995)（参照とし
て本明細書に組み込まれる）））を既に含有している適当なシラン化試薬プライ
マーを選択することにより、又はアミノ官能表面を所望の官能基を含有している
試薬と反応させることにより（例えば、写真石版術において使用される保護され
たアミノ基の局所的な光による光脱保護（Fodorら,「光による空間的位置特定可
能なパラレル化学合成（Light-Directed,Spatially Addressable Parallel Chem
ical Synthesis）」,Science,251:767-773(1991); Fodorら,「生物学的チップを
用いた複合生化学的アッセイ（Multiplexed Biochemical Assays with Biologic
al Chips）」,Nature,364:555-556(1993)（参照として本明細書に組み込まれる
）の後）、その他の官能基を導入することもできる。
【０１８６】 C.官能基の活性化 固体支持体上の官能基はアミノ基であった。直径1mm、 3.25mm間隔のドットの
5×5アレイを有する組立て式マスクを使用して、1〜2％トリエチルアミン（生成
する酸を除去するため）を補足された、70mg/mlアジピン酸ジスクシニミジルエ
ステル（Hillら,「タンパク質の二官能クロスリンキング試薬としてのジスクシ
ニミジルエステル（Disuccinimidyl Esters as Bifunctional Crosslinking Rea
gents for Proteins）」,FEBS Lett,102:282-286(1979); Hortonら,「Covalent
Immobilization of Proteins by Techniques which Permit Subsequent Release
」,Methods Enzymol.,130-141(1987)頁（参照として本明細書に組み込まれる）
）を含有する無水ジメチルホルムアミド（「DMF」）溶液を、少量（典型的には0
.2〜1.0μl）、ギルソン（Gilson）P-10ピペットを使用して手動で固体支持体に
適用した。適用後、フード内で、室温で、30分間、反応を進行させ、その後、再
びアジピン酸ジスクシニミジルエステルを適用した。計1時間の反応時間の後、
支持体を無水DMFで洗浄し、真空デシケーター内で室温で乾燥させた。
【０１８７】 官能基がカルボキシル基である場合には、固体支持体を1-エチル-3-（3-ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（「EDC」）と反応させることができ
る（Frankら,「分節固体支持体としてのセルロースペーパーディスク上での連続
流動条件下での同時複合ペプチド合成（Simultaneous Multiple Peptide Synthe
sis Under Continuous Flow Conditions on Cellulose Paper Discs as Segment
al Solid Support」,Tetrahedron,44:6031-6040(1988) （参照として本明細書に
組み込まれる））。この反応の前に、0.1N HClで簡単に処理することにより、固
体支持体の表面をプロトン化した。前記の組立て式マスクを使用して、1M EDC（
Sigma,St.Louis,MO）、1mM 5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及び20mM KH2PO4 （pH＝8.3）を含有する新鮮な溶液を、少量（典型的には0.2〜1.0μl）、手動で
固体支持体に適用した。反応を1時間進行させ、その後、支持体を蒸留水で洗浄
し、真空デシケーター内で室温で乾燥させた。
【０１８８】 D.予め活性化された固体支持体へのアミノ官能化捕獲オリゴヌクレオチドのカッ
プリング EDCで活性化された固体支持体以外の支持体の場合には、やはり前記の組立て
式マスクを使用して、1nmol/μlの5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド（即ち、表2
の配列）を含む20mM KH2PO4（pH8.3）を、少量（0.2〜1.0μl）、活性化された
支持体へ適用した。反応を室温で1時間進行させた。
【０１８９】 E.固体支持体上の残存反応基の不活性化 反応生成物が、非捕獲プローブ依存的に固体支持体上に非特異的に捕獲される
のを防止するため、相補的オリゴヌクレオチドプローブの捕獲後、固体支持体の
表面上の残存反応基を不活性化させることが必要である場合がある。この点に関
して、支持体を、0.1N水酸化ナトリウム中で、室温で、5分間インキュベートし
た。又は、0.2Mリジン（pH＝9.0）中で不活性化を実施することもできる。不活
性化後、支持体表面を中和するため、0.1Nリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）で
支持体を洗浄した。蒸留水での最後の洗浄後、支持体を乾燥させ、真空デシケー
ター内で室温で保存した。
【０１９０】実施例2 -アッセイシステムの設計 GeneAmp In Situ PCR System 1000（登録商標）（Perkin Elmer,Applied Bios
ystems Division,Foster City,CA）（G.J.Nuovo,PCR in situ Hybridizaiton,Ne
w York:Raven Press(第2版、1994年)（参照として本明細書に組み込まれる））
を使用して、ハイスループット式に、ハイブリダイゼーションを試験し、続いて
捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブ捕獲オリゴヌクレオチドハイブリッドを
洗浄するための、半自動カスタム設計アッセイシステムを作成した。システムの
概略フローチャートが、図27に示されている。システムは、試料担荷装置及び多
重ポートシステムを介して、一連の液体槽、そして廃液槽と接続されたフロース
ルー・ハイブリダイゼーションチャンバーからなっている。液体輸送は、ポンプ
により調節される。ポンプを、組立てラインの末端に設置し、システムの漏出及
び汚染を防止するための軽度の真空を維持する条件下で作動させた。ハイブリダ
イゼーションチャンバー及び液体槽は、GeneAmp In Situ PCR System 1000（登
録商標）内で正確に調和するよう設計されていたため、アッセイのハイブリダイ
ゼーション段階及び洗浄段階の間、温度は正確に調節され維持され得た。
【０１９１】 システムの個々の部分を、以下のセクションにおいて詳細に説明する。
【０１９２】 A.ハイブリダイゼーションチャンバー ハイブリダイゼーションチャンバーは、フロースルーの特徴に順応するよう修
飾されたインサイチューPCR試薬収納システムである。収納システムは、ガラス
顕微鏡スライド（76×25×1.2±0.02mm）と、薄いステンレス・スチール・クリ
ップによりスライドに取り付けられたシリコン・ゴム隔壁とから構成されている
。金属クリップの内側の卵形の縁は、ハイブリダイゼーション・プローブ及び洗
浄液の収納を保証する、水及び気体が通過しない封を作出するために十分な力で
、シリコン・ディスクの端を、スライドに押し付ける。包含量は、およそ50μl
である。固定化された捕獲オリゴヌクレオチドのアッセイは、シリコン・ディス
クにより覆われたスライドの中央部分（およそ13mm×15mm）に含まれる。異なる
部材の組立ては、In Situ PCR Systemの製造業者より提供される組立てツールに
より容易となる。組立て後、12"のチューブ及び多重試料ルアー・アダプター（m
ultiple sample luer adapter）を有する2つの25G3/4注射針（Becton Dickinson
,Rutherford,NJ）の挿入により、ハイブリダイゼーションチャンバーの入口及び
出口を作出する。プローブ-標的ハイブリッドの洗浄中の上方側方（up-and-acro
ss）流動パターンを保証するため、斜めに注射針を挿入する。
【０１９３】 B.液体槽 異なる洗浄溶液を収納する槽は、GeneAmp In Situ PCR System 1000（登録商
標）のサーマル・ブロック（thermal block）の垂直溝と調和するよう、カスタ
ム設計された。各槽は、シリコン・シーラント（Dow Corning,Midland,MI）を使
用して相互に接着させた、組立て式シリコン・ガスケット（Nunc,Inc.,Napiervi
lle,IL）を収納する2つのガラス顕微鏡チャンバー・スライド（25×75×1mm）か
らなっている。12"長のチューブ及び多重試料ルアー・アダプターを有する21G3/
4"注射針（Becton Dickinson,Rutherford,NJ）のシリコン・ガスケットへの挿入
により、出口を作出した。空気入口を作出するため、チューブを有しない第2の2
1G3/4"注射針（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）を、シリコン・ガスケッ
トへ挿入した。液体槽は、漏出不可であり、サーマル・ブロックの溝内に正確に
調和しており、含まれた液体への良好な熱伝達を保証するため金属フィンに取り
付けられている。各槽の容量は、およそ2mlである。
【０１９４】 C.マルチポートシステム及び試料担荷装置 液体槽、試料担荷装置、及びハイブリダイゼーションチャンバーは、手動で調
節される一方向の液体の流動を可能にするマルチポートシステムを通って接続さ
れている。システムは、雄雌接続により相互に接続された、ルアー・アダプター
を有する一連の3方向ナイロン・ストップコック（Kontes Scientific Glassware
/Instruments,Vineland,NJ）からなっている。液体槽からの雌ルアー・アダプタ
ーは、雄雄ルアー・アダプター・カップラー（Biorad,Richmond,CA）を介してマ
ルチポート雌ルアー・アダプターと接続されている。試料担荷装置は、液体槽と
接続されたポートと、ハイブリダイゼーションチャンバーと接続されたポートと
の間に設置されている。それは、ルアー・アダプターを介してマルチポートシス
テムと直接接続された1mlシリンジ（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）か
らなる。液体の流動は、所望の方向にストップコック上のハンドルを回すことに
より手動で調節されうる。
【０１９５】 D.廃液槽 ハイブリダイゼーションチャンバーからの出口チューブは、プランジャーが固
定された位置に取り付けられている、ルアー・アダプターを有する20mlシリンジ
（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）からなる廃液槽と接続されている。ポ
ンプとの接続は、12"長のチューブ及び多重試料ルアー・アダプターを有する21G
3/4"注射針の、プランジャーのシリコン・ガスケットへの挿入により、確立され
ている。ポンプを作動させると、シリンジ内にわずかな真空が生じ、それが、液
体槽から、ハイブリダイゼーションチャンバーを経由して、廃液槽へと液体を流
動させる。
【０１９６】 E.ポンプ システムにおける液体の流動を調節するため、蠕動ポンプP-1（Pharmacia,Pis
cataway,NJ）を使用した。それは、システム内のわずかな真空を維持するため、
組立てラインの末端に設置された。ポンプの入口チューブは、3方向ナイロン・
ストップコックを介して、廃液槽の出口チューブと接続されていた。この構造に
より、重力による排液を可能とする、廃液槽内の真空の放出が確立される。
【０１９７】実施例3 -ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件 異なる捕獲オリゴヌクレオチドの捕獲特異性を調査するため、6テトラマーの
うちの3個（即ち、24ヌクレオチドのうちの12個）を共有する2つの捕獲オリゴヌ
クレオチドプローブを使用して、ハイブリダイゼーション実験を実施した。この
実験は、異なる捕獲オリゴヌクレオチドを区別することが最も困難な例を表して
いる。一般的に、位置特定可能なアレイ上の異なる増幅産物を分離するためには
、より少ないテトラマーを共有する他の捕獲オリゴヌクレオチドが選択されるで
あろう。
【０１９８】 典型的には、文献記載の常法をわずかに修飾した方法に従い、それぞれ10pmol
のオリゴヌクレオチドcomp12及びcomp14（表3参照）を、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（New England Biolabs,Beverly,MA）10単位、［γ-32P］ATP 2.22MBq、5
0mMトリス-HCl（pH8）、10mM MgCl2、1mM EDTA、及び10mMジチオトレイトールを
収納する20μlの容量で、5'末端標識した。超微細DNA等級セファデックス（Seph
adex）G-25（Pharmacia,Piscataway,NJ）を収納するカラムでの濾過により、取
り込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。セファデックスは、10mM酢酸
アンモニウム中で4℃で一夜、予め膨張させた。標識されたオリゴヌクレオチド
プローブを真空で乾燥させ、ハイブリダイゼーション溶液（0.5M Na2HPO4[pH7.2
]、1％結晶等級BSA、1mM EDTA、7％SDS）に溶解させた。標識されたオリゴヌク
レオチドプローブcomp12及びcomp14の比活性は、それぞれ、2.86×106cpm/pmol
及び2.43×106cpm/pmolであった。
【０１９９】
【表３】 使用されたオリゴヌクレオチド（5'から3'）
【０２００】 前セクションに記載されたようにして、アミノリンク捕獲オリゴヌクレオチド
12及び14（表3参照）400ピコモルを、カルボキシル官能化ガラス顕微鏡スライド
及びアミノ官能化ガラス顕微鏡スライドの両方に沈積させ、反応させた。相補的
オリゴヌクレオチドプローブcomp12とのハイブリダイゼーションにより、左上及
び右下の斜めの位置について陽性のシグナルが生じ、相補的オリゴヌクレオチド
プローブcomp14とのハイブリダイゼーションにより、左下及び右上の斜めの位置
について陽性のシグナルが生じるよう、2×2マトリックスアレイで捕獲オリゴヌ
クレオチドを固定化した。
【０２０１】 放射標識オリゴヌクレオチドプローブcomp12及びcomp14（表3参照）を、それ
ぞれ2.5pmol/100μl及び4.1 pmol/100μlの濃度でハイブリダイゼーション溶液
に溶解させた。ハイブリダイゼーション溶液は、アッセイシステム内輸送中のプ
ローブの視覚的モニタリングを容易とする、2％ブロモフェノールブルー・マー
カー5μlを補足されていた。次いで、放射標識プローブ100マイクロリットルを
注入し、ハイブリダイゼーションチャンバーへとポンプで送った。ハイブリダイ
ゼーションを70℃で15分間実施した。
【０２０２】 ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーを、低ストリ
ンジェンシー洗浄緩衝液（2×SSC緩衝液は300mM塩化ナトリウム及び30mMクエン
酸ナトリウムを収納する）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（「SDS」））2mlで2
回、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（0.2×SSC、0.1％SDS）（1×SSC緩衝液は
150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含有する）2mlで2回、70℃
で連続的に洗浄した。
【０２０３】実施例4 -捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブの検出 洗浄後、捕獲オリゴヌクレオチド-オリゴヌクレオチドプローブ・ハイブリッ
ド、シリコン・ディスク、注射針、及び金属カバー・クリップを、ガラス顕微鏡
スライドから除去し、残存している液体をキムワイプ（Kimberly-Clark,Roswell
,GA）を使用して吸収した。ホスフォールイメージャー（phosphorimager）（Mol
ecular Dynamics,Sunnyvale,CA）を使用して、捕獲されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを可視化し定量した。ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャー
・スクリーンに21時間曝露した後、試験された異なる固体支持体についてのデー
タを収集した。得られた画像を図28に示す。定量データは、表4A及び4Bに示す。
【０２０４】 使用された条件下においては、NH2官能化スライドについて得られたシグナル
及び交差反応性データの方が、COOH官能化スライドについて得られたものよりも
優れていた。
【０２０５】
【表４Ａ】 捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブ12の定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２０６】
【表４Ｂ】 捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブ14の定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２０７】実施例5 -捕獲オリゴヌクレオチドの固定化パラメータの最適化 文献記載の方法に従い、ポリマーをスライド上に沈積させた（Barnardら,「不
連続の感知部位を有するファイバーオプティック・センサー（A Fibre-Optic Se
nsor With Discrete Sensing Sites）」,Nature 353:338-40(1991); Bonkら,「
ポリマーでコーティングされたイメージング・オプティカル・ファイバー・バン
ドル上のアリルアジドによるパターン化センサー・アレイの組立て（Fabricatio
n of Patterned Sensor Arrays With Aryl Azides on a Polymer-coated Imagin
g Optical Fiber Bundle）」,Anal.Chem.66:3319-20(1994); Smithら,「ポリ-N-
アクリルピロリドン-ペプチド化学における新規な樹脂（Poly-N-acrylpyrrolido
ne-A New Resin in Peptide Chemistry）」,Int.J.Peptide Protein Res,13:109
-12(1979)（参照として本明細書に組み込まれる））。
【０２０８】 アミノリンク捕獲オリゴヌクレオチド12及び14（表3参照）400ピコモルを、4
つの同一の光沈積ポリマー・スポットを収納するガラス顕微鏡スライドに2×2パ
ターンで沈積させ、反応させた。相補的オリゴヌクレオチドプローブcomp12との
ハイブリダイゼーションにより、上及び下の位置について陽性のシグナルが生じ
、相補的オリゴヌクレオチドプローブcomp14とのハイブリダイゼーションにより
、左及び右の位置について陽性のシグナルが生じるよう、オリゴヌクレオチドを
スポットした。
【０２０９】 放射標識オリゴヌクレオチドプローブcomp12（表3参照）を、2.4 pmol/100μl
の濃度でハイブリダイゼーション溶液に溶解させた。アッセイシステム内輸送中
のプローブのモニタリングを容易にするため、ブロモフェノールブルー・マーカ
ー（2％溶液5μl）をハイブリダイゼーション溶液に添加した。
【０２１０】 放射標識プローブcomp12 100マイクロリットルを、ハイブリダイゼーションチ
ャンバーへとポンプで送った。ハイブリダイゼーションを70℃で15分間実施した
。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーを、低ストリ
ンジェンシー洗浄緩衝液（2×SSC、0.1％SDS）1mlで3回、高ストリンジェンシー
洗浄緩衝液（0.2×SSC、0.1％SDS）1mlで3回、70℃で連続的に洗浄した。
【０２１１】 ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャー・スクリーンに24時間曝露
した後、試験された全ての異なる固体支持体についてのデータを収集した。得ら
れた画像を図29に示す。定量データを、表5に示す。
【０２１２】
【表５】 捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブの定量 EFDMA＝エチレングリコールジメタクリレート HDDMA＝ヘキサンジオールジメタクリレート＊ pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２１３】 固定化化学は、効率的な核酸増幅産物の捕獲にとって必要な適当な物理的特性
を提供する、テーラーメイドの特別ポリマー・マトリックスの使用を可能にする
。固定化された捕獲オリゴヌクレオチドの特異性は、ディファレンシャル・ハイ
ブリダイゼーションにより単一の誤対合、欠失、及び挿入を区別する現行の方法
（K.L.Beattieら「ゲノセンサー研究の進歩（Advances in Genosensor Research
）」,Clin.Chem.41:700-06(1995)（参照として本明細書に組み込まれる））と比
較して良好であった。最後に、本発明のアッセイシステムが、核酸オリゴマーの
普遍的な同定を可能にすることが証明された。
【０２１４】実施例6 -位置特定可能なオリゴヌクレオチドプローブの固体支持体への捕獲 異なる捕獲オリゴヌクレオチド固定化法の後、ポリマーでコーティングされた
スライドを、位置特定可能なオリゴヌクレオチドプローブの捕獲能について試験
した。次いで、3-（トリメチルオキシシリル）プロプルメタクリレートによるシ
ラン化の後、モノマーをスライド上で重合させた。1つの例においては、ポリエ
チレングリコール含有クロスリンカーを用いて、COOH官能基を有するポリマー層
を形成させた。もう一つの例においては、OH官能基を形成させるため、ポリエチ
レングリコール-メタクリレート・モノマーを、スライドへと重合させた。COOH
官能基を有するスライドを、実施例1のEDC活性化法を使用して活性化した。
【０２１５】 OH官能基を有するスライドは、0.2M 1,1'-カルボニルジイミダゾール（「CDI
」）（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.）を含む「低水（low water）」アセト
ン（J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.）を含有する密閉された50mlプラスチック・
ディスポーザブル・チューブ（Corning Inc.,Corning,N.Y.）内でのインキュベ
ーションにより、室温で一夜活性化した。次いで、「低水」アセトンでスライド
を洗浄し、室温で真空で乾燥させた。
【０２１６】 アミノリンク捕獲オリゴヌクレオチド14を、両スライド上の予め印を付けた位
置に手動でスポットした（1スライド当たり4ドット）。反応はフード内で実施さ
れ、スポットされたオリゴヌクレオチドの量は2×0.2μl（0.8nmol/μl）であっ
た。全反応時間は1時間であった。次いで、予め印を付けた各ドットにプロピル
アミンを数滴適用することにより、15分間、スライドを不活性化した。不活性化
後、スライドを0.1Nリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中で5分間インキュベート
し、二重蒸留H2Oで洗浄し、真空で乾燥させた。
【０２１７】 スライド上の相補的捕獲オリゴヌクレオチドを、放射標識オリゴヌクレオチド
プローブcomp14（表3）とハイブリダイズさせた。放射標識オリゴヌクレオチド
プローブcomp14 100マイクロリットル（2.8pmol；6,440,000cpm/pmol）を、ハイ
ブリダイゼーションチャンバーにポンプで送った。ハイブリダイゼーションを、
0.5M Na2HPO4[pH7.2]、1％結晶等級BSA、1mM EDTA、7％SDS中で、70℃で15分間
実施した。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーを、
低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（2×SSC、0.1％SDS）2mlで2回、高ストリンジ
ェンシー洗浄緩衝液（0.2×SSC、0.1％SDS）2mlで2回、70℃で連続的に洗浄した
（1×SSC緩衝液は150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含有する
）。
【０２１８】 ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャー・スクリーンに30分間曝露
した後、両スライドについてのデータを収集した。ガラス顕微鏡スライドをホス
フォールイメージャー・スクリーンに30分間曝露した後、データを収集した。表
6及び図30を参照のこと。
【０２１９】
【表６】 OH官能化スライドにおける捕獲オリゴヌクレオチドプローブ14の定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２２０】 この試験において、OH官能基を含有するポリマーでコーティングされたスライ
ドの方が、COOH官能基を含有するポリマーでコーティングされたスライドよりも
良好な結果が得られた。
【０２２１】 20％アミン含有モノマーで重合され、4％EGDMA又はHDDMAでクロスリンクされ
た予め調製された（ポリHEMA）含有ポリマーでは、放射標識ライゲーション産物
配列（ホスフォールイメージャー・スクリーンに23時間曝露した後にのみ可視化
された（表5））約275amolを捕獲することが可能であった。ポリエチレンメタク
リレートポリマー製剤を使用すると、ライゲーション産物配列10.6fmolを捕獲す
ることが可能であった。シグナルは、30分間の曝露の後に検出され得た。
【０２２２】実施例7 -メンブレン支持体を使用して捕獲されたオリゴヌクレオチドの検出 メンブレン支持体を使用した異なる捕獲オリゴヌクレオチドの捕獲特異性を調
査するため、捕獲オリゴヌクレオチドプローブ12及び14（表3参照）を使用して
ハイブリダイゼーション実験を実施した。
【０２２３】 OH官能化ナイロン・メンブレンの細片（Millipore,Bedford,Massachusetts）
を、0.2Mカルボニルジイミダゾールを含む「低水」アセトン溶液に一夜浸した。
細片をアセトンで洗浄し、真空で乾燥させた。2つの容量の0.2μl（1mM）の捕獲
オリゴヌクレオチド12及び14を含む20mM K2HPO4（pH8.3）（表3）を、特別ブロ
ッティング装置（Immunetics,Cambridge,Massachusetts）を使用してメンブレン
に担荷した。相補的オリゴヌクレオチドプローブを、実施例3の記載のようにし
て放射性標識した。オリゴヌクレオチドプローブを真空で乾燥させ、ハイブリダ
イゼーション緩衝液（0.5M Na2HPO4[pH7.2]、1％結晶等級BSA、1mM EDTA、7％SD
S）200μlにとった。Hybaidハイブリダイゼーション・オーブン内の1.5mlエッペ
ンドルフチューブ内で、ハイブリダイゼーション緩衝液800μl中で、60℃で、15
分間、メンブレンをプレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション・コン
パートメントの総容量を減少させるため、不活性カルナウバロウ（Strahl & Pit
sch,Inc.,New York,New York）500μlをチューブに充填した。プレハイブリダイ
ゼーション後、放射標識プローブ200μlを添加した。60℃で15分間、メンブレン
をハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを、低ストリ
ンジェンシー洗浄緩衝液（2×SSC、0.1％SDS）1mlで2回15分間、高ストリンジェ
ンシー洗浄緩衝液（0.2×SSC、0.1％SDS）1mlで2回15分間、60℃で洗浄した。ホ
スフォールイメージャー（Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA）を使用して、捕
獲されたオリゴヌクレオチドプローブを定量した。ホスフォールイメージャー・
スクリーンに45分間曝露した後、データを収集した。結果を表7に示す。捕獲オ
リゴヌクレオチド12及び14の活性は、それぞれ、112pic/amol及び210pic/amolで
ある。
【０２２４】
【表７】 メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２２５】 一連の同様の実験において、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼ
ーション時間をさらに探索した。表8に示されたデータ（捕獲オリゴヌクレオチ
ド12及び14の活性は、それぞれ、251pic/amol及び268pic/amolである）は、以下
の条件で得られた結果を表している。ハイブリダイゼーション緩衝液800μl中で
65℃で15分間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション緩衝液1m
l中で65℃で15分間のハイブリダイゼーション、低ストリンジェンシー洗浄緩衝
液1mlでの65℃で5分間の2回の洗浄、及び高ストリンジェンシー洗浄緩衝液1mlで
の65℃で5分間の2回の洗浄。
【０２２６】
【表８】 メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２２７】 表9に示されたデータ（捕獲オリゴヌクレオチド12及び14の活性は、それぞれ
、487pic/amol及び506pic/amolである）は、以下の条件で得られた結果を表して
いる。ハイブリダイゼーション緩衝液150μl中で70℃で15分間のプレハイブリダ
イゼーション、ハイブリダイゼーション緩衝液200μl中で70℃で15分間のハイブ
リダイゼーション、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70℃で5分間の2
回の洗浄、及び高ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70℃で5分間の2回の
洗浄。
【０２２８】
【表９】 メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２２９】 表10に示されたデータは、以下の条件で得られた結果を表している。ハイブリ
ダイゼーション緩衝液150μl中で70℃で15分間のプレハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション緩衝液200μl中で70℃で5分間のハイブリダイゼーショ
ン、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70℃で5分間の2回の洗浄、及び
高ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70℃で5分間の2回の洗浄。
【０２３０】
【表１０】 メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２３１】 表11に示されたデータは、以下の条件で得られた結果を表している。ハイブリ
ダイゼーション緩衝液150μl中で70℃で5分間のプレハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション緩衝液200μl中で70℃で1分間のハイブリダイゼーショ
ン、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70℃で2分間の2回の洗浄、及び
高ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70℃で5分間の2回の洗浄。
【０２３２】
【表１１】 メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量 ＊pic＝相対ホスフォールイメージャーカウント
【０２３３】 これらのデータは、捕獲オリゴヌクレオチドプローブの相補配列とのハイブリ
ダイゼーションが特異的であったことを証明している。ガラススライドで実施さ
れた前実験と比較して、有意に多い量（即ち、amol量と比較してfmol量）のオリ
ゴヌクレオチドプローブが、メンブレン支持体に再現可能に捕獲された。これら
の2つの極めて密接に関連した捕獲オリゴヌクレオチドプローブについて、約1％
という平均交差反応性値が得られた。しかし、アレイ内の他の捕獲オリゴヌクレ
オチド対については、これらの値は有意に優れていたであろう。一般的に、その
ような値は、当分野において既知の既存の方法の使用、即ちアレル特異的オリゴ
ヌクレオチドハイブリダイゼーション（「ASO」）又はハイブリダイゼーション
による配列決定（「SBH」）のようなディファレンシャル・ハイブリダイゼーシ
ョン法によっては達成され得ない。
【０２３４】実施例8 -ガラス表面の洗浄 濃縮NH4OH-H2O2-H2O（1:5:5, v/v/v）水溶液中80℃で５分間グラススライド（
Fisher Scientific, Extra thick microslides, frosted cat. #12-550-11）を
保温し滅菌水で洗浄した。濃縮HCl-H2O2-H2O（1:1:5, v/v/v）水溶液中80℃で5
分間2回目の保温を行った。参照として本明細書に組み入られる、U. ジョーンソ
ン（U. Jonsson）らの「よく特徴づけられたシリカ表面上でのフィブロネクチン
の吸収挙動」コロイド界面科学雑誌（J. Colloid Interface Sci.）、第90巻：
第148-163頁（1982年）を参照せよ。スライドを滅菌水、メタノール、ならびに
アセトンでよく洗浄し、室温で風乾させた。
【０２３５】実施例9 -メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン（Methacryloyloxyp
ropyltrimethoxysilane)によるシラン化 実施例8に基づき調製した、洗浄済みスライドを2.6mlのメタクリロイルオキシ
プロピルトリメトキシシラン（Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wi
s. cat.#23,579-2）、0.26mlのトリエチルアミンおよび130mlのトルエンから構
成される溶液中室温で24?48時間保温した。参照として本明細書に組み入られる
、E. ヘッドボーグ（E. Hedborg）らのセンサーズ アクチュエーターズ A（Se nsors Actuators A ）第37-38巻：第796-799頁（1993年）を参照せよ。スライド
をアセトン、メタノール、滅菌水、再度メタノールならびに再度アセトンでよく
洗浄し、室温で風乾させた。図31を参照せよ。
【０２３６】実施例10 -ジクロロジメチルシランによるシラン化 実施例8に基づき調製した洗浄済みスライドを12mlのジクロロジメチルシラン
および120mlのトルエンを含む溶液中室温で15分間保温した。スライドをアセト
ン、メタノール、滅菌水、再度メタノール、ならびに再度アセトンでよく洗浄し
風乾させた。
【０２３７】実施例11 -メタクリル酸誘導体ガラスのポリ（エチレングリコール）メタクリレ
ートの重合 3.5mlのアセトニトリル中2.2gのポリ（エチレングリコール）メタクリル酸（A
ldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wis. cat.#40,953-7）および50mg
の2,2'-アゾビス（2-メチルプロピオニトリル）を氷上で冷却し3分間アルゴン気
流でパージ(purge)させた。次の段階をアルゴン大気下、グローブボックス中で
行った。実施例8および9に基づき調製したメタクリル酸誘導体グラススライド上
に5〜15滴の重合混合液を載せた。実施例10に基づきシラン化させておいた2枚目
のスライドグラスでメタクリル酸誘導体グラススライドならびに重合混合液を包
含し、この2枚のグラススライドを強く加圧してクリップで固定した。次にスラ
イドを減圧乾燥機に移した。重合反応を熱分解的に55℃で、または光分解的に36
6nmで開始させた。図32を参照せよ。
【０２３８】実施例12 -メタクリル酸誘導体ガラスのアクリル酸およびトリメチロールプロパ
ンエトキシレート14/3 EO/OH）トリアクリレートの重合 3.5mlのアセトニトリル中0.5gのアクリル酸（Aldrich Chemical Company, Inc
. Milwaukee, Wis. cat.#14,723-0）、1.83gのトリメチロールプロパンエトキシ
ル酸（14/3 EO/OH）トリアクリル酸（Aldrich Chemical Company, Inc. Milwauk
ee, Wis. cat.#23,579-2）、および50mgの2,2'-アゾビス（2-メチルプロピオニ
トリル）を氷上で冷却し3分間アルゴン気流でパージさせた。次の段階を実施例1
1で記載されるように、グローブボックス中で行った。次にスライドを減圧乾燥
機に移し実施例11に記載されるように重合させた。図33を参照せよ。
【０２３９】実施例13 -メタクリレート誘導体グラスのポリ（エチレングリコール）メタクリ
ル酸およびトリメチロールプロパンエトキシル酸（14/3 EO/OH）トリアクリル酸
の重合 3.5mlのアセトニトリル中0.55gのポリ（エチレングリコール）メタクリル酸（
Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wis. cat.#40,953,7）、1.64gの
トリメチロールプロパンエトキシル酸（14/3 EO/OHトリアクリレート（Aldrich
Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wis. cat.#23,579-2）、および50mgの2,2'
-アゾビス（2-メチルプロピオニトリル）を氷上で冷却し3分間アルゴン気流でパ
ージさせた。次の段階を実施例11で記載されるように、グローブボックス中で行
った。次にスライドを減圧乾燥機に移し実施例11に記載されるように重合させた
。図34を参照せよ。
【０２４０】実施例14 -材料および方法 オリゴヌクレオチド合成および精製。オリゴヌクレオチドをIDT社（Coralvill
e, IA）からの注文合成品、または標準的なホスホラミダイト化学を用いたABI39
4 DNAシンセサイザー（PE Biosystems Inc.;Foster City, CA）による自家製品
などからオリゴヌクレオチドを得た。スペーサーホスホラミダイト18、3'-アミ
ノモディファーC3 CPG、および3'-フルオレセインCPGをグレンリサーチ（Glen R
esearch）（Sterling, VA）より購入した。その他の試薬は全てPE バイオシステ
ムズ（Biosystems）より購入した。3'-アミノ修飾化および／または蛍光標識化
オリゴヌクレオチドを25℃にて2時間濃縮NH4OH水溶液で処理し支持体から切断し
た。無水DMF（28μl）のテキサスレッド-Xサクシニミジルエステル（500μg）（
Molecular Probes; Eugene, OR）溶液を含むチューブに0.2M NaHCO3（150μl）
およびオリゴヌクレオチド（200μg）を添加することによりテキサスレッド標識
を行った。続いて終夜25℃で撹拌し、3M NaCl（20μl）および氷冷エタノール（
500μl）を添加し、30分間ドライアイスエタノール槽にて冷却および12,000 g
で30分間遠心してほとんどの未反応標識を除去した。上清を除去し、沈澱したオ
リゴヌクレオチドを70％エタノール（100μl）で洗浄し、乾燥させた。Zip13に
対する相補配列を含んだ完全長LDR産物を刺激する70merのフルオレセイン標識FA
McZip13-Prd を1000Å細孔径CPGで合成した。配列は： であった（位置特定可能なアレイ特異的部分を太字で示す）。標識化および未標
識化オリゴヌクレオチドを12％変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によ
って精製した。バンドを紫外線陰影によって可視化し、ゲルから切断して、0.5M NaCl、5mM EDTA、pH8.0中37℃で終夜溶出させた。製造説明書に従いC18セップ-
パックス（Sep-Paks）（Waters Corporation; Milford, MA）にてオリゴヌクレ
オチド溶液を脱塩し、続いてオリゴヌクレオチドを乾燥濃縮させ（Speed-Vac）-
20℃で保存した。
【０２４１】 ポリマー被覆スライド 顕微鏡用スライド（Fisher Scientific, プレクリーン、3インチ×1インチ×1
.2mm）を2％メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン-0.2％トリエチルア
ミンのCHCl3溶液に25℃で30分間浸し、次にCHCl3で洗浄した（15分間を2回）。
モノマー溶液［20L : 8% アクリルアミド-2％アクリル酸-0.02％N,N'-メチレン-
ビスアクリルアミド（モノマー：架橋剤の比率が500：1）-0.8％過硫酸ラジカル
重合開始剤］をスライドの一端に滴下し予めシラン化（5% (CH3)2SiCl2クロロホ
ルム溶液）しておいたカバーガラス（24×50mm）を用いて押し広げた。ホットプ
レートにて70℃で4.5分間スライドを加熱することにより重合を行った。ホット
プレートからスライドを取り除き、単端カミソリ刃ですぐにカバーガラスを剥離
させた。被覆スライドを脱イオン化水で洗浄し、大気中で乾燥させ、外界状態下
で保存した。
【０２４２】 位置特定可能アレイ ポリマー被覆スライドを20mM N-ヒドロキシサクシニミドを含む0.1M 1-［3-（
ジメチルアミノ）プロピル］-3-エチルカルボジイミド塩酸の0.1M K2HPO4/KH2PO 4 , pH6.0溶液に25℃で30分間浸すことにより予め活性化させておいた。活性化ス
ライドを水で洗浄し、65℃のオーブンで乾燥させた；これらはドライエライト(D
rierite)入り乾燥器中25℃で6ヶ月またはそれ以上の期間の保存に対し安定であ
った。
【０２４３】 手動によるスポット操作については、0.2M K2HPO4/KH2PO4、 pH8.3 の捕獲オ
リゴヌクレオチドストック液（500μM）からレイニンピペットマン（Rainin Pip
etman）を用いて0.2μlずつ採取し、前活性化重合体表面上に3×3 アレイで置い
た。結果として得られるアレイを水-ホルムアミド（1：1）を含む加湿容器中65
℃で1時間保温した。自動装置によるスポット操作については、大気調整容器中
で針型スポッターを装備した自動装置を用いて10〜50nlずつ捕獲オリゴヌクレオ
チド（同緩衝液中1.5mM）を25℃で前活性化表面に置いた。4スポット群からなる
アドレスを持つ、２組の3×3アレイを各スライドに置いた。いずれかの方法を用
いてスポットした後、300mM バイシン（bicine）、pH8.0-300mM NaCl-0.1% SDS
にスライドを65℃で30分間浸し、水で洗浄して乾燥させることにより未結合オリ
ゴヌクレオチドを重合表面から除去した。このアレイを必要となるまでスライド
ボックスに25℃で保存した。
【０２４４】 K-ras DNA試料のPCR増幅 パラフィン油下10mM トリス・HCl, pH8.3-1.5mM MgCl2-50mM KCl, 800μM dNT
Ps, 2.5μM フォワードプライマーならびにリバースプライマー（各プライマー1
2.5 pmol；表12を参照せよ）およびパラフィン包埋腫瘍または細胞株から抽出し
た1〜50ng の染色体DNAを含む20Lの反応混合液中でPCR増幅を行った。94℃で2分
間の変性段階に続き、0.2ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ（PE Biosystems）を
添加した。
【０２４５】
【表１２】 PCR/LDR/アレイハイブリダイゼーションによるK-ras 変異検出のた
めに設計されたプライマーおよびプローブ これらのPCRプライマーはN-rasおよびH-rasの共増幅を伴うことなくK-rasのエク
ソン1を増幅するために特異的に設計された。対立遺伝子特異的LDRプローブはそ
れらの5'末端（太字）に24merの位置特定可能アレイ部分および3'末端（下線）
に識別塩基を含めた。共通LDRプローブは5'リン酸基および3'末端にフルオレセ
インまたはテキサスレッド標識のどちらかを含めた。
【０２４６】 94℃15秒および60℃2分の40ラウンドによる熱サイクルに続き、65℃５分の最
終伸長段階によって増幅を行った。PCR後、1μlのプロテナーゼK（18mg/ml）を
添加し、反応溶液を70℃で10分間加熱および95℃で5分間加熱することにより反
応停止させた。予想される大きさの増幅産物の存在を確認するために各PCR産物1
μlを3％アガロースゲルで解析した。
【０２４７】 K-ras DNA試料のLDR パラフィン油下20mM トリス・HCl, pH8.5-5mM MgCl2-100mM KCl, 10mM DTT, 1
mM NAD+, 8pmol 全LDRプローブ（500fmolの各識別プローブ+4pmolの蛍光標識共
通プローブ）、および細胞株または腫瘍試料からのPCR産物1pmolを含む20μl体
積量でLDR反応を行った。7つの変異特異的プローブ、３つの共通プローブ、およ
びコドン12またはコドン13のいずれかに対する野生型判別プローブを含む、各2
つのプローブ混合液を調製した（図35Cおよび表12）。
【０２４８】 反応混合液を94℃で2分間予め加熱処理し、続いて25fmolの野生型Tth DNAリガ
ーゼを添加した。LDR反応を94℃15秒および65℃4分の20ラウンドサイクルで行っ
た。各反応溶液の2μlずつを2Lのゲルローディング緩衝液［8％ブルーデキスト
ラン、50mM EDTA, pH8.0-ホルムアミド（1：5）］と混合し、94℃で２分間変性
して、氷上で冷却した。各混合液の1μlを10％変性ポリアクリルアミドゲルに添
加しABI 377 DNAシーケンサーにより1500ボルトで電気泳動した。
【０２４９】 K-ras LDR産物とDNAアレイのハイブリダイゼーション 最終緩衝液濃度が300mM MES,pH6.0-10mM MgCl2-0.1% SDSである緩衝液を作成
するために40μlの1.4×ハイブリダイゼーション緩衝液でLDR反応液（17μl）を
希釈した。1×ハイブリダイゼーション緩衝液中でアレイを25℃で15分間前保温
を行った。カバーウェルズ（Coverwells）（Grace, Inc; Sunriver, OR）に希釈
LDR反応液を充填しアレイに装着した。このアレイを加湿培養チューブに設置し
回転ハイブリダイゼーションオーブン中65℃および20rpmで1時間保温した。ハイ
ブリダイゼーション後、アレイを25℃で10分間300mM バイシン、pH8.0-10mM MgC
l2-0.1% SDSで洗浄した。蛍光シグナルを顕微鏡／CCDを用いて測定した（「画像
解析」を参照せよ）。
【０２５０】 合成LDR産物とDNAアレイのハイブリダイゼーション 4,500fmolの全フルオレセイン標識共通LDRプローブおよび9×500fmolの各未標
識識別LDRプローブを含む位置特定可能なアレイ特異的部分を組み合わせた100am
ol, 1fmol, 3fmol, 10fmol, または30fmolのFAMcZip13-Prd（アドレス13に相補
する合成70merLDR産物）を含む4通りのハイブリダイゼーション混合液を、55μl
の300mM MES、pH6.0-10mM MgCl2-0.1% SDSに調製した。前節に記載される手順に
従いハイブリダイゼーションを行い、フルオロイメージャー（FluorImager）お
よび落射蛍光顕微鏡のデータを取得し解析を行った（「画像解析」を参照せよ）
。
【０２５１】 LDRおよび連続希釈G12V/G12とDNAアレイのハイブリダイゼーション これらの実験は20μl体積量で行った。G12V変異を含むPCR増幅SW620細胞株DNA
を100nM（2,000fmol）の野生型（G12）DNAおよび100nM（2,000fmol）のG12V識別
プローブならびにテキサスレッド標識共通プローブの両方を含むLDR混合液に5nM
（100fmol=1/20）から0.050nM（1fmol=1/2,000）で希釈した。LDRおよびハイブ
リダイゼーションは上述のように行い、顕微鏡／CCDによるイメージ化は「画像
解析」に詳述されるように行った。
【０２５２】 画像解析 モレキュラーダイナミクスフルオロイメージャー595（Molecular Dynamics Fl
uorImager 595）（Sunnyvale, CA）またはプリンストンインストルメントTE/CCD
-512 TKBMIカメラ（Princeton Instruments TE/CCD-512 TKBMI camera）（Trent
on, NJ）を装備したオリンパスAX70 落射蛍光顕微鏡（Melville, NY）を用いて
アレイを画像化した。フルオロイメージャーによるフルオレセイン標識プローブ
の解析については、530／30発光フィルターを用いて488nm励起を使用した。走査
空間解像度はピクセルあたり100μmとした。結果として得られる画像を機器に備
え付けられているImageQuaNTソフトウェアを用いて解析した。落射蛍光顕微鏡に
100W水銀ランプ、FITCフィルターキューブ（励起480/40、二色性ビームスプリッ
ター595、発光645/75）、および100mmマクロ対物レンズを装着した。マクロ対物
レンズにより直径15mmの対象領域の照射および12.3×12.3mmマトリックスのCCD
への7×7mmアレイ領域の投射が可能となる。カメラを供給したウィンビュー32（
Winview32）ソフトウェアを用いて画像を16ビットモードで収集した。サイオン
イメージ（Scion Image）（Scion Corporation, Frederick, MD）を用いて解析
を行った。
【０２５３】実施例15 -捕獲アドレスの設計 本発明のアプローチは「アドレス」とよばれる24塩基で設計された捕獲配列に
依存しており、これらはお互いに非常に異なっておりまた標的配列または染色体
上のその他の配列に対するいかなる相同性も欠損している（表13）。
【０２５４】
【表１３】 原型アレイに用いられるアドレス配列 *対応するアドレス配列中のテトラマーオリゴヌクレオチドセグメントの順番。3
6セット全てから無作為に選別した6テトラマーは以下の通りである；1=TGCG; 2=
ATCG; 3=CAGC; 4=GGTA;5=GACC; 6=ACCT。緊密な配列である{Zip1,3,5}{Zip11,13
,15}および{Zip21,23,25}は1、3、5番目テトラマー配置が異なっているが、2、4
、6番目テトラマー配置は同一である。† スペーサーNH2=PO4(CH2CH2O)6PO3(CH2)3NH2
【０２５５】 各アドレス配列は完全長24merが70℃〜82℃（Oligo 6.0, Molecular Biology
Insights, Inc., Plymouth MN and Cascade, COを用いて算出）の範囲で同様のT
m値を持つような6セットのテトラマーの組合せである。各テトラマーが少なくと
も２つまでその他全てのものと異なり、自己相補または他のいかなるテトラマー
に対しても相補ではない36テトラマーの開始群を開発した（表1および13を参照
せよ）。各アドレス配列が少なくとも3つの交互テトラマー単位までその他全て
のものから異なるようにテトラマーを組み合わせた（表13）。これにより各アド
レスがその他全てのものとは少なくとも6塩基まで異なり、しかるにオリゴヌク
レオチドプローブの最も緊密な位置特定可能アレイ特異的部分ですら交差ハイブ
リダイゼーションするのを防ぐことが保証される（正確なハイブリダイゼーショ
ンのTm値はどの不正確なハイブリダイゼーションのものより少なくとも24℃高い
）。シグナルが検出されるそれらのアドレスの位置から各変異の存在および型を
決定した。異なる変異特異的LDRプローブを同セットアドレス補体配列に付加さ
せることができるので、このアレイは普遍的であり、任意の遺伝子中の変異を検
出するためにプログラムすることができる。
【０２５６】実施例16 -アレイ調製 様々な型の2次元および3次元マトリックスを以下に関して調べた：（i）表面
調製の容易度；（ii）ヌクレオチド負荷容量；（iii）オリゴヌクレオチドの結
合に加えハイブリダイゼーションならびに洗浄に求められる条件に対する安定性
；および（iv）蛍光検出の適合性。位置特定可能アレイを構築する好ましい方法
論はガラス固相支持体に容易に架橋されたアクリルアミド／アクリル酸共重合の
フィルムをまず作成し、次に重合体表面全体に無作為に拡散した遊離カルボキシ
ル基を活性化して、共有アミド結合を形成するためにアミン末端化捕獲オリゴヌ
クレオチドを添加することを含む（図34A-Bおよび36A）。記載されるカップリン
グ化学は迅速で直接的、効率的であり、手動および自動スポット操作に適応しや
すい。活性表面およびオリゴヌクレオチド結合表面は共に長期保存に対して安定
である。
【０２５７】実施例17 -ハイブリダイゼーション条件の至適化 モデル位置特定可能アレイにおける蛍光標識70merプローブハイブリダイゼー
ションを緩衝液、金属補因子、体積、pH、時間、および混合の力学の機能として
測定した（表14）。緊密なアドレスについてさえ、シグナル-ノイズ比率が少な
くとも50：1であり交差ハイブリダイゼーションは無視できるかまたは不在であ
った。これらの実験から異なるアドレスはおよそ同比率でハイブリッドを形成す
る、つまり、1アドレスあたりに結合するオリゴヌクレオチド量で標準化した場
合に蛍光シグナルレベルは比較的均一であることが示唆される。マグネシウムは
ハイブリッドを形成させるには必須であり、この二価陽イオン存在下で1fmol以
下のプローブを検出することができた（表14；図37）。pHが8.0から6.0に低下す
ることによりハイブリダイゼーションシグナルが倍加されるが、大量のポリマー
マトリックス中の未結合アクリル酸基から生じる負電荷（それ故オリゴヌクレオ
チドとの反発的相互作用が減少する）が遮蔽されることによる可能性が高い。こ
の仮説を確証するために、標準的なカップリング条件の下、捕獲オリゴヌクレオ
チドが既に結合しているアレイ上の遊離カルボキシル基をエタノールアミンで保
護した。pH8.0での保護したアレイのハイブリダイゼーションはpH6.0における保
護なしでの同アレイと一致する結果が得られた。確実なハイブリダイゼーション
を得るためには連続して混合することが重要であることが判明し、時間経過検証
から標準として選択された65℃で1時間が導き出された。ハイブリダイゼーショ
ン体積を減少させることによりハイブリダイゼーションシグナルが改善されたが
、これは相対的にプローブ濃度が増加したためである。連続して混合することの
できる特殊化した小体積ハイブリダイゼーション容器を用いることによりさらな
る改善が達成されうる。
【０２５８】
【表１４】 ハイブリダイゼーションシグナルにおけるハイブリダイゼーション
条件の効果 *ハイブリダイゼーションは1pmolのFAMcZip13-Prdおよび手動でスポットしたア
レイで行った。緩衝液は、緩衝液A：300mM バイシン、pH8.0-10mM MgCl2-0.1% S
DS；†緩衝液B：300mM MES、pH6.0-10mM MgCl2-0.1% SDS。 混合は、断続性（Inter.）：10分毎に1回試料を手動で混合；連続性（Cont.）；
ハイブリダイゼーションオーブン内20rpmで試料を撹拌。
【０２５９】実施例18 -K-ras LDR産物のアレイハイブリダイゼーション 位置特定可能アレイの検出に共役するPCR/LDR増幅を、モデルシステムとしてK
-ras遺伝子を用いて検証した。K-ras DNA隣接コドン12および13を選択的に増幅
させるためにエクソン特異的なPCRプライマーを用いた。結腸直腸癌のK-ras遺伝
子に見いだされる7つの最も共通な変異を検出するためにLDRプローブを設計した
（図35C、表14）。例えば、コドン12の2番目であるGGTはアスパラギン酸をコー
ドするGATに変異しうるが、これは5'末端に位置特定可能アレイ特異的部分の補
体をもつcZip13および蛍光標識した共通プローブの3'末端に識別塩基、Aを連結
することにより検出される（図35C）。
【０２６０】 既知K-ras変異を含む細胞株またはパラフィン包埋腫瘍に由来する9つの各DNA
試料についてPCR/LDR反応を行った。LDRが成功したことを確認するために各反応
液からアリコート（2μl）を搾取しシーケンス機器で電気泳動を行った。次に3
×3位置特定可能アレイによるLDR産物混合液のハイブリダイゼーションを行い（
各アドレスを4つ組にスポットした）、蛍光スポットの位置を検出することによ
って異なる変異を判別した（図36Bおよび図39）。野生型試料のWt(G12)およびWt
(G13)は予想通りそれぞれZip1ならびにZip25における4つの同じハイブリダイゼ
ーションシグナルを示した。変異試料は細胞株または腫瘍に存在する野生型DNA
と同様に、変異に一致するハイブリダイゼーションシグナルを示した。この唯一
の例外はG12V試料で、G12V K-ras対立遺伝子に対しホモ接合性の細胞株（SW620
）に由来する細胞株であった。実験は手動ならびに自動でスポットしたアレイお
よびフルオレセインまたはテキサスレッドいずれかで標識したLDRプローブを用
いて数回繰返した。これらいずれの実験においても偽陽性または偽陰性シグナル
は出現しなかった。アレイ上に見られる最少量のノイズは埃、掻き傷、および／
または重合体中の小泡に帰することができる。これらの不備は4つ組のスポット
パターンで再現されるものよりも弱く散発的であるため容易に判別される；この
ようなノイズは製造条件をより厳密にすることにより最小化される。
【０２６１】実施例19 -アレイ捕獲感受性 LDR反応後、アレイ上の正確なアドレスとのハイブリダイゼーションに関して
、過剰の未結合識別プローブは正しく結合したLDR産物および蛍光標識LDR産物と
競合する。捕獲感受性を測定するために、標準的な条件で、全セットのK-ras LD
Rプローブ（全9,000fmolの識別および共通プローブを組み合わせた）存在下100a
mol（=1/90,000）から30（=1/300）fmolの標識化合成70merのFAMcZip13-Prd（こ
れは完全長LDR産物を刺激する；配列に関して材料と方法を参照せよ）を用い4つ
組でDNAアレイをハイブリダイゼーションさせた。フルオロイメージャー（Fluor
Imager）を用いたアレイ解析は4,500fmolのFAM標識LDRプローブおよびハイブリ
ダイゼーション溶液中に位置特定可能アレイ特異的部分を含む4,500fmolのプロ
ーブ存在下最少3fmol（=1/3,000）のFAMcZip13-Prd標識プローブから開始した場
合に、3：１以上のシグナル対ノイズ比率が得られることを示している。蛍光を
定量する顕微鏡／CCD計測手段を用いた結果はより著しいものであった：1fmol（
=1/9,000）の標識化プローブ（図37、右側）で開始することで3：1のシグナル対
ノイズ比率を維持することができ、その限界はさらに至適化した後100amolまで
伸展することができると予測される。所定のアレイの、いずれかの機器により定
量した蛍光に関して、捕獲数値は添加される標識化FAMcZip13-Prd量に伴い直線
的に変化した。同アレイに対し、同濃度で同プローブを再度ハイブリダイゼーシ
ョンする再現性は±5%以内であった。アレイ間の蛍光シグナルにおける差異は結
合した捕獲オリゴヌクレオチド量の差異を反映しており、これは手動によるスポ
ット操作特有の不正確さおよび／または重合体の均一性における差異によるもの
である。
【０２６２】実施例20 -PCR/LDR/アレイハイブリダイゼーションによる低存在量変異の検出 PCR／LDR/アレイハイブリダイゼーションを用いて野生型DNAの低レベル変異検
出の限界値を測定するために、連続希釈系を調製し解析した。1：20から1：500
の範囲の比率でPCR増幅した純G12V DNAを野生型K-ras DNA中に希釈した。2,000f
molのG12V変異に対する各識別および共通プローブをそれぞれ含む2プローブのセ
ットを用いて、2,000fmolの全DNAに対し2つ組LDR反応を行った。1：200の希釈度
で陽性ハイブリダイゼーションシグナルを定量することが可能であることが明ら
かとなった（図38）；シグナルは1：500の希釈度においても判別可能であるが、
後者の場合重合体の埃または気泡によるノイズレベルによって結果の正確な定量
性は妨げられた。純野生型DNA対照はハイブリダイゼーションシグナルを示さな
かった。これらの結果は明らかにPCD/LDRと組み合わせた場合、位置特定可能ア
レイハイブリダイゼーションは全DNAの1％しか存在しない遺伝子多型を検出しう
ることを示している。これらの結果は、26プローブセットおよび産物のゲル電気
泳動に基づく解析を用いたPCR/LDRはシグナル対ノイズが少なくとも3：1の比率
で、野生型が500倍まで過剰に存在する中で任意のK-ras変異をも検出することが
できることを示す早期の研究と一致している。
【０２６３】実施例21 -γ-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（γ-methacryloxyp
ropyltrimethoxysilane）で被覆したグラススライド表面上でのアクリルアミド-
アクリル酸重合体の重合反応 1％（v/v）濃度のアクリル酸を作成するために10mlの19％アクリルアミド-1％
ビスアクリルアミド（w/v）溶液に100mgのビス-アクリロイルシスタミン（Sigma
）を添加した。33μlの2％（w/v）過硫酸アンモニウム（Biorad）、および100μ
lアリコートあたり1μlのTEMEDを添加した後混合液を重合させた。実施例9に記
載されるように、25μlのTEMED活性化溶液をγ-メタクリルオキシプロピルトリ
メトキシシラン被覆グラススライドにアプライし、実施例10に記載されるように
ジクロロジメチルシランで被覆したグラススライド下で重合させた。
【０２６４】実施例22 -アクリルアミド-ビスアクリルアミド-アクリル酸共重合体への色素お
よび色素標識オリゴヌクレオチドの付着 実施例9に記載されるようにγ-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン
でシラン化した固相支持体にアクリルアミド-ビスアクリルアミド-アクリル酸共
重合体から構成される楔形ゲルを調製した。1mlのアクリルアミド-ビスアクリル
アミド-アクリル酸（9.5％：0.5％：1％ w/v）溶液に33μlの2％過硫酸アンモニ
ウムを添加した。100μlアリコートに1μlのTEMEDを添加し20μlのこの混合液を
シラン化した固相支持体にアプライした。
【０２６５】 0.1M フルオレセインアミン（Research Organics）、0.1M プトレセイン（put
rescein）含有0.1M ボディピー（Bodipy）-FL-NHS（Molecular Probes）、およ
びアミノ誘導体化フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドを含む .1Mリン酸緩衝
液 pH7および50mM EDC（Pierce）を楔形ゲルにアプライした。加湿容器で室温に
て30分間カップリング反応を進めた。相対蛍光単位をモレキュラーダイナミクス
595フルオロイメジャーによる光電子増倍管で、488nm励起、513nm発光および700
V電位にて測定した。表15は表面に結合する色素についての相対蛍光度を示して
いる。ゲルの類比深度領域において、ボディピー（Bodipy）FLはプトレセインを
介してマトリックスに結合しているにも関わらずRFUが最も高かったが、一方で
フルオレセインアミンはマトリックスと直接結合しているにも関わらずシグナル
はより低かった。ボディピーFLはフルオレセインに比べpH感受性が低いことが分
かっていおり、これがほぼ5倍のRFUの違いを説明している。表面に結合したフル
オレセイン標識オリゴヌクレオチドはフルオレセインより5倍以上RFUが低下した
。フルオレセイン標識アミノオリゴヌクレオチドで最も低いシグナルが観察され
た。色素はオリゴヌクレオチドより効率的にマトリックスに結合するように思わ
れるが、これはより容易にマトリックスに浸透するためである可能性がある。図
40のように楔形ゲルの最大深度勾配に沿った相対蛍光単位（RFU）を測定し色素
のマトリックス浸透能力を示した。ゲルの厚さが増加するにつれフルオレセイン
アミンのRFUが増加する。
【０２６６】
【表１５】 アクリルアミド／アクリル酸共重合体に結合する色素およびオリゴ
ヌクレオチド相対蛍光の定量 ＊RFU=相対蛍光単位
【０２６７】実施例23 -野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子のPCR/LDR検出のためのBRCA1
およびBRCA2のエクソン増幅 50ngのDNA、2.5mMの各dNTP、1×TCK緩衝液（20mM トリシン、200μg/ml ウシ
血清アルブミン、および50mM 酢酸カリウム）、および .25U Taqポリメラーゼを
含む20μlの反応混合液から開始して染色体DNAからの増幅を行った。BRCA1エク
ソン20およびBRCA2エクソン11を増幅するために、8pmolの各BRCA1エクソン2プラ
イマーと共に4pmolの各フォワードプライマーならびにリバースプライマープラ
イマーを用いた。チューブにミネラルオイルを充填し94℃で1.5分間前保温した
。必要単位のポリメラーゼを導入するために1×緩衝液で希釈したポリメラーゼ1
μlを添加してホットスタートを行った。40サイクルで各セグメントを増幅した
。各サイクルは94℃15秒の融解段階、および55℃2分の混合アニール-伸長段階か
らなる。最終サイクル後、55℃でさらに5分間反応を継続した。PCR後、プロテナ
ーゼKで70℃10分間および90℃15分間処理した。
【０２６８】 変異対立遺伝子と野生型を判別するために、変異対立遺伝子から野生型を、各
対立遺伝子について異なる蛍光色素をもつ異なる大きさのバンドとしてゲル上で
検出可能に設計された競合LDRに対する鋳型としてPCR産物を用いた。共通プロー
ブを5'リン酸化しC3スペーサーにてその3'末端を遮断した（Bk）。連結反応には
500fmolの各識別プローブおよび750fmolの各共通プローブを用い、10サイクルで
94℃にて15秒間の変性および65℃で２分間の連結反応を行った。10％アクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動によりLDR産物を分離しABI 373蛍光シーケンサーで検
出した。ABI TAMRA-350 サイズ基準をLDR試料に添加した。
【０２６９】 アレイ上の特異的補体アドレスに対する捕獲について位置特定可能アレイ特異
的部分を含めるためにLDRプローブを再設計した。2種類の方法を開発した。一つ
目は、各対立遺伝子を同定するための異なる色素を持つLDR標的あたりのアレイ
上にあるアドレスを設置する（表16）。
【０２７０】
【表１６】 BRCA1およびBRCA2の3つの特異的変異を検出するためのプローブ。L
DR標的あたりのアレイ上のあるアドレスとのハイブリダイゼーションによる捕獲
、および各対立遺伝子間を識別するための異なる蛍光色素からのシグナル。
【０２７１】 これらのプローブは野生型PCR産物および変異PCR産物とハイブリダイゼーショ
ンするが、両プローブが間隙または重複なく完全に一致する場合にのみ結合する
（図41）。識別プローブの各位置特定可能アレイ特異的部分はLDR産物をアレイ
上の特異的アドレスへと配向させる。2つめの方法は、変異の存在および不在を
判別する全てのLDRプローブに、各LDR産物を個々のアドレスに配向させる特有の
位置特定可能アレイ特異的部分を持たせることである（表17）。
【０２７２】
【表１７】 BRCA1およびBRCA2の3つの特異的変異を検出するためのプローブ。
単一の蛍光色素に由来する対立遺伝子シグナルあたりのある特有のアレイアドレ
スとのハイブリダイゼーションによるアレイ上での捕獲。
【０２７３】 一つの色素のみが必要とされる（図43）。変異の存在または不在を確認するた
めにゲルで大きさによってこれらの産物を分離することができる（図44）。単一
および二重の色素プローブ法を並行して用い変異に対するLDRによってPCR産物を
探索した。同試料から得られたLDR産物を両ゲルにロードし、両方とも一致した
量の各LDR産物を示す。それらの産物はゲル上で完全には分離し得ないため、二
重色素法によりゲル上での変異産物対野性型産物を視覚的に判別することがより
容易になる。しかし、アレイ上でのアレイ特異的部分のハイブリダイゼーション
によりアレイ上で完全に物理的に分離することが可能となりこの場合単一の色素
で十分である。これらのアレイは再現性を確認するための群としてそれぞれスポ
ットした4つの、複数のアドレス（表18）によって作成された（図44）。
【０２７４】
【表１８】 アレイに結合する捕獲プローブ
【０２７５】 100W水銀バーナー、フルオレセインならびにローダミンフィルターキューブお
よびプリンストンインストルメント TEK512/CCDカメラ（Princeton Instruments
TEK512/CCD camera）を用いてオリンパスプロビスAX70（Olympus Provis AX70
）顕微鏡でアレイを画像化した。
【０２７６】 TET標識LDR産物から独立してFAM標識LDR産物を画像化した。8ビットグレース
ケールへ変換する前にLDRシグナルをより狭域に絞り16ビットグレースケールを
再調整した。フォトショップ（Photoshop）を用いて、FAM（野性型）を緑色に、
およびTET（変異）を赤色にして8ビット画像に色付けをした（図45）。最後にこ
れらの画像を重ね合わせ、アドレスに野性型対立遺伝子および変異対立遺伝子の
両方が存在すると黄色になるような併用画像を作成した。野性型対立遺伝子が各
試料に存在し、LDR産物の位置特定可能特異的部分に相補的なアドレスのみが検
出可能なシグナルを有していた。従って、位置特定可能アレイのハイブリダイゼ
ーションは極めて特異的である。アレイにハイブリダイゼーションする各試料の
ゲルレーンを示す。各試料の変異の存在は一致するアレイアドレスの描写および
ゲルバンドに下線を引くことで指し示す。それぞれの場合において、アレイはゲ
ルの結果を再現した。二重標識法は同アレイアドレス上の野性型および変異対立
遺伝子の存在を同定することができ、この方法はホモ接合体個体またはヘテロ接
合体個体を同定することができる。
【０２７７】実施例24 -アレイの調製およびハイブリダイゼーション反応における使用 単層被覆支持体と比較した場合、ガラス顕微鏡スライド上を重合体コーティン
グすることにより捕獲プローブの結合容量が増加した。この結果に対して、20μ
mまでの厚さの中性重合体層で支持体を調製した。この重合体はモノメタクリレ
ートグリセロールを混入した材料に基づくアクリルアミドであった。酸化させる
と、モノメタクリレートグリセロールのビシノールジオールがアルデヒドに転換
し、これは末端アミン化オリゴヌクレオチド捕獲プローブの固定点としてはたら
く。
【０２７８】 表面に重合体を固定するために、参照として本明細書に組み込まれるS. サバ
ード（S. Savard）らの手順、「水溶液中のシラン加水分解および濃縮（Hydroly
sis and Condensation of Silanes in Aqueous Solution）」、ポリム コンポ
ス（Polym Compos）第５巻：第242-249ページ（1984年）に従い、まずガラスを3
-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートでシラン化した。3-（トリメ
トキシシリル）プロピルメタクリレート（0.04M）の希HCl水溶液、pH2-4を25℃
にて30分間激しく撹拌する。きれいな3×1"顕微鏡スライド（実施例8に従い調製
）を25℃で30分間、時々撹拌しながらこの溶液中で保温し、脱イオン水で洗浄、
窒素で風乾し、24時間以内に使用する。
【０２７９】 1インチおよび1000インチのステンレススチール製楔をメタクリレート処理し
たスライドおよび疎水性（10％ v/vジクロロジメチルシランのトルエン溶液）を
もつ2枚目の顕微鏡スライドの間3箇所の端に設置する。E. N. チモフ（E. N. Ti
mofeev）ら、「アクリル共重合体ゲルへの短いオリゴヌクレオチドの位置選択的
固定化（Regioselective Immobilization of Short Oligonucleotides to Acryl
ic Copolymer Gels）」核酸リサーチ（Nucleic Acids Res.）第24巻：第3142-31
48頁（1996年）、これは参照として本明細書に組み入れられる。楔で固定された
３端を顕微鏡スライドの１カ所1インチを空けたクランプの位置に保持する。次
に形成された腔をN,N-ジメチルアクリルアミド（0.9M）、モノメタクリレート（
0.1M）（Polysciences, Inc. Warrington, PA）、N,N-メチレン-ビスアクリルア
ミド架橋剤（0.0027M）を含む重合剤、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミ
ン（0.2％v/v）および要時調製した10％過硫酸アンモニウム（2％v/v）で充填し
重合反応を開始する。25℃にて30分間重合反応を行い、「サンドイッチ」を解離
させる。重合体フィルムを脱イオン水で洗浄し、乾燥させてさらに使用するまで
4℃で保存する。
【０２８０】 前記参照で実行されているように、従来の手法を用い、N,N-ジメチルアクリル
アミドで共重合した前駆体を設計した特注品である、そのゲルの形態でアルデヒ
ドを作成するためにNaIO4にて酸化反応を行う。本発明におけるアルデヒドをメ
タクリレートグリセロールのビシノールジオールにNaIO4（0.1M、25℃、1時間）
を処理することにより作成する。マトリックスを含むアルデヒドを脱イオン水中
に浸水させる（25℃、1時間）。スライドを浴槽から取り出し、水和させた表面
から過剰の水を窒素気流にて噴き落とす。重合体を乾燥させる（25℃、30分間）
。0.5μl容量の注射器を用いて、0.1μlの第１、末端アミンを含む蛍光標識24残
基捕獲オリゴヌクレオチドプローブ（pH5より低い0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液中
に500μM）をアルデヒド化表面に滴下する。アドレスを含む液体の上に0.1μlの
シアノ水素化ホウ酸ナトリウム（0.1M）を直接滴下する。加湿容器中で24時間還
元アミノ化反応を行う（25℃）。カップリング反応後、マトリックスを65℃で3
０分間、300mM NaClおよび0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含むビシン緩衝液（3
00mM, pH8）に浸す。このスライドを脱イオン水にて洗浄し、窒素風乾して乾燥
器にて保存する。
【０２８１】 実施例14に従いハイブリダイゼーションを行う。
【０２８２】 4×倍率で水銀蒸気ランプを用いたユニバーサルイメージング（Universal Ima
ging）からのスポットカメラ（Spot Camera）により蛍光画像を取得する。ロー
ダミン標識補体に対する露光時間は10秒とする。メタモルフ（Metamorph）を用
いてバックグラウンド以上の光シグナル量を定量する。オリジナル画像を50％ま
で減少させ、400ピクセル径円周を積算する。
【０２８３】 表19は上述の方法で調製したスライドの捕獲性能を示している。
【０２８４】
【表１９】 捕獲プローブの蛍光定量
【０２８５】 変異を検出する本アプローチは3つの直交性成分をもつ：（i）一次PCR増幅（i
i）水相LDRの検出：および（iii）固相ハイブリダイゼーションの捕獲。従って
、各段階でのバックグラウンドシグナルを最小化することができ、結果として本
発明方法の全体的な感度および精度は他のストラテジーによって供給されるそれ
ら以上に有意に上昇される。例えば、「ハイブリダイゼーションによる配列決定
（Sequencing by hybridazation）」法は（i）複数ラウンドのPCRまたはPCR/T7
転写反応；（ii）PCR増幅産物の断片化処理またはこれらの一本鎖化；および（i
ii）長時間のハイブリダイゼーション反応（10時間またはそれ以上）を必要とし
これらの処理量が限定される（Guoら、Nucleic Acids Res.、第2巻：第5456-546
5頁（1994年）；Haciaら、Nat. Genet.、第14441-447頁（1996年）；Cheeら、Sc ience 、第274巻：第610-614頁（1996年）；Croninら、Human Mutation、第７巻
：第244-255頁（1996年）；Wangら、Science、第280巻：第1077-1082（1998年）
；Schenaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第93巻：第10614-10619頁（1996年
）；およびShalonら、Genome Res.、第6巻：第639-645頁（1996年）、これらは
参照として本明細書に組み入れられる。）。加えて、これらのアレイに固定され
たプローブは広範囲なTm値を有するので、0℃から44℃の温度でハイブリダイゼ
ーションを行う必要がある。結果として、例えば反復配列中の小規模な挿入およ
び欠損によるハイブリダイゼーションのミスマッチおよび非特異的結合のために
、バックグラウンドノイズおよび偽シグナルが増加する（Haciaら、Nat. Genet. 、第14441-447頁（1996年）；Croninら、Human Mutation、第7巻：第244-255頁
（1996年）；Wangら、Science、第280巻：第1077-1082頁（1998年）；およびSou
thern, E. M.、Trends in Genet.、第12巻：第110-115頁（1996年）、これは参
照として本明細書に組み入れられる）。逆に、本発明の方法により単一の反応で
複合的なPCRが可能となり（Belgraderら、Genome Sci. Technol.、第1巻：第77-
87頁（1996年）、これらは参照として本明細書に組み入れられる）、産物を一本
鎖型に変換するための付加的な段階が必要とされず、反復配列中の滑り（slippa
ge）を含む全ての点変異を容易に判別することができる（Dayら、Genomics、第2
9巻：第152-162頁（1995年）、これは参照として本明細書に組み入れられる）。
選択的DNAアレイは配列の多様性または試料中に存在する標的の量的なものが原
因でハイブリダイゼーション効率のばらつきを被る。類似の熱力学的性質をもつ
多岐にわたるアドレス配列を設計する本手法を用いることによって、ハイブリダ
イゼーションを65℃で行うことができ、結果として厳密および迅速なハイブリダ
イゼーションが得られる。変異検出段階からの脱ハイブリダイゼーション段階は
、ゲルを基とするLDR検出を用いて既に獲得しているため、LDR産物定量化の見通
しを与える。
【０２８６】 ガラス表面に直接スポットした、またはインサイチュで合成したアレイと比較
して、重合体表面にスポットしたアレイは単一捕獲に実質的改善を供給する（Dr
obyshevら、Gene、第188巻：第45-52頁（1997年）；Yershovら、Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 、第93巻：第4913-4918頁（1996年）；およびParinovら、Nucleic Acids Res. 、第24巻：第2998-3004頁（1996年）、これらは参照として本明細書
に組み入れられる）。しかし、その他に記載される重合体は用いるアドレスが8m
erから10merに限定されるが、本発明重合体表面によって容易に24mer捕獲オリゴ
ヌクレオチドを浸透させ共有結合させることが可能となる。さらに、60から75ヌ
クレオチド残基長のLDR 産物が浸透し、続いて妥当なアドレスに実質的にハイブ
リダイゼーションすることも分かる。付加的な長所として、この重合体はほとん
どあるいは全くバックグラウンド蛍光を与えず、蛍光標識オリゴヌクレオチドの
非特異的な結合を示さない。最後に、個々のアドレスにスポットし共有結合させ
た捕獲プローブは近隣のスポットに「漏洩」しないため、例えばゲルパッドを切
除することによる物理的な位置分離を行う必要性が排除される。
【０２８７】 本発明は文献中に前出する他のアレイを基とする検出システムから実質的に異
なる、高処理量の変異検出に関するストラテジーに関連する。溶液中で行われる
ポリメラーゼ連鎖反応／リガーゼ検出反応（PCR/LDR）と共役して、本発明アレ
イにより、遺伝性でその遺伝子について配列の50％として存在するか、散発性で
野生型配列の1％またはそれ以下で存在するかどうかという単一塩基変異の正確
な検出が可能となる。熱安定性DNAリガーゼが変異判別の特異性を供給する一方
で、LDRプローブの多岐にわたる位置特定可能アレイ特異的部分が各LDR産物をDN
Aアレイ上の設計されたアドレスへと導くため、この感度が得られる。アドレス
配列は一定でありこれらの補体を任意の組み合わせのLDRプローブに付属させる
ことができるため、本発明の位置特定可能アレイは普遍的である。従って、広範
囲な遺伝性変異を検出するために単一のアレイ設計をプログラムすることができ
る。
【０２８８】 多種多様な遺伝子にある多くの潜在的部位における変異の迅速な検出に関する
確実な方法により癌患者の診断および治療の改善が非常に確実なものとなる。唾
液、痰、尿、および糞便中に排出される細胞の変異解析に関する非侵襲性試験は
高危険率群の監視を単純化および改善し、内視鏡試験の費用および不快さを減少
させ、癌の、早期治療可能な段階でのより効果的な診断へと結び付けることがで
きる。排出される変異検出の実行可能性が機知の、および遺伝学的に特徴付けら
れている腫瘍を持つ患者で明確に示されているが（Sidranskyら、Science、第25
6巻：第102-105頁（1992年）、Nollauら、Int. J. Cancer、第66巻：第332-336
頁（1996年）；Calasら、Cancer Res.、第54巻：第3568-73頁（1994年）；Haseg
awaら、Oncogene、第10巻：第1413-16頁（1995年）；およびWuら、「癌の分子マ ーカの早期検出（Early Detection of Cancer Molecular Markers）」 （Lippman
ら、編集）（1994年）、これらは参照として本明細書に組み入れられる）、効果
的な前駆症状診断は無数の潜在的低頻度変異を最小の偽陽性および偽陰性で同定
する必要があると思われる。さらに、治療に対する反応性のようなものについて
の臨床的情報を有する腫瘍内の遺伝学的変化を定量するための技術の統合によっ
てより進行性の腫瘍をもつ患者治療に対する選択方法を根本的に変化させること
ができた。大規模な臨床試験で多くの候補遺伝子を試験することが信頼性のある
遺伝子マーカーの同定および確証に必要である。このような臨床試験で正確に変
異プロフィールを記録することが必要とされるため、100,000以上のアドレスを
もつ高価な微少寸法チップを作製することはできるが、これらの内、低存在比の
変異を検出する能力を示すものはない（Haciaら、Nat. Genet.、第14441-447頁
（1996年）；Cheeら、Science、第274頁：610-614（1996年）；Kozalら、Nat. M ed 、第2巻：第753-759頁（1996年）；およびwangら、Science、第280頁：第1077
-1082頁（1998年）、これらは参照として本明細書に組み入れられる）。本発明
の普遍的位置特定可能アレイの方法は多種多様な遺伝子の様々なコドンにおける
低頻度の変異を迅速および信頼性よく同定すること、また同様に癌進行に関連す
る様々な遺伝子の欠損および増幅を定量することのできる可能性を有している。
加えて、mRNA発現プロフィールに関して、LDRユニバーサルアレイはK-ras、N-ra
s、およびH-rasのような高度に類似する遺伝子を判別することができる。さらに
、特定遺伝子または特定の変異タンパク質を標的とする新規治療法が開発される
と、迅速および正確な高処理量の遺伝子試験の重要性は疑い無く増加するであろ
う。
【０２８９】 本発明は例証を目的として詳細に記載されているが、単にその目的のためにあ
るものであり、次に続く特許請求項によって定義される本発明の精神および範囲
から逸脱することなく当業者によりここに変法が作製できることが理解される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 先行技術および本発明のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）/リガーゼ
検出反応（LDR）の各プロセスを示す流れ図であり、点変異などの生殖系列上の
変異の検出に関するものである。
【図２】 先行技術および本発明のPCR/LDRプロセスを示す流れ図であり、
癌に関連した変異の検出に関するものである。
【図３】 同一遺伝子の2種の多型（すなわち対立遺伝子の差）におけるホ
モ接合体またはへテロ接合体の検出を目的とした、対立遺伝子特異的なプローブ
上のアドレスを用いる本発明のPCR/LDRプロセスを示す略図である。
【図４】 任意の部位において生じうるすべての塩基を識別する対立遺伝子
特異的なプローブのアドレスを用いる本発明のPCR/LDRプロセスを示す略図であ
る。
【図５】 近傍の2か所の部位に存在しうる任意の塩基の有無の検出を目的
として、対立遺伝子特異的なプローブのアドレスを用いる本発明のPCR/LDRプロ
セスを示す略図である。
【図６】 挿入および欠失を識別する対立遺伝子特異的なプローブのアドレ
スを用いる本発明のPCR/LDRプロセスを示す略図である。
【図７】 正常配列が大半を占める中で、数度が低い変異（コドン内）を検
出するために対立遺伝子特異的なプローブのアドレスを用いる本発明のPCR/LDR
プロセスを示す略図である。
【図８】 アドレスを共通のプローブ上に置き、対立遺伝子の差を異なる蛍
光シグナル（F1、F2、F3、およびF4）で識別する本発明のPCR/LDRプロセスを示
す略図である。
【図９】 隣接する対立遺伝子および近傍の対立遺伝子をともに検出する本
発明のPCR/LDRプロセスを示す略図である。
【図１０】 一つのコドンに対して生じうるすべての一塩基変異を検出する
本発明のPCR/LDRプロセスを示す略図である。
【図１１】 共有結合による修飾、移動（grafting）、および固相支持体へ
のオリゴマー結合の化学反応を示す。
【図１２Ａ〜図１２Ｃ】 オリゴヌクレオチドの共有結合を介した固相支持
体への結合に対して本明細書で提案される化学反応を示す。
【図１３Ａ〜図１３Ｃ】 オリゴヌクレオチドプローブの捕獲に関する別の
フォーマットを示す。図13Bでは、位置特定可能なアレイに特異的な部分が、対
立遺伝子特異的なプローブ上にある。各対立遺伝子は、それぞれアドレスZ1およ
びZ2上の蛍光シグナルの捕獲により識別される。図13Cでは、位置特定可能なア
レイに特異的な部分は共通プローブ上にあり、各対立遺伝子は各2本の対立遺伝
子に対応する蛍光シグナルF1およびF2の捕獲により識別される。
【図１４Ａ〜図１４Ｅ】 完全長が各24merのオリゴマーを、固相支持体上
の様々な部位にスポッティングすることでオリゴマーの8×8アレイを構築する手
順を示す。
【図１５Ａ〜図１５Ｅ】 図14A〜Eに示した8×8アレイ構築手順の斜視図で
ある。
【図１６Ａ〜図１６Ｃ】 完全長が各24merのオリゴマーを、図14A〜Eから
図15A〜Eの手法に従って固相支持体上にスポッティングする際に使用する装置の
図である。
【図１７】 一連の固有の24merを作製する際に使用することが可能な、少
なくとも2塩基が異なる36種の四量体を使用した本発明によるデザインを示す。
【図１８Ａ〜図１８Ｇ】 PNAの四量体を付加して、固有の25merのアドレス
をもつ5×5アレイの作製法を示す略図である。
【図１９Ａ〜図１９Ｅ】 6種類の四量体を連続的にカップリングすること
で24merの8×8のアレイを構築する手順を示す。
【図２０Ａ〜図２０Ｃ】 図19B〜Cに示した8×8アレイの構築手順の斜視図
である。
【図２１Ａ〜図２１Ｆ】 図19B〜Cに示した位置特定可能なアレイ合成の切
断面を示す。
【図２２Ａ〜図２２Ｃ】 図19B〜C、図20A〜C、および図21A〜Gに示した固
相支持体上における24merの8×8アレイ合成に使用する装置の略図である。
【図２３Ａ〜図２３Ｃ】 図19（図19D〜E）に示した8×8アレイの構築手順
の斜視図である。
【図２４Ａ〜図２４Ｃ】 図19D〜Eおよび図23A〜Cに示した固相支持体上に
おける24merの5×5アレイの合成に使用する装置の略図である。
【図２５Ａ〜図２５Ｃ】 6種の供給溶液を5つの出力ポートに分けることが
可能なバルブブロックアセンブリの略図である。
【図２６Ａ〜図２６Ｄ】 6種の供給溶液を5つの出力ポートに同時に排出す
ることが可能な円形マニホールドの図である。
【図２７】 本発明のプロセスを実施するアッセイシステムを示す略図であ
る。
【図２８】 様々な誘導体を導入した表面のホスホイメージャー（phosphor
imager）によるデータを示す。
【図２９】 重合体マトリックスの様々な架橋条件のホスホイメージャーに
よるデータを示す。
【図３０】 水酸基により機能を付与したスライドのホスホイメージャーに
よるデータを示す。
【図３１】 3-メタクリロイロキシプロピルトリメトキシシランでシラン処
理したガラス製スライドを作製する反応式を示す。
【図３２】 3-メタクリロイロキシプロピルトリメトキシシランでシラン処
理したガラス製スライド上で、重合体化したポリ（エチレングリコール）メタク
リレートを合成する反応式を示す。
【図３３】 3-メタクリルロイロキシプロピルトリメトキシシランでシラン
処理したガラス製スライド上で、重合体化したアクリル酸およびトリメチロール
プロパンエトキシレート（14/3 EO/OH）トリアクリレートを合成する反応式を示
す。
【図３４Ａ〜図３４Ｂ】 3-メタクリロイロキシプロピルトリメトキシシラ
ンでシラン処理したガラス製スライド上で、重合体化したポリ（エチレングリコ
ール）メタクリレートおよびトリメチロールプロパンエトキシレート（14/3 EO/
OH）トリアクリレートを合成する反応式を示す。
【図３５Ａ〜図３５Ｃ】 位置特定可能なアレイを用いたPCR/LDRによる変
異検出法を示す。図35Aは、変異の識別に使用するLDRプローブの略図を示す。個
々の対立遺伝子特異的なプローブは、5'端に位置特定可能な配列の相補的部分（
Z1またはZ3）を有し、また3'端に識別用塩基を有する。共通LDRプローブは、5'
端がリン酸化されており、3'端に蛍光標識を有する。このプローブは、標的DNA
上で互いに隣接してハイブリッドを形成し、接合部が完全に相補的である場合に
のみリガーゼによってニックが埋められる。図35Bは、変異の存在および種類が
、LDR反応産物と位置特定可能なDNAアレイ間のハイブリダイゼーションにより決
定されることを示す。このプローブの位置特定可能なアレイ特異的部分の配列は
十分異なるようにデザインされている。そのため、任意の部分に対して正しい相
補性塩基を含むプローブのみがそのアドレスにおいて結合状態を保つ。図35Cは
、K-ras遺伝子を含む染色体DNAの略図である。エキソンには影をつけてあり、コ
ドン12および13の位置を明示してある。K-ras遺伝子のDNAで隣接するコドン12お
よび13を選択的に増幅する目的でエキソンに特異的なプローブを使用した。プロ
ーブは図35Aの上部に示すように、これら2つのコドンにおける7通りの変異をLDR
により検出するようにデザインした。
【図３６Ａ〜図３６Ｂ】 DNAアレイ上にあるK-rasの変異の検出を示す。図
36Aは、ゲルを用いた位置特定可能なアレイの略図である。γ-メタクリルオキシ
プロピルトリメトキシシランで処理した顕微鏡用スライドガラスを、アクリルア
ミド/アクリル酸の共重合体マトリックスを共有結合を介して結合させる基盤と
して使用する。アミン修飾した捕獲用オリゴヌクレオチドは、N-ヒドロキシコハ
ク酸イミドで活性化させた表面に分散した位置に結合させる。3×3の格子内の各
位置は、各アドレス（および対応するK-ras変異配列または野生型配列）に対応
する。図36Bは、各LDR反応でハイブリッドを形成したアレイと、2秒間の露光に
よって検出された蛍光シグナルを示す。9枚すべてのアレイで、各腫瘍または細
胞系列の試料に対し、正確な変異型および/または野生型が同定された。一部の
パネルでみられる小さなスポット-例えばG13D変異を含むパネルの中央付近にみ
られるスポット-は、不正なハイブリダイゼーションを意味するものではなく、
不完全な重合体によるノイズである。
【図３７】 2種の異なる検出装置を用いた位置特定可能なアレイの捕獲感
度の判定を示す。この際、後述する4通りのハイブリダイゼーションを行った。
グラフは、フルオルイメージャー（fluorimager）（左）または、蛍光顕微鏡（e
pifluorescence microscope）/CCD（右）を用いて捕獲した70merの相補配列の定
量結果を示す。各点は、個々のアレイに対するハイブリダイゼーションを表す。
【図３８】 位置特定可能なアレイ捕獲を対象としたPCR/LDRを用いて、野
生型DNAが多数を占める中にわずかに存在するK-ras変異DNAの検出を示す。G12V
変異を含む細胞系列SW620に由来するDNA、および正常リンパ球に由来するDNAを
対象としたPCRでK-ras遺伝子の第1エキソンを増幅した。G12V増幅断片の10、20
、40、または100 fmolに加えて、PCRで増幅した野生型断片2,000 fmolを含む混
合物を調製し、G12V変異に特異的なプローブを用いたLDRで変異型DNAを決定した
（識別用プライマーと共通プライマーを各2,000 fmol）。画像データは、CCDの
露光時間を5〜25秒間として収集した。データは、蛍光シグナル強度を撮像時間
で割って基準化した。各データポイントは、4枚の独立したDNAアレイのハイブリ
ダイゼーションに由来する平均シグナルから平均背景シグナルを差し引いた値を
表す。
【図３９】 位置特定可能なアレイ捕獲を用いたPCR/LDRによるK-ras変異の
検出を示す。
【図４０】 BRCA 1遺伝子およびBRCA 2遺伝子における3種類の特異的変異
を検出するためのプローブのライゲーションを示す。
【図４１】 BRCA 1遺伝子およびBRCA 2遺伝子における3種類の特異的変異
を検出するためのプローブのライゲーションを示す。
【図４２】 LDRにより検出されたBRCA 1遺伝子およびBRCA 2遺伝子におけ
る3種類の特異的変異の同定（ゲル使用）を示す。
【図４３】 アレイのアドレス上にカップリングさせたオリゴヌクレオチド
を示す。標識は、表16に示した通りにスポットしたオリゴヌクレオチドを示す。
【図４４】 BRCA 1遺伝子およびBRCA 2遺伝子における3種類の特異的変異
のLDRによる検出を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (71)出願人 ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステイト ユニバーシティ アンド アグリカルチュラル アンド メカニカル カレッジ アメリカ合衆国 ルイジアナ州 バトン ルージュ デビッド ボイド ホール 203 (72)発明者 バラニー フランシス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ニュー ヨーク イースト 63ド ストリート 450 アパートメント ＃12シー (72)発明者 ジェリー ノーマン ピー． アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ニュー ヨーク １シー イースト 83 ストリー ト 308 (72)発明者 ウィトウスキ ナンシー イー． アメリカ合衆国 ミネソタ州 エディナ タラ ロード 7224 (72)発明者 デイ ジョセフ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ペイン ティッド ポスト ポンドビュー 11 (72)発明者 ハンマー ロバート ピー． アメリカ合衆国 ルイジアナ州 バトン ルージュ トゥレイン ドライブ 4967 (72)発明者 バラニー ジョージ アメリカ合衆国 ミネソタ州 ファルコン ヘイツ ノース プライアー アベニュ ー 1313 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA11 AA17 CA01 CA09 CA10 CA11 HA12 HA14 HA19 4B063 QA01 QA12 QA17 QA18 QA19 QQ42 QR20 QR38 QR56 QR80 QR82 QS24 QS25 QS34 QX02

Claims (153)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において、
    一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる一つ又は複数
    の多数の配列を同定する方法： 多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性
    のある試料を提供する段階； 特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配
    列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合には相互ライゲーションに適し
    ているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされ
    る場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有するような、各
    セットが（ａ）標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第
    一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）標的特異的部分及び検出可能な
    レポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ
    る、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階； リガーゼを提供する段階； 混合物を形成するために、試料、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、
    及びリガーゼを混合する段階； オリゴヌクレオチドプローブセットは、それらの各々の標的ヌクレオチド配列
    以外の試料中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるが、一つ又は複数のミ
    スマッチの存在のために相互ライゲーションせず、変性処理時に個別に分離され
    るような、試料中に存在し、（ａ）位置特定可能なアレイ特異的部分、（ｂ）互
    いに結合した標的特異的部分、及び（ｃ）検出可能なレポーター標識を含むライ
    ゲーション産物配列を作製するために互いにライゲーションする場合には、任意
    のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離さ
    れる変性処理、及びオリゴヌクレオチドプローブセットを塩基特異的方法で隣接
    位置でそれらの各々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるハイブリダ
    イゼーション処理を含む、一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに混合物を
    供する段階； 捕獲用オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌク
    レオチド配列を有する、多孔質表面および、特定部位に固定された種々の捕獲用
    オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を提供する段階； 前述の供する段階後、塩基特異的方法で位置特定可能なアレイ特異的部分が捕
    獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに効果的な条件下で、混合物を
    固体支持体と接触させ、これにより位置特定可能なアレイ特異的部分を相補的捕
    獲用オリゴヌクレオチドにより固体支持体上の部位で捕獲する段階；並びに 固体支持体に特定部位で捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標識
    を検出し、これにより試料中に一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列が存在する
    ことを示す段階。
  2. 【請求項２】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション
    接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに
    適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意
    の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、このようなライゲー
    ションを妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 ミスマッチがライゲーション接合部の３’側塩基である、請
    求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション
    接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに
    適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意
    の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、このようなライゲー
    ションを妨害するライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にミスマッチが存
    在する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 ミスマッチがライゲーション接合部の３’側塩基に隣接した
    塩基である、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 試料が、多数の配列差異を伴う一つ又は複数の多数の標的配
    列を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項１記載の方法
    ： 前述の検出後に、既知量の標的ヌクレオチド配列により試料から作製された捕
    獲されたライゲーション産物配列の検量線を用いて、試料から作製された捕獲さ
    れたライゲーション産物配列の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオ
    チド配列の量を定量する段階。
  7. 【請求項７】 試料が、多数の配列差異を伴う一つ又は複数の多数の標的ヌ
    クレオチド配列を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項
    １記載の方法： 既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階； 特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイ
    ブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する
    任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされ
    る場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在し、混合物を
    生成するために、混合が、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴ
    ヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプロー
    ブセット、及びリガーゼの混合を含むような、各セットが、（ａ）固体支持体上
    にマーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び捕獲用オリゴヌ
    クレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌ
    クレオチドプローブ、並びに（ｂ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標
    的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチド
    プローブにより特徴付けられる、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプロ
    ーブセットを提供する段階； 固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オ
    リゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又
    は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階；並びに 既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から作製された捕獲されたライゲーシ
    ョン産物の量と、捕獲された他のライゲーション産物の量とを比較することによ
    り、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。
  8. 【請求項８】 一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、試料中の
    標的ヌクレオチド配列と、一つ又は複数の単ヌクレオチド部位で異なる、請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】 各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を
    識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットか
    らなる、オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオ
    チドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群のオ
    リゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプローブ
    は、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、
    塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダ
    イズする異なる標的特異的部分を有する、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異
    を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
    からなる、オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレ
    オチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群の
    オリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプロー
    ブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは
    、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリ
    ダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 試料が、多数の配列差異を伴う２種以上の多数の標的ヌク
    レオチド配列を未知量含む可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項１記載
    の方法： 検出後に、試料中の各々の多数の標的配列により作製された捕獲されたライゲ
    ーション産物配列の相対量を比較することにより、試料中の各々の多数の標的ヌ
    クレオチド配列の相対量を定量し、これにより試料中の２種以上の標的ヌクレオ
    チド配列の相対レベルの定量的測定を提供する段階。
  12. 【請求項１２】 複数の標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接するヌ
    クレオチド部位での、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要と
    するヌクレオチド部位での単独の標的ヌクレオチド配列中又は複数の対立遺伝子
    の差異内の、２種以上の隣接するヌクレオチド部位での又は重複するオリゴヌク
    レオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位における複数の対立遺伝
    子の差異が、重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有す
    るオリゴヌクレオチドプローブセットで識別される、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、
    実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらが同様のハイブリダイゼーション
    条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 単独の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオ
    チド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ
    又は複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプロ
    ーブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌク
    レオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複
    数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリゴヌクレオチド
    プローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分
    を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立
    遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、
    固体支持体上に異なる部位で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識
    が検出され、これにより、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複
    数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の試料中の存在を示すよう
    な、請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲ
    ーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互い
    に隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲー
    ションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブ
    リダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブは、このようなライ
    ゲーションを妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求
    項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 複数の標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接するヌ
    クレオチド部位での、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要と
    するヌクレオチド部位での単独の標的ヌクレオチド配列中又は複数の対立遺伝子
    の差異内の、２種以上の隣接するヌクレオチド部位での又は重複するオリゴヌク
    レオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位における複数の対立遺伝
    子の差異が、重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有す
    るオリゴヌクレオチドプローブ群で識別される、請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接
    してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーション
    に適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任
    意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、このようなライゲ
    ーションを妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチが存在する、請求
    項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 単独の標的ヌクレオチド配列中に重複するオリゴヌクレオ
    チドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠
    失、マイクロサテライト反復、転座、又は他のＤＮＡ再編成からなる複数の対立
    遺伝子差異、もしくは複数の標的ヌクレオチド配列中に重複するオリゴヌクレオ
    チドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠
    失、マイクロサテライト反復、転座、又は他のＤＮＡ再編成からなる複数の対立
    遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌク
    レオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチドプローブセ
    ットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサ
    テライト反復、転座、及び他のＤＮＡ再編成からなる群より選択される複数の対
    立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプ
    ローブセットで構成され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、
    第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一の
    オリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子と塩基特異的方法でハイブリダ
    イズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上の異な
    る位置で捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これによ
    り試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における挿入、欠失、マイク
    ロサテライト反復、転座、及び他のＤＮＡ再編成からなる群より選択される一つ
    又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌ
    クレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿
    入、欠失、マイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺伝子
    差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにお
    いて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ
    第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子に塩基特異的方法でハイ
    ブリダイズする異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請
    求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 正常配列の過剰な存在下での、単独の標的ヌクレオチド配
    列中の、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは、重複するオリゴヌク
    レオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子
    差異の低い存在比、又は正常配列の過剰な存在下での、複数の標的ヌクレオチド
    配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌク
    レオチド部位での、複数の対立遺伝子差異の低い存在比が識別され、これらのオ
    リゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成
    し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するため
    に設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、群
    内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有
    し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正常な対立遺
    伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し
    、検出において、固体支持体上の異なる位置で捕獲された各群のライゲーション
    産物配列の標識が検出され、これにより、試料中における、一つ又は複数の標的
    ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の低い
    存在比の対立遺伝子の存在を示す、請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣
    接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーシ
    ョンに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中の任意の
    他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオ
    チドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション接合部の
    塩基にミスマッチを有する、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 正常配列の過剰な存在下での、単独の標的ヌクレオチド配
    列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、又は重複するオリゴヌクレ
    オチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異
    の低い存在比、又は正常配列の過剰な存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列
    における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌク
    レオチド部位での複数の対立遺伝子差異の低い存在比が、試料中で定量される方
    法であり、以下の段階を更に含む、請求項２０記載の方法： 既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階； 各セットが、（ａ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分
    及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプロー
    ブ、並びに（ｂ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び
    検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特
    徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレ
    オチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接して
    ハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在
    する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズ
    される場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数
    のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階； 各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数
    の対立遺伝子差異を識別するために設計された、一つ又は複数のオリゴヌクレオ
    チドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットで構
    成され、群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正
    常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列とハイブ
    リダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、混合は、試料、マーカー標
    的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカ
    ー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合し、混合物を
    生成することを含むような、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段
    階； 固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オ
    リゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又
    は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階；並びに 既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列により作製された捕獲されたライゲ
    ーション産物の量を、低い存在比の未知の試料から作製された他の捕獲されたラ
    イゲーション産物の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の
    量を定量する段階。
  23. 【請求項２３】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、選択された条
    件下で、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド
    配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合はライゲーション接合
    部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場
    合には第一のオリゴヌクレオチドプローブがこのようなライゲーションを妨害す
    るライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 単独の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオ
    チド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ
    又は複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオ
    チドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌ
    クレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は
    複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリゴヌクレオチ
    ドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分
    を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対
    立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において
    、固体支持体上の特定部位で捕獲された各群のライゲーション産物配列の異なる
    レポーター標識が検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチ
    ド配列における一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子
    の存在を示す、請求項１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーション
    に適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する
    任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌ
    クレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション接
    合部の塩基にミスマッチを有する、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 単独の標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接するヌ
    クレオチド部位で、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とす
    るヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、もしくは複数の標的ヌクレオチ
    ド配列中の、２個以上の隣接するヌクレオチド部位で、又は重複するオリゴヌク
    レオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差
    異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特
    異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接す
    るようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位で相互ライゲー
    ションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存
    在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオ
    リゴヌクレオチドプローブが、このようなライゲーションを妨害するライゲーシ
    ョン接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 単独の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオ
    チド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ
    又は複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオ
    チドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での
    複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレ
    オチドプローブセットで構成され、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブ中で
    、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有するか、も
    しくは第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、上
    記検出において、固体支持体上に特定部位で捕獲された各群の多数の標識された
    ライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより試料中の一つ又は複数
    の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の
    対立遺伝子の存在を示す、請求項１記載の方法。
  29. 【請求項２９】 所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲ
    ーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに
    隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲー
    ションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任
    意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオ
    リゴヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーシ
    ョン接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接する
    ヌクレオチド部位で、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要と
    するヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、もしくは、複数の標的ヌク
    レオチド配列中の、２個以上の隣接するヌクレオチド部位で、又は重複するオリ
    ゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立
    遺伝子差異を識別し、これらのオリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特
    異的部分のプローブを含む、請求項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーション
    に適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他
    のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌ
    クレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション接
    合部の塩基にミスマッチを有する、請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての
    全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンに
    ついての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の複
    数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、これらのオリゴ
    ヌクレオチドセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が
    、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するために設計さ
    れた一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリ
    ゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それ
    らのライゲーション接合部でそれらの５’側塩基のみが異なり、かつ異なるレポ
    ーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーシ
    ョン接合部でそれらの３’側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレ
    イ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーシ
    ョン接合部の塩基に隣接するそれらの３’側塩基のみが異なり、かつ異なる位置
    特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項２９記載の方法。
  33. 【請求項３３】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーション
    に適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他
    のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチ
    ドプローブは、ライゲーション接合部の３’側塩基又はライゲーション接合部の
    この塩基に隣接する塩基にミスマッチを有し、もしくは第二のオリゴヌクレオチ
    ドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション接合部の５
    ’側塩基にミスマッチを有する、請求項２９記載の方法。
  34. 【請求項３４】 単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての
    全ての可能な単塩基突然変異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の２種以上の
    隣接するコドンについての、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセッ
    トを必要とするヌクレオチド部位での全ての可能な単塩基突然変異が識別され、
    これらのオリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴う
    オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 変性処理が約８０℃〜１０５℃で行われる、請求項１記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイク
    ルが、約３０秒から約５分間の長さである、請求項１記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記供する段階が２サイクルから５０サイクル繰り返され
    る、請求項１記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記供する段階の総時間が１分から２５０分間である、請
    求項１記載の方法。
  39. 【請求項３９】 リガーゼが、サーマスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
    ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ、サーマスサーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔ
    ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リガーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ、Ｔ４リ
    ガーゼ、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種ＡＫ１６リガーゼ、アキフェクスエオリ
    クス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）リガーゼ、サーモトガマリチマ（Ｔ
    ｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）リガーゼ、及びピロコッカス（Ｐｙｒ
    ｏｃｏｃｃｕｓ）リガーゼからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  40. 【請求項４０】 検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素、
    抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、及
    び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  41. 【請求項４１】 オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々、
    ４０℃〜８５℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項１記載の方法。
  42. 【請求項４２】 オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、２０
    ヌクレオチド長から２８ヌクレオチド長を有する、請求項１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 混合物が更に担体ＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセ
    ットについて、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのためのオリゴヌクレ
    オチドプローブが、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのためのマッチし
    たライゲーション産物配列の生成速度の０．００５未満であるような、ライゲー
    ションされた部位でミスマッチされたライゲーション産物配列の生成速度を実現
    する、請求項１記載の方法。
  45. 【請求項４５】 以下の段階を更に含む、請求項１記載の方法： 混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。
  46. 【請求項４６】 前記増幅が、試料のポリメラーゼに基づく増幅法へ供する
    ことにより実施される、請求項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、ＤＮＡポリメラーゼ
    により実施される、請求項４５記載の方法。
  48. 【請求項４８】 固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、
    ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で
    製造されている、請求項１記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記検出が、以下の段階を含む、請求項１記載の方法： 特定部位で固体支持体をスキャニングし、かつオリゴヌクレオチドプローブセ
    ットのライゲーションが生じたかどうかを確定する段階；及び 確定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付ける段階
    。
  50. 【請求項５０】 多数の捕獲用オリゴヌクレオチドは各々、異なるヌクレオ
    チド配列を有する、請求項１記載の方法。
  51. 【請求項５１】 オリゴヌクレオチドが内部挿入又は欠失を伴わずに１端で
    互いに並置された場合に、各捕獲用オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド総数の
    ４個毎に少なくとも１個でアレイ上のその隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドと
    異なる、請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴヌ
    クレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが接
    触時にそれにハイブリダイズされないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔て
    られた隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項５０記載の方法。
  53. 【請求項５３】 オリゴヌクレオチドプローブセットを、標的ヌクレオチド
    配列に、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置
    特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度でハイブ
    リダイズする、請求項１記載の方法。
  54. 【請求項５４】 以下の段階を更に含む、請求項１記載の方法： 混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵
    素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊す
    る段階。
  55. 【請求項５５】 前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求項
    ５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 以下の段階を更に含む、請求項１記載の方法： 捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定され
    た捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。
  57. 【請求項５７】 固体支持体が、異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に
    相補的である異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う様々な部位で固定された異
    なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、これにより異なるオリゴヌクレオチドプ
    ローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請求項
    １記載の方法。
  58. 【請求項５８】 固体支持体が、全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に
    相補的である捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体上に固定された同一の
    捕獲用オリゴヌクレオチド、及び異なってオリゴヌクレオチドプローブセットに
    結合される標識を含み、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが
    異なる標識により検出されかつ識別される、請求項１記載の方法。
  59. 【請求項５９】 多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、
    アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリ
    マーである、請求項１記載の方法。
  60. 【請求項６０】 機能性モノマーがアクリル酸である、請求項５９記載の方
    法。
  61. 【請求項６１】 機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、
    請求項５９記載の方法。
  62. 【請求項６２】 親水性ポリマーが、５０：１未満のレベルで架橋される、
    請求項５９記載の方法。
  63. 【請求項６３】 親水性ポリマーが、５００：１未満のレベルで架橋される
    、請求項６２記載の方法。
  64. 【請求項６４】 以下を含む、固体支持体上のオリゴヌクレオチドアレイ： 多孔質表面及び各々オリゴヌクレオチド結合に適した位置のアレイを有する、
    固体支持体； 各アレイ位置で固体支持体に結合した、固体支持体へのオリゴヌクレオチドの
    カップリングに適したリンカー又は支持体；及び １６個のヌクレオチドより大きいオリゴヌクレオチドで占有されるアレイ位置
    の少なくとも一部を伴う固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ。
  65. 【請求項６５】 異なるオリゴヌクレオチドが、固体支持体上の異なるアレ
    イ位置で結合され、異なる核酸を検出する、請求項６４記載のアレイ。
  66. 【請求項６６】 固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、
    ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で
    製造された、請求項６４記載のアレイ。
  67. 【請求項６７】 固体支持体が、アレイ位置に結合したオリゴヌクレオチド
    を伴うアレイ位置を有する、請求項６４記載のアレイ。
  68. 【請求項６８】 多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、
    アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリ
    マーである、請求項６４記載のアレイ。
  69. 【請求項６９】 機能性モノマーがアクリル酸である、請求項６８記載のア
    レイ。
  70. 【請求項７０】 機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、
    請求項６８記載のアレイ。
  71. 【請求項７１】 親水性ポリマーが、５０：１未満のレベルで架橋される、
    請求項６８記載のアレイ。
  72. 【請求項７２】 親水性ポリマーが、５００：１未満のレベルで架橋される
    、請求項６８記載のアレイ。
  73. 【請求項７３】 以下を備える、多数の標的ヌクレオチド配列中の単塩基の
    変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列の１種以上を同定するキ
    ット： リガーゼ； 各々（ａ）標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する
    第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）標的配列特異的部分及び検出
    可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブで特徴付けら
    れ、ここで特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレ
    オチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーション
    に適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイ
    ズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有するよう
    な、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット；並びに 捕獲用オリゴヌクレオチドが、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であ
    るヌクレオチド配列を有するような、多孔質表面及び特定部位で固定された捕獲
    用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体。
  74. 【請求項７４】 リガーゼが、サーマスアクアティカスリガーゼ、サーマス
    サーモフィラスリガーゼ、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、サーマス種ＡＫ１６
    リガーゼ、アキフェクスエオリクスリガーゼ、サーモトガマリチマリガーゼ、及
    びピロコッカスリガーゼからなる群より選択される、請求項７３記載のキット。
  75. 【請求項７５】 以下を更に備える、請求項７３記載のキット： 標的ヌクレオチド配列の一次増幅に適した、増幅プライマー；及び ポリメラーゼ。
  76. 【請求項７６】 固体支持体が、異なる位置特定可能なアレイ特異的部分と
    相補的である異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う、様々な特定部位に固定さ
    れた異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、これにより異なるオリゴヌクレオ
    チドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位にハイブリダイズされかつ検
    出される、請求項７３記載のキット。
  77. 【請求項７７】 固体支持体が、全ての位置特定可能なアレイ特異的部分と
    相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体上に固定された同一の捕獲
    用オリゴヌクレオチド、及び異なってオリゴヌクレオチドプローブセットに結合
    される標識を含み、これによりオリゴヌクレオチドプローブセットが、異なる標
    識により検出されかつ識別される、請求項７３記載のキット。
  78. 【請求項７８】 オリゴヌクレオチドプローブセット及び捕獲用オリゴヌク
    レオチドが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの
    位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、
    オリゴヌクレオチドプローブセットが各標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズ
    するように配置された、請求項７３記載のキット。
  79. 【請求項７９】 以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において
    一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列
    の１種以上を同定する方法： 多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含む可能性があ
    る試料を提供する段階； 各セットは、（ａ）標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有
    する第一のオリゴヌクレオチド、並びに（ｂ）標的特異的部分及び検出可能なレ
    ポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、
    特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配
    列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適して
    いるが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる
    場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有するような、多数
    のオリゴヌクレオチドプローブを提供する段階； リガーゼを提供する段階； 試料を、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼと混合し、
    混合物を形成する段階； 混合物を、試料中に存在するならば、いずれかハイブリダイズしたオリゴヌク
    レオチドが、標的ヌクレオチド配列から隔離されている変性処理、及びオリゴヌ
    クレオチドプローブセットが、隣接する位置で塩基特異的方法で、それらの各々
    の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするようなハイブリダイゼーション処
    理を含む一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに供され、かつ（ａ）位置特
    定可能なアレイ特異的部分、（ｂ）互いにライゲーションされた標的特異的部分
    、及び（ｃ）検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物配列を作製す
    るために互いにライゲーションされ、かつここにおいてオリゴヌクレオチドプロ
    ーブセットは、それらの各々の標的ヌクレオチド配列を除いて、試料中のヌクレ
    オチド配列にハイブリダイズすることができるが、一つ又は複数のミスマッチの
    存在のために互いにはライゲーションせず、かつ変性処理時に個別に分離される
    段階； 捕獲用オリゴヌクレオチドが、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補
    的なヌクレオチド配列を含む、特定部位に固定された異なる捕獲用オリゴヌクレ
    オチドを伴う固体支持体を提供する段階； 前述の供する段階の後に、混合物を、負荷電を遮蔽しかつ塩基特異的方法で捕
    獲用オリゴヌクレオチドに対し位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイ
    ズするのに有効な条件下で、固体支持体と接触させ、これにより、固体支持体上
    の相補的捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う位置で位置特定可能なアレイ特異的部
    分を捕獲する段階；並びに 固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標
    識を検出し、これにより、試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列の存在
    を示す段階。
  80. 【請求項８０】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーション
    に適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他
    のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、このようなライゲーショ
    ンを妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項７９記
    載の方法。
  81. 【請求項８１】 ミスマッチが、ライゲーション接合部の３’側塩基にある
    、請求項８０記載の方法。
  82. 【請求項８２】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーション
    に適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他
    のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、このようなライゲーショ
    ンを妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項８０記
    載の方法。
  83. 【請求項８３】 ミスマッチが、ライゲーション接合部の３’側塩基にある
    、請求項８２記載の方法。
  84. 【請求項８４】 試料が、多数の配列差異を伴う一つ又は複数の多数の標的
    配列を未知量潜在的に含み、以下の段階を更に含む、請求項７９記載の方法： 試料中の標的ヌクレオチド配列の量を、検出後、試料から生成された捕獲され
    たライゲーション産物配列の量を、標的ヌクレオチド配列の既知量を伴う試料か
    ら作製された捕獲されたライゲーション産物配列の検量線と比較することにより
    、定量する段階。
  85. 【請求項８５】 試料が、多数の配列差異を伴う一つ又は複数の多数の標的
    配列を未知量潜在的に含み、以下の段階を更に含む、請求項７９記載の方法： 既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階； 各セットが、（ａ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分
    及び固体支持体上の捕獲用オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ
    特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）マーカー
    標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識
    を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、これらの特定
    のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが
    、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズさ
    れる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌ
    クレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこ
    のようなライゲーションを妨害するミスマッチを有し、上記混合が、試料、マー
    カー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数の
    マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合し、混
    合物を生成する段階を含む、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブ
    セットを提供する段階； 固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オ
    リゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又
    は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階；並びに 試料中の標的ヌクレオチド配列の量を、既知量の標的ヌクレオチド配列から生
    成された捕獲されたライゲーション産物の量を、捕獲された他のライゲーション
    産物の量と比較することにより、定量する段階。
  86. 【請求項８６】 一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、一つ又
    は複数の単独のヌクレオチド部位で試料中の標的ヌクレオチド配列と異なる、請
    求項８５記載の方法。
  87. 【請求項８７】 オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オ
    リゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形
    成し、各群が、単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子差異を識別するよう
    に設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各
    群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプ
    ローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプロー
    ブが、塩基特異的方法で、所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハ
    イブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項８６記載の方法。
  88. 【請求項８８】 オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オ
    リゴヌクレオチドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形
    成し、各群が、単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子差異を識別するため
    に設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各
    群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプ
    ローブが、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプロー
    ブが、異なる標的特異的部分を有し、これが所定の対立遺伝子又はマーカーヌク
    レオチド配列に、塩基特異的方法でハイブリダイズする、請求項８６記載の方法
    。
  89. 【請求項８９】 試料が、多数の配列差異を伴う未知量の２種以上の多数の
    標的ヌクレオチド配列を潜在的に含み、以下の段階を更に含む、請求項７９記載
    の方法： 試料中の各々の多数の標的ヌクレオチド配列の相対量を、検出後、試料中の各
    々の多数の標的配列により形成された捕獲されたライゲーション産物配列の相対
    量を比較することにより定量し、これにより試料中の２種以上の標的ヌクレオチ
    ド配列の相対レベルの定量的測定を提供する段階。
  90. 【請求項９０】 単独の標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接するヌ
    クレオチド部位での、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要と
    するヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、もしくは、複数の標的ヌク
    レオチド配列中の、２個以上の隣接するヌクレオチド部位での、又は重複するオ
    リゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対
    立遺伝子差異を、重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを
    有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項７９記載の方法。
  91. 【請求項９１】 オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、
    実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらは標的ヌクレオチド配列に同様の
    ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項７９記載の方法。
  92. 【請求項９２】 単独の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオ
    チド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ
    又は複数の位置での複数の対立遺伝子差異を識別し、これらのオリゴヌクレオチ
    ドプローブセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、
    単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された
    一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリゴヌ
    クレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的
    特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で
    所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出
    において、異なる部位で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配
    列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配
    列において一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存
    在を示す、請求項７９記載の方法。
  93. 【請求項９３】 所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲ
    ーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに
    隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部で相互ライゲーシ
    ョンに適しているが、試料中の任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズさ
    れる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブが、このようなライゲーショ
    ンを妨害するライゲーション接合部での塩基のミスマッチを有する、請求項９２
    記載の方法。
  94. 【請求項９４】 単独の標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接するヌ
    クレオチド部位での、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要と
    するヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド
    配列中の、２個以上の隣接するヌクレオチド部位での、又は重複するオリゴヌク
    レオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差
    異が、重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリ
    ゴヌクレオチドプローブ群で識別される、請求項９２記載の方法。
  95. 【請求項９５】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し
    てハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部で相互ライゲーションに
    適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中の任意の他の
    ヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には、このようなライゲーション
    を妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項９４記載
    の方法。
  96. 【請求項９６】 単独の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオ
    チドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠
    失、マイクロサテライト反復、転座、又は他のＤＮＡ再編成からなる複数の対立
    遺伝子差異、もしくは複数の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオ
    チドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠
    失、マイクロサテライト反復、転座、又は他のＤＮＡ再編成からなる複数の対立
    遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドプローブセットが、多数の
    オリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチド
    プローブセットを必要としている一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠
    失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のＤＮＡ再編成からなる群より選択
    される複数の対立遺伝子差異を識別するように設計された一つ又は複数のオリゴ
    ヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセ
    ットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を
    有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺
    伝子とハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固
    体支持体上の異なる位置で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識が
    検出され、これにより、試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列におけ
    る挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、又は他のＤＮＡ再編成からなる
    群より選択される一つ又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項７９記載
    の方法。
  97. 【請求項９７】 オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌ
    クレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿
    入、欠失、及びマイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺
    伝子差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセット
    において、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、
    かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子
    にハイブリダイズするように、異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部
    分を有する、請求項７９記載の方法。
  98. 【請求項９８】 正常配列の過剰な存在下での、単独の標的ヌクレオチド配
    列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌ
    クレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝
    子差異の低い存在比、もしくは正常配列の過剰な存在下での、複数の標的ヌクレ
    オチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする
    複数のヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異の低い存在比が識別され、
    これらのオリゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプロー
    ブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識
    別するための設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構
    成され、群内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブを共有し、及び第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正
    常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的
    部分を有し、上記検出において、様々な位置で固体支持体上に捕獲された各群の
    ライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数
    の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の
    低い存在比の対立遺伝子の存在を示す、請求項７９記載の方法。
  99. 【請求項９９】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーショ
    ン接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣
    接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライ
    ゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中
    の任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴ
    ヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション
    接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項９８記載の方法。
  100. 【請求項１００】 正常配列の過剰な存在下での、単独の標的ヌクレオチド
    配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、又は重複するオリゴヌク
    レオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差
    異の低い存在比、もしくは正常配列の過剰な存在下での、複数の標的ヌクレオチ
    ド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数
    のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異の低い存在比が、試料中で定量さ
    れる方法であり、以下の段階を更に含む、請求項９９記載の方法： 既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階； 各セットが、（ａ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分
    及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプロー
    ブ、並びに（ｂ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び
    検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特
    徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のこれらのオリ
    ゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに
    隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料
    中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブ
    リダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有す
    る、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階； 各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数
    の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチ
    ドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットで構成
    され、ここで群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチド
    プローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法
    で、正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列と
    ハイブリダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、上記混合は、試料、
    マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多
    数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合し
    、混合物を形成することを含む、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供す
    る段階； 固体支持体上に特定部位で捕獲された、ライゲーションされたマーカー特異的
    オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ
    又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階；並びに 既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列により作製された捕獲されたライゲ
    ーション産物の量を、低い存在比の未知の試料から作製された他の捕獲されたラ
    イゲーション産物の量と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の
    量を定量する段階。
  101. 【請求項１０１】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーシ
    ョン接合部の完全な相補性により、選択された条件下で、対応する標的ヌクレオ
    チド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーショ
    ン接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチ
    ドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズ
    される場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブがこのようなライゲーショ
    ンを妨害するライゲーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項１００
    記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 単独の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレ
    オチド部位での複数の対立遺伝子差異、もしくは複数の標的ヌクレオチド配列中
    の一つ又は複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌ
    クレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単
    独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一
    つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリゴヌク
    レオチドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異
    的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、所定の対立遺伝子に
    塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出に
    おいて、特定部位で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の
    異なるレポーター標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌ
    クレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の対立遺伝
    子の存在を示す、請求項７９記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーシ
    ョン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接
    してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーショ
    ンに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在す
    る任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴ
    ヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション
    接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項１０２記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 単独の標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接する
    ヌクレオチド部位で、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要と
    するヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、もしくは複数の標的ヌクレオ
    チド配列中の、２個以上の隣接するヌクレオチド部位で、又は重複するオリゴヌ
    クレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子
    差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的
    特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１０２記載の方法
    。
  105. 【請求項１０５】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーシ
    ョン接合部の完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣
    接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位で相互ライ
    ゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中
    に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二
    のオリゴヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲ
    ーション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項１０４記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 単独の標的ヌクレオチド配列における一つ又は複数のヌ
    クレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列に
    おける一つ又は複数の位置での複数の対立遺伝子差異を識別し、オリゴヌクレオ
    チドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での
    複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレ
    オチドプローブセットで構成され、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブにお
    いて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有するか、
    もしくは第一のオリゴヌクレオチドプローブが、共通の標的特異的部分を有し、
    上記検出において、固体支持体上に特定の位置で捕獲された各群の多数の標識さ
    れたライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより、試料中の一つ又
    は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又
    は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項７９記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライ
    ゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互い
    に隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲ
    ーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する
    任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二の
    オリゴヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲー
    ション接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項１０６記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、２個以上の隣接す
    るヌクレオチド部位で、又は重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要
    とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、もしくは、複数の標的ヌ
    クレオチド配列中の、２個以上の隣接するヌクレオチド部位で、又は重複するオ
    リゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対
    立遺伝子差異を識別し、これらのオリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的
    特異的部分を伴うプローブを含む、請求項１０６記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーシ
    ョン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接
    してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーショ
    ンに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の
    他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴ
    ヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション
    接合部の塩基にミスマッチを有する、請求項１０８記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについて
    の全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドン
    についての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の
    複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、これらのオリ
    ゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が
    、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するように設計さ
    れた一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットで構成され、各群のオリ
    ゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それ
    らのライゲーション接合部でそれらの５’側塩基のみが異なり、かつ異なるレポ
    ーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーシ
    ョン接合部でそれらの３’側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレ
    イ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーシ
    ョン接合部の塩基に隣接するそれらの３’側塩基のみが異なり、かつ異なる位置
    特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項１０７記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーシ
    ョン接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接
    してハイブリダイズされる場合に、ライゲーション接合部での相互ライゲーショ
    ンに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の
    他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオ
    チドプローブは、ライゲーション接合部の３’側塩基に又はライゲーション接合
    部のこの塩基に隣接する３’側塩基にミスマッチを有し、もしくは第二のオリゴ
    ヌクレオチドプローブは、このようなライゲーションを妨害するライゲーション
    接合部の５’側塩基にミスマッチを有する、請求項１０７記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについて
    の全ての可能な単塩基突然変異、又は２種以上の隣接するコドンについての全て
    の可能な、もしくは複数の標的ヌクレオチド配列中の重複するオリゴヌクレオチ
    ドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での単塩基突然変異が識別され
    、これらのオリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴
    うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１１１記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 変性処理が約８０〜１０５℃で行われる、請求項７９記
    載の方法。
  114. 【請求項１１４】 変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイ
    クルが、約３０秒〜約５分間の長さである、請求項７９記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 前記供する段階が２サイクルから５０サイクル繰り返さ
    れる、請求項７９記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 前記供する段階の総時間が１分から２５０分間である、
    請求項７９記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 リガーゼが、サーマスアクアティカスリガーゼ、サーマ
    スサーモフィラス リガーゼ、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、サーマス種ＡＫ
    １６リガーゼ、アキフェクスエオリクスリガーゼ、サーモトガマリチマリガーゼ
    、及びピロコッカスリガーゼからなる群より選択される、請求項７９記載の方法
    。
  118. 【請求項１１８】 検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素
    、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、
    及び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項７９記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々
    、４０℃〜８５℃のハイブリダイゼーション温度を有する、請求項７９記載の方
    法。
  120. 【請求項１２０】 オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、２０
    ヌクレオチド長から２８ヌクレオチド長を有する、請求項７９記載の方法。
  121. 【請求項１２１】 混合物が担体ＤＮＡを更に含む、請求項７９記載の方法
    。
  122. 【請求項１２２】 特定のオリゴヌクレオチドプローブセットについて、前
    記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのためのオリゴヌク
    レオチドプローブが、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのための一致し
    たライゲーション産物配列の形成速度の０．００５未満であるようにライゲーシ
    ョンされた部位でミスマッチされたライゲーション産物配列の形成速度を達成す
    る、請求項７９記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 以下の段階を更に含む、請求項７９記載の方法： 混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。
  124. 【請求項１２４】 前記増幅が、ポリメラーゼに基づく増幅法への試料を供
    することにより実施される、請求項１２３記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、ＤＮＡポリメラー
    ゼにより実施される、請求項１２３記載の方法。
  126. 【請求項１２６】 固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂
    、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料
    から製造される、請求項７９記載の方法。
  127. 【請求項１２７】 前記検出が、以下の段階を含む、請求項７９記載の方法
    ： 特定部位で固体支持体をスキャンする段階；及び オリゴヌクレオチドプローブセットのライゲーションが生じたかどうかを確定
    し、かつ同定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付け
    る段階。
  128. 【請求項１２８】 多数の捕獲用オリゴヌクレオチドが各々、異なるヌクレ
    オチド配列を有する、請求項７９記載の方法。
  129. 【請求項１２９】 オリゴヌクレオチドが内部挿入又は欠失を伴わずに１端
    で互いに並置された場合に、各捕獲用オリゴヌクレオチドが、アレイ上のその隣
    接する捕獲用オリゴヌクレオチドと、ヌクレオチド総数の４個毎に少なくとも１
    個異なる、請求項１２８記載の方法。
  130. 【請求項１３０】 各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴ
    ヌクレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが
    接触時にそれにハイブリダイズされないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔
    てられた隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項１２８記載の方法
    。
  131. 【請求項１３１】 オリゴヌクレオチドプローブセットを、標的ヌクレオチ
    ド配列に、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位
    置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度より低い温度でハイブ
    リダイズする、請求項７９記載の方法。
  132. 【請求項１３２】 以下の段階を更に含む、請求項７９記載の方法： 混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵
    素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊す
    る段階。
  133. 【請求項１３３】 前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求
    項１３２記載の方法。
  134. 【請求項１３４】 以下の段階を更に含む、請求項７９記載の方法： 捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定され
    た捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。
  135. 【請求項１３５】 固体支持体が、異なる位置特定可能なアレイ特異的部分
    に相補的である異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う、様々な部位に固定され
    た異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、これにより異なるオリゴヌクレオチ
    ドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請
    求項７９記載の方法。
  136. 【請求項１３６】 固体支持体が、全ての位置特定可能なアレイ特異的部分
    に相補的である捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体上に固定された同一
    の捕獲用オリゴヌクレオチド、及び異なってオリゴヌクレオチドプローブセット
    に結合される標識を含み、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセット
    が異なる標識により検出されかつ識別される、請求項７９記載の方法。
  137. 【請求項１３７】 負電荷を遮蔽するのに有用な条件が、接触を二価のカチ
    オン含有化合物の課存在下で実施することに関連する、請求項７９記載の方法。
  138. 【請求項１３８】 二価のカチオンが、Ｍｇ＋２、Ｃａ＋２、Ｍｎ＋２及び
    ＣＯ＋２からなる群より選択される、請求項１３７記載の方法。
  139. 【請求項１３９】 二価のカチオンがＭｇ＋２である、請求項１３８記載の
    方法。
  140. 【請求項１４０】 負荷電を遮蔽するのに有効な条件が、接触においてその
    ｐＨが６．０であるか又はそれ以下である、請求項７９記載の方法。
  141. 【請求項１４１】 負電荷を遮蔽するのに有効な条件が、中和剤による遊離
    カルボン酸基のキャッピングに関連する、請求項７９記載の方法。
  142. 【請求項１４２】 中和剤が、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プ
    ロパノールアミン、ジプロパノールアミン、イソプロパノールアミン、及びジイ
    ソプロパノールアミンからなる群より選択される、請求項１４１記載の方法。
  143. 【請求項１４３】 中和剤がエタノールアミンである、請求項１４２記載の
    方法。
  144. 【請求項１４４】 前記接触が、固体支持体の存在下での混合物の混合によ
    り実施される、請求項７９記載の方法。
  145. 【請求項１４５】 位置特定可能なアレイ特異的部分が、接触時に、温度６
    ０℃から７０℃で、捕獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項
    ７９記載の方法。
  146. 【請求項１４６】 前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチ
    ドプローブに対する比が１：３００未満であるライゲーション産物の存在を示す
    、請求項７９記載の方法。
  147. 【請求項１４７】 前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチ
    ドプローブに対する比が１：９００未満であるライゲーション産物の存在を示す
    、請求項１４６記載の方法。
  148. 【請求項１４８】 前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチ
    ドプローブに対する比が１：３０００未満であるライゲーション産物の存在を示
    す、請求項１４７記載の方法。
  149. 【請求項１４９】 前記検出が、ライゲーションされないオリゴヌクレオチ
    ドプローブに対する比が１：９０００未満であるライゲーション産物の存在を示
    す、請求項１４８記載の方法。
  150. 【請求項１５０】 前記検出が、非標的ヌクレオチド配列と１個の塩基差異
    で異なる標的ヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド
    配列に対する比が１：２０未満で存在することを示す、請求項７９記載の方法。
  151. 【請求項１５１】 前記検出が、非標的ヌクレオチド配列と１個の塩基差異
    で異なる標的ヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド
    配列に対する比が１：５０未満で存在することを示す、請求項１５０記載の方法
    。
  152. 【請求項１５２】 前記検出が、非標的ヌクレオチド配列と１個の塩基差異
    で異なる標的ヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド
    配列に対する比が１：１００未満で存在することを示す、請求項１５１記載の方
    法。
  153. 【請求項１５３】 前記検出が、非標的ヌクレオチド配列と１個の塩基差異
    で異なる標的ヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド
    配列に対する比が１：２００未満で存在することを示す、請求項１５２記載の方
    法。
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