JP2005201901A - 表面に活性化されたカルボキシル基を有する固体基板を利用して生体分子を前記固体基板上に高密度で固定化する方法及びそれによって製造されるマイクロアレイ - Google Patents

Abstract

【課題】 表面に活性化されたカルボキシル基を有する固体基板を利用して生体分子を前記固体基板上に高密度で固定化する方法及びそれにより製造されるマイクロアレイを提供する。
【解決手段】 固体支持体をシラン無水物でコーティングして前記固体支持体表面に無水物官能基を導入する段階と、前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は生体分子をマイクロアレイ用基板に固定する方法及びそれによって製造されるマイクロアレイに関する。

マイクロアレイは、特定分子が基板上に一定の領域に高密度で固定化されたものを称する。このようなマイクロアレイには、例えば、ポリヌクレオチドまたは蛋白質マイクロアレイが公知である。マイクロアレイについては、例えば、特許文献１及び２に開示されている。また、前記マイクロアレイの製造方法には、一般的にフォトリソグラフィを利用する方法が知られている。フォトリソグラフィを利用する場合、除去可能な保護基を有する単量体が塗布された基板表面の一定領域をエネルギー源に露出させて保護基を除去し、除去可能な基で保護された単量体をカップリングさせる段階を反復することによって、ポリヌクレオチドのマイクロアレイを製造できる。さらに他の方法では、既に合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させる方法などがある。既に合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させる方法としては、例えば、スポッティング法、インクジェットプリンタのような圧電印刷方式、及びマイクロピペッティング法などが利用されうる。一般的に、既に合成された生体分子を基板上に固定化する方式が、生体分子を自由に配列できるという長所があるため、広く使われている。

ガラスやプラスチックのような基板自体の表面に生体分子を固定化することは一般的に難しく、既に合成された生体分子を固体基板上に固定化するために、基板表面は特定の官能基を有するように処理される。このような官能基の例には、例えば、アミノ基、アルデヒド基、エポキシド、及びエステル基が挙げられる。

固体基板を官能基でコーディングし、ここに活性化された生体分子を固定化する方法は、公知のものである。例えば、特許文献３には、へパリンまたはラミニンのようなカルボキシル基を有している蛋白質のカルボキシル基をカルボジイミドで活性化させ、これをアミノ基でコーディングされた固体基板と反応させて固定化する方式が開示されている。また、特許文献４には、アミノ基でコーディングされたガラス基板にリン酸イミダゾリドによって活性化されたポリヌクレオチドを基板に固定化する方法が開示されている。しかし、これらの方法は何れもアミノ基でコーディングされた基板を使用しているため、生体分子を活性化しなければならないという短所がある。

また、特許文献５には、既にカルボキシル基を有しているプラスチックプレートを利用してポリヌクレオチドを固定化する方法が開示されている。例えば、カルボキシル基とアミノ基とを同時に有している“Ｓｕｍｉｌｏｎ”ＭＳ−３７９６Ｆ及びＭＳ−３６９６Ｆ（住友ベークライト社）が利用されうるということが開示されている。しかし、前記方法は、既にカルボキシル基を有しているプラスチックプレートを使用しているため、カルボキシル基の密度が適正でないか、または高くないという問題点がある。また、前記方法は、ポリヌクレオチドが固定化された支持体を利用してｃＤＮＡを合成する方法に関する。したがって、マイクロアレイのような標的生体分子に関する分析のために、蛍光度を測定する必要性が高くない。したがって、高密度のカルボキシル基を導入する必要性についても言及されていない。
米国特許第５,４４５,９３４号公報 米国特許第５,７４４,３０５号公報 米国特許第５,３５０,８００号公報 米国特許第５,７６０,１３０号公報 米国特許第５,６５６,４６２号公報

標的生体分子に対する分析結果から得られる蛍光度のより高い強度を得るために、マイクロアレイ用の基板上に生体分子をより高密度で固定化させることが所望されている。

本発明が解決しようとする目的は、活性化されたカルボキシル基を有する基板を利用して生体分子を基板上に高密度で固定化する方法を提供することである。

本発明が解決しようとする目的は、また、活性化されたカルボキシル基を有する基板を利用して生体分子を基板上に高密度で固定化する方法によって製造されるマイクロアレイを提供することである。

本発明者は上記課題に鑑み鋭意検討した結果、カルボン酸無水物を利用することによって、基板上に高密度で生体分子を固定化できることを見出し、本発明をするに至った。

すなわち、本発明の一態様は、固体支持体をシラン無水物でコーティングして前記固体支持体表面に無水物官能基を導入する段階と、前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法である。

また、本発明の他の一態様は、固体支持体をアミノシランでコーティングして前記固体支持体の表面にアミノ官能基を導入する段階と、前記アミノ官能基をテトラカルボキシル二無水物と反応させて、無水物官能基を固体支持体表面に導入する段階と、前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法である。

本発明の生体分子を固体支持体上に付着させる方法によれば、一つの無水物官能基に対して二つのカルボキシル基が生成されるため、生体分子を高密度で固体支持体上に固定化できる。

本発明のマイクロアレイによれば、生体分子が高密度で固定化されているため、マイクロアレイを利用した分析の結果、得られる蛍光度をより向上させることができる。

本発明は、固体支持体をアミノシランでコーティングして前記固体支持体の表面にアミノ官能基を導入する段階と、前記アミノ官能基をテトラカルボキシル二無水物と反応させて、無水物官能基を固体支持体表面に導入する段階と、前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法を提供する。

本発明の方法において、前記固体支持体は、特別に制限されず、透明または不透明なものでありうる。望ましくは、前記固体支持体は、環境的に安定的であるか、または耐化学性を有する物質である。望ましい固体支持体の例としては、ガラス、シリコンウェーハ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート及びポリウレタンからなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。

本発明の方法において、前記シラン無水物は、望ましくは、下記式（１）の構造式を有する。

（式中、Ｒ_１は、３価の直鎖または分岐の脂肪族基または芳香族基であり、望ましくは、Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝の脂肪族基であり、さらに望ましくは、Ｒ_１は、

であり、Ｒ’は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の置換または非置換のアルキレン基、アリーレン基、アリールアルキル基またはアルキルアリーレン基であり、Ｒ_２は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基または水素原子であり、それぞれのＲ_２は、同一または異なる。）
さらに望ましくは、前記シラン無水物は、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物であり、これはＧｅｌｅｓｔ社等から購入可能である。

本発明の方法において、前記固体支持体表面をシラン無水物でコーディングするには、シラン無水物を０.０１質量％ないし９０質量％で含む溶液を用いて行うのがよい。

前記溶液は、下記式（２）または式（３）で示されるシラン化合物をさらに含むのがよい。

（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、または水素原子であり、Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルコキシ基、ヒドロキシ基またはハロゲン原子であり、Ｒ_４は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、またはフッ素化炭化水素官能基であり、ｎは１〜１５の整数である。また、前記フッ素化炭化水素官能基は、望ましくは−ＣＦ_３を含むフッ素化炭化水素官能基である。）

（式中、Ｒ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、または水素原子である。また、前記Ｒ_５は、同一であっても異なっていてもよい。）
前記式３で示されるシラン化合物としては、１,２−ビス（トリエトキシシリル）エタンなどが好ましく挙げられる。

前記式２または式３で示される前記シラン化合物は、シラン無水物１００質量部に対して０ないし０.０１質量部で含まれうる。

コーティングに使われる前記溶液は、適当な溶媒に化学式１の化合物を混合することにより得られる。また、前記溶液には化学式２または化学式３で示されるシラン化合物がさらに混合されてもよい。前記シラン無水物と化学式２または３で示されるシラン化合物との質量比は、０.０１：９９.９９ないし１００：０が望ましい。また、合成されたシランオリゴマーの全組成は、質量比で０.０１ないし９０％になりうる。前記溶液に使われうる溶媒には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールのようなアルコール溶媒またはメチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルピロリドン（Ｎ−メチルピロリドン）またはこれらの混合物などが挙げられる。

本発明の方法において、前記シラン無水物のコーティングは、従来公知の方法を用いて行えばよい。例えば、ディップコーティング法（自己組織化単分子コーティング法）、スピン法、スプレイ法、及び化学気相蒸着法よりなる群から選択される少なくとも一種の方法によって行われうる。ディップコーティング法は、１分以上行えばよく、スピンコーティング法は、３００ｒｐｍないし２,５００ｒｐｍで行えばよい。このように形成されたシラン無水物コーティング層は、１００℃ないし３００℃ほどの温度で硬化させて３次元の網状構造層を形成させうる。

次に、本発明の方法において、前記シラン無水物の加水分解は、２０℃〜１００℃の水溶液を用いて行われうる。このような加水分解は、前記温度で酸性または中性の水などで１分以上処理し、窒素雰囲気下で乾燥させることによって行われうる。加水分解の結果、一つのシラン無水物から二つのカルボキシル基が生成されるため、高密度のカルボキシル基を有する基板が得られる。これにより、高密度の活性化されたカルボキシル基を形成でき、前記活性化されたカルボキシル基に生体分子を高密度で固定できる。例えば、従来から広く用いられている、表面にアミノ基を有する基板にコハク酸無水物を反応させれば一つのカルボキシル基が形成される。しかしながら、本発明の方法によれば、従来の表面にアミノ基を有する基板を利用する場合に比べて２倍ほど多くのカルボキシル基を形成することができる。従って、このような基板を用いたマイクロアレイを利用した分析で、蛍光度が強く検出されうる。

次に、本発明の方法において、カルボキシル基をカルボジイミドおよびコハク酸イミドと反応させる。

前記カルボジイミドは、望ましくは、下記式（４）で示される。

（式中、Ｒ_６は、アルキル基またはシクロアルキル基であり、Ｒ_７は、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノアルキル基またはシクロアルキルアミノ基でありうる。）
望ましくは、前記カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。前記ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩として用いてもよい。また、本発明の方法において、前記コハク酸イミドは、望ましくは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）である。

本発明の方法において、前記カルボジイミドおよび前記コハク酸イミドは、前記カルボジイミドおよびコハク酸イミドを、それぞれ２０ｍｍｏｌ／ｌ〜２００ｍｍｏｌ／ｌ含む溶液として用いられうる。前記溶液に用いられる溶媒は、特に制限されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールのようなアルコール溶媒またはメチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルピロリドン（Ｎ−メチルピロリドン）またはこれらの混合物などが挙げられる。反応時間は、特別に制限されないが、望ましくは３０分以上である。カルボジイミドまたはＮ−ヒドロキシコハク酸イミドなどの上述した化合物は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社などから購入可能である。

カルボキシル基とカルボジイミド及びコハク酸イミドとの反応は次のようなメカニズムによって生じると推定されるが、下記メカニズムに限定されるわけではない。まず、カルボジイミドによって基板表面のカルボキシル基は、アミノ基と反応できる不安定な中間体、すなわち、Ｏ−アシルイソウレアエステル結合（Ｏ−ａｃｙｌｉｓｏｕｒｅａ ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）を形成し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）または水溶性であるＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）によってさらに安定的なスクシンイミジルエステルを形成し、活性化されたカルボキシル基を有する基板になる。

本発明の方法において、固定化される生体分子は、活性化されたカルボキシル基に結合可能な官能基を有するものであれば特に制限なく用いられる。前記生体分子はアミノ基を有するものが望ましい。前記生体分子は、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または蛋白質などが望ましく挙げられる。

本発明によって製作された活性化されたカルボキシル基を有する基板に、１級アミノ基のような反応性官能基を有する生体分子を反応させれば、活性化されたカルボキシル基のエステル結合に作用してアミド結合を形成して生体分子が固定化される。このような固定化方式は、ハイブリダイゼーション過程で生じうる標的物質と基板との非特異的結合を大きく減らせるという長所がある。

図１は、本発明による表面に活性化されたカルボキシル基を有するマイクロアレイ用基板の製造方法の一例を表す反応式である。まず、固体支持体上にシラン無水物、すなわち、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＴＳＡ）をコーティングして、無水物官能基を固体支持体表面に導入する（ａ）。次いで、加水分解反応を行って、カルボキシル基を有する基板を製造し（ｂ）、これを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカルボジイミドならびにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及びＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）のようなコハク酸イミド化合物の存在下で反応させて、活性化されたカルボキシル基を有する基板を製造する（ｃ）。

本発明はまた、上述した活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体表面に生体分子を固定する方法によって生体分子を固定して製造されるマイクロアレイを提供する。このようなマイクロアレイは、従来一般的なマイクロアレイのように、生体分子が固定化されたスポット領域がアレイ状に配列されている。

生体分子を上述した活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体上に固定化する方法は、公知の方法が用いられる。例えば、接触式のスポッティング、インクジェットプリンタのような圧電印刷方式及びマイクロピペッティング法が利用されうる。

本発明はまた、固体支持体をアミノシランでコーティングして前記固体支持体の表面にアミノ官能基を導入する段階と、前記アミノ官能基をテトラカルボキシル二無水物と反応させて、無水物官能基を固体支持体表面に導入する段階と、前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法を提供する。

固体支持体としては、上記したのと同様のものが用いられる。

本発明の方法において、固体支持体をアミノシランでコーディングするには、アミノシラン化合物を０．０１質量％ないし９０質量％含む溶液を用いて行われるのが望ましい。

本発明の方法において、前記アミノシラン化合物は、下記式（５）または（６）で示される。

（式中、Ｒ_８は、酸素原子、窒素原子を含んでいてもよい、アルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基またはアルキルアリーレン基であり、Ｒ_９は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基または水素原子である。）
望ましくは、前記Ｒ_８はアルキレン基であり、前記Ｒ_９はアルキル基であり、さらに望ましくは、前記Ｒ_８はＣ_１〜Ｃ_４のアルキレン基であり、前記アルキル基はメチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。アミノシラン化合物の具体的な例には、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−アミノウンデシルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）アミン、Ｎ−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリエトキシシランなどが挙げられる。

本発明の方法において、固体支持体表面にアミノシランをコーティングする段階は、化学式（５）または（６）で示される１以上のアミノシラン化合物と、水、エタノール、及びメタノールのようなアルコール溶媒とを混合して溶液を調製し、この溶液を攪拌してアミノシラン化合物を縮合反応させてオリゴマー水和物を得る段階を含む。アミノシラン化合物でコーディングされた基板は、２００℃ないし３００℃ほどの温度で焼成過程を経て３次元の網状構造層を形成させうる。

また、本発明の方法において、固体支持体表面にアミノシランをコーティングする際に用いる前記溶液は、下記式（２）または式（３）で示されるシラン化合物をさらに含んでいてもよい。

（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、または水素原子であり、Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルコキシ基、ヒドロキシ基またはハロゲン原子であり、Ｒ_４は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、またはフッ素化炭化水素官能基であり、ｎは１〜１５の整数である。また、前記フッ素化炭化水素官能基は、望ましくは−ＣＦ_３を含むフッ素化炭化水素官能基である。）

（式中、Ｒ_５は、Ｃ_１ないしＣ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、または水素原子でありうる。また、前記Ｒ_５は、同一であっても異なっていてもよい。）
前記式３で示されるシラン化合物としては、１,２−ビス（トリエトキシシリル）エタンなどが好ましく挙げられる。

このような式（２）または（３）のシラン化合物は、アミン層の疎水性を調節するために疏水性シラン化合物、または、結着力を向上させるためにシランアルコキシドを混合して使用してもよい。

前記式（２）または式（３）などで示されるシラン化合物は、アミノシラン化合物１００質量部に対して０ないし０.０１質量部で含まれることが望ましい。

本発明の方法において、前記アミノシランをコーティングする方法は、当業者によく知られているコーティング技術を利用できる。例えば、ディップコーティング法（自己組織化単分子コーティング法）、スピン法、スプレイ法、及び化学気相蒸着法よりなる群から選択される方法によって行われうる。

本発明の方法において、前記テトラカルボキシル二無水物は、望ましくは下記式（７）で示される。

（式中、Ｒ_１０は、酸素原子、フッ素原子を含んでいてもよい、４価の芳香族基、複素環基、脂環基または脂肪族基などの４価の有機基であることが望ましい。）
さらに望ましくは、前記テトラカルボキシル二無水物は、ピロメリット酸二無水物、３,３’,４,４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２,２’,３,３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２,３,３’,４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１,２,４,５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３,３’,４,４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２,２’,３,３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２,３,３’,４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３,４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３,４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１,４,５,８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１,２,５,６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２,３,６,７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２,２−ビス（３,４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１,２,３,４−テトラカルボキシブタン二無水物よりなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。

本発明の方法において、前記テトラカルボキシル二無水物は、前記テトラカルボキシル二無水物を０.０２質量％ないし９０質量％含む溶液として用いられることが望ましい。前記溶液において、テトラカルボキシル二無水物は、特に制限されないが、望ましくは、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド及びＮ−メチルピロリドンから選択される少なくとも一種の溶媒に溶解されている。

前記テトラカルボキシル二無水物と固体支持体表面上のアミノ基との反応は、例えば、前記テトラカルボキシル二無水物をアミノ基板上にディップコーティング法（自己組織化分子コーティング法）によって単分子膜を形成させ、１０分以上反応させることによって行われうる。このようなテトラカルボキシル二無水物の結合は、アミノ基による親核置換反応によるもの考えられる。反応終了後、反応溶媒を使用して物理的に吸着されている前記テトラカルボキシル二無水物は、洗浄によって除去され、窒素雰囲気下で乾燥されうる。また、残りの洗浄溶媒をオーブンなどを用いて窒素雰囲気下で乾燥しても除去できる。

本発明の方法において、前記無水物官能基の加水分解は、２０℃〜１００℃の水溶液を用いて行われうる。このような加水分解は、前記温度で酸性または中性の水などで１分以上処理し、窒素雰囲気下で乾燥させることによって行われうる。加水分解の結果、一つの無水物官能基から二つのカルボキシル基が生成されるため、高密度のカルボキシル基を有する基板を形成させうる。これにより、高密度の活性化されたカルボキシル基を形成でき、前記活性化されたカルボキシル基に生体分子を高密度で付着できる。例えば、従来広く使われている、表面にアミノ基を有する基板にコハク酸無水物を反応させれば、一つのカルボキシル基が形成される。したがって、本発明の方法によれば、従来の表面にアミノ基を有する基板を利用する場合に比べて、２倍も多くのカルボキシル基を形成するため、このような基板を利用して製作されたマイクロアレイを利用した分析で、蛍光度が強く検出されうる。

本発明の方法において、前記カルボジイミドは、望ましくは、下記式（４）で示される。

（式中、Ｒ_６は、アルキル基またはシクロアルキル基であり、Ｒ_７は、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノアルキル基またはシクロアルキルアミノ基であることが望ましい。）
さらに望ましくは、前記カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。前記ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩として用いてもよい。

本発明の方法において、前記コハク酸イミドは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）であることが望ましい。

また、本発明において、前記カルボジイミドまたはコハク酸イミドは、前記カルボジイミドおよび前記コハク酸イミドをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／ｌ〜２００ｍｍｏｌ／ｌ含む溶液として用いられうる。前記溶液に用いられる溶媒は、特に制限されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールのようなアルコール溶媒またはメチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルピロリドン（Ｎ−メチルピロリドン）またはこれらの混合物などが挙げられる
本発明において、前記生体分子は、活性化されたカルボキシル基と結合できる官能基を有する生体分子であれば特に制限なく用いられる。前記生体分子は、アミノ基を有するものが望ましい。前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または蛋白質などが望ましく挙げられる。

図２は、本発明による表面に活性化されたカルボキシル基を有するマイクロアレイ用基板の製造方法の一例を表す反応式である。まず、基板上にγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）のようなアミノシラン化合物をコーティングして、表面にアミノ基を有する基板を製造する（ａ）。次いで、表面にアミノ基を有する基板に１,２,４,５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物のようなテトラカルボン酸二無水物を反応させて、無水物官能基を基板上に導入する（ｂ）。次いで、加水分解反応を行って、基板上にカルボキシル基を形成し（ｃ）、これを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカルボジイミドならびにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及びＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）のようなコハク酸イミド化合物の存在下で反応させて、活性化されたカルボキシル基を有する基板を製造する（ｄ）。

本発明は、また、上述した活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体上に生体分子を固定する方法によって製造されるマイクロアレイを提供する。

上述した活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体表面に生体分子を固定化する方法は、公知の方法が用いられる。例えば、接触式のスポッティング、インクジェットプリンタのような圧電印刷方式、及びマイクロピペッティング法が利用されうる。

以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲は下記実施例に限定されない。

試験例１：活性化されたカルボキシル基を有する基板またはアミノシランでコーディングされた基板に核酸をコーティングする方法。

（１）アミノシランでコーディングされた基板の製造
γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）をエタノールに溶解させて、０.００２ｍｏｌ／ｌのγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）の溶液を調製した。得られた溶液を洗浄されたスライド状のガラス基板上にディップコーティングによってコーティングし、１２０℃で１時間処理して、アミノシランでコーディングされたガラス基板を製造した。

（２）活性化されたカルボキシル基を有する基板の製造
３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＴＳＡ）をエタノールに溶解させて、０.００２ｍｏｌ／ｌの３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＴＳＡ）の溶液を製造した。得られた溶液を洗浄されたスライド状のガラス基板上にディップコーティングによってコーティングし、１２０℃で１時間処理して、シラン無水物でコーディングされたガラス基板を製造した。

前記シラン無水物（ＴＳＡ）でコーディングされたガラス基板を２５℃の弱酸性の水で３分間洗浄して、無水物官能基を加水分解してカルボキシル基にさせた。得られたカルボキシル基を表面に有する前記ガラス基板を、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とをそれぞれ１００ｍｍｏｌ／ｌとなるようにしてＤＭＦに溶解させた溶液と１時間反応させて、活性化されたカルボキシル基を有するマイクロアレイ用基板を製造した。反応後、前記基板をエタノールで洗浄した後、窒素容器内で保管した。

（３）核酸の固定及びハイブリダイゼーション実験
配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブをＤＭＳＯと混合した後、スポッタを使用して前記活性化されたカルボキシル基を有する基板またはアミノシランでコーディングされた基板上に固定化してスポッティングした。３７℃、１００％の相対湿度で１時間固定化した後、洗浄することにより前記プローブが固定化されたマイクロアレイを製作した。

前記マイクロアレイに対して、前記プローブと相補的なヌクレオチド配列を有している標的核酸をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ条件は、０.１％のＳＳＰＥＴ（０.１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む塩水ナトリウムリン酸塩ＥＤＴＡ緩衝溶液）に標的核酸を溶かし、３７℃で１４時間反応させた。反応後、マイクロアレイを６×ＳＳＰＥＴと３×ＳＳＰＥＴでそれぞれ５分間洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させた。乾燥させたマイクロアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂモデル（Ａｘｏｎ社製）を利用してスキャンした。その結果を図３（Ａ）及び（Ｂ）に表した。ハイブリダイゼーション過程で、アミノシランでコーディングされた基板、すなわち、アミノ基板に対してはコハク酸無水物／ＮＭＰブロッキングを行った。

図３（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、本発明の方法によって製作された活性化されたカルボキシル基を有する基板を利用したマイクロアレイは、ハイブリダイゼーション過程においてブロッキングを行わなくとも、優れたスポット蛍光度とスポット形状とが得られた。図３（Ａ）及び（Ｂ）で、それぞれ左側はプローブ濃度１００μｍｏｌ／ｌに対する結果であり、右側は２５μｍｏｌ／ｌに対する結果である。図３（Ａ）は、ＴＳＡでコーティングされた基板に対する結果であり、図３（Ｂ）は、ＧＡＰＳでコーティングされた基板に対する結果である。図３（Ａ）及び（Ｂ）に表した結果を蛍光度の数値を、下記表２に示す。

試験例２：活性化されたカルボキシル基を有する基板、アミノ基板及びアミノ層上で活性化されたカルボキシル基を有する基板を利用した核酸のコーティング
（１）活性化されたカルボキシル基を有する基板の製造
３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物と１,２−ビス（トリエトキシシリル）エタンとをエタノールに溶解させて、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＴＳＡ）と１,２−ビス（トリエトキシシリル）エタンとをそれぞれ０.００２ｍｏｌ／ｌ含む混合液を得た。前記混合液を洗浄されたスライド状のガラス基板上にディップコーティングによってコーティングし、１２０℃で１時間処理して、シラン無水物でコーディングされたガラス基板を製造した。

前記シラン無水物でコーディングされたガラス基板を２５℃の弱酸性の水で３分間洗浄して、シラン無水物を加水分解してカルボキシル基とした。得られたカルボキシル基を表面に有する前記ガラス基板を、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とをそれぞれ１００ｍｍｏｌ／ｌとなるようにＤＭＦに溶解させた溶液に１時間反応させた。反応後、ガラス基板をエタノールで洗浄し、窒素容器内で保管した。以下、このように製作された基板をＴＳＡ基板という。

（２）アミノシランでコーディングされた基板の製造
３−アミノプロピルトリメトキシシランと１,２−ビス（トリエトキシシリル）エタンをエタノールに攪拌しつつ溶解させて、３−アミノプロピルトリメトキシシランと１,２−ビス（トリエトキシシリル）エタンとをそれぞれ０.００２ｍｏｌ／ｌ含む混合液を調製した。この混合液を洗浄されたスライド状のガラス基板上にディップコーティングによってコーティングし、１２０℃で１時間処理した。これを、以下“アミノ基板”という。

（３）活性化されたカルボキシル基を有する基板の製造
前記アミノ基板をコハク酸無水物または１,２,４,５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物が０.０１ｍｏｌ／ｌとなるようにＤＭＦに溶解させた各溶液に浸漬させて、１時間反応させた。反応後、エタノールで洗浄し、窒素容器内で乾燥させた。次いで、コハク酸無水物または１,２,４,５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物で処理された各基板を２５℃の弱酸性の水で３分間洗浄して、無水物官能基を加水分解してカルボキシル基にさせた。得られたカルボキシル基を表面に有する各基板を、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とＮ,Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とがそれぞれ１００ｍｍｏｌ／ｌとなるようにＤＭＦに溶解させた溶液に浸漬させて１時間反応させ、カルボキシル基を活性化させた。反応後、各基板をエタノールで洗浄した後、窒素容内器で保管した。以下、このように製作された基板を、それぞれ“ＳＡ（コハク酸無水物）基板”及び“ＢＤ（１,２,４,５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物）基板”という。

（４）核酸の付着及びハイブリダイゼーション実験
配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブをＤＭＳＯと混合した後、スポッタを使用して基板上に固定化してスポットを形成した。３７℃、１００％の相対湿度で１時間固定化し、洗浄後処理を行ってプローブが固定化されたマイクロアレイを製作した。

このように製作されたマイクロアレイに対して、前記プローブと相補的なヌクレオチド配列を有している標的核酸をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ条件は、０.１％のＳＳＰＥＴ（０.１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む塩水ナトリウムリン酸塩ＥＤＴＡバッファ）に標的核酸を溶かし、３７℃で１４時間反応させた。反応後、マイクロアレイを６×ＳＳＰＥＴと３×ＳＳＰＥＴでそれぞれ５分間洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させた。乾燥されたチップをＡｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂモデルを利用してスキャンした。その結果を表１及び図４に表す。ハイブリダイゼーション過程で、アミノ基板に対しては、コハク酸無水物／ＮＭＰ遮断過程を行った。

表１に示されるように、本発明の方法によって製作されたマイクロアレイは、遮断過程が不要であり、スポットも優れた特性を表した。図４は、各マイクロアレイに対して行われたハイブリダイゼーション結果を表す図面である。図４Ａないし図４Ｄは、それぞれ順次にＴＳＡ基板、ＢＤ基板、ＳＡ基板及びアミノ基板を表す。蛍光度は、赤色に行くほど強く、青色に行くほど弱い。

本発明の生体分子を固体支持体上に付着させる方法は、生体分子を固体に固定化して得られた製品、例えば、ポリヌクレオチドまたは蛋白質マイクロアレイの製造に利用されうる。

本発明のマイクロアレイは、多様な分析方法、例えば、ポリヌクレオチドまたは蛋白質マイクロアレイを利用した生物学的分析方法に使用されうる。

本発明による表面に活性化されたカルボキシル基を有するマイクロアレイ用基板の製造方法の一例を表す図面である。 本発明による表面に活性化されたカルボキシル基を有するマイクロアレイ用基板の製造方法の一例を表す図面である。 本発明の方法の実施例において製造されたＴＳＡまたはＧＡＰＳでコーティングされた各基板に核酸プローブを固定化し、標的核酸とハイブリダイズした後、蛍光で検出した結果を表す図面である（図３（Ａ）はＴＳＡでコーティングされた基板に対する結果であり、図３（Ｂ）はＧＡＰＳでコーティングされた基板に対する結果である）。 本発明の方法の実施例において製造されたされたＴＳＡ基板、ＢＤ基板、ＳＡ基板またはアミノ基板に核酸プローブを固定化し、標的核酸とハイブリダイズした後、蛍光で検出した結果を表す図面である（図４Ａないし図４Ｄは、それぞれ順次にＴＳＡ基板、ＢＤ基板、ＳＡ基板及びアミノ基板に対する結果である）。

Claims (35)

1. 固体支持体をシラン無水物でコーティングして前記固体支持体表面に無水物官能基を導入する段階と、
   前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、
   前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、
   前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、
   を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法。
2. 前記固体支持体は、ガラス、シリコンウェーハ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート及びポリウレタンよりなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記シラン無水物は、下記式（１）で示されことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
   （式中、Ｒ_１は、３価の直鎖または分岐の脂肪族基または芳香族基であり、Ｒ’は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の置換または非置換のアルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基またはアルキルアリーレン基であり、Ｒ_２は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基または水素原子であり、それぞれのＲ_２は、同一または異なる。）
4. 前記Ｒ_１は、
   であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記シラン無水物は、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記コーティングは、前記シラン無水物を０.０１質量％ないし９０質量％含む溶液を用いて行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記溶液は、下記式（２）または式（３）で示されるシラン化合物をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
   （式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、または水素原子であり、Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルコキシ基、ヒドロキシ基またはハロゲン原子であり、Ｒ_４は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、またはフッ素化炭化水素官能基であり、ｎは１〜１５の整数である。）
   （式中、Ｒ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、または水素原子である。）
8. 前記シラン化合物は、前記シラン無水物１００質量部に対して０ないし０.０１質量部に含まれることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
9. 前記コーティングは、ディップコーティング法、スピン法、スプレイ法、及び化学気相蒸着法よりなる群から選択される少なくとも一種の方法によって行われることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記加水分解は、２０℃〜１００℃の水溶液を用いて行われることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記カルボジイミドは、下記式（４）で示されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
    （式中、Ｒ_６は、アルキル基またはシクロアルキル基であり、Ｒ_７は、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノアルキル基またはシクロアルキルアミノ基である。）
12. 前記カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記コハク酸イミドは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドであることを特徴とする請求項１〜１２に記載の方法。
14. 前記カルボジイミドおよび前記コハク酸イミドは、前記カルボジイミドおよび前記コハク酸イミドをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／ｌ〜２００ｍｍｏｌ／ｌ含む溶液として用いられることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記生体分子は、アミノ基を有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または蛋白質であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 請求項１〜１６のいずれかの方法によって製造されるマイクロアレイ。
18. 固体支持体をアミノシランでコーティングして前記固体支持体の表面にアミノ官能基を導入する段階と、
    前記アミノ官能基をテトラカルボキシル二無水物と反応させて、無水物官能基を固体支持体表面に導入する段階と、
    前記無水物官能基を加水分解させて、カルボキシル基にする段階と、
    前記カルボキシル基をカルボジイミド及びコハク酸イミドと反応させて、前記カルボキシル基を活性化する段階と、
    前記活性化されたカルボキシル基を有する固体支持体と生体分子とを接触させて前記生体分子を前記固体支持体上に固定させる段階と、
    を含む生体分子を固体支持体上に固定させる方法。
19. 前記コーティングは、アミノシラン化合物を０.０１質量％ないし９０質量％含む溶液を用いて行われることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 前記アミノシラン化合物は、下記式（５）または（６）で示されることを特徴とする請求項１９に記載の方法、
    （式中、Ｒ_８は、酸素原子、または窒素原子を含んでいてもよい、アルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基、アルキルアリーレン基であり、Ｒ_９は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基または水素原子である。）
21. 前記溶液は、下記式（２）または式（３）で示されるシラン化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
    （式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、または水素原子であり、Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_２０のアルコキシ基、ヒドロキシ基またはハロゲン原子であり、Ｒ_４はＣ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、またはフッ素化炭化水素官能基であり、ｎは１〜１５の整数である。）
    （式中、Ｒ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_２０の直鎖または分枝のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基、または水素原子である。）
22. 前記シラン化合物は、前記アミノシラン化合物１００質量部に対して０ないし０.０１質量部で含まれることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 前記コーティングは、ディップコーティング法、スピン法、スプレイ法、及び化学気相蒸着法よりなる群から選択される少なくとも一種の方法によって行われることを特徴とする請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記テトラカルボキシル二無水物は、下記式（７）で示されることを特徴とする請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
    （式中、Ｒ_１０は、酸素原子、フッ素原子を含んでいてもよい、４価の芳香族基、複素環基、脂環基または脂肪族基である。）
25. 前記テトラカルボキシル二無水物は、ピロメリット酸二無水物、３,３’,４,４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２,２’,３,３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２,３,３’,４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１,２,４,５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３,３’,４,４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２,２’,３,３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２,３,３’,４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３,４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３,４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１,４,５,８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１,２,５,６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２,３,６,７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２,２−ビス（３,４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１,２,３,４−テトラカルボキシブタン二無水物よりなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
26. 前記テトラカルボキシル二無水物は、前記テトラカルボキシル二無水物を０.０２質量％ないし９０質量％含む溶液として用いられることを特徴とする請求項１８〜２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記溶液における溶媒が、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド及びＮ−メチルピロリドンから選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. 前記加水分解は、２０℃〜１００℃の水溶液を用いて行われることを特徴とする請求項１８〜２７のいずれかに記載の方法。
29. 前記カルボジイミドは、下記式（４）で示されることを特徴とする請求項１８〜２８のいずれかに記載の方法。
    （式中、Ｒ_６は、アルキル基またはシクロアルキル基であり、Ｒ_７は、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノアルキル基またはシクロアルキルアミノ基である。）
30. 前記カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはＮ,Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. 前記コハク酸イミドは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドであることを特徴とする請求項１８〜３０のいずれかに記載の方法。
32. 前記カルボジイミドおよび前記コハク酸イミドは、前記カルボジイミドおよびコハク酸イミドをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／ｌ〜２００ｍｍｏｌ／ｌ含む溶液として用いられることを特徴とする請求項１８〜３１のいずれかに記載の方法。
33. 前記生体分子は、アミノ基を有することを特徴とする請求項１８〜３２のいずれかに記載の方法。
34. 前記生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または蛋白質であることを特徴とする請求項１８〜３３のいずれかに記載の方法。
35. 請求項１８〜３４のいずれかの方法によって製造されるマイクロアレイ。