CN116250060A - 一种半导体芯片的表面连接体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物芯片领域，提供了一种半导体芯片表面连接体及其制备方法和应用，所述芯片表面连接体通过以硅烷化分子为溶质，甲苯为溶剂，与芯片表面反应形成连接在芯片表面的键合分子，并与功能化分子反应修饰羟基和酯基制得。本发明获得的芯片表面连接体能稳定地结合于芯片表面，在酸性和碱性条件下稳定，具有较好的导电性、加电稳定性以及抗核酸合成所需有机溶剂，对于后续的核酸合成及其他应用极其有利。
Description
本发明涉及生物芯片制备技术领域，尤其涉及一种用于TiN芯片合成核酸的表面连接体及其制备方法和应用。
半导体芯片合成核酸的稳定连接体(linker)非常重要，其可用于表面原位合成或预制备大量的DNA探针，同时也可牢固连接核酸以便进行后续的原位杂交等应用，通过对样品杂交信号的检测分析，得到样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。可在疾病诊断、药物筛选和新药开发、农业与环境研究等领域发挥巨大的应用。现在市场多用贵金属芯片合成核酸，其方法众多，包括多种linker和多种核酸合成方法。但用于半导体芯片合成核酸的稳定linker很是罕见。由于半导体价格便宜，芯片制备简单，且更加适合工业化大批量生产，因此开发半导体芯片linker，促进半导体芯片的应用非常重要。现在多是在半导体上简单修饰分子后连接聚合物或嫁接其他材料，如Y.Shacham-Diamand研究了用化学方法在TiN上修饰硅烷化分子后再镀Co(W,P)材料[1]；Xuan Tuan Le用重氮盐法修饰TiN表面，再用于电镀聚合物[2]，此方法问题在于需要加电修饰，不利于规模化大批量生产；另一种方法是利用直接吸附法，将小分子吸附在TiN表面，以此来应用[3]，此方法的缺点在于粘附性不牢固，对水敏感，特别在后续应用时会脱落，难以进一步开发所需的芯片诊断产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于半导体TiN芯片合成核酸的稳定连接体(linker)，其主要方法是在洁净的TiN表面进行硅烷化反应，使表面氨基化，再通过羧基氨基反应修饰上含有羟基/羟基保护基和酯基的功能化分子，便可实现后续芯片上核酸原位合成。
一方面，本发明提供了一种芯片表面连接体，其特征在于，所述连接体通过硅烷化分子与芯片表面反应形成连接在芯片表面的键合分子，所述键合分子进一步与功能化分子反应修饰上羟基和酯基制得。具体地，本发明提供了一种芯片表面连接体，所述连接体通过 硅烷化分子于合适溶剂中与芯片表面反应形成连接在芯片表面的键合分子，所述键合分子与功能化分子反应修饰上羟基和酯基制得。所述羟基可以是游离的羟基也可以是被保护基保护的羟基。
在一些实施方案中，所述硅烷化分子选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、双(γ-三甲基甲硅烷基丙基)胺和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷中的一种或多种，优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
在一些实施方案中，所述硅烷化分子是在合适的溶剂中与芯片表面进行反应的。在一些实施方案中，所述溶剂选自甲苯、乙醇和甲醇中的一种或多种，优选为甲苯。
在一些实施方案中，所述溶剂与硅烷化分子的体积比为2:1～40:1，优选为20:1～35:1，更优选为30:1。所述溶剂与硅烷化分子的体积比可选自2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1或40:1。
在一些实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应时的温度为50℃～100℃，优选60℃～80℃，更优选65℃。所述反应的具体反应温度可选自50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。在一些实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应时间优选1～6小时，更优选2～5小时，最优选4小时。其他优选的反应时间为1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时或6小时。在一些实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应条件是在50℃～100℃反应1～6小时。在一些优选实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应条件是在60℃～80℃反应2～5小时。在一个具体实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应条件是在65℃密封反应4小时。
在一些实施方案中，所述功能化分子为包含长碳链且含有酯基的羟基物质。在另一些实施方案中，所述功能化分子选自丁二酸酐修饰的碱基单体、甲基丙烯酸羟乙酯、丁二酸修饰的碱基单体和乙二酸修饰的碱基单体中的一种或多种，优选为丁二酸酐修饰的碱基单体。在一些实施方案中，所述功能化分子的碱基单体部分选自腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷中的一种或多种。在一个具体实施方案中，所述 功能化分子选自丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷中的一种或多种。
在一些实施方案中，在用功能化分子反应修饰键合分子之前，还包括在合适条件下加固芯片表面连接键合分子的步骤。
在一些实施方案中，所述加固条件为放置于60℃～100℃干燥装置中1小时～6小时，优选加固放置温度为75℃～95℃，最优选90℃。其他优选的加固放置温度为75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃；加固放置时间优选为1小时～4小时，最优选1小时，其他优选的放置时间为1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时或4小时。在一些具体实施方案中，所述加固条件为放置于90℃干燥装置中1小时。
在一些实施方案中，所述芯片为半导体芯片。在一些具体实施方案中，所述半导体芯片表面包含TiN(氮化钛)或TiW(钛钨)，优选TiN。
另一方面，本发明还提供一种芯片表面连接体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将硅烷化分子与合适溶剂按一定体积比混合得到混合液；
步骤2：将芯片与步骤1的混合液接触反应形成连接在芯片表面的键合分子；
步骤3：将反应后连接键合分子的芯片表面与功能化分子接触反应修饰上羟基和酯基。
在一些实施方案中，上述步骤1中所述硅烷化分子选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、双(γ-三甲基甲硅烷基丙基)胺和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷中的一种或多种，优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
在一些实施方案中，上述步骤1中所述溶剂选自甲苯、乙醇和甲醇中的一种或多种，优选为甲苯。
在一些实施方案中，上述步骤1中所述溶剂与硅烷化分子的体积比为2:1～40:1，优选20:1～35:1，更优选30:1。其他优选的溶剂与硅烷化分子的体积比为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1或40:1。
在一些实施方案中，上述步骤2中所述硅烷化分子与芯片表面反应的条件为50℃～100℃反应1～6小时。在一些优选实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应的条件为60℃～80℃反应2～5小时。在一个具体实施方案中，所述硅烷化分子与芯片表面反应的条件为65℃密封反应4小时。
在一些实施方案中，所述功能化分子为包含长碳链且含有酯基的羟基物质。在另一些实施方案中，所述功能化分子选自丁二酸酐修饰的碱基单体、甲基丙烯酸羟乙酯、丁二酸修饰的碱基单体和乙二酸修饰的碱基单体一种或多种，优选为丁二酸酐修饰的碱基单体。在一些实施方案中，所述功能化分子中的碱基单体部分选自腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷中的一种或多种。在一个具体实施方案中，所述功能化分子选自丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述步骤3之前还包括在合适条件下加固芯片表面连接键合分子的步骤。
在一些实施方案中，所述加固条件为放置于60℃～100℃干燥装置中1小时～6小时，优选为放置于75℃～95℃干燥装置中1小时～3小时，最优选为放置于90℃干燥装置中1小时。所述加固条件的放置温度可选自75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃；加固放置时间优选为1小时～4小时，最优选为1小时，其他优选的放置时间可选自1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时或4小时。在一些具体实施方案中，所述加固条件为放置于90℃干燥装置中1小时。
在一些实施方案中，所述芯片为半导体芯片。在一些具体实施方案中，所述半导体芯片表面包含TiN或TiW，优选TiN。
本发明还提供前文所述的芯片表面连接体在核酸合成或制备芯片诊断试剂盒中的应用。
发明详述
本发明提供了一种芯片表面连接体，特别是半导体芯片连接体，所述连接体通过硅烷化分子于合适溶剂中与芯片表面反应形成连接在芯片表面的键合分子，并与功能化分子反应修饰羟基和酯基制得。
本发明描述的硅烷化分子可以是3-氨丙基三乙氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、双(γ-三甲基甲硅烷基丙基)胺或γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷。在本发明的一些实施方案中，硅烷化分子为3-氨丙基三乙氧基硅烷。本发明中描述的键合分子是硅烷化分子与芯片表面发生反应后得到的共价连接在芯片表面的基团。在本发明的一些实施方案中，所述硅烷化分子APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶解在如甲苯等 合适溶剂中(溶剂与硅烷化分子体积比为2:1～40:1，优选30:1)，于50℃～100℃(优选65℃)的高温下与含TiN的半导体芯片表面反应1～6小时(优选4小时)后，于芯片表面形成键合分子。
在本发明的一些实施方案中，在用功能化分子反应修饰键合分子之前，还包括在合适条件下加固芯片表面连接键合分子的步骤。在本发明的一些实施方案中，加固条件为将与硅烷化分子反应后的芯片放置于60℃～100℃的烘箱1～6小时，优选90℃的烘箱中放置1小时。
本发明中功能化分子为包含长碳链且含有酯基的羟基物质，可以是丁二酸酐修饰的碱基单体、甲基丙烯酸羟乙酯、丁二酸修饰的碱基单体或乙二酸修饰的碱基单体，在本发明的一些实施方案中使用丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷或胸腺嘧啶核苷中一种或多种混合溶液。本发明所述长碳链是指分子中包含有多个碳碳共价键的长链结构，可包含碳原子数为2个以上，优选为2～4个。包含长碳链且含有酯基的羟基物质分子结构越长，后续在核酸合成过程中空间位阻越小，有利于合成。在本发明的一些实施方案中单独使用丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、丁二酸酐修饰的鸟嘌呤核苷、丁二酸酐修饰的胞嘧啶核苷或丁二酸酐修饰的胸腺嘧啶核苷溶液。在一些实施方案中，所述功能化分子还可选自丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷，甲基丙烯酸羟乙酯，丁二酸修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷，乙二酸修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷中羧酸与氨基反应后脱除羟基的基团。本发明中将功能分子修饰于键合分子上，形成的功能化分子基团含有羟基和酯基，便于后续芯片上电促DNA的合成以及切割。
本发明中功能化分子反应修饰的羟基可以是羟基基团本身，即-OH，也可以是被保护的羟基，如-ODMT，羟基保护基是通过常用的保护基团保护的羟基。本发明的一些实施方案中，所述功能化分子反应修饰的羟基为羟基基团。在另一些实施方案中，所述功能化分子反应修饰的羟基为ODMT。
本发明描述的芯片表面连接体通过共价键稳定结合在芯片表面，可用于电辅助芯片合成核酸等应用。其中，所述的半导体芯片为本领域常见的包括半导体材料的芯片。本发明中所述半导体芯片可选自一般表面包含TiN或TiW的片状半导体芯片。本发明的一个具体实施方案中，所述芯片为可应用于CustomArray芯片合成仪的半导体芯片。在进行芯片表面连接反应前包括芯片的清洗步骤。在本发明中，所述芯片清洗步骤可包括依次用水、醇、水 冲洗，干燥，即得干燥清洁的芯片表面。其中，所述水一般为蒸馏水，醇为乙醇、甲醇，主要去除污染物质如其他杂质金属粉尘、无机颗粒和有机小分子。
本发明还提供一种芯片表面连接体的制备方法，包括以下步骤：将硅烷化分子与合适溶剂按一定体积比混合得到混合液；将清洗后的芯片与配好的混合液接触反应形成连接在芯片表面的键合分子；将反应后的芯片表面与功能化分子接触反应修饰上羟基和酯基制得连接体。在一些实施方案中，在用功能化分子反应修饰键合分子之前还包括在合适条件下加固芯片表面连接键合分子的步骤。
在本发明的一些实施例中，以甲苯为溶剂与硅烷化分子按体积比2:1～40:1，优选30:1混合制得混合液。所述硅烷化分子可以是3-氨丙基三乙氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、双(γ-三甲基甲硅烷基丙基)胺或γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷，优选3-氨丙基三乙氧基硅烷。将清洗后的芯片与所述混合液在50℃～100℃条件，优选65℃条件下反应1～6小时，优选反应4小时。具体反应如下所示：
反应后，取出芯片，再依次用水、醇冲洗，最后用水冲洗，吹干。
将反应后的芯片在合适条件下加固芯片表面连接的键合分子。所述的加固条件为放置于60℃～100℃干燥装置中加固1小时～6小时，优选加固放置温度为75℃～95℃，最优选为90℃；加固放置时间优选为1小时～4小时，最优选为1小时。在本发明中所述加固芯片的温度一般会高于芯片表面连接硅烷化分子的温度。
加固后的芯片再进行功能化分子修饰。功能化分子为包含长碳链且含有酯基的羟基物质，所述羟基物质包括但不限于丁二酸酐修饰的碱基单体、甲基丙烯酸羟乙酯、乙二酸修饰的碱基单体。在本发明的一些实施方案中单独使用丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷的溶液。在本发明的一些具体实施方案中使用丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷的两种或两种以上混合溶液。功能化分子中含有酯基，可用于DNA合成及切割，所述的酯基是切割位点，为了把芯片上合成的DNA切下来，成自由溶液状的寡核苷酸池(oligo pool)。功能化分子中的含有的羟基是DNA合成的启动位点。在本发明的一些实施方案中，碱基单体部分提供的羟基用于DNA合成。另外，所述羟基分子溶液还可包含用于功能化修饰的活 化剂等，例如NHS(N,N-羟基琥珀酰亚胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)。
本发明还提供如前文所述的芯片表面连接体在合成DNA或制备芯片试剂盒中的应用。本发明的芯片表面连接体包含如下应用：在芯片上进行DNA合成；用于疾病生物标志物芯片检测；用于开发POCT的芯片试剂盒；高通量芯片筛选试剂盒。
本发明中的芯片表面连接体能用于合成DNA；合成的DNA与寡核苷酸(如DNA引物)杂交后再经碱和热TE处理，还可用于与寡核苷酸(如DNA引物)杂交。本发明的芯片表面连接体合成的DNA经过多次核酸杂交、洗脱、杂交循环应用，该芯片表面连接体依然能保持较好的稳定性。本发明实施例制备的芯片表面连接体导电性好，加电稳定，可用于电辅助合成DNA等核酸分子，如连接体没有此性质会影响DNA合成。本发明的芯片表面连接体抗DNA合成所需的有机溶剂(包括4,5-二氰基咪唑,三氯乙酸，乙酸酐，1-甲基咪唑及碘液等)，抗酸碱，抗氨解，否则无法进行DNA合成。在芯片连接体用于芯片杂交检测应用中，本发明可解决现有连接体对水、酸碱、有机溶剂的合成环境敏感、对热不稳定等问题，因此芯片可以重复性利用。
术语“芯片”表示由半导体之类的无机物或金、银、铂等金属形成的固体支持物，其表面具有特定位点形成的微阵列，所述位点通常以行列形式排列，其中各位点可用于某种类型的化学或生物化学分析、合成或方法。微阵列上的这些位点通常小于100微米。在本发明的一些实施方案中，所述芯片为含TiN的半导体芯片。
术语“键合分子”表示位于连接体端部，分子的一端能与固体表面(如含TiN的半导体芯片)共价相连，另一端具有反应基团的化学分子，所述反应基团与或能与相关的化学物质，例如小分子、寡聚物或聚合物相连，在本发明中能与功能化分子相连。键合分子已经与固体表面结合和/或其反应基团已连接有相关的化学物质。键合分子的反应基团可连接有保护基团，其中所述保护基团可用化学或电化学方法除去。
术语“功能化分子”表示位于连接体末端部分，基团的一端能与键合分子相连，另一端具有反应基团的化学分子，所述反应基团与或能与相关的化学物质，例如小分子、寡聚物或聚合物相连，在本发明中能与脱氧核糖核苷酸分子相连。功能化分子可已经与键合分子和/或其反应基团已连接有相关的化学物质。功能化分子的反应基团可连接有保护基团，其中所述保护基团可用化学或电化学方法除去。在本发明中功能化分子可以是丁二酸酐修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷，甲基丙烯酸羟 乙酯，丁二酸修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷，乙二酸修饰的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷等。
术语“碱基单体”表示能发生聚合从而构成大分子，例如寡聚物、共-寡聚物、聚合物或共聚物基本结构的组合单位的分子。单体的例子包括A、C、T、G、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、尿苷酸、氨基酸和其他化合物。
术语“寡聚物”表示具有中等相对分子质量(intermediate relative molecular mass)的分子，其结构基本上包含实际上或在概念上衍生自较低相对分子量分子的少量单位。如果除去某分子的一个或几个单位后，其特性确实显著不同，则该分子可视作具有中等相对分子量。如果该分子的部分或整体具有中等相对分子量，并且基本上包含实际上或在概念上衍生自较低相对分子量分子的少量单位，可将其描述为寡聚的，或用作为形容词使用的寡聚物来描述。寡聚物通常由单体构成。
本发明提供了一种半导体TiN芯片表面用于合成核酸的稳定linker及其制备方法和应用。本发明以硅烷化分子为溶质，甲苯为溶剂，与TiN芯片表面在高温反应一定时间后，再用更高温度加固，最后在硅烷化分子上修饰含有酯基和羟基的功能化分子，便完成此稳定linker的制作。此linker稳定性好，抗有机溶剂、强酸和强碱，可应用于TiN芯片表面核酸原位合成，并可进一步进行芯片表面原位杂交，为开发相关芯片诊断产品提供了可能，奠定了基础。
图1为TiN芯片linker制备流程图；
图2为TiN芯片连接linker的可行性显色测试图；
图3为TiN芯片的linker抗有机溶剂稳定性测试图；
图4为TiN芯片的linker抗氨解条件稳定性测试图；
图5为TiN芯片的linker抗酸碱稳定性测试图；
图6为TiN芯片的linker用于DNA合成及杂交结果图。
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的芯片表面连接体、其制备方法和应用进行具体地描述。但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实例1：linker制备实验
Linker制备具体实验步骤：
①TiN芯片(IC代工厂)用蒸馏水冲洗5次，乙醇冲洗5次，甲醇冲洗5次，再用蒸馏水冲洗5次，氮气吹干；
②配置甲苯与APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)混合液(30:1，体积比),将TiN芯片浸入此混合液中，密封后65℃反应4小时。具体反应如下所示：
③取出芯片，放于90℃烘箱，高温加固1小时后，再用乙醇清洗3次，蒸馏水清洗3次，氮气吹干芯片；
④芯片浸泡于丁二酸酐修饰的碱基单体(碱基单体为腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷或胞嘧啶核苷10.8mg和NHS 1.53mg，EDC 7.64mg溶于100uL水)混合溶液，静置反应8小时；
⑤芯片依次用乙醇，丙酮，乙醇，蒸馏水冲洗5次，氮气吹干，便得到此稳定的linker，如图1所示；所述连接体包括键合分子和功能化分子，其中，键合分子为硅烷化分子，功能化分子为包含羟基(或被保护的羟基)和酯基的分子。
用以上方法在TiN芯片表面制得linker，用大量乙醇冲洗，再用蒸馏水冲洗芯片，氮气吹干。取20uL三氯乙酸到修饰有linker的芯片表面，1秒后快速收集三氯乙酸到离心管，如图2所示，与三氯乙酸原液对比，发现明显的颜色变化(微红色)，这是由于linker顶 端的ODMT基团(4,4'-双甲氧基三苯甲基，碱基分子单体上自带ODMT)与三氯乙酸显色反应所致，说明linker在表面修饰成功。
实例2：linker稳定性测试
2.1 linker抗有机溶剂稳定性
为了测试linker抗有机溶剂的稳定性，特别是与TiN表面反应的硅烷化分子稳定性，首先将硅烷化分子按照实施例1方法反应于TiN芯片表面(不包括功能化分子修饰步骤)，再将此芯片浸泡于合成寡核苷酸所用的有机溶剂(包括4,5-二氰基咪唑,三氯乙酸，乙酸酐，1-甲基咪唑，碘液，各成分体积比1:1:1:1:1)中,室温放置两天，再用乙醇和蒸馏水冲洗干净后，利用羧基与氨基的反应将探针DNA-H1(2uM，南京金斯瑞生物科技有限公司)连接于硅烷化分子上，再用cy5和cy3两种荧光分子修饰的探针DNA-H2(10nM，南京金斯瑞生物科技有限公司)同时与DNA-H1杂交，如图3a所示，芯片杂交设计如图3b所示，分为四个部分，上边两部分杂交，下边两部分作为对比。杂交后再放与芯片扫描仪(CustomArray,GenePix 4000B)下扫描(532nm/635nm)，可以发现，只有杂交部分有明显的荧光如图3c所示，这也表明第一步硅烷化分子修饰在经过有机溶剂浸泡后，依然稳定存在于TiN芯片表面，可进行后续的反应和应用。
DNA-H1探针的序列为：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTTT-NH2-3’(SEQ ID NO:1)
DNA-H2-cy5探针的序列为：
5’-TAGGGAAAGAGTGT-Cy5-3’(SEQ ID NO:2)
DNA-H2-cy3探针的序列为：
5’-AGATCGGAAGAGCG-Cy3-3’(SEQ ID NO:3)
2.2 linker抗氨解条件稳定性
为了测试linker抗氨解条件的稳定性，特别是与TiN表面反应的硅烷化分子稳定性，首先将硅烷化分子按照实施例1方法反应于TiN表面(不包括功能化分子修饰步骤)，再将此芯片浸泡于28％氨水中，65℃放置16小时后，再用乙醇和蒸馏水冲洗干净后，利用羧基与氨基的反应将探针DNA-H1(2uM，南京金斯瑞生物科技有限公司，序列同实施例2.1)连接于硅烷化分子上，再用cy5和cy3两种荧光分子修饰的探针DNA-H2(10nM，南京金斯瑞生物科技有限公司，2种探针序列同实施例2.1的DNA-H2)与DNA-H1杂交，如图4a所示，芯片杂交设计如图4b所示，分为四个部分，上边两部分杂交，下边两部分作为对比。杂交后再放与芯片扫描仪下扫描(532nm/635nm)，可以发现，只有杂交部分有明 显的荧光如图4c所示，这也表明第一步硅烷化分子修饰在经过氨水浸泡后，依然稳定存在于TiN芯片表面，可进行后续的反应和应用。
2.3 linker抗酸碱稳定性
为了测试linker抗酸碱的稳定性，特别是与TiN表面反应的硅烷化分子稳定性，首先将硅烷化分子按照实施例1方法反应于TiN表面(不包括功能化分子修饰步骤)，再将此芯片浸泡于0.5M氢氧化钠溶液中0.5小时，蒸馏水冲洗后再放置于0.5M盐酸溶液中0.5小时后，再用蒸馏水冲洗干净后，利用羧基与氨基的反应将探针DNA-H1(2uM，南京金斯瑞生物科技有限公司，序列同实施例2.1的SEQ ID NO:1)连接于硅烷化分子上，再用cy5和cy3两种荧光分子修饰的探针DNA-H2(10nM，南京金斯瑞生物科技有限公司，2种探针序列同实施例2.1的DNA-H2,分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)与DNA-H1杂交，如图5a所示，芯片杂交设计如图5b所示，分为四个部分，上边两部分杂交，下边两部分作为对比。杂交后再放与芯片扫描仪下扫描(532nm/635nm)，可以发现，只有杂交部分有明显的荧光如图5c所示，这也表明第一步硅烷化分子修饰在经过强碱和强酸浸泡后，依然稳定存在于TiN芯片表面，可进行后续的反应和应用。
实例3：linker用于DNA合成及杂交
修饰有此linker的TiN芯片合成DNA。TiN芯片分为上下两部分，上半部分修饰linker，下半部分不修饰linker，作为空白对照，如图6a所示。将此芯片放置于CustomArray芯片合成仪上，利用如柱合成的方法(参见参考文献[4])，将合成DNA的试剂逐个注入芯片表面进行合成，合成38nt DNA(序列同实施例2.1的DNA-H1，SEQ ID NO:1)，合成后，将芯片放置于芯片扫描仪上扫描，结果如图6b所示，在linker修饰部分有明显颜色变化，空白部分无颜色变化，说明DNA合成成功。为了验证所合成DNA是否为所需DNA，可采用cy3荧光分子修饰的DNA探针(100pM，南京金斯瑞生物科技有限公司，探针序列同实施例2.1的DNA-H2-cy3，SEQ ID NO:3)与其杂交，杂交后，将芯片放置于芯片扫描仪上扫描，结果如图6c所示，有明显的红光，说明杂交成功，芯片所合成序列是目标序列。进一步说明此linker可用于DNA的原位合成。
参考文献：
1.Malki,Maayan,et al."Thin electroless Co(W,P)film growth on titanium–nitride layer modifiedby self-assembled monolayer."Surface and Coatings Technology 252(2014):1-7.
2.Zeb,Gul,et al."On the chemical grafting of titanium nitride by diazonium chemistry."RSC Advances 5.62(2015):50298-50305.
3.Qiu,Guangyu,Siu Pang Ng,and Chi-Man Lawrence Wu."Label-free surface plasmon resonance biosensing with titanium nitride thin film."Biosensors and Bioelectronics 106(2018):129-135.
4.
H.Synthesis of oligonucleotides on a soluble support[J].Beilstein journal of organic chemistry,2017,13(1):1368-1387.
Claims (24)
- 一种芯片表面连接体，其特征在于，所述连接体通过硅烷化分子与芯片表面反应形成连接在芯片表面的键合分子，所述键合分子进一步与功能化分子反应修饰上羟基和酯基制得。
- 根据权利要求1所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述硅烷化分子选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、双(γ-三甲基甲硅烷基丙基)胺和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷中的一种或多种，优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
- 根据权利要求1或2所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述硅烷化分子是在合适的溶剂中与芯片表面进行反应的，所述溶剂选自甲苯、乙醇和甲醇中的一种或多种，优选为甲苯。
- 根据权利要求3所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述溶剂与硅烷化分子的体积比为2:1～40:1，优选30:1。
- 根据权利要求1～3中任一项所述的芯片表面连接体，其特征在于，硅烷化分子与芯片表面反应的温度为50℃～100℃，优选65℃。
- 根据权利要求1～5中任一项所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述硅烷化分子与芯片表面反应的时间为1～6小时，优选4小时。
- 根据权利要求1～6中任一项所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述功能化分子为包含长碳链且含有酯基的羟基物质。
- 根据权利要求7所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述功能化分子选自丁二酸酐修饰的碱基单体、甲基丙烯酸羟乙酯、丁二酸修饰的碱基单体和乙二酸修饰的碱基单体中的一种或多种，优选为丁二酸酐修饰的碱基单体；其中，所述碱基单体部分选自腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷中的一种或多种。
- 根据权利要求1～8中任一项所述的芯片表面连接体，其特征在于，在用功能化分子反应修饰键合分子之前，还包括在合适条件下加固芯片表面连接键合分子的步骤。
- 根据权利要求9所述的芯片表面连接体，所述合适条件包括放置于60℃～100℃干燥装置中放置1小时～6小时，优选为放置于90℃干燥装置中放置1小时。
- 根据权利要求1～10中任一项所述的芯片表面连接体，其特征在于，所述芯片为半导体芯片。
- 根据权利要求11所述的芯片表面连接体，所述半导体芯片表面包含TiN或TiW，优选TiN。
- 一种芯片表面连接体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将硅烷化分子与合适溶剂按一定体积比混合得到混合液；步骤2：将芯片与步骤1的混合液接触反应形成连接在芯片表面的键合分子；步骤3：将反应后连接键合分子的芯片表面与功能化分子接触反应修饰上羟基和酯基。
- 根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷化分子选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、双(γ-三甲基甲硅烷基丙基)胺和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷中的一种或多种，优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
- 根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的溶剂选自甲苯、乙醇和甲醇中的一种或多种，优选为甲苯。
- 根据权利要求13～15中任一项所述的制备方法，所述溶剂与硅烷化分子的体积比为2:1～40:1，优选为30:1。
- 根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，所述步骤2中芯片表面与所述混合液接触反应的条件为50℃～100℃反应1～8小时，优选为65℃反应4小时。
- 根据权利要求13～17中任一项所述的制备方法，所述步骤3中功能化分子为包含长碳链且含有酯基的羟基物质。
- 根据权利要求18所述的制备方法，所述功能化分子选自丁二酸酐修饰的碱基单体、甲基丙烯酸羟乙酯、丁二酸修饰的碱基单体和乙二酸修饰的碱基单体中的一种或多种，优选为丁二酸酐修饰的碱基单体；其中，所述碱基单体部分选自腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷中的一种或多种。
- 根据权利要求13～19中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3之前还包括在合适条件下加固芯片表面连接键合分子的步骤。
- 根据权利要求20所述的制备方法，所述合适条件包括放置于60℃～100℃干燥装置中1h～6h，优选为放置于90℃干燥装置中1小时。
- 根据权利要求13～21中任一项所述的制备方法，所述芯片为半导体芯片。
- 根据权利要求22中所述的制备方法，所述半导体芯片表面包含TiN或TiW，优选TiN。
- 权利要求1～12中任一项所述的芯片表面连接体在核酸合成或制备芯片试剂盒中的应用。
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