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Die
vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Befestigung von
Oligonukleotiden, die eine Vielzahl von Reaktionsstellen aufweisen,
an ein Glassubstrat. Insbesondere betrifft die vorliegende Offenbarung
ein Verfahren zur Befestigung eines haarnadelförmigen Oligonukleotids, das
ein Thiophosphat Rückgrat
mit einer Vielzahl von Stellen aufweist, an ein Glassubstrat.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Immobilisierung von Sonden- oder Zielmolekülen an ein festes Substrat
ist ein integraler Bestandteil von vielen Bioassaytechniken. Glassubstrate
werden im Allgemeinen Polymersubstraten aus einer Vielzahl von Gründen vorgezogen.
Glassubstrate besitzen eine gesteigerte Toleranz gegenüber höheren Temperaturen
und Waschschritten mit höherer Innenstärke. Im
Gegensatz zu Polymersubstraten, die porös sind, halten nichtporöse Glassubstrate
weniger fremdes Material, das zu Hintergrundsignalen beitragen könnte. Weil
Glas nicht porös
ist, können weiterhin
Volumina von Biomolekülen,
die auf die Oberfläche
eines Glassubstrates aufgebracht werden, auf einem Minimum gehalten
werden. Glas besitzt eine niedrige Hintergrundfluoreszenz, die nicht merklich
mit der Sensitivität
von Fluoreszenz basierten Nachweisverfahren wechselwirkt. Auch kann
die Silanoloberfläche
von Glas einfach durch Silanisation von funktionalen Silanen modifiziert
werden.
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In
manchen Anwendungen ist es bevorzugt, Oligonukleotide und DNA Proben
an Glasoberflächen
kovalent anzuheften. Viele der gegenwärtig verwendeten Verfahren
zum kovalenten Anheften von Oligonukleotiden an Glasoberflächen verwenden
bifunktionale Linker oder Biotin-Streptavidin Verknüpfungen.
Beispielsweise offenbaren Wanda G. Beattie et al. in Hybridization
of DNA Targets to Glass-Tethered Oligonucleotide Probes. 4 MOLECULAR
BIOTECHNOLOGY 213 (1995) die Anheftung von Oberflächenoligonukleotiden
durch Verknüpfen
eines 5'-terminalen
Amins an ein epoxysilanisiertes Glas. Die Anheftungsreaktion findet
vorzugsweise in 100 mM NaOH statt. Kleine Volumina (> 1 nl) der Reaktionslösung werden
auf der Substratoberfläche
verteilt oder aufgebracht ("aufgespottet") und sehr schnell verdampft.
Weil die verteilte Flüssigkeit
so schnell verdampft, müssen
chemische Reaktionen schnell und wirksam sein, so dass sich eine
ausreichende Anzahl von Molekülen
in einer kurzen Zeitspanne anheftet. Darüber hinaus steigt die Alkalikonzentration der
Reaktionslösung
an, wenn das Lösungsmittel verdampft,
was Oligonukleotidabbau verursacht, was wiederum zu falschen Signalen
und hohem Hinter grund in dem Assay beiträgt. Erhöhte Alkalikonzentration kann
auch bewirken, dass das Silan sich von dem Glassubstrat ablöst.
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Michael
Pirrung und Mitarbeiter an der Duke Universität haben herausgefunden, dass
Oligonukleotide mit einem 5'-Phosphothionat
mit Bromacetamid-derivatisiertem Silan auf einer Glasoberfläche durch
nukleophile Substitution reagieren. Die Reaktion dauert ungefähr eine
halbe Stunde und wird bei neutralem pH in wässriger Lösung durchgeführt. Leider
ist die 5'-Phosphorylierung
teuer, insbesondere für
eine große
Anzahl von Oligomeren, und jeder nicht erfolgreiche Einbau, der
von Sulfurisierung gefolgt wird, ist nicht wirksam- für die Anheftung.
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Das
einfache Erhöhen
der Konzentration der Sonden oder DNA Primer, um die Reaktionsgeschwindigkeit
der Anheftung zu steigern, kann das Dilemma des Anheftens von Oligonukleotiden
an Oberflächen
nicht lösen.
Beispielsweise ist der Oberflächenbereich
eines Objektträgers
begrenzt. Die größte Dichte
von Oligonukleotiden auf einer Glasoberfläche beträgt 0,1 pmol/mm2,
was einem Molekül pro
39 Quadratangström
(Southern et al., Nature Genetics Supplement, 21, 5–9 (1999))
entspricht. Die Erreichbarkeit von Oligonukleotiden an dem Oberflächenbereich
(0,013 mm2, 0,57 nl) eines verteilten Tropfens
in 130 μm
Durchmesser ist bei 2,3 μM
(1,33 fmol) gesättigt.
Darüber
hinaus ist es fraglich, ob dicht gepackte Substrate eine Lösung liefern,
weil beobachtet wurde, dass dicht gepackte Substrate die Enzymerreichbarkeit
reduzieren.
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Wie
die obige Diskussion zeigt, sind Verbesserungen in dem Bereich der
kovalenten Verknüpfung
von Oligonukleotiden an Oberflächen,
insbesondere Glasoberflächen,
immer noch möglich
und gewünscht.
Beispielsweise wird ein Verfahren zur kovalenten Verknüpfung von
Oligonukleotiden an Glasoberflächen
benötigt,
das eine verbesserte Verlässlichkeit
und Wiederholbarkeit zeigt. Insbesondere wird ein Verfahren benötigt, das
eine bessere Kontrolle der Reaktionswirksamkeit, der molekularen Dichte
und Konformation und der Enzymverträglichkeit erlaubt. Idealerweise
wäre ein
solches Verfahren auch wirtschaftlich in der Verwendung. Diese und
andere Punkte werden detaillierter unten angegangen.
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Kurzzusammenfassung der
Erfindung
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Die
vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Binden eines
Oligonukleotid Primers an ein Glassubstrat, das Binden einer reaktiven
Gruppe an ein Substrat und Umsetzen des Substrats mit einem Oligonukleotid-Primer,
welcher eine Vielzahl von re aktiven Gruppen enthält, die der reaktiven Gruppe entsprechen,
die auf dem Substrat enthalten ist, um den Oligonukleotid-Primer
an das Glassubstrat zu binden, umfasst.
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Die
Vielzahl der reaktiven Gruppen, die auf dem Oligonukleotid-Primer
enthalten sind, sind Thiophosphatgruppen. Die reaktiven Thiophosphatgruppen,
die auf dem Oligonukleotid-Primer enthalten sind, können zueinander
angrenzend vorliegen oder zufällig über den
Primer verteilt sein. Der Oligonukleotid-Primer kann auch eine Nukleotidsequenz
enthalten, die einer Proteinbindungsstelle entspricht. Der Oligonukleotid-Primer
kann in der Konfiguration einer Haarnadel mit einer Schlaufe, welche
eine Vielzahl reaktiver Stellen enthält, vorliegen.
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Insbesondere
wird ein Verfahren zum Binden eines Oligonukleotid-Primers an ein
Glassubstrat offenbart, das die Herstellung einer Bromacetamid-derivatisierten
Silan-Glasoberfläche auf
einem Glassubstrat, und die Umsetzung der Bromacetamidderivatisierten
Silan-Glasoberfläche
mit einem Oligonukleotid-Primer umfasst, welcher eine Vielzahl von
Thiophosphatgruppen enthält,
um den Oligonukleotid-Primer an das Glassubstrat zu binden.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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1 zeigt
ein mögliches
Reaktionsschema zur Herstellung einer Bromacet-amidderivatisierten Silan-Glasoberfläche.
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2a zeigt
eine Ausführungsform
des Oligonukleotid-Primers als eine Schwanzstruktur mit fünf Gruppen,
welche die Fähigkeit
besitzen, mit der Oberfläche
des Substrates zu reagieren.
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2b zeigt
eine Ausführungsform
des Oligonukleotid-Primers mit einer geschlossenen Schlaufenstruktur.
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2c zeigt
eine Ausführungsform
des Oligonukleotid-Primers als ein Haarnadelmolekül mit sechs
Nukleosiden, die durch Thiophosphate in der Schlaufe verbunden sind,
und die ein einzelsträngiges
3'-Ende und ein
5'-Ende in einem
doppelsträngigen
Stamm aufweisen.
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2d zeigt
eine Detailansicht des Oligonukleotid-Primers. der in 2c dargestellt
ist.
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3 zeigt
die Bindungsreaktion zwischen dem Oligonukleotid-Primer, der in 2 dargestellt ist,
mit der Bromacetamid-derivatisierten Silan-Glasoberfläche, die
in 1 gezeigt ist.
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4 zeigt
eine Ausführungsform
einer Primerverlängerungsreaktion
als Array, welche die vorliegenden Oligonukleotide verwendet.
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5 zeigt
eine Ausführungsform
einer Ligationsreaktion, welche die vorliegenden Oligonukleotide
verwendet.
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6 zeigt
die Abbildung von Farbstoff endmarkierten Spots von sowohl linearen
als auch Haarnadel Oligonukleotid-Primer Verlängerungsreaktionen, die in
Beispiel 1 durchgeführt
wurden.
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7A zeigt
die Abbildung von Farbstoff endmarkierten Spots der Primerverlängerung
des Ligationsproduktes aus Beispiel 2a.
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7B zeigt
die Abbildung von Farbstoff endmarkierten Spots der Primerverlängerung
des Ligationsproduktes aus Beispiel 2b.
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8A zeigt
einen Vergleich eines Oligonukleotids mit einer reaktiven Stelle
(Peak a) mit einem Oligonukleotid mit fünf reaktiven Stellen (Peak
b). Wie durch die Intensität
der Markierung gezeigt wird, hat Peak b ungefähr die fünffache Menge an Fluoreszenzmarkierung
gegenüber
Peak a eingebaut, der nur eine reaktive Stelle aufweist.
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8B zeigt,
dass ein Oligonukleotid mit fünf
reaktiven Stellen nahe der Schwanzposition (Peak a) ungefähr dieselbe
Fluoreszenzmarkierung eingebaut hat wie das Haarnadel Oligonukleotid
mit fünf
reaktiven Stellen (Peak b).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Befestigung von
Oligonukleotiden, die eine Vielzahl von Reaktionsstellen aufweisen,
an ein Glassubstrat. Obwohl jede Art von Glas als ein Substrat verwendet
werden kann, ist das bevorzugte Substrat Borsilicatglas. Das Substrat
kann verschiedene physikalische Formen, wie (aber nicht darauf beschränkt) Objektträger oder
Kugeln, annehmen.
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Die
Oberfläche
des Substrats ist modifiziert, um die Anheftung der Oligonukleotide
an die Oberfläche
zu erleichtern. Das Oligonukleotid ist im Allgemeinen mit Thiophosphatgruppen
modifiziert. Die Oberfläche
des festen Trägers
ist mit einer entsprechenden reaktiven Gruppe modifiziert.
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Es
wurde gefunden, dass eine Vielzahl von reaktiven Gruppen auf dem
Oligonukleotid die Reaktionswirksamkeit verstärkt. Vorzugsweise enthält das betreffende
Oligonukleotid eine Vielzahl von Gruppen in einem einzelnen Molekül, welche
die Fähigkeit besitzen,
mit der Oberfläche
des Substrates zu reagieren. Im allgemeinen kann das Oligonukleotid
irgendeine Anzahl von reaktiven Gruppen aufweisen. Vorzugsweise
weist das Oligonukleotid von einer bis fünf reaktive Gruppen (siehe 2a,
die 5 reaktive Gruppen zeigt) auf. Die reaktiven Gruppen können innerhalb
eines Nukleosids nach dem anderen angeordnet sein, oder sie können über das
Oligonukleotid verteilt sein. Vorzugsweise sind die reaktiven Gruppen
innerhalb von zwei bis sechs Nukleosiden nacheinander angeordnet,
um eine Haarnadelstruktur in dem Oligonukleotid zu bilden. Die reaktiven
Gruppen sind Thiophosphatgruppen. Obwohl die betreffenden Oligonukleotide
nicht auf jene Oligonukleotide mit Haarnadelkonfigurationen beschränkt sind,
sind Oligonukleotide mit Haarnadelkonfigurationen, wie jenen, die
in den 2c und 2d dargestellt
sind, bevorzugt. Alternativ dazu kann das betreffende Oligonukleotid
eine geschlossene Schlaufenstruktur, wie in 2b gezeigt,
bilden.
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Erfindungsgemäß weist
das Glassubstrat eine Bromacetamid-derivatisierte Silan-Glasoberfläche auf. 1 stellt
ein mögliches
Reaktionsschema zur Herstellung einer Bromacetamid-derivatisierten Silan-Glasoberfläche dar.
Die reaktiven Objektträger können hergestellt
werden durch Ausgehen von entweder herkömmlichen Glasobjektträgern oder
Amin beschichteten Objektträgern
(kommerziell erhältlich von
Amersham Pharmacia Biotech Inc. und Corning Inc.). Die Zweiphasenreaktion
ist sehr wirksam.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
des Oligonukleotids ist in 2c, und
detaillierter in 2d gezeigt. In den 2c und 2d ist
der Oligonukleotid-Primer ein Haarnadelmolekül mit sechs Nukleosiden in
der Schlaufe. Die Nukleoside in der Schlaufe sind durch Thiophosphate
verbunden. Die Haarnadel weist ein einzelsträngiges 3'-Ende und ein 5'-Ende in dem doppelsträngigen Stamm
auf. Der einzelsträngige
Schwanz ist äquivalent
zu einem einzelsträngigen
Oligonukleotid. Dieser Ansatz erlaubt ein schnelles und wirksames
Anheften durch Aufrechterhalten relativ geringer Konzentrationen
von Oligonukleotid-Primern und hohen Konzentrationen an reaktiven
Gruppen. Die Anheftung des Primers an die Bromacet-amid-derivatisierte
Silan-Glasoberfläche ist
in 3 gezeigt.
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Weil
das Oligonukleotid an irgendeiner der reaktiven Stellen in der Schlaufe
an das Substrat anheften kann, steigt die Reaktionswahrscheinlichkeit (Reaktionsgeschwindigkeit
und -wirksamkeit) mit der Anzahl der reaktiven Stellen, die in der
Schlaufe enthalten sind, an. Weil die Befestigung des Oligonukleotids
in dem Rückgrat
liegt, sind sowohl das 5'-
und 3'-Ende zusätzlich frei
für Modifikationen
mit Reportergruppen. Dies ist vielseitiger als wenn die Anker entweder
an dem 5'- oder
3'-Ende vorliegen.
Während
die Reaktion an einem Ende auftritt, steht das andere Ende für weitere
Markierung zur Verfügung. Darüber hinaus
weist die Haarnadelstruktur eine Stamm-Schlaufeneinheit auf, die
zusätzliche
Parameter hinzufügt,
um die Oligonukleotide voneinander zu beabstanden und die Dichte
und die gewünschte Konformation
der einzelsträngigen
Einheit zur Primerverlängerung
ebenso wie zur Ligation zu kontrollieren.
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Dieses
Verknüpfungsschema
bietet signifikante Vorteile zur Immobilisierung von cDNA oder irgendeinem
PCR Produkt an Mikrochips durch Hybridisierung und Ligation. Wenn
beispielsweise das 5'-Ende
der Haarnadel während
der Synthese chemisch phosphoryliert wird und der 3'-einzelsträngige Schwanz
eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer PCR Primer Sequenz
ist, könnte
das PCR Produkt mit dem einzelsträngigen Schwanz hybridisieren
und kovalent durch enzymatische oder chemische Ligation verknüpft werden.
Viele der gegenwärtigen
Ansätze
zur kovalenten Anheftung eines PCR Produkts an eine Oberfläche fokussieren
hauptsächlich
auf das Modifizieren von PCR Primern. Ein Vorteil dieses Ansatzes
ist, dass die reaktive Position in dem selbst gefalteten Makromolekül verborgen
sein kann. Der Ansatz der Hybridisierung, gefolgt von Ligation könnte eine
höhere
Reaktionswahrscheinlichkeit aufweisen als die einfache Wechselwirkung
von reaktiven Gruppen, weil eine solche bimolekulare Reaktion von
mehreren Faktoren als der alleinigen Wahrscheinlichkeit des Aufeinandertreffens
von zwei Substraten abhängt.
Das vorliegende Verfahren und die Oligonukleotide sind nicht auf
die Hybridisierung von Nukleinsäuren
beschränkt.
Beispielsweise kann der Oligonukleotid-Primer auch eine Nukleotidsequenz aufweisen,
die einer Proteinbindungsstelle entspricht und wäre beispielsweise in Proteinassays nützlich.
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Das
vorliegende Anheftungsverfahren weist das Potenzial auf, Oligonukleotide
und DNAs durch eine kovalente Bindung an eine Silica basierte Glasoberfläche anzuheften,
mit verbesserter Kontrolle der Reaktionswirksamkeit, molarer Dichte
und Konformation und Enzymkompatibilität. Bei der gegebenen Vielseitigkeit
der vorliegenden Oligonukleotide ist es möglich, dass Verwendungen mit
anderen als den hier erwähnten
Substraten gefunden werden. Die folgenden Beispiele dienen nur der
Darstellung und sollten nicht verwendet werden, um die angehängten Ansprüche in irgendeiner
Weise zu beschränken.
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Beispiele
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Objektträgerherstellung
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Vorgewaschene
Glasobjektträger
(25 × 75 mm
Mikroskopobjektträger
von VWR Scientific Products West Chester, PA wurden für 3 Minuten
in 95 % Ethanol (350 ml) enthaltend ungefähr 2–3 % (wt/vol) 3-Aminopropylmethylethoxysilan,
pH 5,0 untergetaucht, mit Ethanol gewaschen und in einem Ofen bei 75°C für 4 Stunden
getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Glasobjektträger in ein
Glasgestell gesetzt und in 160 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) enthaltend Bromessigsäure (2,0
g, 14,9 mmol), 4-(Dimethylamino)-pyridin
(DMAP) (0,4 g, 3,3 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (4,0
g, 19,4 mmol) untergetaucht. Der Reaktionsbehälter wurde auf einen Schüttler in
der Dunkelheit für
4 Stunden gesetzt. Die Objektträger
wurden anschließend
mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet.
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Das
Haarnadel Oligonukleotid weist fünf
Thiophosphate in der sechs Nukleosid Schlaufe mit einem Stamm von
fünf Basenpaaren
und einem einzelsträngigen
Arm von siebzehn Basen auf, das kommerziell erhältlich ist von Genosys (The
Woodland, Texas). Die Thiophosphate sind auf der rechten Seite der
kleinen a's in der
Sequenz CCTGGaaaaaACCAGGGTATTCTTATAACTGAC angeordnet. Das Haarnadel
Oligonukleotid wurde gelöst
und in 1 × TE (10
mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0) gelagert. Die Konzentration des
Oligonukleotids wurde auf der Basis einer spektrophotometrischen
Messung berechnet. Das Oligonukleotid (100 bis 0,4 μM in einer
Verdünnungsreihe)
wurde auf eine Bromacetamidsilan beschichtete Glasoberfläche unter
Verwendung eines Molecular Dynamics Gen III Spotters (Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA) aufgebracht. Das Volumen der Spots betrug 0,7 nl,
und die Größe betrug 130 μm im Durchmesser.
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Beispiel 1: Primerverlängerung
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Beispiel 1 a
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Die
Objektträger
mit den Primern wurden auf eine heiße Platte, die auf 48°C erhitzt
worden war, gesetzt. Die Primerverlängerung wurde in 45 μl Thermo
Sequenase Puffer (25 mM TAPS Puffer, pH 9,3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 2-Mercaptoethanol) mit 0,5 μM des Farbstoffterminators
Cy5-ddGTP, Thermo Sequenase DNA Polymerase (4 Einheiten) durchgeführt. Die
verwendeten Matrizen betrugen 2 pmol von entweder einem 23-mer CTGATCGTCAGTTATAAGAATAC
oder einem 28-mer CTGATCGTCAGTTATAAGAATACTAGCA (was eine verzweigte
Struktur am 5'-Ende
des Haarnadelstammes ergab). Die Reaktionsmischung wurde mit kochendem
Wasser, nachdem sie für
10 Minuten inkubiert worden war, weggewaschen. Das Bild der Farbstoffterminator
markierten Spots wurde unter Verwendung eines Avalance Microscanners
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) erhalten. Wie in 6 gezeigt
wurde beobachtet, dass sich das Integral der Fluoreszenzintensität jedes
Spots linear mit der Konzentration der aufgebrachten Lösung ändert.
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Beispiel 1b
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Vier
Oligonukleotide, die unterschiedlich mit Thiophosphaten in dem Rückgrat modifiziert
waren, wurden von Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA) bezogen.
Die Thiophosphate sind auf der rechten Seite der kleinen a's in der folgenden
Sequenz angeordnet: CCTGGaaACCAGGGTATTCTTATAACTGAC weist zwei Thiophosphate
in der Haarnadel-Schlaufe auf. aaaaaACCAGGGTATTCTTATAACTGAC weist
fünf Thiophosphate
in dem 5'-Schwanz
auf. AAaCCAGGGTATTCTTATAACTGAC und aAACCAGGGTATTCTTATAACTGAC. Das Oligonukleotid
wurde gelöst
und in 1 × TE
Puffer gelagert. Die Konzentration des Oligonukleotids wurde basierend
auf der spektrometischen Messung berechnet. Die Primer wurden aus
50 μl Lösung aufgebracht.
Die Primerverlängerung
wurde genauso in 45 μl
Thermo Sequenase Puffer durchgeführt.
Die verwendeten Matrizen betrugen 2 pmol des 23-mer CTGATCGTCAGTTATAAGAATAC.
Die Signalintensität des
eingebauten Cy5-ddGTP änderte sich
dramatisch mit der Zahl der Thiophosphate in den Primern. Wie in 8A gezeigt,
wies das Signal eine fünffache
Differenz in den Primern mit entweder einem (Peak a) oder fünf Thiophosphaten
(Peak b) auf. 8B zeigt, dass ein Oligonukleotid
mit fünf
reaktiven Stellen nahe der Schwanzposition (Peak a) ungefähr dieselbe
eingebaute Fluoreszenzmarkierung wie ein Haarnadel Oligonukleotid
mit fünf
reaktiven Stellen aufweist.
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Beispiel 2: Ligation
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Beispiel 2a
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Eine
50-mer Thiophosphat Haarnadel, pGAATTCTACCCTGGaaaaaaCCAGGGTAGAATTCGTAAAACGACGGCCAG
wurde chemisch während
der Synthese phosphoryliert und auf einer Glasoberfläche, wie
zuvor beschrieben, immobilisiert. Die Ligation wurde in 40 μl eines Enzympuffers
(66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 10
mM DTT, 66 μM ATP)
enthaltend 3 Einheiten T4 DNA Ligase und 200 pmol eines Ligationsfragments,
3'-CATTTTGCTGCCGGTCACGGTTC-5', durchgeführt. Die
Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert und mit
heißem
Wasser gewaschen. Eine Primerverlängerung wurde anschließend mit Cy5-ddTTP
durchgeführt.
Das Ligationsprodukt diente als ein Selbstverlängerungsprimer, der mit Cy5-ddTTP
durch thermale Sequenase markiert wurde. Siehe 7a.
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Beispiel 2b:
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Die
Ligation eines 100-mer PCR Produkts von pUC-18 wurde mit thermisch
stabiler Pfu DNA Ligase bei 48°C
durchgeführt.
Die Reaktionsmischung enthielt 40 μl Enzympuffer (20 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT,
10 μM ATP,
0,1 % Igepal) und 4 Einheiten Pfu DNA Ligase und ein 100-mer Fragment
(5 pmol) von pUC-18, das mit universal und revers M 13 Primern amplifiziert
wurde. Die Reaktion wurde bei 48°C
für 15
min inkubiert und anschließend
mit ausreichend heißem
Wasser gewaschen, um überschüssige Reaktionsbestandteile
zu entfernen. Eine Primerverlängerung
wurde anschließend
mit Cy-3-ddTTP durchgeführt.
Das Ligationsprodukt diente als ein Selbstverlängerungsprimer, der mit Cy3-ddTTP
durch thermale Sequenase markiert wurde, um die Ligation zu bestätigen. Siehe 7b.
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Obwohl
verschiedene Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung oben detailliert beschrieben sind, ist die
vorliegende Erfindung nicht auf solche spezifischen Beispiele beschränkt. Verschiedene Modifikationen
sind für
den Fachmann einfach erkennbar und fallen in den Schutzbereich der
im folgenden angehängten
Ansprüche.