JP2005538726A - 固体支持体上に配列させるための核酸インク組成物 - Google Patents
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Abstract
生体アレイの製造おいて固体支持体上に付着させるための、核酸を含有する媒質またはインク溶液が提供される。この媒質は、約30体積%から約80体積%の、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、ホルムアミド、またはそれらの組合せを有してなる有機溶液;約3.5〜9.5のpH値を持つ緩衝液;および核酸を含む組成を有し、この核酸はより好ましいハイブリダイゼーションを提供するように変性される。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、マレイン酸塩またはコハク酸塩を含有してもよい溶液から調製できる。この媒質により、多くの従来のインク溶液に関連する現象である過剰な劣化を伴わずに、溶液中に核酸を長期間貯蔵することができる。
Description
本出願は、メラニー・シー・コローリス(Melanie C.Koroulis)およびサントナ・パル(Santona Pal)の氏名で、2001年5月16日に出願された米国特許出願第09/859160号を含む、2003年9月16日に出願された米国特許出願第10/244898号の優先権の恩恵を主張するものである。この特許出願をここに引用する。
本発明は、生物学的検定に使用するための高密度核酸アレイの製造に関する。本発明は、特に、「インク」とも称される核酸を含有する溶液の配合に関する。
ハイブリダイゼーションは、プローブ部分に対して相補的な核酸配列の存在を検査するために広く用いられている。多くの場合、これにより、従来の配列決定法に対する、簡単で速くかつ安価な代替法が提供される。ハイブリダイゼーションには、核酸のクローニングと精製や、塩基特異的反応の実施や、退屈な電気泳動分離が必要ない。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、遺伝的多型の分析、遺伝病の診断、癌診断学、ウイルスおよび微生物病原体の検出、クローンのスクリーニング、ゲノム地図作製およびフラグメントライブラリーの順序付けなどの様々な目的のためにうまく用いられている。
異種(heterogeneous)検定において、核酸アレイは、規則的なパターンで固体支持体の表面にそれぞれ異なる区域に拘束された多数の個々のオリゴヌクレオチド種を、各オリゴヌクレオチドの位置が分かるように有してなる。一つのアレイは選択されたオリゴヌクレオチドのコレクションを含有することができる(例えば、全て公知の臨床的に重要な病原体に特異的なプローブまたは遺伝病の全て公知の配列マーカーに特異的なプローブ)。そのようなアレイは、診断研究所の要望を満たすことができる。あるいは、一つのアレイは、所定の長さnを持つ全ての可能性のあるオリゴヌクレオチドを含有しても差し支えない。核酸のそのような包括的なアレイとのハイブリダイゼーションにより、多数の検定に使用できるであろう全ての成分n−merのリストが得られる。その例としては、明白な遺伝子同定(例えば、法廷研究における)、未知の遺伝子変異体および変異の決定(関連するゲノムの内の一つの配列が一旦分かったら、関連ゲノムの配列決定を含む)、クローンのオーバーラップ、および従来の方法により決定された配列の調査が挙げられる。最後に、包括的なアレイへのハイブリダイゼーションにより前記n−merを調査することにより、完全に未知の核酸の配列を決定するのに十分な情報を提供することができる。
オリゴヌクレオチドアレイは、特許文献1に記載されているように、部位指向性(site-directing)マスクと組み合わせて固相化学合成方法を用いて、全てのオリゴヌクレオチドを同時に支持体上に直接合成することにより調製できる。拘束されたオリゴヌクレオチドの長さを一つ分増加させるには、重複しない窓および4つのカップリング反応を持つ4つのマスクが必要である。合成のそれぞれのその後の工程において、異なる組の4つのマスクが用いられ、これにより、各特定区域で合成されたオリゴヌクレオチドの特有の配列が決定される。効率的なフォトリソグラフィー技法を使用して、1cm2の面積当たり105ほど多い個々のオリゴヌクレオチドを含有する小型アレイが実証されている。
オリゴヌクレオチドアレイを作製するための別の技法としては、特許文献2に記載されているような、圧電ポンプを用いた精密滴下堆積(precise drop deposition)が挙げられる。圧電ポンプは、微小体積の液体を基体表面に供給する。このポンプの設計は、インクジェットプリントに用いられているポンプに非常に類似している。このピコポンプは、3000Hzまでで50マイクロメートルの直径(約65ピコリットル)の小滴を供給することができ、250マイクロメートルの標的に正確に当たることができる。例示として、ポンプユニットに、4つのオリゴヌクレオチドのそれぞれのためと、5番目が結合のための活性化剤を供給するためのものである、5つのノズルアレイヘッドを設けてられる。このポンプユニットは、移動するアレイプレートに小滴が下方に発射されている間も、静止したままである。電圧が印加されると、極小滴がポンプから排出され、官能化された結合部位でアレイプレート上に堆積される。極小滴堆積順序に基づいて各個別の結合部位で異なるオリゴヌクレオチドが合成される。
高密度アレイを作製するための普及した方法では、生体試料流体の溶液中に浸され、次いで、表面に触れさせられるピンを使用する。核酸(例えば、オリゴヌクレオチドまたはDNA)は一般に、生体高分子と相溶性のある緩衝液の成分として用いられる塩を含有する水性媒質(「プリント用インク」または「インク」と称されることもある)内に可溶化される。3X SSC(450mMの塩化ナトリウムおよび45mMのクエン酸ナトリウム)がプリント用インクの標準濃度である。例えば、特許文献3(実施例1)を参照のこと。
しかしながら、SSC含有インクを使用することは、問題となることがある。3X SSCインクを使用したDNAアレイの製造において遭遇する最初の問題は、水性媒質の蒸発速度が、多数のスライドをプリントするのに要する時間と比較すると非常に速いことである。このことは、製造プロセスの拡大に対する重大な障害である。さらに、本出願の発明者等は、3X SSCインクは必要な数のスライドをプリントできないだけでなく、プリントされたアレイの品質と性能が水性媒質の蒸発のために変動し、このことによりDNAの濃度が急速に変化してしまうことに気付いた。
米国特許第5510270号明細書
米国特許第5474796号明細書
米国特許第5807522号明細書
それゆえ、従来技術の欠点を克服する、核酸の高密度アレイ(HDA)をプリントするためのインク組成物の必要性がある。
本発明は、一部は、固体支持体上に付着される、核酸の溶液を懸濁させるためのインクまたは媒質を提供する。この媒質は、約30体積%から約80体積%の、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、ホルムアミド、またはそれらの組合せを有してなる有機溶液;約3.5〜9.5のpH値を持つ緩衝液;および核酸を有してなる組成を有し、この核酸はより好ましいハイブリダイゼーションを提供するように変性される。この緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、マレイン酸塩またはコハク酸塩を含有する溶液から調製される。インク中のDMSOの濃度が増加すると、系全体のpH値も増加する。それゆえ、DMSOの強力なアルカリ性を補正するには、低pH値を持つ緩衝溶液が必要である。この媒質は、多くの従来のインク溶液に関連する現象である過剰な劣化を伴わずに、溶液中に核酸を長期間貯蔵することができる程度の安定性を有する。高密度アレイ(HDA)をプリントするのに使用する場合、本発明の媒質により、少なくとも20〜30日間のような長期間に亘る、大量製造が容易になる。さらに、その媒質により、官能化された基体表面への付着性が優れたものとなり、プリントされた核酸のハイブリダイゼーション効率が向上する。本発明のインク溶液は、核酸に、ハイブリダイゼーションされたときに増大した蛍光信号を示させることができると考えられる。
特定のプリント状況について湿潤性を向上させるためにインクの粘度を変化させるもの、例えば、グリセロール、ヒストンタンパク質などを含む他の試薬をインク組成物の一部として含むこともできる。インクは、ポリリシン、スペルミンなどのポリカチオン剤を少量含有してもよい。
核酸の変性を促進させるために、核酸を、プリント前に、少なくとも一日間に亘り、好ましくはそれより長く(例えば、約5〜10日間または15日間)、組成物中に懸濁してもよい。
別の態様において、本発明は、生体アレイを製造する方法に関する。本発明の方法は、本発明によるインク溶液を固体支持体に接触させるかまたは他の様式で付着させる工程を有してなる。付着工程はさらに、ピンの先端を前記媒質中に浸漬し、ピンの先端に媒質が付いている状態で先端を媒質から取り出し、インク溶液を固体支持体に移す各工程をさらに含む。付着工程は、核酸の一つ以上のアレイを提供するために、複数回繰り返しても差し支えない。このことは、例えば、凸版ピンアレイを使用することにより行うことができる。
本発明のインク溶液の追加の特徴および利点は、以下の詳細な説明に解説される。前述した一般的な説明および以下の詳細な説明と実施例の両方は、本発明を単に描写するものであり、特許請求の範囲に記載された本発明を理解する上での概要を提供することを意図したものであると理解されよう。
高密度アレイ(HDA)の大量製造のために、核酸(例えば、オリゴヌクレオチド、一本鎖または二本鎖DNA、またはRNA)が、製造運転の過程でずっと溶液中に懸濁されたままであり、この安定性が、ハイブリダイゼーション効率を損なわずに維持されることが必須である。インク中にフォーマットされた核酸の所望の寿命は、約四ヶ月から約一年の間である。本発明は、これらの目標を満たすことのできるインク組成物を提供する。インク溶液の化学的特徴を改良することにより、本発明は、以前の研究を超えて進歩し、ある意外な結果を達成した。本発明は、ここに引用する米国特許出願第09/859160号明細書に記載されたような、以前のインク組成物に関連する問題や欠点を克服し、安定性を改善する。DMSO:SSCを含有するインク溶液に対して、本発明のインク組成物は、一部は、水の濃度を減少させることにより、蒸発の問題を改善するだけでなく、過剰な変性を制御し、インク中に懸濁された核酸の鎖に良好な安定性を提供することができる。
水の蒸発は、大部分が水性であり、一般に、3X SSC(450mMの塩化ナトリウムおよび45mMのクエン酸ナトリウム)のものなどの食塩クエン酸ナトリウム(SSC)を含有する核酸インク溶液を使用する場合、プリントマイクロアレイの大量製造に対する重大な障害である。ほとんどの核酸プリントプロセスにおいて、インク溶液は大気条件に曝露されることが多く、これにより、インク中の溶媒の望ましい蒸発が促進される。しかしながら、望ましくない結果は、インク溶液からの水の蒸発であり、これにより、有機成分のレベルが次第に濃縮される。工業プリントプロセスに関して、そのような蒸発は許容できない。蒸発により、一般に、DMSO濃度が濃縮されて絶えず変化するインク組成物が得られるので、工業製造されたアレイは、一貫性のない品質になってしまうであろう。
長期に亘り、DMSO含有量の変化および関連するpHのために、核酸が累進的に変性される。例えば、図1のパネルAおよびBは、DSMO:SSCベースのインク中の変性された核酸を示している。これらのインク中の塩の濃度は、有機成分の影響のみをモニタするために、0.25X SSCで一定に維持されている。パネルAは、増加する濃度(50%〜90% v/v)のDMSOまたはエチレングリコール(EG)を含有するインクの選択された一群中に溶媒和された1.5kBのDNAが約4日後に変性される範囲を示すアガロースゲルの写真である。(このプロセスは、バイオ・フォーマットとも称される)パネルBは、インクへの曝露から約21日後の同じDNA試料の状態を示している。EGベースのインクとは対照的に、一本鎖DNAのような電気泳動度で、DMSOベースのインク中の新たなより速く移動するバンドの発生が、効果的な変性が高濃度のDMSOで生じることを示唆している(Ts'o, P.O.P. et al., Tetrahedron, 1961, 13, 198; Zimmerman,E. et al. Biochemische Zeitschrift, 1966, 344, 386)。
核酸の変性は、強調されるハイブリダイゼーション応答にとっては有益であるが、過剰に変性された種は、大きな凝集塊を形成し易く、そのような凝集塊は溶液から沈殿する傾向にある。DNA凝集塊は、ゲルマトリクスを通り抜けることができないので、ゲルのウェル内に維持される(図1のパネルB)。図2は、時間の経過と共に、変性された種が凝集する様子を示している。それゆえ、核酸を増加する濃度のDMSOに曝露すると、高容量の工業プリント操作に必要とされるような比較的長い期間に亘り核酸を劣化させ、その結果、プリントされたアレイの生産性が減少し得る。さらに、高いDMSO濃度では溶液中の塩の溶解度が減少するので、インク中の塩は、比較的少量で存在する場合でさえも、核酸の凝集と沈殿に影響を与え得る。さらに、図3のパネルAおよびBからのデータが示すように、DNAの変性は、塩のない場合さえも、DMSOインク中で生じる。
塩の最も重要な効果は、プリントピンおよび被覆されるスライド表面などの部材の湿潤性に影響を与えることにある。アレイの製造において、核酸インクが、接触プリントピンを完全に濡らし、ピンから基体の官能化された表面に完全に移行できることが望ましい。言い換えれば、インクは、ピンに付着し、表面に大量に吸着されるべきである。それゆえ、pHや、塩および有機溶媒の濃度を含む他のパラメータを注意深く決定しなければならない。
本発明のインク組成物は、一部は、水の濃度を減少させることにより、蒸発に関連する問題を克服する。さらに、本出願人等は、予期せずに、本発明の組成物の少なくとも四つの他の利点を発見した。第一に、本発明の組成物は、核酸の長期間貯蔵を可能にし、このため、アレイを連続的に大量生産できる。以前は、短期の貯蔵が、従来技術における解決できなかった永続的な問題であった。第二に、本発明の組成物により、優れた付着性、ハイブリダイゼーション効率および結合支持体上にプリントされた核酸種からの応答を提供するプリント可能なインク溶液が生成される。荷電した支持体表面について、本発明のインク組成物中の比較的低い塩濃度により、核酸を支持体に良好に結合させるために溶液のイオン強度が減少する。第三に、約60体積%以上のDMSO濃度を持つ組成物により、変性レベルが増大し、これは、さらに予期せぬことに、時間の経過と共に増加する。しかしながら、本発明は、約80%を超える濃度では、DMSOは、過剰な変性を生じ、高度に変性された核酸が凝集してしまい、溶液から沈殿し、検定において効果的なハイブリダイゼーションができないことも発見した。第四に、DMSO、低レベルの塩、および制御されたpHの組合せにより、プリントされたときに好ましいスポットのモルホロジーが生じる。従来、塩の濃度が高いほど、良好な視角的コントラストが達成されると考えられていた。しかしながら、本出願の発明者等は、比較的低濃度でも、好ましい光の散乱が達成されることを発見した。塩は、インクの溶媒成分が乾燥した際に、溶液から結晶化すると考えられている。
それゆえ、本発明の媒質は、蒸発を減少させ、懸濁された核酸の安定性を増大させ、プリントされたスポットの検出を改善する最適な組成物を提供する。この媒質は、空気から水分を吸収して、水成分の蒸発による溶媒の正味の損失を克服すると考えられる。さらに、この組成物は、長期に亘り溶液中の核酸の変性を制御する。核酸は、従来のプリント用インクで達成されるよりも、検定において核酸配列間のハイブリダイゼーションにより好ましく、立体配座を明らかに示す。これらの全ての特性が、核酸インク溶液において望ましい。
本発明によれば、プリント用インク組成物は、水、核酸、約30体積%または約40体積%から約80体積%のジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せ、および酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、またはコハク酸塩を含有する溶液から調製される、約3.5から9.5の範囲の最終pH値を持つ緩衝液を含有する。緩衝液が酢酸/酢酸塩溶液を含有する場合、pH値は、約6から約8.5、好ましくは約6.5から約7.5である。緩衝液がクエン酸/クエン酸塩溶液である場合、pH値は、約3.5から約7.5、好ましくは約4から約6.5である。緩衝液がクエン酸/クエン酸塩−リン酸塩溶液である場合、pH値は、約6.0から約9、好ましくは約7から約8.5である。緩衝液を、コハク酸/OH/コハク酸塩溶液から調製する場合、pH値は、約3.5から約7、好ましくは約4から約6.5である。約5〜5.5のpH値でマレイン酸塩緩衝系を使用してよく、このとき混合溶媒組成物は、エチレングリコールまたはホルムアミドいずれかを含有し、またはpHが約8から8.5でDMSOによる緩衝系を使用してもよい。
ある実施の形態において、組成物が約40体積%から約80体積%のDMSOを含有する場合、緩衝溶液は、約0.1X(1.65mMのクエン酸+0.85mMのクエン酸ナトリウム)から約0.8X(13.2mMのクエン酸+6.8mMのクエン酸ナトリウム)の最終濃度を有する。組成物が約40〜70体積%のDMSOを含有する場合、クエン酸塩緩衝系は、約0.1Xから約0.5X(8.25mMのクエン酸+4.25mMのクエン酸ナトリウム)の最終濃度を有する。溶液が約40〜60体積%のDMSOを含有し、クエン酸緩衝液が、約0.1Xから約0.4X(6.6mMのクエン酸+3.4mMのクエン酸ナトリウム)の最終濃度を有することが好ましい。溶液が約50体積%のDMSOを含有し、クエン酸塩緩衝液が、約0.25X(4.125mMのクエン酸+2.125mMのクエン酸ナトリウム)の最終濃度を有することがより好ましい。
組成物が約40体積%から約80体積%のDMSOを含有する場合、酢酸/酢酸塩緩衝溶液は、約0.1X(4.64mMの酢酸+0.36mMの酢酸ナトリウム)から約0.8X(37.12mMの酢酸+2.88mMの酢酸ナトリウム)の最終濃度を有する。DMSOが約40〜70体積%である場合、酢酸塩緩衝系は、約0.1Xから約0.5X(23.2mMの酢酸+1.8mMの酢酸ナトリウム)の最終濃度を有する。溶液が約40〜60体積%のDMSOを含有し、酢酸塩緩衝液が約0.1Xから約0.4X(18.56mMの酢酸+1.44mMの酢酸ナトリウム)の最終濃度を有することが好ましい。組成物が約50体積%のDMSOおよび約0.25X(11.6mMの酢酸+0.9mMの酢酸ナトリウム)の最終濃度の酢酸塩緩衝液を有してなることがより好ましい。
組成物が約40体積%から約80体積%のDMSOを含有する場合、クエン酸/クエン酸塩−リン酸塩に基づく緩衝溶液は、約0.1X(1.52mMのクエン酸+1.93mMのリン酸ナトリウム)から約0.8X(12.16mMのクエン酸+15.44mMのリン酸ナトリウム)の最終濃度を有する。DMSOが約40〜70体積%である場合、クエン酸/クエン酸塩−リン酸塩緩衝系は、約0.1Xから約0.5X(7.6mMのクエン酸+9.65mMのリン酸ナトリウム)の最終濃度を有する。組成物が40〜60体積%のDMSOを含有し、クエン酸/クエン酸塩−リン酸塩緩衝系が約0.1Xから約0.4X(4.8mMのクエン酸+7.72mMのリン酸ナトリウム)の最終濃度を有することが好ましい。組成物が約50体積%のDMSOを有してなり、クエン酸/クエン酸塩−リン酸塩緩衝系が約0.25X(3.8mMのクエン酸+4.825mMのリン酸ナトリウム)の最終濃度を有することがより好ましい。
組成物が約40体積%から約80体積%のDMSOを含有する場合、コハク酸/水酸化ナトリウムに基づく緩衝溶液は、約0.1X(2.5mMのコハク酸+0.75mMの水酸化ナトリウム)から約0.8X(20.0mMのコハク酸+6.0mMの水酸化ナトリウム)の最終濃度を有する。DMSOが約40〜70体積%である場合、コハク酸/水酸化ナトリウム緩衝系が、約0.1Xから約0.5X(12.5mMのコハク酸+3.75mMの水酸化ナトリウム)の最終濃度を有する。溶液が約40〜60体積%のDMSOを含有し、コハク酸/水酸化ナトリウム緩衝系が、約0.1Xから約0.4X(10mMのコハク酸+3mMの水酸化ナトリウム)の最終濃度を有することが好ましい。組成物が約50体積%のDMSOを有してなり、コハク酸/水酸化ナトリウム緩衝系が約0.25X(6.25mMのコハク酸+1.875mMの水酸化ナトリウム)の最終濃度を有することがより好ましい。
他の実施の形態において、インクは、個別か一緒のいずれかで、もしくはDMSOと共に、約1体積%から約50体積%または55体積%のエチレングリコール(EG)またはホルムアルデヒドの混合有機溶液を有してなる。混合有機溶液を有するインク組成物は、核酸種からの優れたハイブリダイゼーション応答を有することに加えて、pHの単なる制御を超えた良好な核酸安定性も提供し、これにより、長期間のプリント運転でのアレイの大量生産が促進される。
インク組成物が約40体積%から約80体積%のDMSOおよび先に特定したような約0.1Xから約0.8Xの最終濃度でのクエン酸塩緩衝液を有してなることが好ましい。組成物が、約40体積%から約75体積%のDMSOおよび約1体積%から約50体積%のEG並びに約0.25Xから約0.5Xの最終濃度のクエン酸塩緩衝液を有してなることがより好ましい。組成物が、約50体積%のDMSO、約10体積%から約40体積%のEGおよび約0.25Xの最終濃度のクエン酸塩緩衝液を有してなることが最も好ましい。もちろん、上述したような他の緩衝系を用いてもよい。ある実施の形態において、エチレングリコールの代わりに、ホルムアルデヒドを用いても差し支えない。エチレングリコールおよび/またはホルムアルデヒドを含有する実施の形態において、有機溶液は約5体積%から約40体積%のEG/ホルムアルデヒドを有してなることが好ましい。溶液が約10体積%から約30体積%のEG/ホルムアルデヒドを有してなることがより好ましい。以下の実施例における各表は、本発明の組成物における緩衝液の濃度およびpHを列挙している。
インク組成物は、0から約4mMの間、好ましくは0.5mMの最終濃度でエチレン−ジアミン−テトラ−酢酸(EDTA)を含有してもよい。湿潤性を向上させ、プローブの先端で付着させるため、または特定のプリント状況のために組成物に所望のレオロジー特性を与えるように、インクの粘度を変えられるもの(例えば、グリセロールなど)を含む他の試薬をインク組成物の一部として含ませることもできる。インクは、コバルト(III)ヘキサアミン、スペルミン、スペルミジン、ポリリシン、ヒストンタンパク質などの多価の陽イオン、有機および無機の分子を低濃度で含有してもよい。これらの分子の正電荷により、負の電荷が近隣のDNA断片上で架橋することにより、DNA断片の縮合または自己結合が生じる。少量の中性ポリマー(例えば、デキストラン)は、媒質中の核酸の、プリントされた基体表面への保持能力を改善できるであろう。これらの代わりの非イオン性試薬は、ポリ陽イオン縮合剤から発生する任意の複雑な状態を潜在的に緩和できる。さらに、それらの試薬は、全てのHDA基体に適用でき、必ずしも、正に荷電されたHDA基体には限られない。
本発明のインク組成物により、長期の貯蔵が可能となり、核酸の沈殿や凝集による不安定性がなく、核酸の完全さが保持される。その結果、この組成物により、少なくとも15〜20日間に亘る長期のプリントが可能になる。
本発明のインク組成物および方法に用いられる核酸は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)を含んでよい。核酸は、一本鎖でも二本鎖であってもよい。核酸は、例えば、PCR生成物、PCRプライマー、または核酸二重体(duplex)であってもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖のDNAまたはオリゴヌクレオチドであることが好ましい。インク溶液中の核酸の一般的な濃度は、約0.01mg/mlから約0.50mg/mlまでに亘り、好ましくは約0.25mg/mlである。
別の態様によれば、本発明は、核酸を固体支持体に付着させる方法を提供する。この方法は、固体支持体上に本発明によるインク溶液を接触させるかまたは他の様式で付着させる工程を有してなる。この付着工程は、ピンの先端をインク溶液中に浸し、ピンの先端にインクが付いた状態でその先端をインク溶液から取り出し、インクを固体支持体に移す各工程を有してなる。付着工程は、核酸の一つ以上のアレイを提供するように複数回繰り返しても差し支えない。これは、例えば、凸版ピンアレイを使用することにより行うことができる。付着工程は、自動化されたロボット式プリンタを用いて行ってもよい。そのようなロボット式システムは、例えば、マサチューセッツ州、ケンブリッジ所在のインテリジェント・オートメーション・システムズ(Intelligent Automation Systems: IAS)社から市販されている。
このピンは中実でも中空であっても差し支えない。中実ピンの先端は一般に平坦であり、ピンの直径により、基体に移送される流体の体積が決定される。凹形底部を有する中実ピンを使用しても差し支えない。一度の試料装填により多数のアレイをプリントするために、中実ピンよりも大きな試料体積を保持し、したがって、一度の装填により複数のアレイをプリントできる中空ピンを用いても差し支えない。中空ピンとしては、プリント毛管、ピンセット(tweezer)およびスプリット・ピンが挙げられる。好ましいスプリット・ピンの例は、テレケム・インターナショナル(TeleChem International)(カリフォルニア州、サニーベイル所在)が開発したマイクロ・スポッティング・ピンである。
ピンの行列からの各ピンが対応する供給ウェル、例えば、マイクロタイタ・プレートのウェル中に嵌るように配列された凸版ピンアレイを使用して、HDAを形成することが好ましい。このピンアレイは、再吸引(redraw)毛管イメージング・リザーバと共に使用してもよい。ここに引用する国際公開第99/55460号パンフレットを参照のこと。
本発明の方法によれば、プリントされた核酸を保持できる限り、どのような固体支持体を用いてもよい。固体支持体は、核酸を上に付着させる平坦表面を有することが好ましい。固体支持体は典型的に膜またはガラス基板である。例えば、固体支持体は、ソーダ石灰、または他のガラス組成物から製造された市販のガラス製顕微鏡用スライド(3インチ×1インチ(約7.5cm×2.5cm))などの二次元固体ガラス表面である。基体は、ボロアルミノシリケートガラスまたはホウケイ酸ガラス(例えば、米国特許出願第09/245142号明細書)いずれかから製造されていることが好ましい。他の支持体としては、三次元多孔質ガラス表面(例えば、コーニング社によるVycor(商標);米国特許出願第10/101144号明細書)またはPyrex(商標)ガラスフリット(例えば、米国特許第10/101135号明細書)からテープ・キャストまたはゾル・ゲルプロセスにより製造された多孔質ガラス基板が挙げられる。ガラス基体が、核酸の付着を促進させるように官能化されたかまたはコーティングされた表面を有することが好ましい。例えば、その表面は、アミノ、ヒドロキシル、またはアルキルチオール基、アクリル酸、エステル、無水物(例えば、スチレン−コ−マレイン酸無水物(SMAコポリマー))、アルデヒド、エポキシドまたは反応性官能基を生成できる他の保護された前駆体を含む様々な反応性極性部分を有してなる。ガンマ−アミノプロピルシラン(GAPS)(例えば、γ−アルミノプロピルトリメトキシシラン、N−(ベータ−アミノエチル)−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、N−(ベータ−アミノエチル)−γ−アミノプロピルトリエトキシシランまたはN’−(ベータ−アミノエチル)−γ−アミノプロピルメトキシシラン)などのアミノアルキルシランまたはポリリシンを有してなるもののような、表面コーティングアミノ化剤が好ましい。
プリントの後処理において、スライドを熱い沸騰水にさらすと、DMSO/エチレングリコール/ホルムアルデヒドベースのインク組成物(変性溶媒)中のプリントされた核酸(DNA)をさらに変性することができる。プリントされたスライドの後の熱変性から得られた強調信号は、ハイブリダイゼーション効率の改善を示唆する。
本発明の方法により製造されたアレイを、標識付けられた標的(例えば、オリゴヌクレオチド、cDNAやcRNAなどの核酸断片、PCT生成物など)を用いて、調べてもよい。標的は、Cy3、Cy5、またはAlexa染料などのフルオロフォアで、またはビオチン、ジゴキソゲニン(digoxogenin)などの他のハプテンで標識付けてもよい。核酸をビオチン化する方法は、馴染みがあり、ピアス(Pierce)により記載されている(Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook. Pierce Chemical Company, 1992, Rockford, Illinois)。
あるいは、ハイブリダイゼーション事象(すなわち、ビオチンの存在)を検出するために、固体支持体を、ストレプトアビジン/ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベーションしてもよい。そのような酵素複合体は、例えば、ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)(カリフォルニア州、バーミンガム)から市販されている。ストレプトアビジンは、高親和性でビオチン分子と結合して、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをハイブリダイゼーションされたプローブに近接して架橋させる。結合していないストレプトアビジン/ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体は、簡単な洗浄工程で洗い流される。次いで、過酸化物および適切な緩衝液の存在下で沈殿している基体を用いて、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ酵素の存在を検出する。アルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)について化学発光基体を、もしくはHRPまたはアルカリ性ホスファターゼについて発光基体を使用することも可能である。その例としては、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)社から得られるアルカリ性ホスファターゼについてのジオキシ基体またはジェー・ビー・エル・サイエンティフィック(JBL Scientific)(カリフォルニア州、サンルイスオビスポ)社からのAttophos HRP基体が挙げられる。
高密度核酸アレイの使用および製造方法が、Microarray Biochip Technology, M.Schena, el. Eaton Publishing, Natick, MA (2000)に述べられている。本明細書を通じて挙げられた特許および他の文献を引用する。
以下のセクションの実施例は、本発明の利点および品質を例示し、説明するものである。
一連の研究において、40体積%、50体積%、70体積%、および80体積%のDMSO、エチレングリコール、またはホルムアルデヒドの溶媒溶液を使用して、それぞれ3つの異なるpH値で、8種類の異なる緩衝系を調製した。図4Aは、8種類の緩衝系により製造されたインク溶液を用いてプリントしたそれぞれのアレイの着色像を示している。緩衝液組成物を調節することにより、各インク溶液のpH値が変わる。1.5kBのDNA断片を、図のパネルAに指定した各インクでプリントし、Cy3標識相補DNAでハイブリダイゼーションした。比較対照のために、中央は、それぞれ、左から右に、2列ずつの1X SSC含有インク、0.25X SSC含有インク、および遺伝標準DMSOベースインクがプリントされたアレイである。各インク溶液を、塩の含有量、バイオ・フォーマットした核酸(DNA)の安定性、およびプリントされた核酸からのハイブリダイゼーション応答についてスクリーニングした。これらの研究から、表1に要約したインク組成物は、現在使用されているDMSO:SSCインクよりも安定であり、匹敵するかまたはより良好なハイブリダイゼーション応答を示す。
図4Aおよび4Bの両方から分かるように、緩衝系のpHは、本発明のインク組成物を用いてプリントしたマイクロアレイのハイブリダイゼーションの性能に大きな影響を与える。クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、酢酸塩またはコハク酸塩を含有するインク組成物を用いたハイブリダイゼーションは、フタル酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、またはトリス−マレイン酸塩を含有するインク系、並びに対照よりも良好に機能した。リン酸塩含有インクのハイブリダイゼーション性能は、クエン酸塩またはクエン酸塩−リン酸塩インクのものに匹敵するように思えるが、リン酸塩は、DMSO溶媒を含有する媒質中で沈殿し易い。それゆえ、リン酸塩のみの緩衝液組成物は好ましくない。
図5A〜5Fは、着色像で、他のプリントインク溶液と比較した、本発明によるDMSO:クエン酸塩ベースのインクを示している。γ−アミノプロピルシラン(GAPS)を被覆したガラススライド上で、22の酵母ORFおよび対照としての、pBR DNAのCy5標識付け1.5kB断片を6種類の異なるインクでプリントした。パネルA〜Fの各々は、Flexyのロボット式プリンタを用いて別々のピンによりプリントし、各DNA片は三重にプリントした。パネルAは、50%のDMSO:1X SSCベースのインクを用いてプリントし;パネルBは、50%のDMSO:0.25X SSCベースのインクを用い;パネルCは、50%のDMSO:クエン酸塩(0.25X、pH5.5)インクを用いた。パネルDおよびEに用いたインクは、DMSOを含有しなかった。それぞれ、水性の80%のエチレングリコールベースのインクおよび50%のエチレン:0.25X SSCベースのインクを、パネルDおよびEに用いた。パネルFは、50%のホルムアルデヒド:0.25X リン酸塩溶液を用いてプリントした。Cy3標識した酵母cDNA試料を、プリントしたマイクロアレイにハイブリダイゼーションした。信号強度を強調し、それによって、マイクロアレイのハイブリダイゼーション性能の感度を改善する上でのインクの役割が、これらのパネルにおいて明らかに示された。
安定性に関して、エチレングリコール(EG)およびホルムアルデヒドベースのインクの全てが優れていたが、一般に、DMSOベースのインクよりも低いハイブリダイゼーション信号を示したことが分かった。それでも、エチレングリコールおよびホルムアルデヒドベースのインクの特定の組成物は、匹敵するハイブリダイゼーションの性能を与えられる。それらの組成が表2に列挙されている。
表2のエチレングリコールおよびホルムアルデヒドベースのインクは、良好なハイブリダイゼーション信号を示し、1.0Xと0.1Xとの間の塩濃度および様々なpH条件下で安定であった。より重要なことに、これらのインクは安定性を維持し、核酸は、80%までの有機物含有量を持つ組成物中で懸濁されたままであった。このことは、インク溶液から水が蒸発すると、有機成分が豊富な最終組成物が一般に得られるので、価値のある特性である。
一方で、DMSOベースのインク中のDMSOは、プリントされた核酸のハイブリダイゼーション効率に好ましく寄与するが、DMSOは、長期間に及ぶと核酸の完全さを損なうので、高濃度では使用できない。もう一方で、エチレングリコールおよび/またはホルムアルデヒドを含有するインク組成物は、高濃度で安定であり、溶液中の水の総量を低下させるので、水の蒸発による濃度減少を低下させるのに有用である。DMSOおよびEGベースのインクの両方の好ましい特性を組み合わせたインクは、潜在的に非常に有益である。
DMSOおよびエチレングリコール(EG)/ホルムアルデヒドの両方を含有する、表3に列記した混合組成のインクは、安定であると同時に、大量生産プリントのための寿命および要求されるレベルのハイブリダイゼーション効率の両方を満たすほど十分に核酸を変性している。
改めて言うと、多量の有機成分を含有したインク組成物は、水分の蒸発の影響をそれほど受けないので、これらのインクは、それに関連する有害の問題をそれほど被らなかった。図6A(着色像)および図6Bは、4種類の異なるインク組成物:α)−50%のDMSO:SSC(0.25X);β)−50%のDMSO:クエン酸塩(0.25X、pH約5.5);γ)−80%の水性エチレングリコール;δ)−50%のDMSO+30%のエチレングリコール:クエン酸塩(0.25X、pH約5.5)中の1.5kBのDNAがプリントされたDNAアレイ上のCy3標識した1.5kBのDNAにより行われたハイブリダイゼーションの比較を示している。このDNAは異なる濃度でプリントされた:1)0.25mg/ml;2)0.125mg/ml;3)0.06mg/ml。
図7Aは、GAPS被覆スライド上にプリントされた、それぞれ4種類の酵母遺伝子の24の複製体からなる、DNAマイクロアレイ上の酵母cDNAハイブリダイゼーションの着色像を示している。組成物1(Comp1)は非緩衝インクである。本発明によれば、組成物2(Comp2)は、pH5.5での50%のDMSO:クエン酸塩であり、組成物3(Mixed)は、50%のDMSO+30%のエチレングリコール:クエン酸塩の混合インクである。図7Bは、検査したインクによる遺伝子に関するCy3およびCy5チャンネル由来の平均ハイブリダイゼーション信号における差を要約している。上述したインクのいずれにより得られた正味の保持およびハイブリダイゼーション信号は、DNAの配列および切断された断片に依存するのが分かる。それゆえ、信号は遺伝子ごとに異なるであろう。インクの湿潤性は、プリント表面の表面エネルギーなどの、インクが接触する材料の物理的性質による。言い換えれば、インクに得られたハイブリダイゼーションからの絶対信号は、ピンおよびスライドの材料による。
本発明を、一般的に、並びに実施例と図面により、詳細に説明してきたが、当業者には、本発明は、具体的に開示された実施の形態に必ずしも制限されず、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、改変および変更を行えることが理解されるであろう。それゆえ、変更が、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲から逸脱しない限り、それらは本発明に含まれるとみなされるべきである。
Claims (11)
- 核酸の溶液を懸濁させるための媒質であって、前記媒質が、
ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せを有してなる、約30体積%から約80体積%の有機溶液、
約3.5〜9.5のpH値を持つ緩衝液、
水、および
核酸、
を有してなる組成を有し、
前記核酸が、より好ましいハイブリダイゼーションを行うように変性することを特徴とする媒質。 - 核酸を支持体上に付着させる方法であって、
a) 約30体積%から約80体積%のジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せ;約3.5〜9.5のpH値を持つ緩衝液;水;および核酸を有してなる組成を持つ核酸の溶液を提供し、
b) 前記支持体に前記溶液を付着させる、
各工程を有してなる方法。 - 前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、マレイン酸塩、またはコハク酸塩を含む溶液から調製され、
a) 前記緩衝液が酢酸塩を含む場合、前記pH値が約6から約8.5までであり、
b) 前記緩衝液がクエン酸塩を含む場合、前記pH値が約3.5から約7.5までであり、
c) 前記緩衝液がクエン酸塩−リン酸塩を含む場合、前記pH値が約6.0から約9までであり、
d) 前記緩衝液がコハク酸塩を含む場合、前記pH値が約3.5から約7までであり、
e) 前記緩衝液がマレイン酸塩を含む場合、前記pH値が約5から約8.5までであることを特徴とする請求項1または2記載の発明。 - 前記組成物により、前記核酸の沈殿または凝集による不安定性なく該核酸の完全さを維持しながら、少なくとも15日間に亘り長期の貯蔵およびプリントが可能になることを特徴とする請求項1または2記載の発明。
- 前記組成が、
a) 約40体積%から約80体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.8Xのクエン酸+クエン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
b) 約50体積%のDMSOおよび約0.25Xのクエン酸+クエン酸ナトリウムの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、
c) 約40体積%から約80体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.8Xの酢酸+酢酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
d) 約50体積%のDMSOおよび約0.25Xの酢酸+酢酸ナトリウムの最終濃度の酢酸塩緩衝液、
e) 約40体積%から約80体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.8Xのクエン酸+リン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
f) 約50体積%のDMSOおよび約0.25Xのクエン酸+リン酸ナトリウムの最終濃度のクエン酸/クエン酸塩−リン酸塩緩衝液、
g) 約40体積%から約80体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.8Xのコハク酸+水酸化ナトリウムの最終濃度の緩衝液、または
h) 約50体積%のDMSOおよび約0.25Xのコハク酸+水酸化ナトリウムの最終濃度のコハク酸/水酸化ナトリウム緩衝液、
を有してなる請求項1から4いずれか1項記載の発明。 - 前記組成が、多価の陽イオン、有機および無機の分子、または中性ポリマーを含有することを特徴とする請求項1から5いずれか1項記載の発明。
- 前記陽イオン分子が、コバルト(III)ヘキサアミン、スペルミン、スペルミジン、ポリリシン、ヒストンを含むことを特徴とする請求項1から6いずれか1項記載の発明。
- 核酸の溶液を懸濁させるための媒質であって、個別に、一緒に、またはDMSOと共に、約1体積%から約55体積%の、エチレングリコール(EG)またはホルムアルデヒド;約3.5〜9.5のpH値を持つ緩衝液;水;および核酸を有してなる組成を有することを特徴とする媒質。
- 固体支持体上に核酸を付着させる方法であって、
前記固体支持体上に、個別に、一緒に、またはDMSOと共に、約1体積%から約55体積%の、エチレングリコール(EG)またはホルムアルデヒドの混合有機溶液;約3.5〜9.5のpH値を持つ緩衝液;水;および核酸を有してなる組成を有する核酸の溶液を付着させる工程を有してなる方法。 - 前記組成が、
a) 約40体積%から約80体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.8Xの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、
b) 約40体積%から約75体積%のDMSO、約1体積%から約50体積%のEGおよび約0.25Xから約0.5Xの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、または
c) 約50体積%のDMSO、約10体積%から約40体積%のEGおよび約0.25Xの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、
を有してなることを特徴とする請求項8または9記載の発明。 - 前記組成が、
a) 約40体積%から約60体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.4Xのクエン酸+クエン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
b) 約50体積%のDMSOおよび約0.25Xのクエン酸+クエン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
c) 約40体積%から約60体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.4Xの酢酸+酢酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
d) 約40体積%から約60体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.4Xのクエン酸+リン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、または
e) 約40体積%から約60体積%のDMSOおよび約0.1Xから約0.4Xのコハク酸+水酸化ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
を有してなることを特徴とする請求項8または9記載の発明。
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