DE69818371T2 - "Bubble-jet" -Verfahren zur Probenaufgabe auf festen Trägern und zur Herstellung von Sondenarrays. - Google Patents

"Bubble-jet" -Verfahren zur Probenaufgabe auf festen Trägern und zur Herstellung von Sondenarrays. Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spotbildung einer Sonde auf einem festen Träger, eine Sondenanordnung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ein Verfahren zum Nachweis einer einsträngigen (ss) Zielnukleinsäure und ein Verfahren zur Identifizierung einer Basensequenz einer ss-Zielnukleinsäure unter Verwendung der Probenanordnung.
  • Verwandter Stand der Technik
  • Als rasches und akkurates Verfahren zur Bestimmung einer Basensequenz einer Nukleinsäure, zum Nachweis einer Zielnukleinsäure in einer Probe und Identifizierung verschiedener Bakterien ist die Verwendung einer Sondenanordnung, wo eine oder mehrere Substanzen, die spezifisch an eine Zielnukleinsäure binden können, sog. Sonden, auf einem festen Träger auf einer großen Anzahl von Stellen angeordnet sind, vorgeschlagen worden. In einem allgemeinen Verfahren zur Herstellung dieser Probenanordnungen, das in der EP Nr. 0373203B1 beschrieben ist, (1) wird die Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger synthetisiert oder (2) eine zuvor synthetisierte Sonde auf einem festen Träger angebracht. Das USP Nr. 5405783 beschreibt das Verfahren (1) im Einzelnen. Betreffend das Verfahren (2) lehren das USP Nr. 5601980 und Science, Bd. 270, Seite 467 (1995) ein Verfahren zum Anordnen von cDNA in einer Anordnung unter Verwendung einer Mikropipette.
  • Bei dem obigen Verfahren (1) ist es nicht notwendig, eine Nukleinsäuresonde vorher zu synthetisieren, weil die Nukleinsäuresonde direkt auf einen festen Träger synthetisiert wird. Allerdings ist es schwierig, eine Nukleinsäuresonde, die auf einem festen Träger synthetisiert ist, zu reinigen. Die Genauigkeit bei der Bestimmung der Basensequenz einer Nukleinsäure und beim Nachweis der Nukleinsäure in einer Probe unter Anwendung einer Sondenanordnung hängt im großen Umfang von der Richtigkeit der Basensequenz der Nukleinsäuresonde ab. Für das Verfahren (1) ist daher eine weitere Verbesserung der Genauigkeit einer Nukleinsäuresonde erforderlich, um eine Sondenanordnung besserer Qualität herzustellen. Bei dem Verfahren (2) ist eine Stufe für die Synthetisierung einer Nukleinsäuresonde vor der Fixierung der Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger erforderlich, allerdings kann die Nukleinsäuresonde vor der Bindung der Probe an einen festen Träger gereinigt werden. Aus diesem Grund ist also gegenwärtig das Verfahren (2) bevorzugter als das Verfahren (1) für ein Verfahren zur Herstellung einer Probenanordnung hoher Qualität. Allerdings ist das Verfahren (2) problematisch bei dem Vorgang der dichten Spotbildung einer Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger. Wenn beispielsweise eine Sondenanordnung dafür verwendet wird, die Basensequenz einer Nukleinsäure zu bestimmen, ist es bevorzugt, so viele Arten von Nukleinsäuresonden wie möglich auf einem festen Träger anzuordnen. Wenn Mutationen in einem Gen effektiv nachgewiesen werden sollen, ist es bevorzugt, Nukleinsäuresonden von Sequenzen, die den jeweiligen Mutationen entsprechen, auf einem festen Träger anzuordnen. Wenn außerdem eine Zielnukleinsäure in einer Probe oder zu Genmutationen und -deletionen nachgewiesen werden sollen, ist es gewünscht, dass die Menge der Proben, die von einem Individium entnommen wird, insbesondere eine Blutprobe, so klein wie möglich ist. Es ist somit bevorzugt, dass soviel Informationen wie möglich auf der Basensequenz unter Verwendung einer kleinen Probenmenge erhalten wird. Unter Berücksichtigung dieser Punkte ist es bevorzugt, dass beispielsweise 10.000 oder mehr Nukleinsäuresondenspots pro Quadratinch (1.550 pro Quadratzentimeter) in einer Sondenanordnung angeordnet werden.
  • Patent Abstracts of Japan, Bd. 097, Nummer 006, 30. Juni 1997 beschreibt ein Verfahren zum Fixieren eines Antigens oder Antikörpers an eine feste Phase ohne Desaktivierung desselben bzw. derselben, wobei ein Drucker vom Tintenstrahltyp mit einem piezoelektrischen Element in seinem Druckmechanismus verwendet wird.
  • Die Arbeit von O'Donnell-Maloney und Little mit dem Titel "Mikrofabrication and array technologies for DANN sequencing and diagnostics", Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 13 (1996) Seiten 151–157 ist ein anderes Dokument, das die Versendung der piezoelektrischen Tintenstrahltechnologie für die Fleckenbildung von Sondentröpfchen auf einem Substrat offenbart.
  • Database WPI Section CH, Week, 9304, Derwent Publications Ltd., London, GB; Class E17, AN 93-031735 XP002105850 beschreibt eine Tintenzusammensetzung auf Wasserbasis, die für den Tintenstrahldruck geeignet ist.
  • Patent Abstracts of Japan, Bd. 018, Nr. 306 (P-1752), 10. Juni 1994 beschreibt ein Messverfahren für ein kochempfindliches Antigen, das genau das Rinderserumalbumin (BSA) das als Blockierungsmittel verwendet wird, reinigt.
  • Die Arbeit von Chrisey et al. mit dem Titel "Fabrication of patterned DNA surfaces" beschreibt die Verwendung von photolithographischen Verfahren zur Bildung von Mustern von einzelnen oder multiplen DNA-Spezies auf einem festen Träger.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Als Ergebnis der Forschung, die von den Erfindern durchgeführt wurde, um die oben diskutierten Probleme zu lösen, haben sie festgestellt, dass ein Tintenstrahlausstoßverfahren unter Verwendung der Bubble-jet-Technik die Spotbildung einer Sonde mit beträchtlich hoher Dichte ermöglicht, so dass auf diese Weise die vorliegende Erfindung gemacht werden konnte.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer Sondenanordnung zur Verfügung zustellen, wobei eine große Anzahl von Sonden auf einem festen Träger gebunden werden, ohne dass die Sonden beschädigt werden.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung einer Probenanordnung mit einer Vielzahl von Spots, die voneinander unabhängig auf vielen Stellen auf einer Oberfläche eines festen Trägers angeordnet sind, zur Verfügung gestellt, wobei die Spots eine Sonde enthalten, die spezifisch an eine Zielsubstanz binden, mit einer Stufe, bei der eine Flüssigkeit, die die Sonde enthält, zugeführt wird und die Flüssigkeit an eine vorbestimmte Stelle auf der Oberfläche des festen Trägers nach einer Tintenstrahlmethode zur Bildung von Spots gebunden wird, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Tintenstrahlmethode ein Bubble-jet-Verfahren ist.
  • Das USP-Nr. 5601980 hat festgestellt, dass es ungeeignet ist, eine herkömmliche Tintenstrahlmethode bei der Spotbildung einer Nukleinsäuresonde zu verwenden. In den Zeilen 31–52 in der zweiten Spalte von USP Nr. 5601980 wird gesagt, dass die Anwendung der Tintenstrahldrucktechnik, wobei eine kleine Menge Tinte durch eine Druckwelle ausgestoßen wird, ungeeignet ist, weil die Druckwelle zum Ausstoßen der Tinte zu einem drastischen Anstieg der Tintentemperatur führen und damit zur Beschädigung der Nukleinsäuresonde führen kann und das Streuen der Tinte beim Ausstoßen kann zu einer Kontamination der angrenzenden Sondenspots führen. Daher beschreibt das USP-Nr. 5601980 ein Verfahren zur Herstellung einer Sondenanordnung, wobei ein Tropfen einer Flüssigkeit, die eine Nukleinsäuresonde enthält, auf einer Spitze einer Mikropipette unter Anwendung eines Gasdrucks gebildet wird, während die Größe des Tropfens überwacht wird, die Druckanwendung beendet wird, wenn der Tropfen die vorbestimmte Größe erreicht hat und der Tropfen auf einen festen Träger aufgetragen wird.
  • Das USP Nr. 5474796 beschreibt die Herstellung einer Oligonukleotidanordnung, wobei eine Matrix auf hydrophoben und hydrophilen Bereichen auf einer festen Trägeroberfläche gebildet wird und vier Nukleotide nacheinander auf den hydrophilen Bereich mit einer Strahlpumpenvorrichtung unter Anwendung eines piezoelektrischen Impulses ausgestoßen werden und ein Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz einer Zielnukleinsäure unter Anwendung der Oligonukleotidanordnung. Allerdings beschreibt dieser Stand der Technik kein Verfahren, bei dem Nuk- 1einsäuresonden, die jeweils eine Basensequenz einer vorbestimmten Länge aufweisen, vorher unter Anwendung einer Tintenstrahltechnik ausgestoßen werden, um die Nukleinsäuresonden genau und dicht anzuordnen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Ansicht, die ein Verfahren zur Herstellung einer Sondenanordnung unter Verwendung eines Bubble-jet-Kopfes erläutert;
  • 2 ist eine Querschnittsansicht entlang der Linie 2-2 des Bubble-jet-Kopfes von 1;
  • 3 zeigt einen Graph, der eine theoretische Menge und eine tatsächliche Gewinnung einer Nukleinsäurensonde, die nach dem Bubble-jet-Verfahren in Beispiel 3 auf einer Aluminiumplatte aufgetragen worden ist, erläutert;
  • 4 zeigt einen Graph, der eine theoretische Menge und eine tatsächliche Gewinnung einer Nukleinsäuresonde, die auf einer Aluminiumplatte nach dem Bubble-jet-Verfahren in Beispiel 4 aufgetragen worden ist, erläutert;
  • 5A ist eine schematische Planansicht von einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Sondenanordnung und
  • 5B ist eine Querschnittsansicht, die entlang der Linie 5B-5B in 5A aufgenommen wurde; und
  • 6 dient zur Erklärung des Spotbildungsverfahrens in Beispiel 8.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • (Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung einer Sondenanordnung)
  • Die 1 und 2 sind schematische Diagramme, die ein Verfahren zur Herstellung einer Sondenanordnung, beispielsweise einer Nukleinsäuresondenanordnung, nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutern. In 1 sind ein Flüssigkeitszuführungssystem (Düse) 101, das ausstoßbar eine Sonde enthaltende Flüssigkeit, beispielsweise eine Nukleinsäuresonde, als Ausstoßflüssigkeit hält, ein fester Träger 103 (beispielsweise eine transparente Glasplatte etc.), an den die Nukleinsäuresonde gebunden werden soll und einen Bubble-jet-Kopf 105, eine Art von Tintenstrahlköpfen mit einem Mechanismus, um Wärmeenergie auf die Flüssigkeit auszuüben und damit die Flüssigkeit auszustoßen, gezeigt. 104 bedeutet eine Flüssigkeit, die eine Nukleinsäuresonde enthält und aus dem Bubble-jet-Kopf 105 ausgestoßen wird. 2 ist eine Querschnittsansicht, die im wesentlichen entlang der Linie 2-2 des Bubble-jet-Kopfes 105 von 1 aufgenommen ist. In 2 gibt es den Bubble-jet-Kopf 105, eine Flüssigkeit 107, die eine Nukleinsäuresonde enthält und ausgestoßen werden soll und einen Substratbereich 117 mit einem Heizelement, das eine Ausstoßenergie auf die Flüssigkeit ausübt. Der Substratbereich 117 umfasst einen Schutzfilm 109 aus Silikonoxid etc., Elektroden 111-1 und 111-2 aus Aluminium etc., eine exothermische Widerstandsschicht 113 aus Nikrome etc., eine Hitzesammelschicht 115 und ein Basismaterial 116 aus Aluminiumoxid etc. mit guten Strahlungseigenschaften. Eine Flüssigkeit 107, die eine Nukleinsäuresonde enthält, kommt zu einer Ausstoßöffnung (Ausstossauslass) 119 und bildet einen Miniskus 121 durch einen vorbestimmten Druck. Wenn elektrische Signale von den Elektroden 111-1 und 111-2 ausgegeben werden, erzeugt ein Bereich, der durch 123 (Blasenbereich) gezeigt ist, schnell Hitze und es erscheint eine Blase in der Flüssigkeit 107, die mit dem Bereich 123 in Kontakt kommt. Der Miniskus stösst bei dem Druck aus, und die Flüssigkeit 107 wird von der Öffnung 119 ausgestoßen und fliegt gegen die Oberfläche eines festen Trägers 103. Obwohl die ausstoßbare Menge der Flüssigkeit mit einem Bubble-jet-Kopf dieser Struktur von der Größe der Düse etc. abhängt, kann sie auf etwa 4–50 Picoliter gesteuert werden und sie ist sehr geeignet dafür, Nukleinsäuresonden in hoher Dichte anzuordnen.
  • (Beziehung zwischen der ausgestoßenen Flüssigkeit und dem festen Träger)
  • (Durchmesser der Spots auf dem festen Träger)
  • Um die oben beschriebene Dichte (beispielsweise 10.000 Sondenspots pro Quadratinch, wobei die obere Grenze etwa 1 × 106 ist) auf einem festen Träger zu erhalten, ist es bevorzugt, dass der Durchmesser der Spots etwa 20–100 μm beispielsweise beträgt und dass die Spots voneinander unabhängig sind. Diese Spots werden durch die Eigenschaften einer Flüssigkeit, die aus einem Bubble-jet-Kopf ausgestoßen wird und den Oberflächeneigenschaften des festen Trägers, auf dem die Flüssigkeit gebunden wird, bestimmt.
  • (Eigenschaften der Ausstoßflüssigkeit)
  • Jede Flüssigkeit kann als Ausstoßflüssigkeit verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die Flüssigkeit von einem Bubble-jet-Kopf ausgestoßen werden kann, die von dem Kopf ausgestoßene Flüssigkeit an den gewünschten Positionen auf einem festen Träger ankommt und die Flüssigkeit nicht die Nukleinsäuresonde beschädigt, wenn sie mit der Nukleinsäuresonde vermischt wird und ausgestoßen wird.
  • Angesichts der Eigenschaften der Flüssigkeit, die aus einem Bubble-jet-Kopf ausgestoßen werden soll, weist die Flüssigkeit bevorzugt Eigenschaften auf, wie eine Viskosität von 1–15 cbs und eine Oberflächenspannung von 30 Dyn/cm oder höher. Wenn die Viskosität 1–5 cps ist und die Oberflächenspannung 30–50 Dyn/cm ist, wird die Position des Ankommens auf einem festen Träger sehr genau, was für eine besondere Eignung spricht.
  • Hinsichtlich der Tintenstrahlausstoßeigenschaften der Flüssigkeit und der Stabilität einer Nukleinsäuresonde in der Flüssigkeit beim Ausstoß mit einem Bubble-jet ist es bevorzugt, dass eine Nukleinsäuresonde mit einem 2–5.000-mer, insbesondere 2–60-mer in einer Konzentration von 0,05–500 μMol, insbesondere 2–50 μMol, enthalten ist.
  • (Zusammensetzung der Flüssigkeit)
  • Die Zusammensetzung einer Flüssigkeit, die aus einem Bubble-jet-Kopf ausgestoßen werden soll, unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, mit der Maßgabe, dass sie nicht wesentlich eine Nukleinsäuresonde beeinträchtigt, wenn sie mit einer Nukleinsäuresonde vermischt ist oder wenn sie, wie oben beschrieben, aus dem Bubble-jet-Kopf ausgestoßen wird, und eine flüssige Zusammensetzung, die ganz normal auf einen festen Träger mit dem Bubble-jet-Kopf ausstoßbar ist, erfüllt bevorzugte Bedingungen. Allerdings enthält eine bevorzugte Flüssigkeit Glyzerin, Harnstoff, Thiodiglykol oder Ethylenglykol, Isopropylalkohol und einen Acetylenalkohol, der durch die folgende Formel (I) dargestellt ist:
    Figure 00100001
    worin R1, R2, R3 und R4 Alkylgruppen, insbesondere geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1–4 Kohlenstoffatomen, bedeuten, m und n ganze Zahlen bedeuten und m = 0 und n = 0 oder 1 ≤ m + n ≤ 30 und wenn m + n = 1, dann ist m oder n Null.
  • Insbesondere wird eine Flüssigkeit, die 5–10 Gew.-% Harnstoff, 5–10 Gew.-% Glyzerin, 5–10 Gew.-% Thioglykol und 0,02 bis 5 Gew.-%, insbesondere 0,5–1 Gew.-% eines Actylenglykols, der durch die obige Formel (I) gezeigt ist, umfasst, bevorzugt verwendet.
  • Wenn diese Flüssigkeit verwendet wird, sind die Spots, die durch Ausstoßen der Flüssigkeit, die die Nukleinsäureprobe enthält, aus einem Bubble-jet-Kopf erhalten werden und an einem festen Träger haften, rund, und ein Bereich, wo die ausgestoßene Flüssigkeit gebunden ist, ist begrenzt. Selbst wenn somit eine Nukleinsäuresonde dicht als Spots aufgetragen wird, kann eine Verbindung zwischen angrenzenden Spots effektiv verhindert werden. Es wird kein Abbau der Nukleinsäuresonde, die auf einem festen Träger als Spot aufgetragen ist, beobachtet. Allerdings sind die Eigenschaften der Flüssigkeit für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenanordnung nicht auf die oben erwähnten eingeschränkt. Wenn beispielsweise Strukturen, wie Löcher, auf einer festen Trägeroberfläche vorhanden sind, um ein Ausbreiten der Flüssigkeit auf dem festen Träger mit einem Bubble-jet-Kopf und ein Vermischen mit angrenzenden Spots zu verhindern, können eine Flüssigkeit einer Viskosität und einer Oberflächenspannung außerhalb des obigen Bereichs und eine Nukleinsäuresonde einer Basenlänge und Konzentration außerhalb des obigen Bereichs verwendet werden.
  • (Arten der funktionellen Gruppen des festen Trägers und der Nukleinsäuren)
  • In einem Verfahren, um die Nukleinsäuresonde an den festen Träger sicher zu binden und ebenfalls den aufgetragenen Spot einer Nukleinsäuresonde an einer definierteren Position auf dem festen Träger, um eine Kreuzkontamination zwischen angren zenden Spots zu verhindern, zu halten, kann man die Sonde und den festen Träger mit funktionellen Gruppen, die miteinander reagieren können, ausstatten.
  • (SH-Gruppe und Maleimido-Gruppe)
  • Die gemeinsame Verwendung der Maleimidogruppe und der Thiol (-SH)-Gruppe kann als bevorzugtes Beispiel genannt werden. Das heißt also, durch Binden einer Thiol(-SH)-Gruppe an den Terminus einer Nukleinsäuresonde und Behandeln der festen Trägeroberfläche, damit sie eine Maleimidogruppe aufweist, reagiert die Thiolgruppe in einer Nukleinsäuresonde, wenn sie auf die Oberfläche des festen Trägers aufgebracht ist, mit der Maleimidogruppe auf dem festen Träger, um die Nukleinsäuresonde auf dem Träger zu immobilisieren, so dass sich Sondenspots an den vorbestimmten Positionen auf dem festen Träger bilden. Wenn insbesondere diese Nukleinsäuresonde, die eine Thiolgruppe am Terminus enthält, in einer Flüssigkeit aus der oben erwähnten Zusammensetzung gelöst wird und auf eine feste Trägeroberfläche mit Maleimidogruppen mit einem Bubble-jet-Kopf aufgetragen wird, kann die Nukleinsäuresondenlösung einen sehr kleinen Spot auf dem festen Träger bilden. Im Ergebnis können kleine Spots aus einer Nukleinsäuresonde auf den vorbestimmten Positionen der Oberfläche des festen Trägers gebildet werden. In diesem Fall ist es nicht notwendig, eine Konstruktion, wie Löcher, die aus einer teilweise hydrophilen und hydrophoben Matrix zusammengesetzt sind, auf der Oberfläche des festen Trägers vorzusehen, um eine Verbindung zwischen den Spots zu verhindern.
  • Wenn beispielsweise eine Flüssigkeit, die eine Nukleinsäuresonde mit 18-mer Nukleotiden bei einer Konzentration von 8 μMol enthält und so eingestellt ist, dass sie eine Viskosität und Oberflächenspannung innerhalb der obigen Bereiche aufweist, von einer Düse (Menge des Ausstoßes etwa 24 Picoliter) mit einem Bubble-jet-Drucker (Produktname BJC620; Canon Inc., modifiziert für den Druck auf einer flachen Ebene) mit einem Zwischenraum zwischen dem festen Träger und Düsenspitze des Bubble-jet-Kopfs von etwa 1,2–1,5 mm ausgestoßen wurde, konnten Spots mit einem Durchmesser von etwa 70–100 μm gebildet werden, und es wurden keine Spots aufgrund von Streuung, wenn die ausgestoßene Flüssigkeit auf die Oberfläche des festen Trägers (nachfolgend als Satellitenspot bezeichnet) trifft, beobachtet. Die Umsetzung zwischen den Maleimidogruppen auf dem festen Träger und den SH-Gruppen am Terminus der Nukleinsäuresonden ist in etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur (25°C) vervollständigt, obwohl dieses von den Bedingungen einer ausgestoßenen Flüssigkeit abhängt. Die erforderliche Zeit ist kürzer als diejenige, die erforderlich ist, wenn ein piezoelektrischer Jet-Kopf verwendet wird, um eine Flüssigkeit auszustoßen. Obwohl der Grund nicht bekannt ist, wird angenommen, dass die Temperatur der Nukleinsäuresondenlösung im Bubble-jet-Kopf entsprechend seinem Grundprinzip erhöht ist, so dass die Reaktionseffizienz zwischen einer Maleimidogruppe und einer Thiolgruppe erhöht ist, um die Reaktionszeit abzukürzen.
  • Außerdem neigt eine Thiolgruppe dazu, unstabil unter alkalischen oder neutralen Bedingungen zu werden, und eine Disulfidbindung (-S-S-), die ein Dimer ergibt, kann gebildet werden. Um die Disulfidbindung zu vermeiden und eine effektive Umsetzung zwischen einer Thiolgruppe und einer Maleimidogruppe durchzuführen, ist es bevorzugt, Thiodiglykol in die Ausstoßflüssigkeit zu geben.
  • Zur Einführung der Maleimidogruppe auf einer festen Trägeroberfläche können verschiedene Methoden angewandt werden. Wenn beispielsweise ein Glassubstrat als fester Träger verwendet wird, kann die Maleimidogruppe auf die Oberfläche des festen Trägers durch die Einführung einer Aminogruppe auf das Substrat und der folgenden Umsetzung zwischen der Aminogruppe und einem Reagenz, das N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimid (EMCS reagent: Dojin Co., Ltd.) enthält, eingeführt werden. Die Aminogruppeneinführung auf der Oberfläche kann durchgeführt werden, indem ein Aminosilankupplungsmittel mit dem Glassubstrat umgesetzt wird.
  • (Strukturformel von EMCS)
    Figure 00140001
  • Eine Nukleinsäuresonde mit einer Thiolgruppe an ihrem Terminus kann hergestellt werden, indem eine Nukleinsäure mit dem 5'-Thiolmodifikator C6 (Glen Research Co., Ltd.) als Reagenz für den 5'-Terminus in einem automatischen DNA-Synthesegerät gefolgt von einer üblichen Schutzgruppenentfernung und Reinigung über die Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie synthetisiert wird.
  • (Aminogruppe und Epoxidgruppe)
  • Als funktionelle Gruppen für die Immobilisierung, die nicht der oben erwähnten Kombination der Thiolgruppe und der Maleimidogruppe entspricht, kann eine Kombination aus der Epoxidgruppe (auf dem festen Träger) und der Aminogruppe (Nukleinsäuresondenterminus) ebenfalls verwendet werden. Epoxidgruppen können auf einer festen Trägeroberfläche eingeführt werden, beispielsweise durch Auftragen von Polyglycidylmethacrylat mit einer Epoxidgruppe auf die Oberfläche eines festen Trägers aus einem Harz oder durch Auftragen eines Silankupplungsmittels mit einer Epoxidgruppe auf die Oberfläche eines festen Glasträgers für die Umsetzung, eingeführt werden.
  • Wie oben erklärt wurde, wenn funktionelle Gruppen auf einer festen Trägeroberfläche und in einen Terminus einer ss-Nukleinsäuresonde zur Bildung kovalenter Bindungen eingeführt werden, ist die Nukleinsäuresonde fester an dem festen Träger befestigt. Da außerdem die Nukleinsäuresonde immer an ihrem Terminus an dem festen Träger bindet, werden die Zustände der Nukleinsäuresonde in jedem Spot homogen. Im Ergebnis tritt die Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuresonden und den Zielnukleinsäuren gleichmäßig auf, so dass der Nachweis einer Zielnukleinsäure und die Identifikation einer Basensequenz mit noch stärker verbesserten Genauigkeiten realisiert werden kann. Wenn Nukleinsäuresonden mit einer funktionellen Gruppe an jedem Terminus kovalent mit einem festen Träger gebunden sind, kann eine Sondenanordnung quantitativ ohne Unterschiede in der Menge der gebundenen DNA-Sonde aufgrund des Unterschieds in Sequenz oder Länge, im Vergleich mit Nukleinsäuresonden, die auf einem festen Träger durch nicht kovalente Bindungen (beispielsweise elektrostatisch, etc.) fixiert sind, hergestellt werden. Außerdem nehmen alle Teile der Nukleinsäure an der Hybridisierungsreaktion teil, so dass die Effizienz der Hybridisierung beträchtlich verbessert werden kann. Des weiteren kann ein Linker, wie Alkylengruppen mit 1–7 Kohlenstoffen oder Ethylenglykolderivate, zwischen dem ss-Nukleinsäurebereich, der mit einer Zielnukleinsäure hybridisiert und der funktionellen Gruppe für die Bindung mit einem festen Träger vorhanden sein. Wenn diese Nukleinsäuresonde an einen festen Träger gebunden ist, kann ein vorbestimmter Zwischenraum zwischen der Oberfläche des festen Trägers und der Nukleinsäuresonde hergestellt werden, so dass die Effizienz der Umsetzung zwischen einer Nukleinsäuresonde und einer Zielnukleinsäure wohl noch weiter verbessert werden kann.
  • (Herstellungsverfahren der Sonde)
  • Eine der bevorzugten Ausführungsformen der Sondenanordnungsherstellungsmethode wird nun erklärt. Als erstes wird eine Flüssigkeit, die 7,5 Gew.-% Glyzerin, 7,5 Gew.-% Harnstoff, 7,5% Thiodiglykol und 1 Gew.-% eines Acetylenalkohols, der durch die obige allgemeine Formel (1) gezeigt ist (beispielsweise Produktname: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.), hergestellt. Eine ss-Nukleinsäuresonde mit einer Länge von beispielsweise einem etwa 2–5.000 mer, insbesondere einem etwa 2–60 mer, mit einer Thiolgruppe an ihrem Terminus in einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Als nächstes wird die Nukleinsäuresonde in der obigen Flüssigkeit bei einer Konzentration in einem Bereich von 0,05–500 μMol, insbesondere 2–50 μMol vermischt, um eine Flüssigkeit herzustellen, die mit einer Viskosität von 1–15 cps, insbesondere 1–5 cps und einer Oberflächenspannung von 30 Dyn/cm oder höher, insbesondere 30–50 Dyn/cm ausgestoßen werden kann. Dann wird diese Ausstoßflüssigkeit in eine Düse eines Bubble-jet-Kopfs beispielsweise gefüllt. Es werden Maleimidogruppen nach der obigen Methode auf einer festen Trägeroberfläche eingeführt. Der feste Träger wird so platziert, dass der Abstand zwischen der Oberfläche des festen Trägers mit den Maleimidogruppen und die Düsenspitze des Bubble-jet-Kopfs so nahe wie etwa 1,2–1,5 mm wird, und der Bubble-jet-Kopf wird zur Ausstoßung der Flüssigkeit betrieben. Es ist hier als Ausstoßbedingung erwünscht, das Druckmuster so einzustellen, dass keine Verbindung zwischen den Spots miteinander auf einem festen Träger möglich ist. Wenn ein Bubble-jet-Kopf, dessen Auflösung 360 × 720 dpi ist, für die Spotbildung verwendet wird, sind bevorzugte Bedingungen, dass ein Flüssigkeitsausstoß von 2 Leerlaufausstößen in der 360 dpi-Richtung gefolgt wird, und ein Flüssigkeitsausstoß wird von 5-fachen Leerlaufausstößen in der 720 dpi-Richtung gefolgt. Diese Bedingungen können einen Raum von etwa 100 μm zwischen den Spots schaffen und ausreichend eine Kontamination zwischen angrenzenden Spots verhindern. Dann lässt man den festen Träger beispielsweise in einer Feuchtigkeitskammer stehen, bis eine Reaktion zwischen den Maleimidogruppen auf einem festen Träger und den Thiolgruppen der Nukleinsäuresonden in einer Flüssigkeit fortschreitet und die Nukleinsäuresonden sicher am festen Träger fixiert werden. Es ist ausreichend, dieses bei Raumtemperatur (etwa 25°C) für etwa 30 Minuten, wie oben beschrieben, zu lassen. Dann werden die Nukleinsäuren, die nicht auf dem festen Träger reagiert haben, weggewaschen und man erhält eine Nukleinsäuresondenanordnung.
  • Um nun die Nachweisgenauigkeit (S/N-Verhältnis) bei beispielsweise dem Nachweis einer Zielnukleinsäure mit dieser Nukleinsäureprobenanordnung zu verbessern, ist es bevorzugt, die feste Trägeroberfläche zu blockieren, nachdem die Nukleinsäuresonden am Träger fixiert sind, um zu verhindern, dass die Oberfläche, wo keine Nukleinsäuren verbunden sind, mit einer Zielnukleinsäure, etc., die in einer Probe enthalten ist, reagiert. Das Blockieren kann beispielsweise durch Eintauchen des festen Trägers in einer 2%igen wässrigen Rinderserumalbuminlösung für 2 Stunden oder durch Zersetzen der Maleimidogruppen, die nicht an den Nukleinsäurensonden auf der Oberfläche des festen Trägers gebunden sind, erfolgen. Beispielsweise kann DTT (Dithiothreit), β-Mercaptoethanol, etc. verwendet werden. Allerdings ist wegen des Effekts des Verhinderns der Adsorption der Ziel-DNA eine wässrige Lösung aus Rinderserumalbumin am meisten geeignet. Dieser Blockierungsschritt kann nach Bedarf durchgeführt werden. Beispielsweise kann dieser Blockierungsschritt weggelassen werden, wenn eine Probe restriktiv zu den jeweiligen Spots auf der Sondenanordnung zugeführt wird, so dass die Probe im Wesentlichen nicht an den Bereichen bindet, die nicht den Sondenspots entsprechen. Der Blockierungsschritt kann ebenfalls weggelassen werden, wenn sich Löcher zuvor auf dem festen Träger gebildet haben, und die Bereiche, die nicht den Löchern entsprechen, können dann die Bindung der Nukleinsäuresonden verhindern.
  • Die Sondenanordnungen, die mit dieser Methode hergestellt werden, können eine Vielzahl von Spots, die die gleiche Nukleinsäuresonde enthalten, oder eine Vielzahl von Spots, die jeweils eine andere Nukleinsäure enthalten, je nach Applikation, aufweisen. Die Sondenanordnung, bei der die Nukleinsäuresonden in einer hohen Dichte nach der obigen Verfahrensweise angeordnet sind, kann dann für den Nachweis einer ss-Zielnukleinsäure und für die Identifizierung einer Basensequenz verwendet werden. Wenn beispielsweise eine ss-Zielnukleinsäure einer bekannten Basensequenz, die in einer Testprobe vorhanden sein kann, nachgewiesen wird, wird eine ss-Nukleinsäure mit einer Basensequenz, die komplementär zu derjenigen der Zielnukleinsäure ist, als Sonde verwendet und es wird eine Sondenanordnung hergestellt, worin eine Vielzahl von Spots, die die Sonde enthalten, auf einem festen Träger angeordnet sind. Jede Probe wird zu jedem Spot der Probenanordnung gebracht, und man lässt die Probenanordnung bei Bedingungen stehen, die eine Hybridisierung zwischen der Zielnukleinsäure und der Sonde ermöglicht, dann wird das Vorhandensein/Nichtvorhandensein eines Hybrids in jedem Spot nach einer bekannten Methode, wie der Fluoreszenznachweis, nachgewiesen. Dieses ermöglicht den Nachweis des Vorhandenseins/Nichtvorhandenseins der Zielsubstanz in einer Probe. Wenn eine Sondenanordnung dafür verwendet wird, eine Basensequenz einer ss-Zielnukleinsäure, die in einer Probe enthalten ist, zu identifizieren, dann wird eine Vielzahl von ss-Nukleinsäuren mit Basensequenzen komplementär zu den angenommenen Sequenzen der Zielnukleinsäure als Sonden auf dem festen Träger als Spot gebildet. Dann werden Aliquots der Probe zu den jeweiligen Spots gebracht und unter Bedingungen inkubiert, die die Hybridisierung der Zielnukleinsäure und der Sonde ermöglichen, und dann wird das Vorhandensein/Nichtvorhandensein der Hybridisierung an jedem Spot nach einer bekannten Methode, wie der Fluoreszenzmethode, nachgewiesen. Dieses ermöglicht die Identifizierung einer Basensequenz einer ss-Zielnukleinsäure. Eine andere Anwendung der erfindungsgemäßen Probenanordnung ist beispielsweise eine Anwendung, bei der spezifische Basensequenzen, die durch ein DNA- Bindungsprotein erkannt werden, und chemische Substanzen mit der Eigenschaft, an die DNA zu binden, können berücksichtigt werden.
  • (Arten des Tintenstrahlkopfes)
  • Obwohl eine Anordnung, bei der eine Nukleinsäuresonde auf einen festen Träger mit einem Bubble-jet-Kopf, aufgetragen wird, oben bereits erläutert wurde, kann auch in der vorliegenden Erfindung ein piezoelektrischer Strahlkopf, der eine Flüssigkeit in einer Düse durch Vibrationsdruck der piezoelektrischen Elemente ausstößt, verwendet werden. Allerdings wird in der vorliegenden Erfindung eher ein Bubble-jet-Kopf verwendet, weil eine Bindungsreaktion an einen festen Träger während eines kurzen Zeitraums abgeschlossen ist und die Sekundärstruktur der DNA durch die Hitze ungefaltet ist, so dass die Effizienz der nachfolgenden Hybridisierungsreaktion wie oben beschrieben erhöht werden kann.
  • Außerdem kann ein Tintenstrahlsystem mit einer Vielzahl von Köpfen dafür verwendet werden, eine Vielzahl von Spots gleichzeitig auf einem festen Träger zu bilden, so dass zwei oder mehrere Spots verschiedene Nukleinsäuresonden enthalten können.
  • (PNA/DNA)
  • Die vorliegende Erfindung ist anhand einer Nukleinsäuresonde als Sondenbeispiel erläutert worden. Nukleinsäuresonden umfassen Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sonden, Ribonukleinsäure (RNA)-Sonden und Peptidnukleinsäure (PNA)-Sonden. PNAs sind synthetische Oligonukleotide, worin vier Basen (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin), die in der DNA enthalten sind, an ein Peptidgerüst und nicht an ein Zucker/Phosphat-Gerüst gebunden sind, wie in der folgenden Formel (II) gezeigt ist: PNA-Strukturformel (II):
    Figure 00210001
    worin "Base" jede der vier Basen (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin), die in der DNA enthalten sind, bedeutet, und p die Basenlänge der PNA bedeutet. PNAs können beispielsweise nach Methoden, die als Festphasensynthese vom Typ tBOC und Festphasensynthese vom Typ Fmoc bekannt sind. PNAs sind gegenüber Enzymen, wie Nukleasen und Proteasen, im Vergleich zu natürlichen Oligonukleotiden der DNA und RNA resistenter, sie werden kaum oder nicht enzymatisch gespalten und sie sind im Serum stabil. Aufgrund des Nichtvorhandenseins der Zuckereinheit oder Phosphatgruppen werden die PNAs kaum durch die Ionenstärke eines Puffers beeinträchtigt. Deshalb ist es nicht erforderlich, die Salzkonzentration, etc. zu steuern, wenn PNAs mit einer ss-Zielnukleinsäure umgesetzt werden. Außerdem soll aufgrund der Nichtvorhandenen elektrostatischen Abstoßung ein Hybrid zwischen PNA und einer ss-Zielnukleinsäure hitzestabiler als solche zwischen einer DNA-Sonde und einer ss-Zielnukleinsäure und zwischen einer RNA-Sonde und einer ss-Zielnukleinsäure sein. Wegen dieser Eigenschaften werden PNAs als Sonden für den Nachweis einer Zielnukleinsäure und die Bestimmung einer Basensequenz verwendet. Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäureanordnung ist ebenfalls effektiv, wenn eine PNA-Sonde als Nukleinsäuresonde verwendet wird, und man kann ohne weiteres eine PNA-Sondenanordnung, bei der PNA-Sonden dicht und sehr genau angeordnet sind, herstellen. Um insbesondere beispielsweise die Dichte einer Sondenanordnung durch sicheres Binden einer PNA-Sonde auf bestimmten Positionen auf einem festen Träger, wie im Fall der DNA-Sonden und RNA-Sonden zu erhöhen, werden zwei Arten von funktionellen Gruppen, die miteinander reagieren können, in den Terminus der PNA-Sonde und die feste Trägeroberfläche eingeführt. Eine bevorzugte Kombination ist, wie oben erwähnt, eine Kombination einer Thiolgruppe (am Terminus der PNA) und einer Maleimidogruppe (an der festen Trägeroberfläche). Eine Thiolgruppe kann beispielsweise am Terminus der PNA durch beispielsweise Einführen einer Cystein(CH(NH2)-(COOH)CH2SH)-Gruppe, etc. die eine Thiolgruppe im N-Terminus (entsprechend dem 5'-Terminus der DNA) einer PNA-Sonde enthält, eingeführt werden. Eine Cysteingruppe kann am N-Terminus einer PNA-Sonde beispielsweise durch Umsetzen der Aminogruppe des N-Terminus einer PNA-Sonde und der Carboxylgruppe des Cysteins eingeführt werden. Weiterhin kann unter Verwendung eines geeigneten Linkers, wie ein solcher, der eine Aminogrup pe und eine Carboxylgruppe, wie NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2COOH, enthält, die Aminogruppe am N-Terminus einer PNA-Sonde mit der Carboxylgruppe des Linkers umgesetzt werden, und dann wird die Aminogruppe des Linkers mit der Carboxylgruppe des Cysteins umgesetzt, so dass das Cystein an die PNA-Sonde über den Linker bindet. Wenn eine Bindungsgruppe an einem festen Träger über einen Linker, wie oben erwähnt, eingeführt wird, kann ein Teil der PNA-Sonde, die mit einer Zielsubstanz zusammenwirkt, von dem festen Träger durch einen vorbestimmten Abstand getrennt sein, so dass eine weitere Verbesserung der Hybridisierungseffizienz erwartet werden kann.
  • Die PNA kann eine geringere Wasserlöslichkeit als eine DNA mit gleicher Basenlänge wie die Polymerlänge der PNA aufweisen. Wenn somit eine Flüssigkeit für den Tintenstrahlausstoß hergestellt wird, ist es bevorzugt, die PNA in Trifluoressigsäure (beispielsweise einer 0,1 gew-%igen wässrigen Lösung aus Trifluoressigsäure) etc. vorher zu lösen und dann eine Ausstoßflüssigkeit mit Eigenschaften, die mit dem Tintenstrahlausstoß unter Verwendung der verschiedenen oben erwähnten Lösungsmittel verträglich sind, herzustellen.
  • Insbesondere kann die zunächst vorgenommene Lösung in Trifluoressigsäure die Umwandlung der Cysteinreste am Terminus in Cystein aufgrund der Oxidation der Thiolgruppen der PNA verhindern. Somit ist dieses für eine weitere Verbesserung der Effizienz einer Reaktion zwischen der Thiogruppe der PNA und der Maleimidograuppe auf einer festen Trägeroberfläche bevorzugt. Obwohl die Reaktionsdauer von 30 Minuten für eine Reaktion zwischen einer Thiolgruppe, die am Terminus einer DNA-Sonde eingeführt ist oder einer RNA-Sonde und einer Maleimidogruppe aus einer festen Trägeroberfläche (wenn ein Bubble jet-Kopf verwendet wird) ausreichend ist, ist es bevorzugt, die Reaktion für etwa 2 Stunden im Fall der PNA, auch wenn ein Bubble-jet-Kopf verwendet wird, fortschreiten zu lassen.
  • In der vorliegenden Erfindung sind die Sonden nicht auf Nukleinsäuresonden beschränkt, und sie umfassen Substanzen, die spezifisch an eine Zielsubstanz in einer nachzuweisenden oder zu analysierenden Probe binden können, beispielsweise Liganden, die spezifisch an Rezeptoren binden können, Rezeptoren, die spezifisch an Liganden binden können, Oligopeptide und Polypeptide, die an Oligopeptide und Polypeptide mit spezifischen Aminosäuresequenzen binden können und Proteine, (beispielsweise Antikörper, Antigene, Enzyme etc).
  • Wie oben erwähnt wurde, kann nach dem Verfahren zur Herstellung einer Sondenanordnung mit der Stufe, dass eine Sondenlösung einem festen Träger unter Anwendung eines Tintenstrahlausstoßverfahrens zugeführt wird, eine Probenanordnung sehr einfach hergestellt werden. Wenn insbesondere funktionelle Gruppen sowohl in eine Nukleinsäureanordnung als auch in eine feste Trägeroberfläche eingeführt werden, um eine kovalente Bindung zwischen diesen zu bilden, dann verbinden sich angrenzende Spots nicht miteinander, auch wenn ein fester Träger, auf dem vorher keine Löcher, etc. vorgesehen worden sind, das heißt, ein fester Träger, der im wesentlichen eben ist und homogene Oberflächeneigenschaften (Wasserbenetzbarkeit etc.) aufweist, verwendet wird. Im Ergebnis kann eine Nukleinsäuresondenanordnung, in der Spots einer Nukleinsäuresonde genau und dicht angeordnet sind, außerordentlich effizient und bei geringen Kosten hergestellt werden.
  • Diese Beschreibung soll nicht einen festen Träger ausschließen, der Löcher auf der Oberfläche in der vorliegenden Erfindung aufweist. Wenn beispielsweise ein trübes Matrixmuster (als schwarze Matrix BM) bezeichnet, vorher zwischen den Löchern gebildet wird, in die eine Sondenlösung gegeben wird, kann die Nachweisgenauigkeit (SN-Verhältnis) weiterhin beim optischen Nachweis (beispielsweise Fluoreszenznachweis) der Hybridisierung zwischen einer Sonde und einer Zielsubstanz verbessert werden. Wenn außerdem eine Matrix, deren Oberfläche eine geringe Affinität zu einer Sondenlösung aufweist, zwischen angrenzenden Löchern vorgesehen ist, kann die Sondenlösung bequem in die gewünschten Löcher gegeben werden, selbst wenn die Lösung auf etwas versetzte Positionen während der Zugabe der Sondenlösung in die Löcher gegeben wird. Um diesen Effekt auszunutzen, kann ein fester Träger verwendet werden, auf dessen Oberfläche Löcher vorgesehen sind. Ein fester Träger mit einer auf seiner Oberfläche gebildeten Matrix, ein Herstellungsverfahren dafür und ein Verfahren zur Anwendung des festen Trägers nach dieser Ausführungsform werden nachfolgend beschrieben.
  • Die 5A und 5B zeigen Beispiele für eine Probenanordnung nach dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 5A ist eine Planansicht und 5B ist eine Querschnittsansicht, die entlang der Linie 5B-5B von 5A aufgenommen ist. Diese Probenanordnung weist einen Aufbau auf, bei dem ein Matrixmuster 125 in einer Rahmenstruktur, die hohle Teile (Löcher) 127 angeordnet in Form einer Matrix enthält, auf einem festen Träger gebildet ist. Die Löcher 127, die durch das Matrixmuster 125 (hervorstehender Bereich) getrennt sind, werden als Durchlöcher (Bohrbereiche) im Matrixmuster vorgesehen, wobei die Seitenwände der Löcher durch die hervorstehenden Teile gebildet sind, und die Oberfläche des festen Trägers 103 liegt am Boden 129 frei. Die freiliegende Oberfläche des festen Trägers 103 bildet eine Oberfläche, die an eine Sonde binden kann, und die Sonden (nicht gezeigt) werden an die vorbestimmten Löcher fixiert.
  • Materialien zur Bildung des Matrixmusters sind bevorzugt solche, die das Matrixmuster trüb machen, unter Berücksichtigung der Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit, des S/N-Verhältnisses und der Verlässlichkeit, wenn ein Reaktionsprodukt einer Sonde und einer Zielsubstanz optisch nachgewiesen wird, beispielsweise durch Messen von Fluoreszenz, die aus dem Reaktionsprodukt emittiert wird. Als solche Materialien können beispielsweise Metalle (Chrom, Aluminium, Gold, etc.) und schwarze Harze etc., beispielsweise genannt werden. Zu schwarzen Harzen gehören Harze, wie Acryl, Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polyamid, Acrylmonomer und Urethanacrylat und lichtempfindliche Harze, wie Photoresists, die schwarze Farbstoffe oder Pigmente enthalten. Als spezifische Beispiele für lichtempfindliche Harze können beispielsweise ein UV-Resist, DEEP-UV-Resist, ultravioletthärtbare Harze verwendet werden. Als UV-Resists können negative Resists, wie cyclisierte Polyisopren/aromatisches Bisacid-Resiste, und Phenolharz/aromatische Acidverbindung-Resists und positive Resists, wie Novolakharz/Diazonaphtochinon-Resists erwähnt werden. Als DEEP-UV-Resists können positive Resists, beispielsweise radiolytische Polymerresists, wie Polymethylmethacrylat, Polymethylensulfon, Polyhexafluorbutylmethacrylat, Polymethylisopropenylketon und Poly-1-trimethylsilylpropylenbromid und Lösungsunterdrückungsresists, wie o-Nitrobenzylestercholat und negative Resists wie Polyvinylphenol-3,3'-diazidediphenylsulfon und Glycidylpolymethacrylat erwähnt werden.
  • Als ultravioletthärtende Harze können Polyesteracrylat, Epoxiacrylat und Urethanacrylat, etc., die etwa 2–10 Gew-% eines oder mehrerer Photopolymerisationsinitiatoren, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus Benzophenon und seinen substituierten Derivaten, Benzoin und seinen substituierten Derivaten, Acetophenon und seinen substituierten Derivaten und Oximverbindungen, wie Benzyl, etc. besteht, erwähnt werden.
  • Als schwarze Pigmente können Ruß und schwarze organische Pigmente verwendet werden.
  • Wenn das Reaktionsprodukt einer Sonde und einer Zielsubstanz nicht optisch nachgewiesen wird und wenn Licht von einer Matrix nicht den optischen Nachweis eines Reaktionsprodukts beeinflusst, ist die Verwendung von Nichtlichtabschirmsubstanzen als Material für ein Matrixmuster nicht ausgeschlossen.
  • Als eine der Methoden zur Herstellung eines Matrixmusters unter Verwendung der obigen Materialien wird ein Verfahren angewendet, bei dem eine Photoresistschicht auf einer Harz- oder Metallschicht, die sich auf der Oberfläche eines Substrats gebildet hat, gebildet wird, und nach der Musterbildung der Resistschicht wird das Harz nach einem Verfahren, wie Ätzen, gemustert. Wenn ein lichtempfindliches Harz verwendet wird, kann das Harz selbst belichtet, entwickelt werden, und falls erforderlich, nach einem Verfahren der Photolithographie unter Verwendung einer Photomaske für die Musterbildung. Wenn eine Matrix 125 aus einem Harz hergestellt ist, ist die Oberfläche der Matrix 125 hydrophob. Diese Konfiguration ist bevorzugt, wenn eine wässrige Lösung als Lösung als Lösung, die die Probe enthält, verwendet wird, und in die Löcher gegeben wird. Das heißt, wenn eine Sondenlösung in die Löcher nach der Tintenstrahlmethode gegeben wird, kann die Probenlösung sehr bequem in die gewünschten Löcher gegeben werden, selbst wenn die Sondenlösung in etwas versetzten Positionen aufgetragen wird. Wenn außerdem verschiedene Sonden gleichzeitig in angrenzende Löcher gegeben werden, kann eine Kreuzkontamination dieser in die Löcher gegeben verschiedenen Sondenlösungen verhindert werden.
  • Da eine Lösung einer Sonde, ein Biomaterial, wie Peptide und Nukleinsäuren, oftmals eine wässrige Lösung ist, kann diese Anordnung, bei der ein Matrixmuster wasserabweisend ist, in geeigneter Weise bei diesen Gelegenheiten verwendet werden.
  • Als nächstes wird ein Verfahren zur Herstellung eines Bodens eines Lochs (ein freiliegender Bereich einer festen Trägeroberfläche), die eine Sonde binden kann, beschrieben. Eine funktionelle Gruppe, die auf dem Boden eines Lochs gehalten wird, wird durch die funktionelle Gruppe, die auf einer Sonde getragen werden soll, bestimmt. Wenn beispielsweise eine Nukleinsäuresonde, in der eine Thiolgruppe am Terminus eingeführt ist, verwendet wird, veranlasst die Thiolgruppe der Nukleinsäuresonde, die in die Löcher gegeben wurde, eine kovalente Bindung mit der Maleimidiogruppe auf der Oberfläche des festen Trägers, und die Nukleinsäuresonde wird dann auf der Oberfläche des festen Trägers fixiert. In ähnlicher Weise ist es mit einer Nukleinsäuresonde, die eine Aminogruppe am Terminus aufweist, bevorzugt, Epoxidgruppen auf einer festen Trägeroberfläche einzuführen. Als andere Kombination dieser funktionellen Gruppen ist beispielsweise eine Kombination aus einer Carboxylgruppe für eine Nukleinsäuresonde (durch Einführen eines Succineimidderivats an den Terminus einer Nukleinsäuresonde) und einer Aminogruppe für eine feste Trägeroberfläche bevorzugt. Diese Kombination aus Amino- und Epoxidgruppen ist schlechter bei der Immobilisierung der Tintenstrahl ausgestoßenen Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger als eine Kombination aus Thiol- und Maleimodogruppen, allerdings nur bis zu einem vernachlässigbaren Ausmaß, wenn die Löcher auf dem festen Träger vorgesehen sind.
  • Die Amino- oder Epoxidgruppe kann auf einer Glasplatte als fester Träger eingeführt werden, indem zunächst die Oberfläche der Oberfläche der Glasplatte mit einer Alkalilösung, wie Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid, behandelt wird, um die Hydroxylgruppen (Silanolgruppen) an der Oberfläche frei zu legen, und dann wird ein Silankupplungsmittel, das eine Silanverbindung enthält, an die eine Aminogruppe (beispielsweise N-β-(Aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilan, etc.) eingeführt worden war oder eine Silanverbindung, in die eine Epoxidgruppe (beispielsweise γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, etc.) eingeführt worden ist, mit einer Hydroxylgruppe auf der Oberfläche der Glasplatte umgesetzt wird. Zur Einführung der Maleimidogruppen auf der Oberfläche der Glasplatte werden die Aminogruppen, die nach dem obigen Verfahren eingeführt wurden, mit N-Maleimidocaproyloxysuccinimid oder Succinimidyl-4-(maleimidophenyl)butyrat, etc. umgesetzt.
  • Die Strukturen von N-(3-(Aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilan, γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und Succinimidyl-4-(maleimodiphenyl)butyrat sind unten gezeigt:
    • – N-(3-(Aminoethyl)-γ-aminopropytrimethoxysilan (CH3O)2SiC3H6 NHC2H4NH2
    • – γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan
      Figure 00300001
    • – Succinimidyl-4-(maleimidophenyl)butyrat
      Figure 00300002
  • Wenn eine Epoxidgruppe auf einer festen Trägeroberfläche bei der obigen Oberflächenbehandlung eines festen Trägers eingeführt wird, kann die Basis der Löcher hydrophil nach der Bindung der Epoxidgruppen an eine Probe durch Öffnen nichtumgesetzter Epoxidringe unter Verwendung einer wässrigen Lösung aus Ethanolamin, etc., um diese in Hydroxylgruppen zu verwandeln, gemacht werden. Dieser Vorgang ist bevorzugt, wenn ein wässriges Lösungsmittel, das eine Zielsubstanz, enthält, die spezifisch mit einer Sonde reagiert, in die Löcher gegeben wird, an die die Sonde gebunden worden ist.
  • Wenn eine Harzplatte als fester Träger verwendet wird, können Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen oder Aminogruppen auf der Oberfläche des Harzsubstrats nach der Methode, die in Kapitel 5 von „The Organic Thin Films and Surface", Bd. 20, Academic Press. beschrieben ist, eingeführt werden. Alternativ können nach der Einführung der Hydroxylgruppe nach der Methode, die für die oben erwähnte Glasplatte gezeigt ist, Aminogruppen oder Epoxidgruppen unter Verwendung einer Silanverbindung mit Aminogruppen oder Epoxidgruppen eingeführt werden. Des weiteren kann eine Maleimidogruppe eingeführt werden. Funktionelle Gruppen können vor oder nach der Bildung des Matrixmusters auf einem festen Träger eingeführt werden. Vor der Bildung des Matrixmusters kann eine Reaktionslösung, die für die Einführung einer funktionellen Gruppe erforderlich ist, auf eine feste Trägeroberfläche durch Spinnbeschichtung oder Tauchbeschichtung, etc., gegeben werden. Nach der Matrixbildung kann eine Reaktionslösung in jedes Loch nach dem Tintenstrahlverfahren, etc. gegeben werden.
  • Zur Bindung einer Sonde an ein Harzsubstrat werden beispielsweise Hydroxylgruppen durch Oxidation der Oberfläche eines Harzsubstrats eingeführt, dann werden die Hydroxylgruppen mit einem Silankupplungsmittel, das aus einer Silanverbindung, die eine Aminogruppe zur Einführung von Aminogruppen enthält, zusammengesetzt ist, umgesetzt, und jede Aminogruppe wird mit einer funktionellen Gruppe einer Sonde nach der Beschreibung in der japanischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 60-015560 umgesetzt.
  • Wenn das Substrat nach der Behandlung hydrophil ist, können die oben erwähnten Harze für die Matrixmusterbildung ohne irgendeine Behandlung als relativ wasserabweisendes Material verwendet werden. Wenn weiterhin ein Abweisungsvermögen erforderlich ist, kann ein Wasserabweisungsmittel in eine Matrix hinzugegeben werden. Wenn ein Matrixmuster aus einem lichtempfindlichen Harz, wie Photoresists, gebildet wird, kann ein Nachbacken unter geeigneten Bedingungen nach der Belichtung und Entwicklung ein stärkeres Abweisungsvermögen dem Matrixmuster verleihen.
  • Wenn eine Probenlösung lipophil ist, kann, obwohl bisher hauptsächlich eine hydrophile Sondenlösung erklärt worden ist, eine gegenteilige Behandlung erfolgen.
  • Die Größe und Form der Löcher in einem Matrixmuster können nach der Größe eines Substrats der Größe einer Anordnung, wie sie im ganzen schließlich hergestellt werden soll, der Anzahl und Art der Sonde, die die Anordnung bildet oder einem Verfahren zur Herstellung eines Matrixmusters, einem Verfahren zum Zuführen einer Probenlösung in Löcher in einem Matrixmuster und einem Nachweisverfahren, etc. gewählt werden.
  • Der Querschnitt der Löcher durch eine Ebene parallel zum Substrat kann verschiedene Formen, zusätzlich zu den in 5 gezeigten Quadraten, wie als Rechtecke, verschiedene Polygone, Kreise und ovale Formen einnehmen.
  • Bevorzugt weisen die Löcher eine maximale Breite von 300 μm oder weniger, unter Berücksichtigung der Anzahl der Reaktionsteilnehmer und der Größe einer gesamten Anordnung, auf. Wie beispielsweise in 5 gezeigt ist, kann, wenn ein Querschnitt, der parallel zu einem Substrat aufgenommen ist, quadratisch ist, eine Seite 200 μm oder weniger in der Länge sein. Wenn die Löcher rechteckig sind, beträgt bevorzugt die maximale Seite 200 μm oder weniger und wenn die Löcher rund sind, beträgt der Durchmesser 200 μm oder weniger. Die minimale Grenze hinsichtlich der Länge beträgt etwa 1 μm.
  • Die Löcher können in verschiedenen Mustern nach Bedarf angeordnet sein. Die Löcher können in gleichen Abständen unter Bildung von Reihen und Spalten, wie in 5 gezeigt ist, angeordnet sein, oder die Löcher können so angeordnet sein, dass sie von den Positionen der Löcher in angrenzenden Linien abweichen.
  • Der Abstand zwischen angrenzenden Löchern wird bevorzugt so eingestellt, dass keine Kreuzkontamination verursacht wird, selbst wenn die Ausstoßpositionen etwas versetzt von der Position des Ziellochs, in das eine Sondenlösung beispielsweise mit der Tintenstrahlmethode gegeben wird, sind. In Anbetracht der Größe der ganzen Anordnung, der Kreuzkontamination und der Handhabung bei der Zugabe der verschiedenen Lösungen liegt der Abstand zwischen den angrenzenden Löchern in einem Bereich des ½- bis 2-fachen der maximalen Breite.
  • Es ist beispielsweise erwünscht, dass 100 × 100 oder 1.000 × 1.000 oder mehr Arten von Sonden in einer Probenanordnung für die vollständige Ausnutzung der Funktionen der Kombinationschemie vorhanden sind, und die Größe eines Substrats beträgt wünschenswerter Weise 1 Inch × 1 Inch oder 1 cm × 1 cm für die Eignung für automatische Operationen, wie Sondenfixierung, die Probenzuführung und der Nachweis, somit ist es für quadratische Löcher bevorzugt, eine Seite eines Quadrats eines Lochs auf 1–200 μm oder weniger einzustellen, und die Entfernung zwischen angrenzenden Löchern beträgt 200 μm oder weniger je nach Matrixgröße.
  • Die Dicke einer Matrix (Höhe von der festen Trägeroberfläche) wird nach der Methode der Herstellung des Matrixmusters, Löchervolumen und Volumen einer zuzuführenden Probenlösung bestimmt. Sie beträgt bevorzugt 1–20 μm. Diese Dicke ermöglicht es, dass, wenn eine Sondenlösung in jedes Loch nach der Tintenstrahlausstoßmethode gegeben wird, die Probe bei vorbestimmten Positionen auf einem festen Träger gehalten wird, was die Kreuzkontamination sehr effizient verhindert, selbst wenn die Eigenschaften der Sondenlösung nicht für die Ausbildung kleiner Spots auf der festen Trägeroberfläche in Relation zu den Bedingungen für die Tintenstrahlausstoßmethode, nicht geeignet sein sollten.
  • Wenn ein Loch eine Größe der oberen Grenze der oben beschriebenen gewünschten Bereiche aufweist, das heißt, 200 μm × 200 μm × 20 μm, dann ist das Lochvolumen 800 pl. Wenn diese Größe verwendet wird und der Abstand zwischen angrenzenden Zellen (× in 1) ebenfalls auf 200 μm eingestellt wird, erhält man eine Lochdichte mit 625 Löchern/cm2. Das bedeutet, man kann eine Anordnung mit einer Lochdichte in einer Größenordnung von 102 Löchern/cm2 oder mehr erhalten. Wenn ein Loch ein Quadrat mit einer Seite von 5 μm ist, wird der Abstand zwischen angrenzenden Löchern auf 5 μm gesetzt, die Dicke des Matrixmusters auf 4 μm eingestellt, das Lochvolumen zu 0,1 pl gesetzt und die Lochdichte auf 1.000.000 Löcher/cm2 festgelegt. Da eine Musterbildung mit 5 μm × 5 μm × 4 μm möglich bei der augenblicklichen Feinverarbeitungstechnologie ist, kann eine Anordnung mit einer Lochdichte in einer Größenordnung von 106 Löchern/cm2 oder mehr in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
  • In dieser Ausführungsform beträgt das Materialvolumen einer Sondenlösung oder einer Substanz, die mit einer Sonde, die in ein Loch gegeben wird, reagieren soll, 0,1 Picoliter (pl) bis 1 Nanoliter (nl) aus der obigen Berechnung, wenn das zuzuführende Volumen das gleiche sein soll oder fast das gleiche wie das Volumen des Lochs. Wenn eine Matrix eine geringe Affinität zu einer zuzuführenden Lösung hat, ist es möglich, die Lösung in einem Volumen, das das Lochvolumen übersteigt, hinzuzugeben, die oberhalb der Öffnung des Lochs aufgrund der Oberflächenspannung je nach Typ der Lösung gehalten wird. In diesem Fall kann eine Lösung in einem Volumen, dass das 10- bis mehrere 10-fache größer als das des Lochs ist, zugeführt und gehalten werden. Das bedeutet, einige Picoliter bis einige 10 Nanoliter einer Lösung werden zugeführt. In allen Fällen wird eine Sondenlösung bevorzugt in die Löcher mit dem Tintenstrahlverfahren gegeben, so dass man diese kleine Lösungsmengen mit genauer Position und genauer Zuführungsgenauigkeit hinzugeben kann, wobei allerdings auch Mikrodispenser und Mikropipetten verwendet werden können. Beim Tintenstrahldruck wird die Tinte unter Positionieren mit hoher Genauigkeit in einer Größenordnung von Mikrometer ausgestoßen. Diese Methode ist daher für die Zuführung einer Lösung in die Löcher gut geeignet. Da das Volumen einer auszustoßenden Tinte mehrere 10 Picoliter bis mehrere Nanoliter beträgt, kann man sagen, dass die Tintenstrahlmethode für die Zuführung einer Lösung auch in dieser Hinsicht geeignet ist.
  • Nach dieser Ausführungsform kann ein Ausbreiten der Tröpfchen quantitativ durch die Reaktion zwischen einer Nukleinsäuresonde und einer festen Trägeroberfläche als auch durch die Löcher gesteuert werden. Wenn außerdem eine Flüssigkeit in einer leicht versetzten Richtung ausgestoßen wird, wenn ein Tröpfchen auf einem Bereich, das ein Loch aufweist, auftrifft, wird ein Teil des Tröpfchens auf der Matrix abgestoßen und langsam in das Loch gezogen, weil die Matrix keine Affinität zu der ausgestoßenen Lösung hat.
  • Die in der vorliegenden Erfindung angewandte Tintenstrahlmethode unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, und es kann eine Piezostrahlmethode, eine Bubble-jet-Methode unter Verwendung von Thermoblasenbildung, etc. angewendet werden.
  • Jedes Material kann für den festen Träger 103 nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange wie die oben beschriebenen funktionellen Gruppen auf die Oberfläche eingeführt werden können. Nach einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind bevorzugte Materialien solche, auf deren Oberfläche ein Matrixmuster gebildet werden kann. Wenn das Reaktionsprodukt einer Sonde und eine Zielsubstanz optisch mit einem Nachweissystem über einen festen Träger nachgewiesen wird, ist der feste Träger bevorzugt transparent. Als diese Materialien können Glas, einschließlich synthetischer Quartz und geschmolzener Quartz, Silikon, Acrylharze, Polycarbonatharze, Polystyrolharze und Vinylchloridharze erwähnt werden. Wenn das Reaktionsprodukt optisch nicht über einen festen Träger nachgewiesen wird, ist es bevorzugt, einen optischen schwarzen festen Träger zu verwenden, und Harzsubstrate, die schwarze Farbstoffe und Pigmente, wie Ruß, enthalten, können verwendet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung, die eine Substanz, die mit der Sonde (der Testlösung) reagiert, auf eine Probenanordnung gegeben und unter geeigneten Reaktionsbedingungen für die Fortschreitung der Reaktion stehen gelassen. Wenn viele Testlösungen auf die Anordnung gegeben werden müssen, wird zumindest eine Testlösung auf viele Löcher in der Sondenanordnung gegeben. In diesem Fall kann, wie oben gezeigt, wenn die zugeführte Lösung eine Affinität zu den Löchern, die eine fixierte Sonde in der bereits hergestellten Sondenanordnung enthalten und keine Affinität zu dem Matrixmuster aufweist, eine quantitative Zuführung der Lösung auf einen eingeschränkten Bereich ohne Kreuzkontamination erreicht werden. Da die meisten Biomaterialien wasserlöslich sind, sind die Löcher hydrophil und das Matrixmuster ist wasserabweisend. Die Anwendung der Tintenstrahlmethode für die Zuführung dieser Substanzen für die oben gezeigte Reaktion kann außerdem quantitativ eine sehr kleine Lösungsmenge zuführen.
  • Erfindungsgemäß werden sehr kleine Mengen einer Sondenlösung und einer Testlösung verwendet. Es ist somit erwünscht, Bedingungen zur Verhinderung der Verdampfung oder Dampfbildung der zugeführten Lösungen für beide Fälle vorzusehen.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Einzelnen mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben.
  • (Beispiel 1)
  • Herstellung einer Nukleinsäurensondenanordnung unter Verwendung eines Bubble-jet-Druckers und Bewertung der Sondenanordnung.
  • (1) Waschen des Substrats
  • Eine Glasplatte mit 1 Inch × 1 Inch wurde in einem Ständer platziert und über Nacht in einem Ultraschall-Waschdetergens getaucht. Nach dem Ultraschallwaschen in dem Detergens für 20 Minuten, wurde das Detergents durch Spülen mit Wasser entfernt. Nach dem Spülen mit destilliertem Wasser wurde die Ultraschallbehandlung in einem Behälter, der destilliertes Wasser enthielt, für 20 Minuten durchgeführt. Die Glasplatte wurde für 10 Minuten in einer 1 N Natriumhydroxidlösung, die auf 80°C vorgeheizt war, getaucht. Dann wurde die Platte mit Was ser und destilliertem Wasser gewaschen, um eine Glasplatte für eine Probenanordnung herzustellen.
  • (2) Oberflächenbehandlung
  • Eine 1 gew-%ige Lösung eines Silankupplungsmittels (Produktname: KBM603; Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), die eine Silanverbindung mit einer Aminogruppe (N-β-(Aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilan) enthält, wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, um die Methoxygruppen mit der obigen Silanverbindung zu hydrolysieren. Dann wurde das Substrat in diese Lösung bei Raumtemperatur (25°C) für 20 Minuten eingetaucht, aus der Lösung herausgenommen und durch Blasen mit Stickstoffgas auf beiden Seiten der Glasplatte getrocknet. Dann wurde die Glasplatte für 1 Stunde in einem Ofen, der auf 120°C aufgeheizt war, gebacken, um die Silankupplungsbehandlung zu vervollständigen und eine Aminogruppe auf der Oberfläche des Substrats einzuführen. Dann wurden 2,7 mg N-(6-Maleimido-caproyloxy)-succinimid (Dojin Co., Ltd.) (abgekürzt als EMCS) ausgewogen und in einer Mischung aus DMSO/Ethanol (1 : 1) bis auf eine Endkonzentration von 0,3 mg/ml gelöst, um eine EMCS-Lösung herzustellen. Die Glasplatte mit der Silankupplungsbehandlung wurde in die EMCS-Lösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden für die Reaktion der Aminogruppen und die Carboxylgruppen, die auf der Oberfläche der Glasplatte getragen werden, getaucht. Bei dieser Bedingung erhielt die Glasplatte auf ihrer Oberfläche Maleimidogruppen von dem EMCS. Die aus der EMCS-Lösung herausgenommene Glasplatte wurde nacheinander mit einem Lösungsmittelgemisch aus Dimethylsulfoxid und Ethanol und mit Ethanol gewaschen und dann in einer Stickstoffgasatmosphäre getrocknet.
  • (3) Synthese der DNA-Sonde
  • Es wurde eine einzelsträngige (ss) Nukleinsäure mit der SEQ ID Nr. 1 mit einem automatischen DNA-Sythesegerät synthetisiert. Es wurde eine Thiol(SH)-Gruppe am Terminus der ss-DNA von SEQ ID Nr. 1 mit einem Thiolmodifikator (Glen Research Co., Ltd.) während der Synthese im automatischen DNA-Synthesegerät eingeführt. Nach einer üblichen Schutzgruppenentfernung wurde die DNA gewonnen, über Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt und in den folgenden Experimenten verwendet.
    SEQ ID NR. 1
    5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
  • (4) DNA Ausstoß und Bindung an ein Substrat unter Verwendung eines BJ-Druckers
  • Die ssDNA mit der SEQ ID NR. 1 wurde einer TE-Lösung (10 mMol Tris-HCl (pH 8)/1 mMol wässrige EDTA-Lösung) auf eine Endkonzentration von etwa 400 mg/ml gelöst, um eine ssDNA-Lösung herzustellen (die genaue Konzentration wird aus der Absorption berechnet).
  • Eine wässrige Lösung, die Glyzerin mit 7,5 Gew-%, Harnstoff mit 7,5 Gew-%, Thioglykol mit 7,5 Gew-% und einen Acetylenalkohol (Produktname: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) mit der obigen allgemeinen Formel (2) zu 1 Gew-% hergestellt und in die DNA-Lösung gegeben, um eine Endkonzentration der ssDNA auf 8 μMol einzustellen. Diese Flüssigkeit hatte ei ne Oberflächenspannung in einem Bereich von 30–50 Dyn/cm und eine Viskosität von 1,8 cps (Viskosimeter vom E-Typ: Tokyo Keiki Co., Ltd.). Die Flüssigkeit wurde in einen Tintentank eines Bubble-jet-Druckers (Produktname: BJC620; Canon Inc.) gefüllt, und der Tintentank wurde auf einen Bubble-jet-Kopf montiert. Der hier verwendete Bubble-jet-Drucker (Produktname: BJC620;. Canon Inc.) ist modifiziert worden, um einen Druck auf einer Platte zu ermöglichen. Dieser Bubble-jet-Drucker kann mit einer Auflösung von 360 × 720 dpi drucken. Die in (2) oben behandelte Glasplatte wurde dann auf diesen Drucker montiert, und die Flüssigkeit, die die Sondennukleinsäure enthielt, wurde als Spot auf der Glasplatte gebildet. Der Abstand zwischen der Düsenspitze des Bubble-jet-Kopfs und der Oberfläche der Glasplatte betrug 1,2–1,5 mm. Die Bedingungen für die Spotbildung wurden in der Weise eingestellt, dass die Flüssigkeit einmal, gefolgt von 2 Leerausstößen in Richtung 360 dpi als Spot gebildet und dann einmal gefolgt von fünf Leerlaufausstößen in Richtung 720 dpi als Spot ausgebildet wurde. Nach Beendigung der Spotbildung ließ man die Glasplatte in einer Feuchtigkeitskammer für 30 Minuten stehen, um die Reaktion zwischen den Maleimidogruppen und der Glasplattenoberfläche und den Thiolgruppen am Terminus der Nukleinsäuresonden zu vervollständigen. Die Menge der DNA-Lösung, die bei einem Ausstoßvorgang des Druckers ausgestoßen wurde, betrug etwa 24 pl.
  • (5) Blockierungsreaktion
  • Nach Vervollständigung der Reaktion zwischen den Maleimidogruppen und der Thiolgruppe wurde die Glasplatte mit 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, um die DNA enthaltende Flüssigkeit vollständig von der Oberfläche der Glasplatte wegzuspülen. Dann wurde die Glasplatte in eine wässrige 2%ige Rinderserumalbuminlösung eingetaucht und für 2 Stunden stehen gelassen, um mit der Blockierungsreaktion fortzuschreiten.
  • (6) Hybridisierungsreaktion
  • Eine ssDNA mit einer Basensequenz komplementär zur DNA von SEQ ID NR. 1 wurde mit einem automatischen DNA Synthesegerät synthetisiert, und Rhodamin wurde an ihren 5'-Terminus gebunden, um eine markierte ssDNA zu erhalten. Diese markierte ssDNA wurde in 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) auf eine Endkonzentration von 1 μMol gelöst. Die Sondenanordnung, die einer Blockierungsbehandlung unterworfen wurde und in (5) oben hergestellt wurde, wurde in diese Lösung bei Raumtemperatur (25°C) für drei Stunden getaucht, um mit der Hybridisierungsreaktion fortzuschreiten. Dann wurde die Sondenanoodnung mit 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, um die ssDNA, die nicht mit der Nukleinsäuresonde hybridisiert hat, wegzuwaschen. Dann wurde die Fluoreszenzintensität in jedem Spot der Sondenanordnung mit einem Bildanalysegerät (Produktname: ARGUS; Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) quantifiziert.
  • (7) Ergebnisse
  • Die Fluoreszenzintensivität der Spots der Nukleinsäure von SEQ ID NR. 1, die vollständig mit der markierten ssDNA übereinstimmte, betrug 4.600. Außerdem wurde die Sondenanordnung, auf der die jeweiligen Sports eine Fluoreszenz nach der Hybridisierung emittierten, mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Corp.) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass bei der Probenanordnung dieses Beispiels
    • (a) jeder Spot fast rund war und einen Durchmesser in einem Bereich von etwa 70–100 μm aufwies;
    • (b) es Freiräume mit etwa 100 μm gab, die fast den gleichen Durchmesser eines jeden Spots zwischen den angrenzenden Spots aufwiesen, so dass jeder Spot deutlich unabhängig war;
    • (c) die Spalten und Reihen der Spots in Linien angeordnet waren.
  • Diese Tatschen sind sehr effektiv beim automatischen Nachweis etc. von hybridisierten Spots auf einer Probenanordnung.
  • (Beispiel 2)
  • Herstellung einer Nukleinsäuresondenanordnung unter Verwendung eines Bubble-jet-Druckers und Nachweis der Zielnukleinsäure unter Verwendung der Probenanordnung.
  • (1) Es wurde in der gleichen Weise wie in (1) und (2) von Beispiel 1 eine Glasplatte für eine Probenanordnung hergestellt.
  • (2) Synthese der DNA-Sonde
  • Es wurden einsträngige Nukleinsäuren mit den SED ID NRn. 1–4 mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Die ss-Nukleinsäuren von SED ID Nrn. 2–4 waren wie folgt: ausgehend von der in Beispiel 1 verwendeten ss-Nukleinsäure mit SEQ ID NR. 1 unterschieden sich eine Basis in SEQ ID NR. 2, drei Basen in SEQ ID NR. 3 und 6 Basen in SEQ ID NR. 4. Es wurde eine Thiol(-SH)-Gruppe an jeden Terminus der ssDNA mit den SEQ ID NRn. 1–4 mit einem Thiol-Modifikator (Glen Research Co., Ltd.) während der Synthese im automatischen DNA-Synthesegerät eingeführt. Nach einer üblichen Deprotektion wurde dann die DNA gewonnen, über die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt und in den folgenden Experimenten eingesetzt. Die Sequenzen mit den ID Nrn. 2–4 sind unten gezeigt:
    SEQ ID NR. 2:
    5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3'
    SEQ ID NR. 3:
    5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3'
    SEQ ID NR. 4:
    5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3'
  • (3) DNA-Sondenausstoss und Binden an das Substrat unter Verwendung eines BJ-Druckers
  • Die ss-DNAs mit den SEQ ID NRn. 1–4 oben wurden verwendet, um vier Ausstossflüssigkeiten nach der Methode, die ähnlich zu der in (4) von Beispiel 1 war, herzustellen. Die jeweiligen Flüssigkeiten wurden in vier Tintentanks des in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet-Druckers gefüllt, und die jeweiligen Tintentanks wurden auf den Bubble-jet-Köpfen montiert. Die in (1) herge stellte Glasplatte wurde auf dem Drucker montiert, und die vier Nukleinsäuresonden wurden auf jeweils vier Bereiche mit 3 × 3 mm auf der Glasplatte als Spots gebildet. Das Spotmuster auf jedem Bereich war das gleiche wie in Beispiel 1. Nach der Vervollständigung der Spotbildung ließ man die Glasplatte in einer Feuchtigkeitskammer für 30 Minuten stehen, um die Maleimidogruppe und die Thiolgruppe reagieren zu lassen.
  • (4) Blockierungsreaktion
  • Nach Vervollständigung der Reaktion zwischen der Maleimidogruppe und der Thiolgruppe wurde die Glasplatte mit einer 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) gewaschen, um die die DNA enthaltende Lösung von der Oberfläche der Glasplatte vollständig wegzuspülen. Dann wurde die Glasplatte in eine wässrige 2%ige Rinderserumalbuminlösung eingetaucht und für 2 Stunden stehen gelassen, um die Blockierungsreaktion fortschreiten zu lassen.
  • (5) Hybridisierungsreaktion
  • Eine ssDNA mit einer Basensequenz, die komplementär zur DNA mit der SEQ ID NR. 1 war, wurde mit einem automatischen DNA-Sythesegerät synthetisiert, und es wurde Rhodamin an ihren 5'-Terminus gebunden, um eine markierte ssDNA zu erhalten. Diese markierte ssDNA wurde in einer 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) bis zu einer Konzentration von 1 μMol gelöst. Die in (4) erhaltene Probenanordnung wurde einer Hybridisierungsreaktion für 3 Stunden unterworfen. Dann wurde die Sondenanordnung mit einer 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, um die ssDNA wegzuwaschen, die nicht mit der Nukleinsäuresonde hybridisiert. Dann wurden die jeweiligen Spots der Sondenanordnung unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Nikon Corp.) beobachtet und die Fluoreszenzmengen wurden mit dem Bildanalysegerät (Produktname: ARGUS; Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) quantifiziert.
  • (6) Ergebnisse
  • Die Fluoreszenzintensität der Spots der DNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 1, die vollständig mit der markierten ssDNA übereinstimmte, betrug 4.600, während die Fluoreszenzintensität für die Spots der DNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 2, die eine nicht übereinstimmende Base enthielt, 2.800 betrug. Für die Spots der DNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 3 mit drei nicht übereinstimmenden Basen betrug die Fluoreszenzintensität 2.100, was weniger war als die Hälfte für die vollständig übereinstimmende Sonde. Es wurde keine Fluoreszenz für die DNA mit der SEQ ID NR. 4, die sechs nicht übereinstimmende Basen enthielt, beobachtet. Das obige Ergebnis zeigt an, dass eine vollständig komplementäre ssDNA spezifisch auf dem DNA-Anordnungssubstrat nachgewiesen wurde.
  • Beispiel 3
  • Konzentration der DNA-Sondenlösung und Eigenschaften des Bubble-jet-Ausstoßes
  • (1) Synthese der DNA-Sonde
  • Die unten gezeigte ssDNA mit der SEQ ID NR. 5 wurde mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert und in einer TE-Lösung (10 mMol Tris-HCl (pH 8)/1 mMol wässrige EDTA-Lösung) auf Konzentrationen von etwa 0,2 mg/ml, 2 mg/ml und 1,5 mg/ml gelöst, um DNA-Sondenlösungen mit drei verschiedenen Konzentrationen (die genauen Konzentrationen wurden aus der Absorption berechnet) herzustellen.
    SEQ ID NR. 5:
    5'GCCTGATCAGGC3'
  • (2) Ausstoß mit einem BJ-Drucker
  • Eine wässrige Lösung, die Glyzerin mit 7,5 Gew-%, Harnstoff mit 7,5 Gew-%, Thiodiglykol mit 7,5 Gew-% und Acetylenalkohol (Produktname: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) zu 1 Gew-%, das die obige allgemeine Formel (I) aufwies, enthielt, wurde hergestellt, in die in (1) hergestellte 0,2 mg/ml Sondenlösung gegeben und auf eine Endkonzentration von etwa 0,02 mg/ml (3 μMol) eingestellt. Diese Lösung wurde in einen Tintentank des in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet- Druckers gefüllt, und der Tintentank wurde auf den in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet-Kopf montiert.
  • Es wurde eine Aluminiumplatte der Größe A4 auf den Drucker montiert, und die Flüssigkeit wurde auf einen Bereich von 3 × 5 Quadratinch auf der Aluminiumplatte als Spots ausgebildet. Die Bedingung der Spotbildung wurde so eingestellt, dass eine Spotbildung in einer Dichte von 360 × 720 dpi in dem obigen Bereich durchgeführt werden konnte. Es wurde eine kommerzielle Tinte für den BJ 620 zunächst als Kontrolle auf die Aluminiumplatte gedruckt. Dieser Vorgang wurde insgesamt auf vier Aluminiumplatten durchgeführt.
  • Die Nukleinsäuresonde, die auf den jeweiligen Aluminiumplatten als Spots ausgebildet war, wurde mit der TE-Lösung gewonnen und nach der Gelfiltrationsmethode gereinigt. Die Mengen der gewonnenen gereinigten Nukleinsäuresonde wurden durch Absorption gemessen. Die theoretische Gewinnung der Nukleinsäuresonde ist wie folgt. Das bedeutet, ein Volumen eines Tröpfchens, das vom Kopf des in diesem Beispiel verwendeten Druckers ausgestoßen wurde, betrug 24 Picoliter. Da vier Aluminiumplatten, auf denen die Lösung in Spots auf einen Bereich von 3 × 5 Quadratinch bei einer Dichte von 360 × 720 dpi ausgebildet waren, verwendet wurden, ergab sich die folgende Gleichung: 24 (Picoliter) × (720 × 360) × (3 × 5) × 4 Platten = 373 μl.
  • Die Absorption bei 260 nm der Nukleinsäuresonde für dieses Volumen und die Absorption bei 260 nm der gewonnenen Nukleinsäuresonde sind in 3 gezeigt.
  • (3) Der Vorgang, der identisch mit dem in (2) beschrieben ist, wurde mit den Sondenlösungen bei Konzentrationen von 2 mg/ml und 15 mg/ml durchgeführt. Die Endkonzentrationen der Nukleinsäuresonde der jeweiligen Ausstoßflüssigkeiten waren 30 μMol (0,2 mg/ml) und 225 μMol (1,5 mg/ml). Die Absorption der Nukleinsäuresonde, die aus den jeweiligen Lösungen gewonnen wurde, und die Absorption der Nukleinsäure in theoretischen Mengen sind in 3 gezeigt.
  • (4) Ergebnisse
  • Wie in 3 gezeigt ist, waren die Mengen der Nukleinsäuresonde tatsächlich nah an den theoretischen Werten. Daraus folgt, dass bei dem Ausstoß einer Nukleinsäuresonde unter Anwendung der Bubble-jet-Methode kein quantitativer Verlust der Nukleinsäuresonde aufgrund von Anbrennen und Verkleben der Nukleinsäuresonde am Heizelement des Bubble-jet-Kopfs beobachtet wurde. Es gab keine Schwierigkeiten im Kopf, wie kein Ausstoß, während der Spotbildung auf der Aluminiumplatte mit den Flüssigkeiten der verschiedenen Konzentrationen. Ein makroskopischer Vergleich mit den Spots der Tinte für einen Bubble-jet-Drucker, die als Kontrolle auf der Aluminiumplatte als Spots gebildet waren, und den Spots der Nukleinsäuresonden zeigte, dass der Spotbildungszu stand der Spots, die unter Verwendung der Flüssigkeiten bei Konzentrationen von 3 μMol und 30 μMol gebildet worden waren, ähnlich wie derjenige für den Tintenspot war. Die Spots, die mit der Flüssigkeit bei einer Konzentration von 225 μMol gebildet worden waren, zeigten einige Mängel im Vergleich mit dem Tintenspot.
  • (Beispiel 4)
  • Einfluss des Bubble-jet-Prozesses auf die Nukleinsäuresonde
  • (1) Synthese der Nukleinsäuresonde
  • Eine Nukleinsäuresonde, die ein 10-mer von Adenylsäuren (nachfolgend abgekürzt "A" (synthetische Substanz), OligoA (40–60 mer; Pharmacia Co., Ltd.), und Poly (dA) (300–400 mer; Pharmacia Co., Ltd.) umfasste, wurde mit einer TE-Lösung verdünnt, um Lösungen von Nukleinsäuresonden mit verschiedenen Basenlängen bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml herzustellen. Die Basensequenz der 10-mer-Sonde (SEQ ID NR. 6) ist nachfolgend gezeigt:
    SEQ ID NR. 6:
    5'AAAAAAAAAA3'
  • (2) Ausstoß der DNA-Lösung mit dem Bubble-jet-Drucker
  • Eine wässrige Lösung, die Glyzerin mit 7,5 Gew-%, Harnstoff mit 7,5 Gew-% und Acetylenalkohol mit 1 Gew.-% (Produktname: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.), das durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist, enthielt, wurde hergestellt, und die in (1) hergestellten jeweiligen Nukleinsäuresondelösungen wurden mit dieser wässrigen Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml verdünnt.
  • Wie in Beispiel 3 wurden die jeweiligen Nukleinsäuresondenlösungen, die in einer Kartusche abgefüllt waren, auf einer Aluminiumplatte ausgestoßen, und es wurde der Spotbildungsstatus makroskopisch beobachtet. Im Ergebnis wiesen die Probenanordnungen für die Nukleinsäuresonden mit den Basenlängen des 10-mers und 40–60 mers unabhängige Spots, die gleichmäßig auf der Aluminiumplatte angeordnet waren, auf. Für die Nukleinsäuresonde mit dem 300–400-mer, obwohl im wesentlichen eine ähnliche Anordnung enthalten wurde, waren auf einigen Bereichen angrenzende Spots miteinander verbunden. Dieses kann auf die leicht ungenaue Ausstoßrichtung des Bubble-jet-Kopfes zurückzuführen sein, was durch Änderungen der physikalischen Eigenschaften aufgrund der langen Basenkette der Nukleinsäuresonde verursacht wird.
  • Die Spots auf der Probenanordnung, die unter Verwendung der jeweiligen Nukleinsäuresondenlösungen hergestellt worden waren, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben, gewonnen. Ein 100 μl Aliquot von jeder gewonnenen Nukleinsäuresondenlösung wurde über die Umkehrphasen-HPLC analysiert, ob die Nukleinsäuresonden durch Ausstoß im Vergleich mit den Lösungen vor dem Ausstoß gespalten worden sind oder nicht. Ein 7–70%iger Acetonitrilgra dient, der 1 Mol Triethylaminacetat enthielt, wurde als Elutionsmittel für die Umkehrphasen-HPLC verwendet. Im Ergebnis beobachtete man kein DNA-Fragment, das wohl gespalten war, was bestätigt, dass die Nukleinsäuresonden nicht durch den Ausstoß mit der Bubble-jet-Methode denaturiert worden waren. Die gewonnenen Nukleinsäuresonden wie in Beispiel 3 quantifiziert, und die Nukleinsäuresonden mit drei verschiedenen Basenlängen wurden bei fast theoretischen Mengen, wie in 4 gezeigt ist, gewonnen.
  • (Beispiel 5)
  • Untersuchung der Reaktionsdauer
  • Es wurden wie in Beispiel 1 Probenanordnungen hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Glasplatte, die einer Oberflächenbehandlung unterworfen war, auf der die Nukleinsäuresonden als Spot gebildet waren und in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur (25°C) für 10 Minuten oder 90 Minuten oder über Nacht wie in (4) von Beispiel 1 stehen gelassen. Die jeweiligen Anordnungen wurden für die Hybridisierung verwendet. Im Ergebnis zeigten die Probenanordnungen, die für 90 Minuten oder über Nacht reagierten, eine Fluoreszenzstärke, die ähnlich zu derjenigen der in Beispiel 1 erhaltenen Probenanordnung war. Dieses zeigt, dass eine Bindungsreaktion zwischen der Maleimidogruppe auf der Oberfläche der Glasplatte und der Thiolgruppe am Terminus der Nukleinsäuresonde fast in 30 Minuten vervollständigt war. Die Probenanordnung, die für 10 Minuten reagierte, zeigte allerdings nur eine Fluoreszenz von etwa 70 % derjenigen von Beispiel 1.
  • (Beispiel 6)
  • Herstellung einer PNA-Probenanordnung unter Verwendung eines Bubble-jet-Druckers und Nachweis einer Zielnukleinsäure unter Anwendung der Probenanordnung.
  • (1) Es wurde in der gleichen Weise wie in (1) und (2) von Beispiel 1 eine Glasplatte für die Probenanordnung hergestellt.
  • (2) Synthese der PNA-Sonde
  • Proteinnukleinsäuren (PNAs) (Nippon Perceptive Co., Ltd.) mit den Basensequenzen mit den SEQ ID NRn. 7 und 8, die nachfolgend gezeigt sind, wurden hergestellt. Bei den PNAs war ein Cysteinrest (als Cys ausgedrückt) am N-Terminus der PNA (entsprechend dem 5'-Terminus der DNA) gebunden und als Ergebnis wurde am N-Terminus eine Thiolgruppe eingeführt. Die PNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 8 wird hergestellt, indem eine Base der PNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 7 ausgetauscht wurde.
    SEQ ID NR. 7
    NCys-NH(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2CONH-ACTGGCCGTCGTTTTACAC
    SEQ ID NR. 8
    NCys-NH(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2CONH-ACTGGCCGTTGTTTTACAC
  • (3) PNA-Sondenausstoss und Bindung an ein Substrat unter Verwendung eines BJ-Druckers
  • Die jeweiligen PNA-Sonden wurden in 100 μl 0,1 Gew-% Trifluoressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 80 μMol gelöst. Dann wurde eine wässrige Lösung, die Glyzerin mit 7,5 Gew-%, Harnstoff mit 7,5 Gew-%, Thiodiglykol mit 7,5 Gew-% und Acetylenalkohol zu 1 Gew-% (Produktname: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.), das durch die obige allgemeine Formel (I) dargestellt ist, enthielt, in die Trifluoressigsäurelösungen der PNAs gegeben, um eine Endkonzentration der PNA-Sonde auf 8 μMol einzustellen. Diese Flüssigkeiten hatten eine Oberflächenspannung in einem Bereich von 30– 50 Dyn/cm und eine Viskosität in einem Bereich von 1– 5 cps.
  • Diese PNA-Sondenlösungen wurden als Spots in einer Weise, die ähnlich zu der in (3) von Beispiel 2 ist, auf den jeweiligen Bereichen der in (1) hergestellten Glasplatte ausgebildet. Nach Vervollständigung der Spotbildung ließ man die Glasplatte in einer Feuchtigkeitskammer für 3 Stunden stehen, um die Maleimidogruppe und Thiolgruppe reagieren zu lassen. Die Menge der PNA-Sondenlösung, die durch einen Ausstoßvorgang des Druckers ausgestoßen worden war, betrug etwa 24 pl.
  • (4) Blockierungsreaktion
  • Nachdem die Maleimidogruppe und die Thiolgruppe vollständig abreagiert hatten, wurde die Glasplatte mit einer 1 Mol NaCl/50 mMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, um die die PNA enthaltende Flüssigkeit von der Oberfläche der Glasplatte vollständig wegzuspülen. Dann wurde die Glasplatte in eine wässrigen 2%igen Rinderserumalbuminlösung eingetaucht und für 3 Stunden stehen gelassen, um mit der Blockierungsreaktion fortzuschreiten.
  • (5) Hybridisierungsreaktion
  • Eine ssDNA mit einer Basensequenz, die komplementär zu der PNA mit der SEQ ID NR. 7 war, wurde mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert, und es wurde Rhodamin an ihren 5'-Terminus gebunden, um eine markierte ssDNA zu erhalten. Diese markierte ssDNA wurde in 10 mMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) auf eine Endkonzentration von 5 nMol (Lösungsvolumen 1 ml) gelöst. Die PNA-Sondenanordnung, die der Blockierungsbehandlung in (4) oben unterworfen worden war, wurde in diese Lösung bei Raumtemperatur (25°C) für 12 Stunden stehen gelassen, um mit der Hybridisierungsreaktion fortzuschreiten. Dann wurde die Sondenanordnung mit 10 ml Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, um die ssDNA wegzuwaschen, die nicht mit der PNA-Sonde hybridisiert hatte. Dann wurde die Fluoreszenzmenge der Spots der Sondenanordnung mit einem Bildanalysegerät (Produktname: ARGUS 50; Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) quantifiziert.
  • (6) Ergebnisse
  • Die Fluoreszenzintensität von jedem Spot der PNA-Sonde mit der SEQ ID Nr. 7, die vollständig mit der markier ten ssDNA übereinstimmte, betrug 2.400, während sie 1.100, etwa die Hälfte, für die PNA-Sonde mit der SEQ ID Nr. 8 mit einer nicht übereinstimmenden Base betrug. Daraus folgt, dass die vollständige komplementäre ssDNA spezifisch auf der PNA-Anordnung nachgewiesen worden war.
  • Nach der Hybridisierung wurde die Probenanordnung, auf der jeder Spot eine Fluoreszenz emittiert, mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Corp.) beobachtet. Als Ergebnis ist bei der Probenanordnung dieses Beispiels gezeigt worden, dass
    • (a) jeder Spot fast rund war und einen Durchmesser im Bereich von etwa 200 μm aufwies;
    • (b) es distinkte Freiräume von 50 μm zwischen angrenzenden Spots gab, so dass jeder Spot eindeutig unabhängig war;
    • (c) die Spalten und Reihen der Spots in Linien angeordnet waren.
  • Diese Tatsachen sind beim automatischen Nachweis etc. von hybridisierten Spots auf einer Probenanordnung sehr effektiv.
  • Da es außerdem nicht notwendig für eine Lösung ist, dass sie Natriumchlorid in der Hybridisierungsreaktion enthält und dass anschließend nicht umgesetzte ssDNA entfernt wird, ist es nicht erforderlich, auf die Ablagerung von Natriumchlorid während der Fluoreszenzbeobachtung zu achten. Im Ergebnis konnte der Nachweis der Hybride auf einer Sondenanordnung ganz einfach nachgewiesen werden. Außerdem ist es nicht notwendig, während der Lagerung dicht zu verschließen, so dass die Handhabung einfacher ist.
  • Der Grund dafür, dass der Durchmesser der Spots der PNA-Sonde größer als derjenige der Spots der in Beispiel 1 hergestellten Anordnung ist, ist noch nicht geklärt. Allerdings sind die vorliegenden Erfinder zur Auffassung gelangt, dass die PNA-Sonden eine leicht schwächere Wasserlöslichkeit im Vergleich mit den DNA-Sonden aufweisen. Es wird daher angenommen, dass sich die Spotdurchmesser unterscheiden aufgrund des Unterschieds, dass die Wasserlöslichkeit einen Unterschied bei der Oberflächenspannung der jeweiligen Tintenstrahlausstoßflüssigkeiten verursacht.
  • (Beispiel 7)
  • Herstellung und Bewertung eines Glassubstrats mit einer schwarzen Matrix in einer Sondenanordnung, die auf ihrer Oberfläche Epoxygruppen aufweist.
    • (1) Ein Glassubstrat (50 mm × 50 mm), das aus synthetischem Quarz bestand, wurde einer Ultraschallreinigung mit einer wässrigen 2%igen Natriumhydroxidlösung und einer UV-Ozonisierung für die Reinigung der Oberfläche unterworfen. Eine wässrige 50 gew.-%ige Methanollösung, die 1 Gew-% eines Silankupplungsmittels (Produktname: KBM403, von Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) enthielt und eine Silanverbindung mit einer Epoxidgruppe (γ-Glycid oxypropyltrimethoxysilan) enthielt, wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, um die Methoxygruppen der obigen Silanverbindung zu hydrolysieren. Dann wurde die Lösung auf die Oberfläche des obigen Substrats mit einem Spinbeschichtungsgerät aufgetragen, bei 100°C für 5 Minuten erhitzt und dann getrocknet, um die Epoxidgruppen auf der Oberfläche des Substrats einzuführen.
    • (2) Dann wurde ein DEEP-UV-Resist (Resist vom Negatyp für eine schwarze Matrix) (Produktname: BK-739P, von Nippon Steel Chemical Co., Ltd.), der Ruß enthielt, auf das obige Substrat mit einem Spinnbeschichtungsgerät aufgetragen, und man erhielt nach dem Aushärten eine Filmdicke von 5 μm, und dann wurde das Substrat bei 80°C für 5 Minuten unter Verwendung einer Heizplatte für die Filmhärtung erhitzt. Ein Bereich von 1 cm × 1 cm des Substrats wurde einer Nahbelichtung unter Verwendung einer Maske unterworfen, die so als Muster ausgebildet wurde, dass der Abstand (X) zwischen den benachbarten Löchern in 5 100 μm wäre und die Geometrie der Löcher ein Quadrat mit 100 μm × 100 μm ergeben würde, und das Substrat wurde in einer anorganischen alkalischen Entwicklungslösung mit einem Spinentwicklerinstrument entwickelt, dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um vollständig die Entwicklungslösung zu entfernen. Das Substrat wurde dann oberflächlich mit einen Spintrockner getrocknet, und bei 180°C für 30 Minuten in einem sauberen Ofen, damit der Resist völlig aushärtet, erhitzt; somit erhielt man ein Substrat mit 2.500 Löchern, die in einer vorbestimmten Anordnung, wo die angrenzenden Löcher voneinander durch die schwarze Matrix isoliert waren, angeordnet sind. Hier betrug das kalkulierte Volumen der Löcher 50 Picoliter (pl). An diesen Punkt konnte die Oberfläche der schwarzen Matrix kaum nass werden, weil ihr Kontaktwinkel gegenüber Wasser 93° betrug, und die Bodenoberfläche der Löcher wurde allerdings leicht nass, weil ihr Kontaktwinkel gegenüber Wasser 35° betrug.
    • (3) Eine wässrige 10 μMol Rhodamin B-Lösung wurde in einen Tintentank für einen Bubble-jet-Drucker (Produktname: BJC620, von Canon Inc.) gefüllt, und der Tank wurde auf den Bubble-jet-Kopf des Bubble-jet-Druckers, der in Beispiel 1 oben beschrieben und verwendet wurde, montiert. Und die festen Träger, die nach den obigen Beschreibungen in (1) und (2) hergestellt worden waren, wurden in den Drucker eingesetzt, und die Löcher von jedem festen Träger wurden mit Rhodamin B befüllt, so dass sich ein kariertes Muster ergab. Hier betrug die Zugabe von Rhodamin B pro Loch etwa 50 Picoliter, und die Positionsgenauigkeit der Abgabe dieses Druckers betrug ± 2,5 μm. Dann wurde eine wässrige 10 μMol Amino-FITC-Lösung in einen anderen Tintentank eingefüllt, und der Tintentank wurde in den Bubble-jet-Kopf des obigen Druckers eingebaut, und die Lösung wurde in die Löcher gegeben, die anders als die Löcher, die bereits mit Rhodamin B befüllt waren, waren und benachbart dazu angeordnet waren. Der Grund für die Verwendung von Rhodamin B und Amino-FITC liegt darin, dass beide wasserlöslich sind, so dass sie einfach vom Tintenstrahlkopf abzugeben sind, und die Beobachtung ihrer Fluoreszenz er möglicht es, die Bedingungen und die Kreuzkontamination der in die Löcher gefüllten Lösung zu überprüfen.
    • (4) Ein G-Anregungsfilter (für Rhodamin B) und ein B-Anregungsfilter (für Amino-FITC) wurden in ein Fluoreszenzmikroskop (von Nikon Corporation) eingesetzt, und die Bedingungen jeder Lösung, die in die Löcher gefüllt worden war, wurden hinsichtlich der Fluoreszenz bei einer Vergrößerung von × 100 beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass jede Lösung gleichmäßig ohne Bildung eines Tropfens in die Löcher gegeben wurde. Außerdem wurde keine Fluoreszenz eines anderen Pigments in jedem Loch beobachtet, das heißt also, es wurde keine Kreuzkontamination beobachtet.
  • (Beispiel 8)
  • Herstellung der Probenanordnung unter Verwendung des Substrats von Beispiel 7 und Nachweis einer Zielnukleinsäure damit
    • (1) Ein Substrat mit einem BM wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 hergestellt.
    • (2) Als DNA-Sonden wurden drei Oligonukleotide hergestellt, das heißt ein 18-mer Oligonukleotid, dessen 5'-terminale Hydroxylgruppe mit einer Aminogruppe über eine Phosphatgruppe und einem Hexamethylen gebunden war (SEQ ID NR. 9), eine Sonde, die sich von dem Oligomer mit der SEQ ID NR. 9 in einem einzigen Nukleotid unterschied (SEQ ID NR. 10) und eine Sonde, die sich von dem Oligomer mit der SEQ ID NR. 9 in zwei Nukleotiden un terschied (SEQ ID NR. 11) (alle hatten HPLC-Güte, von Nippon Fluor Mills Co., Ltd.). Die Basensequenz des Oligomers mit der SEQ ID NR. 9 war komplementär zu derjenigen eines Bereichs einer multiplen Klonierungsstelle einer M13mp18-ssDNA, die die ssDNA ist. Die Basensequenz und die Bindungsstruktur der DNA-Sonden 9–11 sind unten gezeigt. SEQ ID NR. 9 5'NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACGACGGCCAGT3' SEQ ID NR. 10 5'NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTATAACCACGCCCAGT3' SEQ ID NR. 11 5'NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACCACGGCCAGT3'
    • (3) Einsträngige DNAs wurden synthetisiert, wobei jede davon vollständig komplementär mit jeder der DNA-Sonden mit den SEQ ID NRn. 9–11 war. Dann wurde jede DNA-Sonde und jede ssDNA separat in einer TE-Lösung (pH 8) gelöst, deren NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, und man erhielt eine Endkonzentration von 100 μMol; auf diese Weise wurden DNA-Sondenlösungen und komplementäre ssDNA-Lösungen hergestellt. 100 μl jeder DNA-Sondenlösung wurde in 100 μl der entsprechenden komplementären ssDNA-Lösung gegeben und damit vermischt, und jede Mischung wurde auf 90°C erhitzt und dann auf 25°C über 2 Stunden abgekühlt, damit die DNA-Sonde und die ssDNA hybridisieren. Jede der Lösungen, die ein Hybrid von jeder der DNA-Sonden mit den SEQ ID NRn. 9–11 enthielt, wurde in die wässrige Lösung, die 7,5 Gew-% Glyzerin, 7,5 Gew-% Harnstoff, 7,5 Gew-% Thiodiglykol und 1 Gew-% Acetylenglykol, das durch die allgemeine Formel (1) oben dargestellt ist, enthielt (Produktname: Acetylenol EH, von Kawaken Fine Chemical, Co., Ltd.) bis zu einer Enthybridkonzentration von 8 μMol gegeben. Die Oberflächenspannung jeder Lösung, die einen Hybrid von jeder DNA-Sonde enthält, liegt in einem Bereich von 30 –50 Dyn/cm, und die Viskosität liegt in einem Bereich von 1–5 cps (Viskosimeter vom E-Typ, von Tokyo Keiki, Co., Ltd.). Dann wurden drei Tintentanks für einen Bubble-jet-Drucker hergestellt und jeder Tintentank wurde mit jeder der obigen drei verschiedenen Hybridlösungen befällt und in den Kopf des in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet-Druckers eingebaut. Das Glassubstrat mit einer schwarzen Matrix (BM), die wie in (1) und (2) beschrieben hergestellt wurde, wurde ebenfalls in den Drucker eingebaut, und die Lösung, die den Hybrid der DNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 9 enthielt, wurde zunächst in die erste Reihe der Löcher (131 in 6) gegeben. Dann wurde die Lösung, die den Hybrid der DNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 10 enthielt, in die zweite Spalte der Löcher (133) in 6, die benachbart zu derjenigen der ersten Spalte waren, gegeben, und weiterhin wurde die Lösung, die den Hybrid der DNA-Sonde mit der SEQ ID NR. 11 enthielt, in die dritte Spalte der Löcher (135 in 6), die sich neben der zweiten Säule befanden, gegeben. Es wurden vier Ausstöße von jeder Hybridlösung in jedes Loch bis zu einer Endmenge der Lösung pro Loch von etwa 10 Picoliter gegeben. Diese Menge war etwa das 2-fache große Volumen eines jeden Lochs; allerdings hat die mikroskopische Beobachtung der Löcher ergeben, dass, obwohl die Hybridlösung oberhalb der Öffnung der Löcher aufgetragen war, sie aufgrund der hydrophoben Matrix in den Löchern blieb, so dass keine Kreuzkontamination zwischen den Löchern beobachtet wurde. Dann wurde das Substrat in einen Thermohygrostat platziert, dessen Temperatur und Feuchtigkeit 25° und 100 betrugen, damit die Aminogruppen der Sonden mit den Epoxidgruppen der Löcher reagieren können. Da die Aminogruppen in den Basen der Sonden mit den ssDNAs vollständig komplementär damit hybridisierten, konnten sie nicht mit den Epoxidgruppen der Löcher reagieren.
    • (4) Dann wurde das Substrat mit 80°C reinem Wasser für 10 Minuten gewaschen, um die komplementären Stränge von den Sonden, die mit dem Substrat verbunden waren, zu dissoziieren und damit wegzuwaschen. Danach wurde das Substrat mit einer wässrigen 1%igen Methanolaminlösung bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt, um die Ringe der nicht umgesetzten Epoxidgruppen von jedem Loch zu öffnen. Das Substrat wurde dann mit reinem Wasser gewaschen und getrocknet. Der Vorgang bei der obigen Beschreibung (4) ermöglicht es, dass sich die Ringe der Epoxidgruppen, die mit den DNA-Sonden in den Löchern nicht umgesetzt sind, öffnen, wobei sich Hydroxylgruppen bilden, und das umgesetzte Methanolamin weist ebenfalls eine Hydroxylgruppe auf; deswegen ist die Hydrophilizität der Bodenoberfläche der Löcher erhöht, was vorteilhaft ist, wenn eine Lö sung, die Ziel-ssDNAs enthält, in die Löcher gegeben wird.
    • (5) Es wurden einsträngige DNAs, die vollständig komplementär mit der DNA-Sonde von SEQ ID NR. 9 waren, in TE-Lösung (pH 8), deren NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, gelöst, und man erhielt eine Konzentration von 10 μMol, und dann wurde die Probenanordnung mit den nach der obigen Beschreibung (4) erhaltenen Löchern, in die Epoxidgruppen eingeführt worden waren, in die Lösung eingetaucht und die Temperatur der Mischung von 80°C auf 25°C über 2 Stunden herabgesetzt, damit die Hybridisierungsreaktion erfolgt. Danach wurde das Substrat bei 20°C für 20 Minuten mit TE-Pufferlösung (pH 8), deren NaCl-Konzentration 10 mMol betrug, gewaschen, und die Waschlösung, die auf der Oberfläche des Substrats verblieb, wurde mit einem Spintrockner entfernt.
    • (6) 2-Methyl-4,6-bis(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumiodid (nachfolgend als P2 bezeichnet), das nicht fluoresziert, bis es in einer doppelsträngigen Nukleinsäure eingebaut ist, wurde in einer TE-Lösung (pH 8,0), dessen NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, bis zu einer Endkonzentration von 10 μMol gelöst. Und diese Lösung wurde in den Tintentank des obigen Tintenstrahldruckers eingefüllt, und der Tank wurde in den Kopf des obigen Tintenstrahldruckers eingebaut. Das Substrat, das einer Hybridisierung nach der obigen Beschreibung (5) unterworfen worden war, wurde ebenfalls in den obigen Drucker eingesetzt, und jedes Lochs des Substrats wurde mit 100 Picoliter der P2-Lösung befällt. Danach ließ man das Substrat in einer Spezialkammer, deren Feuchtigkeit 100% betrug, für 5 Minuten zur Vermeidung des Eintrocknens stehen, während seine Fluoreszenz beobachtet und quantitativ mit einem Inversmikroskop (Produktname: IMT2, von Olympus Optical Co., Ltd., Vergrößerung: × 100, unter Verwendung eines Filterwürfels für ein Fluoreszenzmikroskop (ein Anregungsfilter für 455 nm bis 595 nm) Durchgang), eines Dichromspiegels für 620 nm, eines Sperrfilters für die Fluoreszenz von 610 nm bis 725 nm (Durchgang) mit einer ICCD-Kamera (Produktname: C2400-87 von Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) und eines Bildprozessors (Produktname: ARGUS 50, von Hamamatsu Photonics Co., Ltd.), der damit verbunden ist, bestimmt. Der Beobachtungsbereich wurde bei 25 μm × 25 μm und die Integration auf × 64 eingestellt, und der Amplifikationsgrad von ARGUS 50 wurde entsprechend eingestellt.
  • Im Ergebnis wurde eine Fluoreszenzintensität von 1.200 bis 1.500, was fast die gleiche als der Hintergrund war, aus den Löchern beobachtet, an die die DNA-Sonde der SEQ ID NR. 11 gebunden war, während eine Fluoreszenzintensität von 9.800 bis 10.300 aus den Löchern mit der DNA-Sonde der SEQ ID NR. 9 beobachtet wurde, und es wurde eine Fluoreszenzintensität von 3.500 bis 3.900 aus den Löchern mit der DNA-Sonde der SEQ ID NR. 10 beobachtet. Die Messung der Fluoreszenzintensität wurde wieder vorgenommen, nachdem jeder fester Träger bei 35°C für 10 Minuten mit einer TE-Pufferlösung gewaschen worden war und die Fluoreszenzintensität aus den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID NR. 10 enthielten, fiel auf den Hintergrundgrad herab.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Probenanordnung eine Hybridisierungsreaktion in jedem Loch zusätzlich zum spezifischen Nachweis der Zielnukleinsäure, die vollständig komplementär zur DNA-Sonde der SEQ ID NR. 9 ist, ermöglicht.
  • (Beispiel 9)
  • Selektive Zugabe von Reaktionsteilnehmern in jedes Loch der Probenanordnung von Beispiel 8 und die Reaktion derselben mit der Sonde.
    • (1) Ein Substrat, das die immobilisierten DNA-Sonden von SEQ ID NRn. 9–11 hielt, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 hergestellt.
    • (2) Drei Typen von ssDNAs wurden synthetisiert, und jede davon war vollständig komplementär zu einer der DNA-Sonden der SEQ ID NRn. 9–11. Jede ssDNA wurde in einer TE-Pufferlösung (pH 8), die 50 mMol NaCl enthielt, bis auf eine Endkonzentration von 100 μMol gelöst. Es wurden drei Tintentanks für einen Bubble-jet-Drucker (Produktname: BJC620 von Canon Inc.) hergestellt, und die drei Tanks wurden mit den obigen ssDNA-Lösungen befällt und in den in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet-Druckerkopf eingesetzt. Das nach der obigen Beschreibung in (1) hergestellte Substrat wurde ebenfalls auf den Printer gesetzt und in jedes Loch, wo eine der DNA-Sonden der SEQ ID Nrn. 9–11 immobilisiert war, wurden 100 pl/Loch der Lösung, die die entsprechende komplementäre ssDNA enthielt, gegeben. Aus der mikroskopischen Beobachtung der Löcher an diesem Punkt wurde weder ein Auslaufen der Lösung noch eine Kreuzkontamination beobachtet, was zeigt, dass viele Reaktionslösungen separat in die Löcher der Probenanordnung gegeben werden können.
    • (3) Nachdem die Hybridisierungsreaktion in jedem Loch in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt worden war, wurde eine P2-Lösung in jedes Loch in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 gegeben, um das gebildete Hybrid durch Fluoreszenzbeobachtung nachzuweisen. Im Ergebnis wurde in jedem Loch eine Fluoreszenzintensität von 9.800–10.300 beobachtet. Es wurde aus dem Ergebnis bestätigt, dass ein Reaktionsteilnehmer separat in jedes Loch der Probenanordnung gegeben werden kann, dass der Reaktionsteilnehmer mit der Sonde in jedem Loch reagieren kann und dass das erhaltene Produkt der Reaktion nachgewiesen werden kann.
  • (Beispiel 10)
  • Behandlung zur Herstellung einer Hydrophilizität an der Bodenoberfläche der Substratlöcher von Beispiel 7
    • (1) Es wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 ein Glassubstrat mit einem schwarzen Matrixmuster hergestellt.
    • (2) Die Oberfläche des Substrats, auf dem eine schwarze Matrix gebildet worden war, wurde einer UV-Ozonisierung unterworfen. An diesem Punkt betrug der Kontaktwinkel der Oberfläche der schwarzen Matrix gegenüber Wasser 93°, was bedeutet, dass die Oberfläche der schwarzen Matrix wasserabweisend war, und der Kontaktwinkel der Bodenoberfläche der Löcher gegenüber Wasser betrug 22°, was bedeutet, dass die Bodenoberfläche der Löcher hydrophil im Vergleich mit der unbehandelten Bodenoberfläche der Löcher des in Beispiel 7 hergestellten Substrats war. Das könnte auf die Wirkung der oben beschriebenen UV-Ozonisierung zurückzuführen sein.
    • (3) Dann wurden wässrige Rhodamin-B- und Amino-FITC-Lösungen, wie in Beispiel 7, in die Löcher von einem Tintenstrahldrucker gegeben, und die Bedingungen in den Löchern beobachtet. Die Beobachtung zeigte, dass sich jede wässrige Lösung gleichmäßig verteilte, ohne innerhalb der Löcher einen Tropfen zu bilden. Wenn ein fester Träger mit Löchern auf seiner Oberfläche als fester Träger einer Probenanordnung verwendet wird, ist es nicht notwendig, die Lösung aus einem Tintenstrahldrucker bei einer sehr definierten Position auf der Oberfläche des Trägers ausgestoßen zu halten, und eine vollständige Verteilung der ausgestoßenen Lösung über die Bodenoberfläche des Lochs ist für den nachfolgenden Nachweis der Reaktion zwischen einer Sonde und einer Zielsubstanz bevorzugt. Die Behandlung zur Hydrophilisierung der Bodenoberfläche des Lochs, die in diesem Beispiel beschrieben wurde, ist eine bevorzugte Ausfüh rungsform der vorliegenden Erfindung. Des weiteren wurde nur erwarteter Weise Pigment in jedem Loch gefunden, was zeigt, dass, mit diesem Tintenstrahlprozess, jede wässrige Pigmentlösung in jedes Loch gegeben werden kann, ohne dass irgendeine Kreuzkontamination verursacht wird.
  • (Beispiel 11)
  • Verfahren zur Herstellung einer Probenanordnung unter Verwendung eines festen Trägers, der funktionelle Gruppen enthält, für die Sondenimmobilisierung durch Eingabe einer Lösung mit der Tintenstrahlmethode in jedes Loch in der schwarzen Matrix und seine Anwendung.
    • (1) Es wurde ein Substrat mit einer schwarzen Matrix in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 hergestellt.
    • (2) Ein Silankupplungsmittel (Produktname: KBM603, von Shin-Etsu-Chemical Co., Ltd.), das eine Silanverbindung enthielt, an die eine Aminogruppe gebunden ist, (N-(3-Aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilan) gebunden ist, wurde in einer wässrigen 10 Gew.-%igen Methanollösung bis auf eine Konzentration von 1 Gew.-% gelöst und bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, um die Methoxygruppen der obigen Silanverbindung zu hydrolysieren. Dann wurde diese Lösung in einen Tintentank für einen Bubble-jet-Drucker (Produktname: BJC620, von Canon Inc.) gefüllt und der Tank wurde in den Kopf des in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet-Druckers eingesetzt. Das in der obigen Beschreibung (1) hergestellte Substrat wurde ebenfalls auf den Drucker gesetzt, und die Lösung des Silankupplungsmittels, das eine Silanverbindung enthielt, deren Methoxygruppen bereits hydrolysiert waren, wurde in jedes Loch des Substrats in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 gegeben. Nach dem Stehenlassen in einem Thermohygrostat, dessen Temperatur und Feuchtigkeit 25°C und 100% waren, für 30 Minuten, wurde das Substrat mit destilliertem Wasser gewaschen, spingetrocknet und bei 100°C für 30 Minuten gebacken, um Aminogruppen auf der Oberfläche der Löcher einzuführen.
    • (3) Dann wurde Succiimidyl-4-(maleimidophenyl)butylat (von Aldrich Co., Ltd.) in einer 5 gew.-%igen DMSO-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 5 Gew-% gelöst, und es wurden 100 Picoliter dieser Lösung in jedes Loch mit einem Tintenstrahldrucker in der gleichen Weise wie in der obigen Beschreibung (2) gegeben, danach ließ man das Substrat in einem Thermohygrostat, dessen Temperatur und Feuchtigkeit 30°C und 100% betrugen, für 2 Stunden stehen. Das Substrat wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und spingetrocknet. Somit wurden Maleimidogruppen auf der Bodenoberfläche der Löcher eingeführt.
    • (4) Als DNA-Sonden wurden drei Oligonukleotide hergestellt, das heißt, ein 18-mer Ologonukleotid, dessen 5'-terminale Hydroxylgruppe mit einer Thiolgruppe über eine Phosphorgruppe und Hexamethylen (SEQ ID NR. 12) verbunden war, eine Sonde, die sich von dem Oligomer der SEQ ID NR. 12 in einem einzigen Nukleotid (SEQ ID NR. 13) unterschied und eine Sonde, die sich von dem Oligomer der SEQ ID NR. 12 in zwei Nukleotiden (SED NR. 14) unterschied (alle von HPLC-Güte, von Nippon Flower Mills Co., Ltd.). Die Basensequenz und die Linkerstruktur der DNA-Sonden der SEQ ID NR. 12–14 sind unten gezeigt. SEQ ID NR. 12 5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACGACGGCCAGT3' SEQ ID Nr. 13 5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACCACGGCCAGT3' SEQ ID NR. 14 5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTATAACCACGCCCAGT3'
    • (5) Jede der obigen DNA-Sonden der SEQ ID NR. 12–14 wurde in einer 10 mMol Phosphatpufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 100 μMol gelöst, und jede DNA-Sondenlösung wurde in die Löcher des in der obigen Beschreibung (3) hergestellten Substrats in der gleichen Weise wie in dem oben beschriebenen Beispiel 8 gegeben. Die mikroskopische Beobachtung eines jeden Lochs zeigte, dass die hinzugefügte DNA-Sondenlösung oberhalb der Oberfläche der Öffnung des Lochs stand, jedoch in den Löchern aufgrund der hydrophoben Matrix verblieb, und es wurde keine Kreuzkontamination zwischen den Löchern beobachtet. Nachdem man das Substrat in einem Thermohygrostat für 2 Stunden stehen gelassen hatte, dessen Temperatur und Feuchtigkeit 30°C und 100% betrugen, wurde es mit destilliertem Wasser gewaschen, spingetrocknet, um die Thiolgruppen jeder DNA-Sonde mit den Maleimidogruppen in jedem Loch zur Bindung der DNA-Sonden an das Substrat reagieren zu lassen.
    • (6) Es wurden einzelsträngige DNAs synthetisiert, die vollständig komplementär zur DNA-Sonde von SEQ ID NR. 12 waren. Dann wurden die ssDNAs separat in einer TE-Lösung, deren NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, bis zu einer Endkonzentration von 10 μMol gelöst. Das mit der DNA-Sonde verbundene Substrat, das in der obigen Beschreibung in (5) hergestellt wurde, wurde in diese Lösung getaucht, und ihre Temperatur wurde von 80°C auf 25°C über zwei Stunden erniedrigt, um die Hybridisierung zu verursachen. Dann wurde das Substrat bei 20°C für 20 Minuten mit einer TE-Lösung (pH 8), deren NaCl-Gehalt 10 mMol betrug, gewaschen, und die auf der Oberfläche des Substrats verbliebene Waschlösung wurde mit einem Spintrockner entfernt.
    • (7) Das Reagenz YOYO-1, das fluoresziert, wenn es in einem Hybrid eingebaut ist, wurde in einer TE-Lösung, deren NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, bis zu einer Endkonzentration von 10 μMol (pH 8) gelöst. 100 μl dieser Lösung wurde in jedes Loch gegeben, das einer Behandlung nach der obigen Beschreibung (6) in unterworfen worden war, in der gleichen Weise wie nach der obigen Beschreibung in (2) mit einem Tintenstrahldrucker gegeben, und die Fluoreszenz wurde beobachtet und quantitativ in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 (unter Verwendung eines B-Anregungsfilters) bestimmt. Hier war der Signalamplifikationsgrad von ARGUS 50 der gleiche wie in Beispiel 8.
  • Im Ergebnis wurde eine Fluoreszenzintensität von 1.800 bis 2.000, was fast die gleiche wie vom Hintergrund war, in den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID NR. 14 enthielten, beobachtet, während eine Fluoreszenzintensität von 7.500 bis 8.000 in den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID NR. 12 enthielt, beobachtet wurde, und es wurde eine Fluoreszenzintensität von 3.100 bis 3.300 wurde in den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID NR. 13 enthielten, beobachtet. Nachdem der feste Träger bei 35°C für 10 Minuten mit einer TE-Pufferlösung gewaschen worden war, wurde wieder eine Messung der Fluoreszenzintensität in jedem Loch durchgeführt, und die Fluoreszenzintensität aus den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID NR. 13 enthielten, fiel auf den Hintergrundwert ab.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung einer erfindungsgemäßen Probenanordnung eine Hybridisierungsreaktion in jedem Loch zusätzlich zum spezifischen Nachweis der Zielnukleinsäure, die vollständig komplementär zur DNA-Sonde der SEQ ID NR. 9 ist, ermöglicht.
  • (Beispiel 12)
    • (1) Es wurde ein Substrat hergestellt, an das die DNA-Sonden der SEQ ID NRn. 12 bis 14 in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 gebunden waren.
    • (2) Es wurden drei ssDNAs komplementär zu den DNA-Sonden der SEQ ID NRn. 12–14 synthetisiert. Dann wurde jede DNA-Sonde in einer TE-Pufferlösung, deren NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, bis zu einer Endkonzentration von 10 μMol gelöst. Hier betrug der pH-Wert je der ssDNA-Lösung 8. Drei Tintentanks für einen Bubblejet-Drucker (Produktname: BJC620, von Canon Inc.) wurden hergestellt, und die drei Tintentanks wurden mit den obigen drei ssDNA Lösungen befällt und in den Kopf des in Beispiel 1 verwendeten Bubble-jet-Druckers eingesetzt. Das in der obigen Beschreibung (1) hergestellte Substrat wurde ebenfalls in den Drucker eingesetzt, und in jedes Loch, indem eine der ssDNA-Sonden der SED ID Nrn. 12–14 fixiert war, wurden 100 pl/Loch einer Lösung, die die entsprechende komplementäre ssDNA enthielt, gegeben. Aus der mikroskopischen Beobachtung der Bedingungen in den Löchern an diesem Punkt wurde weder ein Auslaufen der Lösung noch eine Kreuzkontamination beobachtet, was zeigt, dass es möglich ist, die Lösung der Substanzen, die umgesetzt werden soll, separat in jedes Loch der Probenanordnung zu geben.
    • (3) Nachdem die Hybridisierungsreaktion in jedem Loch in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 durchgeführt worden war, wurde eine YOYO-1-Lösung in jedes Loch in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 gegeben, um eine Hybridbildung über die Fluoreszenzbeobachtung nachzuweisen. Im Ergebnis wurde in jedem Loch eine Fluoreszenzintensität von 7.500–8.000 beobachtet. Es wurde aus diesem Ergebnis bestätigt, dass ein Reaktionsteilnehmer separat in jedes Loch der Probenanordnung des festen Trägers gegeben werden kann und mit der Sonde in jedem Loch reagieren kann und dass das erhaltene Produkt der Reaktion nachgewiesen werden kann.
  • (Beispiel 13)
  • Verfahren zur Herstellung einer Probenanordnung unter Verwendung eines Substrats mit Löchern mit Epoxidgruppen, die durch Eintauchen des Substrats nach der BM-Bildung in einer Lösung für die Einführung der Epoxidgruppe eingeführt worden sind.
    • (1) Ein Substrat mit einer schwarzen Matrix wurde nach der Beschreibung (2) von Beispiel 7 hergestellt.
    • (2) In der gleichen Weise wie in (1) von Beispiel 7 wurde eine wässrige 1 gew-%ige Lösung eines Silankupplungsmittels (Produktname: KBM403, von Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), die eine Silanverbindung mit einer Epoxidgruppe enthält (γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilan), bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, um die Methoxygruppen der Silanmolekülverbindung zu hydrolysieren. Dann wurde der in der obigen Beschreibung (1) hergestellte feste Träger in diese Lösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten eingetaucht, und mit destilliertem Wasser gewaschen, und nachdem das verbliebene Wasser mit einem Stickstoffgasfluss entfernt worden war, wurde er bei 120°C für 5 Minuten gebacken, um die Epoxidgruppen an der Bodenoberfläche der Löcher einzuführen. An diesem Punkt war die Oberfläche der schwarzen Matrix wasserabweisend, weil ihr Wasserkontaktwinkel 95° betrug, und der Boden der Löcher war hydrophil, weil sein Wasserkontaktwinkel 33° betrug. Somit war die Einführung der Epoxidgruppen an der Bodenoberfläche der Löcher durch Behandeln des BM-behandelnden festen Trägers mit einem Silankupplungsmittel möglich.
    • (3) Nach den in (3) und (4) von Beispiel beschriebenen Prozeduren wurden die DNA-Sonden der SEQ ID NRn. 9–10 an die Bodenoberfläche der Löcher gebunden.
    • (4) Es wurde eine einsträngige DNA komplementär zur DNA-Sonde von SEQ ID NR. 9 auf einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert, und es wurde Tetramethylrhodamin über einen Hexanolaminlinker an ihrem 5'-Terminus gebunden, um eine markierte ssDNA zu erhalten. Dann wurde die markierte ssDNA in einer TE-Pufferlösung (pH 8), deren NaCl-Konzentration 50 mMol betrug, bis zu einer Endkonzentration von 2 μMol gelöst. Anschließend wurde das nach der obigen Prozedur (3) hergestellte Substrat mit der gebundenen DNA-Sonde in diese Lösung getaucht, und die Temperatur der Lösung wurde von 80°C auf 25°C über 2 Stunden erniedrigt, um eine Hybridisierungsreaktion zu verursachen. Danach wurde die Probenanordnung bei 29°C für 20 Minuten unter Verwendung einer 10 mMol NaCl/TE-Pufferlösung (pH 8) gewaschen, um freie markierte ssDNA wegzuwaschen. Dann wurde die Fluoreszenzintensität in jedem Loch quantitativ in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 bestimmt.
  • (5) Ergebnisse
  • Es wurde eine Fluoreszenzintensität von 8.500–9.400 in den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID Nr. 9 enthielten, beobachtet, was eine perfekte Übereinstimmung der markierten ssDNAs zeigte. Und die Fluoreszenzinten sität von 2.800–3.400 wurde in den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID Nr. 10 enthielt, beobachtet, während eine Fluoreszenzintensität so niedrig wie 1.200 – 1.500 in den Löchern, die mit den DNA-Sonden der SEQ ID NR. 11 gebunden waren, beobachtet wurde. Nachdem die obige Sondenanordnung bei 35°C für 10 Minuten unter Verwendung einer 10 mMol NaCl/TE-Pufferlösung (pH 8) gewaschen worden war, erniedrigt sich die Fluoreszenzintensität, die an den Löchern, die die DNA-Sonde der SEQ ID Nr. 10 enthielten, beobachtet wurde, auf den Hintergrundwert. Somit ist offensichtlich, dass die Verwendung einer erfindungsgemäßen Probenanordnung den spezifischen Nachweis von Zielhybridsubstanzen möglicht macht.
  • Erfindungsgemäß kann, wie oben beschrieben, eine eine Sonde enthaltende Lösung auf einen festen Träger als Spot ausgebildet werden, ohne dass die Sonde beschädigt wird oder ohne dass Satelittenspots durch die Tintenstrahlmethode verursacht werden. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht eine effiziente Herstellung einer Sondenanordnung hoher Qualität, wobei die Sondenspots unabhängig voneinander in hoher Dichte angeordnet sind.
  • Erfindungsgemäß kann ebenfalls eine Probenanordnung mit mehr Information über eine Zielsubstanz in großer Genauigkeit auch aus einer kleinen Probenmenge erhalten werden. Außerdem kann die Anwesenheit/Abwesenheit einer Zielsubstanz in einer Probe genauer und schneller unter Verwendung der Probenanordnung bestimmt werden. In ähnlicher Weise kann die Struktur einer Zielsubstanz in einer Probe genauer und schneller unter Verwendung der Probenanordnung identifiziert werden.
  • Erfindungsgemäß kann eine etwas verschobene Positionierung während der Zuführung mindestens einer Sondenlösung und einer Probenlösung auf einen festen Träger ebenfalls unter Verwendung eines festen Trägers mit Löchern auf der Oberfläche des festen Trägers ermöglicht werden. Ein weiterer Anstieg der Genauigkeit beim Nachweis einer Zielsubstanz und der Identifizierung ihrer Struktur kann durch Herstellen einer Matrix mit verschiedenen Funktionen erreicht werden.
  • [SEQUENZPROTOKOLL]
    Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001

Claims (58)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Sondenanordnung mit einer Vielzahl von Spots, die voneinander unabhängig auf vielen Stellen auf einer Oberfläche eines festen Trägers angeordnet sind, wobei die Spots eine Sonde enthalten, die spezifisch an eine Zielsubstanz binden kann, mit der Stufe, dass eine Flüssigkeit, die die Sonde enthält, zugeführt wird und die Flüssigkeit an eine vorbestimmte Stelle auf der Oberfläche des festen Trägers nach einer Tintenstrahlmethode zur Bildung der Spots angebracht wird wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Tintenstrahlmethode ein Bubble-Jet-Verfahren ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sonde eine einsträngige Nukleinsäuresonde ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die einsträngige Nukleinsäuresonde eine einsträngige DNA-Sonde ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, worin die einsträngige Nukleinsäuresonde eine RNA-Sonde ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, worin die einsträngige Nukleinsäuresonde eine einsträngige PNA-Sonde ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Oberfläche der festen Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe aufweist und die einsträngige Nukleinsäuresonde eine zweite funktionelle Gruppe aufweist und die erste und die zweite funktionelle Gruppe miteinander über einen Kontakt reagieren.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die erste funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des festen Trägers eine Maleimidogruppe ist und die zweite funktionelle Gruppe der einsträngigen Nukleinsäuresonde eine Thiol(SH)-gruppe ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der feste Träger eine Glasplatte ist und eine Maleimidogruppe eingeführt wird, indem eine Aminogruppe auf die Oberfläche der Glasplatte gegeben wird und dann die Aminogruppe mit N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimid umgesetzt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, worin der feste Träger eine Glasplatte ist und die Maleimidogruppe eingeführt wird, indem eine Aminogruppe auf die Oberfläche der Glasplatte gegeben wird und dann die Aminogruppe mit Succinimidyl-4-(maleimidophenyl)butyrat umgesetzt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Maleimidogruppe mit der Thiolgruppe für mindestens 30 Minuten umgesetzt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die einsträngige Nukleinsäure eine einsträngige PNA-Sonde ist, an deren Terminus die Thiolgruppe vorhanden ist und die Maleimidogruppe mit der Thiolgruppe für mindestens 2 Stunden umgesetzt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Thiolgruppe am Terminus der einsträngigen PNA-Sonde eingeführt wird, indem eine Cysteingruppe an einem N-Terminus der einsträngigen PNA-Sonde gebunden wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 6, worin die erste funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des festen Trägers eine Epoxidgruppe ist und die zweite funktionelle Gruppe der einsträngigen Nukleinsäuresonde eine Aminogruppe aufweist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der feste Träger eine Glasplatte ist, und die Epoxidgruppe eingeführt wird, indem eine Silanverbindung mit einer Epoxidgruppe in ihrem Molekül auf die Oberfläche der Glasplatte aufgetragen wird und die Verbindung mit der Glasplatte umgesetzt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Epoxidgruppe eingeführt wird, indem Polyglycidylmethacrylat mit einer Epoxidgruppe auf den festen Träger aufgetragen wird.
  16. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Flüssigkeit Harnstoff zu 5–10 Gew-%, Glyzerin zu 5 –10 Gew-%, Thiodiglykol zu 5–10 Gew-% und einen Acetylenalkohol zu 1 Gew-% der Flüssigkeit enthält.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, worin der Acetylenalkohol eine Struktur aufweist, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt ist:
    Figure 00860001
    (worin R1, R2, R3 und R4 eine Alkylgruppe bedeuten, m und n jeweils eine ganze Zahl bedeuten und m = 0 und n = 0 oder 1 ≤ m + n ≤ 30, und wenn m + n = 1, ist m oder n 0).
  18. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Konzentration der einsträngigen Nukleinsäuresonde in der Flüssigkeit 0,05– 500 μMol beträgt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Konzentration der einsträngigen Nukleinsäuresonde in der Flüssigkeit 2–50 μMol aufweist.
  20. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Länge der einsträngigen Nukleinsäuresonde 2–5.000 Basen beträgt.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Länge der einsträngigen Nukleinsäuresonde 2–60 Basen beträgt.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Flüssigkeit so zugeführt wird, dass sich unabhängige Spots in einer Dichte von 1.550 Spots pro Quadratzentimeter (10.000 Spots pro Quadratinch) auf dem festen Träger oder höher bilden.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sonde ein Oligopeptid oder ein Polypeptid mit einer spezifischen Aminosäuresequenz ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sonde ein Protein ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Protein ein Antikörper ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Protein ein Enzym ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sonde ein Antigen ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 1, worin der feste Träger eine ebene Oberfläche und homogene Oberflächeneigenschaften aufweist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, worin vor dem Aufgeben der Sonde auf den festen Träger ein Blockieren durchgeführt wird, um zu verhindern, dass sich eine Probe an eine Oberfläche haftet, die nicht den Spots entspricht.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, worin für das Blockieren der feste Träger, auf dem sich die Spots gebildet haben, in eine wässrige Lösung aus Rinderserumalbumin getaucht wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, worin die Konzentration der wässrigen Lösung aus Rinderserumalbumin 0,1–5% beträgt.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, worin der feste Träger in eine wässrige Lösung aus Rinderserumalbumin für mindestens 2 Stunden getaucht wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Flüssigkeit auf die Oberfläche des festen Trägers gegeben wird, so dass sich ein Abstand zwischen den benachbarten Spots bildet, der nicht kleiner als die maximale Breite des Spots ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 1, worin der feste Träger durch eine Matrix, die in einem Muster auf der Oberfläche angeordnet ist, aufgeteilt ist, eine Vielzahl von Löchern, deren Boden die Oberfläche des festen Trägers als Muster belichtet, vorgesehen ist, und die Flüssigkeit in die jeweiligen Löcher gegeben wird.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, worin der feste Träger optisch transparent und die Matrix trüb ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Matrix ein Harz umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Oberfläche der Matrix hydrophob ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 34, worin der Boden der Löcher hydrophil ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Löcher eine maximale Breite von 200 μm aufweisen.
  40. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Matrix eine Breite vom ½–2-fachen der maximalen Breite der Löcher aufweist.
  41. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Dicke der Matrix 1– 20 μm beträgt.
  42. Verfahren nach Anspruch 34, worin das Matrixmuster durch Photolithographie gebildet wird.
  43. Verfahren nach Anspruch 32, worin die Photolithographie die Stufen aufweist: Ausbilden einer Harzschicht auf der Oberfläche des festen Trägers, Ausbilden einer Photoresistschicht auf der Harzschicht, Belichten der Photoresistschicht mit Licht in einem Muster, das dem Matrixmuster entspricht und Entwickeln, um das Muster des Photoresists auf der Harzschicht auszubilden, und eine Stufe, bei der die Harzschicht unter Verwendung des Photoresists als Maske gemustert wird und dann das Muster des Photoresists entfernt wird.
  44. Verfahren nach Anspruch 42, worin die Photolithographie die Stufen aufweist: Ausbilden einer lichtempfindlichen Harzschicht auf der Oberfläche des festen Trägers, Belichten der lichtempfindlichen Harzschicht mit Licht in einem Muster, das dem Matrixmuster entspricht, und Entwickeln.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, worin die lichtempfindliche Harzschicht aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem UV-Resist, einem DEEP-UV-Resist oder einem Ultraviolett gehärteten Harz besteht.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, worin der UV-Resist aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem zyklisierten Polyisopren/aromatisches Bisazid-Resist, einer Phenolharz/aromatische Azidverbindung-Resist oder einem Novolakharz/Diazonaphtochinon-Resist besteht.
  47. Verfahren nach Anspruch 45, worin das DEEP-UV-Harz ein strahlenlysierbarer Polymerisist oder ein Lösungsunterdrückungsresist ist.
  48. Verfahren nach Anspruch 47, worin der Strahlenzersetzungspolymerresist mindestens ein solcher ist, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus Polymethylmethacrylat, Polymethylensulfon, Polyhe×afluorbutylmethacrylat, Polymethylisopropenylketon und Poly-1-trimethylsilylpropynbromid gewählt ist.
  49. Verfahren nach Anspruch 47, worin der Lösungsunterdrückungsresist o-Nitrobenzylcholatester ist.
  50. Verfahren nach Anspruch 45, worin der DEEP-UV-Resist Polyvinylphenol-3,3'-diaziddiphenylsulfon oder Polyglycidylpolymethacrylat ist.
  51. Verfahren nach Anspruch 44, worin das Wasserabweisungsvermögen des Matrixmusters, das durch Mustern der lichtemp findlichen Schicht gebildet ist, weiterhin durch Nachbacken des Matrixmusters verbessert wird.
  52. Verfahren nach Anspruch 34, worin eine erste funktionelle Gruppe, die eine kovalente Bindung mit einer zweiten funktionellen Gruppe der Sonde bilden kann, auf der Oberfläche des festen Trägers vor Bildung der Löcher eingeführt wird.
  53. Verfahren nach Anspruch 34, worin eine erste funktionelle Gruppe, die eine kovalente Bindung mit einer zweiten funktionellen Gruppe der Sonde bilden kann, auf der Oberfläche des festen Trägers nach der Bildung der Löcher eingeführt wird.
  54. Verfahren nach Anspruch 53, worin eine Lösung, die eine Verbindung zur Einführung der ersten funktionellen Gruppe auf die Oberfläche des festen Trägers enthält, in die Löcher gegeben wird.
  55. Verfahren nach Anspruch 54, worin die Lösung in die Löcher mit der Tintenstrahlmethode gegeben wird.
  56. Verfahren nach Anspruch 55, worin die Lösung ein Silankupplungsmittel, das eine Silanverbindung mit einer Epoxidgruppe oder eine Aminogruppe in ihrem Molekül enthält, ist.
  57. Verfahren nach Anspruch 55, worin die Lösung eine Verbindung, die mit einer Aminogruppe auf einem Glassubstrat reagieren kann, um eine Maleimidogruppe auf dem Glassubstrat einzuführen, enthält.
  58. Verfahren nach Anspruch 57, worin die Verbindung N-Maleimidocaproyloxysuccinimid oder Succinimidyl-4-(maleimidophenyl)butyrat ist.
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