DE60024181T2

DE60024181T2 - Makromolekulare Anordnungen über Polymerverzweigungen und Verfahren zu ihren Herstellung

Info

Publication number: DE60024181T2
Application number: DE60024181T
Authority: DE
Inventors: Mountain View Mcgall Glen
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2020-09-02
Also published as: US20060134672A1; CA2317179A1; JP2001131208A; JP2004323859A; EP1081163B1; EP1081163A1; ATE310751T1; DE60024181D1; US6994964B1; JP3618285B2

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der U.S. Provisional Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 60/151,862, die am 1. September 1999 eingereicht wurde.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Arrays. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Anhaftung von funktionellen Stellen an die Oberfläche eines solchen Substrats. Die Erfindung streift mehrere wissenschaftliche Disziplinen wie z.B. die Polymerchemie, Biochemie, Molekularbiologie, Medizin und medizinische Diagnostik.
STAND DER TECHNIK
Die Synthese von hochdichten makromolekularen Arrays ist bekannt. Solche hochdichten makromolekularen Arrays beinhalten Nukleinsäurearrays, Peptidarrays, Kohlenhydratarrays. Siehe beispielsweise die U.S.-Patente Nr. 5,143,854, 5,384,261, 5,405,783 und 5,424,186.
Ein Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Arrays beinhaltet photolithographische Techniken unter Verwendung von durch Licht abspaltbaren Schutzgruppen. Kurz gesagt beinhaltet das Verfahren das Anbinden von durch Licht entfernbaren Gruppen an die Oberfläche eines Substrats, das Exponieren ausgewählter Bereiche des Substrats an Licht, um jene Bereiche zu aktivieren, das Anbinden eines Monomers mit einer durch Licht entfernbaren Gruppe an die aktivierten Bereiche und das Wiederholen der Schritte der Aktivierung und Anbindung, bis Makromoleküle mit der gewünschten Länge und Sequenz synthetisiert sind. Siehe die U.S.-Patente Nr. 5,324,663, 5,384,261, 5,405,783 und 5,412,087.
Zusätzliche Verfahren und Techniken, die auf die Synthese von Arrays anwendbar sind, wurden in den U.S.-Patenten Nr. 5,424,186, 5,445,934, 5,451,683, 5,482,867, 5,489,678, 5,491,074, 5,510,270, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,677,195, 5,744,101, 5,744,305, 5,753,788, 5,770,456, 5,831,070 und 5,856,011 beschrieben.
Herkömmliche Substrate, die bei der Synthese von Arrays verwendet werden, bestehen aus flachen zweidimensionalen Oberflächen oder dreidimensionalen Oberflächen wie z.B. einer porösen Matrix oder einem quervernetzten Polymergel. Während diese Substrate im Allgemeinen zufrieden stellend waren, sank, wenn die Dichte des Arrays zunahm, unter den Assaybedingungen aufgrund des Zusammendrängens das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, was oft zu einer verschlechterten Leistungsfähigkeit führte. Die Fragen des Zusammendrängens und der Leistungsfähigkeit werden wichtiger, je mehr Anwendungen für hochdichte makromolekulare Arrays entwickelt werden. Somit besteht ein Bedarf für hochdichte makromolekulare Arrays mit guter oder verbesserter Leistungsfähigkeit unter den Assaybedingungen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines makromolekularen Arrays bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen eines Substrats, an das ein oder mehr Initiatoren freier Radikale kovalent angebunden sind, wobei jeder Initiator freier Radikale eine Radikal-Erzeugungsstelle distal zu dem Substrat aufweist;
(b) Kontaktieren des kovalent angebundenen Substrats mit Monomeren unter Bedingungen, die eine lebende freie Radikal-Polymerisation von den Radikal-Erzeugungsstellen der Initiatoren zur Bildung einer polymeren Bürste unterstützen; und
(c) kovalente Anbindung einer Vielzahl von Makromolekülen an die polymere Bürste.

Die Polymerisation wird in dem obigen Verfahren erreicht, indem eine lebende freie Radikal-Polymerisation verwendet wird. Das Substrat in dem obigen Verfahren umfasst unter bestimmten Gesichtspunkten Glas oder Siliciumdioxid. In einer Ausführungsform umfassen die Monomere eine Vinylgruppe. In einer Ausführungsform können die Monomere beispielsweise mindestens zwei unterschiedliche Monomere beinhalten. Ein beispielhaftes Monomer ist Vinylacetat.
In einer Ausführungsform können die Monomere die folgende Struktur aufweisen:
wobei R₁ Wasserstoff oder Niederalkyl ist; und
R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder -Y-Z sind, wobei Y Niederalkyl ist und Z Hydroxyl, Amino oder C(O)-R ist, wobei R Wasserstoff, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
In einer anderen Ausführungsform sind R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Hydroxyalkyl, Polyalkylenoxid oder -Y-Z, wobei Y ein lineares oder verzweigtes Niederalkyl, Aryl, Alkylaryl oder Polyalkylenoxid ist und Z Wasserstoff, Hydroxyl, Alkoxy, Carboxy, Amino, Hydrazino, Sulfhydryl oder C(O)-R ist,
wobei R Wasserstoff, Hydroxy, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
Das Polymer, das auf dem Träger gebildet wird, kann beispielsweise Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen oder irgendeine Kombination von diesen aufweisen.
Ein polymeres Bürstensubstrat, das in der Lage ist, die Synthese eines makromolekularen Arrays zu unterstützen, welches kovalent verknüpfte Monomere mit beispielsweise Hydroxyl-, Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen oder irgendeiner Kombination von diesen umfasst, kann gebildet werden.
Es werden ebenfalls Verfahren bereitgestellt, um die polymeren Bürstensubstrate des obigen Verfahrens zu verwenden. Assays von makromolekularen Arrays, die an den polymeren Bürstensubstraten hergestellt wurden, können durchgeführt werden. Derartige Assays beinhalten Hybridisierungsassays von Polynukleotiden und Ligandenbindungsassays von Peptiden.
Polymere Bürstensubstrate und polymere Bürstensubstrate, die makromolekulare Arrays umfassen, können unter Verwendung der Verfahren der Erfindung hergestellt werden.
Es wird ein Verfahren zur Anhaftung von funktionellen Stellen an eine Oberfläche eines festen Substrats bereitgestellt, umfassend:

(a) Bereitstellen eines Substrats, an das ein oder mehr Initiatoren freier Radikale kovalent angebunden (ist) sind, wobei jeder Initiator eines freien Radikals eine Radikal-Erzeugungsstelle distal zu dem Substrat aufweist;
(b) Kontaktieren des Substrats mit einer Mischung aus Bindungs-Monomeren und Verdünnungs-Monomeren unter Bedingungen, die die lebende freie Radikal-Polymerisation von den Radikal-Erzeugungsstellen der Initiatoren unterstützen, wobei die Dichte der funktionellen Stellen durch das Verhältnis der funktionellen Monomer zu den Verdünnungs-Monomeren bestimmt wird; und
(c) kovalente Anbindung einer Vielzahl von Makromolekülen an die polymere Bürste.

Unter einem Gesichtspunkt ist der Initiator ein Initiator vom Azo-Typ. Die funktionelle Stelle ist beispielsweise Amino, Hydroxyl oder Carboxyl. Das Verhältnis von Bindungs-Monomeren zu Verdünnungs-Monomeren beträgt beispielsweise von 1:2 bis 1:200 oder beträgt unter gewissen Gesichtspunkten von 1:2 bis 1:2000 oder mehr.
Die Monomere des Verfahrens weisen beispielsweise unabhängig voneinander die folgende Struktur auf:
wobei R₁ Wasserstoff oder Niederalkyl ist; und
R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder -Y-Z sind, wobei Y Niederalkyl ist und Z Hydroxyl, Amino oder C(O)-Rist, wobei R Wasserstoff, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
In einer anderen Ausführungsform sind R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Hydroxyalkyl, Polyalkylenoxid oder -Y-Z, wobei Y ein lineares oder verzweigtes Niederalkyl, Aryl, Alkylaryl oder Polyalkylenoxid ist und Z Wasserstoff, Hydroxyl, Alkoxy, Carboxy, Amino, Hydrazino, Sulfydryl oder C(O)-Rist, wobei R Wasserstoff, Hydroxy, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
Unter einem Gesichtspunkt enthält das Monomer keine freie Hydroxylgruppe und ist ein Verdünnungs-Monomer. Unter einigen Gesichtspunkten fungiert das Verdünnungs-Monomer als ein Polymerisationsterminator.
Das Substrat kann unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren hergestellt werden, wobei die Dichte der Polymerbürsten 0,1 bis 1000 pmol der einzelnen Polymerketten pro cm² des Substratoberflächenbereichs beträgt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A, 1B und 1C zeigen das Schema der Bildung einer Polymerbürste durch freie Radikal-Verfahren. 1A stellt ein durch Wärme erzeugtes Oberflächenradikal (I) dar, das die Polymerisation von Vinylmonomeren (M) initiiert, was in einer angebundenen Polymerkette auf der Oberfläche resultiert. 1B zeigt die freie Radikal-Polymerisation auf einer Oberfläche, wobei Initiatoren kovalent an einer Oberfläche angebunden sind und durch Wärme oder Licht in der Gegenwart von Monomeren aktiviert werden. 1C zeigt schematisch eine dreidimensionale Verteilung von Hydroxylgruppen auf einem Polymerbürstensubstrat.
Die 2 zeigen die Strukturen und Syntheseschemata für die Synthese des Silan-Kopplungsmittels I.
3 zeigt die Strukturen und ein Syntheseschema der Synthese des Silan-Kopplungsmittels II.
4 zeigt ein Beispiel eines an der Oberfläche gebundenen Initiators, wobei der Initiator zum Azo-Typ gehört.
5 zeigt einige beispielhafte Monomere der vorliegenden Erfindung.
6 zeigt die freie Radikal-Polymerisation, um hydroxylierte Polymerbürstenoberflächen zu erzeugen, wobei das Monomer IV verwendet wird.
7 zeigt einen Vergleich der Dichten funktioneller Hydroxylgruppen auf polymeren Bürsten gegenüber flachen zweidimensionalen Substraten.
8 zeigt einen Vergleich der Signalintensität von der Hybridisierung auf polymeren Bürsten gegenüber flachen zweidimensionalen Substraten.
ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
A. Allgemeine Techniken
Bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung können, sofern nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der organischen Chemie, Polymertechnologie, Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Zellbiologie, Biochemie und Immunologie eingesetzt werden, welche innerhalb der Fachkenntnis liegen. Solche herkömmlichen Techniken beinhalten die Polymerarraysynthese, Hybridisierung, Ligation, Detektion der Hybridisierung unter Verwendung einer Markierung. Spezielle Darstellungen geeigneter Techniken kann man dem nachstehenden Beispiel entnehmen. Jedoch können natürlich andere gleichwertige herkömmliche Verfahren ebenfalls verwendet werden. Solche herkömmlichen Techniken kann man in Standardlaborhandbüchern finden, wie z.B. Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Bd. I–IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual und Molecular Cloning: A Laboratory Manual (alle von der Cold Spring Harbor Laboratory Press).
B. Definitionen
Wie hierin verwendet sollen gewisse Begriffe die folgenden definierten Bedeutungen aufweisen.
Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet umfassen die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das" Bezugnahmen auf den Plural, wenn der Kontext nicht klar etwas anderes vorschreibt. Beispielsweise, kann der Begriff "ein Array" eine Vielzahl von Arrays beinhalten, sofern der Kontext nicht klar etwas anderes vorschreibt.
Ein "Array" ist eine absichtlich erzeugte Sammlung von Molekülen, welche entweder synthetisch oder biosynthetisch hergestellt werden kann. Die Moleküle in dem Array können identisch oder voneinander verschieden sein. Der Array kann eine Vielzahl von Formaten, z.B. Bibliotheken löslicher Moleküle, Bibliotheken von Verbindungen, die an Harzkügelchen, Siliciumdioxidscheibchen oder andere feste Träger angebunden sind, annehmen.
Der Begriff "Molekül" bezieht sich im Allgemeinen auf ein Makromolekül oder Polymer, wie es hierin beschrieben wird. Jedoch liegen Arrays, die im Gegensatz zu Makromolekülen oder Polymeren einzelne Moleküle umfassen, ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
"Vordefinierter Bereich" bezieht sich auf eine lokalisierte Fläche auf einem festen Träger, welche für die Bildung eines ausgewählten Moleküls verwendet wird, wurde oder werden soll und im Übrigen hierin alternativ als ein "ausgewählter" Bereich bezeichnet wird. Der vordefinierte Bereich kann irgendeine geeignete Form, z.B. kreisförmig, rechtwinklig, elliptisch, keilförmig usw. aufweisen. Der Kürze zuliebe werden hierin "vordefinierte Bereiche" manchmal einfach als "Bereiche" bezeichnet. In einigen Ausführungsformen ist ein vordefinierter Bereich und somit eine Fläche, auf welcher jedes einzelne Molekül synthetisiert wird, kleiner als 1 cm² oder weniger als 1 mm² und noch bevorzugter weniger als 0,5 mm². In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen weisen die Bereiche eine Fläche von weniger als 10.000 μm² oder noch bevorzugter weniger als 100 μm² auf. Zusätzlich werden typischerweise mehrfache Kopien des Polymers innerhalb jedes vorausgewählten Bereichs synthetisiert. Die Anzahl der Kopien kann in den Tausenden bis zu den Millionen liegen.
Unter einigen Gesichtspunkten kann ein vordefinierter Bereich geschaffen werden, indem die Bereiche (z.B. Kügelchen, Harze, Gele usw.) physikalisch in Vertiefungen, flachen Schalen getrennt werden.
"Fester Träger", "Träger" und "Substrat" beziehen sich auf ein Material oder eine Gruppe von Materialien mit einer starren oder halbstarren Oberfläche oder Oberflächen. Unter einigen Gesichtspunkten wird wenigstens eine Oberfläche des festen Trägers im Wesentlichen flach sein, auch wenn es unter gewissen Gesichtspunkten wünschenswert sein kann, Synthesebereiche für unterschiedliche Moleküle mit beispielsweise Vertiefungen, erhöhten Bereichen, Stiften oder herausgeschnittenen Rinnen physikalisch zu trennen. Unter gewissen Gesichtspunkten werden der (die) feste(n) Träger die Form von Kügelchen, Harzen, Gelen, Mikrokügelchen oder andere geometrische Konfigurationen annehmen.
Eine "Schutzgruppe" ist ein Anteil, welcher an ein Molekül gebunden ist und welcher bei selektiver Exposition an einen Aktivator räumlich entfernt werden kann. Mehrere Beispiele von Schutzgruppen sind in der Literatur bekannt. Aktivatoren beinhalten elektromagnetische Strahlung, Ionenstrahlen, elektrische Felder, Magnetfelder, Elektronenstrahlen und Röntgenstrahlen.
"Aktivierungsgruppe" bezieht sich auf jene Gruppen, welche, wenn sie an eine bestimmte funktionelle Gruppe oder reaktive Stelle angebunden sind, diese Stelle reaktiver machen gegenüber der Bildung einer kovalenten Bindung mit einer zweiten funktionellen Gruppe oder reaktiven Stelle. Beispielsweise beinhalten Aktivierungs gruppen, die anstelle einer Hydroxylgruppe verwendet werden können, -O(CO)Cl; -OCH₂Cl; -O(CO)OAr, wobei Ar eine aromatische Gruppe, vorzugsweise eine p-Nitrophenylgruppe ist; -O(CO)(ONHS). Aktivierungsgruppen, welche für eine Carboxylgruppe nützlich sind, beinhalten einfache Estergruppen und Anhydride. Die Estergruppen beinhalten Alkyl-, Aryl- und Alkenylester und insbesondere solche Gruppen wie 4-Nitrophenyl, N-Hydroxylsuccinimid und Pentafluorphenol. Andere Aktivierungsgruppen sind den Fachleuten bekannt.
Ein "Kanalblock" ist ein Material mit einer Vielzahl von Rillen oder vertieften Bereichen auf einer seiner Oberflächen. Die Rillen oder vertieften Bereiche können eine Vielzahl von geometrischen Konfigurationen annehmen, einschließlich Streifen, Kreisen oder geschlängelten Wegen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Kanalblöcke können in einer Vielzahl von Arten hergestellt werden, einschließlich des Ätzens von Siliciumblöcken, des Formens oder Pressens von Polymeren.
Die Begriffe "photolabil" und "durch Licht spaltbar" werden über diese Anmeldung hinweg austauschbar verwendet.
Der Begriff "gegebenenfalls substituiert" bezieht sich auf das Vorliegen oder Fehlen eines Substituenten an der Gruppe, die definiert wird.
Eine "polymere Bürste" bezieht sich gewöhnlich auf Polymerfolien, welche Ketten von Polymeren umfassen, die an die Oberfläche eines Substrats angebunden sind. Die polymeren Bürsten dieser Erfindung sind funktionalisierte Polymerfolien, welche funktionelle Gruppen wie z.B. Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Thiol-, Amid-, Cyanat-, Thiocyanat-, Isocyanat- und Isothiocyanatgruppen oder eine Kombination von diesen an den Polymerketten an einem oder mehr Orten umfassen. Die polymeren Bürsten dieser Erfindung sind zu einer Anbindung oder schrittweisen Synthese von Makromolekülen an diesen fähig.
Ein "Initiator freier Radikale" oder "Initiator" ist eine Verbindung, die unter gewissen Bedingungen wie z.B. Wärme, Licht oder einer anderen elektromagnetischen Strahlung ein freies Radikal liefern kann, welches freie Radikal von einem Monomer zu einem anderen übertragen werden kann und so eine Kette von Reaktionen auslösen kann, durch welche ein Polymer gebildet werden kann. Mehrere Initiatoren freier Radikale sind im Stand der Technik bekannt, wie z.B. der Azo-Typ oder der Nitroxid-Typ oder jene, die Mehrkomponentensysteme umfassen. Ein Beispiel eines Mehrkomponentensystems ist ein Alkyl- oder Arylmetall und ein Bindungsligand und ein stabiles sauerstofffreies Radikal. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,312,871.
Die "lebende freie Radikal-Polymerisation" ist definiert als ein lebender Polymerisationsprozess, wobei Ketteninitiation und Kettenfortpflanzung ohne signifikante Kettenabbruchreaktionen stattfinden. Jedes Initiatormolekül erzeugt eine wachsende Monomerkette, welche sich kontinuierlich fortpflanzt, bis das gesamte verfügbare Monomer umgesetzt wurde. Die lebende freie Radikal-Polymerisation unterscheidet sich von der herkömmlichen freien Radikal-Polymerisation, wo Ketteninitiations-, Kettenfortpflanzungs- und Kettenabbruchreaktionen gleichzeitig auftreten und die Polymerisation fortschreitet, bis der Initiator aufgebraucht ist. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,677,388. Die lebende freie Radikal-Polymerisation erleichtert die Steuerung des Molekulargewichts und der Molekulargewichtsverteilung. Lebende freie Radikal-Polymerisationstechniken beinhalten beispielsweise ein reversibles Capping der Enden von wachsenden Ketten während der Polymerisation. Ein Beispiel ist die Atomtransfer-Radikal-Polymerisation (ATRP).
Eine "Radikal-Erzeugungsstelle" ist eine Stelle auf einem Initiator, an welcher freie Radikale als Reaktion auf Wärme oder elektromagnetische Strahlung erzeugt werden. Beispielsweise existiert in dem Fall eines Initiators vom Azo-Typ, wie er in 2 gezeigt ist, eine Radikal-Erzeugungsstelle an dem Kohlenstoffatom auf jeder Seite des -N=N-Anteils.
Ein "Polymerisationsterminator" ist eine Verbindung, welche eine Polymerkette an einer weiteren Polymerisation hindert. Diese Verbindungen können ebenfalls als "Terminatoren" oder "Capping-Mittel" oder "Inhibitoren" bekannt sein. Verschiedene Polymerisationsterminatoren sind im Stand der Technik bekannt. Unter einem Gesichtspunkt kann ein Monomer, das keine freien Hydroxylgruppen aufweist, als ein Polymerisationsterminator wirken.
Der Begriff "fähig, die Synthese eines makromolekularen Arrays zu unterstützen" bezieht sich auf eine polymere Bürste, die mit funktionellen Gruppen wie z.B. Hydroxyl, Amino, Carboxyl funktionalisiert wurde. Diese funktionellen Gruppen erlauben eine makromolekulare Synthese, indem sie als "Anbindungspunkte" wirken. Zu den Zwecken der vorliegenden Erfindung sind solche polymeren Bürsten, die funktionelle Gruppen nur an den Endpunkten umfassen, nicht fähig, die Synthese eines makromolekularen Arrays zu unterstützen.
Der Begriff "Bedingungen, die eine freie Radikal-Polymerisation fördern" bezieht sich auf jene Bedingungen, einschließlich des Vorliegens von Wärme oder elektromagnetischer Strahlung, oder Lösungsmitteln, Cosolventien, welche die Bildung und Fortpflanzung freier Radikale erlauben. Solche Bedingungen sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden weiterhin nachstehend beschrieben.
Ein "Makromolekül" oder "Polymer" umfasst zwei oder mehr Monomere, die kovalent verbunden sind. Die Monomere können einzeln oder in Reihen von mehreren Monomeren, die gewöhnlich als "Oligomere" bekannt sind, verbunden werden. So können beispielsweise ein Monomer und eine Reihe von fünf Monomeren verbunden werden, um ein Makromolekül oder Polymer von sechs Monomeren zu bilden. In ähnlicher Weise kann eine Reihe von fünfzig Monomeren mit einer Reihe von hundert Monomeren verbunden werden, um ein Makromolekül oder Polymer von einhundertundfünfzig Monomeren zu bilden.
Die Monomere in einem vorgegebenen Polymer oder Makromolekül können identisch oder voneinander verschieden sein. Ein Monomer kann, unabhängig vom Molekulargewicht, ein kleines oder ein großes Molekül sein. Weiterhin kann jedes der Monomere ein geschütztes Element sein, das nach der Synthese modifiziert wird. Die bestimmte Anordnung der Monomere innerhalb eines Makromoleküls kann hierin als die "Sequenz" des Makromoleküls bezeichnet sein.
"Monomer" wie hierin verwendet bezieht sich auf jene Monomere, die verwendet werden, um Polymere der polymeren Bürste zu bilden, wie auch jene Monomere, die verwendet werden, um Makromoleküle an der polymeren Bürste zu bilden. Die Bedeutung des Monomers wird jedoch aus dem Kontext klar, in welchem es verwen det wird. Die Monomere zur Bildung der Polymere der polymeren Bürste weisen beispielsweise die allgemeine Struktur:
auf, wobei R₁ Wasserstoff oder Niederalkyl ist; R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder -Y-Z sind, wobei Y Niederalkyl ist und Z Hydroxyl, Amino oder C(O)-Rist, wobei R Wasserstoff, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
Der Begriff "Alkyl" bezieht sich auf solche Gruppen wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl usw., welche linear, verzweigt oder cyclisch sein können.
Der Begriff "Alkoxy" bezieht sich auf Gruppen wie z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy usw., welche linear, verzweigt oder cyclisch sein können.
Der Begriff "Nieder", wie er in dem Kontext von Niederalkyl oder Niederalkoxy verwendet wird, bezieht sich auf Gruppen, die ein bis sechs Kohlenstoffatome aufweisen.
Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf einen aromatischen Kohlenwasserstoffring, an welchen eine Alkylgruppe angebunden ist. Der Begriff "Aryloxy" bezieht sich auf einen aromatischen Kohlenwasserstoffring, an welchen eine Alkoxygruppe angebunden ist. Ein Durchschnittsfachmann würde diese Begriffe leicht verstehen.
Unter einem Gesichtspunkt ist das Monomer ein "Verdünnungs"-Monomer, wenn es keine freie Hydroxylgruppe enthält.
Die Monomere zur Herstellung von Makromolekülen der vorliegenden Erfindung sind im Stand der Technik wohlbekannt. Wenn beispielsweise das Makromolekül ein Peptid ist, beinhalten die Monomere beispielsweise die L-Aminosäuren, die D-Aminosäuren, die synthetischen und/oder natürlichen Aminosäuren, sind aber nicht auf diese beschränkt. Wenn das Makromolekül eine Nukleinsäure oder ein Polynukleotid ist, beinhalten die Monomere ein beliebiges Nukleotid. Wenn das Makromolekül ein Polysaccharid ist, können die Monomere irgendeine Pentose, Hexose, Heptose oder deren Derivate sein.
Wie hierin verwendet ist ein "Polynukleotid" eine Sequenz von zwei oder mehr Nukleotiden. Polynukleotide der vorliegenden Erfindung beinhalten Sequenzen von Deoxyribopolynukleotiden (DNA) oder Ribopolynukleotiden (RNA), welche aus natürlichen Quellen isoliert, rekombinant erzeugt oder künstlich synthetisiert werden können. Ein weiteres Beispiel eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung kann ein Polyamidpolynukleotid (PNA) sein. Die Polynukleotide und Nukleinsäuren können als einzelsträngig oder doppelsträngig existieren.
Der Begriff "Nukleotid" beinhaltet Deoxynukleotide und Analoge von diesen. Diese Analogen sind jene Moleküle, die einige strukturellen Merkmale mit einem natürlich vorkommenden Nukleotid gemeinsam haben, so dass, wenn diese in eine Polynukleotidsequenz eingebaut werden, sie eine Hybridisierung mit einem komplementären Polynukleotid in Lösung erlauben. Typischerweise sind diese Analogen von natürlich vorkommenden Nukleotiden abgeleitet, indem die Base, die Ribose oder der Phosphodiesteranteil ersetzt und/oder modifiziert wurden. Die Änderungen können maßgeschneidert sein, um die Hybridbildung zu stabilisieren oder zu destabilisieren oder um die Spezifität der Hybridisierung mit einer komplementären Polynukleotidsequenz nach Wunsch zu erhöhen oder um die Stabilität des Polynukleotids zu erhöhen.
Analoge beinhalten ebenfalls geschützte und/oder modifizierte Monomere, wie sie herkömmlicherweise bei der Polynukleotidsynthese verwendet werden. Wie ein Fachmann sehr wohl weiß, verwendet die Polynukleotidsynthese eine Vielzahl basengeschützter Nukleosid-Derivate, bei welchen ein oder mehr der Stickstoffatome des Purin- und Pyrimidin-Anteils durch Gruppen wie z.B. Dimethoxytrityl, Benzyl, tert-Butyl und Isobutyl geschützt sind.
Beispielsweise werden gegebenenfalls strukturelle Gruppen zu der Ribose oder Base eines Nukleosids zum Einbau in ein Polynukleotid zugegeben, wie z.B. eine Methyl-, Propyl- oder Allylgruppe an der 2'-O-Position an der Ribose, oder eine Fluorgruppe, welche die 2'-O-Gruppe ersetzt, oder eine Bromgruppe an der Ribonukleosidbase. 2'-O-Methyloligoribonukleotide (2'-O-MeORNs) weisen eine höhere Affinität zu komplementären Polynukleotiden (insbesondere RNA) auf als ihre unmodifizierten Gegenstücke. 2'-O-MeORNA-Phosphoramidit-Monomere sind im Handel z.B. bei der Chem Genes Corp. oder der Glen Research, Inc. erhältlich. Alternativ können Deazapurine und Deazapyrimidine, bei welchen ein oder mehr N-Atome des heterocyclischen Purin- oder Pyrimidinrings durch C-Atome ersetzt sind, ebenfalls verwendet werden.
Die Phosphodiesterverknüpfung oder das "Zuckerphosphat-Gerüst" des Polynukleotids kann ebenfalls, beispielsweise mit Methylphosphonaten, O-Methylphosphaten oder Phosphorothioaten, substituiert oder modifiziert sein. Ein anderes Beispiel eines Polynukleotids, welches solche modifizierten Verknüpfungen umfasst, beinhaltet für die Zwecke dieser Offenbarung "Peptidpolynukleotide", bei welchen ein Polyamidgerüst an Polynukleotidbasen oder modifizierte Polynukleotidbasen angebunden ist. Peptidpolynukleotide, welche ein Polyamidgerüst umfassen, und die Basen, die in natürlich vorkommenden Nukleotiden gefunden werden, sind im Handel z.B. bei der Biosearch, Inc. (Bedford, MA) erhältlich. Siehe ebenfalls die U.S.-Patente Nr. 5,773,571 und 5,786,461.
Nukleotide mit modifizierten Basen können ebenfalls in dieser Erfindung verwendet werden. Einige Beispiele von Basenmodifikationen beinhalten 2-Aminoadenin, 5-Methylcytosin, 5-(Propin-1-yl)cytosin, 5-(Propin-1-yl)uracil, 5-Bromuracil, 5-Bromcytosin, Hydroxymethylcytosin, Methyluracil, Hydroxymethyluracil und Dihydroxypentyluracil, welche in die Polynukleotide eingebaut werden können, um die Bindungsaffinität zu komplementären Polynukleotiden zu modifizieren.
Die Gruppen können ebenfalls mit verschiedenen Positionen an dem Nukleosidzuckerring oder an den Purin- oder Pyrimidinringen verknüpft werden, welche den Duplex durch elektrostatische Wechselwirkungen mit dem negativ geladenen Phosphatgerüst oder durch Wechselwirkungen in den Haupt- und Nebenfurchen stabilisieren können. Beispielsweise können Adenosin- und Guanosinnukleotide an der N²-Position mit einer Imidazolylpropylgruppe substituiert werden, was die Duplexstabili tät erhöht. Universelle Basenanaloge wie z.B. 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol können ebenfalls aufgenommen werden. Eine Vielzahl modifizierter Polynukleotide, die zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, werden z.B. in "Antisense Research and Application", S.T. Crooke und B. LeBleu (Herausg.) (CRC Press, 1993) und "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" in ACS Symp. Ser. #580, Y.S. Sanghvi und P.D. Cook (Herausg.) ACS, Washington, D.C. 1994 beschrieben.
Wenn das Makromolekül von Interesse ein Peptid ist, können die Aminosäuren irgendwelche Aminosäuren, einschließlich α-, β- oder ω-Aminosäuren sein. Wenn die Aminosäuren α-Aminosäuren sind, kann entweder das optische L-Isomer oder das optische D-Isomer verwendet werden. Zusätzlich sind nichtnatürliche Aminosäuren, beispielsweise β-Alanin, Phenylglycin und Homoarginin, ebenfalls von dieser Erfindung umfasst. Diese Aminosäuren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe beispielsweise Stryer, Biochemistry, letzte Ausgabe, Kapitel über Aminosäuren und über Proteine.
Verfahren der Cyclisierung und Polymerumkehr von Polymeren sind in der parallelen Anmeldung U.S. Ser. Nr. 08/351,058 offenbart, welche eine CIP der U.S. Ser. Nr. 07/978,940 ist, welche eine CIP des U.S.-Pat. Nr. 5,242,974 ist.
Der Begriff "Hybridisierung" bezieht sich auf den Prozess, bei welchem zwei einzelsträngige Polynukleotide nichtkovalent binden, um ein stabiles doppelsträngiges Polynukleotid zu bilden; eine dreisträngige Hybridisierung ist theoretisch ebenfalls möglich. Das resultierende (gewöhnlich) doppelsträngige Polynukleotid ist ein "Hybrid." Der Anteil der Population von Polynukleotiden, die stabile Hybride bilden, wird hierin als der "Hybridisierungsgrad" bezeichnet.
Verfahren zur Durchführung von Polynukleotid-Hybridisierungsassays sind im Stand der Technik weit entwickelt. Die Hybridisierungsassay-Verfahren und -Bedingungen werden in Abhängigkeit von der Anwendung variieren und werden entsprechend den bekannten allgemeinen Bindungsmethoden ausgewählt, einschließlich jenen, auf die Bezug genommen wird in: Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2. Ausg., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger und Kimmel, "Methods in Enzymo logy," Bd. 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Inc., San Diego, CA., 1987; Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80:1194 (1983).
Es wird anerkannt, dass die Fähigkeit von zwei einzelsträngigen Polynukleotiden, zu hybridisieren, von Faktoren wie z.B. deren Grad an Komplexität wie auch der Stringenz der Bedingungen der Hybridisierungsreaktion abhängen wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Stringenz" auf die Bedingungen einer Hybridisierungsreaktion, welche das Ausmaß beeinflussen, in welchem Polynukleotide hybridisieren. Stringente Bedingungen können ausgewählt werden, die ermöglichen, dass Polynukleotidduplexe auf der Basis ihres Ausmaßes an Fehlpaarungen unterschieden werden. Eine hohe Stringenz korreliert mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit für die Bildung eines Duplexes, der fehlgepaarte Basen enthält. Somit gilt, je höher die Stringenz, desto größer die Wahrscheinlichkeit, dass zwei einzelsträngige Polynukleotide, die in der Lage sind, einen fehlgepaarten Duplex zu bilden, einzelsträngig bleiben werden. Umgekehrt wird bei einer geringeren Stringenz die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines fehlgepaarten Duplexes erhöht.
Die geeignete Stringenz, die die Auswahl eines perfekt gepaarten Duplexes im Vergleich zu einem Duplex, der ein oder mehr Fehlpaarungen enthält, erlauben wird (oder die die Auswahl eines bestimmten fehlgepaarten Duplexes im Vergleich zu einem Duplex mit einem höheren Ausmaß an Fehlpaarung erlauben wird), wird im Allgemeinen empirisch bestimmt. Mittel zur Einstellung der Stringenz einer Hybridisierungsreaktion sind den Fachleuten wohlbekannt. Siehe beispielsweise Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel, et al., "Current Protocols In Molecular Biology," John Wiley & Sons, 1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996 und regelmäßige Updates; und Hames et al., "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach," IRL Press, Ltd., 1985.
Im Allgemeinen umfassen die Bedingungen, welche die Stringenz erhöhen (d.h. im Hinblick auf die Bildung von besser gepaarten Duplexen selektieren), höhere Temperatur, geringere Ionenstärke und das Vorliegen oder Fehlen von Lösungsmitteln; eine geringere Stringenz wird begünstigt durch niedrigere Temperatur, höhere Ionenstär ke und niedrigere oder höhere Konzentrationen von Lösungsmitteln (beispielsweise niedrigere Konzentrationen an Formamid oder Dimethylsulfoxid). Die Dauer der Hybridisierungsreaktion und die Konzentration der Reaktanden (d.h. des einzelsträngigen Polynukleotids) können die Stringenz ebenfalls beeinflussen, wobei kurze Reaktionszeiten und niedrige Reaktandenkonzentrationen eine höhere Stringenz begünstigen.
Über diese gesamte Offenbarung hinweg werden verschiedene Gesichtspunkte dieser Erfindung in einem Bereichsformat angegeben. Man sollte verstehen, dass die Beschreibung im Bereichsformat nur der Bequemlichkeit und Kürze dient und nicht als eine unflexible Beschränkung für den Umfang der Erfindung ausgelegt werden sollte. Demgemäß sollte die Beschreibung eines Bereichs so verstanden werden, dass damit alle möglichen Unterbereiche wie auch die einzelnen numerischen Werte innerhalb dieses Bereichs ausdrücklich offenbart sind. Beispielsweise sollte die Beschreibung eines Bereichs wie z.B. von 1 bis 6 so verstanden werden, dass ausdrücklich Unterbereiche wie z.B. von 1 bis 3, von 1 bis 4, von 1 bis 5, von 2 bis 4, von 2 bis 6, von 3 bis 6 wie auch einzelne Zahlen innerhalb dieses Bereichs, beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 und 6 offenbart sind. Dieses trifft unabhängig von der Breite des Bereichs zu.
C. Makromolekulare Arrays an Polymeren Bürsten
I. Polymere Bürsten
a) Allgemeiner Hintergrund
Polymere Bürsten sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Prucker und Ruhe, Macromolecules, 31:592–601 (1998); Huang und Wirth, Analytical Chemistry, 69:4577–4580 (1997); und Husseman et al., Macromolecules, 32:1424–1431 (1999).
Ein traditionelles Verfahren zur Herstellung von polymeren Bürsten ist als "Pfropfen" bekannt. Dieses Verfahren wird typischerweise verwendet, um Blockcopolymere herzustellen, wobei dieses beinhaltet, dass ein Block des Polymers stark an der Ober fläche absorbiert ist, während der andere Block die Bürstenschicht bildet. Einige der Nachteile dieses auf Adsorption basierenden Pfropfens umfassen die Desorption der Brüste und die begrenzte Auswahl an funktionellen Gruppen für die Blockcopolymerstruktur. Ein anderes Verfahren des Pfropfens beinhaltet die Bildung einer kovalenten Verknüpfung zwischen Polymerketten und dem Substrat. Eine kovalente Verknüpfung kann erreicht werden, indem ein funktionalisiertes Polymer mit reaktiven Oberflächengruppen auf dem Substrat kondensiert wird. Bei einer solchen Methodik kann ein Initiator wie z.B. ein mit Monochlorsilyl funktionalisierter Azo-Initiator kovalent an die Substratoberfläche angebunden werden. Ein Kettenwachstum kann unter den Bedingungen einer ionischen oder traditionellen freien Radikal-Polymerisation erreicht werden. Von diesen Verfahren wurde gezeigt, dass sie kovalent angebundene Polymerbürsten mit hohen Pfropfdichten und Molekulargewichten erzeugen. Siehe Husseman, supra.
Jedoch ist ein Hauptproblem, welches die Polymerisationstechnik beeinflusst, die Unfähigkeit, eine enge Polydispersität (d.h. Molekulargewichtsverteilung) bei relativ hohen Molekulargewichten beizubehalten. Darüber hinaus war der Erhalt der gewünschten polymeren Struktur mit den gewünschten funktionellen Gruppen an dem Polymer eine Herausforderung. Als Antwort wurden "lebende Polymerisations"-Verfahren entwickelt.
Der Begriff "lebende Polymerisation" bezieht sich auf einen Polymerisationsprozess, wo die wachsenden Polymerketten eine oder mehr aktive Stellen enthalten, die in der Lage sind, eine weitere Polymerisation zu unterstützen. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,708,102. Eine allgemeine Strategie zum Erhalt einer lebenden Polymerisation ist, dafür zu sorgen, dass eine chemische Spezies das aktive Zentrum, das die Polymerisation unterstützt, reversibel abdeckt. Bei ionischen Polymerisationen, die durch Anionen (anionische Polymerisation) oder Kationen (kationische Polymerisation) initiiert werden, fungiert das Gegenkation bzw. -anion als ein Capping-Mittel. Wenn die Ionen aneinander gebunden werden, hört die Polymerisation auf, aber die reversible Dissoziation in ionische Fragmente liefert eine kontrollierte Quelle für Stellen, welche eine weitere ionische Polymerisation unterstützen. Lebende ionische Polymerisationen werden weithin benutzt, um Blockcopolymere durch eine aufeinander folgende Zugabe verschiedener Alkenmonomere zu bilden.
Im Gegensatz zu lebenden ionischen Polymerisationen benutzen lebende freie Radikal-Polymerisationen Polymerisationsinitiatoren (R-X), die zu einem Alkylradikal (R) zerfallen können, das die Polymerisation von Monomeren unterstützt. Dieser Prozess kann wie in den 1A–C gezeigt dargestellt werden. Wärme oder elektromagnetische Strahlung können verwendet werden, um das Radikal zu erzeugen, welches die Polymerisation von Monomeren initiiert: Wenn Wärme verwendet wird, kann das anfängliche Radikal spontan bei Temperaturen über 100°C erzeugt werden oder kann bei Temperaturen unter 100°C durch die Zugabe einer kleinen Menge an freiem Radikalinitiator erzeugt werden. Siehe beispielsweise Hawker, Macromolecules, 30:373–82 (1997).
Auf einer gewünschten Stufe wird die Polymerisation durch einen Polymerisationsterminator beendet. Solche Terminatoren sind im Stand der Technik bekannt. Siehe Greszta et al., Macromolecules, 27:638 (1994). Ein Ansatz, um die Polymerisation zu beenden, ist es, die wachsenden Radikale reversibel mit Radikalfänger-Radikalen umzusetzen, um kovalente Spezies zu bilden. Ein anderer Ansatz beinhaltet das reversible Umsetzen der wachsenden Radikale mit kovalenten Spezies, um beständige Radikale zu erzeugen. Noch ein anderer Ansatz beinhaltet das Zulassen, dass die wachsenden Radikale an einer degenerativen Transferreaktion teilnehmen, welche denselben Typ von Radikalen regeneriert. Siehe U.S.-Pat. Nr. 4,581,429; Hawker, J. Am. Chem. Soc., 116:11185 (1994); und Georges et al., Macromolecules, 26:2987 (1993).
Lebende freie Radikal-Verfahren erlauben die Verwendung von Blockcopolymeren bei der Bildung der Bürsten und erlauben eine bessere Steuerung der polymeren strukturellen Merkmale wie z.B. Molekulargewicht, Polymerdichte, Verzweigung. Weiterhin erlauben lebende freie Radikal-Polymerisationsverfahren die Kettenfortpflanzung in Gegenwart von unterschiedlichen Monomeren, so dass die Polymerkette variiert werden kann.
Verschiedene Typen von Initiatoren, Verfahren zur Erzeugung freier Radikale, Monomeren und freien Radikal-Capping-Mitteln sind im Stand der Technik beschrieben worden. Siehe beispielsweise die U.S.-Patente Nr. 5,677,388, 5,728,747, 5,708,102, 5,807,937 und 5,852,129. Ein Benzoylperoxid-Chrom-Initiator kann ebenfalls verwendet werden. Siehe Lee et al., J. Chem. Soc. Trans. Faraday Soc. I, 74: 1726 (1978). Zusätzliche Typen von Initiatoren beinhalten α-Halogenester, Alkoxyamin und Initiatoren vom Halogenbenzyl-Typ, welche alle in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Siehe Husseman, supra und Hawker, supra.
Beispiele von Photoinitiatoren, die in verschiedenen effektiven Mengen ausgewählt werden, wie z.B. von 1 bis 10 Gewichtsprozent bezogen auf die gesamten Gewichtsprozente der Reaktanden, beinhalten Benzoine, Disulfide, Aralkylketone, Oximinoketone, Peroxyketone, Acylphosphinoxide, Diaminoketone, wie z.B. Micher's Ketone, 3-Ketocourmarine und dergleichen, und vorzugsweise 1-Hydroxycyclohexylphenylketon.
Die Monomere beinhalten N-Carboxyanhydrid (zur Herstellung von Peptiden), Styrol und Vinylverbindungen. Beispiele für Initiatoren beinhalten: den Azo-Typ, den Nitroxid-Typ. Ein Beispiel eines Terminators ist ein Mittel eines stabilen freien Radikals, welches als TEMPO (2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy) bekannt ist. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,728,747.
Vor kurzem wurden Verfahren zur Erzeugung eines (Meth)Acrylpolymers, welches an beiden Enden hydroxyl-terminiert ist, berichtet. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,852,129. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung eines (Meth)Acrylpolymers durch Polymerisieren eines (Meth)Acrylmonomers unter Verwendung eines organischen Halogenids oder einer halogenierten Sulfonylverbindung als einem Initiator und eines Metallkomplexes mit einem zentralen Metall, das ausgewählt ist aus den Elementen, die zu den Gruppen 8, 9, 10 und 11 des Periodensystems gehören, als einem Katalysator. Dieses (Meth)Acrylatpolymer enthält eine Endstruktur mit der allgemeinen Formel: -CH₂-C(R₁)(CO₂R₂)(X). Dieses endständige Halogen wird in einen hydroxylhaltigen Substituenten umgewandelt, indem mit einer polymerisierbaren Alkenylgruppe und einer Hydroxylgruppe umgesetzt wird. Das Patent '129 beschreibt ebenfalls ein Verfahren, um eine Hydroxylgruppe an jedem Ende einzuführen, beispielsweise indem ein (Meth)Acrylmonomer unter Verwendung eines hydroxylhaltigen Halogenids als einem Initiator in dem oben beschriebenen Schema polymerisiert wird.
b) Polymere Bürsten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind
Während die allgemeine Methodik der Erzeugung von polymeren Bürsten bekannt war, müssen die Verfahren zur Erzeugung von polymeren Bürsten mit mehrfachen funktionellen Gruppen an den Bürsten und die Verwendung solcher multifunktionalisierten polymeren Bürsten bei der Herstellung von makromolekularen Arrays noch erforscht werden.
Jeder Träger für die Herstellung von makromolekularen Arrays muss einen optimalen Abstand der Initiationsstellen, eine Benetzbarkeit der Oberfläche durch sowohl organische Lösungsmittel als auch wässrige Lösungen bereitstellen und die nichtspezifische Bindung von Liganden an die Oberfläche minimieren. Der Abstand der Syntheseinitiationsstellen auf einem festen Träger kann nicht nur die Synthese des Arrays sondern ebenfalls die Bindungsereignisse zwischen einem immobilisierten Makromolekül und seinem Liganden beeinflussen. Die Synthese kann durch Phänomene wie z.B. die Bildung freier Radikale während einer photolytischen Reaktion (bei der lichtgesteuerten Synthese), die Lösungsmittelzugänglichkeit und elektrostatische Effekte an der Oberfläche beeinflusst werden.
Die Benetzbarkeit des Trägers oder der Substratoberfläche hat wahrscheinlich ebenfalls einen direkten Einfluss auf die Ausbeute der Kopplungsreaktionen und der anschließenden Bindungsereignisse. Es wird erwartet, dass die Präsentation von Peptiden oder anderen Liganden zur Erkennung eine Funktion von nicht nur der Hydrophobizität/Hydrophilie des Peptids oder Liganden sondern ebenfalls der physikochemischen Natur der Oberfläche ist, an welche diese angebunden sind. Somit wird erwartet, dass hydrophile Peptidsequenzen sich vollständig in die umgebende wässrige Umgebung erstrecken, wodurch deren Verfügbarkeit zur Erkennung und Bindung durch Rezeptoren maximiert wird. Im Gegensatz dazu können hydrophobe Sequenzen in der Gegenwart einer moderat hydrophoben Substratoberfläche auf der Oberfläche kollabieren und effektiv aus dem Pool verfügbarer Liganden, die einem Rezeptor präsentiert werden, eliminiert werden.
In Anbetracht der obigen Erwägungen erlauben die polymeren Bürsten, auf welche in den Verfahren der Erfindung Bezug genommen wird, die Kontrolle der Dichte der funktionalen Stellen, der Benetzbarkeit und der Porosität.
Wie anhand der Offenbarung hierin und in den begleitenden Beispielen deutlicher werden wird, umfassen die Zusammensetzungen polymerer Bürsten, auf welche in den Verfahren der Erfindung Bezug genommen wird, einzelne Polymerketten, bei welchen die einzelnen Polymerketten mehrfache funktionelle Gruppen wie z.B. Hydroxylgruppen, beispielsweise 2, 3, 4 oder mehr, beinhalten. Siehe beispielsweise die 1A–C und 6. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Bildung solcher polymeren Bürsten auf Substraten wie z.B. Glas oder Siliciumdioxid bereit.
Der Träger der polymeren Bürste kann maßgeschneidert werden, um optimale Eigenschaften für die Synthese und für biologische Assays bereitzustellen. Beispielsweise kann die Endkonzentration der funktionellen Gruppen (Amin oder Hydroxyl) in der polymeren Bürste gesteuert werden, indem die relativen Mengen an nichtfunktionalisierten und funktionalisierten Monomeren variiert werden, die bei der Bildung des Polymers verwendet werden. Zusätzlich kann die Porosität und Löslichkeit der Polymerfolien gesteuert werden, indem die Konzentrationen der Monomere und Vernetzungsmittel in der Zusammensetzung variiert werden. Somit ergibt ein hoher Grad an Vernetzung ein starres unlösliches Polymer mit niedriger Porengröße, wogegen das Weglassen des Vernetzungsmittels insgesamt zu löslichen linearen Polymerketten (mit funktionellen Gruppen) führen wird, die sich von der Oberfläche des Substrats von den Anbindungsstellen weg erstrecken.
Die polymeren Bürsten auf Substraten wie z.B. Glas oder Siliciumdioxid sind nützlich zum Synthetisieren von Arrays von Makromolekülen wie z.B. Polypeptiden, Polynukleotiden und Polysacchariden oder anderen Makromolekülen von Interesse. Die polymeren Bürsten liefern eine poröse dreidimensionale Matrix, die mit reaktiven Gruppen funktionalisiert ist, die als Ausgangspunkte für eine Synthese makromolekularer Arrays dienen. Diese Arrays können ebenfalls für Assays, an denen Makromoleküle beteiligt sind, wie z.B. eine auf einer Hybridisierung basierende Nukleinsäuresequenzanalyse oder Ligand-Peptid- oder Ligand-enzymatische Wechselwirkungen verwendet werden.
Einer der Hauptvorteile dieser Bürsten ist, dass sie eine sehr viel größere Anzahl von Synthesestellen pro Einheitsfläche des Substrats bereitstellen als durch die derzeitige Generation von monofunktionalen Silan-derivatisierten Glasoberflächen ange- boten wird, während ein ähnlicher oder größerer Abstand zwischen den Stellen beibehalten wird. Das Ausmaß der Bindung von „Ziel"-Molekülen an die immobilisierten Makromoleküle wird wesentlich erhöht, was die Detektion verbessert, und die Vielzahl der Bindungsstellen innerhalb des Polymerträgers kann eine zusätzliche kinetische Verbesserung liefern.
Die seitliche Oberflächendichte der Polymerketten kann beispielsweise 0,1–1000 pmol/cm² Substratoberflächenbereich oder z.B. 1–100 betragen. Die seitliche Oberflächendichte der Anbindungsstellen an der Polymerkette, wobei einzelne Polymerketten mehrfache Anbindungsstellen aufweisen, kann beispielsweise 0,1 bis 1.000.000 pmol/cm² Substratoberflächenbereich, z.B. 1–1.000, betragen.
Die Polymerbürsten können verwendet werden, um Arrays von Nukleinsäuren zu bilden. Arrays von Nukleinsäuren, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind, werden im Detail beispielsweise in dem U.S.-Patent Nr. 5,744,305 beschrieben. Auf einem Substrat werden Nukleinsäuren beispielsweise mit unterschiedlichen Sequenzen jeweils in einem vordefinierten Bereich auf einer Oberfläche immobilisiert. Beispielsweise können 10, 50, 60, 100, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ oder 10⁸ unterschiedliche Monomersequenzen auf dem Substrat bereitgestellt werden. Die Nukleinsäuren mit einer bestimmten Sequenz werden innerhalb eines vordefinierten Bereichs eines Substrats bereitgestellt, der einen Oberflächenbereich von beispielsweise ca. 1 cm² bis 10^–10 cm² aufweist. Die Bereiche können Flächen von weniger als ca. 10^–1, 10^–2, 10^–3, 10^–4, 10^–5, 10^–6, 10^–7, 10^–8, 10^–9 oder 10^–10 cm² aufweisen. Beispielsweise kann ein planarer nichtporöser Träger bereitgestellt werden, der wenigstens eine erste Oberfläche und eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäuren aufweist, die an die erste Oberfläche in einer Dichte angebunden sind, die ca. 400 unterschiedliche Nukleinsäuren/cm² übersteigt, wobei jede der unterschiedlichen Nukleinsäuren an die Oberfläche des festen Trägers in einem unterschiedlichen vordefinierten Bereich angebunden ist, eine unterschiedliche feststellbare Sequenz aufweist und beispielsweise eine Länge von wenigstens 4 Nukleotiden aufweist. Die Nukleinsäuren können beispielsweise eine Länge von 4 bis 20 Nukleotiden aufweisen. Die Anzahl der unterschiedlichen Nukleinsäuren kann beispielsweise 1000 oder mehr betragen.
Die Polymerbürsten können ebenfalls auf porösen Siliciumdioxid-Substraten mit einer hohen Porosität, beispielsweise einem hauptsächlich anorganischen porösen Substrat, das einen Trägerbereich und einen porösen Bereich in Kontakt mit dem Trägerbereich einschließt, bereitgestellt werden, wobei der poröse Bereich Poren mit einer Porengröße von 1–500 nm beinhaltet, wobei der poröse Bereich eine Porosität von z.B. 10–90% und eine Dicke der porösen Oberfläche von 0,01–20 μm aufweist, wie in der PCT/US00/09206 beschrieben wird.
c) Verfahren zur Bildung Polymerer Bürsten
Unter einem Gesichtspunkt wird ein Verfahren bereitgestellt, um kovalent verankerte polymere Bürsten von amin- oder hydroxyfunktionalisierten Polymeren auf Glas oder Siliciumdioxidsubstraten herzustellen. Die Polymerfolie wird kovalent durch ein Oberflächenpolymerisationsschema, wie es in den 1A–C und 6 gezeigt ist, auf das Substrat "gepfropft". Ein Initiator wird bereitgestellt, und ein Ende des Initiators wird kovalent an die Substratoberflächer gebunden, während der Initiator eine Radikal-Erzeugungsstelle, distal von dem Substrat, aufweist, um an der Polymerisation teilzunehmen. Unter geeigneten Bedingungen, welche die lebende freie Radikal-Polymerisation unterstützen, werden Monomere mit dem Substrat kontaktiert. Die polymere Kette wird bis zu der gewünschten Länge verlängert, und die Polymerisation kann nach Wunsch beendet werden.
Unter einem Gesichtspunkt wird ein Glassubstrat mit einem Initiator vom Azo-Typ wie z.B. 4,4'-Azobis(pentanamidpropyltriethoxysilan) (AIBN-APS) (I) vorab silanisiert. Siehe 2. Das silanisierte Substrat mit dem gebundenen Initiator ist in 4 gezeigt. In diesem Beispiel wird bei der Aktivierung wie z.B. durch Erwärmen N₂ ausgestoßen, was zwei Kohlenstoffradikale zurück lässt. -Alkyl-(Me)(CN)C-NN-C(Me)(CN)-Alkyl → 2[-Alkyl-(Me)(CN)C•] + N2
Mischungen von geeignet funktionalisierten Monomeren, die als Initiationspunkte zur makromolekularen Synthese fungieren können, wie auch jenen Monomeren, die als "inerte" Verdünnungsmittel (oder Capping-Mittel) fungieren können, werden dann mit den Kohlenstoffradikalen umgesetzt, und die Polymerisation beginnt. Siehe 6. Unter Verwendung einer solchen Mischung von funktionalisierten und Verdünnungs-Monomeren wird der durchschnittliche Abstand der makromolekularen Synthese-Initiationsstellen auf dem Substrat verändert. Dieses Verfahren liefert eine effektive Steuerung von nicht nur der Dichte der funktionellen Stellen sondern ebenfalls von anderen Oberflächeneigenschaften wie z.B. der Oberflächenbenetzbarkeit und der nichtspezifischen Bindung von Makromolekülen.
AIBN-APS kann leicht durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Ein beispielhaftes Verfahren der Herstellung ist in 2 gezeigt. Ein anderes Beispiel eines Initiators vom Azo-Typ (II) und dessen Synthese sind in 3 gezeigt. Siehe ebenfalls Chang und Frank, Langmuir 12:5824–29 (1996); Chang und Frank, Langmuir 14:326–334 (1998); Prucker und Ruhe, supra; Japanisches Patent H1-234479; und Japanisches Patent H3-99702.
Initiatoren vom Azo-Typ werden beispielsweise in Pruker und Ruhe, Macromol., 31:592–601 (1998) beschrieben. Man sollte verstehen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf Initiatoren vom Azo-Typ beschränkt ist. Tatsächlich kann jeder bekannte Initiator verwendet werden, solange der Initiator kovalent mit dem Substrat an einem Ende verknüpft werden kann, während er distal eine Radikal-Erzeugungsstelle trägt, um die Polymerisation zu initiieren.
Oberflächeninitiationsstellen beinhalten Silanverbindungen wie z.B. (X)_a(Y)_bSi-(Z)-Q, wobei b = 3 minus a; X Cl, OMe oder OEt ist; Y C_1-4-Alkyl ist; Z C₂-C₂₀-Alkyl, Alkylaryl oder Polyoxyalkylidin ist; und Q eine radikalbildende Vorläufergruppe ist. Q ist H oder Alkyl, wenn ein Verdünnungssilan verwendet wird.
Andere Initiatoren beinhalten Nitroxyl (Husseman et al., Macromol. 32:1421–31 (1999)), Halogen- (Huang und Wirth, Anal. Chem. 69:4577–80 (1997)) und Thiocarbamat (Kobayashi et al., J Appl. Poly. Sci., 49:447–423 (1999)). Beispiele von Initiatoranteilen beinhalten: -C(CN)(R¹)-N=N-C(CN)(R²)R³; -CR¹(R¹)-S-C(=S)-N(R³)₂; -CR¹(R²)-O-N(R³)R⁴; und -C(R¹)(R²)X; wobei R^1–4 unabhängig voneinander Alkyl sind und X I, Cl oder Br ist.
Die Monomere sind jene, die fähig sind, eine freie Radikal-Polymerisation zu durchlaufen. Unter einem Gesichtspunkt ist das Monomer 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), welches polymerisiert wird, um ein hydroxyfunktionalisiertes Vinylpolymer-Netzwerk bereitzustellen. Eine Vielzahl von Monomeren, welche die gewünschten funktionellen Gruppen liefern, kann verwendet werden. Einige Monomere, welche diese Kriterien erfüllen, können durch die unten gezeigten generischen Strukturen dargestellt werden:
wobei R₁ Wasserstoff oder Niederalkyl ist; R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder -Y-Z sind, wobei Y Niederalkyl ist und Z Hydroxyl, Amino oder C(O)-Rist, wobei R Wasserstoff, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
Einige spezielle Beispiele von Vinylmonomeren, die in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können, sind in 5 gezeigt. Es wird erkannt, dass während die speziellen hierin offenbarten Monomere funktionelle Gruppen wie z.B. Hydroxyl-, Amino-, Carboxylgruppen bereitstellen, man polymere Bürsten herstellen kann, die zusätzliche funktionelle Gruppen wie z.B. Thiol, Cyano, Isocyanat, Thiocyanat oder Isothiocyanat bieten, indem geeignet funktionalisierte Monomere ausgewählt werden. Die Auswahl solcher geeigneten Monomere liegt innerhalb des gewöhnlichen Fachwissens.
Die resultierenden Folien zeigen eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber einer Vielzahl von Bedingungen an den makromolekularen Arrays. Solche Bedingungen beinhalten Synthese- wie auch Assay-Bedingungen.
Wie oben diskutiert können die polymere Bürste und die Silanschicht maßgeschneidert werden, um optimale Eigenschaften wie z.B. einen geeigneten Abstand der funktionellen Gruppen, eine verbesserte Benetzbarkeit und eine minimierte nichtspezifische Bindung von Makromolekülen bereitzustellen. Beispielsweise, kann die Dicke der polymeren Bürste gesteuert werden, indem die Länge der Polymerkette und die Anzahl der Oberflächeninitiatoren variiert werden. Die endgültige Dichte der funktionellen Gruppen (z.B. Amin oder Hydroxyl) an der Bürste kann einfach gesteuert werden, indem die relativen Mengen von nichtfunktionalisierten und funktionalisierten Monomeren variiert werden.
Zusätzlich kann der Abstand zwischen benachbarten Folien an der Bürste gesteuert werden, indem hier und da Polymere eingefügt werden, die Verdünnungs-Monomere umfassen. Somit ist es möglich und kann in manchen Fällen wünschenswert sein, die Dichte der polymeren Folien wie auch die funktionellen Stellen an der Bürste zu verringern. Eine funktionelle Stelle wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Anbindungsstelle auf der Polymerbürste, welche eine funktionelle Gruppe umfasst, die eine Anbindung eines Moleküls an das Polymer erlaubt. Die Oberflächendichte der Initiatorstellen kann ebenfalls variiert werden, indem das Initiatorsilanreagens mit einem nichtfunktionellen Silan wie z.B. Alkyl-SiX₃ verdünnt wird, wobei X ein Halogen oder Alkoxy ist. Die Porosität und Löslichkeit der polymeren Bürsten kann gesteuert werden, indem die Konzentrationen der Vinylmonomere, Vernetzungsmittel und Oberflächeninitiatoren in der Zusammensetzung variiert werden.
Die freie Radikal-Polymerisation wird typischerweise für eine ausreichende Zeitdauer durchgeführt, so dass die gewünschte Umwandlung erreicht wird. Die Zeitdauer, die benötigt wird, kann von der Temperatur der Polymerisation abhängen. Unter einigen Gesichtspunkten gilt, je niedriger die Temperatur, desto länger die Zeitdauer, die benötigt wird, um eine gewünschte Umwandlung zu erreichen. Typischerweise wird die Polymerisation für 1 bis 20 Stunden, vorzugsweise von 1,5 bis 10 Stunden, ins besondere von 2 to 8 Stunden und am meisten bevorzugt von 2,5 bis 6 Stunden, durchgeführt.
Das Polymer, welches durch den Prozess der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann eine Vielzahl von Molekulargewichten aufweisen. Unter einigen Gesichtspunkten kann das Molekulargewicht von der verwendeten Menge an Initiator abhängen, da die verwendete Menge an Initiator festlegen kann, wie viele Ketten initiiert werden.
Die Polymerisationsreaktionen können in einer Vielzahl von Medien, beispielsweise Suspension, Emulsion, Masse, das heißt rein oder ohne Lösungsmittel, oder in wässriger oder nichtwässriger Lösung durchgeführt werden. Wenn sie verwendet werden, umfassen geeignete Lösungsmittel aromatische Kohlenwasserstoffe wie z.B. Benzol, Toluol, Xylole, Pyridine oder andere Lösungsmittel, die vergleichsweise kleine Kettenübertragungskonstanten mit dem (den) bestimmten Monomer(en) aufweisen, die in der Polymerisation verwendet werden. Die Polymerisation kann bei Temperaturen durchgeführt werden, die von –80°C bis 80°C reichen. Der bevorzugte Bereich der Reaktionstemperatur kann von 25°C bis 70°C betragen. Jeder beliebige der bekannten Klasse von Polymerisationsinitiatoren ist geeignet, unter der Voraussetzung, dass dieser die benötigte Löslichkeit in dem Lösungsmittel oder der ausgewählten Monomermischung hat und bei der Temperatur der Polymerisation eine geeignete Halbwertszeit hat. Unter einigen Gesichtspunkten weist der Initiator eine Halbwertszeit auf, die kurz ist im Vergleich zu der Gesamtzeit, die für den Polymerisationsprozess benötigt wird. Der Prozess der Erfindung wird vorzugsweise als ein diskontinuierlicher Prozess durchgeführt, kann aber wenn nötig in irgendeinem der standardmäßigen Polymerisationsprozesse, beispielsweise in semi-diskontinuierlichen, unterdosierten (starved feed) oder kontinuierlichen Prozessen durchgeführt werden.
Die Polymerisationsreaktionen der vorliegenden Erfindung können unter einigen Gesichtspunkten durch ein Lösungsmittel oder Cosolvens ergänzt werden, um dabei zu helfen, sicherzustellen, dass die Reaktionsmischung über die gesamte Monomerumwandlung hinweg eine homogene einzelne Phase bleibt. Jedes Lösungsmittel oder Cosolvens kann ausgewählt werden, unter der Voraussetzung, dass das Lösungsmittelmedium wirksam ist, ein Lösungsmittelsystem zu erlauben, das eine Ausfällung oder Phasentrennung der Reaktanden oder Polymerprodukte vermeidet, bis schließlich alle Polymerisationsreaktionen abgeschlossen sind.
Beispielhafte Lösungsmittel oder Cosolventien beinhalten mit dem Polymerprodukt kompatible aliphatische Alkohole, Glycole, Ether, Glycolether, Pyrrolidine, N-Alkylpyrrolidinone, N-Alkylpyrrolidone, Polyethylenglycole, Polypropylenglycole, Amide, Carbonsäuren und Salze von diesen, Ester, Organosulfide, Sulfoxide, Sulfone, Alkoholderivate, Hydroxyetherderivate wie z.B. Butyl-CARBITOL^TM oder CELLOSOLVE^TM, Aminoalkohole, Ketone und Derivate von diesen und Mischungen von diesen. Wenn Mischungen von Wasser und wasserlöslichen oder -mischbaren organischen Flüssigkeiten als das Reaktionsmedium ausgewählt werden, reicht das Gewichtsverhältnis von Wasser zu Cosolvens typischerweise von 100:0 bis 10:90 und vorzugsweise von 97:3 bis 25:75.
Die Polymerisationsreaktionsgeschwindigkeit der Monomere kann beschleunigt und die Reaktionszeit verringert werden durch die Zugabe einer katalytischen Menge einer Protonensäure, die nicht ebenfalls die kationische Polymerisation initiiert. Die Protonensäure kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus organischen Säuren wie z.B. Schwefel-, Phosphor-, Carbonsäuren, Camphersulfonsäure und Nitroxiden, die funktionelle Säuregruppen enthalten, wie z.B. 3-Carboxyl-Proxyl. Geeignete Mengen können leicht anhand des gewöhnlichen Fachwissens ermittelt werden.
Der Polymerisationsprozess der vorliegenden Erfindung kann mehrere Male innerhalb desselben Reaktionsgefäßes durch die verzögerte und schrittweise Zugabe von mehr Monomer oder Monomeren bei variierenden Mengen an Initiatoren und Abbruchmitteln wiederholt werden.
Die Prozesse der vorliegenden Erfindung können ausgewählt werden, um eine große Vielzahl von Polymeren zu bilden. Weiterhin kann der Prozess der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden, um eine Mischung von zwei oder mehr unterschiedlichen polymerisierbaren Monomeren zu bilden, um daraus Copolymere zu bilden.
Wahlweise können bekannte Zusätze in den Polymerisationsreaktionen ausgewählt werden, wobei die Zusätze für Leistungsverbesserungen an dem resultierenden Produkt sorgen können. Solche Zusätze können Färbemittel, Gleitmittel, Trenn- oder Übertragungsmittel, Tenside, Stabilisatoren und Antischaummittel beinhalten.
II. Verfahren zur Herstellung Makromolekularer Arrays an Polymeren Bürstensubstraten
a) Allgemeines
Beispiele von Makromolekülen, die an polymeren Bürstensubstraten dieser Erfindung hergestellt werden können, beinhalten Nukleinsäuren und Polynukleotide, welche sowohl lineare als auch cyclische Nukleotide umfassen, Peptide, Polysaccharide, Phospholipide, Heteromakromoleküle, bei welchen ein bekanntes Arzneimittel kovalent an irgendeines der oben genannten gebunden ist, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate oder andere Makromoleküle, welche aus der Durchsicht dieser Offenbarung ersichtlich sind. Solche Makromoleküle sind "divers", wenn unterschiedliche (d.h., nichtidentische) Monomere an unterschiedlichen vordefinierten Bereichen eines Substrats verwendet werden.
Man sollte verstehen, dass jedes multifunktionalisierte polymere Bürstensubstrat verwendet werden kann, um makromolekulare Arrays dieser Erfindung herzustellen. Daher sind die polymeren Bürstensubstrate, die zu den Zwecken der Herstellung von makromolekularen Arrays ins Auge gefasst werden, nicht auf die oben beschriebenen Polyhydroxy-funktionalisierten oder Polyaminoacrylat-haltigen polymeren Bürstensubstrate beschränkt.
Die oben beschriebenen makromolekularen Arrays können an den obigen polymeren Bürstensubstraten unter Verwendung einer Anzahl von im Stand der Technik bekannter Verfahren, einschließlich der lichtgesteuerten Verfahren, Fließkanal- und Auftüpfel-Verfahren, auf Stiften basierenden Verfahren und auf Kügelchen basierenden Verfahren hergestellt werden.
b) Lichtgesteuerte Verfahren
"Lichtgesteuerte" Verfahren (welche eine Technik aus einer Familie von Verfahren sind, die als VLSIPS^TM-Verfahren bekannt sind) werden in dem U.S.-Pat. Nr. 5,143,854 beschrieben. Die lichtgesteuerten Verfahren, die in dem '854-Patent diskutiert werden, beinhalten ein Aktivieren von vordefinierten Bereichen eines Substrats oder festen Trägers und dann ein Kontaktieren des Substrats mit einer vorausgewählten Monomerlösung, welche Monomere umfasst, die mit photolabilen Schutzgruppen geschützt sind. Die vordefinierten Bereiche können mit einer Lichtquelle aktiviert werden, die typischerweise durch eine Maske hindurch gezeigt wird (ähnlich zu der Art von Photolithographie-Techniken, die bei der Fabrikation integrierter Schaltungen verwendet werden). Andere Bereiche des Substrats bleiben inaktiv, da sie durch die Maske an der Beleuchtung gehindert werden und chemisch geschützt bleiben. Somit definiert ein Lichtmuster, welche Bereiche des Substrats mit einem vorgegebenen Monomer reagieren. Durch wiederholtes Aktivieren unterschiedlicher Sätze vordefinierter Bereiche und das Kontaktieren unterschiedlicher Monomerlösungen mit dem Substrat wird ein diverser Array von Polymeren auf dem Substrat erzeugt. Natürlich können wenn nötig andere Schritte wie z.B. das Abwaschen der nichtumgesetzten Monomerlösung von dem Substrat verwendet werden.
Unter Verwendung der oben beschriebenen photolithographischen Techniken können die photolabilen Schutzgruppen in einer vorausgewählten Fläche entfernt werden, und es wird ein Monomer, das eine chemisch entfernbare Schutzgruppe trägt, angebunden. Standardmäßige, chemisch entfernbare Schutzgruppen beinhalten jene Gruppen, die im Handel erhältlich sind und von welchen bekannt ist, dass diese unter typischen chemischen Bedingungen entfernt werden können. Beispiele solcher Schutzgruppen beinhalten FMOC, DMT, BOC, t-Butylester und t-Butylether. Siehe ebenfalls parallele U.S. Provisional Anmeldung Nr. 60/146,574, eingereicht am 30. Juli 1999, und die parallele Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 08/630,148, eingereicht am 10. April 1996, für eine zusätzliche Offenbarung geeigneter Schutzgruppen.
Nach der Anbindung eines solchen geschützten Monomers wird die Schutzgruppe entfernt. Die Bedingungen für die Entfernung sind im Stand der Technik bekannt.
Siehe beispielsweise Greene et al., Protective Groups In Organic Chemistry, 2. Ausg., John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1991. Die reaktive Funktionalität, welche vorher mit der chemisch entfernbaren Schutzgruppe geschützt war, wird dann erneut mit einer photolabilen Schutzgruppe geschützt, wobei beispielsweise ein Derivat mit der Formel: R-O-C(O)-X verwendet wird, wobei R ein durch Licht abspaltbarer Anteil (z.B. o-Nitrobenzyle, Pyrenylmethyl, Ddz, verschiedene Benzoingruppen, Bromnitroindol) ist und X eine geeignete Abgangsgruppe (z.B. Cl, F, Pentafluorphenoxy, p-Nitrophenoxy, N-Succinimidyloxy, Adamantancarboxy oder Tetrazolyl) ist.
Der erneute Schutz funktioneller Oberflächengruppen mit solchen Reagenzien wird typischerweise in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, das eine nicht nukleophile Base enthält (z.B. 2,6-Lutidin, Pyridin, Triethylamin oder Diisopropylethylamin). In einigen Ausführungsformen ist ebenfalls ein nukleophiler Katalysator (z.B. N-Methylimidazol, Hydroxybenzotriazol oder 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin) eingeschlossen, um eine weitere Verbesserung der Geschwindigkeit und der Effizienz des erneuten Schutzschrittes zu liefern. Nach der Zugabe der photolabilen Schutzgruppen können die VLSIPS^TM-Zyklen fortgesetzt werden, wobei eine photolithographische Entschützung, gefolgt von einem Koppeln eines zusätzlichen Monomers, ein Ersatz der Schutzgruppe usw. verwendet werden, bis das gewünschte makromolekulare Array vollständig ist.
Unter einem Gesichtspunkt ist das erzeugte Makromolekül ein Polynukleotid. Die standardmäßige Phosphoramidit-Chemie oder H-Phosphonat-Verfahren oder andere Kopplungsverfahren, die den Fachleuten bekannt sind, können zur Monomerkopplung von Monomeren verwendet werden. Zusätzlich kann die photolabile Schutzgruppe, welche dargestellt wird (MeNPOC), durch eine andere photolabile Schutzgruppe wie z.B. NVOC oder jene photolabilen Schutzgruppen, die in den parallelen Anmeldungen, auf die oben Bezug genommen wurde, beschrieben sind, ersetzt werden. Wenn einmal die chemisch entfernbare Schutzgruppe entfernt wurde, kann eine photolabile Schutzgruppe zugefügt werden, wobei ein gemischtes Anhydrid der Schutzgruppe verwendet wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt ist das Makromolekül ein Peptid. Für die Peptidsynthese können im Handel erhältliche Aminosäuren mit chemisch entfernbaren Schutzgruppen, beispielsweise FMOC-Aminosäuren verwendet werden. Nach dem Austausch der Schutzgruppen können die Kopplungsschritte unter Verwendung einer BOP/HOBt-Aktivierung und von Kopplungsverfahren durchgeführt werden. Die Fachleute werden verstehen, dass andere Kopplungsverfahren wie auch andere Aminosäuremonomere mit chemisch entfernbaren Schutzgruppen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Unter noch einem anderen Gesichtspunkt werden alle vorausgewählten Flächen mit einem ersten Monomer derivatisiert, wobei jedes der Monomere eine chemisch entfernbare Schutzgruppe aufweist. Nach der Zugabe des ersten Monomers zu jedem der vorausgewählten Bereiche werden die Schutzgruppen alle in einem einzigen Schritt entfernt, wobei eine chemische Entschützung in Form einer Wäsche über den festen Träger hinweg verwendet wird. Alternativ kann ebenfalls eine Entschützung in der Dampfphase verwendet werden. Siehe die U.S.-Patente Nr. 5,599,695 und 5,831,070. Ein erneuter Schutz von jedem der wachsenden Makromoleküle mit einer photolabilen Schutzgruppe wird dann in der Form einer weiteren Wäsche über den gesamten festen Träger hinweg durchgeführt. Nach diesem erneuten Schutz kann mit photolithographischen Techniken der Makromolekülsynthese fortgefahren werden, wobei Monomere mit chemisch entfernbaren Schutzgruppen verwendet werden.
c) Fließkanal- oder Auftüpfel-Verfahren
Zusätzliche Verfahren, die auf die Arraysynthese an einem einzelnen Substrat anwendbar sind, werden in den U.S.-Patenten Nr. 5,677,195 und 5,384,261 beschrieben. Bei den Verfahren, die in diesen Anmeldungen offenbart sind, werden die Reagenzien durch entweder (1) Fließen lassen innerhalb eines Kanals, der auf vordefinierten Bereichen definiert wurde, oder (2) "Auftüpfeln" auf vordefinierte Bereiche zu dem Substrat befördert. Jedoch können andere Ansätze wie auch Kombinationen von Auftüpfeln und Fließen lassen eingesetzt werden. In jedem Fall werden gewisse aktivierte Bereiche des Substrats mechanisch von anderen Bereichen getrennt, wenn die Monomerlösungen zu den verschiedenen Reaktionsstellen befördert werden.
Ein typisches "Fließkanal"-Verfahren, das auf die vorliegende Erfindung angewendet wird, kann im Allgemeinen wie folgt beschrieben werden. Diverse Makromoleküle werden an ausgewählten Bereichen eines Substrats oder festen Trägers synthetisiert, indem Fließkanäle auf einer Oberfläche des Substrats gebildet werden, durch welche geeignete Reagenzien fließen gelassen oder in welchen geeignete Reagenzien angeordnet werden. Man nehme beispielsweise an, dass ein Monomer "A" in einer ersten Gruppe von ausgewählten Bereichen an das Substrat gebunden werden soll. Wenn nötig wird die gesamte oder ein Teil der Oberfläche des Substrats in allen oder einem Teil der ausgewählten Bereiche zur Bindung aktiviert, indem beispielsweise geeignete Reagenzien durch alle oder einige der Kanäle fließen gelassen werden oder indem das gesamte Substrat mit geeigneten Reagenzien gewaschen wird. Nach der Anordnung eines Kanalblocks auf der Oberfläche des Substrats fließt ein Reagenz, welches das Monomer A aufweist, durch den Kanal (die Kanäle) oder wird in einem oder einigen von diesen angeordnet. Die Kanäle sorgen für einen Fließkontakt mit den ersten ausgewählten Bereichen, wodurch das Monomer A direkt oder indirekt (über einen Abstandhalter) in den ersten ausgewählten Bereichen gebunden wird.
Danach wird ein Monomer B an die zweiten ausgewählten Bereiche gekoppelt, von denen einige von den ersten ausgewählten Bereichen umfasst sein können. Die zweiten ausgewählten Bereiche werden sich durch Translation, Rotation oder Ersatz des Kanalblocks auf der Oberfläche des Substrats; durch Öffnen oder Schließen eines ausgewählten Ventils; oder durch Abscheidung einer Schicht einer Chemikalie oder eines Photoresists in Fließkontakt mit einem zweiten Fließkanal (Fließkanälen) befinden. Wenn nötig wird ein Schritt ausgeführt, um wenigstens die zweiten Bereiche zu aktivieren. Danach wird das Monomer B durch den zweiten Fließkanal (die zweiten Fließkanäle) fließen gelassen oder in diesem (diesen) angeordnet, wodurch das Monomer B an die zweiten ausgewählten Orte gebunden wird. In diesem bestimmten Beispiel werden die resultierenden Sequenzen, die in diesem Stadium der Verarbeitung an das Substrat gebunden sind, beispielsweise A, B und AB sein.
Der Prozess wird wiederholt, um ein ausgedehntes Array von Sequenzen gewünschter Länge an bekannten Orten auf dem Substrat zu bilden.
Nachdem das Substrat aktiviert wurde, kann das Monomer A durch einige der Kanäle fließen gelassen werden, Monomer B kann durch andere Kanäle fließen gelassen werden, ein Monomer C kann durch noch andere Kanäle fließen gelassen werden. Auf diese Weise werden viele oder alle der Reaktionsbereiche mit einem Monomer umgesetzt, bevor der Kanalblock bewegt werden muss oder das Substrat gewaschen und/oder reaktiviert werden muss. Indem man viele oder alle der verfügbaren Reaktionsbereiche gleichzeitig benutzt, kann die Anzahl der Wasch- und Aktivierungsschritte minimiert werden.
Ein Fachmann wird erkennen, dass es alternative Verfahren zur Bildung von Kanälen oder um anderweitig einen Teil der Oberfläche des Substrats zu schützen gibt. Beispielsweise wird gemäß einigen Ausführungsformen eine schützende Beschichtung wie beispielsweise eine hydrophile oder hydrophobe Beschichtung (was von der Natur des Lösungsmittels abhängt) über Teilen des Substrats, die geschützt werden sollen, manchmal in Kombination mit Materialien, die eine Benetzung durch die Reaktandenlösung in anderen Bereichen erleichtern, benutzt. Auf diese Weise werden die fließenden Lösungen weiterhin daran gehindert, außerhalb ihrer beabsichtigten Fließwege zu fließen.
Die "Auftüpfel"-Verfahren der Herstellung von Verbindungen und Bibliotheken der vorliegenden Erfindung können in sehr ähnlicher Weise wie die Fließkanalverfahren implementiert werden. Beispielsweise kann ein Monomer A zu einer ersten Gruppe von Reaktionsbereichen, welche geeignet aktiviert wurden, befördert werden und damit gekoppelt werden. Danach kann ein Monomer B zu einer zweiten Gruppe von aktivierten Reaktionsbereichen befördert werden und damit umgesetzt werden. Anders als bei den oben beschriebenen Fließkanalausführungsformen werden die Reaktanden befördert, indem direkt relativ kleine Mengen von diesen in ausgewählten Bereichen abgeschieden (statt fließen gelassen) werden. Bei einigen Schritten kann natürlich die gesamte Substratoberfläche mit einer Lösung besprüht oder anderweitig beschichtet werden. In bevorzugten Ausführungsformen bewegt sich ein Spender von Bereich zu Bereich, der bei jedem Stopp nur so viel Monomer abschei det wie nötig ist. Typische Spender umfassen eine Mikropipette, um die Monomerlösung zu dem Substrat zu befördern, und ein Robotersystem, um die Position der Mikropipette bezogen auf das Substrat zu steuern, oder einen Tintenstrahldrucker. Bei anderen Ausführungsformen umfasst der Spender eine Reihe von Röhren, einen Verteiler, eine Anordnung von Pipetten, so dass verschiedene Reagenzien gleichzeitig zu den Reaktionsbereichen befördert werden können.
d) Auf Stiften basierende Verfahren
Auf Stiften basierende Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Arrays werden im Detail in dem U.S.-Pat. Nr. 5,288,514 beschrieben. Das Verfahren benutzt ein Substrat mit einer Vielzahl von Stiften oder anderen Erstreckungen. Die Stifte werden jeweils gleichzeitig in einzelne Reagenzbehälter in einer flachen Schale eingeführt. Bei einer üblichen Ausführungsform wird ein Array von 96 Stiften/Behältern benutzt.
Jede flache Schale ist mit einem bestimmten Reagenz zum Koppeln in einer bestimmten chemischen Reaktion an einem einzelnen Stift gefüllt. Dementsprechend werden die flachen Schalen oft unterschiedliche Reagenzien enthalten. Da die hierin offenbarte Chemie derart eingerichtet wurde, dass ein relativ ähnlicher Satz von Reaktionsbedingungen benutzt werden kann, um jede der Reaktionen durchzuführen, wird es möglich, mehrere chemische Kopplungsschritte gleichzeitig durchzuführen. In dem ersten Schritt des Prozesses sorgt die Erfindung für die Verwendung des Substrats (der Substrate), an welchem (welchen) die chemischen Kopplungsschritte durchgeführt werden. Das Substrat ist gegebenenfalls mit einem Abstandhalter versehen, der aktive Stellen aufweist. In dem besonderen Fall von Polynukleotiden kann der Abstandhalter beispielsweise aus einer großen Vielzahl von Molekülen ausgewählt werden, welche in organischen Umgebungen, die mit der Synthese zusammenhängen, wie auch wässrigen Umgebungen, die mit Bindungsstudien zusammenhängen, verwendet werden können.
Beispiele für geeignete Abstandhalter sind Polyethylenglycole, Dicarbonsäuren, Polyamine und Alkylene, die beispielsweise mit Methoxy- und Ethoxygruppen substituiert sind. Zusätzlich werden die Abstandhalter eine aktive Stelle an dem distalen Ende aufweisen. Die aktiven Stellen sind gegebenenfalls anfangs durch Schutzgrup pen geschützt. Zu einer großen Vielzahl von Schutzgruppen, die nützlich sind, gehören FMOC, BOC, t-Butylester und t-Butylether. Verschiedene beispielhafte Schutzgruppen werden beispielsweise in Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press (1989) beschrieben. Unter einigen Gesichtspunkten kann der Abstandhalter eine mittels beispielsweise einer Exposition an eine Säure oder Base spaltbare Funktion bereitstellen.
e) Auf Kügelchen basierende Verfahren
Ein allgemeiner Ansatz für die auf Kügelchen basierende Synthese wird in dem U.S.-Patent Nr. 5,384,261 beschrieben. Für die Synthese von Molekülen wie z.B. Polynukleotiden an Kügelchen wird eine große Vielzahl von Kügelchen in einem geeigneten Träger (wie z.B. Wasser) in einem Behälter suspendiert. Die Kügelchen werden mit fakultativen Abstandhaltermolekülen, die eine aktive Stelle aufweisen, bereitgestellt. Die aktive Stelle ist durch eine fakultative Schutzgruppe geschützt.
In einem ersten Schritt der Synthese werden die Kügelchen zur Kopplung in eine Vielzahl von Behältern verteilt. Zu den Zwecken dieser kurzen Beschreibung wird die Anzahl der Behälter auf drei begrenzt und werden die Monomere als A, B, C, D, E und F bezeichnet. Die Schutzgruppen werden dann entfernt, und ein erster Teil des zu synthetisierenden Moleküls wird zu jedem der drei Behälter zugegeben (d.h., A wird zu Behälter 1 zugegeben, B wird zu Behälter 2 zugegeben und C wird zu Behälter 3 zugegeben).
Danach werden überschüssige Reagenzien von den verschiedenen Kügelchen geeignet abgewaschen und diese erneut in einem Behälter gemischt. Wieder wird man erkennen, dass auf Grund der großen Anzahl an Kügelchen, die zu Beginn benutzt wurden, es in ähnlicher Weise eine große Anzahl von Kügelchen geben wird, die zufällig in dem Behälter dispergiert sind, von denen jedes einen bestimmten ersten Teil des zu synthetisierenden Monomers auf einer Oberfläche von diesem aufweist.
Danach werden die verschiedenen Kügelchen wieder zum Koppeln in eine andere Gruppe von drei Behältern verteilt. Die Kügelchen in dem ersten Behälter werden entschützt und an ein zweites Monomer (D) exponiert, während die Kügelchen in dem zweiten und dritten Behälter an die Molekülteile E bzw. F gekoppelt werden. Dementsprechend werden Moleküle AD, BD und CD in dem ersten Behälter vorliegen, während AE, BE und CE in dem zweiten Behälter vorliegen werden und die Moleküle AF, BF und CF in dem dritten Behälter vorliegen werden. Jedes Kügelchen wird jedoch nur einen einzigen Typ Molekül auf seiner Oberfläche aufweisen. Somit wurden alle möglichen Moleküle, die aus den ersten Teilen A, B, C und den zweiten Teilen D, E und F gebildet werden können, gebildet.
Die Kügelchen werden dann in einem Behälter rekombiniert, und zusätzliche Schritte wie z.B. werden durchgeführt, um die Synthese der Polymermoleküle abzuschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kügelchen mit einem Identifikationslabel markiert, welches für das bestimmte doppelsträngige Oligonukleotid oder die Sonde einmalig ist, welche auf jedem Kügelchen vorliegt. Eine vollständige Beschreibung von Identifikationslabeln zur Verwendung in synthetischen Bibliotheken wird in dem U.S.-Patent Nr. 5,639,603 angegeben.
ANWENDUNGEN
Das Aufkommen von Verfahren für die Synthese diverser Moleküle an festen Trägern hat zu der Entstehung einer Mehrzahl von diagnostischen Anwendungen für solche Arrays geführt. Eine Anzahl dieser diagnostischen Anwendungen beinhaltet das Kontaktieren einer Probe mit einem festen Träger oder Chip, der eine Mehrzahl angebundener biologischer Makromoleküle wie z.B. Peptide und Polynukleotide, oder andere kleine Ligandenmoleküle, die schrittweise aus Baueinheiten synthetisiert wurden, aufweist, um jede Spezies zu identifizieren, die spezifisch an ein oder mehrere der angebundenen Polymere oder kleinen Ligandenmoleküle bindet.
Verfahren zur Erzeugung von Arrays von Polynukleotidsonden, die verwendet werden können, um die vollständige Sequenz einer Zielnukleinsäure bereitzustellen und das Vorliegen einer Nukleinsäure, die eine spezifische Polynukleotidsequenz enthält, nachzuweisen, wurden beschrieben. Das U.S.-Patent Nr. 5,556,752 beschreibt Verfahren zur Erzeugung von Arrays von unimolekularen, doppelsträngigen Polynukleotiden, welche in diagnostischen Anwendungen verwendet werden können, die Wech selwirkungen der Bindung von Protein/DNA beinhalten wie z.B. jene, die mit dem p53-Protein und den Genen, die zu einer Anzahl von Krebserkrankungen beitragen, zusammenhängen. Arrays von doppelsträngigen Polynukleotiden können ebenfalls verwendet werden, um auf neue Arzneimittel mit besonderen Bindungsaffinitäten zu screenen. Vor Kurzem sind vollständige n-mer-Arraysonden mit einem großen allgemeinen Anwendungsbereich beschrieben worden. Siehe U.S. Provisional Anmeldung Nr. 60/100,393, eingereicht am 15. September 1998; und U.S. Aktenzeichen Nr. 09/394,230, eingereicht am 13. September 1999.
Den Fachleuten wird klar sein, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in jedem der oben angegebenen Prozesse zur Festphasensynthese von Arrays biologischer Polymere und kleiner Moleküle wie auch in jedem der oben angegebenen Assay-Verfahren Anwendung finden werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden nur zu Zwecken der Veranschaulichung angegeben und sollen weder dazu dienen, die Erfindung zu beschränken noch zu definieren.
Beispiel 1: Herstellung von Polymeren Bürsten
Natronkalkglas- oder Silicium (100)-Substrate werden mit Piranha-Lösung (30% Wasserstoffperoxid und 70% Schwefelsäure) bei 90°C für 30 Minuten gereinigt, mit einer reichlichen Menge an entionisiertem Wasser gewaschen und mit einem Strom von N₂ getrocknet. Das gereinigte Substrat wird dann mit Azobis(pentanamidpropyltriethoxysilan), bekannt als AIBN-APS, dessen Struktur und Herstellung in 2 gezeigt werden, silanisiert. Siehe Japanisches Patent H1-234479; und Japanisches Patent H3-99702. Das Verfahren besteht aus dem Eintauchen des Glas- oder Siliciumdioxidsubstrats für mehrere Stunden in eine 1 % AIBN-APS-Lösung in Toluol. Nach der Reaktion wird das Substrat mit frischem Toluol gewaschen und mit einem Strom von N₂ getrocknet. Der Reaktionsfortschritt der Silanierung auf Siliciumdioxid kann durch ellipsometrische Dickenmessungen überwacht werden.
Das mit AIBN-APS silanisierte Substrat wird einer Radikal-Polymerisation unterzogen. Das Substrat wird in eine 25–50% Lösung von 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) in entgastem DMF für verschiedene Reaktionszeiten und -temperaturen eingetaucht. Bei einer Reaktionstemperatur von 70°C dissoziiert das Oberflächen-AIBN-Molekül in zwei Radikale, welche die Polymerisation initiieren, um ein hydroxylfunktionalisiertes Methacrylatpolymer zu bilden. Die Substrate werden dann gründlich mit DMF und Wasser gewaschen und gründlich getrocknet. Die resultierende Foliendicke auf Silicium wird durch Ellipsometrie oder AFM (Rasterkraftmikroskopie) überwacht. Beispielsweise wird nach einer 24-stündigen Polymerisation ein Bereich mit 5–30 nm dicker pHEMA-Folie erhalten.
Zusätzliche Details zur Herstellung polymerer Bürsten sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise die U.S.-Patente Nr. 5,852,129, 5,728,747, 5,807,937, 5,708,102 und 5,677,388. Siehe ebenfalls Chang und Frank, Langmuir, 12: 5824–29 (1996); Chang und Frank, Langmuir, 14: 326–334 (1998); Prucker und Ruhe, supra; Japanisches Patent H1-234479; und Japanisches Patent H3-99702.
Beispiel 2: Herstellung eines Polynukleotid-Arrays auf Polymeren Bürsten
Es wurde eine 5 nm dicke pHEMA-Folie auf einem Glassubstrat verwendet. Fluorescein-Moleküle werden durch Standardprozeduren, wie sie beispielsweise in der PCT/US00/09206 beschrieben werden, an die Oberfläche angebunden. Ein repräsentatives silaniertes Kontrollsubstrat, flaches Natronkalkglas, das mit Bis(2-hydroxyethyl)-3-aminopropyltriethoxysilan silaniert war, und das pHEMA-modifizierte Glas wurden verglichen.
Fluoroprime-Färbungsassay
Quantitative Untersuchungen der Synthese, Dichte und Gleichförmigkeit von Siliciumdioxidsubstraten wurden durchgeführt, wobei Verfahren verwendet wurden, die auf einer Oberflächenfluoreszenz basieren, wie in McGall el al.; J. Am. Chem. Soc.: 119: 5081–5090 (1997) beschrieben wird. Eine Fluorezenz-"Färbung" der Oberfläche wurde wie beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine Fluorescein-Konzentration von 0,5 mM in einer Lösung, die 50 mM DMT-T-CEP in Acetonitril enthielt, verwendet wurde. Das Fluorescein-Phosphoramidit wird mit der Standardvorschrift an die freien Hydroxylgruppen gekoppelt. Die Substrate werden dann für ein Minimum von einer Stunde in einer 1:1-Lösung von Ethylendiamin/Ethanol entschützt, mit entionisiertem Wasser gespült und mit trockenem Stickstoff trocken geblasen. Das Substrat wird dann unter Verwendung von Konfokalmikroskopie gescannt. Das erhaltene Signal ist eine Funktion der Anzahl an verfügbaren Hydroxylgruppen auf der Oberfläche. In diesem Fall sind die relativen Werte im Vergleich mit anderen Typen von ähnlich behandeltem Glas ein Anzeichen für die relative Dichte und Kapazität der Oberfläche. Diese Technik liefert ebenfalls ein visuelles Bild der Oberfläche in Bezug auf die Qualität und Gleichförmigkeit der Oberfläche. Die Technik ist nicht auf Hydroxylgruppen beschränkt, sondern kann modifiziert werden, um andere Gruppen von Interesse für den Träger des Polymers von Interesse auf der Oberfläche zu messen, indem das geeignet funktionalisierte Molekül zur Detektion verwendet wird.
Die pHEMA-Folie wies einen viel höheren Hydroxylgehalt/Einheitsfläche des Substrats auf, wie durch eine Fluoreszenzfärbungsanalyse nachgewiesen wurde. Wie in 7 gezeigt wird, war die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von dem mit Fluorescein gefärbten Streifen auf dem pHEMA-modifizierten Glas anfangs wenigstens 60-mal höher als die BIS-Silan-Kontrolle, und diese steigt auf ein > 300-fach höheres Verhältnis nach einem Zeitraum von 40 Stunden in 6x-SSPE-Puffer bei 25°C. Dieser Anstieg beruht hauptsächlich auf einem Verlust der Fluoreszenzintensität auf dem Kontrollsubstrat aufgrund der bekannten Hydrolyse der "Bis"-Silangebundenen Phase in wässrigen Phosphatpuffern. Es scheint dann, dass die pHEMA-Folie stabiler gegenüber einem hydrolytischen Abbau ist als die silanierte Schicht.
HPLC-Quantifizierungsassay
Der HPLC-Quantifizierungsassay wird im Wesentlichen wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,843,655 beschrieben durchgeführt. HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie)-Analysen werden auf einer Beckman System Gold Ionenaustauschersäule unter Verwendung einer Fluoreszenzdetektion bei 520 nm durchgeführt. Die Elution wird mit einem linearen Gradienten von 0,4 M NaClO₄ in 20 mM Tris pH 8 bei einer Fließ geschwindigkeit von 1 mL/min oder mit einem anderen geeigneten Puffersystem durchgeführt. Der HPLC-Quantifizierungsassay wird verwendet, um die Dichte der Stellen, die zur Generierung von Polymeren verfügbar sind, und die Kopplungseffizienz jeder nachfolgenden Zugabe von Monomer zu der wachsenden Kette zu messen.
Bei dieser Technik waren an der Oberfläche ein spaltbarer Sulfon-Linker (5'-Phosphat-ON-Reagens, ChemGenes Corporation), ein Abstandhaltermolekül ("C3", ein Abstandhalter-Phosphoramidit mit drei Kohlenstoffen von Glen Research) und ein Fluorophor (5-Carboxyfluorescein-CX-CED-Phosphoramidit von BioGenex) angebunden. Der Zweck des Abstandhaltermoleküls ist es, zwischen fluoreszierenden Molekülen, die an die beabsichtigten Synthesestellen angebunden wurden, gegenüber denen, die ohne chemische Anbindung auf der Oberfläche verblieben sind, zu unterscheiden. Die Synthese wurde auf den Oberflächen ebenfalls erreicht, indem eine traditionelle auf Säure basierende Polynukleotidchemie (Tritylchemie) verwendet wurde. Eine ähnliche Chemie kann für die Synthese von Polynukleotid, Peptid, Oligosacchariden, Peptidnukleinsäuren und anderen Polymeren angewendet werden. Die Beschreibung in Bezug auf die Peptidnukleinsäuren kann man in der PCT-Schrift WO92/20702, veröffentlicht am 26.11.1992, finden.
Nach der Synthese wird die Oberfläche mit einem bekannten Lösungsvolumen an Reagenz behandelt, das notwendig ist, um den Linker zu spalten, um 3'-C₃-Fluorescein-5' freizusetzen, und dieses wird typischerweise in Lösung über Nacht gespalten (1:1 pro Volumen Ethylendiamin/Wasser). Die resultierende Lösung wird verdünnt und zusammen mit einem internen Standard eingespritzt und durch HPLC analysiert. Der interne Standard ist eine 3'-C₃-C₃-Fluorescein-5'-Kette, die separat auf einem ABI-Synthesegerät hergestellt wurde. Die Konzentration wird durch UV-Vis-Spektren auf einem Varian Cary 3E-Spektrophotometer (Varian) bestimmt. Die Integration von HPLC-Peakflächen kann verwendet werden, um die Dichte der Stellen insgesamt und die Sauberkeit der Kopplung zu bestimmen.
Die silanisierten Kontrollsubstrate wiesen eine Dichte der Hydroxylgruppen von 110 pmol/cm² auf, wogegen das pHEMA-modifizierte Glas eine Dichte der Hydroxylgrup pen von 11.800 aufwies. Somit beinhaltete das pHEMA-modifizierte Glas 107mal mehr Hydroxyle pro Einheitsfläche.
Beispiel 3: Hybridisierungsassay an Arrays von Polynukleotiden auf Polymeren Bürsten
Der Polynukleotidarray auf polymeren Bürsten beinhaltete Polynukleotide, die an ein pHEMA-beschichtetes Glassubstrat, das wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt wurde, angebunden waren.
Sonden mit voller Länge, die zur Hybridisierung fähig sind, typischerweise 20-mer-Sonden, wurden synthetisiert, indem Synthesegeräte von Affymetrix wie in dem Patent 5,405,783 beschrieben verwendet wurden, wobei Nukleosidphosphoramidite, die mit 5'- photolabilen McNPOC-Schutzgruppen ausgestattet waren, verwendet wurden. Die verwendete Sequenz war eine 20-mer-Sonde wie z.B. (3')-AGG TCT TCT GGT CTC CTT TA-(5'), wobei das 3'-Ende an der Oberfläche angebunden war. Die nicht photolabilen Schutzgruppen wurden nach der Synthese in 1:1 Ethylendiamin/Ethanol (v/v) für ein Minimum von 4 Stunden entfernt.
Hybridisierungsassays wurden auf Glasobjektträgern ohne eine weitere Verarbeitung durchgeführt. Jeder Objektträger wurde unter leichtem Rühren in 10–15 ml 10–50 nM Ziel-Oligonukleotid in Hybridisierungspuffer gegeben. Die zwei verwendeten Hybridisierungspuffer sind 6x SSPE. Die Zielsequenz ist das exakte Komplementäre zu der Sondensequenz wie z.B.: (5')-Fluorophor-TCC AGA AGA CCA GAG GAA AT.
Das Muster und die Intensität der Oberflächenfluoreszenz wurden mit einem speziell konstruierten Scanninglaser-Konfokalfluoreszenzmikroskop abgebildet. Wenn nötig wurde die Photonenmultiplierröhrenverstärkung eingestellt, um die Signale innerhalb des Bereichs für den Detektor zu halten.
Der Polynukleotidarray auf der polymeren Bürste wurde für eine Stunde bis zu mehreren Stunden bei verschiedenen Temperaturen mit dem Kontrolloligonukleotid (10 nM in 6X SSPE) hybridisiert. Standardhybridisierungsvorschriften wurden verwendet, wie beispielsweise in der PCT/US00/09206 beschrieben wird. Jede entsprechende Hybridisierungsvorschrift, die im Stand der Technik bekannt ist, kann ebenfalls eingesetzt werden.
In Bezug auf die Hybridisierungscharakteristika ergibt die Synthese an der pHEMA-Folie ebenfalls eine sehr viel höhere Oberflächenkonzentration an Sonden, und dieses führt zu wesentlich höheren Hybridisierungssignalen. 8 zeigt das Hybridisierungssignalverhältnis, das sich in 40 Stunden entwickelte. Das Intensitätsverhältnis, anfangs ~5x höher als die Kontrolle, steigt auf ~9mal höher nach einem Zeitraum der Hybridisierung von 40 Stunden. Das Hybridisierungssignal steigt weiterhin auf der Folie mit der Zeit an, wogegen das silanierte Substrat bereits zu dem Zeitpunkt von 1 Stunde gesättigt ist. Offensichtlich kann, während die pHEMA-Folie zweifellos einen viel höheren Oberflächenhydroxylgehalt und Kapazität zur Bindung von Zielmolekülen aufweist, die Kinetik der Bindung etwas langsamer sein. Dieses wäre das erwartete Ergebnis von dem Zusammendrängen der Sonden auf der vollständig hydroxylierten Polymer-"Bürste", was zu einer beträchtlichen Unzugänglichkeit der Sonden führt.
Es ist wahrscheinlich, dass eine niedrigere Hydroxylkonzentration optimaler ist, da ein größerer Abstand zwischen den Sonden deren Zugänglichkeit für Zielmoleküle in Lösung verbessert. Eine Verdünnung der Sondenkonzentration in der Folie kann erreicht werden, indem die Polymerisation mit einer Mischung von funktionellen und nichtfunktionellen Monomeren durchgeführt wird, um ein Copolymer mit funktionellen Gruppen zu bilden, die entlang der Ketten einen größeren Abstand aufweisen. Man stellt sich vor, dass solche "verdünnten" funktionalisierten polymeren Bürstensubstrate für eine optimale Dichte der Sonden sorgen (welche immer noch vergleichbar ist mit oder größer ist als die, die auf traditionellen Substraten erhältlich ist), während sie für ein vergleichbares oder größeres Signal sorgen.
Nach ungefähr 40 Stunden Hybridisierung wurde die Temperatur auf 45°C angehoben, was zu einer raschen Abnahme der Signale für sowohl die Kontrolle als auch die pHEMA-modifizierten Substrate führte. Dieses beruht auf der Dissoziation der gebunden Zielmoleküle von den Oberflächensonden, wenn der Duplex mit steigender Temperatur destabilisiert wird. Jedoch gibt es keine beobachtbare Abnahme bei dem Signalverhältnis der pHEMA-Probe zu dem Kontrollsubstrat, was nahe legt, dass die Hybridisierungsaffinitäten der Oligonukleotidsonden an beiden Substraten gleichwertig sind.
Bei einem anderen experimentellen Lauf, bei einer Hybridisierung auf einem Substrat, das wie in Beispiel 1 erzeugt wurde, war die Hybridisierung in SSPE (Natriumchlorid, Natriumphosphat, EDTA)-Puffer bei 25°C nach 1 Std. 2,3x höher als bei der Kontrolle. Nach 45°C für 16 Stunden stieg die Intensität 135fach höher als bei dem Standard.
Die obige Beschreibung ist veranschaulichend und nicht beschränkend. Viele Variationen der Erfindung werden für die Fachleute bei der Durchsicht dieser Offenbarung deutlich werden. Lediglich als Beispiel kann eine Vielzahl von Substraten, Polymeren, Initiatoren, Syntheseinitiationsstellen und anderen Materialien verwendet werden, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines makromolekularen Arrays, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Bereitstellung eines Substrats, an das ein oder mehr Initiatoren freier Radikale kovalent angebunden sind, wobei jeder Initiator freier Radikale eine Radikal-Erzeugungsstelle distal zu dem Substrat aufweist; (b) Kontaktieren des kovalent angebundenen Substrats mit Monomeren unter Bedingungen, die eine lebende freie Radikal-Polymerisierung von den Radikal-Erzeugungsstellen der Initiatoren zur Bildung einer polymeren Bürste unterstützen und (c) kovalente Anbindung einer Vielzahl von Makromolekülen an die polymere Bürste.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat Glas oder Siliciumdioxid umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Monomere eine Vinylgruppe umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Monomere mindestens zwei unterschiedliche Monomere beinhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Monomere unabhängig die folgende Struktur aufweisen:
wobei R₁ Wasserstoff oder Niederalkyl ist und wobei R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Hydroxyalkyl, Polyalkylenoxid oder -Y-Z sind, wobei Y ein lineares oder verzweigtes Niederalkyl, Aryl, Alkylaryl oder Polyalkylenoxid ist und Z ist Wasserstoff, Hydroxyl, Alkoxy, Carboxy, Amino, Hydrazino, Sulfhydryl oder C(O)-R, wobei R Wasserstoff, Hydroxy, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die auf dem Träger gebildete Poylmerbürste Hydroxyl, Amino, Carboxyl oder Sulhydrylgrupen oder ein Kombination daraus umfasst:
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Monomere Vinylacetat umfassen.
Verfahren zur Anhaftung von funktionellen Stellen an eine Oberfläche eines festen Substrats, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Bereitstellung eines Substrats, an das ein oder mehr Initiatoren freier Radikale kovalent angebunden (ist) sind, wobei jeder Initiator eines freien Radikals eine Radikal-Erzeugungsstelle distal zu dem Substrat aufweist; (b) Kontaktieren des Substrats mit einer Mischung aus Bindungs-Monomeren und Verdünnungs-Monomeren unter Bedingungen, die die lebende freie Radikal-Polymerisierung von den Radikal-Erzeugungsstellen der Initiatoren unterstützen um ein Bürsten-Polymer, umfassend funktionelle Stellen zu erzeugen, wobei die Dichte der funktionellen Stellen durch das Verhältnis von funktionellen Monomeren zu Verdünnungs-Monomeren bestimmt wird; und (c) kovalente Anbindung einer Vielzahl von Makromolekülen an die polymere Bürste.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Bindungs-Monomere eine Vinylgruppe umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Bindungs-Monomere mindestens zwei unterschiedliche Bindungsmonomere umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Initiator ein Initiator vom Azo-Typ ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die funktionellen Stellen aus der Gruppe gewählt werden, bestehend aus Amino, Hydroxyl, Carboxyl oder Sulhydryl.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Verhältnis von Bindungs-Monomeren zu Verdünnungsmonomeren 1:2 bis 1:200 beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Verhältnis von Bindungs-Monomeren zu Verdünnungs-Monomeren 1:2 bis 1:2000 beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Monomere unabhängig die folgende Struktur aufweisen:
wobei R₁ Wasserstoff oder Niederalkyl ist und wobei R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Hydroxyalkyl, Polyalkylenoxid oder -Y-Z sind, wobei Y ein lineares oder verzweigtes Niederalkyl, Aryl, Alkylaryl oder Polyalkylenoxid ist und Z ist Wasserstoff, Hydroxyl, Alkoxy, Carboxy, Amino, Hydrazino, Sulfhydryl oder C(O)-R, wobei R Wasserstoff, Hydroxy, Niederalkoxy oder Aryloxy ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Substrat Glas oder Siliciumdioxid umfasst.