KR20040055442A - 중합 반응을 이용하여 복제된 핵산 마이크로어레이 및이의 제작 방법 - Google Patents

중합 반응을 이용하여 복제된 핵산 마이크로어레이 및이의 제작 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중합 반응을 이용하여 복제된 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray) 및 그의 제작 방법에 관한 것으로, 핵산 분자를 2 차원 상으로 배열시킨 핵산 마이크로어레이를 원판으로 하여, 여기에 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기 서열을 가지며 중합 반응기를 갖는 핵산 조각을 혼성화시키고, 혼성화된 핵산 조각을 원판 상에서의 위치정보를 유지시킨 상태에서 중합 반응에 의하여 새 기판에 이동시킴으로써, 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작하는 방법 및 이와 같이 제작된 핵산 마이크로어레이에 관한 것이다.

Description

중합 반응을 이용하여 복제된 핵산 마이크로어레이 및 이의 제작 방법{NUCLEIC ACID MICROARRAY REPRODUCED BY USING POLYMERIZATION REACTION AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 중합 반응을 이용하여 복제된 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray) 및 그의 제작 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 수용액 내에서 이온 결합, 수소결합, 반데르발스(van der Waals) 결합 등의 비공유 결합의 세기는 공유 결합에 비하여 1/30 내지 1/300 정도 약하여 안정한 결합을 이루기 힘들지만, 거대 분자의 경우에는, 결합 자리의 수가 많아져서 상온에서도 안정한 결합을 유지할 수 있다. 이러한 비공유 결합은 특정 분자가 다른 분자를 매우 선택적으로 인지할 수 있도록 도와준다. 이와 같이, 다른 분자를 선택적으로 인지하는 특정 분자를 넓은 의미에서 수용체(receptor)라고 정의할 수 있는데, 그 예로서, 세포 표면에서 세포막 안으로 신호를 전달하는 막 단백질(membrane protein), DNA 또는 RNA의 특정 서열을 인지하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 면역작용에 관여하는 항체, 및 대사물질을 가수분해하는 효소 등을 들 수 있다. 이와 같은 수용체와 선택적으로 결합하는 물질을 리간드(ligand)라고 한다.
1975년 DNA의 분자 인지 능력을 이용하여 특정한 염기 서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법인 서던 블라팅(Southern blotting)이 에드윈 서던(Edwin Southern)에 의하여 개발되었다. 이 방법에 따르면, 전기 영동에 의하여 크기에 따라 분리된 DNA 조각을 니트로셀룰로오스 또는 나일론 멤브레인과 같은 고체 기판 상에 이동시켜 DNA 조각들을 크기에 따라 상대적으로 위치시킨다. 그리고 나서, 고체 상에 고정된 DNA 조각에 방사선 동위원소로 표지된 관찰하고자 하는 염기서열을 갖는 DNA 또는 RNA 프로브(probe)를 넣은 후, 혼성화(hybridization)를 통하여 상기 프로브가 상보적으로 결합을 할 수 있는 DNA 조각에 결합하게 하여, 찾고자 하는 염기서열을 가진 DNA, 즉 전기영동으로 분리된 DNA 조각의 크기(위치)를 알 수 있게 된다.
이 방법을 응용하여 RNA를 분석하는 노던 블라팅(Northern blotting), 단백질을 분석하는 웨스턴 블라팅(Western blotting)이 개발되었는데, 그 원리는 크게 다르지 않다. 이러한 수용체와 리간드의 결합을 이용한 많은 분석방법들은 생물학 연구나 의료진단, 신약탐색, 법의학 등 많은 분야에 사용되고 있는데, 이들은 대부분 제한된 수의 수용체와 리간드에 대한 것이다. 핵산의 예를 들면, 4 가지 염기를 가지고 10 개 염기의 순차적 서열로 구성된 DNA를 만들 경우, 가능한 분자의 종류가 1,000,000개 이상이 될 정도로 매우 다양한 구조를 갖고 있다. 그러므로, DNA과 DNA 또는 RNA의 결합반응에 대한 실험은 매우 반복적인 실험과정이 필요하고 이에 따라 많은 노동력과 시간 그리고 막대한 자원을 필요로 했다. 이러한 문제점은 해결하기 위하여, 염기서열을 아는 핵산을 기판위 기지(旣知)의 위치에 이차원으로 배열시키는 핵산 마이크로어레이 기술이 개발되었다.
핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray)는 좁은 기판 표면 위에 매우 다양한 염기서열을 갖는 핵산 조각을 고밀도로 배열시킨 것으로, 고정된 핵산과 미지의 핵산 시료와의 혼성화를 통하여 미지시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 여기서 혼성화란 핵산 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine) 또는 우라실(uracil), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine)간의 수소결합에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 이중나선 핵산(double-stranded nucleic acid)을 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 미지의 핵산 시료 가운데 기판에 고정된 핵산 프로브와 상보적 염기서열을 갖는 핵산 단편은 프로브와 결합하여 기판 표면에 남아있게 되고, 핵산 프로브, 핵산 시료 또는 혼성화 후의 이중나선 핵산을 적당한 방법으로 표지(label)하여, 미지의 시료내의 핵산 염기서열에 대한 정보를 알 수 있다.
일반적으로 핵산 마이크로어레이는 수 백 개 내지 수 십만 개의 매우 다양한 염기서열을 가지는 핵산을 작은 공간에 배열시켜 고정된 기지(旣知)의 핵산과 미지(未知)의 핵산 시료와의 혼성화(hybridization)를 통하여 미지시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 핵산 마이크로어레이는 기존의 Southern blot, Norther blot, 돌연변이 검색 등을 대체하여 동시에 최소한 수백개 이상의 염기서열 부위를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점을 가지고 있다.
핵산 마이크로어레이 제조방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 하나는 기판 상에서 직접 올리고핵산(oligo nucleic acid)을 합성하여 프로브를 만드는 합성법이고, 또 다른 하나는 이미 합성된 cDNA(complementary DNA), PNA(peptide nucleic acids), LNA(locked nucleic acids) 등과 같은 올리고핵산(oligo nucleic acid)을 기판 상에 올리는 방법이다.
올리고핵산을 기판에 올리는 방법에는 몇 가지가 있다. 한 가지 방법은, 반도체 공정에서 많이 사용되는 광식각(photolithography) 기술을 이용한 것으로, 폴리펩타이드를 실리콘 기판상에서 인-시투(in-situ) 합성하는 방법(미국 특허 5,143,854)이 있고, 미국의 Affymetrix사는 이와 유사한 방법으로 올리고핵산을 인-시투로 합성한 핵산 마이크로어레이를 제조, 판매하고 있다. 이 방법은 미리 기판 상에 각각의 염기가 합성될 수 있는 작용기를 도입하고, 작용기 말단은 빛에 민감한(photolabile) 화학물질에 의하여 보호(protect)된 상태로 만든다. 포토마스크(photomask)를 이용하여 특정 부위에만 빛을 쬐어주게 되면, 빛에 민감한 화학물질들이 제거되고, 염기와 반응할 수 있는 작용기만이 노출된다. 이 때, 반응에 참여하는 각각의 염기들도 그 말단이 빛에 민감한 화학물질로 보호되어 있기 때문에, 빛이 조사되어 작용기가 활성화된 부위에만 염기가 한 개씩 결합하게 된다. 그리고 난 후, 반응하지 않은 염기들을 제거하고, 다른 패턴의 포토마스크를 이용하여 기판 위에 특정 염기를 선택적으로 결합시키는 작업을 반복하게 되면, 결과적으로 기판 상의 특정한 위치에 원하는 염기서열의 올리고핵산을 합성할 수 있게 된다. 이 때, 기판 위의 일정한 면적의 각 스팟(spot) 상에 15 ~ 25 mer의 염기서열을 갖는 올리고핵산을 합성할 수 있다.
이와 같은 Affymetrix 칩의 단점으로 꼽히는 고가의 포토마스크를 사용하지않는 광식각을 이용한 올리고핵산 합성을 방법이 개발되었다. 미국의 위스콘신 대학에서 개발한 방법으로 디지털 마이크로미러 어레이(Digital Micromirror Array)로 포토마스크의 역할을 대신하여 76,000개의 올리고뉴클레오타이드를 직접 칩의 표면 위에서 합성하는데 성공하였다(Nature Biotechnology 17 : 974 ~ 978, 1999).
또 다른 방법으로, 잉크젯 프린터의 경우와 같이, 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방식에 의하여, 4가지 염기 중 하나를 전기적으로 방출시켜서 기판 표면 위에 올리고핵산을 합성하는 방법이 있다(US patent 5,474,796). 이 방법은 40 ~ 50 mer의 올리고핵산도 합성할 수 있지만, 배열(aligning) 공정이 용이하지 않으며, 패턴의 최소 크기가 약 100 ㎛ 정도이므로 집적화에 한계가 있다.
또한, 고전적인 방법으로, 이미 합성된 핵산을 기계적 마이크로스파팅(microspotting) 또는 마이크로피펫팅(micropipetting) 방식으로 기판 위에 올리는 방법이 있는데(Science 270:467-470, 1995), 이는 고밀도의 핵산 마이크로어레이를 제조할 수 없다는 단점과 대량생산에 있어서 제약이 있다는 단점이 있어서, 주로 연구용 목적의 핵산 마이크로어레이 제작에 응용되고 있다.
지금까지 개발된 핵산 마이크로어레이의 경우, 제조방식은 달라도 서로 다른 핵산 분자들이 일정한 크기를 갖는 사각형의 기판 위에 바둑판식으로 배열된 것이 특징이다. 혼성화 반응결과를 알기 위해서는 일반적으로 특정 표지 하거나 형광 이미지 스캐너를 사용하여 핵산 마이크로어레이 기판 면을 스캔하는 별도의 단계를 필요로 한다(미국특허 제5,091,652호).
본 발명은 중합 반응을 이용하여 복제된 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray) 및 그의 제작 방법에 관한 것으로, 제조공정이 단순하고 고가의 장비를 필요로 하지 아나하며, 하나의 원판 핵산 마이크로어레이를 이용하여 여러 장의 핵산 마이크로어레이를 생산할 수 있어서, 핵산 마이크로어레이를 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1a 내지 1e는 원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2a 유리 기판 위의 금 패턴을 나타낸 것이고, 2b는 복제된 핵산 마이크로어레이의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3d는 원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제된 마이크로어레이에 대하여 다른 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 혼성화시켜 얻은 형광 이미지를 나타낸 것이다.
*** 도면 주요부의 설명 ***
(1) 원판 핵산 마이크로어레이
(2) 원판에 고정된 핵산 분자
(3) 중합 반응기
(4) 원판에 고정된 핵산 분자와 상보적 결합을 할 수 있는 핵산 조각을 포함하는 용액
(5) 혼성화된 핵산 마이크로어레이
(6) 중합체
(7) 새로운 기판
(8) 복제된 핵산 마이크로어레이
본 발명은 중합 반응(polymerization reaction)을 이용하여 하나의 원판 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray) 및 중합 반응을 이용하여 하나의 원판 마이크로어레이로부터 다수의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 원본 핵산 마이크로어레이에 대한 선택적 분자인지를 통하여 선택적으로 자리잡은 핵산 조각(nucleic acid fragments)을 핵산이 자리잡은 공간적 배열에 대한 정보를 유지시킨 채 새로운 기판으로 동시에 옮기는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 조각에는 중합 가능한 모노머(monomer)인 중합 반응기가 존재하며, 핵산 조각이 원판 상의 상보적 염기서열을 갖는 핵산 분자와의 혼성화 반응을 통하여 원판 핵산 마이크로어레이 상에 선택적으로 자리잡은 후, 여기에 핵산 조각 상의 중합 반응기와 중합 가능한 모노머를 포함하는 용액을 넣어 핵산 조각에 결합된 반응기와 중합체(polymer)를 합성시키고, 이를 새로운 기판에 고정시킴으로써, 원판에 혼성화된 핵산 조각을 원판에서의 공간적 배열에 대한 정보를 유지시킨 채 새로운 기판으로 옮겨, 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작할 수있다. 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 원판 핵산 마이크로어레이에 고정된 핵산은 그대로 남아있으므로, 새로운 핵산 마이크로어레이를 복제한 후에도 원판 핵산 마이크로어레이를 재사용 하는 것이 가능하여, 하나의 핵산 마이크로어레이로부터 다수의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있다.
본 발명에 의한 핵산 마이크로어레이의 제작원리는 핵산 분자의 상보적 염기서열의 분자인식을 기본으로 한다. 아데닌(adenine)-티민(thymine), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine)간의 수소결합에 의한 상보적 결합은 높은 선택성을 가지는데 이는 핵산 마이크로어레이 기술의 기본원리이기도 하다. 본 발명은 이런 핵산 분자간의 높은 선택성을 가진 상보적 결합을 이용하여 원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제 핵산 마이크로어레이를 만드는 방법에 관한 것이다.
우선, 본 발명에 따른 핵산 마이크로어레이는 기판; 및 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기서열을 갖고, 중합 반응 가능한 모노머인 중합 반응기를 3' 말단, 5' 말단 또는 핵산 조각 내에 포함하는 핵산 조각이 원판 핵산 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열의 핵산의 공간적 배열 상태와 거울상의 대칭 배열을 유지하면서 고정된, 상기 중합 반응기 및 이와 중합 반응 가능한 모노머를 사용하여 합성된 중합체를 포함하여 이루어진다. 상기 핵산 마이크로어레이는 기판 평면상에서의 위치에 따라 상이한 염기서열 또는 상이한 유전정보를 갖는 핵산 조각이 중합체에 결합되어 배열되어 있다.
또한, 본 발명의 핵산 마이크로어레이의 제작방법은 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어진다:
1) 제작하고자 하는 핵산 마이크로어레이와 상보적인 염기서열을 갖고, 평면상의 위치에 따라 상이한 서열을 갖는 핵산 분자(2)가 고정된 원판 핵산 마이크로어레이(1)를 준비하는 단계(도 1a 참조);
2) 상기 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기서열을 갖고, 중합 반응 가능한 모노머인 중합 반응기(3)를 갖는 핵산 조각을 포함하는 용액(4)에 원판 핵산 마이크로어레이를 담가, 용액에 존재하는 핵산 조각과 원판 핵산 마이크로어레이 표면의 핵산 분자를 혼성화시키는 단계(도 1b참조);
3) 상기 중합 반응기를 갖는 핵산 조각이 결합된 원판 핵산 마이크로어레이를 세척하여 결합하지 않거나 비선택적으로 결합된 핵산 조각을 제거하는 단계(도 1c 참조);
4) 상기 중합 반응기를 갖는 핵산 조각이 결합된 원판 핵산 마이크로어레이 위에 새로운 기판(7)을 대고, 그 사이에 중합 반응기와 중합 반응 가능한 모노머를 포함하는 용액을 넣고, 핵산 조각에 결합된 중합 반응기와의 중합 반응에 의하여 새로운 기판 상에 중합체(6)를 합성하여, 핵산조각을 원판 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열을 갖는 핵산의 위치와 거울상의 대칭 배열을 유지하면서 중합체 내에 고정시키는 단계(도 1d 참조); 및
5) 원판 핵산 마이크로어레이로부터 상기 중합체가 고정된 기판을 분리시켜 원판의 핵산 마이크로어레이와 상보적인 염기서열의 정보를 갖는 복제된 핵산 마이크로어레이(8)를 제작하는 단계(도 1e 참조).
본 발명에 있어서, 상기 핵산 조각과 원판 핵산 마이크로어레이에 고정된 핵산 분자는 각종 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids), 및 LNA(Locked Nucleic Acids) 등과 같이 염기서열 형태로 정보를 가지며 상보적 염기서열을 포함하는 핵산과 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 모두 포함한다. 상기 기판으로서 사용되는 물질에는 특별한 제한이 없으며, 유리를 사용할 수 있다.
상기 원판 핵산 마이크로어레이는 통상적으로 사용되는 모든 핵산 마이크로어레이를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체예에서 예시한 금 패턴에 올리고뉴클레오타이드를 고정시킨 것 외에도, 광식각, 잉크젯, 스팟팅, 마이크로피펫팅 등의 방식으로 평면에 핵산 패턴을 만든 모든 핵산 마이크로어레이에 대하여 적용 가능하다.
상기 핵산 조각은 3'위치, 5' 위치 또는 핵산 조각 내에는 중합체(polymer)를 만들 수 있는 모노머 유니트(중합 반응기)가 공유결합으로 고정되어 있다. 또한, 상기 단계 4)의 중합체를 만들 수 있는 모노머는 에틸렌기를 가진 중합 가능한 화합물이며, 아크릴아마이드(acrylamide), 메타클릴아마이드(methacrylamide), 아클릴산(acrylic acid), 메타크릴산 (methacrylic acid)과 이들과 구조적으로 연관된 아마이드(amide)나 에스터(ester) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 핵산 분자에는 에틸렌기를 가진 모노머 유니트(중합 반응기)가 붙어있고 이는 역시 에틸렌기를 가진 모노머 유니트와 적당한 조건에서 중합체를 만들 수 있다. 이와 같이 만들어진 중합체는 가지(branch)에 핵산 분자가 공유결합으로 연결된 구조가 된다. 새 기판 쪽으로 중합체가 잘 고정되게 하기 위하여, 새 기판의 표면을 에틸렌기를 이용하여 개질시켜, 중합 반응이 잘 일어날 수 있도록 하여 사용할 수 있다.
상기 단계 5)에 있어서, 원판핵산 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이를 분리시킬 때, 기계적인 힘을 사용하여 분리시킬 수 있지만, 핵산-핵산 결합력에 의해 핵산이 손상되는 거나 마이크로어레이에서 떨어지는 것을 막기 위하여, 원판과 기판을 분리시키기 전에 온도를 높여서 원판 상의 핵산과 새로운 기판 상의 핵산 사이의 수소결합을 약화시켜서 분리시킬 수 있다.
도 1a 내지 1e는 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작하는 과정을 보여준다. 1a는 제작하고자 하는 복제 핵산 마이크로어레이와 상보적 결합을 하는 염기서열의 핵산이 배열되어 있는 원판 핵산 마이크로어레이를 보여주는 것이다. 1b는 복제되는 핵산 마이크로어레이를 구성할 염기서열을 가진 핵산 조각들이 혼합된 용액에 원판 핵산 마이크로어레이를 담가 혼성화시키는 것을 보여주는데, 이 때, 핵산 조각은 3'위치, 5' 위치 또는 핵산 조각 내에 중합체(copolymer)를 만들 수 있는 모노머 유니트(중합 반응기)를 가지고 있다. 1c는 혼성화 반응이 일어난 원판 핵산 마이크로어레이를 세척하여 결합하지 않거나 비선택적으로 결합된 핵산 조각을 제거하여, 핵산 조각이 원판 위의 상보적인 염기서열을 가진 핵산 분자와 선택적으로 결합하여 원판 핵산 마이크로어레이 상에 특정하게 위치한 것을 보여주는 것이다. 1d는 핵산 조각이 혼성화된 원판과 새 기판 사이에 중합 반응기와 중합 가능한 모노머 용액을 넣고 중합반응을 시켜, 원판 핵산 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열을 갖는 핵산의 공간적 배열상태와 거울상의 대칭 상태를 유지한 채로 중합체 내에 핵산 조각을 고정시키는 것을 보여주는 것이다. 이와 같이 핵산 조각을 중합체에 고정시키는 방법으로, 에틸렌기를 가진 화합물의 중합 반응을 이용할 수 있는데, 이러한 기술은 미국의 Mosaic Technologies 사에서 보유하고 있다(미국특허 5,932,711). 1e는 원판 핵산 마이크로어레이로부터 핵산 조각이 중합되어 고정된 새 기판을 분리하여, 상보적 염기서열을 갖는 원판 상의 핵산의 공간적 배열과 거울상의 대칭 배열의 핵산 조각을 갖는 복제 핵산 마이크로어레이를 제작하는 것을 보여준다. 원판으로부터 복제 핵산 마이크로어레이를 분리시킬 때, 원판 위의 핵산과 혼성화된 핵산 사이에 결합을 약화시켜서, 분리 시 핵산-핵산 결합력에 의해 핵산이 손상되거나 기판에서 떨어지는 것을 막기 위하여, 온도를 올려서 분리시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 원판 핵산 마이크로어레이는 단계 1) 내지 5)를 수행 한 이후에도 원래대로 보존되므로, 단계 1)에서 준비된 하나의 원판 핵산 마이크로어레이에 단계 2) 내지 5)를 반복 수행함으로써, 하나의 원판 핵산 마이크로어레이를 사용하여 다수의 복제 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 복제된 핵산 마이크로어레이는 원판 핵산 마이크로어레이 상의 염기서열 정보와 상보적인 염기서열 정보를 가지며 거울상으로 대칭되는 배열의 핵산을 가지게 된다. 예컨대, A 에서 I의 다른 염기서열을 가진 핵산이 있고 이에 상보적인 염기서열을 가진 핵산을 A' 에서 I'이라고 하면 원본 핵산 마이크로어레이와 복제 핵산 마이크로어레이는 아래와 같은 관계를 가진다.
A B C C' B' A'
D E F -> F' E' D'
G H I I' H' G'
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 성멸할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
혼성화에 의하여 원판 표면에 고정된 핵산을 새로운 기판으로 옮기는 것이 가능한지 실험하기 위하여 크롬 마스크(Cr mask)를 사용하여 광식각(photolithography) 기술인 리프트-오프(lift-off) 공정으로 유리기판 위에 금(gold) 패턴을 만들었다. 원판과 복제 핵산 마이크로어레이가 잘 분리될 수 있도록, 금 패턴 이외의 유리 표면을 SigmacoteR(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 소수성 코팅을 하였다.
5' 말단이 티올기(thiol)로 수식된(modified) 올리고뉴클레오타이드(QC3, Thiol Mod C6, 5'-TGAAGACATAGTTCCTCACAG-3')를 티올과 금과의 공유결합을 이용한 자기조립(self assembly) 방법으로 원판 표면에 고정시켰다. 이 실험에서는 QUIGEN Operon사에서 주문 합성한 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 자기조립으로 표면에 고정시키기 위하여, 올리고뉴크레오타이드를 TE 버퍼(Tris-EDTA, pH 7.0)에 녹인 용액을 기판 위에 떨어뜨리고 수용액이 증발하지 않도록 95% 이상의 습도를 유지시키면서 1시간 이상 상온에서 반응시켰다.
본 실시예에서는 에틸렌기를 가진 핵산 조각으로 Mosaic Technologies사의 AcrylditeTM로 수식된 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 즉, 금 패턴 위에서 올리고뉴크레이타이드와 상보적인 염기서열을 가지고 있으며 5' 말단에 AcrylditeTM로 수식된 올리고뉴클레오타이드 (RQC3, 5'-ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC-3')를 5X SSC 버퍼에 녹인 용액을 사용하여 45℃에서 1시간 이상 혼성화 반응시켰다. 이 때, 혼성화되지 않거나 비선택적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위하여 5X SSC에서 10분간 3회, 1X SSC에서 10분간 3회 세척하고 증류수로 세척하였다.
금 표면에 선택적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드의 에틸렌기와의 중합을 위하여 아크릴아마이드(acrylamide)를 사용하였다. 중합 반응을 일으키기 위하여, 아크릴아마이드용액(20%T, 5%C, Acrylamide:N,N'-Methylene-bis-acrylamide = 19:1)에 최종농도 0.1% TEMED(N,N'-Tetramethylethylenediamine) 및 0.1% APS(ammonium persulfate)을 넣은 용액을 핵산이 결합된 원판 핵산 마이크로어레이의 금 패턴의 유리기판과 복제 핵산 마이크로어레이를 만들기 위한 새로운 기판으로 사용된 슬라이드글라스 사이에 넣은 후, 1분간 상온에서 방치하여 중합에 의해 폴리아크릴아마이드 겔이 합성되도록 하였다. 이 때, 아크릴아마이드 용액의 조성비는 복제 핵산 마이크로어레이의 용도나 원하는 기계적 강도에 따라 다르게 사용할 수 있다.
상기 슬라이드 글라스는 폴리아클릴아마이드 겔이 잘 고정될 수 있도록 에틸렌기와 중합이 가능한 Bind Silane(3% g-methacryloxypropyl tri-methoxysilane 메탄올 용액)을 처리하였다. 핵산 혼성화에 의한 결합을 약화시키기 위하여, 95℃ 이상의 증류수 내에서 1분간 방치한 후, 유리기판과 슬라이드 글라스를 분리하였다.
복제 핵산 마이크로어레이인 슬라이드 글라스에 올리고뉴클레오타이드가 옮겨졌는지를 확인하기 위하여, 형광분자인 Cy3가 표지된(labeled) 올리고뉴클레오타이드(QC3)를 혼성화시킨 후, 형광스캐너(ScanArray LITE, Packard Bioscience Inc, Meriden, CT, USA)를 사용하여 스캔하였다. 이 때, 5X SSC 버퍼에 녹인 올리고뉴클레오타이드 용액에서 45℃에서 1시간 이상 혼성화 반응을 시키고, 5X SSC에서 10분간 3회, 1X SSC에서 10분간 3회 세척하고 증류수로 세척하였다.
상기의 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 도 2a는 금 패턴의 카메라 영상으로, 진한 부분이 금 패턴이 놓인 부분이다. 금 패턴은 정사각형이 체크무늬로 되어 있고 한 변의 길이는 가장 큰 사각형부터 각각 128 mm, 64 mm, 32 mm, 16 mm 이다. 도 2b는 스캔 결과 얻은 이미지로 밝은 부분이 형광이 강하게 나온 이미지이다. 도 2a 및 2b에서 알 수 있는 바와 같이, 중합을 이용한 복제 핵산 마이크로어레이는 16 mm 이하의 패턴에 대해서도 복제 가능하다.
실시예 2
에틸렌기를 가진 핵산이 원판 핵산 마이크로어레이에 대하여 선택적으로 결합하여 위치하고, 결합한 핵산이 복제 핵산 마이크로어레이로 옮겨지는 것을 보여주기 위하여, 500 mm 지름의 원이 4X4로 배열된 금 패턴을 사용하여 실험하였다. 실험 조건은 실시예 1과 동일하며, 티올 수식된 4가지 올리고뉴클레오타이드(A1, B1, QC2, QC3)를 금 패턴의 열마다 한 가지씩의 좌측으로부터 고정시키고, 각각의 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열로 된 에틸렌 수식된 올리고뉴클레오타이드(RA1, RB1, RQC2, RQC3) 혼합하여 넣은 후, 혼성화시켜서 복제 핵산 마이크로어레이를 제작하였다. 한 장의 원판 핵산 마이크로어레이를 이용하여 반복하여 복제 핵산 마이크로어레이를 만들었다. 도 3a 내지 3d는 원본 핵산 마이크로어레이에 고정된 핵산과 4가지 올리고뉴클레오타이드 중의 하나와 같은 서열의 올리고뉴클레오타이드에 Cy3가 수식된 것으로 혼성화시킨 후, 형광스캐너로 이미지를 얻은 결과를 나타낸 것이다. 도 3a 내지 3d는 각각 Cy3가 수식된 QC3, QC2, B1, A1 올리고뉴클레오타이드를 넣어 혼성화시킨 후 얻은 이미지이다. 복제 핵산 마이크로어레이는 원본 핵산 마이크로어레이와 거울상으로 반전되고 상보적인 서열을 가지게 됨을 알 수 있다. 실험에 사용된 올리고뉴클레오타이드를 정리해 보면 아래와 같다.
1) A1 5'-GTCCCTCTTGGAAGTCCATGGT-3'
RA1 5'-ACCATGGACTTCCAAGAGGGAC-3'
2) B1 5'-TACCACAGAGTCTAGACTCGTG-3'
RB1 5'-CACGAGTCTAGACTCTGAGGTA-3'
3) QC2 5'-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCA-3'
RQC2 5'-ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC-3'
4) QC3 5'-TGAAGACAGTAGTTCCTCACAG-3'
RQC3 5'-GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT-3'
본 발명에 따른 핵산 마이크로어레이 제조방법은 핵산 간의 혼성화를 이용하여 한 번에 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있으므로, 제조공정이 단순하고 고가의 장비를 필요로 하지 않는다. 또한, 하나의 원판 핵산 마이크로어레이를 이용하여 여러 장의 핵산 마이크로어레이를 생산할 수 있어서, 핵산 마이크로어레이를 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있다.
<110> LG ELECTRONICS INC. <120> NUCLEIC ACID MICROARRAY REPRODUCED BY USING POLYMERIZATION REACTION AND MANUFACTURING METHOD THEREOF <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide A1 <400> 1 gtccctcttg gaagtccatg gt 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide RA1 <400> 2 accatggact tccaagaggg ac 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide B1 <400> 3 taccacagag tctagactcg tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide RB1 <400> 4 cacgagtcta gactctgagg ta 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide QC2 <400> 5 ctgtgaggaa ctactgtctt ca 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide RQC2 <400> 6 actcgcaagc accctatcag gc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide QC3 <400> 7 tgaagacagt agttcctcac ag 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide RQC3 <400> 8 gcctgatagg gtgcttgcga gt 22

Claims (12)

  1. 기판; 및 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산 분자와 상보적 염기서열을 갖고, 중합 반응 가능한 모노머인 중합 반응기를 공유결합에 의하여 3' 말단, 5' 말단 또는 핵산 조각 내에 포함하는 핵산 조각이 원판 핵산 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열의 핵산의 공간적 배열 상태와 거울상의 대칭 배열을 유지하면서 고정된, 상기 중합 반응기와 중합 반응 가능한 모노머를 사용하여 합성된 중합체를 포함하는 핵산 마이크로어레이.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산이 각종 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids) 또는 LNA(Locked Nucleic Acids)와 같이 염기서열 형태로 정보를 가지며 상보적 염기서열을 포함하는 핵산과 선택적으로 결합할 수 있는 분자인 핵산 마이크로어레이.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 중합 반응기 및 이와 중합 반응 가능한 모노머가 에틸렌기를 갖는 화합물인 핵산 마이크로어레이.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 에틸렌기를 갖는 화합물이 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드(methacrylamide), 아크릴산(acrylic acid), 메타크릴산(methacrylic acid), 또는 이들과 구조적으로연관된 아마이드(amide)나 에스테르(ester)인 핵산 마이크로어레이.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 기판이 에틸렌기로 표면 개질되어, 기판 상에서 중합체 합성이 잘 일어날 수 있도록 된 것인 핵산 마이크로어레이.
  6. 1) 제작하고자 하는 핵산 마이크로어레이와 상보적인 염기서열을 갖고, 평면상의 위치에 따라 상이한 서열을 갖는 핵산 분자(2)가 고정된 원판 핵산 마이크로어레이(1)를 준비하는 단계;
    2) 상기 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기서열을 갖고, 중합 반응 가능한 모노머인 중합 반응기(3)를 3' 말단, 5' 말단 또는 핵산 조각 내에 공유결합에 의하여 포함하는 핵산 조각을 포함하는 용액(4)에 원판 핵산 마이크로어레이를 담가, 용액에 존재하는 핵산 조각과 원판 핵산 마이크로어레이 표면의 핵산 분자를 혼성화시키는 단계;
    3) 상기 중합 반응기를 갖는 핵산 조각이 결합된 원판 핵산 마이크로어레이를 세척하여 결합하지 않거나 비선택적으로 결합된 핵산 조각을 제거하는 단계;
    4) 상기 중합 반응기를 갖는 핵산 조각이 결합된 원판 핵산 마이크로어레이 위에 새로운 기판(7)을 대고, 그 사이에 중합 반응기와 중합 반응 가능한 모노머를 포함하는 용액을 넣고, 핵산 조각에 결합된 중합 반응기와 용액 내의 모노머와의 중합 반응에 의하여 새로운 기판 상에 중합체(6)를 합성하여, 핵산조각을 원판 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열을 갖는 핵산의 위치와 거울상의 대칭 배열을유지시킨 상태에서 중합체 내에 고정시키는 단계; 및
    5) 원판 핵산 마이크로어레이로부터 상기 중합체가 고정된 기판을 분리시켜, 원판의 핵산 마이크로어레이와 상보적인 염기서열의 정보를 거울상의 대칭 배열로 포함하는 복제된 핵산 마이크로어레이(8)를 제작하는 단계를 포함하는 핵산 마이크로어레이 제작 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 5) 이후의 원판 마이크로어레이에 단계 2) 내지 단계 5)의 과정을 반복하는 단계를 추가적으로 포함함으로써, 하나의 원판 핵산 마이크로어레이를 사용하여 다수의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산으로서 각종 DNA, RNA, PNA 또는 LNA와 같이 염기서열 형태로 정보를 가지며 상보적 염기서열을 포함하는 핵산과 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 사용하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 중합 반응기 또는 이와 중합 반응 가능한 모노머로서 에틸렌기를 가진 중합 가능한 화합물을 사용하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 중합 가능한 화합물로서 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 또는 이들과 구조적으로 연관된 아마이드나 에스테르를 사용하는 방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 기판을 에틸렌기를 사용하여 표면 개질시켜 사용하는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 5)에 있어서, 원판핵산 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이를 분리시킬 때, 핵산-핵산 결합력에 의하여 핵산이 손상되거나 마이크로어레이에서 떨어지는 것을 방지하기 위하여, 온도를 높여서 원판 상의 핵산과 새로운 기판 상의 핵산 사이의 수소결합을 약화시킨 후, 분리시키는 방법.
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