DE10308931A1

DE10308931A1 - System und Verfahren zur Synthese von Polymeren

Info

Publication number: DE10308931A1
Application number: DE2003108931
Authority: DE
Inventors: Alain Laurent; Philippe Sarra-Bournet; Olivier Aude; Paul Morgavi; Mandrand Bernard; Marc Cuzin
Original assignee: Apibio SAS; Impika SA
Current assignee: Apibio SAS; Impika SA
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-09-23
Also published as: WO2004076059A3; US20060263534A1; JP2006519285A; EP1606047A2; WO2004076059A2; US20100145014A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine automatisierte Polymersynthesevorrichtung zur Synthese einer Polymerkette auf ein festes Substrat durch aufeinanderfolgendes Hinzufügen von Polymerbaublöcken sowie ein Verfahren zur Synnthese von Polymeren auf festen Substraten durch aufeinanderfolgendes Umsetzen von Polymerbaublöcken mit reaktiven Gruppen. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Biochip, der ein festes Substrat mit reaktiven Gruppen umfaßt, auf das Biomoleküle über solche reaktiven Gruppen gebunden sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt eine automatisierte Polymersynthesevorrichtung zur Synthese von Polymerketten auf feste Substrate durch aufeinanderfolgendes Hinzufügen von Polymerbaublöcken und in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Synthese von Polymeren auf festen Substraten durch aufeinanderfolgendes Umsetzen von Polymerbaublöcken mit reaktiven Gruppen. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Biochip, der ein festes Substrat mit reaktiven Gruppen umfaßt, wobei Biomoleküle an die reaktiven Gruppen gebunden sind.
Heutzutage nimmt der Bedarf an Systemen, die zur Synthese von Polymeren nützlich sind, besonders im Gebiet der Oligonukleotid- oder Polypeptidpolymersynthese, konstant zu. Zu diesem Zweck sind verschiedene synthetische Verfahrensweisen entwickelt worden. Zwei synthetische Verfahrensweisen, die bei weitem am wichtigsten sind, sind i) die photochemische Synthese und ii) die „klassische" chemische Synthese solcher Polymere. Beide Verfahren umfassen die Umsetzung von mindestens einer funktionellen Gruppe der Baublöcke des gewünschten Polymers durch nachfolgende Umsetzung dieser Baublöcke unter Bildung des Polymers.
Die funktionellen Gruppen (normalerweise endständige OH-Gruppen) der Baublöcke werden vorübergehend durch intermediäre Schutzgruppen geschützt, die sich bei Behandlung mit geeigneten Reagenzien abspalten. Diese Schutzgruppen sind normalerweise entweder säurelabile Gruppen, wie zum Beispiel DMT (Dimethoxytrityl) und dessen Derivate oder photolabile Gruppen, wie zum Beispiel NPPOC (2-Nitrophenylpropyloxycarbonyl).

Viele Anstrengungen wurden zum Variieren dieser Schutzgruppen unternommen. Zum Beispiel beschreibt das US Patent 6,222,030 die Verwendung von Carbonat-geschützten Hydroxylgruppen in einem 3'-5'-Oligonukleotid.

Beide synthetische Verfahrensweisen sind als in-situ oder ex-situ Synthesen anwendbar. Die in-situ Synthese wird oftmals bevorzugt, da sie einen einfachen Aufbau von verschiedenen oder identischen Polymerketten direkt auf dem entsprechenden Substrat erlaubt, ohne dass eine spätere Fixierung der Polymerkette(n) auf einem Substrat notwendig ist.

Die überwiegende Mehrzahl der synthetischen Verfahrensweisen, die in dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet einen komplizierten Aufbau zur genauen Definition des Reaktionsortes, an dem die Polymerkette aufgebaut werden soll. Dieses umfaßt unter anderem die Verwendung einer Vielzahl von Masken oder eine Vielzahl von Mikrospiegeln für photochemische synthetische Verfahrensweisen.

Die chemische synthetische Verfahrensweise, die die „Nasschemie" verwendet, stößt auf Probleme, die durch die Verwendung starker Basen verursacht werden, die häufig das Material der Vorrichtung zersetzen, in der die Synthese stattfindet.

Einer der Hauptnachteile, der vorstehend erwähnten Verfahren liegt in der Art des Substrats, das in diesen Reaktionen verwendet werden soll. In den meisten Fällen sind Glasobjektträger oder Siliziumdioxid- und Siliziummaterialien verwendet worden, die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Materials umfassen, an die der erste Polymerbaublock durch verschiedene Mittel gebunden werden kann. Zur Überwindung der Nachteile von Glas (Steifigkeit, Zerbrechlichkeit, usw.) wurde vorgeschlagen, das Glassubstrat mit funktionalisierbaren Materialen zu beschichten oder Kunststoffsubstrate zu verwenden:
Das US Patent 6,258,454 offenbart funktionalisierte Oberflächen mit niedriger Oberflächenenergie auf festen Glasträgern (Objektträger), indem die Glasobjektträger, die hydrophile Einheiten auf ihrer Oberfläche aufweisen, mit einer derivatisierenden Zusammensetzung behandelt werden, die eine Mischung von Silanen enthält. Ein erstes Silan sorgt für die gewünschte Verringerung der Oberflächenenergie, während das zweite Silan die Funktionalisierung mit den interessierenden molekularen Einheiten ermöglicht, wie zum Beispiel Ausgangsmonomere, die in der Festphasensynthese von Oligomeren verwendet werden sollen.

Das US Patent 6,146,833 offenbart Reagenzien für die Immobilisierung von Biopolymeren, Herstellungsverfahren und ihre spätere Verwendung bei der Immobilisierung von Biopolymeren für analytische oder diagnostische Zwecke. Die darin offenbarten Reagenzien umfassen einen festen Träger, der aus einem Polymermaterial hergestellt ist, das mindestens eine Oberfläche mit angehängten funktionellen Acylfluoridgruppen aufweist. Der feste Träger umfaßt und ist hergestellt aus polymeren Materialien, umfassend Ethylenacrylsäure- oder Ethylenmethacrylsäurecopolymere und aktives Polypropylen. Biopolymere können nicht direkt an die Oberfläche des Polymerträgers gebunden werden, weil sie zusätzliche Linkergruppen erfordern, deren Einfügung beschwerlich ist.

Ein weiteres Problem, auf das man bei den automatischen Syntheseverfahren vom Stand der Technik stößt, liegt in dem Auslaufen bei der Synthese von Arrays mit hoher Dichte.

Das US Patent 6,184,347 offenbart ein Waschreagenz, das für das Waschen der Oberfläche der Polymerarrays mit hoher Dichte in großem Umfang verwendet wird, um nicht umgesetzte Polymerbaublöcke von den Arrayzellen zu entfernen, während es gleichzeitig mit dem nicht umgesetzten Monomer reagiert, um eine Reaktion des umgesetzten Monomers mit den funktionellen Gruppen auf der HDA-Oberfläche, außerhalb des Oberflächenbereichs, auf welchen das reaktive Monomer aufgebracht wurde, zu verhindern. Daher wird ein Auslaufen der Tröpfchen minimiert, die auf die Oberfläche eines Arrays mit hoher Dichte aufgebracht werden. Die reaktive Waschlösung ist vorzugsweise Methanol.

Eine andere Alternative ist die Synthese von Polymeren in Poren mit einer definierten Größe: das US Patent 6,277,334 offenbart eine chemische Reaktionsvorrichtung, Materialien und Verfahren zur automatischen wirkungsvollen Synthese chemischer Spezies und molekularer Bibliotheken. Oligomere und Molekulare Bibliotheken werden in Poren von porösen Substraten synthetisiert. Die Reaktion findet in den Mikroporen der Substrate statt.

Im Fachgebiet wurden weiterhin verschiedene Vorrichtungen und Verfahren zur Polymersynthese unter Verwendung von Arrays vorschlagen.

Das US Patent 5,472,672 offenbart eine Polymersynthesevorrichtung zum Bau einer Polymerkette, die eine Kopfeinheit mit einem Array von Düsen enthält, wobei jede Düse mit einem Behälter für ein flüssiges Reagenz verbunden ist, und die eine Grundeinheit mit einem Array von Reaktionsstellen enthält. Verschiedene Transportmechanismen sind erforderlich, um das Substrats exakt unterhalb der Düse mit dem Reagenz anzuordnen, das für den spezifischen Polymerbaublock verwendet wird.

US Patent 5,474,796 stellt eine Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung von Arrays aus funktionalisierten Bindungsstellen auf einer Trägeroberfläche, besonders für die Synthese von Oligonukleotiden und Polypeptiden zur Verfügung. In den Arrays sind hydrophile Punkte von hydrophoben Bereichen auf der Oberfläche eines Substrats umgeben. Die Lösung, die die monomeren Polymerbaublöcke umfaßt, wird auf die hydrophilen Reaktionsstellen aufgebracht und wird sich aufgrund der hydrophoben Umgebung nicht mit benachbarten Reaktionsstellen mischen.

Weiterhin offenbart das US Patent 5,529,756 eine Polymersynthesevorrichtung zum Bau einer Polymerkette, die eine Kopfeinheit mit einem Array von Düsen enthält, wobei jede Düse mit einem Behälter für flüssige Reagenzien verbunden ist, und die eine Grundeinheit mit einem Array aus Reaktionsgefäßen enthält. Verschiedene Transportmechanismen sind für das Substrat erforderlich, um das Substrats unter die Düse zu setzen, die das gewählte Mittel enthält. Weiterhin ist der Aufbau ziemlich kompliziert, weil jede einzelne Düse mit einem Reservoir des flüssigen Reagenz verbunden ist.

Weitere Probleme, die beim Verdampfen eines flüssigen Reagenz beobachtet wurden, das auf die Oberfläche eines Substrats aufgetragen wurde, sind Gegenstand der Offenbarung des US Patents 6,177,558. Die Verdampfung eines flüssigen Reagenz während der Festphasensynthese oder der Synthese im Mikromaßstab wird verringert, in dem eine offene feste Trägeroberfläche zur Verfügung gestellt wird, die mindestens eines Bindungsstelle enthält, die mit einer reaktiven chemischen Einheit funktionalisiert wurde. Ein im wesentlichen gesteuertes und winziges Volumen einer flüssigen Reagenzlösung wird auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Die Reagenzlösung umfaßt Reaktanden, die in mindestens einem Lösungsmittel mit relativ hohem Siedepunkt enthalten sind, das vorzugsweise ein polares, aprotisches Lösungsmittel mit einem Siedepunkt von mindestens ungefähr 140 °C ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dinitrilen, Glycolether, Diglycolether, usw.

Das US Patent 6,419,883 schlägt die Verwendung von Mikrotröpfchen einer Lösung vor, die ein Lösungsmittel umfaßt, das einen Siedepunkt von 150°C oder mehr, eine Oberflächenspannung von 30 Dyn/cm oder mehr und eine Viskosität von 0,015 g/cm/sec aufweist. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen zum Beispiel N-Methyl-2-pyrrolidon, Propylencarbonat oder -Butyrolacton. Weiterhin offenbart dieses US Patent ein automatisches System, das in der Lage ist, während der Oligomerensynthese ein oder mehrere Substrate zu verarbeiten, und das einen Inkjet-Druckkopf zum Sprühen eines Mikrotröpfchens umfaßt, das eine chemische Spezies auf einem Substrat umfaßt, einen Scanningtransport zum Scannen des zum Druckkopf benachbarten Substrats, um Mikrotröpfchen selektiv an festgesetzten Stellen aufzutragen, eine Durchflusszelle zur Behandlung des Substrats, auf welchem das Mikrotröpfchen aufgetragen wurde, indem die Substrate einer oder mehreren ausgewählten Flüssigkeiten ausgesetzt wurden, und einen Behandlungstransport umfaßt, um das Substrat zwischen dem Druckkopf und der Durchflusszelle zur Behandlung in der Durchflußzelle zu befördern, wobei der Behandlungstransport und der Scanningtransport verschiedene Teile sind. Das dieser Literaturstelle entsprechende System erfordert eine ziemlich komplizierte Vorrichtung.

Weitere Probleme, auf die man bei der automatischen Synthese von Polymeren, besonders Biopolymeren stößt, sind derart, dass Reaktionen häufig nur dann weitergehen, wenn Aktivatoren zu den einzelnen Polymerbaublöcken gegeben werden. Die Zugabe des Aktivators zu den Polymerbaublöcken wird vor der Verwendung ausgeführt und die Mischung wird in einem externen Behälter gelagert. Der Nachteil ist, dass sich die Mischung während einer kurzen Lebensdauer zersetzen wird und nicht weiter verwendet werden kann. Die zweite in dem Fachgebiet vorgeschlagene Lösung für die Zugabe von Aktivatoren ist, aus zwei Düsen ein Tröpfchen des Polymerbaublocks, das auf die reaktive Stelle aufgetragen wird, und ein Tröpfchen des Aktivators zu sprühen. Dies führt unnötigerweise zu einem komplizierten Aufbau mit verschiedenen Düsen und ziemlich häufig läuft die Reaktion nicht vollständig ab, weil an der Reaktionsstelle die Mischung aus Aktivator und Baublock unvollständig bleibt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein System für eine automatische Polymersynthese zur Verfügung zu stellen, das einen Aufbau zur einfachen Handhabung aufweist und nicht eine Vergeudung von Reagenzien aufgrund ihres Zerfalls nach längerer Lagerung notwendig macht.

Dieses Problem wird durch die vorliegende Erfindung durch ein automatisches Polymersynthesesystem zur Synthese einer Polymerkette auf einem festen Substrat durch aufeinanderfolgendes Hinzufügen von Polymerbaublöcken gelöst, umfassend einen Inkjet- Druckkopf, der eine Vielzahl von Düsen zur gesteuerten Erzeugung von Mikrotröpfchen, die einen Polymerbaublock enthalten, umfaßt, ein Transportmittel zum Befördern eines Substrats, das zum Druckkopf und zur Behandlungseinheit benachbart ist, eine Behandlungseinheit zum Behandeln eines Substrats, auf dem ein Mikrotröpfchen mit einem Fluid aufgetragen wurde und ein zum Druckkopf benachbartes Mikromischgefäß, in dem der Polymerbaublock mit einem Aktivator unmittelbar vor der Reaktion gemischt wird.

Das zum Druckkopf benachbart angeordnete Mikromischgefäß bietet den überraschenden Vorteil, dass nur die Menge an Polymerbaublöcken, die umgesetzt werden soll, mit einem Aktivator unmittelbar vor der Reaktion gemischt wird. Der Ausdruck „benachbart", so wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass sich das Mikromischgefäß entweder in räumlicher Nähe zum Druckkopf befindet und zum Beispiel über Rohre zum Inkjet-Druckkopf aufgelistet ist oder, dass das Mikromischgefäß ein Teil oder ein integraler Bestandteil des Inkjet-Druckkopfs ist und von dem Kopf oder von den Düsen über Festphasenfilterfritten, Diaphragmas und dergleichen getrennt sein kann. Somit wird die Menge des mit dem Polymerbaublock gemischten Aktivators nicht vergeudet, da die Menge dann sofort zur Reaktion verwendet wird und nicht zerfallen kann. Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Mikromischgefäß für jeden einzelnen Baublock, wodurch die Erzeugung von nur genau der Reagenzmenge zugelassen wird, die für die Synthese für jeden verschiedenen Baublock erforderlich ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind alle Elemente des Systems in einer linearen Weise (eindimensional) angeordnet, so dass das Transportmittel das Substrat nur in einer Richtung transportieren kann. Die lässt das Auftragen einer Vielzahl von Mikrotröpfchen ohne komplizierte Mittel zur Richtungssteuerung zu. Somit ist jeder Polymerbaublock einem spezifischen Mikromischgefäß zugeordnet, damit Spuren von Verunreinigungen vermieden werden.

Das Mischen des Polymerbaublocks mit einem Aktivator wird über einfaches Zugeben beider Komponenten (gewöhnlich in Lösung) in das Mikromischgefäß mit oder ohne Rühren erreicht.

Es ist klar, dass im Rahmen der Erfindung ebenfalls eine Vielzahl von Inkjet-Druckköpfen verwendet werden kann.

Ein weiterer überraschender Vorteil der Erfindung liegt darin, dass nur ein Transportmitteltyp zur Beförderung eines Substrats erforderlich ist, um eine Vielzahl von Mikrotröpfchen in jeder Richtung auf einem Substrat aufzutragen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Vielzahl der Düsen linear angeordnet. Dies sorgt für eine einfache Auftragung von einer Vielzahl von Mikrotröpfchen in einer Linie, ohne dass weitere Steuerungsmittel erforderlich sind. Weiterhin muß der Inkjet-Druckkopf nur dann in einer Richtung bewegt werden, um eine gewaltige Anzahl von Mikrotröpfchen zu erzeugen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist jede Düse einzeln addressierbar, wodurch der Aufbau einer Vielzahl von unterschiedlichen Polymerketten ermöglicht wird, von denen jede einzelne oder eine vorher festgesetzte Anzahl davon verschiedene Baublöcke enthält. (Ein Baublock kann vor der Reaktion auch als „Synthon" bezeichnet werden). Weiterhin wird bevorzugt, dass der Inkjetkopf einen Behälter in Verbindung mit jeder Düse umfaßt. Dies vereinfacht den Systemaufbau, da im Stand der Technik jede Düse mit einem Reservoir verbunden sein musste, wodurch kompliziertere Steuerungsmittel und Aufbauten erforderlich waren. Das erfindungsgemäße Mikromischgefäß enthält nur die einen Aktivator und einen Polymerbaublock umfassende Menge an Fluid, die für jede einzelne Reaktionsreihe aufgetragen werden soll. Dies lässt die Verwendung von genau der exakten Menge zu, die zum Ausführen der chemischen Reaktion benötigt wird.

Es wird bevorzugt, dass jeder einen Polymerbaublock umfassender Behälter mit einem getrennten Inkjet-Druckkopf verbunden ist, um eine Verunreinigung der Inkjet-Druckköpfe zu vermeiden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind alle Elemente des Systems in einer drehbaren Trommel angeordnet. Diese drehbare Anordnung erfordert nur die Verschiebung des Substrats (der Substrate) in einer Richtung, wodurch einfach zu steuernde Wiederholungsdurchläufe des Substrats, das unterhalb oder oberhalb des Inkjet-Druckkopfs (Inkjet-Druckköpfe) angeordnet ist, ohne Beschleunigung oder Verlangsamung ermöglicht werden. Weiterhin ermöglicht diese Anordnung die einfache Zugabe weiterer Einheiten (zum Beispiel Module für zusätzliche Polymerbaublöcke, wie zusätzliche Inkjet-Druckköpfe usw.) zu jeder gewünschten Zeit, was bei der Verwendung einer linearen Anordnung der Elemente des Systems viel komplizierter ist.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird weiterhin durch ein Verfahren zur Synthese von Polymeren auf einem festen Substrat durch aufeinanderfolgendes Umsetzen der Polymerbaublöcke gelöst, die reaktive Gruppen umfassen, wobei eine reaktive Gruppe mit einer entfernbaren Schutzgruppe geschützt ist und das die folgenden Schritte umfaßt

a) Bereitstellen einer polymeren Oberfläche, wobei die polymere Oberfläche reaktive Gruppen umfaßt,
b) Aufbringen eines ersten Mikrotröpfchens auf die Oberfläche, das einen ersten Polymerbaublock umfaßt;
c) Umsetzen des ersten Polymerbaublocks mit einer reaktiven Gruppe der polymeren Oberfläche, wobei der erste Polymerbaublock auf die polymere Oberfläche gebunden wird;
d) Entfernen einer Schutzgruppe des gebundenen Polymerbaublocks;
e) Aufbringen eines zweiten Mikrotröpfchens auf das erste Mikrotröpfchen, das einen zweiten Polymerbaublock umfaßt;
f) Umsetzen des zweiten Polymerbaublocks mit der entschützten reaktiven Gruppe des ersten Polymerbaublocks;
e) bei Bedarf, aufeinanderfolgendes Wiederholen der Schritte d)–f),

und wobei nach Schritt c) die restlichen reaktiven Oberflächengruppen mit einer nicht-entfernbaren Schutzgruppe („Capping 1") umgesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert die Erzeugung und räumliche Definition eines spezifischen Reaktionsortes durch die Reaktion eines ersten Mikrotröpfchens, das auf die funktionalisierte Oberfläche, unter Bildung von Mikropunkten aufgebracht wurde. Mit anderen Worten: die Größe des ersten Mikrotröpfchens definiert den räumlich begrenzten Reaktionsart, an dem die Erzeugung der Polymerkette stattfinden wird. Die Reaktion der restlichen reaktiven Oberflächengruppen mit einer nicht-entfernbaren Schutzgruppe (erstes Capping) erlaubt die Erzeugung eines spezifischen Musters von Reaktionsorten, wobei jedes nachfolgende aufgebrachte Mikrotröpfchen ganz, ohne dass ein Auslaufens des aufgebrachten Mikrotröpfchens befürchtet werden muß, reagieren kann. Vorzugsweise weist das erste Mikrotröpfchen einen Durchmesser von 10 μm bis 300 μm auf. Der erste und der zweite Polymerbaublock (und alle weiteren Polymerbaublöcke) können gleich oder verschieden sein.

Besonders bevorzugt wird, dass der Durchmesser des ersten Mikrotröpfchens kleiner ist, als der Durchmesser des zweiten Mikrotröpfchens, wodurch eine vollständige Reaktion des zweiten Mikrotröpfchens, das einen zweiten Polymerbaublock umfaßt, mit dem ersten Polymerbaublock erlaubt wird, der im ersten Mikrotröpfchen umfaßt ist. Besonders bevorzugt wird, dass alle der aufeinanderfolgenden Tröpfchen, das heißt das dritte, vierte, und so weiter, die Größe des zweiten Tröpfchens aufweisen. Weitere mechanische Ungenauigkeiten der Transportmittel des Substrats oder der Steuerungsmittel, die die Verschiebung des Druckkopfs (Druckköpfe) steuern, werden weggelassen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die nicht-entfernbare Schutzgruppe, die mit den nicht-umgesetzten funktionalisierten Oberflächengruppen reagiert, Phosphor. Es wird besonders bevorzugt, dass die Phosphor-enthaltenden Gruppen bei der Reaktion mit den reaktiven funktionellen Gruppen auf der Oberfläche eine Phosphatgruppe bilden, wodurch eine inerte, hauptsächlich chemisch inerte Oberfläche zwischen den Reaktionsorten oder -punkten, die durch das erste Mikrotröpfchen definiert sind, gebildet wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden perfluorierte Phosphorderivate verwendet, die inerte und hydrophobe Bereiche um die Reaktionsorte herum erzeugen. Es wird bevorzugt, dass die Polymeroberfläche einen integralen Bestandteil des Substrats bildet, jedoch ist es auch möglich, dass ein Polymerfilm auf ein Substrat oder ein anderes Material aufgetragen wird.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht die Polymeroberfläche aus einem organischen Polymer. Organische Polymere wie Polyolefine, Polyurethane, Polyacrylate, Polyimide, Polyester und dergleichen sind einfach in der Handhabung und in der Bearbeitung. Sie können weiterhin speziell entsprechend ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften ausgewählt werden, so dass sie chemisch inerte polymere Materialien liefern.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die organische Polymeroberfläche reaktive Gruppen, die aus Hydroxylgruppen, Aminogruppen, NRH-Gruppen und Thiolgruppen ausgewählt sind. Diese Gruppen gestatten eine einfache Reaktion mit einem Polymerbaublock unter Erzeugung einer chemischen Bindung zwischen der reaktiven Gruppe und dem Polymerbaublock.

Die Polymerbaublöcke sind vorzugsweise Nukleoside, Nukleotide, wie zum Beispiel Oligonukleotide, die bis zu 20 Nukleoside umfassen, oder Aminosäuren oder Oligopeptide oder Kohlenwasserstoffeinheiten. Es wird daher für eine große Vielfalt in der Art des zu synthetisierenden Polymers gesorgt.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird besonders bevorzugt, dass vor dem Schritt b) ein Aktivator, wie zum Beispiel Tetrazol, Methyl- oder Ethylthiotetrazol und dergleichen, mit einem ersten Polymerbaublock gemischt wird. Es kann jedoch auch jeder andere Aktivator, der einem Fachmann im wesentlichen bekannt ist, verwendet werden. Der Aktivator gestattet eine schnellere und bessere Reaktion zwischen den zwei Polymerbaublöcken zum Aufbau der Polymerkette.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird weiterhin durch einen Biochip gelöst, der einen Biochip mit einem festen Substrat mit reaktiven Grppen auf dessen Oberfläche und über eine chemische Bindung zwischen den reaktiven Gruppen gebundene Biomoleküle und die Biomoleküle umfaßt, wobei die restlichen reaktiven Gruppen auf der Substratoberfläche, die nicht mit einem Biomolekül umgesetzt worden sind, nicht-entfernbare Schutzgruppen aufweisen. Der Biochip ist über das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich und umfaßt normalerweise 96 Gruppen, wobei jedes Array 128 Mikropunkte mit Oligonukleotidketten umfaßt. Die Anzahl der Arrays und der Mikropunkte kann entsprechend den spezifischen Anforderungen variieren und die vorstehend erwähnten Zahlen haben keine einschränkende Bedeutung.

Der Ausdruck „nicht-entfernbar", so wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass diese Schutzgruppen weder durch chemische (Säuren, Basen) noch durch physikalische Mittel (zum Beispiel elektromagnetische Bestrahlung) entfernt werden können. Diese nicht-entfernbaren Schutzgruppen bilden vorzugsweise eine chemisch und mechanisch inerte Oberfläche, so dass das Material des festen Substrats im wesentlichen chemisch inert gegenüber chemischem oder mechanischem Abbau gemacht wird.

Besonders bevorzugt wird, dass die Schutzgruppen Phosphor- oder Stickstoffverbindungen umfassen, die in der Lage sind, eine chemisch inerte Oberfläche aus beispielsweise Phosphoroxiden perfluorierten Phosphorverbindungen und dergleichen zu erzeugen. Im Falle von Stickstoff wird bevorzugt, dass die Stickstoff-enthaltende Einheit schon von der Oberfläche des Substrats umfaßt wird und nur eine chemische Umwandlung erforderlich ist, wie zum Beispiel von einem Amin zu einem Amid usw. Die inerte Oberfläche kann ebenfalls durch eine nachfolgende Reaktion dieser Schutzgruppen erzeugt werden, die in nicht-reaktive Gruppen umgewandelt werden, wie zum Beispiel die Oxidation von Phosphor(III)- zu Phosphor(V)-Verbindungen, die Umwandlung von einem Amin in ein inertes Amid und dergleichen.

Die Biomoleküle sind vorzugsweise Oligonukleotidsequenzen oder Polypeptidsequenzen oder Kohlenwasserstoffsequenzen, die in der Lage sind vielfältige chemische Reaktionen auf einer Oberfläche auszuführen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Biomoleküle Oligonukleotide, wie RNA, DNA, LNA und deren Chimäre.

Weiterhin wird bevorzugt, dass das Substrat ein organisches Polymer ist, das aktivierte Gruppen, wie zum Beispiel OH-, NRH-, SH-Gruppen und dergleichen umfaßt, so dass eine Vielzahl von Bindungsstellen für die verschiedenen Polymerbaublöcke mit verschiedenen reaktiven Gruppen zur Verfügung gestellt wird, ohne dass die Einführung spezieller Linkereinheiten erforderlich ist. Die Aktivierung wird über verschiedene, dem Fachmann im wesentlichen bekannte Mechanismen erreicht, zum Beispiel über Plasmabehandlung, Laserbehandlung und dergleichen.

Es wird besonders bevorzugt, dass das organische Polymer Polypropylen ist, das gegenüber vielen oder gegenüber den meisten der bekannten chemischen Reaktionen, denen man bei der Synthese von biologischen polymeren Molekülen begegnet, chemisch resistent ist.

Definitionen und Abkürzungen

Polymerbaublock: Der Ausdruck Polymerbaublock bezeichnet eine chemische Einheit, die innerhalb des Endpolymers umfaßt ist. Die chemische Einheit kann daher vor dem Einbau in das Endpolymer funktionelle Gruppen umfassen. Nicht einschränkende Beispiele von geeigneten, erfindungsgemäßen Polymerbaublöcken sind substituierte oder nicht-substituierte Phosphoramidite, Mono-, Oligo- und Polynukleotide, Aminosäuren, Peptide, Zucker (Furanosen, Ribosen, usw.), Biotin, Avidin, Streptavidin, Antikörper und dergleichen.

Mikrotröpfchen: Ein Mikrotröpfchen einer Lösung umfaßt ein Lösungsmittel von einer hohen Oberflächenspannung mit einem Siedepunkt von mehr als 150°C, vorzugsweise mehr als 220 °C und mit einer Oberflächenspannung von ungefähr 26–47 Dyn/cm, vorzugsweise 30–39 Dyn/cm, mit einer Viskosität von 3,3–72 cP, vorzugsweise von 8–20 cP. Jedes Mikrotröpfchen ist eine getrennte einzelne Einheit, die vorzugsweise ein Volumen von ungefähr 100 bis 200 pl, besonders bevorzugt zwischen 5 pl und 70 pl aufweist. Es ist klar, dass der Ausdruck „Lösung", so wie er hierin verwendet wird, das Lösungsmittel an sich und den gelösten Stoff oder mehrere gelöste Stoffe umfaßt.

Die Mikrotröpfchen bilden bei der Reaktion auf der Oberfläche sogenannte Punkte oder Mikropunkte. Die Arrays von Polymeren, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, sind in diesen Mikropunkten oder Punkten angeordnet, die getrennte und einzelne Einheiten sind. Der Durchmesser jedes Mikropunktes kann größer als 1000 μm sein, er liegt jedoch typischerweise im Bereich von ungefähr 5 μm – 800 μm, vorzugsweise im Bereich von ungefähr 10 μm – ungefähr 500 μm und besonders bevorzugt im Bereich von 20 – 200 μm.

Der Abstand zwischen den einzelnen Mikropunkten beträgt typischerweise von ungefähr 1 μm – ungefähr 500 μm, vorzugsweise von ungefähr 20 μm – ungefähr 400 μm. Im allgemeinen sollte der Abstand zwischen den Mikropunkten vorzugsweise in dem Bereich des entsprechenden Ortes des Mikrotröpfchens liegen, damit eine Verwendung von benachbarten Punkten vermieden wird.

Die physikalische Trennung der Mikrotröpfchen wird durch die Reaktion der restlichen funktionellen Gruppen mit einer nicht-entfernbaren Schutzgruppe erhalten, die vorzugsweise Phosphor umfaßt. Diese Bereiche liefern dann eine nicht-reaktive Oberfläche, die chemisch inert ist.

Der Ausdruck „Biomolekül" oder „Biopolymer", so wie er hierin verwendet wird, bedeutet jedes beliebige biologische Molekül in Form eines Polymers, wie zum Beispiel Oligonukleotide, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Kohlenwasserstoffe, Antikörper, usw. Der Ausdruck „Nukleosid", so wie er hierin verwendet wird, umfaßt sowohl Desoxyribonukleoside als auch Ribonukleoside. Der Ausdruck „Oligonukleotid" bezeichnet ein Oligonukleotid, das Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotideinheiten aufweist.

Geeignete Nukleotide, die zur erfindungsgemäßen Synthese von Oligonukleotiden brauchbar sind, sind diejenigen Nukleotide, die aktivierte Phosphor-enthaltende Gruppen enthalten, wie zum Beispiel Phosphotriester, H-Phosphonat und Phosphoramiditgruppen.

Der Ausdruck „Aktivator" bedeutet normalerweise ein Katalysator, der im Falle der Oligonukleotidsynthese ein Katalysator ist, der die Reaktion zwischen der 3'Phosphoramiditgruppe eines Nukleosids und den Hydroxylgruppen des nächsten Nukleosids oder Nukleotids katalysiert. Dies kann ein 5-Methylthiotetrazol. Tetrazol oder 5-Ethylthiotetrazol, DCI oder Pyridiniumchlorid sein.

Der Ausdruck „Alkyl", so wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede beliebige gesättigte geradlinige Kette, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel die Methyl-, Ethyl-. n-Propyl-, Isopropyl, n-Butylgruppe, usw. Der Ausdruck Alkyl umfaßt ebenfalls die Cycloalkylgruppen, wie zum Beispiel die Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptylgruppe, usw.

Der Ausdruck „niederes Alkyl" bezeichnet eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und enthält Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl.

Der Ausdruck „Aryl", so wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede beliebige aromatische Verbindung, die einen bis fünf aromatische Ringe enthält, die entweder anneliert oder verbunden und entweder mit mindestens einem Substituenten nicht-substituiert oder substituiert sind, der normalerweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amino, Halogen, Cyanid und niederem Alkyl besteht. Bevorzugte Arylsubstituenten enthalten einen bis drei annelierte aromatische Ringe. Aromatische Verbindungen, so wie sie hierin verwendet werden, können oder können auch nicht heterocyclisch sein, das heißt sie können mindestens ein Heteroatom, wie zum Beispiel Schwefel, Stickstoff, Phosphor und dergleichen enthalten.

Der Ausdruck „Aralkyl" bezeichnet eine chemische Verbindung, die sowohl Alkyl- als auch Arylspezies enthält und die typischerweise weniger als zwanzig Kohlenstoffatome enthält.

Der Ausdruck „Aralkyl" wird normalerweise zur Bezeichnung von Aryl-substituierten Alkylgruppen verwendet.

Der Ausdruck „heterocyclisch" bezieht sich auf beliebige fünfgliedrige oder sechsgliedrige monocyclische Strukturen oder auf eine achtgliedrige bis elfgliedrige bicyclische Struktur, die entweder gesättigt oder ungesättigt ist. Die Heterocyclen umfassen mindestens ein Heteroatom, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Arsen und dergleichen besteht. Die Ausdrücke „Stickstoff-Heteroatom" und „Schwefel-Heteroatom" sowie „Phosphor-Heteroatom" umfassen jede beliebige oxidierte Form von Stickstoff, Schwefel und Phosphor, sowie auch eine quartäre Form eines beliebigen basischen Stickstoffs. Beispiele „heterocyclischer Verbindungen" umfassen Piperidinyl, Morpholinyl und Pyrrolidinyl.

Der Ausdruck „Halogen" wird in seinem üblichen Sinne dazu verwendet ein Chlor-, Brom-, Fluor oder Iodatom zu bezeichnen.

Der Ausdruck „Oligonukleotid", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Polydesoxynukleotide (die 2-Desoxy-D-Ribose enthalten), Polyribonukleotide (die D-Ribose enthalten), eine beliebige andere Polynukleotidart, die ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und andere Polymere, die nicht-nukleotidische Grundgerüste enthalten, vorausgesetzt, dass die Polymere Nukleobasen in einer Konfiguration enthalten, die eine Basenpaarung und Basenstapelung zulässt, so wie es zum Beispiel bei der DNA und RNA festgestellt wurde.

Durch den Ausdruck „Schutzgruppe, so wie er verwendet wird, wird eine Spezies bezeichnet, die verhindert, dass ein Molekülsegment sich einer spezifischen chemischen Reaktion unterzieht, das aber aus dem Molekül nach einem vollständigen Ablauf dieser Reaktion entfernbar ist. Ein anderer synonymer Ausdruck ist „Cappinggruppe" (Capping 2 gemäß der Erfindung). Diese steht im Gegensatz zu einer „dauerhaften Cappinggruppe" (Capping 1 gemäß der Erfindung), die dauerhaft an ein Segment oder eine funktionelle Gruppe eines Moleküls oder an die funktionellen Gruppen an der Oberfläche des Substrats bindet, um jede weitere chemische Umwandlung dieses Segments zu vermeiden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch zur Synthese von Peptiden durch Standardfestphasen-Peptidsyntheseverfahrensweisen verwendet werden.

Typischerweise wird die Festphasenpeptidsynthese in einer C-N-Richtung durchgeführt. Somit sind verankernde Linker erforderlich, so dass die Spaltung am Ende des synthetischen Bereichs eine C-endständige Säure oder Amid erzeugt. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Linker, der eine aktivierte Carboxylgruppe enthält, an Aminogruppen befestigt, die an die aktivierte Oberfläche eines erfindungsgemäßen Trägers binden können. Jede der „temporären" Schutzgruppen, die in der synthetischen Polypeptidchemie routinemäßig verwendet werden, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Nichteinschränkende Beispiele für solche Gruppen sind beispielsweise BOC(t-Butoxycarbonyl)- und FMOC (N-⁹-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-Gruppen. Andere geeignete Aminoschutzgruppen umfassen 2-(4-Biphenyl)propyl[2]oxycarbonyl (Bpoc), 1-(1-Adamantyl)-1-methylethoxycarbonyl (Adpoc) und dergleichen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Repräsentative Aktivatoren oder sogenannte in-situ Kopplungsreagenzien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen N,N'-Dicyclohexylcarbodümid (DCC) und dergleichen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ihre Verwendung wird in Verbindung mit der Verwendung weiterer Beschleuniger oder Zusatzmittel bevorzugt, wie zum Beispiel 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP und dergleichen.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorteilhafterweise zur Synthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA)- oder Ribonukleinsäure (RNA)-Polymerspezies (sogenannte Oliognukleotide) angewandt durch eine beliebige bekannte DNA oder RNA Festphasen-Synthesechemie, einschließlich der Phosphittriester-, Phosphoramiditsynthese und H-Phosphonatsynthese.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist im Prinzip brauchbar, um ein beliebiges iteratives Nukleinsäuresyntheseverfahren auszuüben- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Oligonukleotide durch das Phosphoramiditverfahren synthetisiert. Für die erfindungsgemäße Phosphoramiditsynthese werden manchmal die reaktiven Stellen auf der Substratoberfläche mit einem zusätzlichen Spacer nach Verfahren vom Stand der Technik funktionalisiert. Die Einführung des Spacers kann vor dem Beginn der Erzeugung der Polymerkette stattfinden oder, zum Beispiel nach Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Spacergruppen können auch nur auf vorher ausgewählte Teile des Reaktionsträgers angewandt werden.

Typischerweise weisen monomere Nukleotid- oder Nukleosidpolymerbaublöcke (die ebenfalls Synthone genannt werden) an geeigneten Nukleobasen- oder 2'-O-Positionen temporäre Schutzgruppen auf.

Festphasen-Nukleinsäuresyntheseverfahren wenden sogenannte temporäre und dauerhafte Schutzgruppen in analoger Weise zur Festphasen-Peptidsynthese an. Basenlabile Schutzgruppen werden zum Schutz der exocyclischen Aminogruppen der heterocyclischen Nukleobasen während der Synthese verwendet. Diese Art des Schutzes wurde normalerweise durch Acylierung mit Acylierungsmitteln, wie zum Beispiel Benzoylchlorid und Isobutyrylchlorid erreicht. Säurelabile Schutzgruppen werden zum Schutz des Nukleotid 5'hydroxyls während der Synthese verwendet. Repräsentative Hydroxylschutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Diese umfassen Dimethoxytrityl-, Monomethoxytrityl-, Trityl- und 9-Phenylxanthen(pixyl)gruppen, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Dimethoxytrityl (DMT) Schutzgruppen werden weithin aufgrund der großen Säurelabilität verwendet, die eine effiziente Entfernung sogar mit sehr verdünnten Säuren ermöglicht.

Nach dem Phosphoramiditverfahren ist der erste Schritt in dem iterativen Kettenverlängerungszyklus die Entfernung der 5'-O-Schutzgruppe (Entschützung) von dem ursprünglichen Monomer, indem der Reaktionsträger in eine Lösung des entschützenden Mittels getaucht wird. Danach wird ein Mittel zum Spülen zugegeben. Für die Entschützung geeignete Reagenzien umfassen Lewissäuren, wie zum Beispiel ZnBr₂, AlCl₃, BF₃ und TiCl₄ in verschiedenen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Dichlormethan, Nitromethan, Tetrahydrofuran und gemischte Lösungsmittel, wie zum Beispiel Nitromethan und niedere Alkylalkohole, wie zum Beispiel Methanol oder Ethanol und deren Mischungen. Nur protische Säuren oder protische Säuren in Kombinationen, wie zum Beispiel Essigsäure, Dichloressigsäure, Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure und Toluolsulfonsäure können ebenfalls verwendet werden.

Die Ketten werden durch Zugabe und Umsetzen der aktivierten monomeren 5'-O-geschützten Synthone verlängert. Bei dem Phosphoramiditverfahren wird ein 5'-DMTr-Desoxynukleosid-3'-O-(N,N-Diisopropylamino)-_-cyanoethylphosphit auf den Reaktionsträger aufgebracht. Phosphoramidite von zahlreichen Nukleosiden sind handelsüblich.

Ein milder organischer Katalysator oder Aktivator, typischerweise Tetrazol, Ethylthiotetrazol oder Methylthiotetrazol wird mit dem Phosphoramidit auf den Reaktionsträger aufgebracht. Die Kopplungsreaktion erfolgt nach der Zugabe eines Spülmittels, typischerweise wasserfreies Acetonitril.

Nach dem Spülen wird ein Cappingreagenz, zum Beispiel durch Eintauchen des Substrats in eine Lösung des Cappingreagenz, auf die vorher ausgewählten Teile des Reaktionsträgers gegeben, um die freien Hydroxylspezies abzudecken, die aufgrund der unvollständigen Reaktion der Phosphitmonomere übriggeblieben sind (Capping 1). Es wird bemerkt, dass es im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung einen fundamentalen Unterschied gibt zwischen dem Capping der nicht-umgesetzten reaktiven Gruppen auf den Oberflächen des festen Trägers (auch als „OberflächenCapping" oder Capping 1 bezeichnet) und dem Nukleotid/Nukleosid selbst (Capping 2). Obwohl beide Reaktionen als „Capping" bezeichnet werden, sollten sie jedoch nicht verwechselt werden. Das Cappingreagenz für das „Capping 2", das typischerweise eine Lösung eines Säureanhydrids ist, bewirkt ebenfalls die Umkehr einer versehentlichen Phosphitylierung der Guanin O-6-Positionen.

Die Oxidation des resultierenden Phosphittriesters zu dem entsprechenden Phosphattriester kann durch die Zugabe eines Oxidationsmittels, dessen Eignung im Fachgebiet bekannt ist, bewerkstelligt werden, wie zum Beispiel eine Lösung von alkalischem Jod in Wasser.

Der Fachmann ist sich bewußt, dass die Synthese von Oligonukleotiden entweder in 3'-5'- oder in 5'-3'-Richtung ablaufen kann.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in der Synthese von Oligonukleotiden angewandt werden, die die natürlich vorkommenden Nukleobasen Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G), Cytosin (C) und Uracil (U) so wie auch nicht-natürlich vorkommende Nukleobasen aufweisen. Nicht-natürlich vorkommende Nukleobasen sind molekulare Einheiten vom Stand der Technik, die die Funktion der natürlich vorkommenden Nukleobasen in ihrer biologischen Rolle als Komponenten von Nukleinsäuren nachahmen.

Oligonukleotidspezies mit einer großen Vielfalt an Modifikationen von Nukleobasen, Zucker oder Zwischen-Zucker-Brücken können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, das allgemein auf die Synthese beliebiger Oligomere anwendbar ist, die durch Festphasenverfahren synthetisierbar sind, wie zum Beispiel auch Polykohlenwasserstoffe.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel bei der Synthese von S-Phosphordithioaten, Phosphorthioaten, usw. angewandt werden.

Die Polymere, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können aus mehr als aus einem Typus einer monomeren Untereinheit zusammengesetzt sein (zum Beispiel, Aminosäuren, Peptidnukleinsäuren, Nukleotide, Zucker (Kohlenwasserstoffe), usw.) und sie können mehr als einen Verbindungstyp zwischen den Untereinheiten besitzen. Erläuternde Polymere, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden umfassen Peptide, Peptoide (N-alkylierte Glycine), _-.Polyester, Polythioamide, N-Hydroxyaminosäuren, _-Ester, Polysulfonamide, N-Alkylate Polysulfonamide, Polyharnstoffe, Peptidnukleinsäuren, Nukleotide, Polysaccharide, Polycarbonate, Oligonukleotide, Oligonukleoside und dergleichen und chimäre Moleküle, die ein oder mehrere dieser zu einem einzigen Makromolekül verketteten Polymere enthalten.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können ebenfalls Bibliotheken von monomeren Spezies hergestellt werden. Diese umfassen Benzodiazepin-Bibliotheken und andere solcher analogen Bibliotheken, einschließlich Mittel gegen Bluthochdruck, Arzneimittel gegen Geschwüre, antifungale Mittel, Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, usw., sie sind jedoch nicht auf diese Mittel beschränkt.

Der Fachmann ist sich völlig bewusst, dass der Rahmen der Erfindung nicht nur die vorstehend erwähnten Merkmale umfaßt, sondern ebenfalls deren Kombinationen und dass der Rahmen der Erfindung ebenfalls jedes einzelne Merkmal in Bezug auf die Erfindung umfaßt, so wie sie hierin beschrieben ist.

Weiterhin wird die Erfindung in der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Figuren im Detail beschrieben.
1 stellt eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems schematisch dar;
2 zeigt einen schematischen erfindungsgemäßen Inkjet-Druckkopf;
3 zeigt eine weitere schematische Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems;
4 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems;
5 zeigt eine schematische Schnittansicht eines erfindungsgemäßen Biochips;
6 zeigt eine weitere schematische Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems.
1 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems 100. System 100 ist innerhalb einer inerten Kammer 101 angeordnet, die mit einem inerten Gas, wie zum Beispiel Argon, Stickstoff und dergleichen geflutet werden kann. Innerhalb der Kammer 101 wird ein Substrat 102 an einem Bförderungsmittel 111 angebracht. Das Substrat besteht vorzugsweise aus einem organischen Polymer, wie zum Beispiel Polyethylen, Polypropylen und dergleichen, das auf seiner Oberfläche funktionelle Gruppen aufweist, wie zum Beispiel Hydroxyl-, Amin- oder Thiolgruppen. Das Beförderungsmittel 111 erlaubt das Befördern des Substrats 102 in X und Y Richtung wie durch den Pfeil in 1 angezeigt wird.
Das System 100 ist zur Synthese von zum Beispiel Oligonukleotiden ausgelegt, die aus den Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) bestehen. Zur Bequemlichkeit sind die Basen als Phosphoramiditderivate vorhanden. Für jede Base wird ein Behälter, der nicht in 1 gezeigt ist, zur Verfügung gestellt. Jeder Behälter enthält eine Lösung der entsprechenden Base in einem Lösungsmittel. Bevorzugte Beispiele von Lösungsmittel sind Glycolether, Alkylphthalate, Alkylsebacate, substituierte oder nicht-substituierte Dialkylether, Benzoesäurederivate (Benzoate und dergleichen) und deren Mischungen. Bevorzugte Lösungsmittel sind Lösungsmittel mit hoher Oberflächenspannung, wie sie vorstehend erwähnt sind.
Vor dem Aufbringen eines Tröpfchens der Base, wird jede Base mit einem entsprechenden Aktivator, wie zum Beispiel Tetrazol (TET) in einem Mikromischgefäß 107, 108, 109 und 110 gemischt. Das Volumen eines Mikromischgefäßes beträgt ungefähr 4 μl. Es ist klar, dass ebenfalls kleinere oder größere Volumen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Obergrenze beträgt ungefähr 1 bis 5 ml, die Untergrenze ungefähr 10 pl. Als allgemeine Regel gilt, dass das Volumen des Mikromischgefäßes das Volumen eines vollständigen Reaktionsschrittes umfaßt. Der Ausdruck „vollständiger Reaktionsschritt" im Zusammenhang mit dem Volumen des Mikromischgefäßes bedeutet, dass ein Polymerbaublock (zum Beispiel eine der vorstehend erwähnten Basen) auf jeden Punkt eines Reaktionsortes, der in dem ersten Reaktionsschritt erzeugt wurde, aufgebracht werden kann. Das Volumen kann daher entsprechend den spezifischen Anforderungen, wie der Größe und der Anzahl der zu bedruckenden Substrate variieren.
Die Mikrotröpfchen bestehen aus einem Puls von sogar noch kleineren Mikrotröpfchen. Jeder Punkt wird normalerweise aus 1 bis 100, besonders bevorzugt 50 Pulsen mit einem Volumen pro Puls von je 1 bis 100, besonders bevorzugt 20 pl, das heißt 1 nl für jeden Punkt, gebildet. Eine vorher definierte Anzahl von Punkten bildet ein Array. Mehrere Arrays sind regulär oder nichtregulär auf dem Substrat angeordnet und bilden einen Biochip. Es sind zum Beispiel 96 Arrays auf einem Substrat angeordnet, jedoch werden im Zusammenhang mit der Erfindung auch weniger oder mehr Arrays verwendet. Das Volumen eines Mikromischgefäßes zum Drucken eines Biochips, der 96 Arrays mit 128 Punkten auf jedem Array umfaßt, würde folglich ≅ 13 μl betragen. Falls mehrere Biochips gleichzeitig gedruckt werden sollen, muß das Volumen angepasst werden oder alternativ dazu das Mikromischgefäß nach Beendigung des Aufbringens auf dem ersten Biochip wieder aufgefüllt werden. Es sollte angemerkt werden, dass die Lebensdauer für die Mischung aus Synthon (Base) und Aktivator nicht 1 Stunde überschreiten sollte, um eine Zersetzung zu vermeiden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bildet das „Totvolumen" des Inkjet-Druckkopfs das erfindungsgemäße Mikromischgefäß.
Nach Mischen des Aktivators und der Base in dem Mikromischgefäß 107, 108, 109 und 110 wird die Lösung zum Inkjet-Druckkopf 103, 104, 105 und 106 transportiert, das heißt es gibt einen Druckkopf für jede Base. Der Druckkopf 103, 104, 105 und 106 weist eine lineare Anordnung einer Vielzahl von kleinen Düsen auf. Die Düsen sind vorzugsweise piezoelektrische Pumpen, die einzeln adressierbar sind, so dass ein Mikrotröpfchen aus nur einer Düse von einer Vielzahl von Düsen erzeugt wird. Die Anzahl der Düsen beträgt entweder 64 oder 128 oder in einer besonders bevorzugten Ausführungsform 256. Das Substrat 102 wird dann zum Inkjet-Druckkopf 103 bewegt, der eine Lösung von beispielsweise A und TET enthält. Entsprechend der Anzahl der Reaktionsstellen, die auf dem Substrat 102 erzeugt werden sollen, wird eine oder eine vorher ausgewählte Anzahl oder werden alle Düsen Mikrotröpfchen auf die Oberfläche des Substrats 102 aufbringen. Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktion wird das Substrat 102 dann zur Behandlungskammer 112 transportiert, die eine Spüleinheit 113, eine Cappingeinheit („Capping 1) 114 und eine Entschützungseinheit 115 umfaßt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung bildet das Substrat 102 eine Wand der Behandlungskammer 112. Das Versiegeln wird durch einen Druck der Kammer auf das Substrat mit oder ohne Versieglungsmittel erreicht. Weitere nicht in 1 dargestellte Einheiten umfassen eine weitere Cappingeinheit („Capping 2") für das Capping der nicht-umgesetzten Hydroxylgruppen der Nukleotide und eine abschließende Entschützungseinheit und eine Oxidationseinheit zur Oxidations der Nukleotid-Phosphorlinkergruppen. Die abschließende Entschützungseinheit wird (zum Beispiel mit NH₃) das Endoligonukleotid entschützen, um bei Bedarf ein biologisch aktives Oligonukleotid zu erzeugen. Eine typische nicht-einschränkende Reihenfolge von Reaktionsschritten ist die folgende:

1. Mischen von Phosphoramidit + Aktivator, Aufspritzen auf das Substrat, Waschen, Oxidieren, Waschen, Capping 1, Waschen, Entschützen, Waschen, Spülen und Trocknen.
2. Mischen des zweiten Phosphoramidits + Aktivator, Aufspritzen auf das Substrat, Waschen, Oxidieren, Waschen, Capping 2, Waschen, Entschützen, Waschen, Spülen und Trocknen, Wiederholen von Schritt 2 so oft wie gewünscht,
3. Zugeben von NH₃, Waschen; Ende.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die verschiedenen Basen (das heißt die Mischung aus Aktivator und der entsprechenden Base) nacheinander zugegeben, ohne dass das Substrat nach jedem Basezugabe-Schritt zur Behandlungssektion 112 befördert wird. Erst nach der Zugabe aller Basen mit der gleichen Position im Oligonukleotid oder nach der Zugabe einer vorher festgesetzten Anzahl von Basen wird das Substrat zur Behandlungssektion 112 befördert, in der es wie vorstehend beschrieben ist, behandelt wird.
Ein entscheidender Punkt ist, dass das zweite Mikrotröpfchen einen größeren Durchmesser als das erste Mikrotröpfchen aufweist, das den Reaktionsort definiert. Nach dem Aufbringen des ersten Mikrotröpfchens werden die nicht-umgesetzten reaktiven Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats 102 mit einem Cappingmittel (Capping 1 oder „Oberflächen-Capping") umgesetzt, vorzugsweise mit einem Phosphor-enthaltenden Mittel, das somit während des vollständigen Synthesezyklus der Polymerkette in eine chemisch inerte Einheit umgewandelt wird (zum Beispiel Phosphate, Perfluoralkyl- oder Arylphosphate, C₈-C₂₀-Alkylphosphate).
2a zeigt eine schematische Ansicht auf einen Druckkopf 200, der in dem erfindungsgemäßen System verwendet werden soll. Der Duckkopf 200 weist ein Metallgehäuse 201 auf. An der Unterseite des Metallgehäuses 201 ist eine einzeln addressierbare Düse 207 angeordnet. Das Innere des Gehäuses 201 enthält eine Kammer 205, in der die zusammen mit dem Aktivator gemischte Base gesammelt wird. Die Kammer 205 steht in fluider Verbindung mit der Düse 207. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Kammer 205 das erfindungsgemäße Mikromischgefäß, in dem der Polymerbaublock und bei Bedarf der Aktivator zusammengemischt werden. Die Düse 207 ist über Piezoelemente 203 addressierbar, die einen Piezostecker 204 aufweist, wodurch die exakte Definition des Aufbringmusters gestattet wird. Der Druckkopf 200 ist weiterhin mit Flüssigkeitszufuhrelementen 206 ausgestattet.
2b zeigt einen Aufbau 205 einer Vielzahl von Druckköpfen 200. Jeder Druckkopf 200 ist mit einem anderen verbunden. Die Düsen 207 sind unter Bildung einer Düsenlinie 202 linear angeordnet. Die Anzahl der Düsen ist individuell entsprechend der Anzahl der verwendeten Druckköpfe 200 wählbar. Bevorzugt sind 128 bis 256 Düsen. Es ist klar, dass ebenfalls weniger Düsen, zum Beispiel 64, 32 und dergleichen innerhalb der Erfindung verwendet werden können. Die Druckköpfe 200 stehen über die Fluidzufuhr 206, die jeden Druckkopf addressiert in fluider Verbindung.
3 zeigt eine andere schematische Ausführungsform des erfindungsgemäßen Systems 300. Das System 300 umfaßt eine drehbare Trommel 301, auf der ein Substrat 317 angebracht ist. Das Substrat ist im wesentlichen dasselbe wie vorstehend beschrieben wurde. Um die Trommel herum sind Inkjet-Druckköpfe 304, 305, 306 und 307 für jede entsprechende Base und Aktivator angeordnet. Benachbart zu den Druckköpfen 304, 305, 306 und 307 befinden sich Mikromischgefäße 308, 309, 310, 311, in denen die Vormischung der zu verwendeten Base und des entsprechenden Aktivators unmittelbar vor der Erzeugung der Mikrotröpfchen und vor dem Aufspritzen der Lösung auf die Substrate gebildet wird.
Die Behandlungseinheit umfaßt die Einheiten 312, 313 und 314 für die Spül-, Entschützungs- und Cappingreagenzien („Capping 2"). Weitere nicht in 3 gezeigte Einheiten umfassen Oxidationseinheiten und eine Capping 1-Einheit, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Weiterhin ist um die Trommel herum ein Trockner 315 zum Trocknen des Substrats nach vollständigem Ablauf der Reaktion angeordnet. Das Betrachtungsgerät 316 kann ein Computer-gesteuertes Bildbetrachtungsgerät sein, das den vollständigen Ablauf der Reaktion bei jeder Reaktionsstufe steuert. Dies kann beispielsweise durch Verwendung eines Färbemittels erreicht werden, das zu der Vormischung aus Base und Aktivator zugegeben wird und das dann visuell durch gewöhnliche Mittel vom Stand der Technik, UV/VIS-Spektroskopie, usw. nachgewiesen werden kann. Eine bevorzugte Klasse von Färbemitteln sind Azulenfarbstoffe.
4 zeigt eine schematische Schnittansicht des erfindungsgemäßen Systems mit einem Mikromischgefäß. Das System 400 weist zwei Behälter 401 und 402 auf. Der Behälter 401 enthält den Polymerbaublock, zum Beispiel ein Phosphoramidit, wenn ein Oligonukleotid synthetisiert werden soll (401) und der Behälter 402 ist für einen Aktivator, zum Beispiel Pyridiniumchlorid, Tetrazol und dergleichen. Wie schon in der vorstehenden Beschreibung erklärt wurde wird nicht nur ein Behälter 401 für den Polymerbaublock und falls notwendig ein Aktivatorbehälter 402 verwendet, sondern in einer anderen Ausführungsform der Erfindung auch eine Vielzahl von Behälter 401 für verschiedene Polymerbaublöcke beziehungsweise Aktivatoren verwendet. Der Polymerbaublock, das heißt zum Beispiel ein Phosphoramidit kann in Lösung vorliegen. Beide Behälter 401 und 402 sind über Rohre 405, zum Beispiel aus Teflon^®, mit dem Mikromischbehälter 403 verbunden. Wie schon unter 1 erklärt ist, weist der Mikromischbehälter 403 ein Volumen von ungefähr 40 μl, vorzugsweise ungefähr 5 – 10 μl auf. Das Mikromischgefäß 403 kann zum Beispiel ein Glasrohr in Y-Form sein, das eine Vielzahl von Fritten 404 umfaßt, die zur Minimierung der Größe eines Mikrotröpfchens am Ausgang 409 dienen. Die Fritten 404 bestehen vorzugsweise aus einem chemisch inertem Material, wie zum Beispiel Keramik und dergleichen. Das Mikromischgefäß 403 wird an den beiden Armen, die über Rohre 405 mit den Behältern 401 und 402 verbunden sind, durch Verschlusskappen 406 verschlossen. Der Ausgang 409 des Mikromischbehälters 403 ist mit dem Inkjet-Kopf 407 verbunden. Von dem Inkjet-Kopf 407 fallen die Mikrotröpfchen auf das Substrat, das in 4 nicht dargestellt ist. Die in 4 nicht gezeigten Mikrotröpfchen bilden die Mikropunkte 408 und die Oberfläche des Substrats.
5 zeigt eine schematische Seitenansicht eines erfindungsgemäßen Biochips. Der Biochip 500 umfaßt ein Substrat 501, das zum Beispiel Polyethylen, Polypropylen oder deren Mischungen ist und das eine funktionelle Sauerstoffgruppen-umfassende Oberfläche enthält. Nach dem vollständigen Ablauf des Reaktionszyklus, so wie er vorstehend beschrieben ist, wird eine der funktionellen Gruppen einer Oligonukleotidsequenz C-T-G-A auf die Oberfläche des Substrats gebunden. Wie vorstehend beschrieben ist, wurde ein Reaktionsbereich durch das erste Mikrotröpfchen erzeugt. Um die Reaktionszone herum werden die restlichen funktionellen Hydroxylgruppen mit einem Phosphor-enthaltenden Reagenz gecapped (Oberflächencapping), das dann zu einem fünfwertigen Phosphor oxidiert wird, um eine chemisch inerte Phosphatspezies auf der Chipoberfläche zu erzeugen. Die Substituenten am Phosphor sind nicht in 5 gezeigt. Bevorzugte Phosphorsubstituenten umfassen perfluorierte Alkyl, Aryl, Aralkyl, Alkylgruppen und dergleichen.
6 zeigt eine weitere schematische Schnittansicht eines erfindungsgemäßen Systems mit einem Mikromischgefäß. Das System 600 umfaßt, wie vorstehend beschrieben ist, einen Inkjet-Druckkopf 601. Es ist klar, dass das System eine Vielzahl von Druckköpfen 601 umfaßt, die nicht in 6 gezeigt sind, wobei jeder Druckkopf für einen unterschiedlichen Polymerbaublock verwendet wird.
Für jeden Druckkopf 601 sind ein Behälter 602 für das Waschlösungsmittel, zum Beispiel Acetonitril oder ein anderes geeignetes Lösungsmittel, wie es zum Beispiel zum Lösen von Phosphoramiditen verwendet wird, ein Behälter für den Aktivator 603 und ein Behälter mit einer Lösung des Polymerbaublocks 604 mit dem Mikromischgefäß 610 verbunden. Die Form und das Material, sowie auch das Volumen dieser Behälter kann entsprechend den spezifischen Anforderungen gewählt werden. Die Behälter 602, 603 und 604 sind über flexible Rohre verbunden, die vorzugsweise aus Teflon^® oder einem ähnlichen Material wie dasjenige des Mikromischbehälters 610 bestehen. Der Mikromischbehälter kann beispielsweise aus Glas, chemisch inertem Kunststoffmaterial und dergleichen bestehen. Die spezifische Form kann jede für den beabsichtigten Zweck zulässige Form sein. Das Volumen des Mikromischgefäßes 610 ist wie in der vorstehenden Beschreibung definiert, so dass nur die genaue Menge der Mischung der Polymerbaublocks mit einem Aktivator, Mischung 606 in dem Mikromischgefäß 610 vorhanden ist. Die Rohre 611, 612 und 613 gehen über die Ventile 609, 607, 607 bis in den Mikromischbehälter 610 hinein. Zusätzlich kann ein Meniskussystem 608 auf der Oberseite des Mikromischbehälters 610 angebracht werden. Das Mikromischgefäß 610 wird zur Vermeidung des Eindringens von Luft mit Verschlußmittel 614 verschlossen. Das Mikromischgefäß 610 wird durch Verbindungsmittel 615 mit dem Inkjet-Druckkopf 601 verbunden. Das Ventil 605 ist ein Ventil zur Steuerung des Durchflusses der Mischung 606 zum Inkjet-Druckkopf 601. Diese besonders bevorzugte Ausführungsform verwendet das Mikromischgefäß 610 nicht nur für die Zugabe der Mischung aus dem Phosphorbaublock, zum Beispiel ein Phosphoramidit und einem Aktivator, sondern auch für das Waschen des Substrats mit einem Waschlösungsmittel nach der Reaktion. Der Aufbau kann daher weiter vereinfacht und bequemer gemacht werden.

Claims

Automatisiertes Polymersynthesesystem zur Synthese einer Polymerkette auf einem festes Substrat durch aufeinanderfolgendes Hinzufügen von Polymerbaublöcken, umfassend die folgenden Merkmale. a) Inkjet-Druckkopf, umfassend eine Vielzahl von Düsen zur gesteuerten Erzeugung eines Mikrotröpfchens, das einen Polymerbaublock umfaßt, b) Behandlungseinheit zum Behandeln eines Substrats, auf dem ein Mikrotröpfchen mit einem Fluid aufgetragen wurde, c) Transportmittel zum Befördern eines Substrats, das zum Druckkopf und zur Behandlungseinheit benachbart liegt, d) zum Druckkopf benachbartes Mikromischgefäß, in dem der Polymerbaublock mit einem Aktivator gemischt wird.
System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elemente linear angeordnet sind.
System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elemente kreisförmig angeordnet sind.
System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vielzahl der Düsen linear angeordnet ist.
System nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass jede Düse einzeln addressierbar ist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkjet-Kopf einen Behälter in Verbindung mit jeder Düse umfaßt.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikromischgefäß nur die Menge an Polymerbaublöcken umfaßt, die für jeden einzelnen Reaktionsschritt aufgebracht werden soll.
System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass jeder einzelne Polymerbaublock in einem getrennten Behälter gelagert wird.
System nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass jeder einzelne Aktivator in einem getrennten Behälter gelagert wird.
Verfahren zur Synthese von Polymeren auf festen Substraten, umfassend die aufeinanderfolgende Reaktion von Polymerbaublöcken, die reaktive Gruppen umfassen, die mit entfernbaren Schutzgruppen geschützt sind, und das die folgenden Schritte umfaßt: a) Bereitstellen einer polymeren Oberfläche, wobei die polymere Oberfläche reaktive Gruppen umfaßt, b) Aufbringen eines ersten Mikrotröpfchens, umfassend einen ersten Polymerbaublock, auf die Oberfläche, c) Umsetzen des ersten Polymerbaublocks mit einer reaktiven Gruppe der polymeren Oberfläche, wobei der erste Polymerbaublock auf die polymere Oberfläche gebunden wird d) Entfernen einer Schutzgruppe des Polymerbaublocks, e) Aufbringen eines zweiten Mikrotröpfchens auf das erste Mikrotröpfchen, umfassend einen zweiten Polymerbaublock, f) Umsetzen des zweiten Polymerbaublocks mit der entschützten reaktiven Gruppe des ersten Polymerbaublocks, e) bei Bedarf, aufeinanderfolgendes Wiederholen der Schritte d)–f), dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt c) die restlichen reaktiven Oberflächengruppen mit einer nicht-entfernbaren Schutzgruppe umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Mikrotröpfchen einen Durchmesser zwischen 1 μm und 1000 μm aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass erste Mikrotröpfchen einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist als der Durchmesser des zweiten Mikrotröpfchens.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-entfernbaren Schutzgruppen Phosphor umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche ein integraler Bestandteil des Substrats ist.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die polymere Oberfläche ein organisches Polymer umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktiven Gruppen aus OH, NRH ausgewählt sind, wobei R H, eine Alkyl-, vorzugsweise eine C₁-C₄-Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe, eine Cycloalkylgruppe, eine SH-Gruppe sein kann.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymerbaublock ausgewählt ist aus Nukleosiden, Nukleotiden, Aminosäuren, Peptiden und Kohlenwasserstoffen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass unmittelbar vor Schritt b) der Aktivator mit dem ersten Polymerbaublock ein einem Mikrobehälter gemischt wird.
Biochip umfassend ein festes Substrat mit reaktiven Gruppen auf einer Oberfläche und Biomoleküle, die an die reaktiven Gruppen auf der Oberfläche gebunden sind, wobei die restlichen reaktiven Gruppen auf der Oberfläche nicht-entfernbare Schutzgruppen aufweisen.
Biochip nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-entfernbaren Schutzgruppen Phosphor umfassen.
Biochip nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle aus der Gruppe ausgewählt sind, die Nukleotide, Oligonukleotide, Polypeptide und Polykohlenwasserstoffe umfaßt.
Biochip nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Subtrat eine organische polymere Substanz umfaßt.
Biochip nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die organische polymere Substanz aktiviertes Polypropylen ist.
Biochip erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18.
Verwendung eines Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Herstellung von Biochips oder Genchips.