DE60132099T2 - Fokussierte akustische energie in der herstellung und screening von kombinatorischen bibliotheken - Google Patents

Fokussierte akustische energie in der herstellung und screening von kombinatorischen bibliotheken Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft im allgemeinen die Verwendung fokussierter akustischer Energie bei der Abgabe von Flüssigkeiten auf dem Gebiet der anorganischen, der organischen und der biomolekularen Chemie. Fokussierte akustische Energie wird verwendet, um eine akustische Abgabe von Fluidtropfen aus einer breiten Auswahl von Materialien zu bewirken, um kombinatorische Sammlungen, z. B. von Molekülen, Gemischen und geschichteten Mehrkomponentenmaterialien, herzustellen. Die kombinatorischen Sammlungen können für die Entdeckung und Bewertung der Zusammensetzung von Materie mit nützlichen biologischen, chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften verwendet werden. Ein besonderes Augenmerk der Erfindung liegt auf der systematischen Erzeugung von dichten Mikroarrays mit kombinatorischen Stellen als Merkmalen auf einer Substratoberfläche.
  • STAND DER TECHNIK
  • Die Entdeckung neuer Materialien mit nützlichen biologischen, chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften führt häufig zum Hervorbringen nützlicher Produkte und Technologien. In zurückliegenden Jahren hat sich extensive Forschung auf die Entwicklung und Implementierung neuer Verfahren und Systeme zum Bewerten möglicher nützlicher chemische Verbindungen konzentriert. In dem Biomakromolekülbereich wird viel der derzeitigen Forschung potentiellen Verfahren zum schnellen und genauen Identifizieren von Eigenschaften verschiedener Oligomere von spezifischen Monomersequenzen, einschließlich Liganden- und Rezeptorwechselwirkungen, aufgewendet durch Screenen kombinatorischer Sammlungen von Biopolymeren einschließlich nukleotidischer, peptidischer und saccharidischer Polymere. Die Eigenschaften solcher kombinatorischer Produkte eröffnen eine potentielle Verwendbarkeit für eine Vielzahl von Anwendungen. Biologische und nichtbiologische kombinatorische Sammlungen können potentiell als supraleitende Materialien, dielektrische Materialien, magnetische Materialien (einschließlich Resonanzproben), phosphoreszierende Materialien, fluoreszierende Materialien, Materialien zur radioaktiven Markierung, photolabile Materialien, thermolabile Reste, optische Materialien, thermoelektrische Materialien, Scheidematerialien (einschließlich mikroporösen Scheidematerialien, physikochemischen Scheidematerialien und substratbindende Eigenschaften) und ähnliche eingesetzt werden.
  • Für biologische Moleküle macht die Komplexität und Variabilität biologischer Wechselwirkungen und der physikalischen Wechselwirkungen, die z. B. einen Proteinaufbau oder eine Struktur anders als die primäre Struktur bestimmen, eine Vorhersehbarkeit biologischer, Material-, physikalischer und/oder chemischer Eigenschaften aus theoretischen Überlegun gen heraus derzeit unmöglich. Für nichtbiologische Materialien, einschließlich schüttfähiger Flüssigkeiten und Feststoffe fehlt trotz vieler Untersuchungen und großer Fortschritte im Verständnis, immer noch ein theoretisches Gerüst, welches vorab eine ausreichend genaue Vorhersage der Zusammensetzung, Struktur und synthetischen Bereitung neuer Materialien ermöglicht.
  • Folglich hängt die Entdeckung neuer nützlicher Materialien zum großen Teil von der Kapazität, neue Materialzusammensetzungen herzustellen und zu charakterisieren, ab. Von den Elementen in dem Periodensystem, die verwendet werden können, um Zusammensetzungen aus mehreren Elementen herzustellen, wurden relativ wenige der praktisch unerschöpflichen möglichen Zusammensetzungen realisiert oder charakterisiert. Es existiert folglich auf dem Gebiet ein allgemeines Bedürfnis nach einem systematischeren, effizienteren und ökonomischeren Verfahren zum Synthetisieren neuer Materialien und zum Screenen dieser auf nützliche Eigenschaften. Darüber hinaus besteht eine Notwendigkeit für ein flexibles Verfahren, um Zusammensetzungen von Materie aus verschiedenen Materialtypen und Kombinationen der Materialtypen herzustellen, einschließlich molekularer Materialien, kristallinen kovalenten und ionischen Materialien, Legierungen und Kombinationen davon, wie z. B. kristalline ionische und Legierungsmischungen oder kristalline ionische und geschichtete Legierungsmaterialien.
  • Das Immunsystem ist ein Beispiel für systematische makromolekulare kombinatorische Protein- und Nukleinsäurechemie, die in der Natur ausgeführt wird. Sowohl das humorale als auch zellvermittelte Immunsystem erzeugen Moleküle mit neuen Funktionen durch Erzeugen riesiger Sammlungen von Molekülen, die systematisch auf eine erwünschte Eigenschaft überprüft werden. Zum Beispiel ist das humorale Immunsystem in der Lage zu bestimmen, welcher der 1012 B-Lymphozytklone, die verschiedene Antikörpermoleküle bilden, sich an einen bestimmten Epitop- oder immunogenischen Ort binden, um diejenigen Klone zu finden, die spezifisch verschiedene Epitope eines Immunogens binden, und um ihre Proliferation und Maturation in Plasmazellen, die Antikörper bilden, zu stimulieren. Da T-Zellen, die für die zellvermittelte Immunität verantwortlich sind, regulatorische Klassen von Zellen und Killer-T-Zellen umfassen, und die regulatorischen T-Zellklassen auch beim Steuern sowohl der humoralen als auch der zellularen Reaktion beteiligt sind, existieren mehr Klone von T-Zellen als von B-Zellen und müssen für eine passende Immunreaktion überprüft und ausgewählt werden. Darüber hinaus ist die embryologische Entwicklung sowohl von Tals auch von B-Zellen ein systematischer und essentieller kombinatorischer DNA-Splice-Prozeß sowohl für schwere als auch für leichte Ketten. Siehe z. B. Therapeutic Immunology, Herausgeber Austen et al. (Blackwell Science, Cambridge MA, 1996).
  • Kürzlich wurde das kombinatorische Können des Immunsystems genutzt, um Antikörper gegen kleine organische Moleküle, wie z. B. Haptene, auszuwählen, wobei einige dieser Antikörper eine katalytische Aktivität akin zu enzymatischer Aktivität mit den kleinen organischen Molekülen als Substrat, die als "katalytische Antikörper" bezeichnet werden (Hsieh et. al. (1993) Science 260 (5016):337–9) zeigen. Der vorgeschlagene Mechanismus von katalytischen Antikörpern ist eine Verformung des molekularen Aufbaus des Substrats hin zu dem Übergangszustand für die Reaktion und umfaßt zusätzlich eine elektrostatische Stabilisierung. Die Synthetisierung und das Überprüfen großer Sammlungen von Molekülen wurde, nicht unerwartet, auch zur Arzneimittelentdeckung verwendet. Es ist bekannt, daß Proteine eine induzierte Anpassung für ein gebundenes Molekül, wie z. B. ein Substrat oder einen Liganden, bilden (Stryer, Biochemistry, 4. Ausgabe (1999) W.H. Freeman & Co., New York), wobei das gebundene Molekül an die Stelle paßt, so ähnlich wie eine Hand in einen Handschuh paßt, was eine Grundstruktur für den Handschuh erfordert, die dann mit der Hilfe eines Substrats oder eines Liganden in die gebundene Struktur geformt wird.
  • Geysen et al. (1987) J. Immun. Meth. 102:259-274 haben eine parallele kombinatorische Peptidsynthese auf Stäben oder Nadeln entwickelt, welche eine Funktionalisierung der Enden polymerer Stäbe umfaßt, um eine kovalente Befestigung einer ersten Aminosäure zu verstärken, und ein nachfolgendes Eintauchen der Enden in Lösungen individueller Aminosäuren. Über das Geysen et al.-Verfahren hinaus wurden kürzlich Techniken zum Synthetisieren großer Arrays von verschiedenen Peptiden und anderen Polymeren auf festen Oberflächen eingeführt. Arrays können einfach als zusätzliche effiziente Überprüfungswerkzeuge angesehen werden. Eine Miniaturisierung von Arrays spart synthetische Reagenzien und schont die Probe, was eine nützliche Verbesserung sowohl in biologischen als auch nicht biologischen Zusammenhängen ist. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 5,700,637 und 6,054,270 von Southern et al., die ein Verfahren zum chemischen Synthetisieren eines Arrays mit hoher Dichte von Oligonukleotiden mit ausgewählter monomerer Einheitslänge innerhalb diskreter Zellen oder Bereiche eines Trägermaterials beschreiben, wobei das Verfahren einen Tintenstrahldrucker verwendet, um individuelle Monomere auf dem Träger abzuscheiden. Bis jetzt waren jedoch miniaturisierte Arrays teuer herzustellen und enthielten signifikante Mengen unerwünschter Produkte an Stellen, an denen ein erwünschtes Produkt erzeugt wird. Daher trifft die Verwendung biomakromolekularer Mikroarrays mit hoher Dichte sogar in dem biologischen Bereich, in dem eine gegebene Probe einzigartig und daher unbezahlbar sein kann, auf Widerstand durch die akademische Gemeinschaft als zu kostenintensiv und noch unzureichend zuverlässig, verglichen mit Arrays, die von Laborpersonal hergestellt werden.
  • Arrays von Tausenden oder sogar Millionen verschiedener Zusammensetzungen der Elemente können durch solche Verfahren gebildet werden. Verschiedene durch mikroelek tronische Festphasenherstellung erhaltene synthetische Polymertechniken wurden als "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis" oder "VLSIPS" Technologie bezeichnet. Solche Verfahren waren erfolgreich beim Überprüfen potentieller Peptid- und Oligonukleotidliganden zum Bestimmen der relativen Bindungsaffinität der Liganden für Rezeptoren.
  • Die derzeit verwendeten parallelen, räumlich gerichteten synthetischen Festphasentechniken, um kombinatorische Biomolekülsammlungen zu bereiten, benötigen schrittweise oder sequentiell ein Koppeln von Monomeren. Das US-Patent Nr. 5,143,854 von Pirrung et al. beschreibt die Synthese von Polypeptidarrays, und das US-Patent Nr. 5,744,305 von Fodor et al. beschreibt ein analoges Verfahren zum Synthetisieren von Oligo- und Polynukleotiden in situ auf einem Substrat durch kovalentes Binden photoentfernbarer Gruppen auf der Oberfläche des Substrats. Ausgewählte Substratoberflächenorte werden durch Verwendung einer Maske Licht ausgesetzt, so daß diese aktiviert werden. Eine Aminosäure oder ein Nukleotidmonomer mit einer photoentfernbaren Gruppe wird dann an dem aktivierten Bereich befestigt. Die Schritte der Aktivierung und der Befestigung werden wiederholt, um Polynukleotide und Polypeptide der gewünschten Länge und Sequenz herzustellen. Andere synthetische Techniken, dargestellt durch die US-Patente Nr. 5,700,637 und 6,054,270 von Southern et al., lehren die Verwendung von Tintenstrahldruckern, die auch eine im wesentlichen parallele Synthese darstellen, da das synthetische Muster vor dem Beginn des "Druckens" des Musters vordefiniert sein muß. Diese Festphasensynthesetechniken, die die sequentielle Kopplung von Aufbaublöcken (z. B. Aminosäuren) umfassen, um die interessierenden Verbindungen zu bilden, können nicht einfach verwendet werden, um viele anorganische und organische Verbindungen zu bereiten.
  • Das US-Patent Nr. 5,985,356 von Schultz et al. lehrt kombinatorische Chemietechniken auf dem Gebiet der Materialwissenschaft, wobei Verfahren und eine Vorrichtung zur Synthese und Verwendung eines Arrays verschiedener Materialien in vordefinierten Bereichen eines Substrats bereitgestellt werden. Ein Array von verschiedenen Materialien auf einem Substrat wird gebildet durch Bereitstellen von Komponenten verschiedener Zusammensetzungen von Materie auf vordefinierten Substratoberflächenorten. Diese synthetische Technik erlaubt es, viele Materialklassen durch systematische kombinatorische Verfahren herzustellen. Beispiele, die Typen von Materialien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf anorganische Materialien, einschließlich ionischen und kovalenten kristallinen Materialien, intermetallischen Materialien, Metallegierungen und Verbundmaterialien einschließlich Keramiken. Solche Materialien können als synthetisches Array auf nützliche Festkörper- und Oberflächeneigenschaften untersucht werden, z. B. auf elektrische Eigenschaften einschließlich Supraleitung und Halbleitung, und thermische, mechanische, thermoelektrische, opti sche, optoelektronische, Fluoreszenz- und/oder biologische Eigenschaften einschließlich Immunogenität.
  • Die Entdeckung und Charakterisierung von Materialien erfordert häufig ein kombinatorisches Abscheiden von dünnen Filmen mit genau bekannter chemischer Zusammenset zung, Konzentration, Stöchiometrie, Fläche und/oder Dicke. Vorrichtungen und Verfahren zum Herstellen von Arrays verschiedener Materialien, jedes mit unterschiedlicher Zusammensetzung, Konzentration, Stöchiometrie und Dünnschichtdicke an bekannten Substratstellen, welche ein systematisches kombinatorisches Array basierend auf der Synthese und Analyse ermöglichen, die Dünnschichtabscheidungsverfahren verwenden, sind bereits bekannt. Obwohl existierende Dünnschichtverfahren die Genauigkeit der Reagenzbereitstellung, die benötigt wird, um Arrays verschiedener Materialien herzustellen, hervorgebracht haben, ist die Vordefinition, welche in diesen synthetischen Techniken erforderlich ist, unflexibel, und die Techniken sind langsam und daher relativ teuer. Darüber hinaus sind Dünnschichttechniken inhärent weniger geeignet, um experimentelle Materialien unter Bedingungen zu erzeugen, die drastisch von Bedingungen abweichen, die thermodynamisch reversibel oder nahe thermodynamisch reversibel sind. Daher besteht ein Bedürfnis nach einer effizienteren und schnelleren Bereitstellung präziser Mengen von Reagenzien, die zur Materialarraypräparation benötigt werden, mit größerer Flexibilität für die Vordefinition und Bildungsbedingungen als durch Dünnschichtverfahren erhältlich.
  • Bei der kombinatorischen Synthese von Biomakromolekülen beschreiben die US-Patente Nr. 5,700,637 und 6,054,270 von Southern et al., wie zuvor erwähnt, ein Verfahren zum Erzeugen eines Arrays von Oligonukleotiden mit ausgewählter monomerischer Einheitslänge innerhalb diskreter Zellen oder Bereiche eines Trägermaterials. Das in situ-Verfahren, das im allgemeinen für Oligo- oder Polynukleotidsynthese beschrieben wird, umfaßt: Koppeln eines Nukleotidprecursors an einen diskreten vorbestimmten Satz von Zellorten oder -bereichen, Koppeln eines Nukleotidprecursors an einen zweiten Satz von Zellorten oder -bereichen, Koppeln eines Nukleotidprecursors an einen dritten Satz von Zellorten oder -bereichen und Fortsetzen der Sequenz von Kopplungsschritten, bis das gewünschte Array erzeugt wurde. Eine kovalente Vernetzung wird an jedem Ort bewirkt, entweder mit der Oberfläche des Trägers oder mit einem Nukleotid, das in einem vorangegangenen Schritt gekoppelt wurde.
  • Die '637- und '270-Patente lehren auch, daß undurchlässige Substrate gegenüber durchlässigen Substraten, wie z. B. Papier, bevorzugt sind beim Bewirken vorkombinatorischer Stellendichten, da die benötigten Fluidvolumen zu einer Migration oder einer Dochtwirkung durch ein durchlässiges Substrat führen, was das Erhalten der kleinen Merkmalsgrößen, die für hohe Dichten erforderlich sind (wie z. B. diejenigen, die durch parallele photoli thographische Synthese erhalten werden können, welche ein Substrat erfordert, das optisch gleichmäßig und im allgemeinen ebenfalls undurchlässig ist, siehe US-Patent Nr. 5,744,305 von Fodor et al.), ausschließt. Da das Tintenstrahldruckverfahren eine parallele Synthesetechnik ist, die es erfordert, daß das Array "vorbestimmter" Natur ist, und das daher unflexibel ist und keine Merkmalstellen in dem Mikrometerbereich oder kleiner ermöglicht, verbleibt ein Bedürfnis im Stand der Technik nach einem nicht photolithographischen kombinatorischen in situ-Arrayherstellungsverfahren, das die hohen durch photolithographische Arrays erhaltbare Dichten bereitstellen kann, eine Leistung, die kleine Volumen von Reagenzien erfordert und ein hochgradig genaues Abscheidungsverfahren ohne die Unflexiblität eines hochgradig parallelen Prozesses, der eine vorbestimmte Stellensequenz benötigt. Da durchlässige Substrate einen größeren Oberflächenbereich zur Lokalisierung von Arraykomponenten bieten, ist ein Verfahren zum nicht-photolithographischen Bewirken eines kombinatorischen Arrays mit hoher Dichte durch Bereitstellen ausreichend kleiner Volumen, so daß eine Verwendung durchlässiger Substrate ermöglicht wird, auch ein Fortschritt gegenüber dem derzeitigen Stand der Technik bei der Arrayherstellung.
  • Wie oben erklärt, ist die parallele photographische in situ-Herstellung biomolekularer Arrays mit hoher Dichte, z. B. Oligonukleotid- oder Polynukleotid-Arrays, auch aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel beschreiben die US-Patente Nr. 5,744,305 und 5,445,934 von Fodor et al. Arrays von Oligonukleotiden und Polynukleotiden, die an einer Oberfläche eines planaren nicht porösen festen Trägers mit einer Dichte befestigt sind, welche 400 bzw. 1000 verschiedene Oligonukleotide/cm2 übersteigt. Die Arrays werden erzeugt, wobei lichtgeführte, räumlich ansteuerbare Synthesetechniken verwendet werden (siehe US-Patente Nr. 5,143,854 und 5,405,783 und die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 90/15070 ). In Bezug auf diese photolithographisch parallel in situ synthetisierten Mikroarrays haben Fodor et al. photolabile Nukleosid- und Peptid-Schutzgruppen entwickelt und Maskierungs- und Automatisierungstechniken (siehe US-Patent Nr. 5,489,678 und die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 92/10092 ).
  • Die zuvor erwähnten Patente offenbaren, daß photolithographische Techniken, die im allgemeinen bei der Halbleiterherstellung verwendet werden, bei der Herstellung von Arrays mit hoher Dichte angewandt werden können. Die photolithographische in situ-Synthese ist am besten für die parallele Synthese, wobei eine unmäßige Anzahl von Maskierungsschritten erforderlich ist, um eine sequentielle in situ-Synthese eines kombinatorischen Arrays zu bewirken. Sogar die parallele kombinatorische Arraysynthese, welche eine minimierte Anzahl von Maskierungsschritten verwendet, verwendet eine signifikante Anzahl solcher Schritte, die sich für jede monomere Einheit, die der Synthese hinzugefügt wird, erhöht. Darüber hin aus ist die parallele photolithographische in situ-Arraysynthese unflexibel und erfordert eine vorbestimmte Maskensequenz.
  • Da eine photolithographische Herstellung eine große Anzahl von Maskierungsschritten erfordert, wird die Ausbeute dieses Prozesses relativ zu einer nicht photolithographischen in situ-Synthese durch den Ausfall des Abblockens und/oder nicht angemessene Photoabblockung durch einige der photolabilen schützenden Gruppen verringert. Diese Probleme mit photolabilen schützenden Gruppen lösen das praktische Ausbeuteproblem für Mehrschritt-in situ-Synthesen im allgemeinen durch Hinzufügen photochemischer Schritte zu dem Syntheseprozeß. Die Probleme wurden nicht durch die Fortschritte angesprochen, die im Stand der Technik bei der Herstellung und Verwendung solcher photolabilen Blocker für in situ-Synthesen gemacht wurden, teilweise, da einige photolabile Abblockgruppen von dem Licht abgeschirmt sind oder von dem Polymer, auf dem sie sitzen, "vergraben" sind, einem Effekt, der sich mit zunehmender Polymerlänge verschlimmert. Daher ist die Reinheit des erwünschten Produkts gering, da das Array beachtliche Verunreinigungen unerwünschter Produkte enthält, die sowohl die Sensitivität als auch die Selektivität reduzieren.
  • Da der photolithographische Prozeß zur in situ-Synthese Stellenkanten mit Maskenlinien, Maskenunzulänglichkeiten und Fehlausrichtung bildet, können diffraktive Effekte und Störungen der optischen Gleichmäßigkeit des Substrats sich kombinieren, so daß die Reinheit reduziert wird durch Erzeugen von Polymeren als Verunreinigungen, die in der Sequenz und/oder Struktur den gewünschten Polymeren ähnlich sind, einem Problem, das an den Stellenkanten betonter wird. Dies verschlimmert sich, wenn photolithographische Protokolle versuchen, die Stellendichte durch Erzeugen von Arrays zu maximieren, die aneinanderstoßende Stellen aufweisen. Da die Wahrscheinlichkeit eines Maskenfehlers oder einer Fehlausrichtung sich mit der Anzahl von Maskierungsschritten und der dazugehörigen Anzahl von Masken erhöht, werden diese Kanteneffekte durch eine erhöhte Anzahl von Maskierungsschritten und die Verwendung mehrerer Maskenmuster, um ein bestimmtes Array herzustellen, verschlechtert. Stellenverunreinigung, d. h. die Erzeugung von Polymeren, die in der Sequenz und/oder Struktur dem erwünschten Polymer ähnlich sind, führt zu einer reduzierten Sensitivität und Selektivität für Arrays, die konstruiert sind, um eine Nukleotidsequenz zu analysieren.
  • Einiger Aufwand wurde darauf gerichtet, Drucktechnologien, insbesondere Tintenstrahldrucktechnologien, so anzupassen, um biomolekulare Arrays zu bilden. Zum Beispiel ist das US-Patent Nr. 6,015,880 von Baldeschwieler et al. auf eine Arrayherstellung gerichtet, welche eine Mehrschritt-in situ-Synthese verwendet. Ein flüssiger Mikrotropfen, der ein erstes Reagenz enthält, wird durch einen einzigen Strahl eines Mehrfachstrahlreagenzspenders auf einen Ort auf der Oberfläche ausgetragen, der chemisch vorbereitet ist, so daß er eine kovalente Befestigung des Reagenz ermöglicht. Der Reagenzspender wird dann relativ zu der Oberfläche versetzt, oder die Oberfläche wird in Bezug auf den Spender versetzt, und mindestens ein Mikrotropfen, der entweder das erste Reagenz enthält, oder ein zweites Reagenz von einem weiteren Spenderstrahl wird an einem zweiten Substratort aufgetragen, der ebenfalls chemisch aktiviert ist, so daß er für eine kovalente Befestigung des zweiten Reagenz reaktiv ist. Optional wird der zweite Schritt wiederholt, wobei entweder die ersten oder zweiten Reagenzien verwendet werden, oder verschiedene flüssigkeitsgetragene Reagenzien von verschiedenen Spenderstrahlen, wobei jedes Reagenz sich kovalent an die Substratoberfläche bindet. Das Patent offenbart, daß Tintenstrahltechnologie verwendet werden kann, um die Mikrotropfen aufzutragen.
  • Jedoch leidet herkömmliche Tintenstrahltechnologie unter einer Anzahl von Nachteilen. Häufig umfaßt Tintenstrahltechnologie ein Erwärmen oder das Verwenden eines piezoelektrischen Elements, um ein Fluid durch eine Düse zu zwingen, um das abgegebene Fluid auf eine Oberfläche zu leiten. Daher kann das Fluid einer Oberfläche ausgesetzt sein, die 200°C vor dem Ausgeben übersteigt, und die meisten, wenn nicht alle peptidischen Moleküle, einschließlich Proteinen, zerfallen unter solchen extremen Temperaturen. Darüber hinaus erzeugt das Zwingen peptidischer Moleküle durch Düsen Scherkräfte, die die Molekularstruktur verändern können. Düsen unterliegen einer Verstopfung, insbesondere wenn sie verwendet werden, um eine Makromoleküle enthaltende Flüssigkeit abzugeben, und die Verwendung erhöhter Temperaturen verschlimmert das Problem, da eine Flüssigkeitsverdampfung zu der Abscheidung ausgefällter Feststoffe auf den Düsen führt. Verstopfte Düsen wiederum können zu fehlgeleitetem Fluid oder der Abgabe von Tröpfchen falscher Größe führen. Zuletzt kann eine herkömmliche Tintenstrahltechnologie, welche eine Düse zur Fluidabgabe verwendet, im allgemeinen nicht verwendet werden, um Arrays mit Merkmalsdichten abzuscheiden, die vergleichbar denjenigen sind, die erhalten werden können, wenn Photolithographie oder andere Techniken verwendet werden, die im allgemeinen bei der Halbleiterprozessierung verwendet werden.
  • Eine Anzahl von Patenten hat die Verwendung akustischer Energie beim Drucken beschrieben. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent Nr. 4,308,547 von Lovelady et al. einen flüssigen Tropfenemitter, der akustische Prinzipien beim Abgeben von Tröpfchen aus einem Flüssigkeitsgehäuse auf ein sich bewegendes Dokument verwendet, so daß Buchstabenstrichcodes darauf gebildet werden. Eine düsenlose Tintenstrahldruckvorrichtung wird verwendet, wobei gesteuerte Tropfen von Tinte durch eine akustische Kraft, die durch einen gekrümmten Wandler an oder unter der Oberfläche der Tinte erzeugt wird, angetrieben werden. Im Gegensatz zu Tintenstrahldruckvorrichtungen unterliegen düsenlose Fluidabgabevorrichtungen, die in dem zuvor erwähnten Patent beschrieben werden, keiner Verstopfung und den hiermit verbundenen Nachteilen, z. B. fehlgeleitetem Fluid oder falsch abgemessenen Tröpfchen.
  • Die Anwendbarkeit der düsenlosen Fluidabgabe für Tintendruckanwendungen wurde im allgemeinen begrüßt. Eine Entwicklung von Tintendruckanwendungen ist primär ökonomisch durch Druckkosten und Druckgeschwindigkeit für akzeptablen Text getrieben. Für akustisches Drucken wurden die Entwicklungsbemühungen daher auf das Reduzieren von Druckkosten reduziert statt die Verbesserung der Qualität und auf ein Erhöhen der Druckgeschwindigkeit statt der Genauigkeit. Zum Beispiel ist das US-Patent Nr. 5,087,931 von Rawson auf ein System zum Transportieren von Tinte unter konstantem Fluß an einen akustischen Tintendrucker mit einer Mehrzahl von Ejektoren, die entlang einer Achse ausgerichtet sind, wobei jeder Ejektor einer freien Oberfläche flüssiger Tinte zugeordnet ist, gerichtet. Wenn eine Mehrzahl von Ejektoren statt einem einzigen Ejektor verwendet wird, erhöht sich im allgemeinen die Druckgeschwindigkeit, jedoch wird die Steuerung der Fluidejektion, insbesondere der Tropfenanordnung, schwieriger.
  • Das US-Patent Nr. 4,797,693 von Quate beschreibt einen akustischen Tintendrucker zum Drucken polychromatischer Bilder auf einem Aufnahmemedium. Der Drucker ist so beschrieben, daß er eine Kombination aus einem Träger, der eine Mehrzahl von verschieden gefärbten flüssigen Tinten aufweist, einem einzigen akustischen Druckkopf, der akustisch mit dem Träger verbunden ist, zum Freigeben konvergierender akustischer Wellen in dem Träger, einem Tintentransportmittel, um den Träger so anzuordnen, daß er sequentiell die verschieden gefärbten Tinten mit dem Druckkopf ausrichtet, und einer Steuerung, um den Strahlungsdruck, der verwendet wird, um Tintentropfen abzugeben, zu modulieren, aufweist. Dieser Drucker ist so beschrieben, daß er für die Realisierung von Kosteneinsparungen konstruiert ist. Da zwei Tröpfchen einer primären Farbe, z. B. Cyan und Gelb, die in ausreichender Nähe zueinander aufgetragen sind, als eine zusammengesetzte oder sekundäre Farbe erscheinen, ist das erforderliche Niveau an Genauigkeit ziemlich gering und zur biomolekularen Arrayherstellung unangemessen. Solch ein Drucker ist insbesondere zur in situ-Synthese ungeeignet, welche eine genaue Tröpfchenabscheidung und eine konsistente Anordnung erfordert, so daß die richtigen chemikalischen Reaktionen auftreten. Das heißt, die Tropfenanordnungsgenauigkeit, die benötigt wird, um die Wahrnehmung einer zusammengesetzten Sekundärfarbe zu bewirken, ist viel geringer als diejenige, die für eine chemische Synthese bei photolithographischen Dichteniveaus benötigt wird. Folglich ist eine akustische Druckvorrichtung, die zum Drucken visuell begreifbarer Materialien geeignet ist, zur Mikroarrayherstellung ungeeignet. Auch kann diese Vorrichtung nur eine begrenzte Menge an Tinte von dem Träger abgeben, bevor sich der Meniskus der Flüssigkeit aus einem akustischen Fokus bewegt und die Tropfenabgabe aufhört. Dies ist eine signifikante Beschränkung für biologische Flüssigkeiten, die typischerweise viel teurer und seltener sind als Tinte. Das Patent von Quate et al. spricht nicht an, wie die meisten der Flüssigkeiten in einem geschlossenen Behälter verwendet werden können, ohne zusätzliche Flüssigkeit von einer externen Quelle hinzuzufügen.
  • Daher besteht im Stand der Technik der kombinatorischen Arrayherstellung ein allgemeines Bedürfnis nach verbesserten räumlich steuerbaren Fluidabgabeverfahren mit ausreichender Tröpfchenabgabegenauigkeit, so daß das Erhalten von Arrays mit hoher Dichte kombinatorischer Materialien, die aus diversen Gruppen von Ausgangsmaterialien gebildet sind, ermöglicht wird. Insbesondere können akustische Fluidabgabevorrichtungen, die hierin beschrieben werden, eine verbesserte räumliche Leitung der Fluidabgabe bewirken ohne die Nachteile des Fehlens an Flexibilität und Gleichförmigkeit, die photolithographischen Techniken oder Tintenstrahldruckvorrichtungen, welche eine Tröpfchenabgabe durch eine Düse bewirken, zugeordnet sind.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Entsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Bilden kombinatorischer Sammlungen bereitzustellen, die die oben erwähnten Nachteile des Standes der Technik überwinden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bilden einer kombinatorischen Sammlung, welche aus einer Mehrzahl von chemischen Einheiten auf der Oberfläche eines Substrats gebildet wird, bereitzustellen, wobei jede chemische Einheit sich von jeder anderen chemischen Einheit unterscheidet, wobei das Verfahren das Einbringen fokussierter akustischer Energie in jeden aus einer Mehrzahl von Behältern, von denen jeder eine andere chemische Einheit in einem Fluid enthält, aufweist, wobei die fokussierte akustische Energie auf eine Weise eingebracht wird, welche bewirkt, daß ein Tröpfchen aus jedem Behälter hin zu einer Stelle auf der Oberfläche des Substrats abgegeben wird, so daß das Tröpfchen, welches die chemische Einheit enthält, daran anhaftet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Herstellen einer kombinatorischen Sammlung aus einer Mehrzahl von verschiedenen Teilen auf einer Substratoberfläche, wobei eine Vorrichtung mit fokussierter akustischer Energie verwendet wird, welche eine akustische Abgabe einer Mehrzahl von Fluidtröpfchen hin zu dafür vorgesehenen Stellen auf einer Substratoberfläche zur Abscheidung darauf ermöglicht. Die Vorrichtung weist auf: eine Mehrzahl von Behältern, die jeder so angepaßt sind, daß sie ein Fluid enthalten, einen akustischen Ejektor, der einen akustischen Strahlungserzeuger und ein Fokussiermittel zum Fokussieren der erzeugten akustischen Strahlung in einem Brennpunkt ausreichend nahe an der Fluidoberfläche in jedem der Behälter aufweist, so daß Tröpfchen daraus abgegeben werden, und ein Mittel zum Anordnen des Ejektors in akustischer Verbindung mit jedem der Behälter. Vorzugsweise ist jeder der Behälter entfernbar und weist ein individuelles Well in einer Titerplatte auf und/oder ist in einem Array angeordnet. Die Behälter sind vorzugsweise im wesentlichen akustisch voneinander ununterscheidbar mit einer passenden akustischen Impedanz, die eine effiziente Fokussierung akustischer Energie nahe der Oberfläche eines enthaltenen Fluids ermöglicht, und die in der Lage sind, Bedingungen des Fluid enthaltenden Reagenz zu widerstehen. In einigen Ausführungsformen, z. B. bei der Herstellung metallischer Arrays, die Gemische aufweisen oder bestimmte andere nicht biologische Materialien, ist die Vorrichtung strukturiert und aus Materialien zusammengesetzt, die zur Verwendung bei erhöhten Temperaturen und reduzierten Drücken geeignet sind, um Festkörper bei Standardtemperatur und Druck (standard temperature and Pressure; STP) zu verflüssigen und/oder reduzierten Temperaturen und erhöhten Drücken zum Verflüssigen von Gasen bei STP. In solchen Ausführungsformen sind auch die Behälter, die Behälterträger und Komponenten der Vorrichtung in Kontakt mit oder nahe bei den Behältern vorzugsweise aus Materialien hergestellt, die typischen Schmelztemperaturen von Metallen widerstehen können, so daß eine Bereitstellung von akustisch abgegebenem geschmolzenem Metall auf dem Substrat ermöglicht wird.
  • Das Verfahren umfaßt im allgemeinen ein Anordnen des akustischen Ejektors, so daß er akustisch mit einem ersten Fluid enthaltenden Behälter verbunden ist, der ein erstes Fluid enthält, und dann Aktivieren des Ejektors, so daß akustische Strahlung erzeugt und gerichtet wird, so daß sie einen Brennpunkt in dem ersten Fluid und nahe der Oberfläche davon aufweist, wodurch ein Fluidtröpfchen hin zu einer ersten dafür vorgesehenen Stelle auf der Substratoberfläche abgegeben wird. Dann wird der Ejektor neu ausgerichtet, so daß er akustisch mit einem zweiten Fluid enthaltenden Behälter verbunden ist, und so wie oben wieder aktiviert, so daß ein Tröpfchen des zweiten Fluids hin zu einer zweiten dafür vorgesehenen Stelle auf der Substratoberfläche abgegeben wird, wobei die ersten und zweiten dafür vorgesehenen Stellen die gleichen sein können oder auch nicht. Wenn es erforderlich ist, kann das Verfahren mit einer Mehrzahl von Fluidbehältern wiederholt werden, die jeder ein Fluid enthalten, wobei jeder Behälter im allgemeinen, obwohl nicht notwendigerweise, ein anderes Fluid enthält. Auch wenn die Fluide in jedem Behälter andere akustische Eigenschaften aufweisen oder auch nicht. Der akustische Ejektor wird daher wiederholt neu angeordnet, so daß ein Tröpfchen von jedem Behälter hin zu einer anderen dafür vorgesehenen Stelle auf einer Substratoberfläche abgegeben wird. Auf solch eine Weise wird das Verfahren leicht an die Verwendung beim Erzeugen eines Arrays von molekularen Zeilen auf einer Substratoberfläche in der Form einer kombinatorischen Sammlung angepaßt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A und 1B, die zusammen als 1 bezeichnet werden, stellen schematisch in einer vereinfachten Querschnittsansicht eine Ausführungsform einer Vorrichtung dar, die in Verbindung mit dem Verfahren der Erfindung nützlich ist, wobei die Vorrichtung erste und zweite Behälter, einen akustischen Ejektor und ein Ejektoranordnungsmittel aufweist. 1A zeigt den akustischen Ejektor akustisch mit dem ersten Behälter verbunden und aktiviert, so daß ein Tröpfchen eines Fluids aus dem ersten Behälter hin zu einer dafür vorgesehenen Stelle auf einer Substratoberfläche abgegeben wird. 1B zeigt den akustischen Ejektor akustisch mit einem zweiten Behälter verbunden.
  • 2A, 2B und 2C, die zusammen als 2 bezeichnet werden, stellen in schematischer Ansicht eine Abwandlung der in 1 gezeigten Vorrichtung dar, wobei die Behälter individuelle Wells in einer Behältertiterplatte aufweisen, und das Substrat weist eine kleinere Titerplatte mit einer entsprechenden Anzahl von Wells auf. 2A ist eine schematische ebene Ansicht der zwei Titerplatten, d. h. der Behältertiterplatte und der Substrattiterplatte, von oben. 2B stellt in einer Querschnittsansicht eine Vorrichtung dar, wobei die Behältertiterplatte aus 2A akustisch mit einem akustischen Ejektor verbunden ist, wobei ein Tröpfchen aus einem ersten Well der Behältertiterplatte in einen ersten Well der Substrattiterplatte abgegeben wird. 2C stellt die in 2B dargestellte Vorrichtung in einer Querschnittsansicht dar, wobei der akustische Ejektor akustisch mit einem zweiten Well der Behältertiterplatte verbunden ist, und wobei darüber hinaus die Vorrichtung so ausgerichtet ist, daß sie es dem akustischen Ejektor ermöglicht, ein Tröpfchen aus dem zweiten Well der Behältertiterplatte in einen zweiten Well der Substrattiterplatte abzugeben.
  • 3A, 3B, 3C und 3D, zusammen als 3 bezeichnet, stellen schematisch in vereinfachter Querschnittsansicht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, in dem ein Dimer in situ auf einem Substrat synthetisiert wird, wobei die Vorrichtung aus 1 verwendet wird. 3A stellt das Abgeben eines Tröpfchens des die Oberfläche modifizierenden Fluids auf eine dafür vorgesehene Stelle einer Substratoberfläche dar. 3B stellt die Abgabe eines Tröpfchens eines ersten Fluids, welches einen ersten molekularen Rest enthält, der zum Anhaften an der modifizierten Oberfläche des Substrats vorgesehen ist, dar. 3C stellt die Abgabe eines Tröpfchens eines zweiten Fluids dar, das einen zweiten molekularen Rest enthält, der zum Anhaften an dem ersten Molekül vorgesehen ist. 3D stellt das Substrat und das in situ durch den in 3A, 3B und 3C dargestellten Prozeß synthetisierte Dimer dar.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bevor die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wird, sollte deutlich werden, daß diese Erfindung nicht auf bestimmte Fluide, Biomoleküle und Vorrichtungsstrukturen beschränkt ist, da diese sich ändern können. Es sollte auch offensichtlich sein, daß die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht beschränkend gedacht ist.
  • Es sollte offensichtlich sein, daß so wie sie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, die Singularformen "ein", "eine" und "der", "die", "das" mehrere Referenzen umfassen, es sei denn, der Zusammenhang gibt klar etwas anderes vor. Daher umfaßt z. B. die Bezugnahme auf "einen Behälter" einen einzigen Behälter sowie eine Mehrzahl von Behältern, eine Bezugnahme auf "ein Fluid" umfaßt ein einziges Fluid sowie eine Mehrzahl und/oder eine Mischung von zwei oder mehr verschiedenen Fluiden, eine Bezugnahme auf "ein Biomolekül" umfaßt ein einziges Biomolekül sowie eine Kombination von Biomolekülen, "ein Rest" kann eine Mehrzahl von Resten bezeichnen.
  • Beim Beschreiben und Beanspruchen der vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß den nachfolgend dargelegten Definitionen verwendet.
  • Die Ausdrücke "akustische Verbindung" und "akustisch verbunden", so wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen einen Zustand, in dem ein Objekt in direktem oder indirektem Kontakt zu einem anderen Objekt angeordnet ist, so daß es akustischer Strahlung ermöglicht wird, zwischen den Objekten ohne wesentlichen Verlust an akustischer Energie übertragen zu werden. Wenn zwei Einheiten indirekt akustisch verbunden sind, wird ein "akustisches Verbindungsmedium" benötigt, um einen Mittler bereitzustellen, durch den akustische Strahlung übertragen werden kann. Daher kann ein Ejektor akustisch mit einem Fluid gekoppelt sein, z. B. durch Eintauchen des Ejektors in das Fluid oder durch Anordnen eines akustischen Kopplungsmediums zwischen dem Ejektor und dem Fluid, so daß akustische Strahlung, die von dem Ejektor erzeugt wird, durch das akustische Kopplungsmedium und in das Fluid übertragen wird.
  • Der Ausdruck "adsorbieren", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die nicht kovalente Rückhaltung eines Moleküls durch eine Substratoberfläche. Das heißt, Adsorption tritt als Folge einer nicht kovalenten Wechselwirkung zwischen einer Substratoberfläche und adsorbierenden Resten auf, die an dem Molekül, das adsorbiert wird, vorhanden sind. Adsorption kann durch Wasserstoffbrückenbildung, Van-der-Waals-Kräfte, polare Anziehung oder elektrostatische Kräfte (z. B. durch ionisches Bonden) auftreten. Beispiele für adsorbierende Reste umfassen Amingruppen, Karboxylsäurereste, Hydroxylgruppen, Nitrosogruppen oder Sulfone, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Häufig können die Substrate mit adsorbierenden Teilen funktionalisiert sein, so daß sie auf eine bestimmte Weise wechselwir ken, so als ob die Oberfläche mit Aminogruppen funktionalisiert ist, um sie positiv in einer pH-neutralen wäßrigen Umgebung aufzuladen. Ähnlich können adsorbierende Gruppen in einigen Fällen hinzugefügt werden, um Adsorption zu bewirken, so als ob ein Grundprotein mit einer sauren Peptidsequenz verschmolzen ist, um Gruppen zu adsorbieren, die elektrostatisch mit einer positiv geladenen adsorbierenden Gruppe Wechselwirken können.
  • Der Ausdruck "angehaftet" wie zum Beispiel in "eine Substratoberfläche mit einer daran "angehafteten" Gruppe", umfaßt kovalente Bindung, Adsorption und physikalische Immobilisation. Die Ausdrücke "binden" und "gebunden" sind in der Bedeutung dem Ausdruck "angehaftet" identisch.
  • Der Ausdruck "Array", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine zweidimensionale Anordnung von Merkmalen, wie z. B. einer Anordnung von Behältern (z. B. Wells in einer Titerplatte) oder eine Anordnung von verschiedenen Materialien einschließlich ionische, metallische oder kovalent kristalline, einschließlich molekularkristalline, zusammengesetzte oder keramische, pergamine, amorphe, fluide oder molekulare Materialien auf einer Substratoberfäche (wie in einem oligonukleotiden- oder peptidischen Array). Verschiedene Materialien im Zusammenhang mit molekularen Materialien umfassen chemische Isomere, einschließlich Struktur-, geometrische und Stereoisomeren, und in dem Zusammenhang von polymeren Molekülen weisen Strukturisomere verschiedene Monomersequenzen auf. Arrays weisen im allgemeinen regelmäßige, geordnete Merkmale, wie z. B. in einem geradlinigen Gitter, parallelen Streifen, Spiralen oder ähnlichem auf, jedoch können nicht geordnete Arrays ebenfalls vorteilhaft verwendet werden. Ein Array wird von dem allgemeineren Ausdruck "Muster" dadurch unterschieden, daß Muster nicht notwendigerweise regelmäßige und geordnete Merkmale enthalten. Die Arrays oder Muster, die gebildet werden, wobei die Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden, haben keine optische Bedeutung für das nicht unterstützte menschliche Auge. Zum Beispiel umfaßt die Erfindung kein Tintendrucken auf Papier oder andere Substrate, um Briefe, Zahlen, Strichcodes, Figuren oder andere Inschriften zu erzeugen, die für das nicht unterstützte menschliche Auge eine optische Bedeutung aufweisen. Darüber hinaus sind Arrays und Muster, die durch das Abscheiden der abgegebenen Tröpfchen auf eine Oberfläche, so wie es hierin vorgesehen ist, vorzugsweise für das nicht unterstützte menschliche Auge im wesentlichen unsichtbar. Die Arrays, die hergestellt werden, wobei das Verfahren der Erfindung verwendet wird, weisen im allgemeinen in dem Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 10 Millionen Merkmale auf, typischerweise etwa 4 bis ungefähr 4 Millionen Merkmale auf.
  • Die Ausdrücke "Biomolekül" und "biologisches Molekül" werden hierin austauschbar verwendet, um irgendein organisches Molekül zu bezeichnen, sei es, daß es in natürlicher Weise vorkommt, rekombinierend erzeugt wurde oder als Ganzes oder teilweise chemisch synthetisiert wurde, d. h. daß es ein Teil eines lebenden Organismus war oder sein kann. Die Ausdrücke umfassen z. B. Nukleotide, Aminosäuren und Monosaccharide sowie oligomere und polymere Spezies, wie z. B. Oligonukleotide und Polynukleotide, peptidische Moleküle, wie z. B. Oligopeptide, Polypeptide und Proteine, Saccharide, wie z. B. Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Mukopolysaccharide oder Peptidoglykane (Peptido-Polysaccharide), und ähnliche. Der Ausdruck umfaßt auch Ribosome, Enzym-Kofaktoren und pharmakologisch aktive Wirkstoffe.
  • Der Ausdruck "Biomaterial" bezeichnet irgendein Material, das biokompatibel ist, d. h. kompatibel zu einem biologischen System, das biologische Moleküle wie oben definiert aufweist.
  • Die Ausdrücke "Sammlung" und "kombinatorische Sammlung" werden hierin austauschbar verwendet, um eine Mehrzahl von chemischen oder biologischen Gruppen, die auf der Oberfläche eines Substrats vorhanden sind, zu bezeichnen, wobei jede Gruppe von jeder anderen Gruppe verschieden ist. Die Gruppen können zum Beispiel peptidische Moleküle und/oder Oligonukleotide sein.
  • Der Ausdruck "Gruppe" bezeichnet irgendeine bestimmte Zusammensetzung von Materie, z. B. ein molekulares Fragment, ein intaktes Molekül (einschließlich einem monomeren Molekül, einem oligomeren Molekül und einem Polymer) oder eine Mischung von Materialien (z. B. eine Legierung oder einem Laminat).
  • Es ist offensichtlich, daß, so wie sie hierin verwendet werden, die Ausdrücke "Nukleosid" und "Nukleotid" Nukleoside und Nukleotide bezeichnen, welche nicht nur die herkömmlichen Purin- und Pyrimidinbasen, d. h. Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G) und Urazil (U), enthalten, sondern auch geschützte Formen davon, worin z. B. die Base mit einer schützenden Gruppe, wie z. B. Acetyl, Difluoracetyl, Trifluoracetyl, Isobutyryl oder Benzoyl und Purin- und Pyrimidinanalogen, geschützt ist. Geeignete Analoge werden dem Fachmann bekannt sein und sind in den einschlägigen Texten und der Literatur beschrieben. Bekannte Analoge umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf 1-Methyladenin, 2-Methyladenin, N6-Methyladenin, N6-Isopentyladenin, 2-Methylthio-N6-Isopentyladenin, N,N-Dimethyladenin, 8-Bromadenin, 2-Thiocytosin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, 5-Ethylcytosin, 4-Acetylcytosin, 1-Methylguanin, 2-Methylguanin, 7-Methylguanin, 2,2-Dimethylguanin, 8-Bromguanin, 8-Chlorguanin, 8-Aminoguanin, 8-Methylguanin, 8-Thioguanin, 5-Fluorurazil, 5-Bromurazil, 5-Chlorurazil, 5-Iodurazil, 5-Ethylurazil, 5-Propylurazil, 5-Methylurazil, 5-Hydroxymethylurazil, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-Urazil, 5-(Methylaminomethyl)-Urazil, 5-(Carboxymethylaminomethyl)-Urazil, 2-Thiourazil, 5-Methyl-2-Thiourazil, 5-(2-Bromvinyl)-Urazil, Urazil-5-Oxyessigsäure, Urazil-5-Oxyessigsäure-Methylester, Pseudourazil, 1-Methylpseudourazil, Queosin, Inosin, 1-Methylinosin, Hypoxan tin, Xantin, 2-Aminopurin, 6-Hydroxyaminpurin, 6-Thiopurin und 2,6-Diaminopurin. Darüber hinaus umfassen die Ausdrücke "Nukleosid" und "Nukleotid" diejenigen Gruppen, die nicht nur herkömmliche Ribose- und Deoxyribosezucker enthalten, sondern auch andere Zucker. Modifizierte Nukleoside und Nukleotide umfassen auch Modifikationen an der Zuckergruppe, wobei z. B. eine oder mehrere der Hydroxylgruppen mit Halogenatomen oder aliphatischen Gruppen ersetzt werden oder als Ether oder Amine funktionalisiert werden. So wie er hierin verwendet wird, sollte der Ausdruck "Oligonukleotid" generisch für Polydeoxynukleotide (2-Deoxy-D-Ribose enthaltend), für Polyribonukleotide (D-Ribose enthalten), für irgendeinen anderen Polynukleotid, der ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und für andere Polymere, welche nicht-nukleotidische Gerüste (z. B. PNAs) enthalten, vorausgesetzt daß die Polymere Nukleobasen in einer Konfiguration enthalten, die eine Basenpaarbildung und ein Basenstapeln ermöglichen, so wie es in DNA und RNA zu beobachten ist. Daher umfassen diese Ausdrücke bekannte Typen von Oligonukleotidmodifikationen, z. B. das Ersetzen eines oder mehrerer der natürlich auftretenden Nukleotide durch ein Analoges, internukleotide Modifikationen, wie z. B. diejenigen mit ungeladenen Vernetzungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosporamidate oder Carbamate), mit negativ geladenen Vernetzungen (z. B. Phosphorthioate oder Phosphordithioate) und mit positiv geladenen Vernetzungen (z. B. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphosphortriester), diejenigen, die Seitengruppen wie z. B. Proteine (einschließlich Nukleasen, Toxinen, Antikörpern, Signalpeptiden oder Poly-L-Lysin) enthalten, diejenigen mit Intercalatoren (z. B. Acridin oder Psoral), diejenigen, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, oxidative Metalle, etc.). Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung in der Länge zwischen dem Ausdruck "Polynukleotid" und "Oligonukleotid" und diese Ausdrücke werden austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke bezeichnen nur die Primärstruktur des Moleküls. So wie sie hierin verwendet werden, sind die Symbole für Nukleotide und Polynukleotide in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature (Biochemistry 9:4022, 1970).
  • Die Ausdrücke "Peptid", "Peptidyl" und "peptidisch", so wie sie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, sind so gedacht, daß sie irgendeine Struktur umfassen, die zwei oder mehr Aminosäuren aufweist. Die meisten der Peptide in den derzeitigen Arrays weisen ungefähr 5 bis 10.000 Aminosäuren, vorzugsweise ungefähr 5 bis 1000 Aminosäuren auf. Die Aminosäuren, die das ganze oder ein Teil eines Peptids bilden, können irgendwelche aus den zwanzig herkömmlichen, natürlich vorkommenden Aminosäuren sein, d. h. Alanin (A), Cystein (C), Asparginsäure (D), Glutaminsäure (E), Phenylalanin (F), Glycin (G), Histidin (H), Isoleucin (I), Lysin (K), Leucin (L), Methionin (M), Asparagin (N), Prolin (P), Glutamin (Q), Arginin (R), Serin (S), Threonin (T), Valin (V), Tryptophan (W) und Ty rosin (Y). Irgendeine der Aminosäuren in den peptidischen Molekülen, welche die derzeitigen Arrays bilden, kann durch eine nicht herkömmliche Aminosäure ersetzt werden. Im allgemeinen werden konservative Ersetzungen bevorzugt. Konservative Ersetzungen ersetzen die ursprüngliche Aminosäure durch eine nicht herkömmliche Aminosäure, die der ursprünglichen in einer oder mehreren ihrer charakteristischen Eigenschaften ähnelt (z. B. Ladung, Hydrophobizität, von der Stearinsäure abgeleitete Masse, z. B. kann man Val durch Nval ersetzen). Der Ausdruck "nicht herkömmliche Aminosäure" bezeichnet andere Aminosäuren als herkömmliche Aminosäuren und umfaßt z. B. Isomere und Modifikationen der herkömmlichen Aminosäuren (z. B. D-Aminosäuren), nicht Proteinaminosäuren, post-translational modifizierte Aminosäuren, enzymatisch modifizierte Aminosäuren, Konstruktionen oder Strukturen, die so konstruiert sind, daß sie Aminosäuren nachahmen (z. B. α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkylaminosäuren, Milchsäure, β-Alanin, Naphtylalanin, 3-Pyridylalanin, 4-Hydroxypyrolin, O-Phosphorserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin und Nor-Leuzin) und Peptide, bei denen die natürlich vorkommende Amid -CONH- Verbindung an einer oder mehreren Stellen in dem Peptidgerüst durch eine nicht herkömmliche Verbindung ausgetauscht sind, wie z. B. durch N-substituierte Amid-Ester-Thioamid-Retropeptid-(-NHCO-), Retrothioamid-(-NHCS-), Sulfonamid-(-SO2NH-) und/oder Peptod-(N-substituiertes Glycin)-Verbindungen. Entsprechend umfassen die peptidischen Moleküle des Arrays Pseudopeptide und Peptidomimetide. Die Peptide dieser Erfindung können (a) natürlich vorkommen, (b) durch chemische Synthese hergestellt sein, (c) durch rekombinierende DNA-Technologie hergestellt sein, (d) durch biochemische oder enzymatische Fragmentierung von größeren Molekülen hergestellt sein, (e) durch Verfahren hergestellt sein, die aus einer Kombination der zuvor aufgezählten Verfahren (a) bis (d) resultieren oder (f) durch irgendwelche anderen geeigneten Mittel zum Erzeugen von Peptiden hergestellt sein.
  • Der Ausdruck "Fluid", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Materie, die nicht fest ist oder zumindest teilweise gasförmig und/oder flüssig ist. Ein Fluid kann einen Festkörper enthalten, der minimal, teilweise oder vollständig gelöst, dispergiert oder suspendiert ist. Beispiele für Fluide umfassen ohne Beschränkung wäßrige Flüssigkeiten (einschließlich Wasser als solches und Salzwasser) und nicht wäßrige Flüssigkeiten, wie z. B. organische Lösungsmittel und ähnliche. So wie er hierin verwendet wird ist der Ausdruck "Fluid" nicht synonym dem Ausdruck "Tinte", insoweit eine Tinte einen Farbstoff enthalten muß und nicht gasförmig und/oder flüssig sein muß.
  • Der Ausdruck "nah" wird verwendet, um den Abstand von dem Brennpunkt der fokussierten akustischen Strahlung zu der Oberfläche des Fluids, von dem ein Tröpfchen abgegeben werden soll, zu bezeichnen. Der Abstand sollte so sein, daß die fokussierte akustische Strahlung, die in das Fluid gerichtet wird, zu einer Tröpfchenabgabe von der Fluidoberfläche führt und ein Fachmann in die Lage versetzt wird, einen passenden Abstand für irgendein gegebenes Fluid auszuwählen, wobei eine einfache und routinemäßige Untersuchung verwendet wird. Im allgemeinen liegt jedoch ein geeigneter Abstand zwischen dem Brennpunkt der akustischen Strahlung und der Fluidoberfläche in dem Bereich von dem ungefähr 1- bis zu dem ungefähr 15-fachen der Wellenlänge der Schallgeschwindigkeit in dem Fluid, typischerweise in dem Bereich von ungefähr dem 1- bis zu ungefähr dem 10-fachen dieser Wellenlänge, vorzugsweise in dem Bereich von dem ungefähr 1- bis zu dem ungefähr 5-fachen dieser Wellenlänge.
  • Die Ausdrücke "Fokussiermittel" und "akustisches Fokussiermittel" bezeichnen ein Mittel zum Bewirken, daß akustische Wellen in einem Brennpunkt konvergieren, entweder durch eine von der Quelle für akustische Energie getrennte Einrichtung, die wie eine optische Linse wirkt oder durch die räumliche Anordnung von Quellen für akustische Energie, die wie eine optische Linse wirken oder durch die räumliche Anordnung von Quellen von akustischer Energie, um eine Konvergenz akustischer Energie in einem Brennpunkt durch konstruktive und destruktive Interferenz zu bewirken. Ein Fokussiermittel kann so einfach sein wie ein festes Element mit einer gekrümmten Oberfläche oder es kann komplexe Strukturen umfassen, wie z. B. diejenigen, die in Fresnellinsen anzutreffen sind, welche Brechung verwenden, um akustische Strahlung zu leiten. Geeignete Fokussiermittel umfassen auch Verfahren zur phasengesteuerten Anordnung, so wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind und z. B. im US Patent Nr. 5,798,779 von Nakayasu et al. und in Amemiya et al. (1997) Proceedings of the 1997 IS&T NIP 13 International Conference an Digital Printing Technologies Proceedings, auf Seiten 698–702 beschrieben werden.
  • Der Ausdruck "Behälter", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Aufnahme oder eine Kammer zum Halten oder Enthalten eines Fluids. Daher hat ein Fluid in einem Behälter notwendigerweise eine freie Oberfläche, d. h. eine Oberfläche, die es erlaubt, ein Tröpfchen davon abzugeben. Ein Behälter kann auch ein Ort auf einer Substratoberfläche sein, in dem ein Fluid eingeschränkt ist.
  • Der Ausdruck "Substrat", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet irgendein Material mit einer Oberfläche, auf der ein oder mehrere Fluide abgeschieden werden können. Das Substrat kann in irgendeiner aus einer Anzahl von Formen, wie z. B. Wafern, Folien, Titerplatten, Membranen, konstruiert sein. Zusätzlich kann das Substrat porös oder nicht porös sein, so wie es zum Abscheiden eines bestimmten Fluids erforderlich ist. Geeignete Substratmaterialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Träger, die typischerweise für die chemische Festphasensythese verwendet werden, z. B. Polymermaterialien (z. B. Polystyren, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinyl-Pyrrolidon, Polyacrylonitril, Polyacrylamid, Polymethyl-Methacrylat, Polytetrafluorethylen, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinyliden Fluorid, Polycarbonat, Divinylbenzen, styrenbasierende Polymere), Agarose (z. B. Sepharose®), Dextran (z. B. Sephadex®), cellulosehaltige Polymere und andere Polysaccharide, Quarz, und quarzbasierende Materialien, Glas (insbesondere Glas mit gesteuerten Poren oder "CPG") und funktionalisierte Gläser, Keramiken und solche Substrate, die mit Oberflächenbeschichtungen behandelt sind, z. B. mit mikroporösen Polymeren (insbesondere cellulosehaltigen Polymeren, wie z. B. Nitrocellulose), mikroporösen metallischen Verbindungen (insbesondere mikroporösem Aluminium), antikörperbindenden Proteinen (erhältlich von Pierce Chemical Co., Rockford IL) oder Bisphenol A Polycarbonat.
  • Substrate von besonderem Interesse sind porös und umfassen wie oben erwähnt: Unbeschichtete poröse Glasplättchen, einschließlich CPG-Plättchen, poröse Glasplättchen, die mit einer polymerischen Beschichtung beschichtet sind, z. B. Aminosilan oder Poly-L-Lysinbeschichtung, wodurch sie eine poröse polymere Oberfläche aufweisen und nicht poröse Glasplättchen, die mit einer porösen Beschichtung beschichtet sind. Die poröse Beschichtung kann eine poröse Polymerbeschichtung sein, so wie sie z. B. ein cellulosehaltiges Polymer (z. B. Nitrocellulose) oder Polyacrylamid aufweisen kann, oder eine poröse metallische Beschichtung (z. B. mikroporöses Aluminium). Beispiele kommerziell erhältlicher Substrate mit porösen Oberflächen, umfassen die Fluorescent Array Surface Technology-(FAST, eingetragene Marke) Objektträger, erhältlich von Schleicher & Schuell Inc. (Keene, NH), die mit einer 10–30 μm dicken porösen, fluiddurchlässigen Nitrocellulose-Schicht beschichtet sind, die im wesentlichen die vorhandene Bindungsfläche pro Flächeneinheit vergrößert. Andere kommerziell erhältliche poröse Substrate umfassen die CREATIVECHIP (eingetragene Marke) durchlässigen Objektträger, die derzeit von Eppendorf AG (Hamburg, Deutschland) erhältlich sind und Substrate mit "dreidimensionaler" Geometrie aufgrund einer geordneten hochgradig porösen Struktur, die es Reagenzien ermöglicht, in die Poren und Kanäle der gesamten Struktur zu fließen und durch diese hindurchzutreten. Solche Substrate sind von Gene Logic, Inc. unter dem Handelsnamen "Flow-Thru Chip" erhältlich und werden von Steel et al. in Kapitel 5 von Microarray Biochip Technology (BioTechniques Books, Natick, MA, 2000) beschrieben.
  • Der Ausdruck "porös" wie "in einem porösen Substrat" oder einem "Substrat mit einer porösen Oberfläche" bezeichnet ein Substrat bzw. eine Oberfläche mit einer Porosität (Hohlraumprozentsatz) in dem Bereich von ungefähr 1% bis ungefähr 99%, vorzugsweise von ungefähr 5% bis ungefähr 99%, insbesondere bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 15% bis ungefähr 95% und mit einer durchschnittlichen Porengröße von ungefähr 100 Å bis ungefähr 1 mm, typischerweise ungefähr 500 Å bis ungefähr 0,5 mm.
  • Der Ausdruck "undurchlässig" wird in dem herkömmlichen Sinne verwendet, so daß er bedeutet, daß es Wasser oder einem anderen Fluid nicht möglich ist, hindurchzutreten. Der Ausdruck "durchlässig", so wie er hierin verwendet wird, bedeutet nicht "undurchlässig". Daher bezeichnet ein "durchlässiges Substrat" und ein "Substrat mit einer durchlässigen Oberfläche" ein Substrat bzw. eine Oberfläche, die von Wasser oder einem anderen Fluid durchdrungen werden kann.
  • Während die zuvor genannten Trägermaterialien repräsentativ für herkömmlich verwendete Substrate sind, ist es offensichtlich, daß ein Substrat tatsächlich irgendein biologisches, nicht biologisches, organisches und/oder anorganisches Material aufweisen kann und in irgendeiner aus einer Auswahl von physikalischen Formen, z. B. Partikeln, Fäden, Ablagerungen, Gelen, Blättern, Röhren, Kugeln, Behältern, Kapillaren, Kissen, Scheiben, Filmen oder Platten vorliegen kann und darüber hinaus irgendeine gewünschte Form aufweisen kann, wie z. B. eine Scheibe, ein Quadrat, eine Kugel oder einen Kreis. Die Substratoberfläche kann flach sein oder nicht, z. B. kann die Oberfläche erhabene oder vertiefte Bereiche aufweisen. Ein Substrat kann zusätzlich enthalten oder so derivatisiert sein, daß es reaktive Funktionalitäten aufweist, die eine Verbindung kovalent an die Substratoberfläche binden. Diese sind weit verbreitet und umfassen z. B. Siliziumdioxidträger, die reaktive Si-OH-Gruppen enthalten, Polyacrylamidträger, Polystyrenträger oder Polyethylenglycolträger.
  • Der Ausdruck "Oberflächenmodifikation", so wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die chemische und/oder physikalische Veränderung einer Oberfläche durch einen additiven oder subtraktiven Prozeß, der eine oder mehrere chemische und/oder physikalische Eigenschaften einer Substratoberfläche oder eines ausgewählten Orts oder eines Bereichs einer Substratoberfläche ändert. Zum Beispiel können Oberflächenmodifikationen (1) eine Änderung der Benetzungseigenschaften einer Oberfläche, (2) das Funktionalisieren einer Oberfläche, d. h. Bereitstellen, Modifizieren oder Ersetzen von funktionellen Oberflächengruppen, (3) Defunktionalisieren einer Oberfläche, d. h. Entfernen von funktionellen Oberflächengruppen, (4) ein anderweitiges Ändern der chemischen Zusammensetzung einer Oberfläche, z. B. durch Ätzen, (5) Erhöhen oder Verringern der Oberflächenrauhigkeit, (6) Bereitstellen einer Beschichtung auf einer Oberfläche, z. B. eine Beschichtung, welche Benetzungseigenschaften aufweist, die von den Benetzungseigenschaften der Oberfläche verschieden sind und/oder (7) Abscheiden von Teilchen auf einer Oberfläche umfassen.
  • "Optional" bedeutet, daß die nachfolgend beschriebenen Umstände auftreten können oder nicht, so daß die Beschreibung Zustände umfaßt, in denen der Umstand auftritt, und Zustände, in denen er nicht auftritt.
  • Der Ausdruck "im wesentlichen", so wie er z. B. in dem Ausdruck "im wesentlichen alle Moleküle eines Arrays" bezeichnet mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, insbesondere mindestens 99% und besonders bevorzugt mindestens 99,9% der Moleküle eines Arrays. Andere Verwendungen dieses Ausdrucks "im wesentlichen" schließen eine analoge Definition ein.
  • Die Erfindung liefert entsprechend ein Verfahren zum Bilden kombinatorischer Sammlungen, wobei fokussierte akustische Energie verwendet wird, um einzelne Fluidtröpfchen aus der freien Oberfläche eines Fluids (z. B. in einem Behälter oder einer Titerplatte) hin zu diskreten Orten auf einer Substratoberfläche abzugeben, wodurch eine außergewöhnlich genaue und reproduzierbare Tröpfchengröße und Geschwindigkeit ermöglicht wird. Die Vorrichtung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung weist eine Mehrzahl von Behältern auf, die jeder ein Fluid enthalten, einen Ejektor mit einem akustischen Strahlungserzeuger zum Erzeugen akustischer Strahlung und einem Fokussiermittel zum Fokussieren der gesamten akustischen Strahlung in einem Brennpunkt innerhalb und ausreichend nahe der Fluidoberfläche in jedem der Behälter, was zu der Abgabe von Tröpfchen führt, und ein Mittel für Mittel zum Positionieren des Ejektors in akustischer Verbindung mit jedem der Behälter.
  • Die Verwendung eines solchen fokussierten akustischen Abgabesystems ermöglicht die Bildung kombinatorischer Arrays, die im allgemeinen eine Dichte in dem Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 250.000 Arrayelementen (z. B. oberflächengebundenen Oligomeren) pro Quadratzentimeter der Substratoberfläche aufweisen, typischerweise in dem Bereich von ungefähr 400 bis ungefähr 100.000 Arrayelementen pro Quadratzentimeter der Substratoberfläche.
  • Jedoch muß betont werden, daß das derzeitige Verfahren das ebenso das Bilden von Arrays mit viel höherer Dichte ermöglicht, d. h. Arrays mit mindestens ungefähr 1.000.000 Arrayelementen pro Quadratzentimeter der Substratoberfläche oder sogar in dem Bereich von ungefähr 1.500.000 bis 4.000.000 oder mehr Elementen pro Quadratzentimeter der Substratoberfläche. Diese Arrays mit hoher Dichte können auf nichtporösen Oberflächen gebildet werden, obwohl ein bedeutender Vorteil der Verwendung der Technologie fokussierter akustischer Energie bei der Herstellung kombinatorischer Arrays ist, daß Substrate mit porösen Oberflächen oder sogar durchlässigen Oberflächen verwendet werden können. Bekannte Herstellungsverfahren für Arrays haben nicht die Herstellung von Arrays mit hoher Dichte auf porösen oder durchlässigen Oberflächen ermöglicht, da bekannte Anordnungsprozesse nicht annähernd so genau sind wie dieses akustische Abscheidungsverfahren und bekannte Prozesse benötigen auch größere Tröpfchenvolumen. Entsprechend waren bekannte Arrayherstellungsverfahren auf die Bildung von Arrays mit geringer Dichte auf porösen Oberflächen beschränkt oder Arrays höherer Dichte auf nichtporösen Oberflächen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 6,054,270 von Southern. Im Gegensatz zu bekannten Verfahren zum Herstellen von Arrays ermöglicht dann der derzeitige akustische Abgabeprozeß eine außerordentlich genaue Abscheidung sehr kleiner Tröpfchen sowie eine Übereinstimmung in der Tröpfchengröße und Geschwindigkeit. Sehr hohe Arraydichten können nun mit hochgradig porösen, durchlässigen Oberflächen erreicht werden. Insbesondere kann das vorliegende akustische Abgabeverfahren verwendet werden, um Arrays mit hoher Dichte herzustellen, die mit einem digitalisierendem Hochpräzisionsscanner gelesen werden können, der eine 2 μm Auflösung ermöglicht, durch Abscheiden von Tröpfchen mit einem Volumen in der Größenordnung von 1 pL, was zu abgeschiedenen Punkten mit ungefähr 18 μm Durchmesser führt. Für Arrays mit ultrahoher Dichte ist ein kleineres Tröpfchenvolumen notwendig, typischerweise von weniger als ungefähr 0,03 pL (die Abscheidung von Tröpfchen mit einem Volumen in der Größenordnung von 0,025 pL führt zu abgeschiedenen Punkten mit ungefähr 4,5 μm im Durchmesser). Die Lokalisierung von abgeschiedenen Tröpfchen, wobei chemische oder physikalische Mittel verwendet werden, so wie sie in dem '270 Patent beschrieben werden, ist überflüssig, da eine akustische Abgabe es ermöglicht, präzise gerichtete genaue Tröpfchen mit einer Genauigkeit an einem bestimmten Ort abzuscheiden.
  • 1 stellt eine geeignete fokussierte akustische Abgabevorrichtung in einer vereinfachten Querschnittsansicht dar. So wie bei allen hierin genannten Figuren, in denen gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind, ist 1 nicht maßstabsgerecht und kann in bestimmten Dimensionen aus Gründen der Klarheit der Darstellung vergrößert dargestellt sein. Die Vorrichtung 11 weist eine Mehrzahl von Behältern auf, d. h. mindestens zwei Behälter, wobei ein erster Behälter mit 13 bezeichnet ist und ein zweiter Behälter mit 15 bezeichnet ist, die jeder so eingerichtet sind, daß sie ein Fluid mit einer Fluidfläche enthalten, z. B. ein erstes Fluid 14 und ein zweites Fluid 16 mit Fluidoberflächen, die mit 17 bzw. mit 19 bezeichnet sind. Die Fluide 14 und 16 können die gleichen sein oder voneinander verschieden sein, und sie können auch akustische oder fluidische Eigenschaften aufweisen, die die gleichen sind oder die verschieden sind. Wie gezeigt, weisen die Behälter im wesentlichen eine identische Konstruktion auf, so daß sie im wesentlichen akustisch ununterscheidbar sind, jedoch ist eine identische Konstruktion keine Notwendigkeit. Die Behälter sind mit getrennten entfernbaren Komponenten gezeigt, können jedoch, falls notwendig, an einer Platte oder einem Substrat befestigt sein. Zum Beispiel kann die Mehrzahl von Behältern individuelle Wells in einer Titerplatte aufweisen, optimal, obwohl nicht notwendigerweise, in einem Array angeordnet. Jeder der Behälter 13 und 15 ist vorzugsweise wie gezeigt axialsymmetrisch mit vertikalen Wänden 21 und 23, die sich von kreisförmigen Behälterböden 25 und 27 nach oben erstrecken und die an Öffnungen 29 bzw. 23 enden, obwohl andere Behälterformen verwendet werden können. Das Material und die Dicke jedes Behälterbodens sollte so sein, daß akustische Strahlung durch diesen hindurch und in das Fluid, das in dem Behälter enthalten ist, transmittiert werden kann.
  • Die Vorrichtung weist auch einen akustischen Ejektor 33 auf, der einen akustischen Strahlungsgenerator 35 zum Erzeugen akustischer Strahlung und ein Fokussiermittel 37 zum Fokussieren der akustischen Strahlung in einem Brennpunkt innerhalb des Fluids, von dem ein Tröpfchen abgegeben werden soll, nahe der Fluidoberfläche aufweist. Wie in 1 gezeigt, kann das Fokussiermittel 37 ein einziges massives Teil mit einer konkaven Oberfläche 39 zum Fokussieren akustischer Strahlung aufweisen, jedoch kann das Fokussiermittel auf andere Weisen wie nachfolgend diskutiert konstruiert sein. Der akustische Ejektor 33 ist daher so eingerichtet, daß er akustische Strahlung erzeugt und fokussiert, so daß ein Tröpfchen eines Fluids von jeder der Fluidoberflächen 17 und 19 abgegeben wird, wenn er akustisch mit den Behältern 13 und 15 und somit mit den Fluiden 14 bzw. 16 verbunden ist. Der akustische Strahlungsgenerator 35 und das Fokussiermittel 37 können als eine einzige Einheit arbeiten, die von einer einzigen Steuerung gesteuert wird oder sie können unabhängig gesteuert sein in Abhängigkeit von der erwünschten Leistungsfähigkeit der Vorrichtung. Typischerweise sind einzelne Ejektorkonstruktionen gegenüber Mehrejektorkonstruktionen bevorzugt aufgrund der Genauigkeit der Tröpfchenanordnung und eine Reproduzierbarkeit der Tröpfchengröße und Geschwindigkeit kann mit einem einzigen Ejektor einfacher erreicht werden.
  • Wie es für den Fachmann offensichtlich ist, kann irgendeine Auswahl von Fokussiermitteln in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann eine oder mehrere gekrümmte Oberflächen verwendet werden, um akustische Strahlung auf einen Brennpunkt nahe einer Fluidoberfläche zu richten. Eine solche Technik ist in dem US-Patent Nr. 4,308,547 von Lovelady et al. beschrieben. Fokussiermittel mit einer gekrümmten Oberfläche wurden in die Konstruktion eines kommerziell erhältlichen akustischen Wandlers, so wie denjenigen, die von Panametrics Inc. (Waltham, MA) hergestellt werden, eingebaut. Zusätzlich sind Fresnel-Linsen aus dem Stand der Technik zum Richten akustischer Energie in einer vorbestimmten Brennweite von einer Objektebene bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,041,849 von Quate et al. Fresnel-Linsen können ein radiales Phasenprofil aufweisen, das einen wesentlichen Teil akustischer Energie in einer vorbestimmten Beugungsordnung unter Beugungswinkeln beugt, die sich radial in Bezug auf die Linse ändern. Die Beugungswinkel sollten so gewählt sein, daß sie die akustische Energie innerhalb der Beugungsordnung auf eine gewünschte Objektebene fokussieren.
  • Es gibt auch eine Anzahl von Möglichkeiten den Ejektor 33 mit jedem individuellen Behälter und so mit dem Fluid darin zu koppeln. Ein solcher Ansatz ist durch direkten Kontakt wie z. B. in US-Patent Nr. 4,308,547 von Lovelady et al. beschrieben, wobei ein Fokus siermittel, das aus einem hemisphärischen Kristall mit segmentierten Elektroden konstruiert ist, in eine abzugebende Flüssigkeit eingetaucht ist. Das zuvor erwähnte Patent offenbart weiterhin, daß das Fokussiermittel an oder unter der Oberfläche der Flüssigkeit angeordnet sein kann. Jedoch ist dieser Ansatz zum akustischen Koppeln des Fokussiermittels an ein Fluid unerwünscht, wenn der Ejektor verwendet wird, um verschiedene Fluide in einer Mehrzahl von Behältern oder Reservoiren abzugeben, da ein wiederholtes Reinigen des Fokussiermittels erforderlich wäre um eine übergreifende Verunreinigung zu vermeiden. Der Reinigungsprozeß würde notwendigerweise die Übergangszeit zwischen jedem Tröpfchen-Abgabeereignis verlängern. Zusätzlich würde bei einem solchen Verfahren Fluid an dem Ejektor anhaften, wenn er von jedem Behälter entfernt wird, wobei Material verschwendet wird, das teuer oder selten sein kann.
  • Daher wäre es ein bevorzugter Ansatz, den Ejektor akustisch an den Behälter und Behälterfluide zu koppeln ohne irgendeinen Teil des Ejektors, z. B. das Fokussiermittel, mit irgendeinem der abzugebenden Fluide in Kontakt zu bringen. An diesem Ende liefert die vorliegende Erfindung ein Ejektoranordnungsmittel zum Anordnen des Ejektors in kontrollierter und wiederholbarer akustischer Kopplung mit jedem der Fluide in den Behältern, um Tröpfchen daraus abzugeben ohne den Ejektor darin einzutauchen. Dies umfaßt typischerweise einen direkten oder indirekten Kontakt zwischen dem Ejektor und der externen Oberfläche jedes Behälters. Wenn ein direkter Kontakt verwendet wird, um den Ejektor mit jedem Behälter akustisch zu koppeln, so ist es bevorzugt, daß der direkte Kontakt vollständig konform ist, um eine effiziente akustische Energieübertragung zu gewährleisten. Das heißt der Ejektor und der Behälter sollten entsprechende Oberflächen aufweisen, die für einen zusammenpassenden Kontakt ausgelegt sind.
  • Daher ist es, wenn eine akustische Kopplung zwischen dem Ejektor und dem Behälter durch das Fokussiermittel erzielt wird, wünschenswert, daß der Behälter eine äußere Oberfläche aufweist, die dem Oberflächenprofil des Fokussiermittels entspricht. Ohne einen konformen Kontakt kann die Effizienz und die Genauigkeit akustischer Energieübertragung verschlechtert sein. Darüber hinaus kann der direkte Kontaktansatz, dann, wenn viele Fokussiermittel eine gekrümmte Oberfläche aufweisen, die Verwendung von Behältern mit einer speziell geformten inversen Oberfläche erfordern.
  • Optimal wird eine akustische Kopplung zwischen dem Ejektor und jedem der Behälter durch indirekten Kontakt, wie in 1A dargestellt, erreicht. In der Figur ist ein akustisches Kopplungsmedium 41 zwischen dem Ejektor 33 und dem Boden 25 des Behälters 13 angeordnet, wobei der Ejektor und der Behälter in einem vorbestimmten Abstand voneinander angeordnet sind. Das akustische Kopplungsmedium kann ein akustisches Kopplungsfluid, vorzugsweise ein akustisch homogenes Material in konformem Kontakt sowohl mit dem aku stischen Fokussiermittel 37 als auch mit jedem Behälter sein. Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, daß das Fluidmedium im wesentlichen frei von Material ist, das andere akustische Eigenschaften aufweist als das Fluidmedium selbst. Wie gezeigt, ist der erste Behälter 13 akustisch mit dem Fokussiermittel 37 gekoppelt, so daß eine akustische Welle von dem akustischen Strahlungsgenerator erzeugt wird und durch das Fokussiermittel 37 in das akustische Kopplungsmedium 41 gerichtet wird, welches dann die akustische Strahlung in den Behälter 13 überträgt.
  • Im Betrieb ist jeder Behälter 13 und 15 der Vorrichtung mit ersten und zweiten Fluiden, 14 bzw. 16, wie in 1 gezeigt, gefüllt. Der akustische Ejektor 33 ist mit Hilfe eines Ejektorpositioniermittels 43, welches unter dem Behälter 13 dargestellt ist, positionierbar, um eine akustische Kopplung zwischen dem Ejektor und dem Behälter durch das akustische Kopplungsmedium 41 zu erreichen. Das Substrat 45 ist über und nahe dem ersten Behälter 13 angeordnet, so daß eine Oberfläche des Substrats, die in 1 als unterseitige Oberfläche 51 gezeigt ist, zu dem Reservoir hin zeigt und im wesentlichen parallel zu der Oberfläche 17 des Fluids 14 darin verläuft. Nachdem der Ejektor, der Behälter und das Substrat richtig ausgerichtet sind, wird der akustische Strahlungsgenerator 35 aktiviert, so daß er akustische Strahlung erzeugt, die von dem Fokussiermittel 37 auf einen Brennpunkt 47 nahe der Fluidoberfläche 17 des ersten Behälters gerichtet wird. In der Folge wird ein Tröpfchen 49 von der Fluidoberfläche 17 auf eine dafür vorgesehene Stelle auf der unterseitigen Oberfläche 51 des Substrats abgegeben. Das abgegebene Tröpfchen kann auf der Substatoberfläche zurückggehalten werden durch Verfestigen darauf nach Kontakt. In solch einer Ausführungsform ist es notwendig, das Substrat bei einer niedrigen Temperatur zu halten, d. h. einer Temperatur, die zu einer Tröpfchenverfestigung nach Kontakt führt. Alternativ oder zusätzlich haftet ein molekularer Rest in dem Tröpfchen nach Kontakt durch Adsorption, physikalische Immobilisierung oder kovalente Bindung an der Substratoberfläche an.
  • Dann richtet, wie in 1B gezeigt, ein Substratpositioniermittel 50 das Substrat 45 über dem Behälter 15 neu aus, um ein Tröpfchen daraus an einer zweiten dafür vorgesehenen Stelle aufzunehmen. 1B zeigt, daß der Ejektor 33 durch das Ejektorpositioniermittel 43 unter dem Behälter 15 angeordnet wurde und in akustisch gekoppelter Beziehung dazu mit Hilfe eines akustischen Kopplungsmediums 41. Nachdem er wie in 1D gezeigt richtig ausgerichtet ist, wird der akustische Strahlungsgenerator 35 des Ejektors 33 aktiviert, so daß akustische Strahlung erzeugt wird, die dann von dem Fokussiermittel 37 auf einen Brennpunkt innerhalb des Fluids 16 nahe der Fluidoberfläche 19 gerichtet wird, wodurch ein Tröpfchen 53 auf das Substrat abgegeben wird. Es sollte offensichtlich sein, daß solch ein Betrieb beispielhaft dafür ist, wie die verwendete Vorrichtung benutzt werden kann, um eine Mehrzahl von Fluiden aus Behältern abzugeben, um ein Muster, z. B. ein Array, auf der Sub stratoberfläche 51 zu bilden. Es sollte ebenfalls offensichtlich sein, daß die Vorrichtung so angepaßt werden kann, daß sie eine Mehrzahl von Tröpfchen aus einem oder mehreren Behältern auf die gleiche Stelle auf der Substratoberfläche abgibt.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung so konstruiert, daß sie eine Übertragung von Fluiden zwischen Titerplatten ermöglicht, in welchem Fall das Substrat eine Substrattiterplatte aufweist und die fluidenthaltenden Behälter individuelle Wells in einer Behältertiterplatte sind. 22 zeigt eine solche Vorrichtung, in der individuelle Wells 13, 15, 73 und 75 in einer Behältertiterplatte 12 als Fluidbehälter zum Enthalten eines abzugebenden Fluids dienen, und das Substrat weist eine kleinere Titerplatte 45 für vier individuelle Wells, die mit 55, 56, 57 und 58 bezeichnet sind, auf. 2A stellt die Behältertiterplatte und die Substrattiterplatte in einer ebenen Ansicht von oben dar. Wie gezeigt, enthält jede der Titerplatten vier Wells, die in einem 2 × 2 Array angeordnet sind. 2B stellt die verwendete Vorrichtung dar, wobei die Behältertiterplatte und die Substrattiterplatte in einer Querschnittsansicht längs der Wells 13, 15 bzw. 55, 57 gezeigt sind. Wie in 1 enthalten die Behälterwells 13 bzw. 15 Fluide 14 und 16 mit Fluidoberflächen, die mit 17 bzw. 19 bezeichnet sind. Die Materialien und die Konstruktion der Wells der Behältertiterplatte sind gleich denjenigen der in 1 dargestellten Behälter. Zum Beispiel weisen die in 2B gezeigten Behälterwells eine im wesentlichen identische Konstruktion auf, so daß sie im wesentlichen akustisch ununterscheidbar sind. Auch in dieser Ausführungsform sind die Böden der Behälter aus einem Material und weisen eine Dicke auf, so daß eine effiziente Übertragung akustischer Strahlung durch diese in das in den Behältern enthaltene Fluid möglich ist.
  • Die Vorrichtung aus 2 weist auch einen akustischen Ejektor 33 mit einer Konstruktion auf, die der des in 1 dargestellten Ejektors ähnlich ist, d. h. der Ejektor weist ein akustisches Erzeugungsmittel 35 und ein Fokussiermittel 37 auf. 2B zeigt den akustisch indirekten Kontakt eines mit einem Behälterwell gekoppelten Ejektors, d. h. ein akustisches Kopplungsmedium 41 ist zwischen dem Ejektor 33 und der Behältertiterplatte 12 angeordnet, d. h. zwischen der gekrümmten Oberfläche 39 des akustischen Fokussiermittels 37 und dem Boden 25 des ersten Behälterwells 13. Wie gezeigt, ist das erste Behälterwell 13 akustisch mit dem akustischen Fokussiermittel 37 gekoppelt, so daß akustische Strahlung, die im allgemeinen in einer Aufwärtsrichtung erzeugt wird, durch das Fokussiermittel 37 in das akustische Kopplungsmedium 41 fokussiert wird, welches dann die akustische Strahlung in das Behälterwell 13 überträgt.
  • Im Betrieb ist jedes der Behälterwells vorzugsweise mit einem anderen Fluid gefüllt. Wie gezeigt, sind die Behälterwells 13 und 15 der Vorrichtung jede mit einem ersten Fluid 14 und einem zweiten Fluid 16 wie in 1, gefüllt, so daß Fluidoberflächen 17 bzw. 19 gebildet werden. 2A zeigt, daß der Ejektor 33 durch ein Ejektoranordnungsmittel 43 unter dem Behälterwell 13 angeordnet ist, um eine akustische Kopplung zwischen diesen durch das akustische Kopplungsmedium 41 zu erreichen. Das erste Substratwell 55 der Substrattiterplatte 45 ist über dem ersten Behälterwell 13 angeordnet, um ein aus dem ersten Behälterwell abgegebenes Tröpfchen aufzunehmen. Nachdem der Ejektor, der Behälter und das Substrat richtig ausgerichtet sind, wird der akustische Strahlungsgenerator aktiviert, so daß eine akustische Welle erzeugt wird, die durch das Fokussiermittel fokussiert wird, um die akustische Welle in einen Brennpunkt 47 nahe der Fluidoberfläche 17 zu richten. In der Folge wird ein Tröpfchen 49 von der Fluidoberfläche 17 in das erste Substratwell 55 der Substrattiterplatte 45 abgegeben. Das Tröpfchen wird in der Substrattiterplatte zurückgehalten durch Verfestigen darauf nach Kontakt, mit Hilfe der niedrigen Temperatur, bei der die Substrattiterplatte gehalten wird. Das heißt, die Substrattiterplatte ist vorzugsweise einem Kühlmittel (nicht gezeigt) zugeordnet, um die Substratoberfläche bei einer Temperatur zu halten, die zu einer Tröpfchenverfestigung nach Kontakt führt.
  • Dann wird, wie in 2C gezeigt, die Substrattiterplatte 45 durch ein Substratpositioniermittel 50 neu angeordnet, so daß das Substratwell 57 direkt über dem Behälterwell 15 angeordnet ist, um ein Tröpfchen daraus aufzunehmen. 2C zeigt auch, daß der Ejektor 33 durch das Ejektorpositioniermittel unter dem Behälterwell 15 neu angeordnet wurde, um den Ejektor und den Behälter durch ein akustisches Kopplungsmedium 41 akustisch zu koppeln. Da die Substrattiterplatte und die Behältertiterplatte unterschiedliche Größen aufweisen, gibt es nur eine Entsprechung, nicht jedoch eine Identität zwischen der Bewegung des Ejektorpositioniermittels und der Bewegung der Substrattiterplatte. Nachdem sie wie in 2C gezeigt richtig ausgerichtet sind, wird der akustische Strahlungsgenerator 35 des Ejektors 33 aktiviert, so daß eine akustische Welle erzeugt wird, die dann von dem Fokussiermittel 37 auf einen Brennpunkt nahe der Fluidoberfläche 19 gerichtet wird, von der ein Tröpfchen 53 auf das zweite Well der Substrattiterplatte abgegeben wird. Es sollte offensichtlich sein, daß solch ein Betrieb beispielhaft dafür ist, wie die verwendete Vorrichtung benutzt werden kann, um eine Mehrzahl von Fluiden aus einer Titerplatte auf eine andere mit anderer Größe benutzt werden kann. Ein Fachmann wird erkennen, daß dieser Typ der Übertragung sogar ausgeführt werden kann, wenn sowohl der Ejektor als auch das Substrat in kontinuierlicher Bewegung sind. Es sollte darüber hinaus offensichtlich sein, daß eine Mehrzahl von Kombinationen von Behältern, Titerplatten und/oder Substraten benutzt werden können beim Verwenden der verwendeten Vorrichtung, um bei der Fluidübertragung mitzuwirken. Es sollte darüber hinaus offensichtlich sein, daß irgendein Behälter mit einem Fluid durch akustische Abgabe gefüllt werden kann, bevor der Behälter für eine weitere Fluidübertragung, z. B. für eine Arrayanordnung, verwendet wird. Darüber hinaus kann das Fluid in dem Behälter in dem Behälter synthetisiert werden, wobei die Synthese zumindest in einem Syntheseschritt die Verwendung einer akustischen Abgabefluidübertragung umfaßt.
  • Wie oben diskutiert, können entweder individuelle, z. B. entfernbare, Behälter oder Titerplatten verwendet werden, um Fluide zu enthalten, die abzugeben sind, wobei die Behälter oder die Wells der Titerplatte vorzugsweise im wesentlichen akustisch voneinander ununterscheidbar sind. Es sei denn, es ist beabsichtigt, daß der Ejektor in das abzugebende Fluid eingetaucht wird, müssen auch die Behälter oder Titerplatten akustische Übertragungseigenschaften aufweisen, die ausreichend sind, um es akustischer Strahlung zu ermöglichen von dem Ejektor zu den Oberflächen der abzugebenden Fluide weitergeleitet zu werden. Typischerweise umfaßt dies das Bereitstellen von Behälter- oder Wellböden, die ausreichend dünn sind, um es akustischer Strahlung zu ermöglichen, durch sie hindurch zu treten ohne unakzeptable Dissipation. Zusätzlich muß das bei der Konstruktion der Behälter verwendete Material mit den darin enthaltenen Fluiden kompatibel sein. Daher wären, wenn es beabsichtigt ist, daß die Behälter oder Wells ein organisches Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril, enthalten, Polymere, welche sich in Acetonitril lösen oder aufquellen, ungeeignet für die Verwendung zur Herstellung der Behälter oder Titerplatten. Für wasserbasierende Fluide ist eine Anzahl von Materialien für die Konstruktion der Behälter geeignet, und diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Keramiken, wie z. B. Siliziumoxid und Aluminiumoxid, Metalle, wie z. B. rostfreien Stahl und Platin, und Polymere, wie z. B. Polyester und Polytetrafluoroethylen. Viele Titerplatten, die zur Verwendung mit der verwendeten Vorrichtung geeignet sind, sind kommerziell erhältlich und können z. B. 96, 184 oder 1536 Wells pro Titerplatte enthalten. Hersteller von geeigneten Titerplatten zur Verwendung in der verwendeten Vorrichtung umfassen Corning Inc. (Corning, New York) und Greiner America, Inc. (Lake Mary, Florida). Jedoch stellt die Verfügbarkeit solcher kommerziell erhältlichen Titerplatten nicht die Herstellung und Verwendung von kundenspezifisch hergestellten Titerplatten aus, welche mindestens ungefähr 10.000 Wells enthalten oder so viele wie 100.000 Wells oder mehr. Für arraybildende Anwendungen ist zu erwarten, daß ungefähr 100.000 bis ungefähr 4.000.000 Behälter verwendet werden können. Darüber hinaus ist es, um die Menge an Bewegung und Zeit, die benötigt wird, um den Ejektor mit jedem Behälter oder Behälterwell auszurichten, bevorzugt, daß die Mitte jedes Behälters nicht mehr als ungefähr 1 cm, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 1 mm und optimal nicht mehr als ungefähr 0,5 mm, von der benachbarten Behältermitte entfernt angeordnet ist.
  • Darüber hinaus kann die Vorrichtung so eingerichtet sein, daß sie Fluide im wesentlichen jeden Typs und jeder erwünschten Menge abgibt. Das Fluid kann wäßrig und/oder nicht wäßrig sein. Beispiele von Fluiden umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, wäßrige Fluide, wie z. B. Wasser als solches und wassergelöste ionische und nichtionische Lösungen, organische Lösungsmittel und lipidische Flüssigkeiten, Suspensionen von nicht mischbaren Fluiden und Suspensionen oder Schlämme von Festkörpern in Flüssigkeiten. Da die Erfindung leicht zur Verwendung bei hohen Temperaturen angepaßt werden kann, können Fluide, wie z. B. flüssige Metalle, keramische Materialien und Gläser verwendet werden. Die US-Patente Nr. 5,520,715 und 5,722,479 von Oeftering beschreiben die Verwendung einer akustischen Abgabe von flüssigem Metall zum Bilden von Strukturen, wobei ein einziger Behälter zum Hinzufügen von Fluid verwendet wird, so daß der Brennpunkt erhalten bleibt. US-Patent Nr. 6,007,183 von Horine ist ein weiteres Patent, das die Verwendung akustischer Energie betrifft, um Tröpfchen flüssigen Metalls abzugeben. Die Fähigkeit feine Tröpfchen solchen Materials zu erzeugen steht im scharfen Gegensatz zur elektrischen Technologie, insoweit sich piezoelektrische Systeme bei erhöhten Temperaturen sub-optimal verhalten. Darüber hinaus kann, aufgrund der Präzision, die möglich ist, wenn die erfindungsgemäße Technologie verwendet wird, die Vorrichtung verwendet werden, um Tröpfchen aus einem Behälter abzugeben, der so eingerichtet ist, daß er nicht mehr als ungefähr 100 Nanoliter an Fluid enthält, vorzugsweise nicht mehr als 10 Nanoliter an Fluid. In bestimmten Fällen kann der Ejektor so eingerichtet sein, daß er ein Tröpfchen von einem Behälter abgibt, der so eingerichtet ist, daß er ungefähr 1 bis ungefähr 100 Nanoliter an Fluid enthält. Dies ist insbesondere nützlich, wenn das abzugebende Fluid seltene oder teure Biomoleküle enthält, wobei es wünschenswert sein kann, Tröpfchen mit einem Volumen von ungefähr einem Picoliter oder weniger abzugeben, z. B. mit einem Volumen in dem Bereich von ungefähr 0,025 pL bis ungefähr 1 pL.
  • Es ist offensichtlich, daß verschiedene Komponenten der Vorrichtung eine individuelle Steuerung zur Synchronisation erfordern können, so daß ein Array auf einem Substrat gebildet wird. Zum Beispiel kann das Ejektoranordnungsmittel so eingerichtet sein, daß es Tröpfchen von jedem Behälter in einer vorbestimmten Sequenz abgibt, die einem auf einer Substratoberfläche herzustellenden Array zugeordnet ist. Ähnlich kann das Substratanordnungsmittel zum Anordnen der Substratoberfläche in Bezug auf den Ejektor so eingerichtet sein, daß es die Substratoberfläche so anordnet, daß sie Tröpfchen in einem Muster oder einem Array darauf aufnimmt. Eines oder beide Positioniermittel, d. h. das Ejektorpositioniermittel und das Substratpositioniermittel, können z. B. aus Motoren, Hebeln, Rollen, Getrieben, einer Kombination davon oder anderen elektromechanischen oder mechanischen Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, konstruiert sein. Es ist bevorzugt sicherzustellen, daß es eine Entsprechung zwischen der Bewegung des Substrats, der Bewegung des Ejektors und der Aktivierung des Ejektors gibt, um eine richtige Arraybildung sicherzustellen.
  • Die Vorrichtung kann auch bestimmte leistungsverbessernde Merkmale aufweisen. Zum Beispiel kann die Vorrichtung ein Kühlmittel zum Erniedrigen der Temperatur der Sub stratoberfläche aufweisen, um z. B. sicherzustellen, daß die abgegebenen Tröpfchen an dem Substrat anhaften. Das Kühlmittel kann so eingerichtet sein, daß es die Substratoberfläche bei einer Temperatur hält, die es einem Fluid ermöglicht, sich teilweise oder vorzugsweise im wesentlichen zu verfestigen, nachdem das Fluid damit in Kontakt tritt. In dem Fall wäßriger Fluide sollte das Kühlmittel die Kapazität aufweisen, die Substratoberfläche bei ungefähr 0°C zu halten. Zusätzlich kann die wiederholte Anwendung akustischer Energie auf einen Behälter mit Fluid zu einer Erwärmung des Fluids führen. Eine Erwärmung kann natürlich zu unerwünschten Änderungen in den Fluideigenschaften, wie z. B. der Viskosität, der Oberflächenspannung und der Dichte, führen. Daher kann die Vorrichtung darüber hinaus Mittel zum Halten des Fluids in dem Behälter bei einer konstanten Temperatur aufweisen. Die Gestaltung und Konstruktion solcher temperaturerhaltender Mittel sind dem Fachmann bekannt und können z. B. Komponenten, wie z. B. ein Heizelement, ein Kühlelement oder eine Kombination davon, aufweisen. Für viele biomolekulare Abscheidungsanwendungen ist es im allgemeinen wünschenswert, daß das Fluid, welches das Biomolekül enthält, bei einer konstanten Temperatur gehalten wird ohne mehr als ungefähr 1°C oder 2°C davon abzuweichen. Darüber hinaus ist es für ein biomolekulares Fluid, das insbesondere wärmeempfindlich ist, bevorzugt, daß das Fluid bei einer Temperatur gehalten wird, die ungefähr 10°C über dem Schmelzpunkt des Fluids nicht übersteigt, vorzugsweise bei einer Temperatur, die ungefähr 5°C über dem Schmelzpunkt des Fluids nicht übersteigt. Zum Beispiel kann es, wenn das ein Biomolekül enthaltende Fluid wäßrig ist, optimal sein, das Fluid während der Abgabe bei ungefähr 4°C zu halten.
  • Alternativ kann für einige Anwendungen, insbesondere diejenigen, die eine akustische Abscheidung von geschmolzenen Metallen oder anderen Materialien umfaßt, ein Heizelement vorgesehen sein, zum Halten des Substrats bei einer Temperatur unter dem Schmelzpunkt des geschmolzenen Materials, jedoch über der Umgebungstemperatur, so daß eine Steuerung der Abkühlgeschwindigkeit bewirkt wird. Die Abkühlgeschwindigkeit kann daher gesteuert werden, so daß ein Experimentieren in Bezug auf die Eigenschaften kombinatorischer Zusammensetzungen, wie z. B. geschmolzenen abgeschiedenen Legierungen, die bei verschiedenen Temperaturen abgekühlt werden, möglich ist. Zum Beispiel ist es bekannt, daß meterstabile Materialien im allgemeinen wahrscheinlicher gebildet werden bei schnellem Kühlen und anderen stark irreversiblen Bedingungen. Der Ansatz des Erzeugens von Materialien durch verschiedene Kühl- oder Quenchraten kann als kombinatorisches Quenchen bezeichnet werden und könnte durch Ändern der Substrattemperatur zwischen akustischen Abgaben von geschmolzenem Material beeinflußt werden. Ein bequemeres Verfahren zum Verwerten kombinatorischer Zusammensetzungen, die aus dem geschmolzenen Zustand bei unterschiedlichen Raten verfestigt wurden, liegt darin, mehrere Arrays mit dem gleichen Muster an nominalen Zusammensetzungen zu erzeugen, die akustisch in dem geschmolzenen Zustand auf Substrate abgegeben wurden, die bei verschiedenen Temperaturen gehalten wurden.
  • Zum Beispiel kann ein Eisenkohlenstoffzusammensetzungsarray auf ein passendes Substrat, wie z. B. Aluminiumoxid, eine Keramik, monokristallines Si oder monokristallines Si, auf dem kristalliner tetraedischer Kohlenstoff (Diamant) durch Standardverfahren gewachsen wurde, abgegeben werden. Arrays mit dem gleichen Muster an nominalen Zusammensetzungen können unter identischen Bedingungen beobachtet werden, außer daß das Substrat für jedes bei einer anderen Temperatur gehalten wird, und die resultierenden Materialeigenschaften könnten für die verschiedenartig gequenchten Zusammensetzungen verglichen werden.
  • In einigen Fällen kann eine Substratoberfläche vor der Bildung eines Arrays darauf modifiziert werden. Eine Oberflächenmodifikation kann eine Funktionalisierung oder Defunktionalisierung, eine Glättung oder Aufrauhung, eine Änderung der Oberflächenleitfähigkeit, Beschichtung, Degradierung, Passivierung oder eine anderweitige Änderung der chemischen Zusammensetzung oder der physikalischen Eigenschaften der Oberfläche umfassen. Ein bevorzugtes Oberflächenmodifikationsverfahren umfaßt ein Ändern der Benetzungseigenschaften der Oberfläche, z. B. um eine Begrenzung eines auf der Oberfläche in einem dafür vorgesehenen Bereich abgeschiedenen Tröpfchens oder eine Verbesserung der Kinetiken für die Oberflächenanhaftung von Molekularresten, die in den abgegebenen Tröpfchen enthalten sind, zu erleichtern. Ein bevorzugtes Verfahren zum Ändern der Benetzungseigenschaften der Substratoberfläche umfaßt ein Abscheiden von Tröpfchen eines geeigneten Oberflächenmodifizierungsfluids an jedem dafür vorgesehenen Ort der Substratoberfläche vor der akustischen Abgabe von Fluiden, um ein Array darauf zu bilden. Auf diese Weise kann die "Ausbreitung" der akustisch abgegebenen Tröpfchen optimiert werden und eine Konsistenz der Punktgröße (d. h. Durchmesser, Höhe und Gesamtform) sichergestellt werden. Eine Weise das Verfahren zu implementieren umfaßt ein akustisches Koppeln des Ejektors an einen Modifizierbehälter, welcher ein Oberflächenmodifikationsfluid enthält und dann Aktivieren des Ejektors, wie im Detail oben beschrieben, so daß ein Tröpfchen des Oberflächenmodifikationsfluids erzeugt und auf eine dafür vorgesehene Stelle auf der Substratoberfläche abgegeben wird. Das Verfahren wird wiederholt so wie es erwünscht ist, um das Oberflächenmodifikationsfluid an zusätzlichen dafür vorgesehenen Stellen abzuscheiden. Dieses Verfahren ist in einer Anzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Erkunden von Oligomeren, um ein Array auf einer Substratoberfläche zu bilden oder in situ Synthetisierung von Arrayoligomeren. Wie oben erwähnt, können andere physikalische Eigenschaften der Oberfläche modifiziert werden einschließlich thermischen Eigenschaften und der elektrischen Leitfähigkeit.
  • 3 stellt schematisch in einer vereinfachten Querschnittsansicht eine bestimmte Ausführungsform des zuvor erwähnten Verfahrens dar, in dem ein Dimer auf einem Substrat synthetisiert wird, wobei eine Vorrichtung verwendet wird, die der in 1 dargestellten ähnlich ist, jedoch mit einem Modifizierbehälter 59, der ein Oberflächenmodifikationsfluid 60 mit einer Fluidoberfläche 61 enthält. 3A stellt die Abgabe eines Tröpfchens 63 des Oberflächenmodiflkationsfluids 60 dar, welches ausgewählt ist, um die Benetzungseigenschaften einer dafür vorgesehenen Stelle auf der Oberfläche 51 des Substrats 45 zu ändern, auf der das Dimer synthetisiert werden soll. Der Ejektor 33 wird von dem Ejektorpositioniermittel 43 unter dem Modifizierbehälter 59 angeordnet, um eine akustische Kopplung zwischen dieser durch das akustische Kopplungsmedium 41 zu bewirken. Das Substrat 45 ist über dem Modifizierbehälter 19 an einem Ort angeordnet, der eine akustische Abscheidung eines Tröpfchens des Oberflächenmodifikationsfluids 60 an einer dafür vorgesehenen Stelle ermöglicht. Nachdem der Ejektor 33, der Modifizierbehälter 59 und das Substrat 45 richtig ausgerichtet sind, wird der akustische Strahlungsgenerator 35 aktiviert, so daß akustische Strahlung erzeugt wird, die durch das Fokussiermittel 37 auf eine Weise gerichtet wird, die eine Abgabe des Tröpfchens 63 des Oberflächenmodifikationsfluids 60 von der Fluidoberfläche 61 auf eine dafür vorgesehene Stelle auf der Unterseite 51 des Substrats ermöglicht. Nachdem das Tröpfchen 63 mit der Substratoberfläche 51 in Kontakt tritt, modifiziert das Tröpfchen einen Bereich der Substratoberfläche, was zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Oberflächenenergie des Bereichs in Bezug auf die abgeschiedenen Fluide führt.
  • Dann wird, wie in 3B gezeigt, das Substrat von dem Substratpositioniermittel 50 neu angeordnet, so daß der Bereich des Substrats, der von dem Tröpfchen 63 oberflächenmodifiziert ist, direkt über dem Behälter 13 angeordnet ist. 3B zeigt auch, daß der Ejektor 33 durch das Ejektorpositioniermittel unter dem Reservoir 13 angeordnet ist, um den Ejektor und den Behälter durch das akustische Kopplungsmedium 41 akustisch zu koppeln. Nachdem er richtig ausgerichtet ist, wird der Ejektor 33 wieder aktiviert, um ein Tröpfchen 49 auf das Substrat abzugeben. Das Tröpfchen 49 enthält einen ersten monomeren Rest 65, vorzugsweise ein Biomolekül, wie z. B. ein geschütztes Nukleosid oder eine Aminosäure, welche nach Kontakt mit der Substratoberfläche daran durch kovalente Bindung oder Adsorption anhaftet.
  • Dann wird, wie in 3C gezeigt, das Substrat 45 wieder von dem Substratpositioniermittel 50 neu angeordnet, so daß die Stelle mit dem ersten monomeren Rest 65, das daran anhaftet, direkt über dem Behälter 15 angeordnet, ist, um ein Tröpfchen davon aufzunehmen. 3B zeigt auch, daß der Ejektor 33 von dem Ejektorpositioniermittel unter dem Behälter 15 angeordnet ist, um den Ejektor und den Behälter durch das akustische Kopplungsmedium 41 akustisch zu koppeln. Sobald er richtig ausgerichtet ist, wird der Ejektor 33 wieder aktiviert, so daß ein Tröpfchen 53 auf das Substrat abgegeben wird. Das Tröpfchen 53 enthält einen zweiten monomeren Rest 67, der für ein Anhaften an dem ersten monomeren Rest 65 angepaßt ist, typischerweise die Bildung einer kovalenten Bindung umfassend, so daß ein Dimer wie in 3D dargestellt, erzeugt wird. Die zuvor erwähnten Schritte können wiederholt werden, um ein Oligomer, z. B. ein Oligonukleotid einer gewünschten Länge, zu erzeugen.
  • Die beim Synthetisieren substratgebundener Oligonukleotide auf diese Weise verwendete Chemie umfaßt im allgemeinen nun herkömmliche Techniken, die dem Fachmann für Nukleinsäurechemie bekannt sind und/oder in der einschlägigen Literatur und den Texten beschrieben sind. Siehe z. B. DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, Hrsg. (Oxford University Press, 1999). Das heißt, die individuellen Kopplungsreaktionen werden unter Standardbedingungen ausgeführt, die für die Synthese von Oligonukleotiden und mit herkömmlich automatisierten Oligonukleotidsynthetisierern verwendet werden. Ein solches Verfahren ist z. B. in D.M. Matteuci et al. (1980) Tet. Lett. 521: 719, US-Patent Nr. 4,500, 707 von Caruthers et al., und US-Patenten Nr. 5,436,327 und 5,700,637 von Southern et al. beschrieben.
  • Alternativ kann ein Oligomer vor dem Anhaften an die Substratoberfläche synthetisiert und dann an einem bestimmten Ort auf der Oberfläche "geortet" werden, wobei das Verfahren der Erfindung wie oben im Detail beschrieben verwendet wird. Wieder kann das Oligomer ein Oligonukleotid sein, ein Oligopeptid oder irgendein anderer biomeolekularer (oder nicht-biomolekularer) Oligomerrest.
  • Es sollte dann offensichtlich sein, daß viele Variationen der Erfindung möglich sind. Zum Beispiel kann jedes der abgegebenen Tröpfchen als ein isoliertes und "fertiges" Merkmal abgeschieden werden, z. B. in georteten Oligonukleotiden, wie oben erwähnt. Alternativ oder zusätzlich kann eine Mehrzahl von abgegebenen Tröpfchen auf dem gleichen Ort auf einer Substratoberfläche abgeschieden werden, um ein biomolekulares Array wie oben beschrieben in situ zu synthetisieren. Zur Arrayherstellung ist zu erwarten, daß verschiedene Waschschritte zwischen Tröpfchenabgabeschritten verwendet werden können. Solche Waschschritte umfassen z. B. ein Eintauchen der gesamten Substratoberfläche, auf der Merkmale abgeschieden wurden, in ein Waschfluid. In einer Abwandlung dieses Prozesses kann die Substratoberfläche auf einem Fluid abgeschieden werden, welches ein Reagenz enthält, das alle Merkmale im wesentlichen gleichzeitig chemisch ändert, z. B. so daß biomolekulare Merkmale, die bereits auf der Substratoberfläche abgeschieden sind, um Orte be reitzustellen, an denen zusätzliche Kopplungsreaktionen auftreten können, aktiviert werden und/oder deren Schutz aufgehoben wird.
  • Das zuvor erwähnte fokussierte akustische Energiesystem ermöglicht eine Abgabe von Tröpfchen mit einer Rate von mindestens ungefähr einer Million Tröpfchen pro Minute für den gleichen Behälter und mit einer Rate von mindestens ungefähr 100.000 Tropfen pro Minute aus verschiedenen Behältern. Zusätzlich ermöglicht es heutige Positioniertechnologie, das Ejektorpositioniermittel schnell und auf eine kontrollierte Weise von einem Behälter zu einem anderen zu bewegen, wodurch eine schnelle und kontrollierte Abgabe verschiedener Fluide ermöglicht wird. Das heißt, derzeit kommerziell erhältliche Technologie ermöglicht es, den Ejektor mit wiederholbarer und gesteuerter akustischer Kopplung an jedem Behälter in weniger als ungefähr 0,1 Sekunde für Hochleistungspositioniermittel und weniger als ungefähr 1 Sekunde für herkömmliche Positioniermittel von einem Behälter zu einem anderen zu bewegen. Ein maßgeschneidertes System ermöglicht es, den Ejektor mit wiederholbarer und gesteuerter akustischer Kopplung in weniger als ungefähr 0,001 Sekunde von einem Behälter zu einem anderen zu bewegen. Um ein maßgeschneidertes System bereitzustellen, ist es wichtig, sich zu vergegenwärtigen, daß es zwei grundlegende Bewegungsarten gibt: impulsartige und kontinuierliche. Impulsartige Bewegung umfaßt die diskreten Schritte des Bewegens eines Ejektors in eine Position, das Abgeben akustischer Energie und erneut das Bewegen des Ejektors in die nächste Position, wobei ein Hochleistungspositioniermittel, das in einem solchen Verfahren verwendet wird, eine wiederholbare und gesteuerte akustische Kopplung an jedem Behälter in weniger als 0,1 Sekunde ermöglicht. Eine kontinuierliche Bewegungskonstruktion bewegt auf der anderen Seite den Ejektor und die Behälter kontinuierlich, wenn auch nicht alle mit der gleichen Geschwindigkeit, und liefert eine Abgabe während der Bewegung. Da die Impulsbreite sehr kurz ist, ermöglicht dieser Typ von Prozeß Behälterübergänge mit über 10 Hz und sogar Behälterübergänge über 1000 Hz.
  • Um die Genauigkeit der Fluidabgabe bereitzustellen, ist es wichtig, den Ort und die Orientierung der Fluidoberfläche in Bezug auf den Ejektor zu bestimmen, von der ein Tröpfchen abzugeben ist. Sonst können die abgegebenen Tröpfchen eine nicht richtig angepaßte Größe aufweisen oder sich auf einer falschen Trajektorie bewegen. Daher betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Höhe einer Fluidoberfläche in einem Behälter zwischen Abgabeereignissen. Das Verfahren umfaßt eine akustische Kopplung eines Fluid enthaltenen Behälters an einen akustischen Strahlungsgenerator und das Aktivieren des Generators, so daß eine akustische Erfassungswelle erzeugt wird, die sich zu der Fluidoberfläche bewegt und davon als eine reflektierte akustische Welle reflektiert wird. Parameter der reflektierten akustischen Welle werden dann analysiert, um die räumliche Beziehung zwischen dem akustischen Strahlungsgenerator und der Fluidoberflä che auszuwerten. Solch eine Analyse umfaßt die Bestimmung des Abstandes zwischen dem akustischen Strahlungsgenerator und der Fluidoberfläche und/oder der Orientierung der Fluidoberfläche relativ zu dem akustischen Strahlungsgenerator.
  • Insbesondere kann der akustische Strahlungsgenerator aktiviert werden, so daß er akustische Strahlung mit niedriger Energie erzeugt, die energetisch unzureichend ist, um ein Tröpfchen von der Fluidoberfläche abzugeben. Dies erfolgt typischerweise durch Verwenden eines extrem kurzen Impulses (in der Größenordnung von 10 Nanosekunden) verglichen mit den normalerweise zur Tröpfchenabgabe benötigten (in der Größenordnung von Mikrosekunden). Durch Bestimmen der Zeit, die die akustische Strahlung benötigt, um von der Fluidoberfläche zurück zu dem akustischen Strahlungsgenerator reflektiert zu werden, und dann Korrelieren dieser Zeit mit der Schallgeschwindigkeit in dem Fluid, kann der Abstand B und damit die Fluidhöhe bestimmt werden. Natürlich muß man aufpassen, um sicherzustellen, daß akustische Strahlung, die von der Grenzfläche zwischen dem Behälterboden und dem Fluid reflektiert wird, nicht berücksichtigt wird. Es ist für den Fachmann auf dem Gebiet der akustischen Mikroskopie offensichtlich, daß solch ein Verfahren herkömmliche oder modifizierte Sonar-Techniken verwendet.
  • Nachdem die Analyse ausgeführt wurde, wird eine akustische Abgabewelle mit einem Brennpunkt nahe der Fluidoberfläche erzeugt, um mindestes ein Tröpfchen des Fluids abzugeben, wobei die optimale Intensität und Direktionalität der akustischen Abgabewelle bestimmt wird, wobei die zuvor erwähnte Analyse optional in Kombination mit zusätzlichen Daten verwendet wird. Die "optimale" Intensität und Direktionalität wird im allgemeinen so ausgewählt, daß Tröpfchen konsistenter Größe und Geschwindigkeit erzeugt werden. Zum Beispiel kann die gewünschte Intensität und Direktionalität der akustischen Abgabewelle bestimmt werden durch Verwenden nicht nur der oben ausgewerteten räumlichen Beziehung, sondern auch geometrischer Daten, die dem Behälter zugeordnet sind, Fluideigenschaftsdaten, die dem abzugebenen Fluid zugeordnet sind, und/oder durch Verwenden historischer Tröpfchenabgabedaten, die der Abgabesequenz zugeordnet sind. Zusätzlich können die Daten die Notwendigkeit aufzeigen, den Ejektor neu auszurichten, so daß der akustische Strahlungsgenerator in Bezug auf die Fluidoberfläche neu ausgerichtet wird, um sicherzustellen, daß der Brennpunkt der akustischen Abgabewelle nahe der Fluidoberfläche liegt, wenn dies erforderlich ist. Zum Beispiel wird, wenn die Analyse aufdeckt, daß der akustische Strahlungsgenerator so angeordnet ist, daß die akustische Abgabewelle nicht nahe der Fluidoberfläche fokussiert werden kann, der akustische Strahlungsgenerator neu ausgerichtet, wobei eine vertikale, horizontale und/oder drehende Bewegung verwendet wird, um eine passende Fokussierung der akustischen Abgabewelle zu ermöglichen.
  • Im allgemeinen wird ein Abtasten der Eigenschaften der Bestandteile des Arrays auf eine Weise ausgeführt, die für das kombinatorische Array passend ist. Ein Abtasten biologischer Eigenschaften, wie z. B. Ligandenbindung oder Hybridisierung, kann im allgemeinen auf eine Weise ausgeführt werden, die in den US-Patenten Nr. 5,744,305 und 5,445,934 von Fodor et al., 5,143,854 und 5,405,783 von Pirrung et al. und 5,700,637 und 6,054,270 von Southern et al. beschrieben wird.
  • Ein Abtasten von Materialeigenschaften kann bewirkt werden durch Messen physika lischer und chemischer Eigenschaften, einschließlich beispielsweise, jedoch nicht beschränkend, Messen der chemischen, mechanischen, optischen, thermischen, elektrischen oder elektronischen Eigenschaften durch Routineverfahren, die leicht an Mikroarrays anpaßbar sind. Zusätzlich zu den Bulkmaterialcharakteristiken oder -eigenschaften können oberflächenspezifische Eigenschaften durch oberflächenspezifische physikalische Techniken und physikalische Techniken, die einer Oberflächencharakterisierung angepaßt sind, gemessen werden. Makroskopische Oberflächenphänomene einschließlich Adsorption, Katalyse, Oberflächenreaktionen einschließlich Oxidation, Härte, Lubrikation und Reibung, können auf einer molekularen Skala untersucht werden, wobei solche Charakterisierungstechniken verwendet werden. Verschiedene physikalische Oberflächencharakterisierungstechniken umfassen ohne Beschränkung diffraktive Techniken, spektroskopische Techniken, mikroskopische Oberflächenabbildungstechniken, oberflächenionisierungsmassenspektroskopische Techniken, thermische Desorptionstechniken und Ellipsometrie. Es ist offensichtlich, daß diese Klassifikationen willkürlich zum Zwecke der Erklärung getroffen wurden und einiger Überlapp vorliegen kann.
  • Zusätzlich zu den Bulkcharakteristiken und -eigenschaften können spezifische Oberflächeneigenschaften durch oberflächenspezifische physikalische Techniken, die zur Oberflächencharakterisierung angepaßt sind, gemessen werden. Makroskopische Oberflächenphänomene einschließlich Adsorption, Katalyse, Oberflächenreaktionen einschließlich Oxidation, Härte, Lubrikation und Reibung können auf einer molekularen Skala untersucht werden, wobei solche Charakterisierungstechniken verwendet werden. Verschiedene physikalische Oberflächencharakterisierungstechniken umfassen ohne Beschränkung diffraktive Techniken, spektroskopische Techniken, mikroskopische Oberflächenabbildungstechniken, oberflächenionisierungsmassenspektroskopische Techniken, thermische Desorptionstechniken und Ellipsometrie. Es ist offensichtlich, daß diese Klassifikationen willkürlich aus Zwecken der Beschreibung getroffen wurden und ein gewisser Überlapp vorliegen kann.
  • Diffraktive Techniken umfassen Röntgenstreuung (XRD, extremer Einfallswinkel zur Oberfläche), hoch-, mittel- und niederenergetische Elektronenbeugung (HEED, MEED, LEED), Reflektions-HEED (RHEED), spinpolarisierte LEED (SPLEED, insbesondere nützlich beim Charakterisieren von Oberflächenmagnetismus und magnetischer Ordnung), niederenergetische Positronenbeugung (LEPD), normale Photoelektronenbeugung (NPD), atomare oder He-Beugung (AD) und eine Anpassung von Neutronenstreuung für eine Oberflächensensitivität. Winkelaufgelöste Röntgenphotoelektronenstreuung (ARXPD) mißt die Winkelphotoemission von Röntgenphotoelektronenanregung und ist daher einer spektroskopischen Technik ähnlicher.
  • Spektroskopische Techniken, welche eine Elektronenanregung verwenden, umfassen Auger-Elektronenspektroskopie (AES), welche 2°-Elektronen erfaßt, die beim Zerfall von Atomen in den Grundzustand nach elektronischer Kernlochanregung abgegeben werden, und ähnliche Techniken, einschließlich Auger electron appearance potential spectroscopy (AEAPS), winkelaufgelöste AES (AREAS), electron appearance potential fine structure spectroscopy (EAPFS), disappearance potential spectroscopy (DAPS). Zusätzliche spektroskopische Techniken verwenden Elektronenstrahlenanregung einschließlich Elektronenumwandlungs-Mössbauer-Spektroskopie (CEM), elektronenstimulierte Ionenwinkelverteilung (ESIAD), Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) und Hochauflösungs-EELS (HREELS), und verwandte Techniken einschließlich electron energy near edge structured (ELNES), Oberflächenelektronenenergiefeinstruktur (SEELFS). Eine zusätzliche auf Elektronenanregung basierende spektroskopische Technik, die einen Modulationsabsorptionsquerschnitt mit einer Energie von 100–500 eV über der Anregungsschwelle mißt, häufig durch Messen von Fluoreszenz, wenn die Kernlöcher zerfallen, ist eine ausgedehnte Röntgenenergieverlustfeinstruktur (EXELFS), NPD APD. Inverse Photoemission von Elektronen (IP) gibt Information über Leitungsbänder und nicht belegte Orbitale.
  • Auf Photonenanregung basierende Spektroskopie, die nicht klassische Teilchen verwendet, wird beispielhaft vertreten durch Ultraviolettphotoemissionsspektroskopie (UPS), Röntgenphotoemissionsspektroskopie (XPS, zuvor bekannt als ESCA, Elektronenspektroskopie zur chemischen Analyse). Zu XPS verwandte Techniken umfassen: Photonstimulierte Ionen-Winkelverteilung (PSD) analog zu ESDIAD, Appearance Potential XPS (APXPS), bei welcher der EAPFS-Querschnitt durch Fluoreszenz des Zerfalls von Röntgenphotoemittierten Kernlöchern überwacht wird, verschiedene winkelaufgelöste Photoemissionstechniken (ARPES) einschließlich winkelaufgelöster Photoemssions-Feinstruktur (ARPEFS), winkelaufgelöster UV-Photoemissionsspektroskopie (ARUPS), winkelaufgelöster XPS (ARXPS), ARXPD, Nahkantenröntgenabsorptionsfeinstruktur, die Energien von ungefähr 30eV über dem Anregungsschwellenwert verwendet, um sowohl primär photoemittierte Elektronen als auch Auger-Elektronen, die durch Kernlochzerfall emittiert werden, mißt (NEXAFS), ausgedehnte Röntgenabsorptionsfeinstruktur (EXAFS), Oberflächen-EXAFS (SEXAFS), die primärphotoemittierte Elektronen (PE-SEXAFS) und Auger-Elektronen, die durch Kernlochzerfall emittiert werden (Auger-SEXAFS) und Ionen, die durch Photoelektronen emittiert werden (PSD-SEXAFS) mißt. Winkelaufgelöste Röntgenphotoemissionsspektroskopie (ARXPS) mißt die Winkelverteilung von photoemittierten Elektronen.
  • Infrarotabsorptionsspektroskopie, welche Molekularstrukturinformation an Adsorbaten, adsorbierten Molekülen, bereitstellt, umfaßt Infrarotreflektionsabsorptionsspektroskopie (IRAS). Die Entfaltung von breitbandigem IRAS, wobei eine dopplerverschobene Quelle und Fourier-Analyse verwendet wird, wird als Fourier-Transformations-IR (FTIR) bezeichnet. Diese Techniken sind insbesondere wichtig zum Bestimmen der Identität und Konformität von adsorbierten Atomen und Molekülen zum Vorhersagen potentieller katalytischer Eigenschaften, z. B. zum Identifizieren, welche Zusammensetzung in einem Array weiter auf katalytische Eigenschaften getestet werden sollte. Die meisten katalytischen Mechanismen beginnen mit Adsorption, einschließlich Physi- und Chemisorption oder beiden (Somorjai, Introduction to Surface Chemistry and Catalysis (1994) John Wiley & Sons).
  • Streuungsbasierte Techniken umfassen Rutherford-Rückstreuung (RBS), Ionenstreuungsspektroskopie (ISS), Hochenergieionenstreuungsspektroskopie (HEIS), Mittelenergieionenstreuungsspektroskopie (MEIS), Niedrigenergieionenstreuungsspektroskopie (LEIS).
  • Mikroskopische Techniken umfassen Rastertunnelmikroskopie (STM) und angewandte Kraftmikroskopie (AFM), welche adsorbierte Moleküle erfassen können. Zum Beispiel wurde STM verwendet, um residente Adsorbate sowie andere Oberflächenkonturen zu zeigen, z. B. das Flüssigkristallmolekül 5-Nonyl-2-nonoxylphenylpyrimidin adsorbiert auf einer Graphitoberfläche (Foster et al. (1988) Nature 338:137). AFM erfaßt eine Auslenkung eines Auslegers, die durch Oberflächenkontakt bewirkt wird, und umfaßt Rasterkraftmikroskopie (SFM) und Reibungskraftmikroskopie (FFM). Kraftbasierte makroskopische Techniken können verwendet werden, um nicht-leitende Oberflächen zu studieren, da sie ein Elektronentunneln aus dem Festkörper erfordern. Massenspektroskopie(MS)-Techniken umfassen SIMS und MALDI-MS, welche verwendet werden können, um Information von ionisierten Makromolekülen, einschließlich Biomakromolekülen, zu gewinnen, die entweder kombinatorisch auf dem Substrat gebildet wurden, oder die an einer Oberfläche eines kombinatorischen Materials adsorbieren. US-Patent Nr. 5,959,297 beschreibt ein scannendes Massenspektrometer mit einer Ionisierungskammer und einem Kollektor, das ein elektrisches Signal als Reaktion auf die Menge an Gasionen ausgibt, welche die Kollektoroberfläche kontaktieren, und Verfahren zum Erfassen von in Arrays angeordneten Sammlungen verschiedener Materialien, die parallel einem Gasreaktant ausgesetzt wurden. MS-Techniken sind auch mit Molekularstrahl(MB)-Techniken kombinierbar, insbesondere reaktiver Molekularstrahlstreuung (MBRS), so daß eine Erfassung von Adsorptions- und Verweilzeitreaktionen an der Adsorbatstelle einschließlich einer Oberflächenkatalyse von Reaktionen adsorbierter Moleküle und der Winkelverteilung des Adsorbats und irgendeines Reaktionsprodukts, das von der Oberfläche abgegeben wird, ermöglicht wird (Atkins, Physical Chemistry, 6. Ausgabe (1998), W.H. Freeman & Co., N.Y.). Ein MS-Abtasten von in einem Mikroarray angeordneten Stellen, die Recktanten durch akustische Bereitstellung ausgesetzt werden, kann mit mikrodesorptiven MB-Techniken oder irgendeiner der hierin beschriebenen Techniken kombiniert werden, welche einen Oberflächenbereich mit ausreichend kleinen Dimensionen abtasten. Zum Beispiel kann eine Mikro-FTIR mit passender Auflösung mit einem Probendurchmesser von 5 μm ausgeführt werden. Eine Liste von Techniken und der ihnen zugeordneten Probendurchmesser folgt: XPS – 10 μm, MALDI-MS – 10 μm, SIMS – 1 μm (Oberflächenabbildung), 30 μm (Tiefenprofilierung), AES – 0,1 μm (100 nm), FE-AES – < 15 nm, AFM/STM – 1,5–5 nm, SEM 4,5 nm, FE-SEM – 1,5 nm, RBS – 2 mm, MB-MS – 0,1–0,3 mm. Es ist offensichtlich, daß das Array für die Charakterisierungstechnik konstruiert sein kann, z. B. in nichtbiomolekularen Arrays, in denen getestete Proben nicht so selten sind und Techniken, die größere Abtastbereiche umfassen, wie z. B. SIMS-Tiefenprofilierung, erwünscht sind, können Stellen mit Dimensionen in der Größenordnung von 100 μm verwendet werden, entsprechend einer Dichte von ungefähr 10.000 Stellen/cm2. Messungen solcher Eigenschaften wie die Leitfähigkeit werden durch größere Merkmale weiter erleichtert.
  • Das thermische Muster eines Arrays kann durch eine Infrarotkamera erfaßt werden, um heiße Punkte, wie z. B. katalytische Bereiche, Reaktionsbereiche und Bereiche der Adsorption in einem Array von Materialien, aufzudecken. Zum Beispiel wurde über ein paralleles Erfassungsverfahren, basierend auf Reaktionswärme, die von katalytischen Oberflächenreaktionen adsorbiert wurde, berichtet (Mostes et al. (1996) Ind. Eng. Chem. Res. 35:4801–03). In der oberflächenkatalysierten Oxidation von Wasserstoff über einer metallischen Oberfläche decken IR-Strahlungsbilder eines Arrays potentieller Katalyte die aktiven Katalyte auf. Die warmen Punkte in dem Bild, die Arraystellen mit katalytischer Aktivität entsprechen, können durch eine Infrarotkamera aufgelöst werden. Trotz Abweichungen in der Wärmekapazität und in der thermischen Oberflächenleitfähigkeit zwischen Materialien, welche die Möglichkeit ergeben, daß Arraystellen mit gleicher katalytischer Aktivität im unterschiedlichen Ausmaß in der Temperatur ansteigen, ist das Vorhandensein oder das Fehlen einer erfaßbaren Erwärmung ein semiquantitatives Anzeichen des Enthalpieanstiegs, welches ausreichend ist zum Erfassen, um Materialien mit einer gewissen katalytischen Aktivität zu identifizieren. Analog für die Adsorption, sogar wenn die Wärme der Adsorption für ein gegebenes Molekül von der Adsorptionsstelle abhängen kann und verschiedene Materialien unterschiedliche Adsorptionsstellen für das gleiche Molekül aufweisen können, ist eine Erwärmung der Arraystelle adäquat zum Erfassen von Material mit Oberflächen, die ein gegebenes Molekül für verschiedene Zwecke adsorbieren, einschließlich potentieller Katalyse von Reaktionen, die dieses Molekül umfassen. Die spontane Reaktion durch Oberflächenneuordnung, Oxidation oder andere Prozesse kann auch durch Erfassung einer Oberflächenerwärmung erfaßbar sein. Da Oberflächen inhärent metastabil sind und die relative Metastabilität der Oberfläche oft die Nützlichkeit eines Materials bestimmt, da sie die nützliche Lebensdauer eines Produkts aus dem Material bestimmt, ist eine Bestimmung der Oberflächenreaktivität unter verschiedenen Bedingungen wichtig. Physikalische, chemische, biologische und/oder Biomaterialien-/Biokompabilitätsmessungen der Kinetiken von Oberflächenneuordnungen allgemein und insbesondere mechanistisch einschließlich Prozessen in Abhängigkeit von der Temperatur, ergeben wertvolle Information über die freie Aktivierungsenergie verschiedener Prozesse. Infrarotbildgebung kann auch für solche Bestimmungen nützlich sein, jedoch darf man sich, da viele, wenn nicht alle, spontanen Oberflächenphänomene wahrscheinlich entropische Phänomene sind, nicht nur auf semiquantitative thermodynamische Messungen verlassen.
  • Biomaterialeigenschaften können ebenfalls charakterisiert oder erfaßt werden. In einigen Fällen können Arrays in Labortiere implantiert werden, und Fibrose, entzündliche Veränderungen, die Förderung von Proteinaggregation und ähnliches können für das nackte Substrat und verschiedene nahegelegene kombinatorische Stellen verglichen werden, obwohl ultimativ individuelle Materialien getrennt implantiert werden sollten. In vitro-Ansätze für eine Biokompatibilität umfassen das Messen von Adsorption verschiedener Proteine und Mischungen davon mit der Zeit an den verschiedenen Stellen. Oberflächen, die (1) geringe Niveaus an (2) sättigbarer Adsorption für (3) die wenigsten verschiedenen Proteine zeigen und (4) die Adsorbatproteine nicht denaturieren, sind höchstwahrscheinlich biokompatibel. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß mit Polyethylenglykol (PEG) modifizierte Si-Oberflächen, in denen die Menge an Adsorbat bei relativ niedrigen Niveaus sättigt, biokompatibeler sind als eine nicht modifizierte Oberfläche, welche fortfährt, Adsorbat über die gesamte beobachtete Zeitdauer zu akkumulieren (Zhang et al. (1998) Biomaterials 19(10):953–60). Zhang et al. untersuchen die Adsorption von Albumin, Fibrinogen und IgG an Si-Oberflächen mit selbstgeordnetem PEG durch Ellipsometrie, um die nichtfaulenden und nichtimmunogenen Eigenschaften der Oberflächen zu beurteilen. Zusätzlich wurden Adhäsion und Proliferation humanen Fibroblasts und Helazellen auf den modifizierten Oberflächen untersucht, um ihre Gewebebiokompabilität zu untersuchen. Adsorptionsexperimente auf polymerfunktionalisierten Oberflächen deuten einen entropischen Effekt an, welcher durch ein konformatives labileres Polymer mit größerem Anti-Adsorptionseffekt bestätigt wird (Cordova et al. (1997) Anal. Chem. 69(7):1370–9), welcher eine Sättigung bewirken kann durch Verhindern einer Denaturierung und Schichtung nichtspezifischer Aggregation.
  • Geeignete analytische Techniken zum Analysieren kombinatorischer Sammlungen, die hierein präpariert wurden, sind in der folgenden Tabelle dargelegt.
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Im allgemeinen dienen, in Bezug auf das Screenen von in einem Array angeordneten Materialien auf verschiedene Eigenschaften, diejenigen oberflächenphysikalischen Charakterisierungstechniken, die in der Lage sind, eine Karte der Oberflächenmikrostrukturen von in einem Array angeordneten Materialien zu analysieren, dazu, verschiedene mögliche Eigenschaften der Oberfläche zu identifizieren, insbesondere physikalische Eigenschaften der Oberfläche, die den Materialeigenschaften zugehörig sind, einschließlich Oberflächenrauhigkeit und Kornorientierung und Funktionalisierung, einschließlich z. B. Silanolbildung und Elektronenwolkenorientierung in kristallinen Siliziumoberflächen, und möglicher chemischer und physikalischer Adsorptions(Chemi-, Physisorptions)-Stellen für verschiedene Moleküle, Information, welche für sich betrachtet nützlich sein kann und beim Vorhersagen der Möglichkeiten für katalytische Aktivität.
  • Es ist offensichtlich, daß, während die Erfindung in Verbindung mit ihren bevorzugten spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, die vorstehende Beschreibung als Erläuterung gedacht ist und nicht, um den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken. Andere Aspekte, Vorteile und Änderungen werden dem Fachmann, zu dessen Gebiet die Erfindung gehört, offensichtlich.
  • Die folgenden Beispiele sind dargelegt, so daß sie den Fachmann mit einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung versehen, wie die Erfindung auszuführen ist, und sind nicht dazu gedacht, den Schutzbereich dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, zu beschränken. Es wurde Aufwand getrieben, um eine Genauigkeit in Bezug auf Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, etc.) sicherzustellen, jedoch sollten einige Fehler und Abweichungen in Betracht gezogen werden. Es sei denn, es ist anders dargelegt, sind die Teile Teile pro Gewicht, die Temperatur ist in °C angegeben, und der Druck liegt bei oder nahe bei Atmosphärendruck.
  • BEISPIEL 1
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Arrays von teilweise nicht hybridisierenden Oligonukleotiden in der Form einer Sammlung und demonstriert die Verwendung fokussierter akustischer Energie in der Festphasensynthese von teilweise nicht hybridisierenden Oligonukleotiden.
  • Mikroporöses Glas, vorzugsweise Glas mit kontrollierter Porengröße (controlled Pore size glass; CPG) wird auf die Oberfläche einer Glasplatte gesintert, um eine CPG-Schicht zu bilden mit einer Dicke, die ausreichend ist, um eine Durchdringung sowohl in dem Abwärts-Strom als auch die seitliche Dochtwirkung von Fluiden zu ermöglichen. Im allgemeinen ist eine ausreichende Dicke größer als ungefähr 10 μm.
  • Entsprechend wird das CPG mit einer Dicke von ungefähr 20 μm aufgetragen auf die Glasoberfläche, und das Glas mit pulverisiertem CPG, das darauf angeordnet ist, wird für ungefähr 20 Minuten auf 750°C erwärmt und dann abgekühlt. Kommerziell erhältliche Objektträger (BDH Super Premium 76 × 26 × 1 mm) werden als Träger verwendet. In Abhängigkeit von dem genauen Glassubstrat und dem verwendeten CPG-Material können die Sintertemperatur und -zeit so angepaßt werden, daß eine durchlässige und poröse Schicht erhalten wird, die zulänglich an dem Glas darunter anhaftet, während im wesentlichen die Durchlässigkeit für Fluide und die Dicke der mikroporösen Glasschicht erhalten bleiben. Die für 20 Minuten erwärmten Objektträger mit einer 1 cm Quadratfläche mikroporösen Glases mit einer Dicke vor dem Erwärmen von ungefähr 20 μm ergeben eine gesinterte Schicht von im wesentlichen der gleichen Dicke wie vor dem Erwärmen, nämlich 20 μm.
  • Die mikroporöse Glasschicht wird mit einem langen aliphatischen Linker derivatisiert, der Bedingungen aushalten kann, welche benötigt werden, um die aromatischen heterozyklischen Basen deprotektionieren zu können, d. h. 30% NH3 bei 55°C für 10 Stunden. Der Linker, welcher einen Hydroxylrest, den Startpunkt für die sequentielle Bildung des Oligonukleotids aus Nukleotidprecursern, bildet, wird in zwei Schritten synthetisiert. Zunächst wird die gesinterte mikroporöse Glasschicht mit einer 25%igen Lösung von 3-Glycidoxypropyltriethoxysilan in Xylen, das mehrere Tropfen von Hunigs-Base als einen Katalyt in einem Anfärbegefäß, das mit einem Trockenrohr ausgestattet ist, enthält, für 20 Stunden bei 90°C behandelt. Die Objektträger werden dann mit MeOH, Et2O gewaschen und luftgetrocknet. Reines Hexaethylenglykol und eine Spurenmenge von konzentrierter H2SO4-Säure wird dann hinzugegeben, und die Mischung wird für 20 Stunden bei 80°C gehalten. Die Objektgläser werden mit MeOH, Et2O gewaschen, luftgetrocknet und bei –20°C trockengehalten, bis sie verwendet werden. (Die präparative Technik ist im allgemeinen in der britischen Patentanmeldung 8822228.6, angemeldet am 21. September 1988, beschrieben.) Eine fokussierte akustische Abgabe von ungefähr 0,24 Picolitern (pL) wasserfreiem Acetonitril (die primäre Kopplungslösung), welches einen fluoreszierenden Marker enthält, auf das mikroporöse Substrat wird dann gezeigt, um eine kreisförmige Fläche mit ungefähr 5,6 μm Durchmesser auf dem durchlässigen, gesinterten, mikroporösen Glassubstrat zu erhalten. Die Menge an akustischer Energie, die auf die Fluidoberfläche einwirkt, kann eingestellt werden, so daß ein passender Durchmesser für die chemische Synthese der erwünschten Stellendichte sichergestellt wird. Kreisförmige Flächen mit 5,6 μm Durchmesser sind geeignet zum Herstellen eines Arrays mit einer Stellendichte von 106 Stellen/cm2 mit kreisförmigen synthetischen Flächen, die von Mitte zu Mitte 10 μm voneinander beabstandet sind, und die synthetischen Flächen sind daher in dem Bereich größter Annäherung Kante zu Kante mindestens 4 μm voneinander beabstandet. Alle nachfolgend räumlich gerichteten akustisch abgegebenen Volumen in dieser Probe haben ungefähr 0,24 pL. Es ist leicht offensichtlich, daß für andere Lösungen als reines Acetonitril die abgegebenen Volumen durch Anpassen der akustischen Energie falls notwendig zum Bereitstellen eines in der Größe nach dem Verteilen auf dem Substrat passenden Tröpfchens (hier ungefähr 5 μm im Radius) eingestellt werden können.
  • Der Oligonukleotidsynthesezyklus wird ausgeführt, wobei eine Kopplungslösung verwendet wird, die durch Mischen gleicher Volumen von 0,5 M Tetrazol in wasserfreiem Acetonitril mit einer 0,2 M Lösung des benötigten β-Cyanoethylphosphoramidit, z. B. A-β-cyanoethyl-phosphoramidit, C-β-cyanoethylphosphoramidit, G-β-cyanoethylphosphoramidit, T(oder U)-β-cyanoethylphosphoramidit. Die Kopplungszeit beträgt 3 Minuten. Oxidation mit einer 0,1 M Lösung von I2 in dem THF/Pyridin/H2O erhält eine stabile Phosphortriester-Bindung. Detritylation des 5'-Endes mit 3%iger Trichloressigsäure (TCA) in Dichloromethan ermöglicht eine weitere Erstreckung der Oligonukleotidkette. Es wird kein Verkappungsschritt benötigt, da der Überschuß der Phosphoramidite, die über reaktiven Stellen auf dem Substrat verwendet werden, groß genug ist, um die Kopplung zur Vollständigkeit zu treiben. Nach der Kopplung des Objektträgers werden die nachfolgenden chemischen Reaktionen (Oxidation mit I2 und Detritylation mit TCA) durch Eintauchen des Objektglases im Anfärbebehälter ausgeführt. Alternativ wird die fokussierte akustische Bereitstellung von I2 in THF/Pyridin/H2O und/oder 3% TCA in Dichloromethan, um die Oxidations- und Tritylations-Schritte zu bewirken, nur an ausgewählten Stellen ausgeführt, wenn eine ausreichende Zeit vergeht, um eine Verdampfung im wesentlichen des gesamten Lösungsmittels aus dem vorangegangenen Schritt zu ermöglichen, so daß die synthetischen Flächenkanten sich nicht nach außen bewegen und näher zu den benachbarten synthetischen Flächen und darüber hinaus, um eine wasserfreie Umgebung für nachfolgende Kopplungsschritte bereitzustellen, wenn I2 in THF/Pyridin/H2O in der Reaktionskammer bereitgestellt wird.
  • Nachdem die Synthese abgeschlossen ist, wird das Oligonukleotid in 30%iger NH3 für 10 Stunden bei 55°C deprotektioniert. Da die Kopplungsreagenzien feuchtigkeitsempfindlich sind, muß der Kopplungsschritt unter wasserfreien Bedingungen in einer abgedichteten Kammer oder einem Behälter ausgeführt werden. Dies kann erreicht werden durch Ausführen der akustischen Fleckenbildung in einer Kammer getrockneten Gases, die erhalten wird durch Evakuieren einer Kammer, die die akustische Abgabevorrichtung und das synthetische Substrat enthält, und durch Ersetzen des evakuierten atmosphärischen Gases mit getrocknetem N2 durch Standardverfahren, Waschschritte können in der Kammer ausgeführt werden oder durch Entfernen des Objektträgers und durch Waschen davon in einer passenden Umgebung, z. B. durch ein Anfärbegefäß, das mit einer Trocknungsröhre ausgestattet ist. Da ein Waschen und andere Schritte, wie z. B. Detritylation, einfacher außerhalb der Kammer ausgeführt werden können, kann die Synthese in einem Raum mit gesteuerter Luftfeuchtigkeit ausgeführt werden, der die Kammer mit gesteuerter Atmosphäre enthält, in der die Fleckenbildung erfolgt, wobei die anderen Schritte in dem Raum außerhalb der Kammer ausgeführt werden. Alternativ kann ein Raum mit gesteuerter Feuchtigkeit zur Fleckenbildung verwendet werden, wobei andere Schritte in einer weniger gesteuerten Umgebung durch Verwendung beispielsweise eines Anfärbebehälters, der mit einem Trocknungsrohr ausgestattet ist, ausgeführt werden.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Peptidarrays in der Form einer kombinatorischen Sammlung und demonstriert die Verwendung fokussierter akustischer Energie in der kombinatorischen Festphasensynthese aller Tetramere, die aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (204 oder = 160.000 Aminosäuresequenzen insgesamt) hergestellt werden können, in einem vierfachen Arrayformat. Vier identische Kopien des herzustellenden kombinatorischen Arrays sind in einer Fläche von 1 cm × 1 cm enthalten, die nominell in vier Quadranten geteilt ist, wobei jeder Quadrant 250.000 synthetisierte Stellen mit einer Größe von 10 μm × 10 μm aufweist, die in einem Array von 500 Reihen und 500 Spalten angeordnet sind. Nur 400 Reihen und Spalten werden in jedem Quadranten verwendet. Die ersten und letzten 50 Reihen und Spalten werden nicht zur Synthese verwendet und dienen dazu, die vier identischen Arrays und die Kanten der Flächen voneinander zu beabstanden, obwohl eine alternative Anordnung der vier identischen Arrays einen größeren Abstand zwischen Arrays erhalten kann durch Bewegen jedes Arrays näher an die Ecken der quadratischen Fläche. Zusätzlich zu dem systematischen Herstellen der kombinatorischen Sequenzen verwendet die Abscheidung der Monomere ein systematisches Verfahren zum Sicherstellen, daß es weniger wahrscheinlich ist, daß sich ähnliche Aminosäuresequenzen räumlich nahe sind. Obwohl viele solche Verfahren existieren, von denen einige eine komplizierte Berechnung erfordern und Kettenähnlichkeiten zusätzlich zur Identität berücksichtigen können, z. B. hydrophobes Val, Leu, Le, beruht das verwendete Schema auf einer grundlegenden sequentiellen Liste von Aminosäuren, die phasenverschoben wird, wenn sich die Reihenzahl erhöht. Zum Beispiel können die 20 natürlichen Aminosäuren sequentiell aufgelistet werden, basierend auf der alphabetischen Reihenfolge ihrer einzelnen Buchstabenabkürzungen, in diesem Fall ist Ala (A) "1", Cys (C) ist "2", Asp (D) ist "3", ... Val (V) ist "19" und Trp (W) ist "20".
  • Für das erste abgeschiedene Monomer in der ersten Reihe in einem gegebenen Quadranten, in dem ein Peptid synthetisiert wird, welches die 51. nominale Reihe in diesem Quadranten ist, beginnend mit der ersten synthetischen Spalte (51. nominale Spalte) werden Aminosäuren (so wie für die unten detaillierter beschriebene Synthese aktiviert) als grundlegende sequentielle Liste von 1 bis 20 in alphabetischer Reihenfolge der Einbuchstabenabkürzungen abgeschieden. Beginnend mit der zweiten synthetischen Reihe (52. nominale Reihe) wird die Reihenfolge um eine Position verschoben, beginnend mit "2" und zurückkehrend zu "1" nach "20" (2, 3, 4, 5 ... 19, 20, 1). Daher ist für die hergestellte vierfache Anordnung von beabstandeten Arrays in der 52. nominalen Reihe (2. synthetische Reihe) eines gegeben Quadranten, die erste in der 51. und 431. nominalen Spalte abgeschiedene Aminosäure der 52. nominalen Reihe "2" oder Cys, und die in den 68. und 448., 69. und 449. und 70. und 450. nominalen Spalten dieser Reihe abgeschiedenen Aminosäuren sind 19, 20 bzw. 1 (V, W, A).
  • Zusätzliche Monomere werden in die Quadranten hinzugefügt wie folgt, obwohl zahlreiche Alternativen bestehen. Für das zweite Monomer in der ersten synthetischen Reihe (51. nominale Reihe) ist die Monomerabscheidungsreihenfolge für das zweite Monomer die gleiche wie für das erste Monomer in den ersten 20 synthetischen Spalten (nominal 51 bis 70) dieser Reihe, und die Ordnung wird um Eins verschoben für jede darauf folgende Gruppe von 20 synthetischen Spalten, daher ist die Ordnung 2, 3 ... 19, 20, 1 für die nominalen Spalten 71–90 (nachfolgend bezeichnet als [71–90] – {2, 3 ... 19, 20, 1}) und gemäß dieser Notation: [91–110] – {3, 4 ... 20, 1, 2); [111–130] – {4, 5 ... 1, 2, 3) ... [431–450] – {20, 1 ... 17, 18, 19). Für die zweiten und dritten Monomere in der zweiten synthetischen Reihe (52. nominale Reihe) ist die Monomerabscheidungsreihenfolge um Eins relativ zu der Reihenfolge für das darunterliegende Monomer in den ersten 20 synthetischen Spalten (nominal 51–70) dieser Reihe verschoben, und die Ordnung ist um Eins für jede darauffolgende Gruppe von 20 synthetischen Spalten verschoben, daher ist für das zweite Monomer die Reihenfolge 3, 4 ... 20, 1, 2 für nominale Spalten 51–70 und: [71–90] – {4, 5 ... 1, 2, 3) [91–110] – {5, 6 ... 2, 3, 4); [111–130] – 6, 7 ... 3, 4, 5) ... [431–450] – {2, 3 ... 19, 20, 1). Man beachte, daß für das zweite Monomer der zweiten synthetischen Reihe die Verschiebung relativ zu der Reihenfolge des ersten Monomers in dem ersten Monomer in den ersten 20 Spalten der ersten Reihe ({1, 2 ... 18, 19, 20}) 2 ist, da Eins die Verschiebung zwischen nachfolgenden Monomeren ist (1. ⇒ 2., 2. ⇒ 3.) und das erste Monomer der zweiten synthetischen Reihe ist um Eins relativ zu dem ersten Monomer der ersten synthetischen Reihe verschoben. Für die zweiten und dritten Monomere in der dritten synthetischen Reihe (53. nominale Reihe) ist die Monomerabscheidung um Zwei relativ zu der Reihenfolge des darunterliegenden Monomers in den ersten 20 synthetischen Spalten (nominal 51–70) dieser Reihe verschoben, und die Reihenfolge ist um Eins für jede nachfolgende Gruppe von 20 synthetischen Spalten verschoben, wodurch die Reihenfolge für das zweite Monomer 5 ... 20, 1, 2, 3, 4 für nominale Spalten 51–70 ist und: [71–90] – {6 ... 1, 2, 3, 4, 5), [91–110] – {7, ... 2, 3, 4, 5, 6), [111–130] – {8, ... 4, 5, 6, 6, 7} ... [431–450] – {4, ... 19, 20, 1, 2, 3}. Für das zweite Monomer in der Nten synthetischen Reihe (nominale Reihe = 50 + N) ist die Monomerabscheidungsreihenfolge für das zweite Monomer um (N – 1) relativ zu der Reihenfolge des ersten Monomers in den ersten 20 synthetischen Spalten (nominal 51–70) dieser Reihe verschoben, und die Reihenfolge ist um Eins für jede aufeinanderfolgende Gruppe von 20 synthetischen Spalten verschoben, daher ist (für (k·N + a) > 20, (k·N + a) verschoben, beginnend mit N + a – 20·I, wobei I die ganze Zahl geteilt durch den Quotienten von (k·N + a) und 20 ist, was Anzahlen von Zyklen mit jedem ganzzahligen Vielfachen von 20 unverschoben darstellt) die Reihenfolge für das zweite Monomer (2·N – 1), 2·N ... (2·N – 3), (2·N – 2) für nominale Spalten 51–70 und: [71–90] – {(2·N ... (2·N – 2), (2·N – 1)}, [91–110] – {(2·N + 1), (2·N + 2) ... (2·N – 1), 2·N}, [111–130] – {(2·N + 2), (2·N + 3) ... 2·N, (2·N + 1)} ... [431–450] – {(2·N – 2), (2·N – 1) ... (2·N – 4), (2·N – 3)}. Daher beginnt für das zweite Monomer in der 400. synthetischen Reihe (450. nominale Reihe), die Monomerabscheidungsreihenfolge für das zweite Monomer mit 19 (799–780) und ist zirkular um 18 relativ zu der Reihenfolge des ersten Monomers in den ersten 20 synthetischen Spalten (nominal 51–70) der ersten Reihe verschoben, und die Reihenfolge ist um Eins für jede nachfolgende Gruppe von 20 synthetischen Spalten verschoben, wodurch die Reihenfolge ist 19, 20 ... (17), (18) für nominale Spalten 51–70 und: [71–90] – {20, 1 ... 17, 18, 19), [91–110] – {1, 2 ... 18, 19, 20), [111–130] – {2, 3 ... 19, 20, 1} ... (431–450] – {20, 1 ... 17, 18, 19). Man beachte, daß für das zweite Monomer der Nten synthetischen Reihe die Verschiebung relativ zu der Reihenfolge des ersten Monomers in den ersten 20 synthetischen Spalten der ersten Reihe ({1, 2 ... 18, 19, 20}) 2·(N – 1) ist, da (N – 1) die Verschiebung zwischen nachfolgenden Monomeren (1. ⇒ 2., 2. ⇒ 3. ) ist und das erste Monomer einer synthetischen Reihe N um (N – 1) relativ zu dem ersten Monomer in der ersten synthetischen Reihe verschoben ist.
  • Die synthetischen chemischen Schritte werden modifiziert von bekannten Festpha sensynthesetechniken (wie z. B. in Geysen et al., internationale Patentanmeldung PCT/AU84/00039 , veröffentlicht als WO 84/83564 beschrieben), die der bahnbrechenden Festphasenpeptidsynthese von Merrifield et al. ((1965 Nature 207:(996):522–23; (1965) Science 150(693)178–85, (1966) Anal. Chem. 38(13):1905–14, (1967) Recent. Prog Horm. Res. 23:451–82) nachgearbeitet wurden. Die herkömmlichen Verfahren der Festphasenpeptidsynthese, so wie sie in diesen grundlegenden Veröffentlichungen gelehrt werden, werden im Detail in Ericksen, B.W. und Merrifield, R.B. (1973) The Proteins 2:255-57 Academic Press, New York, und Meinhofer, J. (1976) The Proteins 2:45–267 Academic Press, New York, beschrieben. Kurz fügen alle diese Verfahren Aminosäuremonomere, die durch tert-Butoxycarbonyl (t-butoxycarbonyl, t-Boc) an ihren Aminogruppen geschützt sind, einschließlich ihrer Alpha-Aminogruppen (Nα), an ein naszentes Peptid, da an dem Substrat an dem Carboxy-Terminal (C-Terminal) anhaftet. Der Carbonylrest der Nα-t-Boc-Aminosäure, der dem Peptid hinzugefügt werden soll, wird aktiviert, um die Hydroxylgruppe des carboxylischen Rests in eine effektive verlassende Gruppe umzuwandeln, was eine reagierende Anhydridsäure zurückläßt, wobei Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) verwendet wird, um eine nukleophile Verschiebung um den Terminal N des naszierenden Peptids zu ermöglichen, so daß eine Peptidbindung gebildet wird, die das Monomer dem bildenden Peptid hinzufügt. Das neu hinzugefügte Monomer hat einen N-Terminus, der vor weiterer Reaktion durch t-Boc geschützt ist, was durch Trifluoroacetatsäure (TFA) entfernt wird, was die endständige Aminogruppe protoniert zurückläßt, gefolgt von einer Deprotonierung der endständigen Aminogruppe mit Triethylamin (TEA), um reaktive freie Aminogruppen geeignet zum Hinzufügen eines weiteren Monomers abzuschirmen.
  • Das verwendete Substrat ist Polyethylen, obwohl das klassische Substrat für die Festphasenpeptidsynthese, durch Friedel-Crafts-Reaktion des Polystyrenharzes an in etwa einem von vier aromatischen Ringen chloromethyliertes Divinylbenzen-kreuzvernetztes Polystyren, auch verwendet werden könnte. Die Herstellung des Polyethylensubstrats, beschrieben in Geysen et al., internationale Patentanmeldung PCT/AU84/00039 , veröffentlicht als WO 84/83564 , verwendet eine γ-Strahlungsbestrahlung (1 mrad Dosis) von Polyethylen gelöst in wäßriger Acrylsäure (6% v/v), um reaktive Polyethylenpolyacrylsäure (PPA) zu erhalten gemäß dem Verfahren von Muller-Schulte et al. (1982) Polymer Bulletin 7:77–81, Nα-t-Boc-Lysinmethylester wird dann mit PPA durch die Lysin-ε-Aminoseitenkette gekoppelt. Nach der Deprotektionierung des Nα durch das Entfernen des t-Boc mit TFA gefolgt von TEA, DCC/Nα-t-Boc-Alanin wird hinzugefügt, um t-Boc-Ala an das Nα des Lys zu koppeln, wodurch ein Peptid wie Nα-t-Boc-Ala-Lys-ε-N-PPA-Linker mit dem die DDC aktivierten Nα-t-Boc-Aminosäuremonomere sequentiell hinzugefügt werden können, um die gewünschten Polymere bei der Deprotektion der Nα-Gruppe des Nα-t-Boc-Ala zu bilden.
  • Das Polyethylensubstrat kann kommerziell erhältliches glattes Polyethylenblattmate rial in verschiedenen Dicken sein. Polyethylenperlen können an einer Oberfläche auf eine Weise anhaften, die es ihnen ermöglicht, von der Oberfläche getrennt zu werden durch Verwendung von Polyethylen mit niedrigem Molekulargewicht (MW) als Klebstoff. In der Größe passende Polyethylenperlen, z. B. durch γ-Bestrahlung beim Vorhandensein von Acrylsäure aktiviert, um PPA zu bilden, können auf eine glatte Polyethylenfläche oder ein Glas oder eine andere Oberfläche aufgebracht werden, die mit niedrigem MW Polyethylen beschichtet ist, oder der Adhäsionsschritt kann vor der Aktivierung ausgeführt werden.
  • Für ein Arrayformat und um die effektive Oberfläche zur Polymerbildung zu erhöhen und die Adhäsion akustisch abgegebener Reagenztröpfchen an dem synthetischen Substrat zu verbessern, wird ein kommerziell erhältliches Polyethylenfaserblattmaterial mit einer Dicke von etwa 25 μm durch herkömmliche Verfahren gemäß Routineverfahren an eine glatte Polyethylenrückseite mit einer Dicke von ungefähr 0,15 cm wärme- oder fusionsgebondet, um ein polyethylenfaserbeschichtetes, rauhes, durchlässiges Substrat zu bilden. Das faserbeschichtete Blatt mit den ungefähren Abmessungen eines kommerziellen Objektträgers wird in Streifen geschnitten und in 6%iger v/v wäßriger Acrylsäure γ-bestrahlt (1 mrad), um das PPA-aktivierte Substrat zu bilden. Das Substrat muß passend getrocknet sein, da die t-Boc-geschützten und DCC-aktivierten Reagenzien wasserempfindlich sind, und eine Wasserverunreinigung von Säuren, die auf die synthetischen Stellen aufgetragen werden, wie z. B. TFA-Aufbringung, die Peptid-Bindung hydrolisieren kann. Daher werden wasserfreie synthetische Bedingungen benötigt. Ein herkömmliches Trocknen des Substrats wird mit warmer getrockneter Luft bei atmosphärischem oder unteratmosphärischem Druck durch Routineverfahren bewirkt, insbesondere werden die Objektträger mit MeOH, Et2O gewaschen, luftgetrocknet und trocken bei –20°C gelagert, bis sie verwendet werden.
  • Das sequentielle kombinatorische Hinzufügen von Monomeren wird wie oben be schrieben an allen Stellen ausgeführt, die mit der passenden DCC/Nα-t-Boc-Aminosäure beschichtet sind. Das richtige Volumen für die akustische Abgabe ist oben beschrieben. Dies liefert eine quasi-parallele Synthese, da das Abdecken verschiedener Stellen nicht nur gleichzeitig erfolgt, sonder modifiziert sein kann, um die gewünschten Peptide nur an einigen Stellen zu synthetisieren und an anderen Stellen später zu synthetisieren. Die tatsächliche Synthese erfordert Waschschritte mit einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, um nichtreagierte aktivierte Aminosäuren oder TFA oder TEA zu entfernen mit einer Gesamtzahl von 11 Schritten pro Monomerhinzufügung. Daher würde eine vollständige sequentielle Synthese die Anzahl von Schritten, die zum Synthetisieren eines Arrays ausgeführt werden, drastisch erhöhen, jedoch würde z. B. ein Synthetisieren jeder zweiten Stelle in einer ersten Syntheserunde und dann ein Synthetisieren in einer zweiten Runde die Arrayqualität verbessern und die Anzahl von Schritten nur verdoppeln. Um sicherzustellen, daß die Peptide nur an den gewählten Stellen gebildet werden, kann der Nα-t-Boc-Ala-Lys-ε-N-PPA-Linker selektiv deprotektioniert werden, um das Nα von Ala nur an ausgewählten Stellen freizulegen durch selektiv gerichtete akustische Energieabgabe von TFA auf die gewünschten Stellen, gefolgt von Waschen und selektiver Anwendung von TEA, gefolgt von einer Waschung, um z. B. eine selektive Deprotektionierung jeder zweiten Stelle zu bewirken.
  • Die grundlegende quasi-parallele kombinatorische Synthese aller Tetrapeptide, die aus den natürlich auftretenden Aminosäuren hergestellt werden können, kann in 44 Schritten, ausschließlich der Substratherstellung, ausgeführt werden. Da keine selektive Linkerdeprotektionierung erforderlich ist, wird das Substrat in TFA in einem Anfärbegefäß eingetaucht, das mit einer Trockenröhre ausgestattet ist, dann gewaschen und in TEA eingetaucht und wieder gewaschen, alles unter wasserfreien Bedingungen. Die Synthese muß so ausge führt werden, daß eine Abgabe der Fluidtröpfchen in einer gesteuerten Atmosphäre auftritt, die zumindest trocken ist und inert gegenüber den verwendeten Reagenzien. Dies kann erreicht werden durch Ausführen der akustischen Befleckung in einer Kammer trockenen Gases, die durch Evakuieren einer Kammer erhalten wird, welche die akustische Abgabevorrichtung und das synthetische Substrat enthält, und Ersetzen des atmosphärischen Gases mit getrocknetem N2 durch Routineverfahren. Waschschritte können in der Kammer ausgeführt werden oder durch Entfernen des Objektträgers und Waschen in einer passenden Umgebung, z. B. in einem Anfärbegefäß, das mit einer Trockenröhre ausgestattet ist. Da ein Waschen und andere Schritte, wie z. B. Detritylation, einfacher außerhalb der Kammer ausgeführt werden können, kann die Synthese auch in einem Raum mit gesteuerter Luftfeuchtigkeit ausgeführt werden, der die Kammer mit gesteuerter Atmosphäre enthält, in der die Befleckung erfolgt, wobei die anderen Schritte in dem Raum außerhalb der Kammer ausgeführt werden. Alternativ kann ein Raum mit gesteuerter Luftfeuchtigkeit zum Beflecken verwendet werden, wobei andere Schritte in einer weniger gesteuerten Umgebung ausgeführt werden, z. B. durch Verwendung eines Anfärbegefäßes, das mit einer Trockenröhre ausgestattet ist.
  • Die Verwendung vorsynthetisierter kurzer Oligopeptide kann ebenfalls anstelle von Aminosäuremonomeren verwendet werden. Da eine fokussierte akustische Abgabe den schnellen Übergang von der Abgabe eines Fluids zu einem anderen ermöglicht, können Oligopeptide in kleinen Volumen auf einem einzigen Substrat (wie z. B. einer Mikrotiterplatte) vorgesehen sein, um ein schnelleres Zusammensetzen von Aminosäureketten zu ermöglichen. Zum Beispiel können alle möglichen Peptiddimere in einer Titerplatte mit über 400 Wells synthetisiert und gespeichert werden. Die Konstruktion der Tetramere kann dann von der Abscheidung von nur 2 Dimeren pro Stelle und einem einzigen Verlinkungsschritt begleitet werden. Dieses weiter ausweitend, kann eine Titerplatte mit mindestens 8.000 Wells verwendet werden, um Peptide mit Trimeren zu konstruieren.
  • BEISPIEL 3
  • Kombinatorische Verfahren der vorangegangenen Beispiele 1 und 2 können angepaßt werden, um kombinatorische Arrays von Polysacchariden gemäß der vorliegenden Erfindung zu bilden. In Oligosacchariden sind die Monosaccharidgruppen normalerweise über Oxy-Etherbindungen verbunden. Polysaccharidetherverbindungen sind chemisch schwierig zu konstruieren, da die Bindungsverfahren für jeden verwendeten Zucker spezifisch sind. Die Ethersauerstoffverbindungsgruppe ist auch für eine Hydrolyse durch nicht enzymatische chemische Hydrolyse anfällig. Daher gibt es keine bekannten Verfahren zur automatisierten Synthese von etherverbundenen Kohlenstoffhydraten und herkömmliche Verfahren zum Herstellen kombinatorischer Arrays sind nicht ausreichend flexibel, um kombinatorische Arrays von Polysacchariden zu ermöglichen. Die Flexibilität akustischer Befleckung kann angepaßt werden, um auf Oxy-Etherverbindung basierende kombinatorische Arrays herzustellen durch Analogie zu dem alternativen Verfahren des selektiven Deblockierens, das verwendet werden kann, um die Arrays aus den Beispielen 1 uns 2 herzustellen. Das heißt, die spezifischen chemischen Verfahren zum Herstellen der Verbindung zwischen irgendeinem Paar von Zuckern kann bequem so ausgewählt werden, so daß eine unterschiedliche Lösung abgegeben wird zum Hinzufügen einer Glukose zu einem spezifischen endständigen Zucker des bildenden Polysaccharids, wie z. B. Fruktose, dann wird es abgegeben, um Glukose einem anderen endständigen Zucker hinzuzufügen, wie z. B. Ribose, ohne die Anzahl von Schritten zu erhöhen, die damit verbunden sind, wie es der Fall wäre bei der photolithographischen Herstellung und der Fall sein könnte beim parallelen Drucken von Mehrfachreagenzien durch herkömmliche Mehrfachdüsendrucker vom Typ Tintenstrahl. Die resultierenden Polysaccharide verbleiben empfindlich gegenüber Hydrolyse.
  • Polysaccharide können in Lösung synthetisiert werden statt in der festen Phase, wie die Biomoleküle, die in den vorangegangenen Beispielen hergestellt werden, und die akustische Abgabe von Tröpfchen kann die Lösungssynthese von im Array angeordneten Polysacchariden mit hoher Dichte auf einem Substrat bewirken, ohne irgendwelche Anhaftung während der Polymerbildung durch selektive Auftragung von Deblockierungsreagenzien auf verschiedene Stellen. Eine in situ Festphasensynthese ist leichter an eine Automatisierung sogar von Polysacchariden, basierend auf Oxy-Etherverbindungen, anzupassen, da zumindest die Deblockierungsschritte gleichzeitig für alle Stellen erfolgen können, obwohl die Anfälligkeit der verschiedenen Verbindungen für eine Hydrolyse die Gesamtausbeute für verschiedene Monomersequenzen unterschiedlich beeinflussen kann. Kürzlich wurden Verfahren zum Ersetzen von Oxy-Ether durch eine Thioetherverbindung ( US-Patente Nr. 5,780,603 und 5,965,719 ) und durch eine Amidverbindung vorgestellt, wobei das N-Atom mit dem anomerischen C des Zuckers verbunden ist ( US-Patent Nr. 5,756,712 ), vorgestellt. Die Festphasensyntheseverfahren der Thioetherverbindungsverfahren können direkt so angepaßt werden, daß sie kombinatorische Arrays mit hoher Dichte auf eine analoge Weise bilden, wie Techniken für die Merrifield-Peptidsynthese. Ähnlich können amidverbindungsbasierte Polysaccharide für eine Bildung von Festphasenarrays mit hoher Dichte angepaßt werden durch Verwenden z. B. von thioetherbasierenden Substratverbindungen, die in den US-Patenten Nr. 5,780,603 und 5,965,719 offenbart sind, oder einer Amidbindung an eine mit einem passenden Rest funktionalisierte Oberfläche durch Analogie der Bindung aus US-Patent Nr. 5,756,712 .
  • Nur die thioetherbasierte Substratbindung wird im Detail erläutert, und diese Vernetzung wird verwendet, um ein Thioether (amidbasierte Oligosaccharide können analog durch Bezugnahme auf US-Patent Nr. 5,756,712 durch eine Thioether- oder andere Substratbindung hergestellt werden) basiertes kombinatorisches Array von Oligosacchariden herzustellen. Das klassische Substrat für die Festphasenpeptidsynthese, divinylbenzenkreuzvernetztes durch Friedel-Crafts-Reaktion des Polystyrenharzes an in etwa einem aus vier aromatischen Ringen chloromethyliertes Polystyren wird verwendet, obwohl ein Polyethylensubstrat ersetzt werden könnte.
  • Ein gesponnenes Polystyrenblatt, das durch herkömmliche Verfahren hergestellt wurde oder kommerziell erhältlich ist, wird auf eine Polystyrenrückseite wärme- oder fusionsgebondet, um eine poröse durchlässige Schicht gesponnenen Polystyrens mit einer Dicke von ungefähr 25 μm zu erhalten. Die passende Ausdehnung der Kreuzvernetzung und Chloromethylation wird durch herkömmliche chemische Syntheseverfahren bewirkt, so wie erforderlich. Die Dicke der durchlässigen Schicht wird so gewählt, daß sie die Abmessungen des Bereichs der tatsächlichen chemischen Synthese beeinflußt, da mehr vertikaler Raum für die Dochtwirkung zu weniger lateraler Ausbreitung der akustisch abgeschiedenen Reagenzien führt. Es ist auch offensichtlich, daß die Ausdehnung der Vernetzung so eingestellt werden kann, daß sie den Grad an Quellung und Aufweichung bei der Anwendung organischer Lösungsmittel steuert, und daß die faserartige Natur der porösen, durchlässigen Schicht gesponnenen Polystyrens relativ mehr synthetische Oberfläche pro nominaler Oberfläche des Substrats bereitstellt als durch Perlen bereitgestellt wird, wodurch eine geringere Quellung erforderlich ist, um die synthetische Fläche auf Polymerstellen innerhalb der Fasern auszudehnen. Das Substrat wird durch herkömmliche chemische Syntheseverfahren aminiert, gewaschen und trocken bei –20°C gelagert, bis es verwendet wird.
  • Die Verbindung eines Zuckers mit diesem Substrat wird zuerst bewirkt. Bernsteinanhydrid (1.2 Äquivalente) wird zu einer Lösung von 1,2:3,4-di-O-Isopropyliden-D-galactopyranose (1 Äquivalent) in Pyridin bei Raumtemperatur hinzugegeben. Die Reaktion wird über Nacht gerührt, dann in vacuo konzentriert, um 1,2:3,4-di-O-Isopropyliden-6-O-(3-carboxy)propanoyl-D-galactopyranose zu erhalten. 80%ige wäßrige Essigsäure wird zu dem Rest hinzugegeben, um die Isopropylidengruppen zu entfernen. Wenn diese Reaktion vollständig ist, wird die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert. Überschüssiges 1:1 Acetanhydrid/Pyridin wird dann dem Rest hinzugegeben, um 1,2,3,4-O-Acetyl-6-O-(3-carboxy)propanoyl-D-galactopyranose zu bilden, zu welcher überschüssige Thioessigsäure in trockenem Dichlormethan unter Argon bei 0°C und BF3-Etherat dann hinzugefügt wird. Das Kältebad wird nach 10 Minuten entfernt. Nach 24 Stunden wird die Mischung mit Dichlormethan verdünnt, mit gesättigtem Natriumdicarbonat gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und konzentriert, um 1-S-Acetyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(3-carboxy)propanoyl-1-thio-α-D-galactopyranose zu erhalten. Das aminierte Polystyren(Merrifield-Harz-)substrat wird mit der 1-S-Acetyl-2,3,4-tri-O-acetyl-6-O-(3-carboxy)propanoyl-1-thio-α-D-galactopyranose und einem Carbodiimidkopplungsreagens in Kontakt gebracht, um zu ermöglichen, daß sich die O-S-geschützte Galactopyranose durch die 6-O-(3-Carboxy)propanoylgruppe an das Substrat koppelt.
  • Das vorstehende Substrat wird zur kombinatorischen Synthese von thioetherverbun denen Polysacchariden basierend auf Thiogalactosederivaten verwendet. Neun Kopien des kombinatorischen Arrays aller möglichen Trimere von vier monomerischen 1-Thiogalactosederivaten (43 = 64 insgesamt) werden auf einer Gesamtsubstratoberfläche von 1 cm2 aufgeteilt in quadratische synthetische Stellen mit 333 μm × 333 μm synthetisiert, entsprechend einer Stellendichte von 1.000 Stellen/cm2. Diese Anordnung erlaubt einen Abstand von 3 Stellen oder 999 μm Abstand zwischen jeder Kopie des Arrays in jeder Achse der Arrayebene. Ein 25 pL Tröpfchen eines fluoreszenten Lösungsmittels, das auf dem beschriebenen porösen durchlässigen gesponnenen Polystyren auf Polystyrensubstrat abgeschieden wurde, ergibt einen Flecken von ungefähr 56 μm Durchmesser, und ein 100 pL Tröpfchen ergibt einen Flecken von ungefähr 112 μm Durchmesser (durch Dochtwirkung in die Tiefe des porösen Substrats ziehender zylindrisch geformter Fleck, wobei ungefähr ½ der porösen Schicht durch festes Polystyren belegt ist, und eine geringe Quellung auftritt).
  • Schritt A: Synthese von 1-Dithioethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-galactopyranosid: 1-Thio-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-galactopyranosid (500 mg, 1,37 mmol) und Diethyl-N-ethylsulfenylhydrazidodicarboxylat (360 mg, 2,0 mmol) (zubereitet durch bekannte Verfahren, wie von Mukaiyama et al. (1968) Tetrahedron Letters 56:5907–8 beschrieben) werden in Dichlormethan (14 mL) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 120 min. ist die Lösung konzentriert, und Säulenchromatographie (SiO2, Hexan/Ethylacetat 2:1) ergibt 1-Dithioethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-galactopyranosid (580 mg Menge) als einen weißen Festkörper (Rf 0,27 in Hexan/Ethylacetat (2:1)). 1H-NMR (360 MHz, CHCl3): δ 1,30 (dd, 3H,J = 7,4 Hz, CH3), 1,96, 2,02, 2,03, 2,13 (4s, 12H, 4CH3CO), 2,79 (ddd, 2H, J = 7,4 Hz, J = 7,4 Hz, J = 1,3 Hz, CH2), 3,94 (ddd, 1H, J4, 5 = 1,0 Hz, J5, 6a = 6,6 Hz, J5, 6b = 7,6 Hz, 5-H), 4,10 ddd, 2H, 61-H, 6b-H), 4,51 (d, 1H, J1, 2 = 10,0 Hz, 1-H), 5,05 (dd, 1H, J2, 3 = 10,0 Hz, J3, 4 = 3,3 Hz, 3H)), 5,38 (dd, 1H, J1, 2 = 10,0 Hz, J3, 3 = 10,0 Hz, 2-H), 5,40 (dd, 1H, J3, 4 = 3,3 Hz, J4, 5 = 1,0 Hz, 4-H), m/z berechnet für C16H24O9S2(M + NA) 447,1, gemessen 447,0.
  • Schritt B: Synthese von 1-Dithioethyl-β-D-galactopyranosid: 1-Dithioethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-galactopyranosid aus Schritt A (500 mg, 1,18 mmol) wird in trockenem Methanol (10 mL) gelöst und mit methanolischem Natriummethoxid (1 M, 150 μL) gelöst. Nach 2 Stunden wird die Lösung mit Amberlit 1R-120 (H+)-Harz neutralisiert, gefil tert und konzentriert, um 1-Dithioethyl-6-β-D-galactopyranosid als einen weißen Festkörper (300 mg, Menge) zu ergeben.
  • Schritt C: Kopplung von 1-Dithioethyl-β-D-galactopyranosid an das Substrat: 1-Dithioethyl-6-β-D-galactopyranosid (200 mg, 780 μmol) wird in trockenem Pyridin (8 mL) gelöst, und DMAP (5 mg) wird der Mischung hinzugefügt, die durchweg bei 60°C gehalten wird.
  • Von den gesamten (9 × 64 = 576) Stellen, die verwendet werden, um die 9fachen Arrays zu bilden, und in jedem doppelten Array von 64 Stellen der gegenwärtigen Synthese, werden ¼ (16 pro Array, 144 insgesamt) der Arraystellen mit dem 1-Dithioethyl-6-β-D-galactopyranosid/DMAP in trockenem Pyridin strukturiert. Diese Lösung wird akustisch auf das Substrat an den gewünschten Orten abgegeben. Trockene gesteuerte atmosphärische Bedingungen, nämlich eine trockene inerte Gasumgebung, werden ebenfalls für diese Oligosaccharidsynthese verwendet. Das passende auf jeder Stelle abgeschiedene Volumen wird durch Testabscheidung an einigen der Arraystellen bestimmt, wobei berücksichtigt wird, daß die synthetische Fläche vollständig in der synthetischen Stelle enthalten sein sollte, und zu viel toter Raum vorzugsweise vermieden wird. Es wurde beobachtet, daß ungefähr 10 bis 100 pL Tröfpchenvolumen passend sind, und 100 pL wird auf die Stellen aufgetragen, wenn das erste Monomer 1-Dithioethyl-6-β-D-galactopyranosid sein soll. Das Substrat ist wie beschrieben gesponnenes Polystyrenharz auf einer Polystyrenunterschicht (Tritylchlorid-Harz, 0,95 mmol/g aktiven Chlors ladend, Polymermatrix: Copolystyren-1% DVB) wird für 24 Stunden bei 60°C erwärmt. Das Harz wird abgefiltert und nachfolgend mit Methanol, Tetrahydrofuran, Dichlormethan und Diethylether (jeweils 10 mL) gewaschen, um zu bewirken, daß 1-Dithioethyl-6-β-D-galactopyranosid kovalent mit dem Tritylharz durch die Hydroxylgruppe in der 6. Position an den gewünschten Stellen verbunden ist.
  • Schritt D: Strukturieren zusätzlichen 1-Dithioethyl-6-pyranosids: Es ist offensichtlich, daß dieser Schritt durchgeführt werden kann mit anderen 1-Dithioethyl-6-pyranosiden, so wie es für eine Verbindung mit dem Substrat erforderlich ist. ¼ der Stellen jedes der doppelten Arrays wird mit einer Lösung befleckt zum Verbinden von 1-Dithioethyl-6-β-D-glucopyranosid in ungefähr dem gleichen Volumen wie in Schritt C abgeschieden, ¼ wird befleckt, um das 1-Dithioethyl-6-β-D-mannopyranosid zu ergeben, und das verbleibende ¼ wird befleckt, um das 1-Dithioethyl-6-β-D-allopyranosid zu ergeben.
  • Schritt E: Erzeugen des freien Thiols auf dem Substrat: Die Substratstellen aus Schritt C werden mit trockenem Tetrahydrofuran (THF) in dem Bereich von 1-Dithioethyl-6-pyranosidabscheidung befleckt (ungefähr 4 pL pro in Schritt C abgeschiedenem pL). Trockenes Methanol (ungefähr ¾ pL pro in Schritt C abgeschiedenem pL), Dithiothreitol (ungefähr 185 Picogramm) und Triethylamin (ungefähr ½ pL pro in Schritt C abgeschiedenem pL) wer den an gewünschten synthetischen Flächen der kombinatorischen Stellen durch akustische Abscheidung abgeschieden, und es wird den Stellen ermöglicht, unter den spezifizierten gesteuerten atmosphärischen Bedingungen für ungefähr 10 Minuten bis zu 1 Stunde bei Raumtemperatur zu reagieren. Das gesamte Substrat wird durch Eintauchen in ein passendes Volumen gewaschen, nachfolgend in Methanol, Tetrahydrofuran, Dichlormethan und Diethylether. Mikro-FTIR (der Substratabscheidungsstellen): 2.565 cm–1 (SH-Ausdehnung). Alternativ kann, wenn eine selektive Erzeugung des freien Thiols nicht erwünscht ist, das Substrat auf der gesamten Oberfläche wie folgt behandelt werden: 8 ml trockenes THF wird auf die Oberfläche des Substrats aufgetragen, das in einem flachen Behälter angeordnet ist, der gerade groß genug ist, um das Substrat zu enthalten, 1,2 ml trockenen Ethanols, 256 mg Dithiothreitol und 0,8 ml Triethylamin werden dem THF hinzugefügt, und der Behälter wird für ungefähr 10 Stunden bei Raumtemperatur unter den beschriebenen Bedingungen geschüttelt.
  • Schritt F: Michael-Addition: Das Substrat aus Schritt E wird wieder in dem flachen Container aus Schritt E angeordnet und in trockenem N,N-Dimethylformamid (4 mL) gequollen, und dann wird Cyclohept-2-en-1-on (280 μl, 252 μmol) hinzugefügt, und der Behälter wird bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 2 Stunden wird die Flüssigkeit entfernt und das Substrat wird aufeinanderfolgend mit Methanol, Tetrahydrofuran, Dichlormethan und Diethylether (jeweils 40 mL) gewaschen. Alternativ können, wenn eine selektive Michael-Addition erwünscht ist, die ausgewählten Stellen selektiv in dem Bereich der Synthese befleckt werden: N,N-Dimethylformamid (ungefähr 2,5 pL pro in Schritt C abgeschiedenem pL), Cyclohept-2-n-1-on (ungefähr 0,2 pL, 0,2 Picomol pro in Schritt C abgeschiedenem pL). Den selektiv befleckten Stellen wird es nun ermöglicht, unter den spezifizierten gesteuerten Atmosphärenbedingungen für ungefähr 10 Minuten bis zu 1 Stunde bei Raumtemperatur vor den spezifizierten Waschschritten zu reagieren.
  • Schritt G: Reduktive Aminierung mit Aminosäure: Das Substrat aus Schritt F wird wieder in dem flachen Behälter der vorangegangenen Schritte angeordnet und in Dichlormethan (4 mL) gequollen. Glycin-tert-butylesterhydrochlorid (150 mg, 1.788 μmol), Natriumsulfat (400 mg), Natriumtriacetoxyborhydrid (252 mg, 1188 μmol) und Essigsäure (40 μL) werden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre hinzugegeben, und der Container wird für 24 Stunden geschüttelt. Die Flüssigkeit wird entfernt, und das Substrat wird nachfolgend aufeinanderfolgend mit Wasser, Methanol, Tetrahydrofuran und Dichloromethan gewaschen.
  • Zusätzliche Monomere können hinzugefügt werden durch Wiederholung der vorangegangenen Schritte mit den erwünschten 1-Dithioethyl-6-pyranosiden. Es ist leicht offensichtlich, daß dieser Schritt mit 1-Dithioethyl-6-β-D-galactopyranosid/DMAP und dem anderen 1-Dithioethyl-6-pyranosid/DMAP ausgeführt werden kann, so wie es für die Verbindung mit dem Substrat erwünscht ist. Die erwünschten Stellen jedes der doppelten Arrays werden selektiv mit der passenden 1-Dithioethyl-6-pyranosid/DMAP-Lösung zur Bindung in ungefähr dem gleichen Volumen, wie es in Schritt C abgeschieden wurde, befleckt (1-Dithioethyl-6-β-D-mannopyranosid/DMAP, 1-Dithioethyl-6-β-D-allopyranosid/DMAP und 1-Dithioethyl-6-β-D-glucopyranosid/DMAP).
  • BEISPIEL 4
  • Kombinatorische Arrays von Legierungen können leicht hergestellt werden, wobei das Verfahren der Erfindung verwendet wird. Geschmolzene Metalle werden akustisch auf Arraystellen auf einem Substrat abgegeben. Für Metalle besteht keine Monomersequenz, jedoch kann die Zusammensetzung der Legierungen geändert werden durch Abscheidung von mehr eines gegebenen Metalls an einer bestimmten Stelle ohne die Probleme, die mit einer Polymerdehnung verbunden sind. Das Problem bei der Abscheidung von mehreren Metalltröpfchen des gleichen Volumens, um verschiedene Zusammensetzungen zu bilden, ist, daß die Arraydichte verringert werden muß, um die voluminöseste hergestellte Zusammensetzung aufzunehmen, da die Größe der Tröpfchen nicht einfach über weite Bereiche von Tröpfchenvolumen einstellbar ist. Ein zusätzlicher Grund, die Arraydichte bei der Legierungsbildung zu reduzieren, ist, daß es für Legierungen häufig wünschenswert ist, ein Material zu bilden, das einen Volumenkörper und eine Oberfläche aufweist, statt einen Film, der eine Oberfläche, jedoch keinen Volumenkörper aufweist, und die Eigenschaften der Dünnschicht"oberfläche" nicht die gleichen sind wie die der Oberfläche des Volumenmaterials (siehe im allgemeinen Somorjai, Surface Chemistry and Catalysis, siehe oben). So wie es leicht offensichtlich ist, besteht eine unendliche Anzahl von Zusammensetzungen irgendwelcher zweier Metalle. Eine Zusammensetzung im Sinne der kombinatorischen Synthese von Arrays von Legierungen durch akustische Abgabe eines Fluids wird kompliziert dadurch, daß die volumetrische akustische Abgabe von verschiedenen geschmolzenen Metallen mit unterschiedlichen Dichten und interatomaren Wechselwirkungen verschieden ist, aber die verschiedenen erzeugten stöchiometrischen Zusammensetzungen entsprechen verschiedenen Kombinationen von Metall und die Anzahlen von Tröpfchen, die abgeschieden wurden, sind reproduzierbar, z. B. eine Legierung aus 5 Tröpfchen von Sn, das bei einer Energie E1 abgegeben wurde, und 5 Tröpfchen von Cu, abgegeben bei E1 oder E2, haben die gleichen Zusammensetzungen, wenn sie unter den gleichen Bedingungen dupliziert werden, und die stöchiometrische Zusammensetzung von interessierenden Legierungen kann immer durch SIMS bestimmt werden. Um eine gleichförmige Legierungsbildung zu fördern, ist es wünschenswert, all die abzuscheidenden Tröpfchen geschmolzenen Metalls auf einer Stelle in schneller Abfolge aufzutragen statt zu warten, bis sich ein Tröpfchen verfestigt hat, bevor ein weiteres abgeschieden wird, obwohl solche kombinatorischen "Stapel" auch mögliches Interesse finden. Da es am bequemsten ist, die akustische Energie zwischen dem Abscheiden von Tröpfchen nicht zu ändern, wird die gleiche Energie am einfachsten zum Abgeben verschiedener Metalle verwendet, und die stöchiometrischen und anderen, einschließlich Oberflächen-, Eigenschaften des so erzeugten Materials können später bestimmt und durch exakte Duplizierung des synthetischen Prozesses reproduziert werden. Die geschmolzenen Metalle müssen bei einer passenden Temperatur (T) über ihrem Schmelzpunkt liegen, um sicherzustellen, daß das Tröpfchen noch geschmolzen ist, wenn es das Substrat erreicht. Zusätzlich zu einer inerten Gasumgebung, welche offensichtlich wichtig ist, wenn die Herstellung von Legierungen statt von Stapeln von oxidierten Metallsalzen erwünscht ist, um eine Oxidation der Metalle insbesondere an der Oberfläche der Tröpfchen zu verhindern, ist ein Gas mit geringer Wärmekapazität gegenüber Gasen mit hoher Wärmekapazität zu bevorzugen. Darüber hinaus kann die Temperatur des Substrats und der Abstand zwischen dem Substrat und dem Fluidmeniskus eingestellt werden, um sicherzustellen, daß geschmolzenes Material das Substrat erreicht und über eine ausreichende Zeit geschmolzen bleibt, um ein Legieren mit nachfolgend abgeschiedenen Tröpfchen zu ermöglichen. Darüber hinaus kann, nachdem eine gegebene Legierungszusammensetzung an einer gegebenen Arraystelle hergestellt ist, sowohl die Abgabeenergie als auch der Meniskus zu Substrat-Abstand eine Anpassung im Licht der zuvor genannten Betrachtungen erfordern, wie es so offensichtlich ist.
  • Ein zweckmäßiger systematischer kombinatorischer Ansatz umfaßt ein Auswählen einer Anzahl von geschmolzenen Zusammensetzungen zur Abgabe und eine Gesamtanzahl von Tröpfchen, die an jeder Stelle abgeschieden wurden. Eine Arraydichte von 105 Stellen/cm2 ist geeignet, da jede Stelle zweckmäßigerweise ein 100 μm Quadrat ist, eine Fläche, die leicht 10 in etwa ein Picoliter (pL) große Tröpfchen aufnehmen kann, da 10 pL gleichförmig über die Fläche der Stelle ausgebreitet nur 1 μm tief wären und die Schwerkraft eine solche vollständige Ausbreitung und einen geringen Oberflächenwinkel verhindert.
  • Für 4 verschiedene geschmolzene metallische Zusammensetzungen, die zur Abgabe verfügbar sind, und 10 Tröpfchen kann einfach gezeigt werden, daß 342 mögliche Zusammensetzungen bestehen, und ähnlich für 15 Tröpfchen 820 mögliche Zusammensetzungen bestehen im Sinne der Tröpfchenanzahl. Die Anzahl von Zusammensetzungen kann erhalten werden durch Berechnen der Anzahl von verschiedenen Zusammensetzungen eines, zweier, dreier, vier bis zu der Anzahl der geschmolzenen getrennt abgegebenen Metalle, und Addieren der Summe. Für d Tröpfchenzusammensetzungen mit m abgegebenen Metallen (obwohl der Behälterinhalt zur geschmolzenen Abgabe nicht ein reines Metall sein muß und selbst eine Legierung sein kann): dQm = n=1→mΣ(S(m)n)·(Z(m,d)n) dQm ist definiert als Anzahl der Metallkompositionen für d = Anzahl der Tröpfchen, m = Anzahl der verfügbaren abzugebenden geschmolzenen Zusammensetzungen, S(m)n ist die Anzahl einzigartiger Sätze mit n Elementen der m verfügbaren geschmolzenen Zusammensetzungen, Z(n,d)n ist # der d Tröpfchenkombinationen von n verwendeten der m zur Abscheidung verfügbaren, entsprechend S(m)n. Darüber hinaus: Z(m,d)n = i=1→C(n,d)ΣO(n,d)l CS(n,d)l bezeichnet den i-ten Satz von Koeffizienten für n Komponenten, die sich zu d Tröpfchen addieren, wobei C(n,d) die Gesamtzahl der Koeffizientensätze repräsentiert, welche dieses Erfordernis erfüllen, O(n,d)l ist die Anzahl möglicher Ordnungen des i-ten Satzes von n Koeffizienten für d Tröpfchen entsprechend CS(n,d)l.
  • Zum Beispiel wird angenommen, daß für d = 10, m = 4 die 4 Behälter Sn, In, Cd bzw. Zn enthalten.
  • 1 Metallzusammensetzungen (n = 1):
  • Z(4,10)1 = i=1→C(1,10)ΣO(1,10)i = 1·1, da der einzige mögliche Koeffizient 10 beträgt und es nur auf eine Weise geordnet werden kann. Das entsprechende S(4)1 beträgt 4, da 4 einzigartige Sätze von 1 Metall zur Abgabe gewählt werden können.
  • 2 Metallzusammensetzungen (n = 2):
  • Das entsprechende S(4)2 beträgt 6, da [4!/2!]12! einzigartige Sätze von 2 Metallen zur Abgabe gewählt werden können. Die C(2,10) einzigartigen Sätze von 2 nicht-negativen, von Null verschiedenen Koeffizienten, die sich zu 10 addieren, wie z. B. (9,1), und der entsprechende O(2,10)i sind [bezeichnet durch die Notation
    {CS(2,10)1:O(2,10)1, CS(2,10)2, 1:O(2,10)2 ... CS(2,10)C(n,d):O(2,10)C(n,d)}]:
    {(9,1):2, (8,2):2, (7,3):2, (6,4):2, (5,5):1}; ⇒
    Z(4,10)2 = j=1→C(2,10)ΣO(2,10)i = 2 + 2 + 2 + 2 + 1 = 9.
  • 3 Metallzusammensetzungen:
  • Das entsprechende S(4)3 beträgt 4 ([4!/1!]/3!, 4 einzigartige Sätze von 3 Metallen können zur Abgabe gewählt werden. Die C(3,10) einzigartigen Sätze von 3 nicht-negativen, von Null verschiedenen Koeffizienten, die sich zu 10 addieren, sind: {(8,1,1):3, (7,2,1):6, (6,3,1):6, (6,2,2):3, (5,4,1):6, (5,3,2):6, (4,4,2):3, (4,3,3):3}; ⇒
    Z(4,10)3 = i=1→C(3,10)ΣO(3,10)i= 3 + 6 + 6 + 3 + 6 + 6 + 3 + 3 = 36.
  • 4 Metallzusammensetzungen:
  • Das entsprechende S(4)4 beträgt 1 (4!/4!), da 1 einzigartiger Satz von 4 Metallen zur Abgabe ausgewählt werden kann. Die C(4,10) einzigartigen Sätze von 4 nicht-negativen, von Null verschiedenen Koeffizienten, die sich zu 10 addieren, sind: {(7,1,1,1):4, (6,2,1,1):12, (5,3,1,1):12, (5,2,2,1):12, (4,4,1,1):6, (4,3,2,1):24, (4,4,2,2):6, (3,3,3,1):4, (3,3,2,2):6}; ⇒
    Z(4,10)4 = i=14→C(4,10)ΣO(4,10)i = 4 + 12 + 12 + 12 + 6 + 24 + 6 + 4 + 6 = 86.
  • Aus dem vorangehenden:
    10Q4 = n=i→4Σ(S(4)n)·(Z(4,10)n) = 4·1 + 6·9 + 4·36 + 1·86 = 288.
  • Ein passendes Substrat für das Legierungsarray von akustisch abgeschiedenen geschmolzenen metallischen Zusammensetzungen ist aus gesintertem Aluminiumoxid durch herkömmliche Verfahren hergestellt oder ist kommerziell erhältlich. Ein Array aus Sn (Schmelzpunkt = 281,8°C), In (Schmelzpunkt = 156,6°C), Cd (Schmelzpunkt = 320,9°C) und Zn (Schmelzpunkt = 419,6°C) Komponenten (z. B. reine abgegebene geschmolzene Metallzusammensetzungen) wird durch akustische Abscheidung von 15 Tröpfchen/Arraystelle auf einem gesinterten Aluminiumoxidsubstrat gebildet. Die Dicke des Substrats beträgt ungefähr 0,25 cm, um der Hitze zu widerstehen. Die Stellendichte ist so gewählt, daß sie alle möglichen Tröpfchenzusammensetzungen ermöglicht, die aus vier Metallen mit 15 Tröpfchen hergestellt werden können, 820 mögliche Zusammensetzungen einschließlich z. B. (in Tröpfchen): 14(Sn), 1·(In), 12Sn, 1In, 1Cd, 1Zn, 1Sn, 12In, 1Cd, 1Zn. Diese Zusammensetzungen und die 901 verbleibenden Zusammensetzungen können wie oben für 10 Tröpfchenzusammensetzungen aus vier Komponenten erhalten werden. Die gewählte Dichte beträgt 1.000 Stellen/cm2, entsprechend einer nominalen Größe der Stellen von 333 × 333 μm, und ermöglicht die vollständige Sammlung von Zusammensetzungen auf einer 1 cm2 Fläche herzustellen. Doppelte Kopien des Arrays werden auf einem kommerziellen mikroskopobjektträgergroßen Streifen des Substrats hergestellt, die um ½ cm voneinander beabstandet sind, um die einfache Trennung der beiden identischen Arrays zu ermöglichen.
  • Die akustische Energie wird eingestellt, so daß ein mittleres Tröpfchenvolumen von ungefähr 1 pL erhalten wird, und eine 15 Tröpfchen Abgabe, die die quadratische 333 × 333 μm Fläche, die für die Stelle bereitgestellt wird, nicht übersteigt, unter den erwünschten Bedingungen einschließlich Atmosphärendruck und Zusammensetzung, Länge des Tröpfchenfluges, Substrattemperatur. Nachdem die mittlere Tröpfchengröße auf ungefähr 1 pL eingestellt ist, werden 15 Tröpfchen jedes Metalls akustisch auf eine Steile abgegeben, und die Abgabeenergie wird verringert, wenn irgendeine dieser reinen Stellen die Grenzen der Stelle überschreitet. Es bestehen genügend Stellen für alle 820 möglichen Zusammensetzungen, die auf jedes 1 cm quadratisches Array abgegeben werden sollen, nachdem bis zu 96 der verfügbaren 1.000 Stellen zur Kalibration verbraucht sind, aber die einzelnen so erzeugten abgegebenen Komponentenstellen können als die einzigen Zusammensetzungsstellen dienen, wenn der lokalisierte Bereich in dem die Legierung sitzt, in der Dimension ausreichend ähnlich den anderen Stellen ist, da Dimensionen ein Kühlen beeinflussen und eine wesentlich veränderte Geometrie nicht genau das gleiche Material ergäbe.
  • Obwohl die tatsächlich abgegebenen Volumen der verschiedenen geschmolzenen Komponenten durch Verwenden einer anderen akustischen Abgabeenergie so eingestellt werden können, daß sie gleich sind, ist eine schnellere Abgabe möglich, wenn die Abgabeenergie konstant gehalten wird. Es ist einfach offensichtlich, daß, wenn eine zu breite Abweichung zwischen den für jede Komponente abgegebenen Tröpfchenvolumen besteht, die Gesamtgeometrie der Kühlungszusammensetzung in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung breit variieren könnte, aber dies ist nicht der Fall für die hier abgeschiedenen Metalle, da sowohl ihre Dichten als auch ihre Faktoren, welche die interatomaren Wechselwirkungen in dem geschmolzenen Zustand bestimmen, wie z. B. die Polarisierbarkeit, ausreichend ähnlich sind. In allen Fällen sind die Bedingungen für die Bildung der Legierung an einer gegebenen Stelle immer reproduzierbar, und die tatsächliche Zusammensetzung oder andere physikalische Eigenschaften der Zusammensetzung können durch physikalische Verfahren einschließlich aller beschriebenen physikalischen Oberflächencharakterisierungsverfahren sichergestellt werden.
  • Aufgrund der Toxizität von Cd wird die akustische Abscheidung des geschmolzenen Metalls in einer getrennten atmosphärisch gesteuerten Kammer mit geringer Luftfeuchtigkeit unter Ar-Gas ausgeführt, um unerwünschte Reaktionen und Abkühlung zu reduzieren. Inerte Gase mit höherer Wärmekapazität und reaktivere Gase, wie z. B. O2 und O2/Kohlenwasserstoffe können für Experimente unter verschiedenen Bedingungen genutzt werden, sie können jedoch eine Einstellung des Abstands zwischen dem Fluidmeniskus und dem Substrat oder der Temperatur des geschmolzenen abzugegebenen Reagens oder beidem erfordern, um sicherzustellen, daß das Tröpfchen das Substrat in einem geschmolzenen Zustand erreicht.
  • Nach einer Kalibration wird das erste doppelte Array durch akustische Abgabe wie beschrieben auf ein Substrat, das bei einer Temperatur von 125°C gehalten wird, befleckt. Jede der 820 möglichen 15 Tröpfchen-Zusammensetzungen wird durch sequentielles Abscheiden von 15 Tröpfchen an jeder Stelle hergestellt, wobei die 15 Tröpfchen gemäß der oben beschriebenen verschiedenen Koeffizientenanordnungen abgeschieden werden. Die Metalle werden bei einer bekannten Temperatur gehalten, die ausreichend größer ist als der Schmelzpunkt des Metalls, so daß das abgegebene Tröpfchen die Substratoberfläche geschmolzen erreicht, einschließlich Flugdistanz und Druck, Temperatur und Wärmekapazität der Atmosphäre. Die Tröpfchen werden an jeder Stelle abgeschieden mit dem am niedrigsten schmelzenden Metall zuerst in der Reihenfolge zunehmender Schmelztemperatur, wobei das Metall mit der höchsten Schmelztemperatur zuletzt abgeschieden wird, z. B. In, Sn, Cd, Zn, so daß aufeinanderfolgende Tröpfchen eines Metalls mit höherer Schmelztemperatur das gesamte verfestigte Material schmelzen. Die Prozedur wird bei verschiedenen Substrat temperaturen in 5 Grad-Intervallen wiederholt, bis Arrays, die mit einer Substrattemperatur gebildet werden, die von 40°C bis 425°C reicht, gebildet werden.

Claims (29)

  1. Verfahren zum Bilden einer kombinatorischen Sammlung, welche aus einer Mehrzahl von chemischen Einheiten auf der Oberfläche eines Substrats gebildet ist, wobei jede chemische Einheit sich von jeder anderen chemischen Einheit unterscheidet, wobei das Verfahren das Einbringen fokussierter akustischer Energie in jeden aus einer Mehrzahl von Behältern, von denen jeder eine andere chemische Einheit in einem Fluid enthält, aufweist, wobei die fokussierte akustische Energie auf eine Weise eingebracht wird, welche bewirkt, daß ein Tröpfchen aus jedem Behälter hin zu einer Stelle auf der Oberfläche des Substrats abgegeben wird, so daß das Tröpfchen, welches die chemische Einheit enthält, daran anhaftet.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fokussierte akustische Energie auf jeden aus der Mehrzahl von Behältern angewandt wird, durch (a) akustisches Koppeln jedes Behälters nacheinander an einen Ejektor, der akustische Strahlung erzeugt, und (b) nach jedem akustischen Kopplungsschritt Aktivieren des Ejektors, um akustische Strahlung zu erzeugen, welche einen Brennpunkt ausreichend nahe der Fluidoberfläche hat, so daß ein Fluidtröpfchen aus dem Behälter hin zu einer Stelle auf der Substratoberfläche abgegeben wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jedes abgegebene Tröpfchen ein Volumen in dem Bereich von ungefähr 1 pL bis ungefähr 5 pL aufweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jedes der abgegebenen Tröpfchen ein Volumen von weniger als ungefähr 1 pL aufweist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jede chemische Einheit ein Molekül ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül ein Biomolekül ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül ein Nukleotid oder ein Oligonukleotid ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül peptidisch ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül ein Ligand ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Einheit eine Legierung ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Einheit ein kristallines Material ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Einheit ein amorphes Material ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bilden der kombinatorischen Sammlung aufweist: (a) akustisches Koppeln eines ersten Behälters, der eine erste chemische Einheit in einem ersten Fluid aufweist, an einen Ejektor, welcher akustische Strahlung erzeugt, (b) Aktivieren des Ejektors, um akustische Strahlung zu erzeugen, welche einen Brennpunkt ausreichend nahe der Oberfläche des ersten Fluids aufweist, so daß ein Tröpfchen davon hin zu einer ersten Stelle auf der Substratoberfläche ausgegeben wird, (c) akustisches Koppeln eines zweiten Behälters, welcher eine zweite chemische Einheit in einem zweiten Fluid aufweist, an den Ejektor, (d) Aktivieren des Ejektors wie in Schritt (b), so daß ein Tröpfchen des zweiten Fluids aus dem zweiten Behälter abgegeben wird hin zu einer zweiten Stelle auf der Substratoberfläche und (e) Wiederholen der Schritte (c) und (d) mit weiteren Behältern, von denen jeder eine chemische Einheit in einem Fluid enthält, bis ein Tröpfchen aus jedem Behälter abgegeben wurde, wobei die Schritte (b) und (d) zu einem Anhaften des Tröpfchens an der Oberfläche des Substrats führen.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der zeitliche Abstand zwischen den Aktivierungsschritten nicht länger ist als ungefähr 1 Sekunde.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der zeitliche Abstand zwischen den Aktivierungsschritten nicht länger als ungefähr 0,1 Sekunde ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der zeitliche Abstand zwischen den Aktivierungsschritten nicht länger als ungefähr 0,01 Sekunde ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der zeitliche Abstand zwischen den Aktivierungsschritten nicht länger als ungefähr 0,001 Sekunde ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste Stelle und die zweite Stelle gleich sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 13, darüber hinaus mit einem Modifizieren mindestens einer der anhaftenden chemischen Einheiten.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren durch Anlegen eines elektrischen Potentials an mindestens eine der anhaftenden chemischen Einheiten bewirkt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren durch Einwirken von Wärme auf mindestens eine der anhaftenden chemischen Einheiten bewirkt wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren durch Richten eines Photonen- oder Materiestrahls auf mindestens eine der anhaftenden chemischen Einheiten bewirkt wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Photonen- oder Materiestrahl ein Molekular-, Ionen-, Elektronen-, Röntgen-, Ultraviolett-, sichtbarer Licht- oder infraroter Strahl ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren durch Aussetzen mindestens einer der anhaftenden chemischen Einheiten mit einem chemischen Wirkstoff, der damit reagiert, bewirkt wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das abgegebene Fluid geschmolzen ist und das Verfahren darüber hinaus ein Steuern der Temperatur des Substrats aufweist, um die Abkühlrate der auf der Substratoberfläche abgeschiedenen Fluidtropfen zu steuern.
  26. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das abgegebene Fluid eine metallische Zusammensetzung ist, wobei die kombinatorische Sammlung eine Sammlung von Legierungen ist, welche unterschiedliche metallische Zusammensetzungen aufweisen.
  27. Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die kombinatorische Sammlung ein Array ist und jede anhaftende chemische Einheit ein Array-Element ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratoberfläche ein poröses Material aufweist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Material ein permeables Material ist.
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