DE60213063T2

DE60213063T2 - Hochdurchsatz- biomolekulare- kristallisation und screening von biomolekularen kristallen

Info

Publication number: DE60213063T2
Application number: DE60213063T
Authority: DE
Inventors: W. Mitchell Palo Alto MUTZ; N. Richard Palo Alto ELLSON; G. Richard Felton STEARNS
Original assignee: Picoliter Inc
Current assignee: Picoliter Inc
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2022-01-23
Also published as: DE60213063D1; EP1352112B1; US20030048341A1; WO2002066713A1; ATE332989T1; EP1352112A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft allgemein die Herstellung von Kristallen, insbesondere von Proteinkristallen, die geeignet sind für die Bestimmung der Struktur durch Röntgenstrahl-Kristallographie. Noch genauer betrifft die Erfindung die Optimierung der Herstellung von solchen Kristallen durch die Erstellung und Verwendung von kombinatorischen Anordnungen, die eingesetzt werden, um die Zusammensetzungen und die Umstände, die die Kristallisierung beeinflussen, schnell zu screenen. Noch spezieller betrifft die Erfindung die Verwendung von fokussierter akustischer Energie um Flüssigkeitströpfchen von Proteinlösungen, Liganden, kristallisationsfördernden Komponenten und dergleichen in Nanoliter- und Subnanolitergröße in einer musterförmigen, systematischen kombinatorischen Weise auszustoßen. Die Erfindung erlaubt außerdem die Kontrolle von Kristallisationsparametern, die nicht mit der Zusammensetzung zusammenhängen, einschließlich der Temperatur. Die eingesetzten kleinen Volumina sparen Protein, während die Kristallisation durch Verringerung der Diffusionszeiten beschleunigt wird. Solche Kleinvolumen-Kristallisationsexperimente können leicht auf einem Substrat als virtuelle Wells, die Tröpfchen umfassen, angeordnet werden, oder die Tröpfchen können in konventionellen Wells vorliegen.
HINTERGRUND
Die Entdeckung von neuartigen Materialien, die nützliche biologische, chemische und/oder physikalische Eigenschaften aufweisen, führt häufig zum Aufkommen von nützlichen Produkten und Technologien. In den vergangenen Jahren hat sich die Forschung umfassend auf die Entwicklung und Verwirklichung von neuen Verfahren und Systemen für die Evaluierung von potentiell nützlichen chemischen Verbindungen fokussiert. Im Bereich der Biomakromoleküle wurde beispielsweise ein Großteil der jüngsten Forschung von potentiellen Verfahren zur schnellen und akkuraten Identifizierung der Eigenschaften von verschiedenen Oligomeren von bestimmten Monomersequenzen, einschließlich Ligand- und Rezeptorinteraktionen, durch das Screenen von kombinatorischen Bibliotheken von Biopolymeren, einschließlich nukleotidischer, peptidischer und saccharidischer Polymere, gewidmet. Die Eigenschaften von solchen kombinatorischen Produkten bieten eine potentielle Verwendbarkeit für eine Vielzahl von Anwendungen. Biologische und nicht-biologische kombinatorische Bibliotheken können potentiell eingesetzt werden als supraleitende Materialien, dielektrische Materialien, magnetische Materialien (einschließlich Resonanzsonden), phosphoreszierende Materialien, fluoreszierende Materialien, Materialien zur radioaktiven Markierung, photolabile Materialien, thermolabile Komponenten, optische Materialien, thermoelektrische Materialien, Trennmaterialien (einschließlich mikroporöse Trennmaterialien, physikalisch-chemische Trennmaterialien und substratbindende Fähigkeiten) und dergleichen.
Für biologische Moleküle gilt, daß die Komplexität und Variabilität der biologischen Wechselwirkungen und der physikalischen Wechselwirkungen, die beispielsweise die Proteinkonformation oder die Proteinstruktur, die eine andere als die Primärstruktur ist, bestimmen, die Vorhersagbarkeit von biologischen, materiellen, physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften ausgehend von theoretischen Überlegungen zu diesem Zeitpunkt ausschließen. Für nicht-biologische Materialien, einschließlich Massen von Flüssigkeiten und Feststoffen, fehlt trotz vieler Untersuchungen und umfassender Verständnisfortschritte immer noch ein theoretischer Rahmen, der er erlaubt, hinreichend genau Zusammensetzung, Struktur und synthetische Herstellung von neuartigen Materialien de novo vorherzusagen.
Dementsprechend hängt die Entdeckung von neuartigen nützlichen Materialien weitgehend von der Kapazität ab, neue Zusammensetzungen von Materie herzustellen und zu charakteristisieren. Von den Elementen des Periodensystems, die verwendet werden können, um Verbindungen aus mehreren Elementen herzustellen, sind bisher relativ wenige der praktisch unerschöpflich möglichen Verbindungen hergestellt oder charakterisiert worden. Demzufolge besteht in der Technik ein allgemeiner Bedarf nach einer systematischeren, effizienteren und ökonomischeren Methode zur Herstellung neuartiger Materialien und für deren Screening auf nützliche Eigenschaften. Des weiteren besteht ein Bedarf nach einem flexiblen Verfahren, um Zusammensetzungen aus Materie aus verschiedenen Materialarten und Kombinationen von Materialarten herzustellen, einschließlich molekularer Materialien, kristalliner, kovalenter und ionischer Materialien, Legierungen und Kombinationen davon, wie z.B. Gemische aus Kristallinionisch und Legierung oder geschichtete Materialien aus Kristallinionisch und Legierung.
Das Immunsystem ist ein Beispiel für die systematische makromolekulare kombinatorische Chemie mit Proteinen und Nukleinsäuren, die in der Natur durchgeführt wird. Sowohl die humoralen als auch die zellvermittelten Immunsysteme produzieren Moleküle, die neuartige Funktionen aufweisen, indem umfangreiche Bibliotheken von Molekülen erzeugt werden, die systematisch nach einer gewünschten Eigenschaft gescreent werden. Zum Beispiel ist das humorale Immunsystem in der Lage, zu bestimmen, welches von 10¹² B-Lymphozytklonen, die verschiedene Antikörpermoleküle herstellen, an ein bestimmtes Epitop oder einen immunogenen Ort bindet, um die Klone zu finden, die verschiedene Epitope eines Immunogens spezifisch binden, und um deren Poliferation und Reifung in Plasmazellen, die diese Antikörper herstellen, zu stimulieren. Da die T-Zellen, die für die zellvermittelte Immunität verantwortlich sind, regulatorische Klassen von Zellen und Killer-T-Zellen umfassen, und die regulatorischen T-Zell-Klassen sowohl bei der Kontrolle der humoralen als auch der zellulären Antwort involviert sind, existieren mehr Klone von T-Zellen als von B-Zellen, und müssen auf eine geeignete Immunantwort gescreent und ausgewählt werden. Darüber hinaus ist die embryologische Entwicklung von sowohl T- als auch B-Zellen ein systematischer und wesentlicher kombinatorischer DNA-Splicingprozess für sowohl schwere als auch leichte Ketten. Siehe z.B. Therapeutic Immunology, Eds. Austen et al. (Blackwell Science, Cambridge MA, 1996).
Jüngst hat man sich die kombinatorische Stärke des Immunsystems nutzbar gemacht, um nach Antikörpern gegen kleine organische Moleküle, wie z.B. Haptene, zu selektionieren. Für einige dieser Antikörper konnte gezeigt werden, daß sie eine mit einer enzymatischen Aktivität verwandte katalytische Aktivität aufweisen mit kleinen organischen Molekülen als Substrat, und wurden als "Katalytische Antikörper" bezeichnet (Hsieh et al. (1993) Science 260(5106):337-9). Der postulierte Mechanismus der katalytischen Antikörper besteht in einer Verdrehung der molekularen Konformation des Substrats hin zum Übergangsstadium für die Reaktion und umfaßt außerdem eine elektrostatische Stabilisierung. Die Synthetisierung und das Screening von großen Bibliotheken von Molekülen wurde, nicht unerwartet, auch bei der Suche nach neuen Arzneistoffen eingesetzt. Von Proteinen ist bekannt, daß sie für ein gebundenes Molekül, wie z.B. ein Substrat oder ein Ligand, einen "induced fit" ausbilden (Stryer, Biochemistry, 4. Auflage (1999) W. H. Freeman & Co., New York), wobei das gebundene Molekül sehr ähnlich einer Hand, die in einen Handschuh paßt, in die Stelle paßt, was eine gewisse Basisstruktur für den Handschuh erfordert, die dann in die gebundene Struktur geformt wird mit Hilfe eines Substrats oder eines Liganden.
Geysen et al. (1987) J. Immun. Meth. 102:259–274 haben eine parallele kombinatorische Peptidsynthese auf Ruten oder Nadeln entwickelt, wobei die Enden von polymeren Ruten für die potentielle kovalente Anheftung einer ersten Aminosäure funktionalisiert werden und die Enden nacheinander in Lösungen von einzelnen Aminosäuren eingetaucht werden. Zusätzlich zu dem Verfahren nach Geysen et al. wurden jüngst Techniken für die Synthese von großen Anordnungen von verschiedenen Peptiden und anderen Polymeren auf Feststoffoberflächen eingeführt. Von Anordnungen kann leicht angenommen werden, daß sie außerdem effiziente Screeningwerkzeuge sind. Die Miniaturisierung von Anordnungen spart Synthesereagenzien und erhält die Probe, was eine nützliche Verbesserung sowohl im biologischen als auch im nicht-biologischen Kontext ist. Siehe z.B. US-Patente mit den Nummern 5,700,637 und 6,054,270 für Southern et al., die ein Verfahren beschreiben zum chemischen Synthetisieren einer hochdichten Anordnung von Oligonukleotiden von ausgewählter Länge an monomeren Einheiten in diskreten Zellen oder Bereichen eines Trägermaterials, wobei bei dem Verfahren ein Tintenstrahldrucker verwendet wird, um individuelle Monomere auf dem Träger abzuscheiden. Bisher waren solche miniaturisierten Anordnungen allerdings kostspielig herzustellen und beinhalten signifikante Mengen an ungewünschten Produkten an den Stellen, wo ein gewünschtes Produkt hergestellt wird. Daher stieß die Verwendung von hochdichten Biomakromolekül-Mikroanordnungen sogar im biologischen Bereich, wo eine gegebene Probe einzigartig und daher unbezahlbar sein kann, bei der akademischen Gemeinschaft auf Widerstand als zu kostspielig, als noch zu unzureichend vertrauenswürdig im Vergleich zu Anordnungen, die vom Laborpersonal hergestellt wurden.
Durch solche Verfahren können Anordnungen von tausenden oder sogar millionen von verschiedenen Zusammensetzungen der Elemente gebildet werden. Verschiedene Polymersyntheseverfahren, die aus der mikroelektronischen Festphasenherstellung abgeleitet wurden, wurden als "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis"- oder "VLSIPS"-Technologie bezeichnet. Solche Verfahren waren erfolgreich beim Screening von potentiellen Peptid- und Oligonukleotidliganden zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität von dem Liganden für Rezeptoren.
Die räumlich gerichteten Syntheseverfahren mit Festphasenparallelen, die gegenwärtig verwendet werden, um kombinatorische Biomolekülbibliotheken aufzubauen, erfordern stufenweise oder aufeinanderfolgend die Verbindung von Monomeren. Das US-Patent Nr. 5,143,854 für Pirrung et al. beschreibt die Synthese von Polypeptidanordnungen und das US-Patent Nr. 5,744,305 für Fodor et al. beschreibt ein analoges Verfahren zur Synthese von Oligo- und Polynukleotiden in situ auf einem Substrat, bei dem auf der Oberfläche des Substrats durch Licht entfernbare Gruppen kovalent gebunden werden. Ausgewählte Substratoberflächenbereiche werden Licht ausgesetzt, um sie zu aktivieren, wobei eine Maske verwendet wird. Dann wird eine Aminosäure oder ein Nukleotid-Monomer mit einer durch Licht entfernbaren Gruppe mit der aktivierten Region verbunden. Die Stufen der Aktivierung und der Verknüpfung werden wiederholt, um die Polynukleotide und Polypeptide der gewünschten Länge und Sequenz herzustellen. Andere Syntheseverfahren, die von den US-Patenten mit den Nummern 5,700,637 und 6,054,270 für Southern et al. veranschaulicht werden, lehren die Verwendung von Tintenstrahldruckern, und sind ebenfalls im wesentlichen Parallelsynthesen, weil das Synthesemuster vor Beginn des "Ausdrucks" des Musters vordefiniert werden muß. Diese Festphasen-Syntheseverfahren, die die aufeinanderfolgende Verknüpfung von Bausteinen (z.B. Aminosäuren) zur Ausbildung der interessierenden Verbindungen umfassen, können zur Herstellung von vielen anorganischen und organischen Verbindungen nicht einfach verwendet werden.
Das US-Patent Nr. 5,985,356 für Schultz et al. lehrt Verfahren der kombinatorischen Chemie auf dem Gebiet der Materialwissenschaften, die Methoden bereitstellen und eine Vorrichtung für die Synthese und Verwendung einer Anordnung diverser Materialien in vorbestimmten Bereichen eines Substrats. Eine Anordnung verschiedener Materialien auf einem Substrat wird hergestellt, indem man Komponenten verschiedener Materialzusammensetzungen in vorbestimmte Substratoberflächenbereiche liefert. Diese Synthesetechnik erlaubt es, viele Materialklassen durch systematische kombinatorische Verfahren herzustellen. Beispiele für die Materialarten umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, anorganische Materialien, einschließlich ionischer und kovalenter kristalliner Materialien, intermetallische Materialien, Metallegierungen und Kompositmaterialien, einschließlich Keramiken. Solche Materialien können wie die synthetisierte Anordnung nach nützlichen Massen- und Oberflächeneigenschaften gescreent werden, z.B. nach elektrischen Eigenschaften, einschließlich Supra- und Halb-Leitung, und nach thermischen, mechanischen, thermoelektrischen, optischen, optoelektronischen, fluoreszierenden und/oder biologischen Eigenschaften, einschließlich immunogene Aktivität.
Die Entdeckung und die Charakterisierung von Materialien erfordert häufig die kombinatorische Abscheidung auf Substraten von dünnen Filmen von exakt bekannter chemischer Zusammensetzung, Konzentration, Stöchiometrie, Bereich und/oder Dicke. Vorrichtungen und Verfahren zur Herstellung von Anordnungen aus verschiedenen Materialien, jedes mit abweichender Zusammensetzung, Konzentration, Stöchiometrie und Dünnschichtdicke an bestimmten Substratorten, die Synthese und Analyse auf der Basis einer systematischen kombinatorischen Anordnung ermöglichen, und die Dünnschichtabscheidungsverfahren anwenden, sind bereits bekannt. Obwohl die bestehenden Dünnschichtverfahren bei der exakten Zuführung von Reagens wirksam verwendet wurden, um so Anordnungen aus verschiedenen Materialien herzustellen, ist die bei diesen Synthesetechniken erforderliche Vorbestimmung unflexibel, und die Techniken sind langsam und daher relativ kostspielig. Außerdem ist es den Dünnschichttechniken zu eigen, daß sie weniger geeignet sind, um unter Bedingungen, die drastisch von den Bedingungen abweichen, die thermodynamisch umkehrbar oder nahezu umkehrbar sind, experimentelle Materialien zu erzeugen. Es besteht daher ein Bedarf nach einer effizienteren und schnelleren Zuführung von genauen Mengen an erforderlichem Reagens für die Herstellung einer Materialienanordnung mit mehr Flexibilität im Hinblick auf Vorbestimmung und Bedingungen der Ausbildung, als es durch Dünnschichtverfahren erreichbar ist.
Wie bereits zuvor bemerkt, beschreiben die US-Patente mit den Nummern 5,700,637 und 6,054,270 für Southern et al. für die kombinatorische Synthese von Biomakromolekülen ein Verfahren zur Erzeugung einer Anordnung von Oligonukleotiden von ausgewählter Länge an monomeren Einheiten innerhalb diskreter Zellen oder Bereiche auf einem Trägermaterial. Die für die Oligo- oder Polynukleotidsynthese allgemein beschriebene in-situ-Methode umfaßt: das Verknüpfen eines Nukleotidprekursors mit einem diskreten vorbestimmten Satz an Zellorten oder -bereichen, das Verknüpfen eines Nukleotidprekursors mit einem zweiten Satz an Zellorten oder -bereichen, das Verknüpfen eines Nukleotidprekursors mit einem dritten Satz an Zellorten oder -bereichen und das Fortsetzen der Abfolge der Verknüpfungsstufen bis die gewünschte Anordnung erzeugt worden ist. Die kovalente Verbindung wird in jedem Bereich entweder mit der Oberfläche des Trägers oder mit einem in einem vorherigen Schritt verknüpften Nukleotid bewirkt.
Die '637- und '270-Patente lehren ebenso, daß impermeable Substrate permeablen Substraten vorgezogen werden, wie z.B. Papier, um hohe Dichten an den kombinatorischen Stellen zu bewirken, da die benötigten Flüssigkeitsvolumina zu einer Wanderung oder zur Fortbewegung nach dem Dochtprinzip durch ein permeables Substrat führen werden, wodurch das Erreichen der kleinen Eigenschaftsgrößen, die für die hohen Dichten erforderlich sind, ausgeschlossen wird (wie z.B. diejenigen, die erreichbar sind durch parallele photolithographische Synthese, bei der ein Substrat erforderlich ist, das optisch glatt und im Allgemeinen auch impermeabel ist, siehe US-Patent Nr. 5,744,305 für Fodor et al.). Da die Tintenstrahldruckmethode eine Parallelsynthesetechnik ist, bei der es erforderlich ist, daß die Anordnung in ihrer Natur "vorbestimmt" ist, und die deswegen unflexibel ist, und da sie nicht Eigenschaftsstellen im Mikrometerbereich oder kleiner möglich macht, besteht weiterhin ein Bedarf in der Technik nach einem nicht-photolithographischen in-situ-Herstellungsverfahren für eine kombinatorische Anordnung, das die durch photolithographische Anordnungen erreichbaren hohen Dichten bereitstellt, eine Leistung, die kleine Volumina an Reagens erfordert und ein äußerst akkurates Abscheidungsverfahren, ohne die Unflexibilität eines höchst parallelen Prozesses, der eine vorbestimmte Stellensequenz erfordert. Da außerdem permeable Substrate einen größeren Oberflächenbereich für das örtliche Anordnen von Anordnungsbestandteilen bieten, ist ein Verfahren zur nicht-photolithographischen Bewirkung von kombinatorischen Hochdichte-Anordnungen durch die Zuführung von hinreichend kleinen Volumina, um die Verwendung von permeablen Substraten zu gestatten, auch ein Vorteil gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik der Anordnungsherstellung.
Wie oben bereits erklärt wurde ist die parallele photolithographische Ausbildung von biomolekularen Anordnungen von hoher Dichte in situ, z.B. von Oligonukleotid- oder Polynukleotidanordnungen ebenfalls im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise beschreiben die US-Patente mit den Nummern 5,744,305 und 5,445,934 für Fodor et al. Anordnungen von Oligonukleotiden und Polynukleotiden, die auf eine Oberfläche eines planaren nicht-porösen festen Trägers in einer Dichte, die jeweils 400 und 1000 verschiedene Oligonukleotide/cm² übersteigt, angeheftet. Die Anordnungen werden erzeugt unter Verwendung von lichtgeführten, räumlich ausrichtbaren Syntheseverfahren (siehe auch US-Patente mit den Nummern 5,143,854 und 5,405,783 und die Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/15070). Im Hinblick auf diese photolithographisch, parallel in situ synthetisierten Mikroanordnungen haben Fodor et al. photolabile Nukleosid- und Peptidschutzgruppen entwickelt sowie Maskierungs- und Automatisierungstechniken; siehe US-Patent Nr. 5,489,678 und Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/10092).
Die vorgenannten Patente offenbaren, daß die üblicherweise bei der Herstellung von Halbleitern angewandten photolitographischen Techniken bei der Herstellung von Anordnungen mit hoher Dichte eingesetzt werden können. Die photolitographische Synthese in situ ist am besten für die Parallelsynthese, was eine übermäßige Anzahl von Maskierungsstufen erfordert, um eine aufeinanderfolgende kombinatorische Anordnungssynthese in situ zu bewirken. Sogar die parallele kombinatorische Anordnungssynthese, bei der eine minimierte Anzahl von Maskierungsstufen eingesetzt wird, braucht eine signifikante Anzahl solcher Stufen, die sich mit jeder monomeren Einheit, die bei der Synthese zugegeben wird, erhöht. Des weiteren ist die parallele photolitographische Anordnungssynthese in situ unflexibel und erfordert eine vorbestimmte Maskensequenz.
Da die photolitographische Herstellung eine große Anzahl von Maskierungsstufen erfordert, wird die Ausbeute dieses Prozesses im Vergleich zu einer nicht-photolitographischen Synthese in situ verringert durch fehlerhaftes Blockieren und/oder unangemessenes Photo-Entblocken durch einige der photolabilen Schutzgruppen. Diese Probleme mit photolabilen Schutzgruppen führen zu dem praktischen Ausbeuteproblem bei in-situ-Synthesen mit vielen Stufen im allgemeinen durch das Hinzufügen von photochemischen Stufen zu dem Syntheseprozeß. Die Probleme sind durch die Fortschritte auf dem Gebiet der Herstellung und Verwendung solcher photolabilen Blocker für die in-situ-Synthese nicht angegangen worden, teilweise weil einige photolabile Blockierungsgruppen vom Licht abgeschirmt sind oder von dem Polymer, auf dem sie sich befinden „begraben" werden, ein Effekt, der sich mit der Erhöhung der Polymerlänge verschlimmert. Daher ist die Reinheit des gewünschten Produkts niedrig, da die Anordnung signifikante Verunreinigungen an ungewünschten Produkten enthalten wird, die sowohl die Empfindlichkeit als auch die Selektivität reduzieren können.
Da der photolitographische Prozeß bei der in situ-Synthese die Kanten der Stellen mit den Linien der Maske definiert, können sich Maskenunvollkommenheiten und -fehlausrichtung, Beugungseffekte und Störungen der optischen Glätte des Substrats so kombinieren, daß sie die Reinheit verringern, indem sie als Verunreinigungen Polymere erzeugen, die in Sequenz und/oder Struktur mit dem gewünschten Polymer ähnlich sind, ein Problem, das zu den Kanten der Stellen hin immer ausgeprägter wird. Dies wird verschlimmert, wenn mit photolitographischen Protokollen versucht wird, die Stellendichte zu maximieren, indem Anordnungen erzeugt werden, die aneinander angrenzende Stellen aufweisen. Da die Wahrscheinlichkeit einer Maskenunvollkommenheit oder einer -fehlausrichtung sich mit der Anzahl der Maskierungsstufen und der damit verbundenen An zahl der Masken erhöht, werden diese Kanteneffekte verschlimmert durch eine erhöhte Anzahl von Maskierungsstufen und durch die Verwendung von mehr Maskenmustern, um eine bestimmte Anordnung herzustellen. Eine Stellenverunreinigung, d.h., die Erzeugung eines Polymers, das in Sequenz und/oder Struktur mit dem gewünschten Polymer ähnlich ist, führt zu einer verringerten Empfindlichkeit und Selektivität für Anordnungen, die konstruiert wurden, um eine Nukleotidsequenz zu analysieren.
Es wurden einige Bemühungen darauf gerichtet, Drucktechniken, insbesondere Tintenstrahldrucktechniken anzupassen, um damit biomolekulare Anordnungen auszubilden. Beispielsweise betrifft das US-Patent Nr. 6,015,880 für Baldeschwieler et al. die Herstellung einer Anordnung unter Verwendung einer in-situ-Synthese mit vielen Stufen. Ein flüssiger Mikrotropfen, der ein erstes Reagens enthält, wird durch eine einzelne Düse eines Reagensverteilers mit vielen Düsen an einem Ort auf der Oberfläche aufgebracht, der chemisch so präpariert ist, daß die kovalente Anheftung des Reagens ermöglicht wird. Der Reagensverteiler wird dann relativ zu der Oberfläche verschoben oder die Oberfläche wird in Bezug auf den Verteiler verschoben, und wenigstens ein Mikrotropfen, der entweder das erste Reagens oder ein zweites Reagens aus einer anderen Verteilerdüse enthält, wird auf einen zweiten Substratort aufgebracht, der ebenfalls chemisch aktiviert ist, um reaktionsbereit für die kovalente Anheftung des zweiten Reagens zu sein. Wahlweise wird die zweite Stufe unter Verwendung entweder des ersten oder des zweiten Reagens oder von verschiedenen flüssigkeitsgetragenen Reagenzien aus verschiedenen Verteilerdüsen wiederholt, wobei jedes Reagens sich kovalent mit der Substratoberfläche verbindet. Das Patent offenbart, daß die Tintenstrahltechnologie verwendet werden kann, um die Mikrotropfen aufzubringen.
Allerdings leidet die gewöhnliche Tintenstrahltechnologie unter einer Anzahl von Nachteilen. Häufig bringt die Tintenstrahltechnologie die Erwärmung oder die Verwendung eines piezoelektrischen Elements mit sich, um eine Flüssigkeit durch eine Düse zu forcieren, um die ausgestoßene Flüssigkeit auf eine Oberfläche zu leiten. Daher kann die Flüssigkeit einer Oberfläche, die 200°C übersteigt, ausgesetzt sein, bevor sie ausgestoßen wird, und die meisten, wenn nicht alle, peptidischen Moleküle, einschließlich Proteine, degradieren unter solchen extremen Temperaturen. Darüber hinaus führt das Forcieren von peptidischen Molekülen durch Düsen zu Scherkräften, die die molekulare Struktur verändern können. Düsen neigen zum Verstopfen, insbesondere, wenn sie verwendet werden, um eine Flüssigkeit auszustoßen, die ein Makromolekül enthält, und die Anwendung von erhöhten Temperaturen verschlimmert dieses Problem, da Flüssigkeitsverdampfung zu einer Abscheidung von präzipitierten Feststoffen auf den Düsen führt. Verstopfte Düsen wiederum können zu fehlgerichteter Flüssigkeit führen oder zum Ausstoß von Tropfen von ungenauer Größe. Schließlich kann die gewöhnliche Tintenstrahltechnologie, bei der eine Düse für den Flüssigkeitsausstoß verwendet wird, im allgemeinen nicht verwendet werden, um Anordnungen mit Merkmalsdichten abzuscheiden, die vergleichbar mit denen sind, die unter Verwendung der Photolitographie oder anderer Techniken, die üblicherweise bei der Halbleiterverarbeitung verwendet werden, erreicht werden.
Eine Anzahl von Patenten haben die Verwendung von akustischer Energie beim Drucken beschrieben. Beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 4,308,547 für Lovelady et al. einen Flüssigkeitstropfen-Emitter, der akustische Prinzipien anwendet beim Ausstoß von Tropfen aus einem Flüssigkeitskörper auf ein sich bewegendes Dokument, um darauf Buchstaben oder Strichcodes auszubilden. Es wird ein düsenloser Tintenstrahldruckapparat verwendet, wobei kontrollierte Tintentropfen durch eine akustische Kraft, die durch einen gebogenen Wandler bei oder unter der Oberfläche der Tinte erzeugt wird, vorwärts getrieben werden. Im Gegensatz zu Tintenstrahldruckvorrichtungen neigen düsenlose Flüssigkeitsausstoßvorrichtungen, die in dem vorgenannten Patent beschrieben werden, nicht zum Verstopfen und zu den damit verbundenen Nachteilen, z.B. fehlgeleitete Flüssigkeit oder Tropfen ungenauer Größe.
Die Anwendbarkeit des düsenlosen Flüssigkeitsausstoßes wurde für Tintendruckanwendungen allgemein angenommen. Die Entwicklung von Tintendruckanwendungen wird primär angetrieben von den Kosten sowie von dem Bedarf, geeigneten Text schnell zu drucken. Für das akustische Drucken wurden daher die Entwicklungsbemühungen darauf fokussiert, eher die Druckkosten zu senken als die Qualität zu verbessern, und eher die Druckgeschwindigkeit zu erhöhen als die Genauigkeit. Beispielsweise zielt das US-Patent Nr. 5,087,931 für Rawson auf ein System zum Transport von Tinte unter konstantem Fluß zu einem akustischen Tintendrucker, der eine Vielzahl von Ausstoßvorrichtungen aufweist, die entlang einer Achse auf einer Linie angeordnet sind, wobei jede Ausstoßvorrichtung mit einer freien Oberfläche flüssiger Tinte verbunden ist. Wenn eine Mehrzahl von Ausstoßvorrichtungen verwendet wird anstelle einer einzelnen Ausstoßvorrichtung, wird im allgemeinen die Druckgeschwindigkeit erhöht, allerdings wird die Kontrolle des Flüssigkeitsausstoßes, insbesondere die Platzierung der Tropfen schwieriger.
Das US-Patent Nr. 4,797,693 für Quate beschreibt einen akustischen Tintendrucker zum Drucken von polychromatischen Bildern auf einem Aufzeichnungsmedium. Der Drucker wird so beschrieben, daß er eine Kombination eines Trägers umfaßt, der eine Mehrzahl von verschiedentlich gefärbten Tintenflüssigkeiten enthält, einen einzelnen akustischen Druckkopf, der mit dem Träger akustisch gekoppelt ist, um konvergierende akustische Wellen in den Träger auszusenden, ein Tintentransportmittel, um den Träger zu positionieren, um aufeinanderfolgend die verschiedentlich gefärbten Tinten mit dem Druckkopf auszurichten, und eine Kontrollvorrichtung, um den Strahlungsdruck, der verwendet wird, um Tintentröpfchen auszustoßen, zu modulieren. Es wird beschrieben, daß dieser Drucker für die Realisierung der Kosteneinsparung entworfen wurde. Da zwei Tropfen einer Primärfarbe, z.B. cyan und gelb, die in hinreichender Nähe abgeschieden werden, als eine zusammengesetzte oder Sekundärfarbe erscheinen werden, ist das erforderliche Niveau an Genauigkeit relativ gering und ungeeignet für die Ausbildung von biomolekularen Anordnungen. Ein solcher Drucker ist insbesondere ungeeignet für die in-situ-Synthese, die eine präzise Tropfenabscheidung erfordert und eine konsistente Platzierung, damit die richtige chemische Reaktion erfolgt. D.h., die Tropfenplatzierungsgenauigkeit, die erforderlich ist, um den Erhalt einer zusammengesetzten Sekundärfarbe zu bewirken, ist viel geringer als die, die erforderlich ist für die chemische Synthese auf photolitographischen Dichtenniveaus. Demzufolge ist eine akustische Druckvorrichtung, die zum Drucken von visuell erfaßbarem Material geeignet ist, ungeeignet für die Herstellung von Mikroanordnungen. Außerdem kann diese Vorrichtung lediglich eine begrenzte Menge an Tinte aus dem Träger ausstoßen, bevor der Flüssigkeitsmeniskus sich aus dem akustischen Fokus bewegt und der Tropfenausstoß aufhört. Dies ist eine signifikante Einschränkung für biologische Flüssigkeiten, die typischerweise weit teurer und seltener als Tinte sind. Das Patent für Quate et al. zielt nicht darauf, wie man die meiste Flüssigkeit in einem geschlossenen Reservoir verwenden kann, ohne zusätzliche Flüssigkeit aus einer externen Quelle zuzugeben.
WO 00/78445 beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Mikrokristallisierungen von Anordnungen, um geeignete Kristallisierungsbedingungen für ein Molekül zu bestimmen, wobei das Verfahren die Ausbildung einer Anordnung von Mikrokristallisierungen umfaßt, wobei jede Mikrokristallisierung einen Tropfen umfaßt, der eine Mutter-Liquor-Lösung umfaßt, deren Zusammensetzung innerhalb der Anordnung variiert, und ein zu kristallisierendes Molekül, wobei der Tropfen ein Volumen von weniger als 1 μl aufweist, und wobei man die Anordnung von Mikrokristallisierungen unter Bedingungen lagert, die dafür geeignet sind, daß sich in den Tropfen in der Anordnung Molekülkristalle ausbilden, und wobei die Molekülkristallausbildung in den Tropfen erfaßt wird.
Es besteht daher ein allgemeiner Bedarf auf dem Gebiet der Herstellung von kombinatorischen Anordnungen nach verbesserten räumlich steuerbaren Flüssigkeitsausstoßverfahren, die eine hinreichende Tropfenausstoßgenauigkeit aufweisen, um das Erreichen von hochdichten Anordnungen von kombinatorischen Materialien, die aus verschiedenen Gruppen von Ausgangsmaterialien hergestellt wurden, zu erlauben. Wie hierin beschrieben wird, können insbesondere akustische Flüssigkeitsausstoßvorrichtungen eine verbesserte räumliche Führung des Flüssigkeitsausstoßes bewirken, ohne die Nachteile des Mangels an Flexibilität und Gleichförmigkeit, die mit photolitographischen Techniken oder Tintenstrahldruckvorrichtungen, die den Tropfenausstoß durch eine Düse bewirken, einhergehen.
Einer der Vorteile des düsenlosen akustischen Ausstoßes ist die Möglichkeit, die Scherkräfte in der Flüssigkeit zu verringern, während eine bessere Kontrolle über das Tropfenvolumen und ein kleineres Minimalvolumen erreicht wird. Diese Vorteile gelten auch im Vergleich zu der herkömmlichen Mikrofluidkanalhandhabung von Flüssigkeiten. Die Verringerung der Scherkräfte ist ein wichtiger Vorteil bei der Handhabung von Makromolekül-Soluten in einer Flüssigkeit und insbesondere bei labilen und komplexen Biomakromolekülen mit komplexer Konformation, wie z.B. Proteine und Nukleinsäuren, die eine Struktur höherer Ordnung als die Primärstruktur aufweisen.
Kristallographische Überlegungen und Anwendungen: Das Verständnis der dreidimensionalen Struktur von Proteinen ist entscheidend für das Verständnis des Mechanismus der Proteinbindung mit anderen Proteinen oder anderen Liganden, einschließlich kleiner Moleküle, Polynukleotide, Oligonukleotide und anderer Komponenten von Interesse. Es besteht daher ein großer Bedarf nach einer schnellen, hoch auflösenden Proteinstrukturbestimmung durch Röntgenkristallographie. Die Fortschritte bei den Computerfähigkeiten zusammen mit der Verfügbarkeit von hochintensiven Röntgenstrahlquellen (wie z.B. Synchrotrone) und Ladungskopplungsspeicher-(CCD)-Detektoren haben die Zeit, die erforderlich ist, um eine Kristallstruktur zu erhalten, drastisch reduziert. Die Syn chrotronstrahlung und die CCD-Detektoren erlauben auch, daß kleinere Kristalle für kristallographische Experimente verwendet werden als die, die bei anderen Verfahren erforderlich sind. Ein signifikantes Hindernis bei der Proteinstrukturbestimmung ist die Unfähigkeit, schnell nach Proteinkristallisationsverfahren zu screenen, die zu der schnellen Herstellung von Proteinkristallen hoher Qualität führen könnten.
Die Bedingungen, unter denen sich Proteinkristalle von hoher Qualität (d.h. solche, die für hochauflösende Einzelkristall-Röntgenkristallographie geeignet sind) ausbilden, sind weitgehend nicht vorhersagbar. Demzufolge sollten kombinatorische Methoden, die viele Kombinationen von Kristallisationsparametern parallel screenen, bei der Bestimmung der optimalen Kristallisationsparameter für die Herstellung von Proteinkristallen hoher Qualität nützlich sein. Die Parameter für die Kristallisationsversuche schließen ein Temperatur, pH, Ionenstärke, Molekulargewicht, Konzentrationen von verschiedenen Lösungsmitteln, Prozent an organischen Komponenten, wie z.B. Dimethylsulfoxid, Proteinkonzentration und Konzentrationen von Makromolekülen und kleine Komponenten wie Co-Kristall-Komponenten. Ausgehend von einem solch großen Satz an Parametern ist es nicht praktikabel, jede mögliche Abwandlung durch konventionell angewandte Verfahren schnell zu screenen. Darüber hinaus sind, auch wenn rekombinante Technologien für die Proteinexpression verwendet werden, die Vorräte an reinen Proteinen für die Kristallisation üblicherweise begrenzt, was die Anzahl an Kombinationen, die getestet werden können, beschränkt und die Chancen einer erfolgreichen Kristallisation verringert. Es besteht daher ein signifikanter Bedarf nach kombinatorischen Verfahren für Versuche zur Bestimmung der optimalen Bedingungen für die Proteinkristallisation, um die Schnelligkeit des Screenings zu erhöhen und die Menge an erforderlichem Protein für ein solches Experiment zu verringern.
Ein weiteres Problem bei der Hochdurchsatz-Kristallisation ist das Erfassen von in der Entstehung begriffenen Proteinkristallen. Die Beobachtung von Kristallen in einer Lösung garantiert nicht das Vorliegen von Proteinkristallen, die für die hochauflösende Röntgenstrahlkristallographie geeignet sind. Anstelle des gewünschten Proteins können Salze in der Pufferlösung kristallisieren. Die gegenwärtigen optischen Untersuchungsmethoden sind gewöhnlich nicht in der Lage, zwischen Pufferkristallen und Proteinkristallen zu unterscheiden, da die Größen und Morphologien dieser Kristalle sich überschneiden. Die Unterscheidung von Pufferkristallen von Proteinkristallen erfordert häufig das Justieren von Kristallen in einem Diffraktometer, eine ineffiziente Methode des Screenings, die es erfordert, die Kristalle aus den Wells zu entfernen und manuell zu justieren. Dieses Handling der Kristalle erhöht die Wahrscheinlichkeit des Brechens, Schmelzens oder der Beschädigung der Kristalle in anderer Weise vor der Akquisition der Daten.
Es besteht daher ein Bedarf nach Kristallisationsexperimenten mit kleinem Volumen, um interessierende Komponenten für die Kristallisation einzusparen, insbesondere Biomakromoleküle, und um mehr Experimente für eine gegebene Menge an Probe zu ermöglichen. Es besteht ein weiterer Bedarf nach der Beschleunigung der erfolgreichen Herstellung von Kristallen hoher Qualität. Darüber hinaus besteht ein Bedarf nach einer Bestimmung, ob die Kristalle der gewünschten Komponente sich kristallisiert haben, insbesondere im Zusammenhang mit der Biomakromolekülkristalli sation, ob sich Kristalle der Biomakromoleküle oder der Nicht-Biomakromoleküle ausgebildet haben. Schließlich besteht ein Bedarf nach der Bestimmung in situ, ob die Kristalle von hinreichender Qualität für die hochauflösende Röntgenstrahl-Kristallographie sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es eine Absicht der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Erfassung von Kristallisationsereignissen und zur Analyse der Charakteristika eines ausgebildeten Kristalls bereitzustellen, wobei sehr kleine Volumina an Reagentien und Materialien verwendet werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, zum Erzeugen einer Flüssigkeitsmenge, die eine interessierende Komponente für die Kristallisation enthält und deren Zusammensetzung bekannt ist, welches die Verwendung von fokussierter akustischer Strahlung zum Abscheiden eines oder mehrerer ein Reagens enthaltender Flüssigkeitströpfchen an einer Stelle auf einer Substratoberfläche umfaßt, wobei wenigstens eines der ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen, die an der Stelle abgeschieden wurden, die interessierende Komponente für die Kristallisation enthält und wenigstens eines der ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen ein Mittel, das die Wahrscheinlichkeit der Kristallbildung erhöht, enthält.
Eine bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist eine fokussierte akustische Ausstoßvorrichtung, wie sie in den US-Patentanmeldungen mit dem Aktenzeichen 09/669,996 und 09/964,212 („Acoustic Ejection of Fluids from a Plurality of Reservoirs") mit den Erfindern Ellson, Foote und Mutz, eingereicht jeweils am 25. September 2000 und 25. September 2001 und übertragen auf Picoliter, Inc. (Mountain View, California) beschrieben wird. Wie in den vorgenannten Patentanmeldungen beschrieben, ermöglicht die Vorrichtung den akustischen Ausstoß von einer Mehrzahl von Flüssigkeitströpfchen in Richtung der designierten Stellen auf einer Substratoberfläche zur Abscheidung darauf und umfaßt: Eine Mehrzahl von Reservoirs, jedes angepaßt, um eine Flüssigkeit zu enthalten, eine akustische Ausstoßvorrichtung, die einen Generator für akustische Strahlung einschließt und ein Fokussierungsmittel zur Fokussierung der erzeugten akustischen Strahlung in einem Fokus in hinreichender Nähe der Flüssigkeitsoberfläche in jedem der Reservoirs, so daß daraus Tröpfchen ausgestoßen werden, und Mittel zur Positionierung der Ausstoßvorrichtung in einer akustisch gekoppelten Beziehung zu jedem der Reservoirs. Vorzugsweise ist jedes der Reservoirs entfernbar, umfaßt einen individuellen Well in einer Well-Platte und/oder ist in einer Anordnung angeordnet. Die Reservoirs sind auch vorzugsweise im wesentlichen akustisch nicht voneinander unterscheidbar, weisen eine geeignete akustische Impedanz und Dämpfung auf, um das energetisch effiziente Fokussieren von akustischer Energie in der Nähe der Oberfläche einer enthaltenen Flüssigkeit zu ermöglichen, und sind in der Lage, den Bedingungen des flüssigkeitsenthaltenden Reagens zu widerstehen.
Gemäß einem verwandten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Erfassen von ausgebildeten Kristallen im Anschluß an das oben beschriebene Verfahren. Das Verfahren schließt ein, wie oben, das Erzeugen einer kleinen Flüssigkeitsmenge, die eine interessierende Komponente für die Kristallisation enthält und deren Zusammensetzung bekannt ist, wobei es um faßt (a) die Abscheidung von einem oder mehreren Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen an einer Stelle auf einer Substratoberfläche durch fokussierten Energieausstoß, wobei wenigstens eines der Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen, die an der Stelle abgeschieden werden, die interessierende Komponente für die Kristallisation enthält, und (b) das Erfassen des Vorliegens und der Quantität an kristallinem Material, das sich aus der interessierenden Komponente in der kleinen Flüssigkeitsmenge an der Stelle zusammensetzt. Vorzugweise, jedoch nicht notwendigerweise, wird die Stufe (b) des Verfahrens akustisch durchgeführt, wie hier noch ausführlicher beschrieben werden wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein System bereitgestellt zur Durchführung von kombinatorischen Experimenten, um eine interessierende Komponente zu kristallisieren und die Kristallisation davon zu erfassen. Das System schließt ein: ein Substrat, das eine Mehrzahl von diskreten Stellen aufweist, eine Mehrzahl von Reservoirs, von denen jedes so ausgestaltet ist, daß es eine ein Reagens enthaltende Flüssigkeit enthält, eine Ausstoßvorrichtung, die einen Generator für akustische Strahlung zum Erzeugen akustischer Strahlung und eine Fokussiervorrichtung zum Fokussieren der akustischen Strahlung an einem Fokus in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche in jedem der Reservoirs umfaßt, Mittel zum Positionieren der Ausstoßvorrichtung in einer akustisch gekoppelten Beziehung zu jedem der Reservoirs und Mittel zum Erfassen der Kristallisation der interessierenden Komponente, wobei eines oder mehrere der auf dem Substrat angeordneten Materialien durch akustischen Ausstoß mit einer oder mehreren ein Reagens enthaltenden Flüssigkeiten in Kontakt gebracht wird/werden und wobei jegliche physikalische oder chemische Veränderung, die nach diesem Inkontaktbringen an einer Stelle erfaßt wird, ein Screening-Ergebnis für das Material darstellt, das an der Stelle vorhanden ist, die mit der einen oder den mehreren ein Reagens enthaltenden Flüssigkeit(en) in Kontakt gebracht wurde. Vorzugsweise wendet die Erfassungsvorrichtung die akustische Erfassung an. Außerdem ist es bevorzugt, daß die Vorrichtung Mittel zur Absicherung der Qualität von jeglichen gebildeten Kristallen einschließt, vorzugsweise ein Mittel, das Röntgenstrahl-Beugung, -Scanning, -Diffraktometrie oder Lichtstreuung einschließt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung hochdichte Anordnungen von kleinen Flüssigkeitsmengen bereit, die eine bekannte Zusammensetzung aufweisen und eine interessierende Komponente für die Kristallisation enthalten, typischerweise, allerdings nicht notwendigerweise, ein Biomolekül, wobei jedes Volumen innerhalb einer diskreten Stelle auf einer in eine Mehrzahl von diskreten Stellen unterteilten Substratoberfläche enthalten ist, wobei jede Stelle nicht mehr als eine einzelne Flüssigkeitsmenge enthält. Die vorliegende Methodik des fokussierten akustischen Ausstoßes ermöglicht die Erstellung von Anordnungen, die wenigstens 100, vorzugsweise wenigstens etwa 1.000, noch bevorzugter wenigstens etwa 62.500, noch bevorzugter wenigstens etwa 250.000, noch bevorzugter wenigstens etwa 1.000.000 und noch bevorzugter wenigstens etwa 1.500.000 Elemente pro Quadratzentimeter an Substratoberfläche umfassen. Diese Anordnungen weisen keine Kanteneffekte auf, die aus optischen und Ausrichtungseffekten der photolitographischen Maskierung hervorgehen, und sie unterliegen auch nicht einer nicht perfekten Ausrichtung der Spots durch die durch Tintenstrahldüsen geleitete Abscheidung von Reagenzien.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A und 1B, auf die gemeinsam als 1 Bezug genommen wird, zeigen in einer vereinfachten Querschnittsansicht schematisch eine Ausführungsform einer Vorrichtung, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, wobei die Vorrichtung erste und zweite Reservoirs umfaßt, eine akustische Ausstoßvorrichtung und ein Mittel zum Positionieren der Ausstoßvorrichtung. 1A zeigt die akustische Ausstoßvorrichtung akustisch gekoppelt mit dem ersten Reservoir, die aktiviert wurde, um einen Flüssigkeitstropfen auszustoßen aus dem Inneren des ersten Reservoirs in Richtung einer designierten Stelle auf einer Substratoberfläche. 1B zeigt die akustische Ausstoßvorrichtung akustisch gekoppelt mit einem zweiten Reservoir.
Die 2A, 2B und 2C, auf die gemeinsam als 2 Bezug genommen wird, zeigen in einer schematischen Ansicht eine Variation der in 1 gezeigten Vorrichtung, wobei die Reservoirs individuelle Wells in einer Reservoir-Well-Platte umfassen, und das Substrat eine kleinere Well-Platte mit einer korrespondierenden Anzahl von Wells umfaßt. 2A ist eine schematische Ansicht des Grundrisses der zwei Well-Platten von oben, d.h. der Reservoir-Platte und der Substrat-Well-Platte. 2B stellt in Querschnittsansicht eine Vorrichtung dar, die die Reservoir-Well-Platte von 2A akustisch gekoppelt mit einer akustischen Ausstoßvorrichtung umfaßt, wobei ein Tröpfchen aus einem ersten Well der Reservoir-Well-Platte in einen ersten Well der Substrat-Well-Platte ausgestoßen wird. 2C zeigt in Querschnittsansicht die Vorrichtung, die in 2B dargestellt ist, wobei die akustische Ausstoßvorrichtung akustisch mit einem zweiten Well der Reservoir-Well-Platte gekoppelt ist und wobei des weiteren die Vorrichtung verschoben ist, um zu ermöglichen, daß die akustische Ausstoßvorrichtung ein Tröpfchen aus dem zweiten Well der Reservoir-Well-Platte in einen zweiten Well der Substrat-Well-Platte ausstößt.
Die 3A, 3B, 3C und 3D, auf die gemeinsam als 3 Bezug genommen wird, stellen in einer vereinfachten Querschnittsansicht schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, bei der unter Verwendung der Vorrichtung aus 1 auf einem Substrat in situ ein Dimer synthetisiert wird. 3A stellt den Ausstoß eines Tröpfchens an Oberflächenmodifikationsflüssigkeit auf eine designierte Stelle einer Substratoberfläche dar. 3B stellt den Ausstoß eines Tröpfchens einer ersten Flüssigkeit dar, die eine erste molekulare Komponente enthält, die für die Anheftung an die modifizierte Oberfläche des Substrats ausgestaltet ist. 3C stellt den Ausstoß eines Tröpfchens einer zweiten Flüssigkeit dar, die eine zweite molekulare Komponente enthält, die für die Anheftung an das erste Molekül ausgestaltet ist. 3D stellt das Substrat und das durch das in den 3A, 3B und 3C dargestellte Verfahren in situ synthetisierte Dimer dar.
4A, 4B und 4C, auf die gemeinsam als 4 Bezug genommen wird, stellen verschiedene Reservoirs herkömmlicher Größe und verschiedene Proteinkristallisationsaufbauten dar. 4A stellt einen Behälter für einen stehenden Tropfen dar, ohne daß der Abdeckstreifen an seinem Platz ist. 4B zeigt einen vollständig zusammengebauten Behälter für einen stehenden Tropfen mit einem gefüllten Flüssigkeitsreservoir und einem stehenden Tropfen, der von einem Abdeckstreifen abgedeckt ist und versiegelt ist, dar. 4C stellt einen vollständig zusammengebauten Proteinkristallisationsbehälter für hängende Tropfen dar mit einem einzelnen experimentellen Proteinkristallisationstropfen, der über dem Flüssigkeitsreservoir hängt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, soll festgestellt werden, daß diese Erfindung nicht auf bestimmte Flüssigkeiten, Biomoleküle oder Vorrichtungsstrukturen beschränkt ist, da diese variieren können. Auch sollte klar sein, daß die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen und nicht als beschränkend gedacht ist.
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, soll festgestellt werden, daß diese Erfindung nicht auf bestimmte Flüssigkeiten, Biomoleküle oder Vorrichtungsstrukturen beschränkt ist, da diese variieren können. Auch sollte klar sein, daß die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen und nicht als beschränkend gedacht ist.
Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß in dieser Spezifikation und den anhängenden Ansprüchen die Singularformen „ein(e/r/s)" und „der/die/das" mehrere Referenzen umfassen, es sei denn, daß aus dem Kontext eindeutig etwas anderes hervorgeht. Demzufolge umfaßt z.B. der Hinweis auf „ein Reservoir" ein einzelnes Reservoir sowie eine Mehrzahl von Reservoirs, der Hinweis auf „eine Flüssigkeit" umfaßt eine einzelne Flüssigkeit sowie eine Mehrzahl und/oder ein Gemisch oder zwei oder mehrere verschiedene Flüssigkeiten, die Bezugnahme auf „ein Biomolekül" umfaßt ein einzelnes Biomolekül sowie eine Kombination von Biomolekülen, „eine Komponente" kann ein Hinweis auf eine Mehrzahl von Komponenten sein und dergleichen.
Bei der Beschreibung und Beanspruchung der vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß den unten dargelegten Definitionen verwendet werden.
Der Begriff „akustische Kopplung" und „akustisch gekoppelt" betrifft hier ein Stadium, bei dem ein Objekt in unmittelbarem oder mittelbarem Kontakt mit einem anderen Objekt angeordnet ist, so daß es möglich ist, daß zwischen den Objekten akustische Strahlung ohne wesentlichen Verlust an akustischer Energie übertragen werden kann. Wenn zwei Untereinheiten mittelbar akustisch gekoppelt sind, wird ein „akustisches Kopplungsmedium" benötigt, um einen Intermediär bereitzustellen, durch welchen die akustische Strahlung übertragen werden kann. Daher kann eine Ausstoßvorrichtung mit einer Flüssigkeit akustisch gekoppelt sein, z.B. durch Eintauchen der Ausstoßvorrichtung in die Flüssigkeit oder da durch das zwischen der Ausstoßvorrichtung und der Flüssigkeit ein akustisches Kopplungsmedium angeordnet wird, um die von der Ausstoßvorrichtung erzeugte akustische Strahlung durch das akustische Kopplungsmedium und in die Flüssigkeit zu übertragen.
Der Begriff „adsorbieren", wie er hier verwendet wird, betrifft die nicht-kovalente Rentention eines Moleküls durch eine Substratoberfläche. D.h., die Adsorption tritt auf als ein Ergebnis einer nicht kovalenten Interaktion zwischen einer Substratoberfläche und Adsorptionsresten, die auf dem Molekül vorliegen, das adsorbiert wird. Die Adsorption kann erfolgen durch Wasserstoffbindung, van-der-Waals-Kräfte, polare Anziehung oder elektrostatische Kräfte (d.h. durch ionische Bindung). Die Beispiele für adsorbierende Reste schließen ein, ohne hierauf beschränkt zu sein, Amingruppen, Carboxylsäurereste, Hydroxylgruppen, Nitrosogruppen, Sulfone und dergleichen. Häufig kann das Substrat mit adsorbierenden Resten funktionalisiert werden, um in einer bestimmten Weise zu interagieren, beispielsweise wenn die Oberfläche mit Aminogruppen funktionalisiert wird, um sie positiv geladen zu machen in einer pH-neutralen wäßrigen Umgebung. In ähnlicher Weise können in manchen Fällen Adsorbatreste zugesetzt werden, um Adsorption zu bewirken, so z.B. wenn ein basisches Protein mit einer aziden Peptidsequenz fusioniert wird, um Adsorbatreste zu erzeugen, die mit einem positiv geladenen adsorbierenden Rest elektrostatisch interagieren können.
Der Begriff „angeheftet", wie z.B. bei einer Substratoberfläche, die einen daran „angehefteten" Rest aufweist, schließt ein kovalente Bindung, Adsorption und physikalische Immobilisierung. Die Begriffe „Bindung" und „verbunden" sind identisch in ihrer Bedeutung mit dem Begriff „angeheftet".
Der hier verwendete Begriff „Anordnung" bezeichnet eine zweidimensionale Anordnung von Merkmalen, wie z.B. eine Anordnung von Reservoirs (z.B. Wells in einer Well-Platte) oder eine Anordnung von verschiedenen Materialien, einschließlich ionisch, metallisch oder kovalente kristalline, einschließlich molekular kristalline, komposite oder keramische, glasige, amorphe, flüssige oder molekulare Materialien auf einer Substratoberfläche (wie in einer Oligonukleotid- oder Peptidanordnung). Verschiedene Materialien im Zusammenhang mit molekularen Materialien schließen ein chemische Isomere, einschließlich Konstitutions-, geometrische und Stereoisomere, und im Zusammenhang mit Polymermolekülen Konstitutionsisomere, die verschiedene monomere Sequenzen aufweisen. Die Anordnungen umfassen im allgemeinen regelmäßige, geordnete Merkmale, wie z.B. bei einem geradlinigen Gitter, parallelen Streifen, Spiralen und dergleichen, jedoch können auch nicht geordnete Anordnungen genauso gut mit Vorteil verwendet werden. Eine Anordnung wird von dem eher allgemeineren Begriff „Muster" dadurch unterschieden, daß Muster nicht notwendigerweise regelmäßige und geordnete Merkmale aufweisen. Die unter Verwendung der Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung ausgebildeten Anordnungen und Muster weisen für das menschliche Auge ohne Hilfsmittel keine optische Signifikanz auf. Z.B. umfaßt die Erfindung nicht den Tintendruck auf Papier oder anderen Substraten, um Buchstaben, Zahlen, Strichcodes, Figuren oder andere Inschriften auszubilden, die für das menschliche Auge ohne Hilfsmittel optische Signifikanz aufweisen. Außerdem sind die durch die Abscheidung von ausgestoßenen Tröpfchen auf einer Oberfläche ausbildeten Anordnungen und Muster, wie sie hier bereitgestellt werden, vorzugsweise im wesentlichen für das menschliche Auge ohne Hilfsmittel nicht sichtbar. Die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Anordnungen umfassen im allgemeinen einen Bereich von etwa 4 bis etwa 10 Millionen Merkmalen, noch typischer etwa 4 bis etwa 1 Millionen Merkmale.
Die Begriffe „Biomolekül" und „biologisches Molekül" werden hier austauschbar verwendet, um jedes organische Molekül zu bezeichnen, sei es als Ganzes oder teilweise natürlich vorkommend, rekombinant hergestellt oder chemisch synthetisiert, welches ein Teil eines lebenden Orga nismus ist, war oder sein kann. Die Begriffe umfassen z.B. Nukleotide, Aminosäuren und Monosaccharide, sowie oligomere und polymere Spezies, wie z.B. Oligonukleotide und Polynukleotide, peptidische Moleküle, wie z.B. Oligopeptide, Polypeptide und Proteine, Saccharide, wie z.B. Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Mucopolysaccharide oder Peptidoglycane (Peptido-Polysaccharide) und dergleichen. Der Begriff umfaßt ebenso Ribosome, Enzym-Cofaktoren, pharmakologisch wirksame Mittel und dergleichen.
Der Begriff „Biomaterial" bezeichnet jedes Material, das biokompatibel ist, d.h. kompatibel mit einem biologischen System, das aus biologischen Molekülen, wie sie oben definiert wurden, zusammengesetzt ist.
Die Begriffe „Bibliothek" und „kombinatorische Bibliothek" werden hier austauschbar verwendet, um eine Mehrzahl von chemischen oder biologischen Komponenten zu bezeichnen, die auf einer Oberfläche eines Substrats vorliegen, wobei jede Komponente von jeder anderen Komponente verschieden ist. Die Komponenten können z.B. Peptidmoleküle und/oder Oligonukleotide sein.
Der Begriff „Komponente" betrifft jede bestimmte Zusammensetzung von Materie, z.B. ein Molekülfragment, ein intaktes Molekül (einschließlich ein monomeres Molekül, ein oligomeres Molekül und ein Polymer) oder ein Gemisch von Materialien (z.B. eine Legierung oder ein Laminat).
Es wird angenommen, daß die Begriffe „Nukleosid" und „Nukleotid", wie sie hier verwendet werden, Nukleoside und Nukleotide bezeichnen, die nicht nur die herkömmlichen Purin- und Pyrimidinbasen umfassen, d.h. Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G) und Uracil (U), sondern auch geschützte Formen davon, z.B. bei denen die Base mit einer Schutzgruppe geschützt ist, wie z.B. Acetyl, Difluoracetyl, Trifluoracetyl, Isobutyryl oder Benzoyl und Purin- und Pyrimidin-Analoga. Die geeigneten Analoga werden dem Fachmann bekannt sein und sind in einschlägigen Texten und Literatur beschrieben. Die üblichen Analoga schließen ohne Beschränkung hierauf ein 1-Methyladenin, 2-Methyladenin, N⁶-Methyladenin, N⁶-Isopentyladenin, 2-Methylthio-N⁶-Isopentyladenin, N,N-Dimethlyadenin, 8-Bromadenin, 2-Thiocytosin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, 5-Ethylcytosin, 4-Acetylcytosin, 1-Methylguanin, 2-Methylguanin, 7-Methlyguanin, 2,2-Dimethlyguanin, 8-Bromguanin, 8-Chlorguanin, 8-Aminoguanin, 8-Methylguanin, 8-Thioguanin, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, 5-Ethyluracil, 5-Propyluracil, 5-Methoxyuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-(Methylaminomethyl)uracil, 5-(carboxymethylaminomethyl)-uracil, 2-Thiouracil, 5-Methyl-2-Thiouracil, 5-Methyl-2-thiouracil, 5-(2-Bromvinyl)uracil, Uracil-5-oxy-essigsäure, Uracil-5-oxy-essigsäuremethylester, Pseudouracil, 1-Methylpseudouracil, Queosin, Inosin, 1-Methylinosin, Hypoxanthin, Xanthin, 2-Aminopurin, 6-Hydroxyaminopurin, 6-Thiopurin und 2,6-Diaminopurin. Außerdem umfassen die Begriffe „Nukleosid" und „Nukleotid" solche Komponenten, die nicht nur die herkömmlichen Ribose- und Desoxyribosezucker enthalten, sondern auch andere Zucker. Die modifizierten Nukleoside oder Nukleotide umfassen auch Modifikationen des Zuckerrestes, z.B. bei denen eine oder mehrere der Hydroxylgruppen mit Halogenatomen oder aliphatischen Gruppen ausgetauscht sind oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert sind.
Der Begriff „Oligonukleotid" soll, wie er hier verwendet wird, generisch sein für Polydesoxynukleotide (2-Desoxy-D-Ribose enthaltend), für Polyribonukleotide (D-Ribose enthaltend), für jeden anderen Typ Polynukleotid, der ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und für andere Polymere, die nicht nukleotidische Hauptketten enthalten (z.B. PNAs), vorausgesetzt, daß die Polymere Nukleobasen in einer Konfiguration enthalten, die Basenpaarung und Basenstapelung ermöglicht, wie es z.B. bei DNA und RNA gefunden wird. Daher schließen diese Begriffe bekannte Arten von Oligonukleotidmodifikationen ein, z.B. die Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotidmodifikationen, wie z.B. solche mit ungeladenen Verknüpfungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate etc.), mit negativ geladenen Verknüpfungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate etc.) und mit positiv geladenen Verknüpfungen (z.B. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphosphortriester), solche, die Seitenreste enthalten, wie z.B. Proteine (einschließlich Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin etc.), solche mit Interkalatoren (z.B. Acridin, Psoralen etc.), solche, die Chelatoren enthalten (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle etc.). Zwischen den Begriffen „Polynukleotid" und „Oligonukleotid" ist keine Unterscheidung in der Länge beabsichtigt, und diese Begriffe werden austauschbar verwendet werden. Diese Begriffe bezeichnen lediglich die Primärstruktur des Moleküls. Die Symbole für Nukleotide und Polynukleotide werden hier in Übereinstimmung mit der IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature Recommendations (Biochemistry 9:4022, 1970) verwendet.
Die Begriffe „Peptid", „Peptidyl" und „peptidisch", wie sie durch die ganze Spezifikation und die Ansprüche verwendet werden, sollen jede Struktur einschließen, die zwei oder mehr Aminosäuren umfaßt. In den meisten Fällen umfassen bei den vorliegenden Anordnungen die Peptide etwa 5.000 bis 10.000 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 5.000 bis 1.000 Aminosäuren. Die Aminosäuren, die das gesamte oder einen Teil eines Peptids ausbilden, können alle der 20 herkömmlichen, natürlich vorkommenden Aminosäuren sein, d.h. Alanin (A), Cystein (C), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Phenylalanin (F), Glycin (G), Histidin (H), Isoleucin (I), Lysin (K), Leucin (L), Methionin (M), Asparagin (N), Prolin (P), Glutamin (Q), Arginin (R), Serin (S), Threonin (T), Valin (V), Tryptophan (W) und Tyrosin (Y). Jede der Aminosäuren in den Peptidmolekülen, die die vorliegenden Anordnungen ausbilden, kann durch eine nicht herkömmliche Aminosäure ausgetauscht werden. Im allgemeinen werden konservative Austäusche bevorzugt. Konservative Austäusche substituieren die ursprüngliche Aminosäure mit einer nicht-konventionellen Aminosäure, die dem Original ähnelt in einer oder mehreren seiner charakteristischen Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobie, sterische Masse; z.B. kann man Val mit Nval ersetzen). Der Begriff „nicht konventionelle Aminosäure" bezeichnet andere Aminosäuren als herkömmliche Aminosäuren und umfaßt z.B. Isomere und Modifikationen der herkömmlichen Aminosäuren (z.B. D-Aminosäuren), nicht-Protein-Aminosäuren, postranslational modifizierte Aminosäuren, enzymatisch modifizierte Aminosäuren, Konstrukte oder Strukturen, die konstruiert wurden, um Aminosäuren nachzuahmen (z.B. α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkyl-Aminosäuren, Milchsäure, β-Alanin, Naphtylalanin, 3-Pyridylalanin, 4-Hydroxyprolin, O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin und nor- Leucin), und Peptide, bei denen die natürlich vorkommende Amidbindung -CONH- an einer oder mehreren Stellen in der Peptidhauptkette mit einer nicht konventionellen Verknüpfung ausgetauscht wurde, wie z.B. N-substituiertes Amid-Ester-Thioamid-Retropeptid-(-NHCO-), Retrothioamid-(-NHCS-), Sulfonamid-(-SO₂NH-) und/oder Peptoid-(N-substituiertes Glycin)-Bindungen. Dementsprechend schließen die peptidischen Moleküle der Anordnung Pseudopeptide und Peptidomimetika ein. Die Peptide dieser Erfindung können (a) natürlich vorkommend, (b) durch chemische Synthese hergestellt, (c) durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt, (d) durch biochemische oder enzymatische Fragmentierung von größeren Molekülen hergestellt, (e) nach Verfahren, die aus einer Kombination der Verfahren (a) bis (d), die oben aufgeführt wurden, hergestellt oder (f) durch jedes andere Mittel zur Herstellung von Peptiden hergestellt sein.
Der Begriff „Flüssigkeit" bedeutet, wie er hier verwendet wird, Materie, die nicht fest ist oder die wenigstens teilweise gasförmig und/oder flüssig ist. Eine Flüssigkeit kann einen Feststoff enthalten, der minimal, teilweise oder vollständig gelöst, dispergiert oder suspendiert ist. Die Beispiele für Flüssigkeiten schließen ohne Beschränkung hierauf ein wäßrige Flüssigkeiten (einschließlich Wasser per se und Salzwasser) und nicht-wäßrige Flüssigkeiten, wie z.B. organische Lösungsmittel und dergleichen. Der Begriff „Flüssigkeit" wird hier nicht synonym mit dem Begriff „Tinte" verwendet, da Tinte einen Farbstoff enthalten muß und nicht gasförmig und/oder flüssig sein darf.
Der Begriff „Nähe" wird verwendet, um den Abstand zwischen dem Fokus der fokussierten akustischen Strahlung und der Oberfläche der Flüssigkeit, aus der ein Tropfen ausgestoßen werden soll, zu bezeichnen. Der Abstand sollte so sein, daß die fokussierte akustische Strahlung, die in die Flüssigkeit gerichtet ist, zu einem Tropfenausstoß aus der Flüssigkeitsoberfläche führt, und ein Fachmann wird in der Lage sein, für jede gegebene Flüssigkeit durch geradlinige und routinemäßige Versuche einen geeigneten Abstand auszuwählen. Allerdings liegt allgemein ein geeigneter Abstand zwischen dem Fokus der akustischen Strahlung und der Flüssigkeitsoberfläche im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 mal der Wellenlänge der akustischen Strahlung in der Flüssigkeit, noch typischer im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 mal der Wellenlänge, vorzugsweise in dem Bereich von etwa 1 bis etwa 5 mal der Wellenlänge.
Die Begriffe „Fokussierungsvorrichtung" und „akustische Fokussierungsvorrichtung" bezeichnen eine Vorrichtung mit der bewirkt wird, daß akustische Wellen in einem Fokus konvergieren entweder durch eine Vorrichtung, die separat von der akustischen Energiequelle ist, die wie eine optische Linse wirkt, oder durch die räumliche Anordnung von akustischen Energiequellen, um die Konvergenz von akustischer Energie im Fokus durch konstruktive und destruktive Interferenz zu bewirken. Eine Fokussiervorrichtung kann so einfach sein, wie ein festes Bauteil, das eine gebogene Oberfläche aufweist, oder sie kann komplexe Strukturen einschließen, wie z.B. diejenigen, die in Fresnel-Linsen zu finden sind, die sich der Beugung bedienen, um die akustische Strahlung zu lenken. Geeignete Fokussiervorrichtungen schließen auch Verfahren der phasengesteuerten Anordnung ein, die auf dem Gebiet bekannt sind und z.B. beschrieben sind in dem US-Patent Nr. 5,798,779 für Nakayasu et al. und Amemiya et al. (1997) Proceedings of the 1997 IS & T NIP13 International Conference on Digital Printing Technologies Proceedings auf den Seiten 698–702.
Der Begriff "Reservoir" wird hier so verwendet, daß er ein Behältnis oder eine Kammer zur Aufnahme oder zum Enthalten einer Flüssigkeit bezeichnet. Daher weist eine Flüssigkeit in einem Reservoir notwendigerweise eine freie Oberfläche auf, d.h. eine Oberfläche, die es einem Tröpfchen erlaubt, daraus ausgestoßen zu werden. Ein Reservoir kann auch ein Ort auf einer Substratoberfläche sein, innerhalb dessen eine Flüssigkeit eingezwängt ist.
Der Begriff „Substrat" wird hier so verwendet, daß er jedes Material bezeichnet, das eine Oberfläche aufweist, auf welcher eine oder mehrere Flüssigkeiten abgeschieden werden können. Das Substrat kann in jeder von einer Anzahl von Formen konstruiert sein, wie z.B. Scheiben, Objektträger, Well-Platten, Membranen. Außerdem kann das Substrat porös oder nicht-porös sein, je nachdem wie es erforderlich ist für die Abscheidung einer bestimmten Flüssigkeit. Die geeigneten Materialien für das Substrat schließen ohne Beschränkung hierauf ein Träger, die typischerweise für die chemische Festphasensynthese verwendet werden, z.B. Polymermaterialien (z.B. Polymere auf der Basis von Polystyrol, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polycarbonat, Divinylbenzol-Styrol), Agarose (z.B. Sepharose®), Dextran (z.B. Sephadex®), Zellulosepolymere und andere Polysaccharide, Siliciumdioxid und Materialien auf Siliciumdioxidbasis, Glas (insbesondere poröses Glas mit kontrolliertem Porendurchmesser oder „CPG") und funktionalisierte Gläser, Keramiken und solche Substrate, die mit Oberflächenbeschichtungen behandelt wurden, z.B. mikroporöse Polymere (insbesondere Zellulosepolymere, wie z.B. Nitrozellulose), mikroporöse metallische Verbindungen (insbesondere mikroporöses Aluminium), antikörperbindende Proteine (erhältlich von Pierce Chemical Co., Rockford IL), Biphenol-A-Polycarbonat oder dergleichen.
Die Substrate können porös sein und die porösen Substrate schließen ein, wie oben angedeutet: Unbeschichtete poröse Glasträger, einschließlich CPG-Träger, poröse Glasträger, die mit einer polymeren Beschichtung beschichtet sind, z.B. einer Aminosilan- oder Poly-L-Lysin-Beschichtung, die daher eine poröse polymere Oberfläche aufweisen, und nicht poröse Glasträger, die mit einer porösen Beschichtung beschichtet sind. Die poröse Beschichtung kann eine poröse Polymerbeschichtung sein, die z.B. umfassen kann ein Zellulosepolymer (z.B. Nitrozellulose) oder Polyacrylamid, oder eine poröse metallische Beschichtung (z.B. ein mikroporöses Aluminium umfassend). Beispiele für im Handel erhältliche Substrate, die poröse Oberflächen aufweisen, umfassen die Fluorescent-Array-Surface-Technology (FAST^TM)-Träger, die von Schleicher & Schuell, Inc. (Keene, NH) erhältlich sind, welche mit einer 10 bis 30 μm dicken porösen, flüssigkeitspermeablen Nitrozelluloseschicht beschichtet sind, die die zur Verfügung stehende Bindungsfläche pro Flächeneinheit der Oberfläche wesentlich erhöht. Andere im Handel erhältliche poröse Substrate schließen ein die permeablen Träger CREATIVECHIP^®, die gegenwärtig von Eppendorf AG (Hamburg, Deutschland) erhältlich sind, und Substrate, die eine „dreidimensionale" Geometrie aufweisen durch eine geordnete, hochporöse Struktur, die es ermöglicht, daß das Reagens in die Poren und Kanäle der gesamten Struktur fließen kann und durch diese hindurch penetrieren kann. Solche Substrate sind erhältlich von Gene Logic, Inc. unter dem Handelsnamen „Flow-Thru Chip" und werden von Steel et al. in Kapitel 5 von Microarray Biochip Technology (BioTechniques Books, Natick, MA, 2000) beschrieben.
Der Begriff „porös" wie in dem Begriff „poröses Substrat" oder „Substrat, das eine poröse Oberfläche aufweist" bezeichnet ein Substrat oder eine Oberfläche, die jeweils eine Porosität (Porenprozentsatz) aufweist in dem Bereich von etwa 1% bis etwa 99%, vorzugsweise etwa 5% bis etwa 99%, noch bevorzugter in dem Bereich von etwa 15% bis etwa 95%, und eine durchschnittliche Porengröße von etwa 100 Å bis etwa 1 mm, typischerweise von etwa 500 Å bis etwa 0,5 mm.
Der Begriff „impermeabel" wird in der herkömmlichen Weise verwendet, in der Bedeutung, daß es nicht erlaubt, daß Wasser oder andere Flüssigkeiten durchdringen. Der Begriff „permeabel" bedeutet, wenn er hier verwendet wird, nicht „impermeabel". Daher bezeichnen „permeables Substrat" und „Substrat, das eine permeable Oberfläche aufweist" ein Substrat oder eine Oberfläche, die jeweils von Wasser oder Flüssigkeit permeiert werden kann.
Während die vorgenannten Trägermaterialien für herkömmlich verwendete Substrate repräsentativ sind, sollte dies so verstanden werden, daß ein Substrat tatsächlich jedes biologische, nicht-biologische, organische und/oder anorganische Material umfassen kann, und in jeder unter einer Vielzahl von physikalischen Formen vorliegen kann, z.B. Partikel, Stränge, Präzipitate, Gene, Blätter, Röhren, Kugeln, Container, Kapillaren, Pads, Scheiben, Filme, Platten und dergleichen, und kann des weiteren jede gewünschte Gestalt aufweisen, wie z.B. eine Scheibe, ein Quadrat, eine Kugel, einen Kreis, etc. Die Substratoberfläche kann flach sein oder nicht, z.B. kann die Oberfläche erhabene oder abgesenkte Bereiche aufweisen. Ein Substrat kann zusätzlich reaktive Funktionalitäten aufweisen, die eine Verbindung kovalent mit der Substratoberfläche verbinden, oder kann in der Weise derivatisiert sein. Diese sind weit bekannt und schließen z.B. ein Siliciumdioxidträger, die reaktive Si-OH-Gruppen enthalten, Polyacrylamidträger, Polystyrolträger, Polyethylenglycolträger und dergleichen.
Der Begriff „Oberflächenmodifikation" wird hier so verwendet, daß er die chemische und/oder physikalische Veränderung einer Oberfläche durch einen additiven oder subtraktiven Prozeß bezeichnet, um eine oder mehrere chemische und/oder physikalische Eigenschaften einer Substratoberfläche oder einer ausgewählten Stelle oder eines Bereichs auf einer Substratoberfläche zu verändern. Z.B. kann die Oberflächenmodifikation mit sich bringen (1) die Veränderung der Benetzungseigenschaften einer Oberfläche, (2) die Funktionalisierung einer Oberfläche, d.h. das Vorsehen, die Modifizierung oder die Substitution von funktionellen Gruppen an der Oberfläche, (3) die Entfunktionalisierung einer Oberfläche, d.h. die Entfernung von funktionellen Gruppen an der Oberfläche, (4) die Veränderung der chemischen Zusammensetzung einer Oberfläche in anderer Weise z.B. durch Ätzen, (5) die Erhöhung oder die Verringerung der Oberflächenrauhigkeit, (6) das Vorsehen einer Beschichtung auf einer Oberfläche, z.B. einer Beschichtung, die Benetzungseigenschaften zeigt, die von den Benetzungseigenschaften der Oberfläche verschieden sind und/oder (7) die Abscheidung von suspendierten Partikeln auf der Oberfläche.
„Optional" oder „wahlweise" bedeutet, daß der nachfolgend beschriebene Umstand eintreten kann oder nicht, so daß die Beschreibung Fälle beschreibt, bei denen der Umstand eintritt und Fälle, bei denen dies nicht der Fall ist.
Der Begriff „im wesentlichen", z.B. in der Phrase „im wesentlichen alle Moleküle einer Anordnung", bezeichnet wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 99% und insbesondere bevorzugt wenigstens 99,9% der Moleküle einer Anordnung. Andere Verwendungen des Begriffs „im wesentlichen" schließen eine analoge Definition ein.
Bei einer Ausführungsform schließlich betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum akustischen Ausstoßen einer Mehrzahl von Tröpfchen in Richtung einer bestimmten Stelle auf einer Substratoberfläche. Die Vorrichtung umfaßt eine Mehrzahl von Reservoirs, jedes so ausgestaltet, das es eine Flüssigkeit enthält, eine Ausstoßvorrichtung, die einen Generator für akustische Strahlung zum Erzeugen akustischer Strahlung umfaßt und eine Fokussierungsvorrichtung zur Fokussierung der akustischen Strahlung in einem Fokus in und in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche in jedem der Reservoirs, und Mittel zum Positionieren der Ausstoßvorrichtung in einer akustisch gekoppelten Beziehung zu jedem der Reservoirs. Vorzugsweise ist keine der Flüssigkeiten eine Tinte.
1 stellt eine geeignete fokussierende akustische Ausstoßvorrichtung in einer vereinfachten Querschnittsansicht dar. Wie bei allen Figuren, auf die hier Bezug genommen wird, bei denen gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet werden, ist 1 nicht zu skalieren und bestimmte Abmessungen können im Sinne der Klarheit der Darstellung überzeichnet sein. Die Vorrichtung 11 schließt eine Mehrzahl von Reservoirs ein, d.h. wenigstens zwei Reservoirs, mit einem ersten Reservoir, das bei 13 angezeigt ist und einem zweiten Reservoir, das bei 15 angezeigt ist, von denen jedes ausgestaltet ist, um eine Flüssigkeit, die eine Flüssigkeitsoberfläche aufweist, zu enthalten, z.B. eine erste Flüssigkeit 14 und eine zweite Flüssigkeit 16, wobei die Flüssigkeitsoberflächen jeweils bei 17 und 19 angezeigt sind. Die Flüssigkeiten 14 und 16 können die gleichen oder verschiedene sein, und sie können auch akustische oder Flüssigkeitseigenschaften aufweisen, die gleich oder verschieden sind. Wie zu sehen ist, sind die Reservoirs von im wesentlichen identischem Aufbau, so daß sie im wesentlichen akustisch nicht unterscheidbar sind, wobei der identische Aufbau kein zwingendes Erfordernis ist. Die Reservoirs sind als separat entfernbare Komponenten dargestellt, können jedoch, falls gewünscht, innerhalb einer Platte oder einem Substrat fixiert sein. Beispielsweise kann die Mehrzahl an Reservoirs individuelle Wells in einer Well-Platte umfassen, optimalerweise, jedoch nicht notwendigerweise, in einer Anordnung angeordnet. Jedes der Reservoirs 13 und 15 ist vorzugsweise axialsymmetrisch, wie dargestellt, und weist jeweils vertikale Wände 21 und 23 auf, die sich von den kreisförmigen Reservoirbasen 25 und 27 nach oben erstrecken und an den Öffnungen 29 und 31 enden, wenngleich auch andere Reservoirformen verwendet werden können. Das Material und die Dicke jeder Reservoirbasis sollte so gewählt sein, daß akustische Strahlung durch diese und in die in den Reservoirs enthaltende Flüssigkeit übertragen werden kann.
Die Vorrichtung schließt auch eine akustische Ausstoßvorrichtung 33 in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche ein, die einen Generator für akustische Strahlung 35 zur Erzeugung von akustischer Strahlung und eine Fokussiervorrichtung 37 zum Fokussieren der akustischen Strahlung in einem Fokus in der Flüssigkeit, aus der ein Tröpfchen ausgestoßen werden soll, umfaßt. Wie in 1 dargestellt, kann die Fokussiervorrichtung 37 ein einzelnes festes Stück umfassen, das eine konkave Oberfläche 39 aufweist zur Fokussierung von akustischer Strahlung, jedoch kann die Fokussiervorrichtung wie unten besprochen wird auch in anderer Weise konstruiert sein. Die akustische Ausstoßvorrichtung 33 ist daher so ausgestaltet, daß sie akustische Strahlung erzeugt und fokussiert, so daß ein Tröpfchen der Flüssigkeit aus jeder der Flüssigkeitsoberflächen 17 und 19 ausgestoßen wird, wenn sie jeweils akustisch mit den Reservoirs 13 und 15 und daher mit den Flüssigkeiten 14 und 16 gekoppelt sind. Der Generator für die akustische Strahlung 35 und die Fokussiervorrichtung 37 kann als eine einzelne Einheit wirken, die durch eine einzelne Kontrollvorrichtung kontrolliert wird, oder sie können unabhängig von einander kontrolliert werden, abhängig von der gewünschten Leistung der Vorrichtung. Typischerweise werden Einzelausstoßvorrichtungskonstruktionen gegenüber Konstruktionen mit vielen Ausstoßvorrichtungen bevorzugt, da die Genauigkeit der Tröpfchenplatzierung und die Konsistenz in Tröpfchengröße und -geschwindigkeit leichter mit einer Einzelausstoßvorrichtung erreicht werden können.
Wie vom Fachmann erkannt werden wird, kann jede aus einer Vielzahl von Fokussierungsvorrichtungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können eine oder mehrere gekrümmte Oberflächen verwendet werden, um akustische Strahlung zu einem Fokus in der Nähe einer Flüssigkeitsoberfläche zu leiten. Eine solche Technik ist in dem US-Patent Nr. 4,308,547 für Lovelady et al. beschrieben. Fokussiervorrichtungen mit gekrümmter Oberfläche sind in der Konstruktion von im Handel erhältlichen akustischen Wandlern inkorporiert worden, wie z.B. diejenigen, die von Panametrics Inc. (Waltham, MA) hergestellt werden. Außerdem sind auf dem Gebiet Fresnel-Linsen zum Lenken von akustischer Energie in einer vorbestimmten fokalen Distanz von einer Objektfläche auf dem Gebiet bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,041,849 für Quate et al. Die Fresnel-Linsen weisen ein radiales Phasenprofil auf, das einen wesentlichen Anteil von akustischer Energie in einer vorbestimmten Beugungsordnung oder in vorbestimmten Beugungswinkeln, die im Hinblick auf die Linse radial variieren können, beugt. Die Beugungswinkel sollten so ausgewählt sein, daß sie die akustische Energie innerhalb der Beugungsordnung auf einer gewünschten Objektfläche fokussieren.
Es gibt auch eine Zahl von Wegen, die Ausstoßvorrichtung 33 mit jedem individuellen Reservoir und damit mit der Flüssigkeit darin akustisch zu koppeln. Ein solcher Ansatz geht über den direkten Kontakt, wie z.B. beschrieben in US-Patent Nr. 4,308,547 für Lovelady, worin eine Fokussiervorrichtung, die aus einem hemispherischen Kristall, der segmentierte Elektroden aufweist, konstruiert ist, in eine auszustoßende Flüssigkeit eingetaucht wird. Das vorgenannte Patent offenbart des weiteren, daß die Fokussiermittel auf oder unter der Oberfläche der Flüssigkeit positioniert werden können. Allerdings ist dieser Ansatz zur akustischen Kopplung der Fokussiervorrichtung mit einer Flüssigkeit ungewünscht, wenn die Ausstoßvorrichtung verwendet wird, um verschiedene Flüssigkeiten in einer Mehrzahl von Behältern oder Reservoirs auszustoßen, da hier das wiederholte Reinigen der Fokussiervorrichtung erforderlich wäre, um eine Kreuzkontaminierung zu vermeiden. Der Reinigungsprozeß würde die Übergangszeit zwischen jedem Tröpfchenausstoßereignis not wendigerweise verlängern. Außerdem würde bei einem solchen Verfahren sich Flüssigkeit an die Ausstoßvorrichtung anheften, wenn sie von jedem Behälter entfernt wird, wodurch seltenes oder kostspieliges Material verschwendet werden könnte.
Daher wäre ein bevorzugter Ansatz, die Ausstoßvorrichtung mit den Reservoirs und den Reservoirflüssigkeiten zu koppeln, ohne einen Teil der Ausstoßvorrichtung, z.B. die Fokussiervorrichtung, mit einer der auszustoßenden Flüssigkeiten in Kontakt zu bringen. Bis zu diesem Punkt stellt die vorliegende Erfindung eine Positionierungsvorrichtung für die Ausstoßvorrichtung zum Positionieren der Ausstoßvorrichtung bei der kontrollierten und wiederholbaren akustischen Kopplung mit jeder der Flüssigkeiten in den Reservoirs bereit, um daraus Tröpfchen auszustoßen, ohne die Ausstoßvorrichtung darin einzutauchen. Dies bringt typischerweise den mittelbaren oder unmittelbaren Kontakt zwischen der Ausstoßvorrichtung und der externen Oberfläche von jedem Reservoir mit sich. Falls unmittelbarer Kontakt verwendet wird, um die Ausstoßvorrichtung mit jedem Reservoir akustisch zu koppeln, ist es bevorzugt, daß der unmittelbare Kontakt vollständig konform ist, um einen effizienten Transfer der akustischen Energie zu sichern. D.h., daß die Ausstoßvorrichtung und das Reservoir korrespondierende Oberflächen aufweisen sollten, die für einen abgestimmten Kontakt ausgestaltet sind. Falls daher die akustische Kopplung zwischen der Ausstoßvorrichtung und dem Reservoir durch die Fokussiervorrichtung erreicht wird, ist es für das Reservoir gewünscht, daß es eine äußere Oberfläche aufweist, die mit dem Oberflächenprofil der Fokussiervorrichtung korrespondiert. Ohne konformen Kontakt kann die Effizienz und die Genauigkeit der Übertragung der akustischen Energie beeinträchtigt werden. Außerdem kann der Ansatz mit unmittelbarem Kontakt die Verwendung von Reservoirs erforderlich machen, die speziell ausgestaltet inverse Oberflächen aufweisen, da viele Fokussiervorrichtungen eine gekrümmte Oberfläche aufweisen.
Optimalerweise wird die akustische Kopplung zwischen der Ausstoßvorrichtung und jedem der Reservoirs durch indirekten Kontakt erreicht, wie in 1A dargestellt. In der Figur ist ein akustisches Kopplungsmedium 41 zwischen der Ausstoßvorrichtung 33 und der Basis 25 des Reservoirs 13 angeordnet, wobei die Ausstoßvorrichtung und das Reservoir in einem vorbestimmten Abstand voneinander orientiert sind. Das akustische Kopplungsmedium kann eine akustische Kopplungsflüssigkeit sein, vorzugsweise ein akustisch homogenes Material, das sowohl mit der akustischen Fokussiervorrichtung 37 und jedem Reservoir in konformem Kontakt steht. Außerdem ist es wichtig, sicherzustellen, daß das flüssige Medium im wesentlichen frei von Material ist, das andere akustische Eigenschaften aufweist als das Flüssigkeitsmedium selbst. Wie gezeigt, ist das erste Reservoir 13 akustisch mit der akustischen Fokussiervorrichtung 37 gekoppelt, so daß eine akustische Welle durch den Generator für die akustische Strahlung erzeugt wird und durch die Fokussiervorrichtung 37 in das akustische Kopplungsmedium 41 gelenkt wird, welches dann die akustische Strahlung in das Reservoir 13 überträgt.
Während des Betriebs werden die Reservoirs 13 und 15 der Vorrichtung jeweils mit den ersten und zweiten Flüssigkeiten 14 und 16, wie in 1 dargestellt, gefüllt. Die akustische Ausstoßvorrichtung 33 ist durch die Positioniervorrichtung für die Ausstoßvorrichtung 43, die unter Reservoir 13 dargestellt ist, positionierbar, um zwischen der Ausstoßvorrichtung und dem Reservoir über das akustische Kopplungsmedium 41 eine akustische Kopplung zu erreichen. Das Substrat 45 wird über und in der Nähe des ersten Reservoirs 13 positioniert, so daß eine Oberfläche des Substrats, die in 1 als Unterseitenoberfläche 51 dargestellt ist, in Richtung des Reservoirs zeigt und im wesentlichen parallel zu der Oberfläche 17 der Flüssigkeit 14 darin ist. Sobald die Ausstoßvorrichtung das Reservoir und das Substrat in geeigneter Anordnung vorliegen, wird der Generator für die akustische Strahlung 35 aktiviert, um akustische Strahlung zu erzeugen, die durch die Fokussiervorrichtung 37 in einem Fokus 47 in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche 17 des ersten Reservoirs gelenkt wird. Als ein Ergebnis wird aus der Flüssigkeitsoberfläche 17 ein Tröpfchen 49 ausgestoßen auf eine bestimmte Stelle auf der Unterseitenoberfläche 51 des Substrats. Das ausgestoßene Tröpfchen kann auf der Substratoberfläche zurückgehalten werden, durch Verfestigung darauf nach Kontakt. Bei einer solchen Ausführungsform ist es erforderlich, das Substrat bei einer niedrigen Temperatur zu halten, d.h. einer Temperatur, die zu einer Tröpfchenverfestigung nach Kontakt führt. Alternativ oder zusätzlich dazu heftet sich ein molekularer Rest innerhalb des Tröpfchens an die Substratoberfläche nach Kontakt durch Adsorption, physikalische Immobilisierung oder kovalente Bindung.
Wie dann in 1B gezeigt ist, repositioniert eine Substratpositionierungsvorrichtung 50 das Substrat 45 über dem Reservoir 15, um ein Tröpfchen davon an einer zweiten bestimmten Stelle zu empfangen. 1B zeigt auch, daß die Ausstoßvorrichtung 33 durch die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung 43 unter dem Reservoir 15 repositioniert wurde und zwar in akustisch gekoppelter Beziehung damit mittels eines akustischen Kopplungsmediums 41. Sobald geeignet angeordnet, wie in 1B gezeigt, wird der Generator für die akustische Strahlung 35 der Ausstoßvorrichtung 33 aktiviert, um akustische Strahlung zu produzieren, die dann durch die Fokussiervorrichtung 37 auf einen Fokus in der Flüssigkeit 16 in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche 19 gelenkt wird, wodurch ein Tröpfchen 53 auf das Substrat ausgestoßen wird. Es sollte klar sein, daß eine solche Vorgehensweise beschreibend dafür ist, wie die angewandete Vorrichtung verwendet werden kann, um eine Mehrzahl von Flüssigkeiten aus Reservoirs auszustoßen, um ein Muster auszubilden, z.B. eine Anordnung auf der Substratoberfläche 51. Gleichermaßen sollte es offensichtlich sein, daß die Vorrichtung so ausgestaltet werden kann, daß eine Mehrzahl von Tröpfchen aus einem oder mehreren Reservoirs auf dieselbe Stelle der Substratoberfläche ausgestoßen wird.
Bei einer anderen Ausführungsform ist die Vorrichtung so konstruiert, daß sie die Übertragung von Flüssigkeiten zwischen Well-Platten ermöglicht, wobei in diesem Fall das Substrat eine Substrat-Well-Platte umfaßt und die flüssigkeitsenthaltenden Reservoirs individuelle Wells in einer Reservoir-Well-Platte sind. 2 stellt eine solche Vorrichtung dar, wobei vier individuelle Wells 13, 15, 73 und 75 in der Reservoir-Well-Platte 12 als Flüssigkeitsreservoirs dienen, um eine auszustoßende Flüssigkeit zu enthalten, und das Substrat umfaßt eine kleinere Well-Platte 45 mit vier individuellen Wells, die mit 55, 56, 57 und 58 angezeigt sind. 2A stellt die Reservoir-Well-Platte und die Substrat-Well-Platte in einer Ansicht der Ebene von oben dar. Wie dargestellt, enthält jede der Well-Platten vier Wells, die in einer 2-x-2-Anordnung angeordnet sind. 2B stellt die verwendete Vorrichtung dar, wobei die Reservoir-Well-Platte und die Substrat-Well-Platte jeweils in Querschnittsansicht entlang der Wells 13, 15 und 55, 57 dargestellt sind. Wie in 1 enthalten die Wells 13 und 15 jeweils die Flüssigkeiten 14 und 16, die jeweils die mit 17 und 19 angezeigten Flüssigkeitsoberflächen aufweisen. Die Materialien und das Design der Wells der Reservoir-Well-Platte sind ähnlich zu denen der Reservoirs, die in 1 dargestellt sind. Z.B. sind die Reservoir-Wells, die in 2B dargestellt sind von im wesentlichen identischem Aufbau, so daß sie akustisch im wesentlichen nicht unterscheidbar sind. Auch bei dieser Ausführungsform sind die Basen der Reservoirs aus einem Material und von einer Dicke, die die effiziente Transmission von akustischer Strahlung dadurch in die Flüssigkeit, die in den Reservoirs enthalten ist, erlaubt.
Die Vorrichtung von 2 schließt auch eine akustische Ausstoßvorrichtung 33 ein, die eine Konstruktion aufweist, die ähnlich zu der der Ausstoßvorrichtung ist, die in 1 dargestellt ist, d.h. die Ausstoßvorrichtung umfaßt eine akustische Erzeugungsvorrichtung 35 und eine Fokussierungsvorrichtung 37. 2B zeigt die Ausstoßvorrichtung akustisch gekoppelt mit einem Reservoir-Well über indirekten Kontakt, d.h. ein akustisches Kopplungsmedium 41 ist zwischen der Ausstoßvorrichtung 33 und der Reservoir-Well-Platte 12 angeordnet, d.h. zwischen der gekrümmten Oberfläche 39 der akustischen Fokussiervorrichtung 37 und der Basis 25 des ersten Reservoir-Well 13. Wie dargestellt ist, ist der erste Reservoir-Well 13 akustisch mit der akustischen Fokussiervorrichtung 37 so gekoppelt, daß die im allgemeinen in Aufwärtsrichtung erzeugte akustische Strahlung durch die Fokussiervorrichtung 37 in das akustische Kopplungsmedium 41 gelenkt wird, welche dann die akustische Strahlung in das Reservoir-Well 13 überträgt.
Bei Betrieb ist jedes der Reservoir-Wells vorzugsweise mit einer verschiedenen Flüssigkeit gefüllt. Wie dargestellt sind die Reservoir-Wells 13 und 15 der Vorrichtung jeweils mit einer ersten Flüssigkeit 14 und einer zweiten Flüssigkeit 16, wie in 1, gefüllt, um jeweils die Flüssigkeitsoberflächen 17 und 19 auszubilden. 2A zeigt, daß die Ausstoßvorrichtung 33 durch eine Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung 43 unter dem Reservoir-Well 13 positioniert ist, um eine akustische Kopplung damit zu erreichen über das akustische Kopplungsmedium 41. Das erste Substrat-Well 55 der Substrat-Well-Platte 45 wird über dem ersten Reservoir-Well 13 positioniert, um ein aus dem ersten Reservoir-Well ausgestoßenes Tröpfchen zu empfangen. Sobald die Ausstoßvorrichtung, das Reservoir und das Substrat in geeigneter Anordnung vorliegen, wird der Generator für die akustische Strahlung aktiviert, um eine akustische Welle zu produzieren, die durch die Fokussiervorrichtung fokussiert wird, um die akustische Welle zum Fokus 47 in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche 17 zu lenken. Als ein Ergebnis wird aus der Flüssigkeitsoberfläche 17 ein Tröpfchen 49 in das erste Substrat-Well 55 der Substrat-Well-Platte 45 ausgestoßen. Das Tröpfchen wird in der Substrat-Well-Platte durch Oberflächenspannung oder wahlweise durch Verfestigung darauf nach Kontakt mittels der niedrigen Temperatur, bei der die Substrat-Well-Platte gehalten wird, zurückgehalten. D.h., die Substrat-Well-Platte ist vorzugsweise mit einer Kühlvorrichtung (nicht dargestellt) verbunden, um die Substratoberfläche bei einer Temperatur zu halten, die nach Kontakt zu einer Tröpfchenverfestigung führt.
Danach wird, wie in 2C gezeigt ist, die Substrat-Well-Platte 45 durch eine Substratpositionierungsvorrichtung 50 so repositioniert, daß das Substrat-Well 57 unmittelbar über dem Reservoir-Well 15 liegt, um ein Tröpfchen davon zu empfangen. 2C zeigt auch, daß die Ausstoßvor richtung 33 durch die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung unter das Reservoir-Well 15 repositioniert wurde, um die Ausstoßvorrichtung und das Reservoir über das akustische Kopplungsmedium 41 akustisch zu koppeln. Da die Substrat-Well-Platte und die Reservoir-Well-Platte unterschiedlich groß sind, besteht lediglich Verbindung, nicht aber Identität, zwischen der Bewegung der Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung und der Bewegung der Substrat-Well-Platte. Sobald geeignet angeordnet, wie in 2C dargestellt, wird der Generator für die akustische Strahlung 35 der Ausstoßvorrichtung 33 aktiviert, um eine akustische Welle zu produzieren, die dann durch die Fokussiervorrichtung 37 auf einen Fokus in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche 19 gelenkt wird, aus der ein Tropfen 53 ausgestoßen wird auf das zweite Well der Substrat-Well-Platte. Es sollte klar sein, daß eine solche Vorgehensweise beschreibend dafür ist, wie die eingesetzte Vorrichtung verwendet werden kann, um eine Mehrzahl von Flüssigkeiten aus einer Well-Platte auf eine andere von unterschiedlicher Größe zu übertragen. Ein Fachmann wird erkennen, daß diese Art des Transfers sogar dann durchgeführt werden kann, wenn sowohl die Ausstoßvorrichtung als auch das Substrat in kontinuierlicher Bewegung sind. Es sollte des weiteren klar sein, daß eine Vielzahl von Kombinationen an Reservoirs, Well-Platten und/oder Substraten verwendet werden kann, wenn man die eingesetzte Vorrichtung verwendet, um einen Flüssigkeitstransfer zu garantieren. Es sollte darüber hinaus klar sein, daß jedes Reservoir vor dem Einsatz des Reservoirs für weiteren Flüssigkeitstransfer durch akustischen Ausstoß mit einer Flüssigkeit gefüllt werden kann, z.B. für die Abscheidung einer Anordnung. Außerdem kann die Flüssigkeit in dem Reservoir in dem Reservoir synthetisiert werden, wobei die Synthese die Anwendung der Flüssigkeitsübertragung durch akustischen Ausstoß bei wenigstens einem Syntheseschritt einschließt.
Wie bereits oben besprochen, können entweder individuelle, z.B. entfernbare, Reservoirs verwendet werden oder Well-Platten, um auszustoßende Flüssigkeiten zu enthalten, wobei die Reservoirs oder die Wells der Well-Platte vorzugsweise im wesentlichen akustisch voneinander nicht unterscheidbar sind. Außerdem müssen die Reservoirs oder Well-Platten akustische Transmission Eigenschaften aufweisen, die hinreichend sind, um zu ermöglichen, daß die akustische Strahlung von der Ausstoßvorrichtung zu den Oberflächen der Flüssigkeiten, die auszustoßen sind, übertragen wird, es sei denn, es ist gewollt, daß die Ausstoßvorrichtung in der auszustoßenden Flüssigkeit eingetaucht ist. Typischerweise bringt dies mit sich, daß man Reservoirs oder Well-Basen vorsieht, die hinreichend dünn sind, um es möglich zu machen, daß die akustische Strahlung hindurchwandern kann ohne inakzeptablen Energieverlust. Zusätzlich muß das bei der Konstruktion der Reservoirs verwendete Material sich mit den darin enthaltenen Flüssigkeiten vertragen. Wenn es also beabsichtigt ist, daß die Reservoirs oder Wells ein organisches Lösungsmittel enthalten, wie z.B. Acetonitril, wären Polymere, die sich in Acetonitril lösen oder darin quellen für die Verwendung bei der Ausbildung der Reservoirs oder Well-Platten ungeeignet. Für Flüssigkeiten auf Wasserbasis sind eine Anzahl von Materialien für die Konstruktion der Reservoirs geeignet und schließen ohne Beschränkung hierauf ein Keramiken, wie z.B. Silciumoxid und Aluminiumoxid, Metalle, wie z.B. nicht rostender Stahl und Platin und Polymere, wie z.B. Polyester und Polytetrafluorethylen. Viele der Well-Platten, die für die Verwendung mit der eingesetzten Vorrichtung geeignet sind, sind im Handel er hältlich und können z.B. 96, 384 oder 1.536 Wells pro Well-Platte enthalten. Die Hersteller von für die Verwendung bei der eingesetzten Vorrichtung geeigneten Well-Platten schließen ein Corning Inc. (Corning, New York) und Greiner America Inc. (Lake Mary, Florida). Allerdings schließt die Verfügbarkeit von solchen im Handel erhältlichen Well-Platten nicht die Herstellung und die Verwendung von kundenspezifisch hergestellten Well-Platten aus, die wenigstens etwa 10.000 Wells oder so viele wie 100.000 Wells oder mehr enthalten. Für Anwendungen zur Ausbildung von Anordnungen ist zu erwarten, daß etwa 100.000 bis etwa 4.000.000 Reservoirs eingesetzt werden können. Um den Bedarf an Bewegung und Zeitbedarf für das Ausrichten der Ausstoßvorrichtung mit jedem Reservoir oder jedem Reservoir-Well zu verringern, ist es außerdem bevorzugt, daß das Zentrum jedes Reservoirs nicht mehr als etwa 1 cm, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 mm oder optimalerweise nicht mehr als etwa 0,5 mm von einem benachbarten Reservoirzentrum angeordnet ist.
Darüber hinaus kann die Vorrichtung so ausgestaltet werden, daß Flüssigkeiten von praktisch jeder Art und Menge, die gewünscht ist, auszustoßen. Die Flüssigkeit kann wäßrig und/oder nicht-wäßrig sein. Die Beispiele für Flüssigkeiten schließen ohne Beschränkung hierauf ein wäßrige Flüssigkeiten, einschließlich Wasser per se und wassergelöste ionische und nicht-ionische Lösungen, organische Lösungsmittel und lipidische Flüssigkeiten, Suspensionen von nicht mischbaren Flüssigkeiten und Suspensionen von Aufschlämmungen von Feststoffen in Flüssigkeiten. Da die Erfindung leicht für die Anwendung bei hohen Temperaturen anzupassen ist, können Flüssigkeiten wie z.B. flüssige Metalle, keramische Materialien und Gläser verwendet werden, siehe z.B. die parallel anhängige US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 09/669/194 („Method and Apparatus for Generating Droplets of Immiscible Fluids"), Erfinder Ellson und Mutz, eingereicht am 25. September, 2000 und übertragen auf Picoliter, Inc. (Mountain View, California). Die US-Patente mit den Nr. 5,520,715 und 5,722,479 für Oeftering beschreiben die Verwendung des akustischen Ausstoßes für flüssige Metalle zur Ausbildung von Strukturen unter Verwendung eines einzelnen Reservoirs und unter Zusatz von Flüssigkeit, um den Fokus aufrecht zu erhalten. Das US-Patent Nr. 6,007,183 für Horine ist ein anderes Patent, das die Verwendung von akustischer Energie zum Ausstoß von Tröpfchen an flüssigem Metall betrifft. Die Möglichkeit der Herstellung von feinen Tröpfchen solcher Materialien steht insoweit im scharfen Gegensatz zu der piezoelektrischen Technologie, als piezoelektrische Systeme bei erhöhten Temperaturen eine suboptimale Performance zeigen. Darüber hinaus kann aufgrund der Genauigkeit, die durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Technologie möglich ist, die Vorrichtung eingesetzt werden, um Tröpfchen aus einem Reservoir auszustoßen, das so ausgestaltet ist, daß es nicht mehr als etwa 100 Nanoliter an Flüssigkeit, vorzugsweise nicht mehr als 10 Nanoliter an Flüssigkeit enthält. In bestimmten Fällen kann die Ausstoßvorrichtung so ausgestaltet werden, daß sie aus einem Reservoir, das so ausgestaltet ist, daß es etwa 1 bis etwa 100 Nanoliter an Flüssigkeit enthält, ein Tröpfchen ausstößt. Dies ist insbesondere nützlich, wenn die auszustoßende Flüssigkeit seltene oder teure Biomoleküle enthält, wobei es gewünscht sein kann, Tröpfchen auszustoßen, die ein Volumen von etwa bis zu 1 Picoliter aufweisen.
Es ist davon auszugehen, daß verschiedene Komponenten der Vorrichtung individuelle Steuerung erfordern oder eine Synchronisation, um auf einem Substrat eine Anordnung auszubil den. Z.B. kann die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung so ausgestaltet werden, daß sie aus jedem Reservoir in einer vorbestimmten Sequenz, die mit einer auf einer Substratoberfläche herzustellenden Anordnung verbunden ist, Tröpfchen ausstößt. Gleichsam kann die Substratpositionierungsvorrichtung zur Positionierung der Substratoberfläche in Bezug auf die Ausstoßvorrichtung so ausgestaltet sein, daß sie die Substratoberfläche ausrichtet, um darauf Tröpfchen in einem Muster oder einer Anordnung zu empfangen. Entweder eine oder beide der Positionierungsvorrichtungen, d.h. die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung und die Substratpositionierungsvorrichtung können aus beispielsweise Motoren, Hebeln, Rollen, Zahnrädern, einer Kombination davon oder anderen elektromechanischen oder mechanischen Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, konstruiert sein. Es ist bevorzugt, sicherzustellen, daß zwischen der Bewegung des Substrats, der Bewegung der Ausstoßvorrichtung und der Aktivierung der Ausstoßvorrichtung Korrespondenz besteht, um eine genaue Ausbildung der Anordnung sicherzustellen.
Die Vorrichtung kann auch bestimmte leistungsfördernde Merkmale einschließen. Z.B. kann die Vorrichtung eine Kühlvorrichtung einschließen, um die Temperatur der Substratoberfläche abzusenken, um beispielsweise sicherzustellen, daß die ausgestoßenen Tröpfchen an dem Substrat anhaften. Die Kühlvorrichtungen können so ausgestaltet sein, daß sie die Substratoberfläche bei einer Temperatur halten, die es der Flüssigkeit ermöglicht, sich teilweise oder vorzugsweise nahezu vollständig zu verfestigen, nachdem die Flüssigkeit in Kontakt damit kommt. Im Falle von wäßrigen Flüssigkeiten sollte die Kühlvorrichtung die Kapazität aufweisen, um die Substratoberflächentemperatur bei etwa 0°C zu halten. Außerdem kann die wiederholte Applikation von akustischer Energie auf ein Reservoir einer Flüssigkeit zu einer Erwärmung der Flüssigkeit führen. Die Erwärmung kann selbstverständlich zu nicht gewollten Veränderungen der Flüssigkeitseigenschaften, wie z.B. der Viskosität, der Oberflächenspannung und der Dichte führen. Daher kann die Vorrichtung des weiteren Mittel umfassen, um die Flüssigkeit in den Reservoirs bei einer konstanten Temperatur zu halten. Die Gestaltung und die Konstruktion von solchen die Temperatur haltenden Mitteln sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise umfassen Komponenten, wie z.B. Heizelemente, ein Kühlelement oder eine Kombination davon. Für viele Anwendungen der biomolekularen Abscheidung ist es im allgemeinen gewünscht, daß die Flüssigkeit, die das Biomolekül enthält, bei einer konstanten Temperatur gehalten wird, ohne mehr als etwa 1°C oder 2°C davon abzuweichen. Außerdem ist es für eine biomolekulare Flüssigkeit, die besonders wärmeempfindlich ist, bevorzugt, daß die Flüssigkeit bei einer Temperatur gehalten wird, die etwa 10°C über dem Schmelzpunkt der Flüssigkeit nicht übersteigt, vorzugsweise bei einer Temperatur, die etwa 5°C über dem Schmelzpunkt der Flüssigkeit nicht übersteigt. Wenn die das Biomolekül enthaltende Flüssigkeit wäßrig ist, kann es daher beispielsweise optimal sein, die Flüssigkeit bei etwa 4°C während des Ausstoßes zu halten.
Alternativ kann für einige Anwendungen, insbesondere für solche, die die akustische Abscheidung von geschmolzenen Metallen oder anderer Materialien mit sich bringen, ein Heizelement vorgesehen sein, um das Substrat bei einer Temperatur unter dem Schmelzpunkt des geschmolzenen Materials zu halten, allerdings über der Umgebungstemperatur, damit die Kontrolle der Küh lungsgeschwindigkeit bewirkt werden kann. Die Kühlungsgeschwindigkeit kann daher kontrolliert werden, um Versuche im Hinblick auf die Eigenschaften von kombinatorischen Zusammensetzungen, wie z.B. von geschmolzen abgeschiedenen Legierungen, die bei verschiedenen Temperaturen gekühlt wurden, zu ermöglichen. Es ist z.B. bekannt, daß metastabile Materialien sich im allgemeinen eher bei schneller Kühlung ausbilden, sowie bei anderen streng irreversiblen Bedingungen. Der Ansatz der Erzeugung von Materialien durch verschiedene Kühlungs- oder Abkühlungsraten kann als kombinatorisches Quenching bezeichnet werden und könnte bewirkt werden, indem man die Substrattemperatur zwischen den akustischen Ausstößen des geschmolzenen Materials verändert. Ein etwas angenehmeres Verfahren der Evaluierung der kombinatorischen Zusammensetzungen, die aus dem geschmolzenem Stadium bei verschiedenen Raten verfestigt wurden, geschieht durch die Erzeugung von multiplen Anordnungen, die das gleiche Muster an nominalen Zusammensetzungen aufweisen, die im geschmolzenen Stadium akustisch ausgestoßen wurden auf Substrate, die bei verschiedenen Temperaturen gehalten wurden.
Beispielsweise könnte eine Eisen-Carbon-Zusammensetzungsanordnung auf ein geeignetes Substrat, wie z.B. Aluminiumoxid, eine Keramik, auf monokristallines Si oder monokristallines Si, auf welchem kristallines tetrahedrisches Carbon (Diamant) nach Routineverfahren wachsen gelassen wurde, ausgestoßen werden. Anordnungen, die nominal das gleiche Zusammensetzungsmuster aufweisen, können unter identischen Bedingungen getüpfelt werden, außer, daß das Substrat jeweils bei verschiedenen Temperaturen gehalten wird, und die resultierenden Materialeigenschaften können für die unterschiedlich abgekühlten Zusammensetzungen verglichen werden.
In einigen Fällen kann eine Substratoberfläche vor der Ausbildung einer Anordnung darauf modifiziert werden. Die Oberflächenmodifikation kann die Funktionalisierung oder die Defunktionalisierung mit sich bringen, die Glättung oder Aufrauhung, die Veränderung der Oberflächenleitfähigkeit, die Beschichtung, die Degradation, die Passivierung oder die anderweitige Veränderung der chemischen Zusammensetzung oder der physikalischen Eigenschaften der Oberfläche. Ein bevorzugtes Oberflächenmodifikationsverfahren schließt die Veränderung der Benetzungseigenschaften der Oberfläche ein, z.B. um die Eingrenzung eines auf die Oberfläche ausgestoßenen Tröpfchens innerhalb eines bestimmten Bereichs oder die Verstärkung der Kinetik der Oberflächenanhaftung der molekularen Reste, die in dem ausgestoßenen Tröpfchen enthalten sind, zu erleichtern. Ein bevorzugtes Verfahren zur Änderung der Benetzungseigenschaften der Substratoberfläche bringt die Abscheidung von Tröpfchen einer geeigneten Oberflächemodifikationsflüssigkeit an jeder bestimmten Stelle der Substratoberfläche vor dem akustischen Ausstoß von Flüssigkeiten zur Ausbildung einer Anordnung darauf mit sich. Auf diese Weise kann die „Ausbreitung" der akustisch ausgestoßenen Tröpfchen optimiert werden und die Konsistenz in Tropfengröße (d.h. Durchmesser, Höhe und Gesamtgestalt) gesichert werden. Ein Weg, das Verfahren zu implementieren, schließt die akustische Kopplung der Ausstoßvorrichtung mit einem Modifikatorreservoir ein, das eine Oberflächenmodifikationsflüssigkeit enthält, und dann die Aktivierung der Ausstoßvorrichtung, wie oben en detail beschrieben wurde, um einen Tropfen der Oberflächenmodifikationsflüssigkeit zu produzieren und in Richtung der bestimmten Stelle auf der Substratoberfläche auszustoßen. Das Verfahren wird wie gewünscht wiederholt, um Oberflächenmodifikationsflüssigkeit an zusätzlichen bestimmten Stellen abzuscheiden. Dieses Verfahren ist bei einer Anzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich, ohne Beschränkung hierauf, das Tüpfeln von Oligomeren zur Ausbildung einer Anordnung auf einer Substratoberfläche oder bei der Synthetisierung von Oligomeranordnungen in situ. Wie oben angemerkt wurde, schließen andere physikalische Eigenschaften der Oberfläche, die modifiziert werden können, thermische Eigenschaften und elektrische Leitfähigkeit ein.
3 stellt in vereinfachter Querschnittsansicht schematisch eine spezifische Ausführungsform des vorgenannten Verfahrens dar, bei dem auf einem Substrat ein Dimer synthetisiert wird unter Verwendung einer Vorrichtung, die ähnlich zu der in 1 dargestellten ist, jedoch einschließlich eines Modifikatorreservoirs 59, das eine Oberflächenmodifikationsflüssigkeit 60, die eine Flüssigkeitsoberfläche 61 aufweist, enthält. 3A stellt dar den Ausstoß eines Tropfens 63 einer Oberflächenmodifikationsflüssigkeit 60, die ausgewählt ist, um die Benetzungseigenschaften einer bestimmten Stelle auf der Oberfläche 51 des Substrats 45 zu verändern, an der das Dimer synthetisiert werden soll. Die Ausstoßvorrichtung 33 wird durch die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung 43 unter dem Modifikatorreservoir 59 in Position gebracht, um eine akustische Kopplung damit über das akustische Kopplungsmedium 41 zu erreichen. Das Substrat 45 wird über dem Modifikatorreservoir 19 an einer Stelle positioniert, die die akustische Abscheidung eines Tropfens der Oberflächenmodifikationsflüssigkeit 60 an einer bestimmten Stelle möglich macht. Sobald die Ausstoßvorrichtung 33, das Modifikatorreservoir 59 und das Substrat 45 in geeigneter Anordnung liegen, wird der Generator für die akustische Strahlung 35 aktiviert, um akustische Strahlung zu produzieren, die durch die Fokussiervorrichtung 37 in einer Weise gelenkt wird, die den Ausstoß eines Tropfens 63 der Oberflächenmodifikationsflüssigkeit 60 aus der Flüssigkeitsoberfläche 61 auf eine bestimmte Stelle auf der Unterseitenoberfläche 51 des Substrats ermöglicht. Sobald das Tröpfchen 63 mit der Substratoberfläche 51 in Kontakt tritt, modifiziert das Tröpfchen einen Bereich der Substratoberfläche, was dazu führt, daß sich die Oberflächenenergie des Bereichs in Bezug auf die abgeschiedenen Flüssigkeiten erhöht oder erniedrigt.
Wie in 3B dargestellt ist, wir dann das Substrat 45 durch die Substratpositionierungsvorrichtung 50 so repositioniert, daß der Bereich der durch das Tröpfchen 63 modifizierten Substratoberfläche unmittelbar über dem Reservoir 13 angeordnet ist. 3B zeigt auch, daß die Ausstoßvorrichtung 33 durch die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung unter dem Reservoir 13 positioniert wird, um die Ausstoßvorrichtung und das Reservoir über das akustische Kopplungsmedium 41 akustisch zu koppeln. Sobald geeignet angeordnet, wird die Ausstoßvorrichtung 33 erneut aktiviert, um so das Tröpfchen 49 auf das Substrat auszustoßen. Das Tröpfchen 49 enthält eine erste monomere Komponente 65, vorzugsweise ein Biomolekül, wie z.B. ein geschütztes Nukleosid oder eine geschützte Aminosäure, welche(s) nach dem Kontakt mit der Substratoberfläche durch kovalente Bindung oder Adsorption daran anhaftet.
Wie dann in 3C dargestellt ist, wird das Substrat 45 erneut durch die Substratpositionierungsvorrichtung 50 repositioniert, so daß die Stelle, die die erste monomere Komponente 65 daran angeheftet trägt, unmittelbar über dem Reservoir 15 angeordnet wird, um ein Tröpfchen da von zu empfangen. 3B zeigt ebenso, daß die Ausstoßvorrichtung 33 durch die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung unter dem Reservoir 15 positioniert wird, um die Ausstoßvorrichtung und das Reservoir über das akustische Kopplungsmedium 41 akustisch zu koppeln. Sobald alles geeignet ausgerichtet ist, wird die Ausstoßvorrichtung 33 erneut aktiviert, um so ein Tröpfchen 53 auszustoßen, das auf das Substrat ausgestoßen wird. Das Tröpfchen 53 enthält eine zweite monomere Komponente 67, die für die Anheftung an die erste monomere Komponente 65 ausgestaltet ist, typischerweise unter Ausbildung einer kovalenten Bindung, um so ein Dimer zu erzeugen, wie es in 3D dargestellt ist. Die vorgenannten Stufen können wiederholt werden, um ein Oligomer, z.B. ein Oligonukleotid, der gewünschten Länge zu erzeugen.
Die Chemie, die beim Synthetisieren von substratgebundenen Oligomeren eingesetzt wird, schließt im allgemeinen herkömmliche Techniken ein, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Organik und Biochemie bekannt sind und/oder in einschlägiger Literatur und Texten beschrieben sind.
Alternativ kann ein Oligomer vor der Anheftung an die Substratoberfläche synthetisiert werden und dann auf einen bestimmten Ort auf der Oberfläche „getüpfelt" werden, indem man die Methodik der Erfindung, wie sie oben ausführlich beschrieben wurde, anwendet. Erneut kann das Oligomer ein Oligonukleotid, ein Oligopeptid oder jede andere biomolekulare (oder nicht biomolekulare) oligomere Komponente sein. Die Herstellung von substratgebundenen peptidischen Molekülen z.B. bei der Ausbildung von Peptidanordnungen und Proteinanordnungen, wird in der parallel anhängigen US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 09/669,997 („Focused Acoustic Energy in the Preparation of Peptidic Arrays"), Erfinder Mutz und Ellson, eingereicht am 25. September, 2000 und übertragen auf Picoliter Inc. (Mountain View, California) beschrieben. Die Herstellung von substratgebundenen Oligonukleotiden, insbesondere von Anordnungen von Oligonukleotiden, bei denen wenigstens eines der Oligonukleotide teilweise nicht-hybridisierende Segmente enthält, wird in der parallel anhängigen US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 09/669,267 („Arrays of Oligonucleotides Containing Nonhybridizing Segments"), Erfinder Ellson, ebenso am 25. September, 2000 eingereicht und auf Picoliter, Inc. (Cupertino, California) übertragen, beschrieben.
Es sollte damit klar sein, daß viele Variationen der Erfindung möglich sind. Beispielsweise kann jedes der ausgestoßenen Tröpfchen als ein isoliertes und „finales" Merkmal abgeschieden werden, z.B. durch das Tüpfeln von Oligonukleotiden, wie es oben beschrieben wurde. Alternativ oder zusätzlich kann eine Mehrzahl von ausgestoßenen Tröpfchen an demselben Ort auf einer Substratoberfläche abgeschieden werden, um in situ eine biomolekulare Anordnung zu synthetisieren, wie oben beschrieben. Für die Herstellung von Anordnungen wird davon ausgegangen, daß verschiedene Waschschritte zwischen den Tröpfchenausstoßstufen angewandt werden können. Solche Waschschritte können einschließen, z.B. das Eintauchen der gesamten Substratoberfläche, auf welcher Merkmale abgeschieden wurden, in einer Waschflüssigkeit. Bei einer Modifikation dieses Vorgangs kann auf die Substratoberfläche eine Flüssigkeit abgeschiedenen werden, die ein Reagens enthält, das alle Merkmale im wesentlichen gleichzeitig verändert, z.B., um bereits auf der Substratoberfläche abgeschiedene biomolekulare Merkmale zu aktivieren und/oder zu entschützen, um Stellen bereitzustellen, an denen zusätzliche Kopplungsreaktionen auftreten können.
Das vorgenannte System für fokussierte akustische Energie ermöglicht den Ausstoß von Tröpfchen in einer Rate von wenigstens etwa 1.000.000 Tröpfchen pro Minute aus demselben Reservoir und bei einer Rate von wenigstens etwa 100.000 Tröpfchen pro Minute aus verschiedenen Reservoirs. Außerdem erlaubt die gegenwärtige Positionierungstechnologie für die Ausstoßvorrichtungspositionierungsvorrichtung, daß diese sich von einem Reservoir zu einem anderen schnell und in einer kontrollierten Weise bewegt, wodurch der schnelle und kontrollierte Ausstoß von verschiedenen Flüssigkeiten möglich wird. D.h., die gegenwärtig im Handel erhältliche Technologie ermöglicht es, daß die Ausstoßvorrichtung von einem Reservoir zu einem anderen mit wiederholbarer und kontrollierter akustischer Kopplung bei jedem Reservoir in weniger als etwa 0,1 Sekunden für Hochleistungs-Positionierungsvorrichtungen und in weniger als etwa 1 Sekunde für gewöhnliche Positionierungsvorrichtungen bewegt wird. Ein für einen Kunden gestaltetes System wird es erlauben, daß die Ausstoßvorrichtung von einem Reservoir zu einem anderen mit wiederholbarer und kontrollierter akustischer Kopplung in weniger als etwa 0,001 Sekunden bewegt wird. Um ein für einen Kunden gestaltetes System bereitzustellen, ist es wichtig, daß man bedenkt, daß es zwei Grundarten der Bewegung gibt: Gepulst und kontinuierlich. Die Pulsbewegung bringt mit sich die diskreten Stufen der Bewegung einer Ausstoßvorrichtung in eine Position, die Aussendung von akustischer Energie und die Bewegung der Ausstoßvorrichtung in die nächste Position. Verwendet man erneut eine Hochleistungs-Positionierungsvorrichtung bei einem solchen Verfahren, erlaubt dies die wiederholbare und kontrollierte akustische Kopplung bei jedem Reservoir in weniger als 0,1 Sekunden. Eine Ausgestaltung für kontinuierliche Bewegung bewegt andererseits die Ausstoßvorrichtung und die Reservoirs kontinuierlich, wenngleich nicht mit der gleichen Geschwindigkeit, und liefert den Ausstoß während der Bewegung. Da die Pulsbreite sehr kurz ist, ermöglicht diese Prozeßart über 10 Hz Reservoirübergänge und sogar über 1.000 Hz Reservoirübergänge.
Um die Genauigkeit des Flüssigkeitsausstoßes sicherzustellen, ist es wichtig, den Ort und die Orientierung der Flüssigkeitsoberfläche, aus der ein Tröpfchen ausgestoßen werden soll, in Bezug auf die Ausstoßvorrichtung zu bestimmen. Anderenfalls können die ausgestoßenen Tröpfchen ungenau in ihrer Größe sein oder sich auf einer ungenauen Flugbahn bewegen. Daher betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Höhe einer Flüssigkeitsoberfläche in einem Reservoir zwischen den Ausstoßereignissen. Das Verfahren schließt ein die akustische Kopplung eines flüssigkeitsenthaltenden Reservoirs mit einem Generator für akustische Strahlung und die Aktivierung des Generators, um eine akustische Welle für die Detektion zu erzeugen, die zu der Flüssigkeitsoberfläche wandert und von dort als reflektierte akustische Welle reflektiert wird. Die Parameter der reflektierten akustischen Strahlung werden dann analysiert, um die räumliche Beziehung zwischen dem Generator für die akustische Strahlung und der Flüssigkeitsoberfläche abzuschätzen. Eine solche Analyse wird die Bestimmung des Abstands zwischen dem Generator für die akustische Strahlung und der Flüssigkeitsoberfläche und/oder der Orientierung der Flüssigkeitsoberfläche in Beziehung zu dem Generator für die akustische Strahlung einschließen.
Etwas genauer kann der Generator für die akustische Strahlung so aktiviert werden, daß er akustische Strahlung niedriger Energie erzeugt, die nicht ausreichend Energie aufweist, um ein Tröpfchen aus der Flüssigkeitsoberfläche auszustoßen. Dies geschieht typischerweise durch Anwendung eines extrem kurzen Pulses (in der Größenordnung von 10ern an Nanosekunden) im Verhältnis zu dem, der normalerweise für den Tröpfchenausstoß erforderlich ist (in der Größenordnung von Mikrosekunden). Durch die Bestimmung der Zeit, die es braucht, bis die akustische Strahlung von der Flüssigkeitsoberfläche zurück zu dem Generator für die akustische Strahlung reflektiert wird und durch die anschließende Korrelierung dieser Zeit mit der Geschwindigkeit des Schalls in der Flüssigkeit, kann die Distanz B und daher die Flüssigkeitshöhe berechnet werden. Selbstverständlich muß sorgfältig vorgegangen werden, um sicherzustellen, daß die von der Grenzfläche zwischen der Reservoirbasis und der Flüssigkeit reflektierte akustische Strahlung abgezogen wird. Vom Fachmann auf dem Gebiet der akustischen Mikroskopie wird erkannt werden, daß ein solches Verfahren herkömmliche oder modifizierte Sonartechniken anwendet.
Sobald die Analyse durchgeführt wurde, wird eine akustische Ausstoßwelle, die einen Fokus in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche aufweist, erzeugt, um wenigstens ein Tröpfchen der Flüssigkeit auszustoßen, wobei die Optimumsintensität und die Ausrichtung der akustischen Welle für den Ausstoß bestimmt wird, indem man die vorgenannte Analyse einsetzt, wahlweise in Verbindung mit zusätzlichen Daten. Die „Optimums"-Intensität und -ausrichtung werden im allgemeinen ausgewählt, um Tröpfchen von konsistenter Größe und Geschwindigkeit zu erzeugen. Z.B. kann die gewünschte Intensität und Ausrichtung der akustischen Welle für den Ausstoß bestimmt werden, indem man nicht nur das wie oben abgeschätzte räumliche Verhältnis verwendet, sondern auch die geometrischen Daten, die mit dem Reservoir verbunden sind, die Flüssigkeitseigenschaftsdaten, die mit der auszustoßenden Flüssigkeit verbunden sind und/oder indem man historische Tröpfchenausstoßdaten, die mit der Ausstoßsequenz verbunden sind, verwendet. Außerdem können die Daten den Bedarf anzeigen, die Ausstoßvorrichtung zu repositionieren, um so den Generator für die akustische Strahlung in Bezug auf die Flüssigkeitsoberfläche zu repositionieren, um sicherzustellen, daß der Fokus der akustischen Welle für den Ausstoß, wie gewünscht, in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche liegt. Falls die Analyse beispielsweise aufdecken sollte, daß der Generator für die akustische Strahlung so positioniert ist, daß die akustische Welle für den Ausstoß nicht in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche fokussiert werden kann, wird der Generator für die akustische Strahlung durch vertikale, horizontale und/oder rotierende Bewegung repositioniert, um eine geeignete Fokussierung der akustischen Welle für den Ausstoß zu ermöglichen.
Im allgemeinen wird das Screening auf die Eigenschaften der Anordnungsbestandteile in einer Weise durchgeführt werden, die für die kombinatorische Anordnung geeignet ist. Das Screening auf biologische Eigenschaften wie z.B. die Ligandenbindung oder die Hybridisierung kann allgemein in der Weise durchgeführt werden, die in den US-Patenten mit den Nr. 5,744,305 und 5,445,934 für Fodor et al., 5,143,854 und 5,405,783 für Pirrung et al. und 5,700,637 und 6,054,270 für Southern beschrieben werden.
Das Screening nach Materialeigenschaften kann bewirkt werden durch Messung der physikalischen und chemischen Eigenschaften, einschließlich beispielsweise, ohne Beschränkung hierauf, Messung der chemischen, mechanischen, optischen, thermischen, elektrischen oder elektroni schen Eigenschaften mittels leicht an Mikroanordnungen anpaßbaren Routineverfahren. Zusätzlich zu den Merkmalen und Eigenschaften der Materialmasse können die oberflächenspezifischen Eigenschaften durch oberflächenspezifische physikalische Verfahren gemessen werden und durch physikalische Verfahren, die für die Oberflächencharakterisierung angepaßt sind. Die makroskopischen Oberflächenphänomene, einschließlich Adsorption, Katalyse, Oberflächenreaktionen, einschließlich Oxidation, Härte, Schmierung und Reibung, können in einem molekularen Maßstab untersucht werden, indem solche Charakterisierungsverfahren angewandt werden. Die verschiedenen physikalischen Oberflächencharakterisierungsverfahren schließen ohne Beschränkung hierauf ein beugende Verfahren, spektroskopische Verfahren, mikroskopische Oberflächenbildgebungsverfahren, Oberflächenionisierungs-Massenspektrometrie-Verfahren, thermische Desorptionsverfahren und die Ellipsometrie. Diese Klassifikationen sollten so verstanden werden, daß sie willkürlich vorgenommen wurden zum Zwecke der Erläuterung, und es mag Überschneidungen geben.
Zusätzlich zu den Merkmalen und Eigenschaften der Materialmasse können die oberflächenspezifischen Eigenschaften durch oberflächenspezifische physikalische Verfahren gemessen werden und durch physikalische Verfahren, die für die Oberflächencharakterisierung angepaßt sind. Die makroskopischen Oberflächenphänomene, einschließlich Adsorption, Katalyse, Oberflächenreaktionen, einschließlich Oxidation, Härte, Schmierung und Reibung, können in einem molekularen Maßstab untersucht werden, indem solche Charakterisierungsverfahren angewandt werden. Die verschiedenen physikalischen Oberflächencharakterisierungsverfahren schließen ohne Beschränkung hierauf ein beugende Verfahren, spektroskopische Verfahren, mikroskopische Oberflächenbildgebungsverfahren, Oberflächenionisierungs-Massenspektrometrie-Verfahren, thermische Desorptionsverfahren und die Ellipsometrie. Diese Klassifikationen sollten so verstanden werden, daß sie willkürlich vorgenommen wurden zum Zwecke der Erläuterung, und es mag Überschneidungen geben.
Zusätzlich zu den Merkmalen und Eigenschaften der Materialmasse können die oberflächenspezifischen Eigenschaften durch oberflächenspezifische physikalische Verfahren gemessen werden und durch physikalische Verfahren, die für die Oberflächencharakterisierung angepaßt sind. Die makroskopischen Oberflächenphänomene, einschließlich Adsorption, Katalyse, Oberflächenreaktionen, einschließlich Oxidation, Härte, Schmierung und Reibung, können in einem molekularen Maßstab untersucht werden, indem solche Charakterisierungsverfahren angewandt werden. Die verschiedenen physikalischen Oberflächencharakterisierungsverfahren schließen ohne Beschränkung hierauf ein beugende Verfahren, spektroskopische Verfahren, mikroskopische Oberflächenbildgebungsverfahren, Oberflächenionisierungs-Massenspektrometrie-Verfahren, thermische Desorptionsverfahren und die Ellipsometrie. Diese Klassifikationen sollten so verstanden werden, daß sie willkürlich vorgenommen wurden zum Zwecke der Erläuterung, und es mag Überschneidungen geben.
Die Beugungsverfahren schließen ein die Röntgenstrahlbeugung (XRD, extremer Einfallwinkel für die Oberfläche), die Elektronenbeugung bei hoher, mittlerer und niedriger Energie (HEED, MEED, LEED), die Reflektions-HEED (RHEED), die spin-polarisierte LEED (SPLEED, besonders nützlich bei der Charakterisierung von Oberflächenmagnetismus und magnetischer Ausrichtung), die Niederenergie-Positronenbeugung (LEPD), die normale Photolelektronenbeugung (NPD), die Atom- oder He-Beugung (AD) und die Anpassung der Neutronenbeugung an die Oberflächenempfindlichkeit. Die winkelaufgelöste Röntgenstrahl-Photoelektronenbeugung (ARXPD) mißt die winklige Photoemission durch Röntgenstrahl-Photoelektronenanregung und gehört daher eher zu einer Art spektroskopischem Verfahren.
Die spektroskopischen Verfahren, die die Elektronenanregung anwenden, schließen ein die Auger-Elektronenspektroskopie (AES), welche 2°-Elektronen erfaßt, die durch das Rückfallen von Atomen auf den Grundzustand nach der Elektronenlückenanregung ausgestoßen werden und verwandte Verfahren, einschließlich der Auger-Elektronenauftrittspotential-Spektroskopie (AEAPS), die winkelaufgelöste AES (ARAES), die Elektronenauftrittspotential-Feinstruktur-Spektroskopie (EAPFS), die Disappearance-Potential-Spektroskopie (DAPS). Zusätzliche spektroskopische Verfahren, die die Elektronenstrahlanregung anwenden, schließen ein die Konversionselektronen-Mossbauer-Spektroskopie (CEM), die elektronenstimulierte winklige Ionenverteilung (ESIAD), die Elektronen-Energieverlust-Spektroskopie (EELS) und die hochauflösende EELS (HREELS) und verwandte Verfahren, einschließlich die Elektronenenergie-Bandkanten-Struktur (ELNES), die Oberflächenelektronenenergie-Feinstruktur (SEELFS). Ein zusätzliches spektroskopisches Verfahren auf der Basis der Elektronenanregung, das die Modulation des Absorptionsquerschnitts mit einer Energie von 100–500 eV über der Anregungsschwelle mißt, häufig durch Messung der Fluoreszenz als Lückenrückfall, ist die erweiterte Röntgenstrahl-Energieverlust-Feinstruktur (EXELFS), NPD APD. Die inverse Photoemission von Elektronen (IP) liefert Informationen über die Leitungsbanden und die nicht besetzten Orbitale.
Die spektroskopischen Verfahren, auf der Grundlage von Photonenanregung, die nicht die klassischen Partikel einsetzen, werden beispielhaft genannt anhand der Ultraviolett-Photoemissions-Spektroskopie (UPS), der Röntgenstrahl-Photoemissions-Spektroskopie (XPS, zuvor bekannt als ESCA, Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse). Die XPS-verwandten Verfahren schließen ein: Die Photonenstimulierte Winklige Ionenverteilung (PSD), analog zu ESDIAD, die Auftrittspotential-XPS (APXPS), bei der der EAPFS-Querschnitt durch die Fluoreszenz aus dem Rückfall von durch Röntgenstrahlen photoemittierten Lücken kontrolliert wird, verschiedene Winkelaufgelöste Photoemissionsverfahren (ARPES), einschließlich der winkelaufgelösten Photoemissions-Feinstruktur (ARPEFS), der winkelaufgelösten UV-Photoemissions-Spektroskopie (ARUPS), der winkelaufgelösten XPS (ARXPS), der ARXPD, der Bandkanten-Röntgenstrahl-Absorptions-Feinstruktur, die Energien von ungefähr 30 eV über der Anregungsschwelle verwendet, um sowohl die primär photoemittierten Elektronen als auch die durch den Lückenrückfall emittierten Auger-Elektronen zu messen (NEXAFS), die erweiterten Röntgenstrahl-Absorptions-Feinstruktur (EXAFS), die Oberflächen-EXAFS (SEXAFS), welche die primär photoemittierten Elektronen (PE-SEXAFS) und die durch den Lückenrückfall emittierten Auger-Elektronen (Auger-SEXAFS) und die von Photoelektronen emittierten Ionen (PSD-SEXAFS) mißt. Die winkelaufgelöste Röntgenstrahl- Photoemissions-Spektroskopie (ARXPS) mißt die winklige Verteilung von photoemittierten Elektronen
Die Infrarotabsorptions-Spektroskopieverfahren, die Informationen über die molekulare Struktur von Adsorbat, adsorbierten Molekülen liefern, schließen ein die Infrarot-Reflektions-Absorptions-Spektroskopie (IRAS). Die Entfaltung von Breitband-IRAS unter Anwendung einer Doppler-verschobenen Quelle und einer Fourier-Analyse wird als Fourier-Transformations-IR (FTIR) bezeichnet. Diese Verfahren sind besonders wichtig bei der Bestimmung der Identität und der Konformation von adsorbierten Atomen und Molekülen für die Vorhersage von potentiellen katalytischen Eigenschaften, z.B. zur Identifizierung, welche Zusammensetzung in einer Anordnung weiter auf katalytische Eigenschaften untersucht werden sollte. Die meisten katalytische Mechanismen verlaufen über die Adsorption, einschließlich der Physi- und Chemi-Sorption oder beidem (Somorjai, Introduction to Surface Chemistry and Catalysis (1994) John Wiley & Sons).
Die auf Streuung basierenden Verfahren schließen ein die Rutherford-Rückstreuung (RBS), die Ionenstreuungsspektroskopien (ISS), die Hochenergie-Ionenstreuungsspektroskopie (HEIS), die Mittelenergie-Ionenstreuungsspektroskopie (MEIS), die Niederenergie-Ionenstreuungsspektroskopie (LEIS).
Die mikroskopischen Verfahren schließen ein die Rastertunnelmikroskopie (STM) und die Angewandte-Kraft-Mikroskopie (AFM), welche absorbierte Moleküle erfassen kann. Z.B. wurde die STM verwendet, um vorliegende Adsorbate sowie andere Oberflächenkonturen aufzuzeigen, z.B. das Flüssigkristallmolekül 5-Nonyl-2-nonoxylphenylpyrimidin, das auf einer Graphitoberfläche adsorbiert war (Foster et al. (1988) Nature 338:137). Die AFM erfaßt eine durch Oberflächenkontakt verursachte Ablenkung in einem Cantilever und schließt ein die Rasterkraftmikroskopie (SFM) und die Reibungskraftmikroskopie (FFM). Um nicht-leitende Oberflächen zu untersuchen, können auf Kraft basierende makroskopische Verfahren verwendet werden, da sie keinen Elektronentunnelung aus der Masse erfordern. Die massenspektroskopischen (MS) Verfahren schließen ein SIMS und MALDI-MS, welche verwendet werden können, um Informationen über ionisierte Makromoleküle zu erhalten, einschließlich von Biomakromolekülen, die entweder kombinatorisch auf dem Substrat gebildet wurden oder die auf einer Oberfläche eines kombinatorischen Materials adsorbiert wurden. Das US-Patent Nr. 5,959,297 beschreibt Rastermassenspektrometer, die eine Ionisationskammer und einen Kollektor aufweisen, der ein elektrisches Signal ausgibt antwortend auf die Menge an Gasionen, die die Kollektoroberfläche berühren, und Verfahren zum Screening von angeordneten Bibliotheken an verschiedenen Materialien, die parallel einem Gasreaktanden ausgesetzt wurden. Die MS-Verfahren sind auch kombinierbar mit Molekularstrahlverfahren (MB), insbesondere mit der reaktiven Molekularstrahlstreuung (MBRS), um die Erfassung der Adsorption und der Verweilzeit an der Adsorptionsstelle, der Reaktionen, einschließlich der Oberflächenkatalyse von Reaktionen adsorbierter Moleküle, und der winkligen Verteilung von Adsorbat und von jedem Reaktionsprodukt, das von der Oberfläche ausgestoßen wird, zu ermöglichen (Atkins, Physical Chemistry, 6. Auflage (1998) W. H. Freeman & Co. N. Y.). Die MS-Beprobung von mikroangeordneten Stellen, die durch akustische Zuführung Reaktanden ausgesetzt sind, kann mit mikrodesorptiven MB-Verfahren kom biniert werden oder mit jedem der hier beschriebenen Verfahren, die einen Oberflächenbereich beproben, der hinreichend kleine Abmessungen aufweist. Beispielsweise kann die Mikro-FTIR in adäquater Auflösung mit einem Probendurchmesser von 5 μm durchgeführt werden. Eine Liste von Verfahren und deren damit einhergehenden Probendurchmessern folgt: XPS – 10 μm, MALDI-MS – 10 μm, SIMS – 1 μm (Oberflächenbildgebung), 30 μm (Tiefenprofilerfassung), AES – 0,1 μm (100 nm), FE-AES – < 15 nm, AFM/STM – 1,5–5 nm, SEM 4,5 nm, FE-SEM – 1,5 nm, RBS – 2 mm, MB-MS – 0,1–0,3 mm. Es ist davon auszugehen, daß die Anordnung für das Charakterisierungsverfahren ausgestaltet werden kann, z.B. bei nicht-biomakromolekularen Anordnungen, bei dem die untersuchten Proben nicht so selten sind und die Verfahren größere Beprobungsbereiche einbeziehen. Z.B. kann die SIMS-Tiefenprofilerfassung verwendet werden, bei der die gewünschten Stellen Abmessungen in der Größenordnung von 100 μm aufweisen, was einer Dichte von etwa 10.000 Stellen/cm² entspricht. Darüber hinaus werden die Messungen von solchen Eigenschaften wie der Leitfähigkeit durch größere Merkmale erleichtert.
Das thermische Muster einer Anordnung kann von einer Infrarotkamera eingefangen werden, um Hot Spots, wie z.B. katalytische Bereiche, Reaktionsbereiche und Bereiche der Adsorption in einer Anordnung von Materialien aufzudecken. Beispielsweise wurde von einem Parallel-Screening-Verfahren berichtet, das auf Reaktionswärme basiert, die von einer katalytischen Reaktion an der Oberfläche absorbiert wurde (Moates et al. (1996) Ind. Eng. Chem. Res. 35:4801-03). Bei der oberflächenkatalysierten Oxidation von Wasserstoff über einer metallischen Oberfläche lassen IR-Strahlungsbilder einer Anordnung von potentiellen Katalysatoren die aktiven Katalysatoren erkennen. Die Hot Spots in dem Bild, die mit den Stellen der Anordnung korrespondieren, die katalytische Aktivität aufweisen, können mit einer Infrarotkamera aufgelöst werden. Trotz der Abweichung in der Wärmekapazität und obwohl die Oberflächenwärmeleitfähigkeit zwischen Materialien zu der Möglichkeit führen kann, daß Stellen der Anordnung, die ähnliche katalytische Aktivität aufweisen, temperaturmäßig in unterschiedlichen Ausmaßen ansteigen, ist das Vorliegen oder die Abwesenheit von nachweisbarer Erwärmung ein semiquantitatives Anzeichen für die Enthalpiefreisetzung, was hinreichend für das Screening ist, um Materialien zu identifizieren, die eine gewisse katalytische Aktivität aufzeigen. Analog gilt für die Adsorption, daß sogar wenn die Adsorptionswärme für ein gegebenes Molekül von der Adsorptionsstelle abhängt und die verschiedenen Materialien verschiedene Adsorptionsstellen für das gleiche Molekül aufweisen können, die Erwärmung der Anordnungsstelle geeignet ist für das Screening von Material, das Oberflächen aufweist, die ein gegebenes Molekül aus verschiedenen Gründen adsorbieren, einschließlich der potentiellen Katalyse von Reaktionen, die das Molekül einbinden. Auch die spontane Reaktion, sei es durch Oberflächenrestrukturierung, Oxidation oder andere Prozesse, kann durch die Detektion der Oberflächenerwärmung erfaßbar sein. Da Oberflächen inhärent metastabil sind und die relative Metastabilität der Oberfläche häufig die Verwendbarkeit eines Materials bestimmt, da es die Nutzungsdauer eines Produkts aus dem Material bestimmt, ist die Bestimmung der Oberflächenreaktivität unter verschiedenen Bedingungen wichtig. Die physikalische, chemische, biologische und/oder Biomaterialien-/Biokompatibilitäts-Messung der Kinetiken der Oberflächenrestrukturierungsprozesse, allgemeine und spezifische Mechanismen eingeschlossen, gegen die Temperatur wird wertvolle Information über die freie Aktivierungsenergie von verschiedenen Prozessen liefern. Auch für solche Bestimmungen kann die Infrarotbildgebung nützlich sein. Da aber viele, wenn nicht alle, spontanen Oberflächenphänomene eher entrope Phänomene sind, darf das Vertrauen nicht nur auf semiquantitative thermo-dynamische Messungen gestützt werden.
Es können auch die Eigenschaften als Biomaterial charakterisiert oder gescreent werden. In einigen Fällen können Anordnungen in Labortiere implementiert werden und die Fibrose, die inflammatorischen Veränderungen, die Förderung der Proteinaggregation und dergleichen können für das nackte Substrat und für verschiedene in der Nähe liegende kombinatorische Stellen verglichen werden, wenngleich letztlich individuelle Materialien separat implantiert werden sollten. Die in vitro-Ansätze für die Biokompatibilität schließen ein die Messung der Adsorption von verschiedenen Proteinen und Gemischen davon über die Zeit an verschiedenen Stellen. Die Oberflächen, die (1) niedrige Niveaus zeigen an (2) gesättigter Adsorption für (3) die wenigsten verschiedenen Proteine und die (4) nicht das Adsorbatprotein denaturieren sind am wahrscheinlichsten biokompatibel. Z.B. wurde für mit Polyethylenglycol (PEG) modifizierte Si-Oberflächen, bei denen sich die Menge an Adsorbat über die Zeit auf relativ niedrigen Niveaus sättigt, gezeigt, daß sie biokompatibler sind als eine nicht-modifizierte Oberfläche, die fortwährend über die gesamten beobachteten Zeiträume Adsorbat akkumuliert (Zhang et al. (1998) Biomaterials 19(10):953-60). Zhang et al. untersuchen die Adsorption von Albumin, Fibrinogen und IgG auf Si-Oberflächen, die selbst angefügtes PEG aufweisen, durch Ellipsometrie, um die nicht-fouling und nicht-immunogenen Eigenschaften der Oberflächen zu evaluieren. Außerdem wurden die Anhaftung und die Proliferation von humanen Fibroblasten und Hela-Zellen auf den modifizierten Oberflächen untersucht, um deren Gewebe-Biokompatibilität zu untersuchen. Die Adsorptionsversuche auf mit Polymer funktionalisierten Oberflächen suggerieren einen entropen Effekt, was belegt wird durch Polymer, mit einer labileren Konformation, das einen größeren Anti-Adsorptionseffekt aufweist (Cordova et al. (1997) Anal. Chem. 69(7):1370-9), was die Sättigung beeinflussen kann durch Vorbeugung von Denaturierung und Absenkung von nicht spezifischer Aggregation.
Geeignete analytische Verfahren für die Analyse von erstellten kombinatorischen Bibliotheken werden hier in der folgenden Tabelle fortgesetzt.
Allgemein gilt, daß im Hinblick auf das Screening von angeordneten Materialien auf verschiedene Eigenschaften solche Verfahren zur Charakterisierung der Oberfläche, die geeignet sind, eine Karte der Oberflächenmikrostrukturen von angeordneten Materialien zu erzeugen, von Verwendung sind bei der Identifizierung verschiedener potentieller Eigenschaften der Oberfläche, insbesondere der physikalischen Eigenschaften der Oberfläche, die sachdienlich sind für die Materialeigenschaften, einschließlich der Oberflächenrauhigkeit und der Körnungsorientierung und für die Funktionalisierung, einschließlich z.B. der Silanolausbildung und der Elektronenwolkenorientierung in kristallinen Siliciumoberflächen, und für potentielle Stellen für die chemische und physikalische Adsorption (Chemi-, Physi-Sorption) von verschiedenen Molekülen, eine Information, die an sich nützlich sein kann oder bei der Vorhersage des Potentials für eine katalytische Aktivität. Der Fachmann auf dem Gebiet der kombinatorischen Chemie wird erkennen, daß die Verfahren dieser Erfindung auf alle Arten der Kristallisierung anwendbar sind. Durch die kombinatorischen Versuchsverfahren der akustischen Tröpfchenabscheidung können organische und anorganische Verbindungen kristallisiert werden. Diese Kristallisation kann aus wäßrigen oder anderen Lösungen oder aus Schmelzen geschehen. Diese Kristallisationen können durch spontane Kernbildung oder durch Kernbildung durch die Zugabe von Impfkristallen erfolgen. Zu den kombinatorischen Tröpfchenzubereitungen, die durch akustische Abscheidung abgeschieden wurden, können in Flüssigkeit suspendierte Impfkristalle zugegeben werden. Die Verfahren der Erfindung können daher schnell von einem Fachmann angewandt werden zur Bestimmung der idealen Bedingungen für die Kristallisation von allem möglichen, von z.B. Diamanten bis Glucosekristallen. Es auch eindeutig klar, daß die vorliegende Erfindung anwendbar ist zur Bestimmung von Bedingungen, die nicht die Kristallisation begünstigen, sondern statt dessen die Ausbildung eines Glases oder anderer amorpher Phasen begünstigen. Außerdem können die kombinatorischen Versuchsverfahren der vorliegenden Erfindung mit kleinen Volumina eingesetzt werden, um Bedingungen zu bestimmen, die eine Form der Kristallisation gegenüber einer anderen begünstigen (z.B. ein bestimmter Polymorph, eher ein polykristallines Aggregat anstelle einer kleinen Anzahl an Einzelkristallen, eine bestimmte Morphologie, wie z.B. faserartige, tafelförmige oder gleichförmige Kristalle oder eine bestimmte Dichte an Fehlstellen).
Der akustische Tropfenausstoß (ADE) liefert auch ein Verfahren zur Erhöhung der Zahl der Kristallisationsbedingungen, die für eine bestimmte Quantität eines Makromoleküls untersucht werden, wie z.B. eines Proteins oder einer Nukleinsäure. Die gegenwärtigen Hochdurchsatzverfahren sind in der Lage, Nanotröpfchen zu screenen (so kleine Volumina wie 40 nl). Die 100-fache Verringerung des experimentellen Kristallisationsvolumens auf 40 nl von 40 μl (bei herkömmlichen Verfahren verwendet) spart Proteinvorräte, ermöglicht das Screening von etwa 480 verschiedenen Kristallisationsbedingungen pro Protein pro Stunde und verringert die für die Kristallisation erforderliche Zeit von mehreren Tagen auf mehrere Stunden (Stevens (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:558). Die Verwendung von kleineren Volumina verringert die Diffusionszeit, wodurch die Geschwindigkeit von sowohl der Kernbildung als auch der Kristallausbildung erhöht wird, und kann aufgrund der schnelleren Raten der Dampfdiffusion als diejenigen bei den üblicherweise verwendeten Verfahren mit stehendem Tropfen (4A, 4B) und hängendem Tropfen (4B) die Kristallisation beschleunigen. Bei diesen Verfahren wird der Tropfen angeordnet in einem kleinen gegenüber der äußeren Atmosphäre versiegelten Behälter in der Anwesenheit eines Reservoirs 70 (4C), das eine Lösungsmittelösung 71 (4C) enthält, die der Zusammensetzung der lösenden Flüssigkeit für das Biomakromolekül oder für die Komponente in den Versuchströpfchen ähnelt, ohne das Biomakromolekül oder die andere für die Kristallisation interessierende Komponente zu enthalten. Es wird eine Dichtung oder ein Siegel eingesetzt, um den Behälter gegenüber der Atmosphäre zu versiegeln 68 (4A), 72 (4C). Häufig ist das Dichtungsmaterial ein Fett wie z.B. ein Hochvakuumfett.
Üblicherweise ist die Lösungsmittellösung, die in dem Reservoir enthalten ist, leicht hyperton bezogen auf die Flüssigkeit in dem Versuchströpfchen, was die Lösungsmitteldiffusion aus dem Tröpfchen in der Weise erlaubt, daß geordnetes Kristallwachstum begünstigt wird. Dem Fachmann ist unverzüglich klar, daß eine leicht hypotone Reservoirlösung manchmal wünschenswert sein kann. Z.B. ist es bekannt, daß die Proteinkernbildung häufig eine hohe Konzentration des für die Kristallisation interessierenden Proteins erfordert, während die Kristalle der besten Qualität für die kristallographische Strukturbestimmung typischerweise bei niedrigeren Konzentrationen gezogen werden (McRee, Practical Protein Crystallogrpahy, 2. Auflage Academic Press, 1999). Daher könnte die Reservoirlösung eine weniger hypertone oder vielleicht sogar eine leicht hypotone Lösung enthalten, nachdem die Kernbildung erfolgt ist.
Multiple Tropfenversuche werden durchgeführt, indem man Kristallisationsaufbauten der in 4 dargestellten Art in Standardgröße verwendet. Der akustische Ausstoß kann eine Anordnung von hängenden Tröpfchen ausbilden, jedes mit einem Volumen von Picolitern, mit Dichten von 1.000/cm², 10.000/cm² oder größer, wodurch mehrere tausend Versuche mit der gleichen Menge an Material durchgeführt werden können, die verwendet würde, um einen Standardversuch mit hängendem Tropfen durchzuführen. Dies ermöglicht sowohl die Verdopplung als auch das kombinatorische Experimentieren mit kleinen Mengen an Biomakromolekül. Die hängenden Tropfen können erzeugt werden, ohne die Notwendigkeit des Umdrehens des Deckstreifens nach dem Abscheiden der Flüssigkeit darauf. Des weiteren kann eine Verdünnung erreicht werden durch akustisches Ausstoßen von Reservoirflüssigkeit auf die darüberliegenden hängenden Tröpfchen, ohne daß das Dichtungssiegel gebrochen wird. Die anfängliche Vorbereitung des Versuchs erfordert gewöhnlich, daß die Reservoirflüssigkeit auf einem das Protein enthaltenden Tröpfchen abgeschieden wird, und dies muß schnell geschehen, um das übermäßige Austrocknen durch die Atmosphäre zu vermeiden. Der ADE ermöglicht es, daß die Verdünnung nach dem Versiegeln der Dichtung durchgeführt wird. Auch Behälter mit sitzendem Tropfen mit Standardgröße können für die Verwendung gemeinsam mit den dichten Anordnungen von Picoliter-Volumina auf jedem Deckstreifen angepaßt werden. Offensichtlich ermöglichen die gegenwärtigen Fortschritte bei den Mikrofabrikationstechniken die Produktion von individuellen Mikrowell-Anordnungen für hängende oder sitzende Versuche, die Tröpfchen in Picolitergröße anwenden. Die atomar glatten Oberflächen, die durch die Mikrofabrikation von monokristallinem Si und dergleichen erhältlich sind, reduzieren die Menge an benötigtem Siegel und können dazu führen, daß für eine separate Dichtung kein Bedarf besteht. Alternativ können gemusterte Polymere, einschließlich photolabile Polymere, die in der Mikroelektronikindustrie routinemäßig verwendet werden, als Dichtungen für Mikrofabrikations-Well-Anordnungen eingesetzt werden. In den individuellen Mikrowells können individuelle Tröpfchen, oder mehrere Tröpfchen, die Kristallisationsexperimente umfassen, angeordnet werden.
Das Flüssigkeitsreservoir kann schnell manipuliert werden. Die Flüssigkeit in Reservoirs für die Kristallisationsversuche mit Standardgröße (z.B. der runde Deckstreifen, der bei dem in 4C dargestellten Behälter für hängende Tropfen mit konventioneller Größe verwendet wird, weist einen Durchmesser von 18–22 mm auf) kann durch herkömmliche Verfahren, wie z.B. das Mikropipettieren oder durch akustische Abscheidung in und Ausstoß aus das/dem Reservoir manipuliert werden. Wenn die Reservoirs signifikant kleiner sind, z.B. bei einer Anordnung von individuellen hängenden Tropfen im Picoliter-Maßstab, die im Mikromaßstab hergestellt wurde, kann die Flüssigkeit in den Mikrowells einfach und wirksam auf die gewünschte Zusammensetzung titriert werden, durch akustische/n Abscheidung und Ausstoß, wodurch die Notwendigkeit, Mikroflüssigkeitskanäle und dergleichen bereitzustellen, vermieden wird. Die Mikroflüssigkeitskanäle erhöhen die Komplexität der Mikrofabrikation und sind nicht in der Lage, akkurat und präzise den Reservoirs die kleinen Volumina zuzuführen oder von diesen zu entfernen, die durch akustische/n Abscheidung/Ausstoß bewirkt werden können.
Durch die Anwendung von ADE, um Volumina zu verteilen, die in dem Bereich von 0,1 Picoliter bis mehrere Nanoliter liegen, wodurch das Volumen der Versuche in der Größenordnung von Picolitern bemessen wird, wird die Möglichkeit, Kristalle in hoher Qualität innerhalb von Minuten anstelle von mehreren Stunden auszubilden, eine wahrscheinliche Erwartung. Wenn die Verwendung von Volumina von 40 nl das Screening von 480 Bedingungen ermöglicht, sollte darüber hinaus die Verwendung von Volumina von 40 pL das Screening von wenigstens 480.000 kombinatorischen Bedingungen für einen gegebenen Proteinvorrat erlauben oder alternativ daß jede der 480 Bedingungen 1.000-fach wiederholt wird, um die Kernbildungsereignisse stochastisch zu erfassen. Die Verwendung von Volumina von etwa 40 pL wird typischerweise die Kristallisation innerhalb weniger Minuten ermöglichen.
Die Möglichkeit, Volumina von solch kleiner Größe genau zu verteilen, gestattet Myriaden kombinatorischer Ansätze. Stevens (2000), Supra, bemerkt die Bedeutung von Verbesserungen auf dem Gebiet der herkömmlichen Mikrofluidik bezüglich der Verringerung des Maßstabs der Proteinkristallisationsversuche, wobei er beobachtet, daß für einige Kristallisationen das Lösungsmittelreservoir nicht mehr erforderlich ist, wenn die Volumina von 4 ml auf 40 nl verringert werden. Es besteht allerdings eine signifikante Möglichkeit, daß die Verringerung der Größe auf 40 pL ein geringfügig hypotones oder isotones Reservoir erfordern kann, um die Diffusion zu verlängern. Die Kristallographen setzen häufig eine Beschichtung auf Ölbasis auf den Tröpfchen ein, um die Diffusion aus dem Tröpfchen zu verringern (im allgemeinen bezeichnet als „Microbatch"-Technik). Das Dampfdiffusionsverfahren vermeidet das Auftragen von Öl auf das Versuchströpfchen, überzieht dafür aber das Reservoir mit einer Ölbeschichtung. Diese Verfahren können in maßstabsgetreu verkleinerten Versuchen durch ADE eingesetzt werden, wie unten noch ausführlicher beschrieben wird.
Ein anderes Verfahren auf Ölbasis, das angepaßt werden könnte für die Herstellung einer kombinatorischen Kristallisationsanordnung unter Verwendung von Tröpfchenvolumina in Picolitergröße ist das Verfahren des „schwimmenden Tropfens", das von Lorber et al. (1996) Journal of Crystal Growth 168:214-15 beschrieben wird. Bei dem Verfahren des schwimmenden Tropfens in Standardgröße werden zwei nicht mischbare Silikonöle, die verschiedene Dichten aufweisen, in einer Well-Platte eingesetzt, was es dem Kristallisationsexperiment erlaubt, an der Grenzfläche zu schwimmen. Ein typisches Paar von solchen Ölen ist Poly-3,3,3-trifluorpropylmethylsiloxan (FMS), welches hochverzweigt, dicht und viskos ist, und Polydimethylsiloxan (DMS), welches unverzweigt, weniger dicht und weniger viskos ist. Bei herkömmlichen Verfahren wird die Verteilung von FMS in Standard-96-Well-Platten durch seine hohe Viskosität verhindert, jedoch erleichtert die düsenlose akustische Abscheidung in verringertem Maßstab die Handhabung des FMS. Bei dem herkömmlichen Verfahren wird DMS auf dem FMS abgeschieden, gefolgt von der Versuchsflüssigkeit. Bei der Version mit verringertem Maßstab sind Mikrowells, die Abmessungen von etwa 65 μm Breite und Tiefe aufweisen und eine Kapazität von etwa 250 pL, ideal. 100 pL an DMS wird in jedem Well (mit dem offenen Ende nach unten) akustisch abgeschieden und wird obwohl es dazu neigt, zu laufen, an der Stelle durch Oberflächenspannung gehalten. Die Kristallisationslösung wird dann als ein Tröpfchen mit einem Volumen von etwa 2 pL bis 20 pL abgeschieden. Wenn das Gesamtversuchsflüssigkeitsvolumen gegen die obere Volumengrenze, 20 pL, geht, können multiple Tröpfchenabscheidungen erfolgreich verwendet werden, da individuell abgeschiedene wäßrige Tröpfchen zusammengehen werden. Der Abscheidung der Versuchsflüssigkeit folgt die Abscheidung von 100 pL an FMS in jedes Well, die viskose FMS-Versiegelung des Versuchs. Man beachte, daß durch das FMS eher Dampfdiffusion auftritt, als durch das DMS, wie bei dem Standardversuch mit dem schwimmenden Tropfen. Dies wird typischerweise von Vorteil sein, da eine langsamere Dampfdiffusion gewöhnlich höherwertige Kristalle liefert. Alternativ kann die Oberseite von jedem Well durch die oben beschriebenen Verfahren der Mikrofabrikation mit Opferschicht so gestaltet sein, daß sie mit dem Umgebungsgas kommuniziert. Die Anordnung könnte auch umgekehrt werden, allerdings bei einer geringfügig höheren Temperatur als der äußersten Versuchstemperatur, allerdings kann dieses Verfahren in Abhängigkeit von dem Verhalten von FMS größere Wells erfordern. Die Flüssigkeitsreservoirs für das Lösungsmittel können auch durch Mikrofabrikation bereitgestellt werden.
Relativ dichte Anordnungen von Tröpfchen mit kleinen Volumina können ohne jedes Lösungsmittelreservoir eingesetzt werden. Solche Anordnungen können eine Ölbeschichtung erfordern, um Kristalle von hoher Qualität zu liefern, die für die Hochauflösungs-Röntgenstrahl-Kristallstrukturanalyse geeignet sind, oder nicht. Diese Anordnungen sollten von der Atmosphäre isoliert sein, und falls sie in einem hinreichend kleinen Volumen eingeschlossen sind, werden die Tröpfchen, die nicht kristallisieren als eine Art Diffusionssenke für überflüssiges Lösungsmittel in den kristallisierenden Tröpfchen dienen (der Lösungsmittelüberschuß wird bedingt durch die Abreicherung des gelösten Stoffs durch die Kristallisation). Alternativ können die Reservoirs leicht für Tröpf chenanordnungen im Mikromaßstab hergestellt werden, z.B. können Mikrokanäle eine gegebene Anzahl von angeordneten Tröpfchen so umgeben, daß kein Tröpfchen größer ist als der gewünschte Abstand von einem Flüssigkeitsreservoir. Etwas kompliziertere Protokolle der Mikrofabrikation können eingesetzt werden, um Mikrowell-Reservoir-Tröpfchenstellen zu erzeugen.
Die akustische Technologie kann auch verwendet werden, um das Auftreten und das Voranschreiten der Proteinkristallisation anzuzeigen: Durch das akustische Scannen nach naszierenden Kristallen und anschließend durch das Scannen in periodischen Abschnitten an den Orten, an denen Kristalle erfaßt wurden. Gegenwärtig wird das Screening der Kristallgrößen mit einem optischen Mikroskop durchgeführt, im allgemeinen gemeinsam mit einem Bildgewinnungssystem. Allerdings ist das optische Screening häufig nicht geeignet, um zwischen Proteinkristallen und Pufferkristallen zu unterscheiden, da es keine Informationen über die Zusammensetzung liefert. Pufferkristalle neigen dazu, dichter zu sein und einen niedrigeren Wassergehalt als Proteinkristalle aufzuweisen. Die im allgemeinen schwache intermolekulare Bindung von Biomakromolekularkristallen im Vergleich zu den kovalenten, metallischen oder ionischen Bindungen der meisten nicht-biomakromolekularen Kristalle führt zu Abweichungen in den mechanischen Eigenschaften. Akustische Wellen werden durch die mechanischen Eigenschaften des Mediums, durch welches sie sich bewegen, beeinflußt. Daher sind akustische Wellen dazu in der Lage, nicht-biomakromolekulare von biomakromolekularen Kristallen zu unterscheiden. Die Anwendung von akustischen Impulsen auf eine Lösung von Kristallen und die Messung der hieraus hervorgehenden akustischen Signale kann dementsprechend eingesetzt werden, um Pufferkristalle von Proteinkristallen zu unterscheiden. Darüber hinaus sind akustische oder sonare Bildgebungsverfahren (z.B. akustische Mikroskopie) von ausgezeichneter Empfindlichkeit für die Größe von jeglichen bildlich erfaßten Kristallen. Daher kann die akustische Pulstechnologie verwendet werden, um die Größe, und, noch wichtiger, die Zusammensetzung eines wachsenden Kristalls zu bestimmen, ohne daß komplizierte Diffraktometrieverfahren erforderlich sind. Die akustische Pulstechnologie kann auch verwendet werden, um die Kinetik von Keimbildung und Wachstum des Kristalls zu untersuchen.
Sobald biomakromolekulare Kristalle hergestellt sind, müssen sie üblicherweise während der Lagerung und während der Röntgenstrahl-Beugungsversuche kühl gehalten werden. Die fokussierte akustische Energie kann leicht verwendet werden, um Kristalle bei niedrigen Temperaturen (z.B. bei etwa 4°C oder weniger) zu handhaben, indem sie an die Oberfläche gezwungen werden und dann ausgestoßen werden. Die Kristalle können unmittelbar in Kapillaren oder Mikrokapillaren mit einem geschlossenen Ende ausgestoßen werden, die dann in ein Diffraktometer eingestellt werden können. Kleinere Mikrokristalle, die aus Versuchen mit verringertem Maßstab, bei welchen die akustische Handhabung von Reagens enthaltenden Picoliter-Tröpfchen einsetzt wurden, erhalten wurden, können durch akustische Abscheidung in im Mikromaßstab hergestellten Kristallfassungen gefaßt werden.
Die Impfung mit Kristallen kann verwirklicht werden durch die ADE-Abscheidung von Kristallfragmenten, die in einer geeigneten Flüssigkeit, häufig die Mutterlauge, aus der die Kristalle gezogen wurden, suspendiert sind. Die Impfung durch den akustischen Tröpfchenausstoß ist für viele Verfahren zum Anziehen von Kristallen anwendbar, es ist jedoch insbesondere nützlich bei der Kristallisation von Biomakromolekülen, da es diese im allgemeinen seltenen Moleküle einspart. Falls aus Versuchen mit kleinen Volumina erhaltene Kristalle nicht hinreichend groß sein sollten, um hochauflösende Strukturen aus den Beugungsdaten zu liefern, sind diese aber in anderer Weise von hinreichender Qualität, so können die Versuche maßstabsgetreu vergrößert werden bis zu Volumina in der Größenordnung von Nanolitern, wie z.B. 40 nl, und die Originalkristalle können verwendet werden, um die maßstabsgetreu vergrößerten Versuche anzuimpfen. Erhaltene Kristalle, die von unzureichender Qualität sind, können für weitere Kristallisationsansätze wieder gelöst werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sing geeignet für die Optimierung der Kristallisation von Biopolymeren und anderer Biomakromoleküle, insbesondere solcher Biomakromoleküle, die eine Konformationsstruktur aufweisen, einschließlich beispielsweise Proteine und verschiedene Klassen an RNAs. Die Konformation betrifft Strukturebenen, die höher liegen als die Primärstruktur oder die Monomersequenz, einschließlich sekundärer, tertiärer und quartärer Struktur. Von der Konformation wird großzügig angenommen, daß sie komplex ist und von einer Anzahl von Faktoren abhängt. Im Idealfall ist die ausgebildete Konformationsstruktur unabhängig von den Kristallisationsbedingungen, wobei dies nicht notwendigerweise der Fall ist (Creighton, Proteins, 2. Auflage, W. H. Freeman, 1993). Es kann eine Analogie gezogen werden zu der Faltung von Proteinen, die ebenfalls hochempfindlich für Umgebungsbedingungen ist (Creighton, Proteins, supra).
Die Kristallisation von Proteinen und anderen Biomakromolekülen, einschließlich Biomakromolekülen, die sekundäre, tertiäre oder quartäre Strukturen aufweisen, ist typischerweise schwierig und zeitaufwendig (Creighton, Proteins, supra, McRee, Practical Protein Crystallography, supra). Ein Grund ist die niedrige Löslichkeit dieser Verbindungen, was zu einer niedrigen Konzentration an gelöstem Stoff führt, was wiederum die Wahrscheinlichkeit der Keimbildung und der Kristallwachstumsereignisse verringert. Weitere Gründe schließen ein: Das hohe Molekulargewicht und die demzufolge niedrige Diffusion, komplexe molekulare Gestalten, die präzise angeordnet werden müssen, und allgemein schwache intermolekulare Bindung. Diese Faktoren führen im Hinblick auf die Unterschiede zwischen kleinen Molekülen und Makromolekülen zu wichtigen Schlußfolgerungen, die die vorliegende Erfindung betreffen. Zunächst diffundieren große Moleküle in Lösung langsamer als kleine Moleküle (siehe Atkins, Physical Chemistry, W. H. Freeman, 1998). Dies beeinflußt die Kinetik der Keimbildung und des Kristallwachstums. Die Kinetik der Kristallausbildung wird beeinflußt durch den Diffusionskoeffizienten in dem Maße, daß der Prozeß diffusionskontrolliert ist. Die Kristallisation reichert die Kristallisationskomponente aus der Lösung in der Nähe der Flüssigkeits-/Kristallgrenzfläche ab, so daß frischer Nachschub an Komponente aus der Flüssigkeitsmasse diffundieren muß, um die Kristallisation fortzusetzen. Demzufolge ist es bei kleinen, schnell diffundierenden Molekülen wahrscheinlicher, daß sie einen Keim bilden, als bei großen Molekülen, und Kristall von kleinen Molekülen werden im allgemeinen schneller wachsen als die von großen Molekülen. Die stochastische Natur der Keimbildung legt nahe, daß viele Versuche mit identischen die Keimbildung ermöglichenden Bedingungen einige Keimbildungsereignisse liefern. Daher ist in den Fällen einer schwierigen Keimbildung eine große Zahl von Versuchsparallelen gerechtfertigt. Aller dings sind viele Biomakromoleküle schwer herzustellen, zu isolieren und aufzureinigen, so daß die zur Verfügung stehenden Mengen für kombinatorische und Kristallisationsparallelversuche gewöhnlich gering sind.
Besonders schwer zu kristallisieren sind Transmembranproteine. Diese Proteinmoleküle erstrecken sich über zelluläre Membranen, so daß die Masse des Moleküls in der lipidreichen Membran selbst vorliegt, während Teile des Proteins sich in das wäßrige Cytoplasma und/oder die extrazelluläre Flüssigkeit erstrecken. Ein solches Protein, das verschiedene hydrophobe und hydrophile Bereiche aufweist, hat im allgemeinen eine komplexe Konformation, die von ihrer ursprünglichen zellulären Umgebung abhängt. Sobald es aus seiner ursprünglichen zellulären Umgebung entfernt wird, inentweder eine wäßrige oder eine nicht-wäßrige Flüssigkeit, ändert sich seine Konformation drastisch. Die Kristallisation von Transmembranproteinen in einer Weise, die deren ursprünglicher Struktur bewahrt, ist daher eine große Herausforderung. Einige solcher Proteine, wie z.B. Bacteriorhodopsin, wurden kristallisiert, indem man eine Salzfällung nach der Lösung und Stabilisierung der hydrophoben Oberflächen mit Octylglucosid vornahm (Michel et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1283-5), eine Leistung, die dem erfolgreichen Kristallographen den Nobelpreis einbrachte. Alternativ erfaßt ein Verfahren, das als zweidimensionale Elektronenkristallographie (2DEC) bezeichnet wird, Membranproteine bildlich, die zweidimensionale Kristalle oder geordnete Anordnungen ausbilden. Obwohl die 2DEC nicht unter dem Phasenproblem der Röntgenstrahl-Kristallographie leidet, sind die berechneten Strukturen von geringer Auflösung. Die gegenwärtige allgemeine Gültigkeit von 2DEC, um Strukturinformationen für Transmembranproteine zu erhalten, spiegelt die Schwierigkeiten wieder, um dreidimensionale Kristalle von hoher Qualität zu erhalten.
Der Fachmann wird sofort verstehen, daß zusätzlich zu der Bereitstellung von Proteinkristallisationsversuchen, die sehr niedrige Flüssigkeitsvolumina einsetzen, um die Schnelligkeit und die Zahl von möglichen Versuchen mit begrenzten Mengen an Proteinen zu erhöhen, der akustische Ausstoß von nicht mischbaren Flüssigkeiten ein verbessertes Verfahren bereitstellen kann, um zwei- und insbesondere dreidimensionale Kristalle von Transmembranproteinen zu erzeugen. Z.B. können Mizellen, die verankerte Proteine enthalten, durch akustischen Ausstoß an Stellen abgeschieden werden, die kleine Flüssigkeitsvolumina (z.B. Picoliter) enthalten. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um Phospholipid-Doppelschicht-Liposome abzuscheiden, die verschiedene Bedingungen im Inneren und im Äußeren des Liposoms aufweisen, und die ein Transmembranprotein aufweisen, das die Doppelschicht durchzieht mit Anteilen innerhalb des und Anteilen außerhalb des Liposoms. Außerdem können zweidimensionale Kristalle von Transmembranproteinen, die in einer Doppelschicht verankert oder eingebettet sind, auf eine Substratoberfläche ausgestoßen werden und in Anordnungen gestapelt werden, die Inter-Protein-Wechselwirkungen ermöglichen (z.B. mit einem extern verankerten Protein), um die Konstruktion eines geeigneten dreidimensionalen Kristalls zu versuchen.
Die detaillierten Strukturen von Proteinen und anderen Biomakromolekülen von höher geordneter Struktur, einschließlich Nukleinsäuren, können noch schwieriger zu erhalten sein durch Lösung oder andere NMR-Techniken als durch kristallographische Verfahren. Die NMR-Verfahren werden bevorzugt für kleinere Proteine oder für Proteine, die nicht kristallisieren, wie z.B. die Proteine der Hitzeschock-Protein-Klassen (HSPs), einschließlich der Steroid- und Retinoid-Rezeptoren und des Prion-Proteins (PrP). Es werden drei Grundmechanismen an dieser Stelle in Betracht gezogen, nach denen ein/e physikalisches/e oder chemisches/e Gebilde oder Bedingung, wie z.B. ein chemisches Mittel, den Kristallisationsprozeß beeinflussen kann und so die Wahrscheinlichkeit der Ausbildung von für die hochauflösende Röntgenstrahl-Kristallographie geeigneten Kristallen zu erhöhen. Erstens kann das/die physikalische oder chemische Gebilde oder Bedingung die Kristallbildung direkt fördern, indem die Thermodynamik oder Kinetik der Kristallisation beeinflußt wird. Zweitens kann das/die physikalische oder chemische Gebilde oder Bedingung eine bestimmte Konformation stabilisieren oder die Denaturierung während der Kristallisation verhindern. Drittens kann ein/e physikalische/s oder chemische/s Gebilde oder Bedingung die amorphe Aggregation des Polypeptids verhindern, wodurch die Faltung in eine strukturierte Konformation und die Kristallisation ermöglicht wird.
Manchmal kann das/die physikalische oder chemische Gebilde oder Bedingung in mehreren Rollen dazu dienen, die Wahrscheinlichkeit, Kristalle in kristallographischer Qualität zu erhalten, erhöhen. Beispielsweise können gelöste Ionen (wie z.B. Zn²⁺, Na⁺) verwendet werden, um die Ionenstärke zum „Aussalzen" der Kristalle durch Stabilisierung des kristallinen Zustands zu erhöhen. Harnstoff, ein chaotropes Mittel (d.h. ein Mittel, das die Strukturen unterbricht, insbesondere wasserstoffgebundenen Strukturen, chaotrope Mittel denaturieren Proteine, jedoch nicht DNA oder RNA) kann verwendet werden, um die Aggregation zu vermeiden und kann auch Ligand sein. Andere Liganden, die keine oberflächenaktiven Mittel oder chaotropen Mittel sind, können die Aggregation noch verringern, indem die Entfaltungsereignisse reduziert werden. Ein oberflächenaktives Mittel kann verwendet werden, um die Aggregation von Proteinen zu verringern, die exponierte hyrophobe Oberflächen aufweisen, und auch, um die ursprüngliche Konformation des Proteins zu stabilisieren. Tatsächlich können nicht-ionische oder zwitterionische oberflächenaktive Mittel oder ionische oberflächenaktive Mittel in der Gegenwart eines divalenten Ions, das die entgegengesetzte Ladung zu dem Ion des oberflächenaktiven Mittels aufweist, die Kristallisation fördern sowie die Aggregation verringern und eine ursprüngliche Konformation in einer wäßrigen Lösung stabilisieren.
Die gleiche chemische oder physikalische Bedingung kann unter manchen Umständen in kompetitiven Weisen wirken, um die Wahrscheinlichkeit der Kristallisation sowohl zu erhöhen als auch zu erniedrigen. Beispielsweise können sowohl hohe als auch niedrige Temperaturen die amorphe Aggregation verringern, der Fachmann auf dem Gebiet der Proteinchemie wird im allgemeinen jedoch sofort erkennen, daß sowohl hohe als auch niedrige Temperaturen die Denaturierung auch erhöhen können, was die Aggregation und die Destabilisierung der ursprünglichen Konformationen erhöhen kann.
Es wurden DNA-bindende Zinkfinger-Proteine kristallisiert und ihre Strukturen wurden bis zu einem hohen Auflösungsniveau in der Gegenwart von Zn²⁺ und von geeigneten Sequenzen an Doppelstrang-DNA bestimmt. Solche Kristalle umfassen Protein/DNA-Cokristalle, wobei das Protein an die spezifische verwandte DNA gebunden ist (Klug et al. (1995) FASEB J. 9(8):597–604). Wie von Klug et al. (1995) supra beschrieben wurde, wurde das Erfordernis von Zn²⁺ für die DNA-Bindung zunächst durch einen glücklichen Zufall in einem ungewöhnlich häufig vorhandenen Xenopus-Transkriptionsfaktor entdeckt, der ein aus 30 Resten bestehendes wiederholtes Sequenzmotiv aufweist, als ein Chelatbildner (EDTA) Zn²⁺ und andere zweiwertige Kationen entfernte und damit die DNA-Bindefähigkeit eliminierte. Letztlich wurde die Hypothese gefestigt, daß das wiederholte Sequenzmotiv, welches als das Zinkfingermotiv benannt wurde, eine unabhängige Minidomäne ausbildet, die ein Zinkion enthält, und das benachbarte Zinkfinger als Module kombiniert werden, um eine DNA-bindende Domäne auszubilden. Die DNA-Sequenz, die der Xenopus-Transkriptionsfaktor bindet, wurde identifiziert, was es ermöglichte, den DNA-Proteinkomplex zu kristallisieren, was zur Aufklärung der Kristallstruktur führte.
Proteinmoleküle können teilweise oder vollständig denaturiert werden, sogar in Anwesenheit eines stabilisierenden Liganden, durch Lösungsmittelbedingungen, wie z.B. pH-Wert, chemische Mittel, wie z.B. oberflächenaktive Mittel, Guanidin und Harnstoff, und physikalische Bedingungen, wie z.B. Temperatur. Bei Proteinen, die katalytische Aktivität aufweisen (d.h. Enzyme), wirkt das enzymatische Substrat als ein strukturstabilisierender Ligand, obwohl die substratgebundene Konformation nicht die einzige ursprüngliche Konformation ist. Teilweise denaturierte Proteine oder Polypeptide weisen wenigstens eine teilweise denaturierte Domäne auf, und schließen Proteine ein, bei denen alle Domänen vollständig denaturiert sind, außer einer lediglich teilweise denaturierten Domäne. Eine nicht-ursprüngliche Struktur in einem Enzym kann über die Inaktivität des Enzyms in der Gegenwart seines ursprünglichen Substrats identifiziert werden. Die Abgrenzung von ursprünglichen, ungeordneten ursprünglichen und denaturierten (nicht-ursprünglichen) Strukturen in anderen Proteinen, einschließlich Strukturproteinen, ist im Allgemeinen schwieriger.
Alle anderen Proteine als diejenigen, die großteils denaturiert sind, oder große Proteine, die keine reguläre Struktur jenseits ihrer Primär-(Sequenz-)Struktur aufweisen, werden allgemein als unter geeigneten Bedingungen kristallisierbar betrachtet. Diese Bedingungen können die Gegenwart von einem oder mehreren Liganden einschließen. Der Begriff "Ligand" umfaßt anorganische und organische Ionen, kleine anorganische oder organische Moleküle und Biopolymere, einschließlich Oligo- und Polypeptide, Oligo- und Polynukleotide, Peptidoglykane und Mukopolysaccharide. Die Beispiele für anorganische Ionen-Liganden schließen divalente Kationen, wie z.B. Mg²⁺, Zn²⁺ und Ca²⁺, ein. Die bekannten Beispiele der organischen Molekül-Liganden schließen Steroide und Retinoide ein, die an ein Protein der Klasse der Hitzeschockproteine (HSP) binden können.
Salze und andere Mittel, die gewöhnlich verwendet werden, um Biomakromolekül-Kristallisation aus der Lösung zu induzieren, allerdings in Mengen, von denen angenommen wird, daß sie ungenügend sind, um als Fällungsmittel bezeichnet zu werden, schließen ein: Calciumchlorid-Dihydrat, Trinatriumcitrat-Dihydrat, Magnesiumsulfat-Hexahydrat, Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat, Lithiumsulfat-Monohydrat, Magnesiumacetat-Tetrahydrat, Natriumacetat-Trihydrat, Monokalium-Dihydrogenphosphat, Zinkacetat-Dihydrat, Calciumacetathydrat, Natriumchlorid, Hexadecyl-Trimethyl-Ammoniumbromid, Kobaltchlorid-Hexahydrat, Cadmiumchlorid-Dihydrat, Kaliumnatriumtatrat-Tetrahydrat, Eisenchlorid-Hexahydrat, Mononatrium-Dihydrogenphosphat, Caesiumchlorid, Zinksulfat-Heptahydrat, Cadmiumsulfathydrat, Nickel(II)chlorid-Hexahydrat, Monoammonium-Dihydrogenphosphat und Dioxan. Die üblicherweise verwendeten Konzentrationen sind leicht abschätzbar. Diese Mittel werden gewöhnlich in viel höheren Konzentrationen als Fällungsmittel verwendet. Da die akustische Abscheidung die Verdünnung in den Tröpfchen erlaubt, kann eine breite Verschiedenheit an Konzentrationen in kombinatorischen Anordnungen leicht ausprobiert werden.
Die Puffer, die üblicherweise für Biomakromolekül-Kristallisationen verwendet werden, schließen in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann offensichtlich oder für ihn leicht erhältlich sind, ein: Natriumacetat-Trihydrat (pH-Wert 4,6), Tris-Hydrochlorid (pH-Wert 8,5), HEPES (pH-Wert 7,5), TRIS (pH-Wert 8,5), HEPES-Na (pH-Wert 7,5), Natriumkakodylat (pH-Wert 6,5), Trinatriumcitrat-Dihydrat (pH-Wert 5,6), Natriumacetat-Trihydrat (pH-Wert 4,6) und Imidazol (pH-Wert 6,5). Für die Puffer gilt, daß der pH-Wert derjenige einer 1,0 M Stammlösung (0,5 M für MES) vor der Verdünnung mit anderen Reaktionskomponenten ist, und eine typische Konzentration ist 0,1 M. Der pH-Wert kann mit HCl oder NaOH, wie es üblich ist, eingestellt werden.
Die Fällungsmittel, die üblicherweise für die Biomakromolekül-Kristallisation verwendet werden, schließen in verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen, die dem Fachmann offensichtlich oder für ihn leicht erhältlich sind, ein: 2-Methyl-2,4-Pentandiol (MPD), Kaliumnatriumtartrat-Tetrahydrat, Monoammonium-Dihydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumformiat, Natriumacetat, Trinatriumcitrat-Dihydrat, 2-Methyl-2,4-Pentandiol, Polyethylenglykol 400, Polyethylenglykol 1000, Polyethylenglykol 1500, Polyethylenglykol 4000, Polyethylenglykol 6000, Polyethylenglykol 8000, Polyethylenglykol 10000, Polyethylenglykol 20000, Polyethylenglykol-Monoethyläther 2000, Polyethylenglykol-Monoethyläther 5000, Polyethylenglykol-Monoethyläther 550, Ethylen-Iminpolymer, Tert-Butanol, Jeffamine® C6007, Natriumacetat-Trihydrat, Isopropanol, Ethanol, Imidazol, 1,6-Hexandiol, Ethylenglykol, wasserfreies Glycerol, Lithiumsulfat-Monohydrat, Natriumchlorid, Natriumformiat, Mononatrium-Dihydrogenphosphat, Magnesiumformiat, Magnesiumchlorid-Hexahydrat und Dioxan.
Die oberflächenaktiven Mittel, die für die biomakromolekulare Kristallisation verwendet werden, schließen diejenigen ein, die anionisch, kationisch, zwitterionisch und nicht-ionisch sind. Die Beispiel von üblicherweise verwendeten oberflächenaktiven Mitteln schließen ein: Natriumdodecylsulfat, Natriumlaurylsulfat, Glycerol und Octylglucosid. Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, wie z.B. Glycerol und Octylglucosid, werden typischerweise verwendet, um exponierte hydrophobe Oberflächen zu stabilisieren und Proteine gegenüber der Fällung löslich zu machen. Die in der Proteinchemie häufig verwendeten chaotropen Mittel schließen Harnstoff und Guanidin ein.
Beispiele für Kombinationen und Konzentrationen von Trennungsmitteln schließen ein: (i) 20% V/V Isopropanol und 20% m/V Polyethylenglykol 4000, (ii) 10% V/V Isopropanol und 20% m/V Polyethylenglykol 4000, (iii) 2% V/V Polyethylenglykol 400 und 2,0 M Ammoniumsulfat, (iv) 10% m/V Polyethylenglykol 8000, 8% V/V Ethylenglykol, (v) 10% m/V Polyethylenglykol 6000, 5% V/V MPD, (vi) 2% m/V Polyethylenglykol 8000 und (vii) 15% m/V Polyethylenglykol 8000.
Die Möglichkeit, gemäß der Erfindung eine verdünnende und nicht-verdünnende Zugabe an Flüssigkeiten zu den Lösungen des Biomakromoleküls der Kristallisationsreagenzien, der bekannten oder postulierten Liganden und dergleichen durchzuführen sind leicht offensichtlich. Zum Beispiel wird die Zugabe von Wasser alle vorliegenden Komponenten in einem Tröpfchen oder Reservoir, in welchem die experimentelle Kristallisation durchgeführt wird, verdünnen. Die Zugabe von Wasser, welches das Biomakromolekül in der gleichen Konzentration wie in dem Versuchströpfchen enthält, wird alle Bestandteile des Tröpfchens verdünnen, außer dem Biomakromolekül. Wie bereits oben erwähnt, kann die in-situ-Erfassung von naszierenden Kristallen, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, es ermöglichen, in einem Versuch der ersten Generation, welcher häufig ein Screeningversuch ist, Kristalle von hoher Qualität zu produzieren.
Das Screening wird häufig in einem Anordnungsformat durchgeführt, bei dem man die üblichen Fällungsmittel in einem breiten Bereich an Konzentrationen und pH-Werten verwendet (Stura et al. (1994) Acta Crystallor. D50:448-55). Um die Zahl von Anordnungsstellen in einer Löslichkeit-Screeninganordnung zu verringern, kann häufig ein Verdünnungsverfahren angewandt werden. Zum Beispiel beschreibt McRee, Practical Protein Crystallography, supra, ein Verdünnungsverfahren, bei dem eine Lösung, die das präzipitierte Protein enthält, mit Wasser verdünnt wird, was es ermöglichen mag, daß sich Protein-Mikrokristalle, die sich entlang des amorphen Präzipitats ausgebildet haben, größere Kristalle animpfen, wenn sich das Präzipitat löst. Der akustische Ausstoß von minutiösen Volumina erlaubt die langsame Verdünnung und kann es ermöglichen, daß die anfängliche Löslichkeits-Screeningstufe ein Kristallisationsversuch der ersten Generation wird, der Kristalle von hoher Qualität liefert.
Es gibt viele Streuungs- und Absorptionsmechanismen für akustische Wellen, die durch eine Suspension von Partikeln in einem flüssigen Medium propagieren. Diese schließen ein: thermische Transportverluste, Reibugswiderstand, akustische Streuung und akustischer Verlust innerhalb der Partikel an sich. Diese Absorptionsmechanismen werden gut beschrieben von Allegra et al. (1972) Journal of the Acoustical Society of America 51(5):1545–1564. Für die akustischen Frequenzbereiche, die gegenwärtig von Interesse sind, wird davon ausgegangen, daß der dominante Verlustmechanismus die akustische Streuung ist. Demzufolge wird, wenn eine kohärente akustische Welle durch eine Partikelsuspension in einer Flüssigkeit propagiert, die Welle von den Partikeln gestreut, und die gestreute Energie wird als ein Verlust durch einen kohärenzempfangenden Wandler gemessen. Die Partikel können beispielsweise Proteinkristalle oder Salzkristalle bei einem Proteinkristallisationsversuch sein. Es wird unten gezeigt werden, daß von der akustischen Streuung erwartet wird, daß sie sehr viel empfindlicher für das Vorliegen von Proteinkristallen ist, und daher eine vielversprechende Methode für die Messung der Proteinkristallkonzentration darstellt, sogar in der Gegenwart von anderen Hintergrundpartikeln, wie z.B. Salzkristallen.
Der Streuungsbedingte akustische Dämpfungskoeffizient α₅ in einer Flüssigkeitssuspension wird beschrieben durch das gut bekannte Verhältnis: α5 = (1/2a) ε k4a4(1/3[1 – κ/κ']2 + [(ρ' – ρ)/(2ρ' + ρ)]2) wobei ε die Volumenfraktion einer bestimmten Substanz in der Suspension ist, k die akustische Wellenzahl in der Flüssigkeit ist (k = 2π/λ = 2πf/c, wobei λ die akustische Wellenlänge in der Flüssigkeit ist, f die akustische Frequenz ist und c die akustische Kompressionsgeschwindigkeit in der Flüssigkeit ist), a der Radius des Partikels ist, κ und κ' jeweils die Kompressionsmodule der Flüssigkeit und des Partikels sind und ρ und ρ' sind die Massendichte von jeweils Flüssigkeit und Partikel. Man beachte, daß der akustische Dämpfungskoeffizient nach k⁴a⁴ variiert, was später noch ausführlicher diskutiert wird. Gleichung (1) gilt für Werte von (ka) < 0,5 und für vernünftig verdünnte Lösungen, bei denen multiple Streuungsereignisse vernachlässigbar sind. Für Partikel von wenigen Mikrometern Größe korrespondiert diese Bedingung mit einer akustischen Wellenlänge von λ ~ 10 μm in der Flüssigkeit. Mit einer typischen Flüssigkeitsgeschwindigkeit von 1500 m/s korrespondiert dies wiederum mit einer akustischen Frequenz von 150 MHz. Es kann daher davon ausgegangen werden, daß das obige Verhältnis für akustische Frequenzen < 150 MHz und für Partikel von mehreren Mikrometern Größe gültig ist.
Wir zeigen nun, daß erwartet wird, daß die akustische Streuung für Proteinkristalle viel stärker ist als für Kristalle vom Salztyp. Man nehme an, daß das Kompressionsmodul und die Dichte eines Proteinkristalls jeweils 4,5e07 N/m² und 0,6e03 Kg/m³ betragen. Man nehme an, daß das Kompressionsmodul und die Dichte eines Salzkristalls jeweils 1,e11 N/m² und 2,2e03 Kg/m³ betragen. Man nehme an, daß das Kompressionsmodul und die Dichte einer wasserähnlichen Flüssigkeit jeweils 2,3e09 N/m² und 1e03 Kg/m³ betragen. Setzt man diese Werte in Gleichung (1) ein, erhält man die folgenden akustischen Dämpfungskoeffizienten in der Flüssigkeit: Protein in Wasser: α5 = 420 ε k4a3 [m–1] Salz in Wasser: α5 = 0,2 ε k4a3 [m–1]
Daraus geht hervor, daß der Dämpfungskoeffizient etwa 2000 mal größer für die Suspension an Proteinkristallen ist als für die Suspension an Salzkristallen. Daher wird bei vergleichbaren Volumenkonzentrationen die akustische Dämpfung von der Streuung durch die Proteinkristalle dominiert werden. Man beachte, daß dieser große Unterschied im Streuungsverhalten zwischen den Protein- und Salzkristallen primär bedingt wird durch die Differenz der Kompressionsmodule der zwei Materialien.
Nebenbei wird angemerkt, daß die akustische Geschwindigkeit in den Proteinkristallen 275 m/s beträgt, während die akustische Geschwindigkeit im Salz 6700 m/s beträgt. Bei verdünnten Lösungen wird die akustische Geschwindigkeit der Suspension gegenüber der der reinen Flüssigkeit in einer Größe verändert werden, die zu der Volumenkonzentration der Partikel multipliziert mit der akustischen Geschwindigkeit der Partikel proportional ist. Es wäre daher zu erwarten, daß die Gegenwart von suspendierten Proteinkristallen die akustische Gesamtgeschwindigkeit einer Flüssigkeit reduzieren würde, während die Geschwindigkeit einer Flüssigkeit durch die Anwesenheit von suspendierten Salzkristallen erhöht würde. Daher würde eine Information über die akustische Ge schwindigkeit, die inhärent erhältlich wäre aus der Dämpfungsmessung, auch eine Information liefern, die das Vorliegen von suspendierten Protein- und Salzkristallen betrifft.
Die Gleichung (1) ist gültig für Werte von (ka) < 0,5. Für größere Werte an ka wird der Dämpfungskoeffizient weniger stark abhängig von dem Wert von (ka), und für (ka) » 1 ist der Dämpfungskoeffizient von der akustischen Frequenz unabhängig. Es besteht daher eine beachtliche Veränderung in der Abhängigkeit des Dämpfungskoeffizienten α₅ von (ka), die bei (ka) ~ 1 auftritt. Es kann möglich sein, diese Veränderung zu verwenden, um die Größe der Proteinkristalle in einer Suspension zu bestimmen, z.B. indem man die akustische Frequenz über einen Bereich von Werten durchfährt, die mit den Werten von (ka) unter und in der Nähe von Eins korrespondiert. Die über diesem Frequenzbereich gemessene Dämpfung würde dann eine charakteristische Abhängigkeit aufweisen (z.B. proportional mit f⁴ bei niedrigeren Frequenzen und würde weniger abhängig von f werden, sobald (ka) Eins erreichen würde). Ein solches Durchfahren einer akustischen Frequenz könnte innerhalb eines Bersttonpulses vorgenommen werden, der allgemein als "chirped tone burst" bezeichnet wird, und das empfangene akustische Signal könnte dann Informationen liefern, die sowohl das Vorliegen als auch die Größe von Proteinkristallen in einer Flüssigkeitssuspension betreffen. Für Partikel mit Mikrometer-Abmessungen ist es nützlich, daß die Bedingung ka ~ 1 in Wasser für akustische Frequenzen der Größenordnung ~ 100 MHz auftritt.
Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die akustische Erfassung, da für die Handhabung der Lösungen von Biomakromolekülen und Reagenzien für die Kristallisation bereits ein akustischer Wandler eingesetzt wird. Daher wird die akustische Erfahrung von suspendierten Partikeln in situ in einer kombinatorischen Anordnung der Erfindung möglich, allein durch den Zusatz eines akustischen Sensors oder anderer datensammelnder Mittel. Die akustischen Sensoren brauchen nicht sperrig zu sein. Darüber hinaus kann die Datensammlung nahezu unmittelbar nach dem Ausstoß durchgeführt werden, was beispielsweise Verdünnungsexperimente erleichtert. Bei solchen Experimenten kann die Auflösung von Präzipitat und das Wachstum von Kristallen unmittelbar nach jedem Verdünnungsschritt bestimmt werden und schließlich in periodischen Abständen danach, und die Entscheidung, ob weiter verdünnt werden soll, kann schnell getroffen werden, wodurch eine mögliche Überverdünnung vermieden wird (die auftreten kann bei der Anwendung von traditionellen optischen Verfahren, die nicht in der Lage sein können, die initiale Ausbildung von Mikrokristallen zu erfassen). Andererseits würden die Entscheidungen über solche Verdünnungen möglicherweise erst nach einer beträchtlichen Zeit zur Bestimmung, ob Kristalle gewachsen sind, erfolgen.
Die Fortschritte bei Röntgenstrahlquellen, die die Bestimmung der Kristallstruktur von immer kleineren Kristallen ermöglichen, erlauben auch Beugungsexperimente in situ von Kristallen in einem dichten Anordnungsformat. Anstatt hinreichend Daten aufzuzeichnen, um die Struktur zu lösen, können solche Versuche entworfen werden, um die Steilen zu überprüfen, an denen sich Biomakromolekülkristalle ausgebildet haben, die durch akustische Verfahren bestimmt wurden, und es kann bestimmt werden, ob die Beugungsqualität kristallographische Strukturen hoher Auflösung liefern würde, wenn genug Beugungsdaten aufgenommen würden. Ob ein Kristall die minimale Grö ße für die hochauflösende Diffraktometrie erreicht hat, kann akustisch bestimmt werden. Ein integriertes System, das die akustische Handhabung von Flüssigkeitströpfchen einsetzt, die akustische Erfassung von Biomakromolekülkristallen in situ und die Abschätzung der Kristallqualität in situ ist möglich. In einigen Fällen können nach der Bestimmung der Kristallqualität Verdünnungsverfahren eingesetzt werden, um die Rekristallisation in situ zu versuchen, um qualitativ höherwertigere oder größere Kristalle auszubilden. Für langsames Kristallwachstum können Verfahren eingesetzt werden, die die Dampfdiffusion kontrollieren, einschließlich der Microbatch-Verfahren, die das Versuchströpfchen mit Öl abdecken, und dem Dampfdiffusions-Kontrollverfahren, bei dem das Reservoir mit Öl abgedeckt wird. Diese Verfahren wurden oben beschrieben und einige werden ausführlicher in den folgenden Beispielen beschrieben.
Der Fachmann wird erkennen, daß weitere Aspekte der Proteinkristallherstellung von der Erfindung umfaßt werden, obwohl sie nicht im Detail beschrieben sind. Zum Beispiel können Proteinkristalle, die Metallsubstituenten aufweisen, nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum erzeugt werden, wobei die akustische Abscheidung eine kombinatorische Versuchsanordnung mit Metallösungen und Kristallfragmenten ermöglicht. Ein angenehmer Weg auf Metallsubstitution zu testen, wäre der Einsatz von Anordnungen von Metallösungen, wie es hierin beschrieben wurde. Auch die Bestimmung von Liganden kann durch Anordnungsverfahren, die durch die akustische Abscheidung erleichtert werden, erreicht werden. Die Anordnungen können sowohl Lösungen von Metallen als auch von Biomolekülen umfassen. (Insulin war erst dann kristallisierbar, als es in einem galvanisierten Behälter gelagert wurde, und das Erfordernis von divalentem Zink als einem Strukturliganden wurde später etabliert.) Die Anordnung von Kristallen in Kapillarröhren und die Handhabung von Kristallen, die unter flüssigem Stickstoff gelagert werden, wird ebenso erleichtert, genauso wie das Experimentieren mit Kälteschutzmitteln, die zum Schutz von Proteinen bei kalter Lagerung verwendet werden. Auch die Bestimmung der Bedingungen, die die amorphe Aggregation begünstigen, wird durch die kombinatorischen akustischen Abscheidungsverfahren erleichtert. Aufgrund des reduzierten Zeitmaßstabs für die Versuche, die mit Volumina von Picolitergröße erfolgen, kann eine breite Varianz an Temperaturen für Kristallisationsversuche angewandt werden, mit folglich geringen Bedenken hinsichtlich thermischer oder mikrobieller Degradation. Häufig wird Natriumazid (NaN₃) eingesetzt, um das Wachstum von Mikroben zu inhibieren, und es wurde gezeigt, daß es die Kristallqualität verringert, und eine Abnahme der erforderlichen Zeit, um einen Versuch abzuschließen (auf weniger als die typische Generationszeit von Mikroben) kann es ermöglichen, dessen Verwendung zu verringern. Schließlich besteht die Wahrscheinlichkeit, daß die akustische Energie verwendet werden kann, um kleine Kristalle zum Zwecke der Impfung zu zerschlagen.
Es sollte klar sein, daß, während die Erfindung im Zusammenhang mit den bevorzugten spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, die vorangehende Beschreibung die Erfindung erläutern soll und nicht deren Umfang begrenzen soll. Weitere Aspekte, Vorteile und Modifikationen werden dem Fachmann, an den sich die Erfindung wendet, offensichtlich sein.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung bereitzustellen, wie die Erfindung zu implementieren ist, und sollen den Umfang von dem, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, nicht beschränken. Es wurde darauf geachtet, die Genauigkeit im Hinblick auf die Zahlenwerte (z.B. Mengen, Temperaturen, etc.) sicherzustellen, aber es sollte berücksichtigt werden, daß manche Fehler und Abweichungen auftreten können. Sofern es nicht in anderer Weise angezeigt wird, sind Anteile Gewichtsanteile, ist die Temperatur in °C und liegt der Druck bei oder in der Nähe des Atmosphärendruckes.
Beispiel 1
Mikrobatch-Kristallisation:
Es wird ein Versuch durchgeführt, bei dem eine Matrix von 15.360 separaten Kristallisationsbedingungen eingesetzt wird, um zu versuchen, eine kleine Menge eines Proteins, das aus Rattenhirngewebe isoliert und aufgereinigt wurde, zu kristallisieren. Die Sequenz des Proteins ist bekannt, allerdings scheiterten Versuche, das Protein in E. coli zu exprimieren aufgrund der Aggregation des nicht-gefalteten Proteins. Die heuristische Sequenzhomologie-Analyse und das Computermodell weisen darauf hin, daß das Protein zu der HSP-Klasse gehört. Die spektroskopischen Verfahren ergaben einen signifikanten Umfang an Sekundärstruktur. Die ursprüngliche PAGE und SDS-PAGE bestätigten, daß das Isolat ein einzelnes Polypeptid hoher Reinheit ist und einen signifikanten Grad an ursprünglicher Konformationsstruktur unter nicht-denaturierenden Bedingungen aufweist. Das Liganden-Screening durch herkömmliche Verfahren ergab keine Liganden.
Die Proteinkonzentration liegt in dem Bereich von 1,5–200 mg/ml. Das kleine Flüssigkeitsvolumen ist insgesamt 40 Picoliter (pl) für jeden separaten Kristallisationsversuch und erfordert ungefähr 7,5 × 10^–3 μg an Proteinen für den gesamten Versuch (bei einer durchschnittlichen Kleinvolumen-Proteinkonzentration von etwa 14 mg/ml). Zum Zwecke der Erleichterung werden die Tropfen aufwärts auf die Unterseite einer silanisierten Glasplatte ausgestoßen. Mehrere Lösungen werden in dem fertigen Tropfen von 40 pl kombiniert, um 15.360 einzelne Versuche zu erzeugen. Es ist leicht zu verstehen, daß diese Versuche in Duplikaten, Triplikaten oder auch auf andere redundante Weise durchgeführt werden können, wie gewünscht. Die verschiedenen Pufferreagenzien, die eingesetzt werden, schließen ein: Natriumacetat, Natriumcitrat, 2[N-Morpholin]ethansulfonsäure (MES), N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-Ethansulfonsäure] (HEPES), TRIS (Tri[hydroxymethyl]aminomethan und Natriumborat. Die Polymere schließen ein: Polyethylenglykol (PEG) 6000, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, PEG-Monomethyläther (PEG MME) 550, PEG MME 2000, PEG MME 5000, Jeffamine M-600 und Jeffamine ED-2001. Die eingesetzten Salze und Metallsalze schließen ein: Eisenchlorid, Ammoniumsulfat, Caesiumchlorid, Zinksulfat-Heptahydrat und Nickel(II)chlorid. Die organischen Additive, die auf ihre Fähigkeit untersucht werden, die Wahrscheinlichkeit der Ausbildung von Kristallen in kristallographischer Qualität zu erhöhen, schließen ein: Dioxan, Imidazol, 1,6-Hexandiol, Tert-Butanol, wasserfreies Glycerol, Ethanol und Ethylenglykol. Anstatt einen rein kombinatorischen Ansatz anzuwenden (siehe vorangehende Beispiele), wird ein heuristischer kombinatorischer Ansatz angewandt, bei dem man bekannte Kristallisationsbedingungen für sequenzhomologieverwandte Proteine verwendet, die von der Biological Molecule Chrystalli zation Database (NIST/CARB BMCD) erhalten werden. Die aus dieser Datenbank erhaltenen Daten ermöglichen eine Eingrenzung der kombinatorischen Versuche auf 15.360 durch eine geeignete Auswahl von Reagenzien. Die BMCD-Daten deuten darauf hin, daß ein makromolekularer Struktur-Ligand unwahrscheinlich ist: die strukturell nächsten homologen Proteine benötigen keinen Liganden, um qualitativ hochwertige Kristalle auszubilden, und die bekannten Strukturen dieser Proteine haben keine biomolekularen Liganden.
Die Reagenzformulierungen oder Kristallisationsgemische werden in kombinatorischer Weise verteilt, wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben, um so viele wie 3840 verschiedene Pufferzusammensetzungen zu erzeugen. Diese Pufferzusammensetzungen sind in separaten Behältern enthalten, nämlich in Wellplatten-Wells. Drei 1536-Wellplatten liefern ein adäquates Lager für 3840 separate Lösungen. Lösungsvolumina von insgesamt 5 μl pro Well stellen mehr Volumen bereit, als für all die verschiedenen Kristallisationsversuchsexperimente benötigt wird. Außerdem finden die Kristallisationsversuche sowohl bei 25°C als auch bei 4°C statt und bei Proteinkonzentrationen von 50 mg/ml und 5 mg/ml. Deshalb werden insgesamt zehn 1536 Well-Platten verwendet werden, um 15.360 separate Kristallisationsversuche zu enthalten. Um die fertige Tropfenformulierungen oder die Versuchstropfen zu erzeugen, werden 20 pl an Proteinlösung mit 20 pl an bereits hergestellter Pufferlösung kombiniert werden.
Um der schnellen Dampfdiffusion der Versuchstropfen mit 40 pl vorzubeugen, wird ein Mikrobatch-Verfahren angepaßt an den Picoliter-Volumenmaßstab, der durch fokussierten akustischen Ausstoß erreichbar ist, wodurch man ein "Picobatch"-Verfahren erhält. Bei dem Verfahren werden Öle eingesetzt, um die Dampfdiffusionsrate zu variieren. Bei einem Standardaufbau für die Dampfdiffusion, bei dem ein hängender oder sitzender Tropfen angewandt wird, überzieht Paraffinöl den Versuchstropfen (Chayen et al. (1990) J. Appl. Cryst. 23:297). Bei dem modifizierten Microbatch-Verfahren wird ein Gemisch von Paraffin- und Silikonölen eingesetzt (Chayen et al. (1996) Journal of Crystal Growth 168:175-80). Bei dem Verfahren zur Kontrolle der Dampfdiffusionsrate (D'Arcy et al. (1997) J. Appl. Cryst. 30:198–202) werden bei Tröpfchenreservoir-Wells mit Standardgröße 200 Mikroliter an Öl über die Reservoirlösung aufgebracht. Bei jedem dieser Verfahren dient das Öl als eine Schranke für die Dampfdiffusion zwischen dem Reservoir und dem Tröpfchen. Das Paraffinöl erlaubt eine so beschränkte Kinetik der Dampfdiffusion, daß der Tropfen sich wie ein Batch-Experiment verhält. Silikonöl führt dazu, daß die Ergebnisse denen, für die kein Öl verwendet wurde, ähnlicher sind. Die konventionellen Microbatch-Verfahren erfordern, daß das Versuchströpfchen unter die Schicht des Öls pipettiert wird. Die Verwendung eines Gemischs von Paraffinöl und Silikonöl erlaubt die Feineinstellung der Dampfdiffusionsrate zwischen dem Tropfen und dem Reservoir. Die Rate der Dampfdiffusion ist auch eine Funktion der Dicke der Ölschicht, die über das Tröpfchen oder das Reservoir oder über beides gezogen wurde.
Bei den Microbatch-Verfahren wird ein Tropfen in ein Gemisch von Paraffinöl und Silikonöl eingekapselt. Je höher die Paraffinölfraktion, desto langsamer ist die Dampfdiffusionsrate. Ein Verhältnis von Paraffinöl zu Silikonöl von 2:1 wird bei diesen speziellen Versuchen verwendet.
Um die Verdampfung der Lösungen zu vermeiden, wird das Ölgemisch über die Kristallisationsgemische verteilt, bevor der Ausstoß auf das silanisierte Substrat über den Wells, die die Kristallisationsgemische enthalten, erfolgt. Beim Ausstoß von sowohl den Kristallisations- als auch den Proteinlösungen durch eine darüberliegende Schicht von nicht-mischbarem Öl werden die Versuchstropfen schnell in dem Ölgemisch eingekapselt. Diese schnelle Einkapselung wird die Dampfdiffusionsrate verlangsamen und die Kristallausbildung ermöglichen.
Um das Setup der Kristallisationsversuche zu vervollständigen, werden fünf 1536-Platten, die 7680 Versuchstropfen enthalten, bei 4°C gehalten und die anderen 7680 Versuchstropfen werden bei 25°C gehalten. Die Tropfen können akustisch auf die Ausbildung von amorphem Präzipitat, Proteinkristallen oder Pufferkristallen gescannt werden. Die Tropfen, die Proteinkristallausbildung aufzeigen, können leicht von den Puffersalzen unterschieden werden anhand deren verschiedenen akustischen Streuungseigenschaften. Um amorphes Präzipitat von Kristallen zu unterscheiden, kann die akustische Mikroskopie auch auf der Grundlage der Partikelgröße angewandt werden. Typischerweise übersteigen die Kristalldurchmesser die Größe von amorphen Präzipitatpartikeln, die aus denaturiertem oder aggregiertem Protein bestehen, bei weitem. Sobald Kristalle geortet wurden, können diese von den Versuchstropfen entfernt und für vorläufige Beugungsversuche verwendet werden, um die Qualität der Beugung zu bestimmen. Alternativ können Mikrokristalle akustisch zu einer Serie von Tropfen ausgestoßen werden, die neue Kombinationen an Kristallisationsreagenzien und dem Protein enthalten, um sie als Impfkristalle für weitere Kristallisationsversuche zu verwenden.
Beispiel 2
Kombinatorische Optimierung der Kristallisationsbedingungen für ein Protein mit flexibler Konformation (I):
Bei vielen Kristallisationsversuchen wird ein Versuch unternommen, Lösungsmittelbedingungen zu finden, unter denen homogene Kristalle erzeugt werden, die ein Beugungsmuster liefern, das die Lösung der Kristallstruktur bis zu einem hohen Auflösungsgrad ermöglicht (z.B. eine Auflösung von 3,5 Å oder weniger). Eine inhärente Flexibilität der Konformation des Proteins kann die Ausbildung von Kristallen hemmen oder verhindern. Beispielsweise ist es schwierig, das Prion-Protein in der zellulären Konformation (PrP^c) zu kristallisieren. PrP^c weist eine vorherrschende, zufällige Coil-Struktur auf, wobei die Quartärstruktur eine eher zufällige Konfiguration der Zufalls-Coil-Domäne und einer einfach gefalteten Domäne, die eine konventionelle Sekundär- und Tertiärstruktur aufweist, ist (Liu et al. (1999) supra; Zahn et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(1):145-50). Mittels Entfaltungs-Experimenten zeigten Jackson et al. (1999) Biochim Biophys Acta 1431(1):1–13, daß die Struktur von heterolog exprimiertem PrP von den Lösungsmittelbedingungen abhängt, wobei die disulfidbindungsreduzierte Sequenz abhängig vom pH-Wert die Annahme von sowohl einer PrP^c-ähnlichen als auch einer Scrapie-konformer-(PrP^Sc)-ähnlichen Struktur erlaubt. Es besteht daher die Möglichkeit, daß die zufällige Coil-Struktur in eine nicht-zufällige und demzufolge kristallisierbare Struktur umgewandelt werden kann, entweder durch die Auswahl von geeigneten Lösungsmittelbedingungen oder durch den Einsatz eines bisher nicht entdeckten Liganden oder durch eine Kombination von beidem. Die Suche nach geeigneten Lösungsmitteln, Liganden und anderer Mikroumgebungsbedingungen kann ergänzt werden durch die Verwendung von Varianten des Proteins, die Kristalle von hoher Qualität ausbilden könnten. Ein Beispiel für diesen Ansatz wird bereitgestellt durch frühe Untersuchungen des Myoglobins (Kendrew, J.C. und Parrish, R.G. (1956) Proc. R. Soc. Lond. A 238:522–527). Diese Untersuchungen zeigten, daß Walrat-Myoglobin-Kristalle von hoher Qualität lieferte, während andere Myoglobinvarianten daran scheiterten, zu kristallisieren. Da Walrat-Myoglobin einen hohen Grad an Sequenzhomologie mit humanem Myoglobin aufweist, könnten daraus strukturelle Schlüsse für die humane Form gezogen werden. Gleichsam wurde für Varianten des PrP mit Substitution einer einzelnen Aminosäure gezeigt, daß sie unterschiedliche Strukturstabilitätseigenschaften aufweisen (siehe z.B. Calzolai et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(15):8340-45).
In Zusammenhang mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Mutantenbibliothek von Proteinen über Standardverfahren erzeugt werden (stellengeleitete Mutagenese, fehlerfreudige PCR, gelenkte Evolution und dergleichen), und kleine Mengen an Proteinen können exprimiert und isoliert werden. Die hieraus hervorgehende Bibliothek von Proteinen kann dann einfach isoliert werden, indem man eine Glutathion-S-Transferase oder andere angenehme Affinitätsmarker einbindet. Eine große Matrix von 5.000 Proteinen könnte 1.000 verschiedenen Bedingungen unterworfen werden, was 5.000.000 verschiedene Versuche mit hängenden Tropfen ohne Verdopplung erfordern würde.
Verwendet man die Picolitertropfen-Technologie und einen nicht-verdünnenden Ansatz an, würde dies die Erzeugung von Well-Platten mit 50 Tropfen erfordern, von denen jede 100.000 verschiedene Lösungen enthält. Bei einem Protein- und Kristallisationslösungsverdünnungsansatz könnten 5.000 Proteinlösungen und 1.000 Kristallisationsbedingungslösungen eingesetzt werden, indem man Standard-1536-Wellplatten verwendet, um Anordnungen auf Deckstreifen auszubilden, die über herkömmlichen Setups mit hängendem Tropfen angeordnet werden. Für das Verfahren mit der Anordnung mit hängendem Tropfen würden Tröpfchen von 40 pl in einer Dichte von etwa 10.000/cm² angeordnet, wie aus den vorangehenden Beispielen offensichtlich hervorgeht. Ein solches Setup würde eine quadratische Fläche von 7 mm × 7 mm eines Deckstreifens mit 18 mm Durchmesser verwenden, was 5.000 Versuchsstellen pro Behälter für den hängenden Tropfen ermöglicht, wodurch insgesamt 1.000 konventionelle Behälter mit hängenden Tropfen erforderlich sind. Jeder Ansatz ist praktisch erreichbar. Die Ölbeschichtung der Tröpfchen ist bei beiden Verfahren möglich. Die Reservoirs der Setups mit dem hängenden Tropfen können ebenfalls mit Öl überzogen werden (Dampfdiffusionsverfahren). Die Tropfen-Wellplatten können in Kontakt mit einem Flüssigkeitsreservoir gebracht werden, welches mit Öl überzogen werden kann. Alternativ können 100-Tropfen-Wellplatten eingesetzt werden, wobei jedes andere Well lediglich Lösungsmittel enthält.
Beide Verfahren werden angewandt mit einer 10-fachen Duplizierung jedes Experiments. Da PrP^Sc einen beachtlichen Gehalt an hydrophobem β-Faltblatt aufweist, werden die PrP^c- enthaltenden Lösungen nicht mit einem Öl in Kontakt gebracht. Allerdings werden die Reservoirs mit hängendem Tropfen mit Öl überzogen. Um die Bedingungen zu variieren, wird das Tropfen-Well-Verfahren eingesetzt, bei dem jedes andere Well als ein Lösungsmittelreservoir verwendet wird, und es wird kein Öl zugegeben, um die Diffusion zu kontrollieren. Die initialen Versuche werden durchgeführt, indem man hPrP(121–230) mutiert. Anstelle der zufälligen kombinatorischen Mutation der gesamten Sequenz wird mit den cDNA-Sequenzen, die Aminosäuresequenzregionen von PrP(121–230) kodieren, für die bereits gezeigt wurde, daß sie weniger strukturiert sind und empfänglich sind, mehr strukturiert zu werden, und zusätzlich mit den flankierenden Bereichen eine fehlerfreudige PCR durchgeführt. Die mutierten Sequenzsegmente werden dann mit dem Rest der kodierenden cDNA-Sequenz verbunden, um die Versuchsproteine zu erzeugen.
Die Tropfen-Well-Platten oder die Deckstreifenanordnungen mit hängendem Tropfen können mittels der scannenden akustischen Mikroskopie schnell nach naszierenden Kristallen gescannt werden. Mit diesem Verfahren werden Pufferkristalle und Proteinkristalle einfach voneinander unterschieden. Die Wells oder die hängenden Tropfen, in denen naszierende Kristalle detektiert wurden, werden leicht verdünnt. Die Tropfen-Wells oder Anordnungsstellen, die Proteinkristalle enthalten, werden dann weiterhin durch scannende Diffraktometrie hinsichtlich der Kristallqualität evaluiert. Die Kristalle hoher Qualität werden gesammelt und von den Proteinen, die zu der Ausbildung von Kristallen hoher Qualität führen, werden mehr synthetisiert, und die erzeugten Kristalle werden in maßstabsgetreu vergrößerten Kristallisationsversuchen als Impflinge verwendet, falls notwendig. Jene Proteinkristalle, die keinen Beugungsgrad aufweisen, werden für die Rekristallisation leicht verdünnt. Die Anordnungsstellen, die amorphes Präzipitat oder amorphes Präzipitat plus Mikrokristalle enthalten, werden ebenfalls verdünnt, und sie werden akustisch und durch scannende Diffraktometrie evaluiert.
Beispiel 3
Kombinatorische Optimierung der Kristallisationsbedingungen für ein Protein mit flexibler Konformation (II):
Ein Protein mit labiler Konformation, wie z.B. PrP kann in der Gegenwart eines Antikörpers oder eines Liganden co-kristallisiert werden, der strukturelle Stabilität liefert, die erforderlich ist, um das Wachstum von Kristallen hoher Qualität zu fördern. Außerdem können Untersuchungen des mit einem biologisch relevanten Liganden komplexierten Proteins nützliche Informationen über biologische(s) Verhalten und Funktionen liefern. Ein Beispiel für die produktive Verwendung dieses Verfahrens im Hinblick auf den Erhalt von Kristallen hoher Qualität ist der Komplex zwischen dem Lambda-Repressor und DNA (Jordan et al. (1985) Science 230:1383–1385). Um Kristalle zu erhalten, wurde die Zusammensetzung des Lambda-Repressorliganden, eine DNA-bindenden Sequenz, systematisch variiert.
Mittels konventioneller Phosphoramidit-DNA-Chemie kann randomisierte DNA synthetisch produziert werden. In den Fällen, bei denen eine große Matrix an Bedingungen erforderlich ist, um homogene Kristalle zu erhalten, könnten 50.000 Ligandenvarianten mit einem Protein kombiniert werden und 1000 Lösungsmittelbedingungen zum Zwecke von Kristallisationsversuchen unterworfen werden. Dies würde insgesamt 50.000.000 verschiedene Bedingungen bedeuten und 500-Tropfen-Well-Platten erfordern, von denen jede 100.000 verschiedene Proben enthält. Falls notwendig, kann die Dichte der Tropfen-Well-Platte verändert werden und eine Platte mit 25 mm × 75 mm kann leicht über 1.000.000 Tropfen aufnehmen. Dieses Verfahren reduziert die Zahl der erforderlichen Platten auf 50 für das hier beschriebene Experiment.
Alternativ kann das in dem vorangehenden Beispiel beschriebene Verfahren eingesetzt werden, so daß es 10.000 herkömmliche Behälter mit hängendem Tropfen erfordert. Da das Lösungsmittel zu jedem Behälter über die Maschine zugegeben werden kann, ist dieses Verfahren praktikabel, wobei jedoch der lösungsmittelreservoirfreie Ansatz für einen Versuch der ersten Generation angenehmer ist. Proteine, die sogar nach Post-Kristallisationsverdünnung keine Kristalle lieferten, die für die Hochauflösungs-Röntgenstrahl-Beugung geeignet sind, können nach dem Verfahren mit hängender Anordnung kristallisiert werden und zwar mit und ohne Impfung. Die Versuchs-Wells und/oder -anordnungsstellen können akustisch hinsichtlich der Kristallqualität evaluiert werden mit dem in dem vorhergehenden Beispiel oder anderenorts hierin beschriebenen Verfahren, und es können weitere Manipulierungen, wie z.B. durch Verdünnung, durchgeführt werden.
Beispiel 4
Verfahren zur modifizierten Microbatch-Kristallisation:
Wie in Beispiel 5 hierin beschrieben wird, kann Öl auf Tröpfchen, in den Reservoir-Wells oder beides eingesetzt werden, um die Raten der Dampfdiffusion zu kontrollieren. Die Kontrolle der Rate der Dampfdiffusion durch Beschichtung der Versuchstropfen, die beim Verfahren mit hängendem oder stehendem Tropfen verwendet werden, mit Paraffinöl, wurde von Chayen et al. (1990) supra demonstriert. Da die Lösungsmitteldiffusion in das oder aus dem Tröpfchen sehr langsam ist, verbleibt das Tröpfchen im Wesentlichen statisch, was die Verwendung des Begriffs "Microbatch" erklärt. D'Arcy et al. (1996), supra, wendet Silikonflüssigkeiten an, die Polymere sind von -(Si(CH₃)₂-O-)_n-, für ein modifiziertes Ölbeschichtungsverfahren, das mehr Diffusion erlaubt. Man kann daher einen Versuch unter Öl durchführen und eine Diffusion aus einem wäßrigen Lösungsmittel durch das Öl haben. Chayen et al. (1997), supra, führten ein Verfahren ein, bei dem die Reservoirflüssigkeit mit einer darüberliegenden Ölschicht beschichtet ist, welche sowohl hinsichtlich der Zusammensetzung als auch hinsichtlich der Dicke zusammengesetzt werden kann, und mit den Microbatch-Verfahren, die die Diffusion durch Beschichtung des Tröpfchens kontrollieren, kombiniert werden kann. In dem vorangehenden Beispiel wurden die Proteinlösungen mit den kombinatorischen Kristallisationspufferlösungen verdünnt. Das vorliegende Beispiel lehrt ein Ausstoßverfahren, bei dem das Protein nicht verdünnt wird und die gesamte Kristallisationsversuchslösung in Wellplatten-Wells vorgemischt wird.
In eine 1536-Wellplatte, die ein in einer Vielzahl von verschiedenen Lösungsmittelbedingungen gelöstes Protein enthält, wird Paraffinöl ausgestoßen oder in andere Weise zu gleichen Teilen verteilt. Zu den Parametern, die in der Lösung variiert werden, gehören pH-Wert, Proteinkonzentration, Konzentration an PEG und Ionenstärke. Die Proteinlösung wird durch die nicht vermischbare Paraffinölschicht auf eine empfangende Substratoberfläche ausgestoßen. Dieser Vorgang führt zu einer Proteinlösung, die in einem nicht-mischbaren Öl eingekapselt ist. Zusätzlich kann ein zweites Öl, wie z.B. ein Silikonöl auf die bereits bestehenden Proteintropfen ausgestoßen werden. Die Zugabe einer zweiten Ölschicht auf die Paraffinölschicht liefert ein Mittel zur Kontrolle der Rate der Dampfdiffusion aus der Proteinlösung. Je mehr Silikonöl sich in der Paraffin-/Silikonöl-Mischung befindet, desto größer ist die Rate der Dampfdiffusion. Die Verwendung einer flachen Empfangsplatte ermöglicht das simultane Screening einer größeren Vielzahl an Kristallisationsbedingungen als die 1536 Bedingungen, die in der Wellplatte gescreent werden können. Für Tropfen-Volumina von 50 Picolitern können auf der Fläche einer herkömmlichen 1536-Wellplatte über 1.000.000 Tropfen gescreent werden.
Das für dieses Verfahren ausgewählte Protein ist die PrP(121–230)-Mutation, die den qualitativ besten Kristall aus dem vorangehenden Beispiel 6 lieferte, wenngleich er immer noch zu klein war. Aufgrund von Bedenken hinsichtlich des in Kontakt bringens von Öl und Proteinlösung wurde ein Parallelversuch durchgeführt, bei dem ein Setup mit stehendem Tropfen verwendet wurde, bei welchem kein Öl mit der Proteinlösung in Kontakt tritt. Bei diesem Versuch wird eine Dichte von etwa 10.000/cm² auf einer Fläche von 7 mm × 7 mm von jedem Deckstreifen eingesetzt und 200 konventionelle Setups von stehenden Tropfen, analog zu der in den vorangehenden Beispielen beschriebenen hängenden Anordnung. Das Lösungsmittel bei diesem Verfahren mit stehender Anordnung wird mit dem gleichen Ölgemisch überzogen, wie für das modifizierte Microbatch-Verfahren (Dampfdiffusionskontrollverfahren). Die Paraffin- und Silikonöle können in verschiedenen Verhältnissen kombiniert werden, um die Dampfdiffusionsraten zu kontrollieren, wie zuvor erwähnt.
Beispiel 5
Kristallisation eines mit verwandter DNA komplexierten DNA-bindenden Transkriptionsfaktors mit einer Anordnung mit einem Reservoir pro hängendem Tropfen:
Ein neu isolierter Frosch-Transkriptionsfaktor wird isoliert und in einem Prokaryoten nach herkömmlichen Verfahren exprimiert. Die Sequenzhomologie deutet darauf hin, daß das Protein ein Mitglied der Familie der DNA-bindenden Zink-Finger-Proteine ist. Eine nicht-denaturierende PAGE in Gegenwart eines Überschusses an Zink etabliert mehrere verschiedene Konformere mit verschiedenen Mobilitäten. Die Zugabe von EDTA zu der nicht-denaturierenden PAGE reduziert das beobachtete elektrophoretische Muster auf ein einzelnes Mobilitätsband, wie anhand einer Standard-PAGE beobachtet wird, wodurch etabliert ist, daß eher mehrere Konformationen des reinen Proteins vorliegen als Verunreinigungen. Um Informationen zu den Kristallisationsbedingungen und über gebundene DNA-Sequenzen für homologe Proteine zu erhalten wird auf NIST/CARB BMCD zurück gegriffen mit dem Wissen um die Bindungssequenzen von Homologen wird eine heuristische kombinatorische (z.B. strenge Konsens-Nukleotide nicht variierend) ssDNA-Anordnung durch akustische Abscheidung erzeugt, wie in einem vorangehenden Beispiel beschrieben wurde, wobei die DNA-Sequenz kovalent an die Substratoberfläche angeheftet wird. Um alle komplementären Sequenzen zu synthetisieren, werden Routine-Verfahren der Synthese von DNA angewandt, und es wird eine Anordnung von dsDNA durch stringente Hybridisierung mit Reannealing ausgebildet, um die Stringenz der Komplementarität zu erhöhen.
Die Anordnung wird unter physiologischen Bedingungen und in Anwesenheit von Zn²⁺ mit einer dünnen, darüberliegenden, wäßrigen Schicht der Proteinlösung in Kontakt gebracht. Eine Infrarot-Videokamera wird verwendet, um die Anordnung bildlich zu erfassen und nach der Integration des Signals über die Zeit werden diejenigen Stellen identifiziert, die die meiste Wärme freisetzen. Die DNA-Sequenzen der heißesten Stellen werden auf die Bindung hin untersucht, wobei die am besten bindende DNA identifiziert wird, wie durch Differentielle Scannende Kalorimetrie (DSC) abgesichert wird. Die durch DSC bestimmte Bindungskonstante wird verwendet, um den korrekten Überschuß an DNA zu bestimmen, um im Wesentlichen das gesamte Protein zu binden, ohne daß ein solch großer Überschuß vorliegt, daß die Kristallisation gehemmt wird. Eine nicht-denaturierende PAGE in Gegenwart dieser Menge an DNA offenbart eine einzelne Mobilitätsbande und kein erkennbares Signal von Konformeren, die die DNA nicht binden.
Die in den vorherigen Beispielen beschriebene hängende Anordnung wird eingesetzt, um zu versuchen, das Protein zu kristallisieren. Die Informationen aus NIST/CARB BMCD über ähnlich kristallisierte Komplexe, ermöglicht die Anwendung einer heuristischen kombinatorischen Kristallisationsstrategie, bei der 10.000 Kristallisationsbedingungen eingesetzt werden. Jedes Experiment wird zehnfach dupliziert für eine Gesamtheit von 100.000 Experimenten. Zwanzig konventionelle Behälter für hängende Tropfen werden eingesetzt, wobei jeder eine Anordnung von 5.000 hängenden Tröpfchen in Picolitergröße in einer Dichte von etwa 10.000 Tröpfchen pro Quadratzentimeter enthält. Von den Experimenten, die zeigten, daß sie Protein-/DNA-Co-Kristalle lieferten, kann für mehrere gezeigt werden, daß sie Kristalle hoher Qualität liefern, die für die Röntgenstrahl-Strukturanalyse zu klein sind. Die Bedingungen werden maßstabsgetreu vergrößert und die kleinen Kristalle werden unmittelbar aus ihren Anordnungsstellen in die maßstabsgetreu vergrößerten Tröpfchen akustisch ausgestoßen. Das maßstabsgetreu vergrößerte Experiment zweiter Generation liefert mehrere Kristalle hoher Qualität, die für die röntgenstrahl-kristallographische Analyse groß genug sind. Die Kenntnis der Kristallisationsbedingungen erlaubt auch die Kristallisation von spezifisch substituierten, schwermetalltragenden Aminosäuren für den Phasenabgleich als eine Hilfe für die Strukturanalyse.
Beispiel 6
Kristallisation eines Transmembran-Proteins:
Ein Transmembran-Protein, das aus Nervengewebe von Xenopus isoliert wurde, wird in einem Prokaryoten exprimiert. Das Protein ist in wäßriger Lösung lediglich mit einem oberflächenaktiven Mittel löslich. Die Sequenzhomologie-Analyse offenbart, daß das Protein zur Rhodopsin-Familie gehört. Das Protein bildet leicht 2-D-Anordnungen aus. Das Protein in einer Phospholipid-Doppelschicht liefert Strukturdaten niedriger Auflösung, wenn man die Elektronenbeugungskristallographie anwendet. Die nicht-denaturierende PAGE (in der Gegenwart eines geeigneten nichtionischen oberflächenaktiven Mittels) etabliert, daß das Protein rein und strukturiert ist. Die Daten von NIST/CARB BMCD über das am meisten homologe Protein, das in 3-D kristallisiert ist, erlauben einen heuristischen kombinatorischen Ansatz, bei dem Salze und nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, einschließlich Octylglukosid verwendet werden und bei welchem die hängende Anordnung der vorherigen Beispiele eingesetzt wird. Die Lösungsmittelreservoirs für das Verfahren mit hängender Anordnung werden mit Ölen variierender Zusammensetzungen überzogen. Die Kristalle der höchsten Qualität werden erhalten, wenn man ein Ölverhältnis von 50/50 Paraffin/Silikon verwendet. Sie sind für die Verwendung für die Röntgenstrahl-Strukturanalyse jedoch zu klein.
Diese Kristalle werden verwendet, um die Versuche maßstabsgetreu zu vergrößern, um Kristalle hoher Qualität zu erhalten, die für die hochauflösende röntgenstrahl-kristallographische Analyse groß genug sind. Einige der kleinen Kristalle werden einer kombinatorischen Interaktion mit Schwermetallösungen ausgesetzt. Diese Wechselwirkungen führen zu Ereignissen des isomorphen Austausches von Schwermetallen (McRee, Practical Protein Crystallography, supra). Isomorph ausgetauschte Kristalle von adäquater Größe werden erhalten, die die Lösung der Struktur bis zu einer Auflösung von 2,5 Å ermöglichen.

Claims

Verfahren zum Erzeugen einer Flüssigkeitsmenge, die eine interessierende Komponente für die Kristallisation enthält und deren Zusammensetzung bekannt ist, welches die Verwendung von fokussierter akustischer Strahlung zum Abscheiden eines oder mehrerer ein Reagens enthaltender Flüssigkeitströpfchen an einer Stelle auf einer Substratoberfläche umfaßt, wobei wenigstens eines der ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen, die an der Stelle abgeschieden wurden, die interessierende Komponente für die Kristallisation enthält und wenigstens eines der ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen ein Mittel, das die Wahrscheinlichkeit der Kristallbildung erhöht, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Bestimmen, ob die interessierende Komponente für die Kristallisation Kristalle gebildet hat, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei auf der Substratoberfläche eine Anordnung von Flüssigkeitsmengen, von denen jede eine bekannte Zusammensetzung und bekannte chemische und physikalische Zustände hat, erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens eines der ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen, die an der Stelle abgeschieden wurden, ein oder mehrere die Kristallisation fördernde Mittel enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus anorganischen Salzen, anorganischen Molekülen, organischen Salzen, organischen nicht-polymeren Molekülen und Polymeren.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das die Kristallisation fördernde Mittel ein oberflächenaktives oder chaotropes Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die interessierende Komponente für die Kristallisation durch ein oberflächenaktives oder chaotropes Mittel gelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die interessierende Komponente für die Kristallisation ein Biomakromolekül umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die interessierende Komponente für die Kristallisation ein Biomakromolekül umfaßt, wobei das Biomakromolekül in einer bestimmten Konformation durch einen Liganden stabilisiert wird, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ionen, nichtpolymeren Molekülen und Biopolymeren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Ligand ein zweiwertiges Kation, ein Steroid, ein Retinoid oder ein Biopolymer mit einer Sequenz von Monomeren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Monosacchariden, Aminosäuren und Nukleotiden, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ligand ein ionischer Bestandteil eines Salzes ist, welches als ein die Kristallisation förderndes Mittel wirkt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Biomakromolekül eine teilweise oder vollständig native Proteindomäne umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das oberflächenaktive oder chaotrope Mittel, welches die interessierende Komponente löst, ein die Kristallisation förderndes Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei wenigstens eines der ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen, die an der Stelle abgeschieden sind, ein zweites Biomakromolekül enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches weiterhin das Steuern der Temperatur des Substrats und der Temperatur und des Drucks, die die ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen und die Flüssigkeitsmengen umgeben, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die interessierende Komponente für die Kristallisation ein Biomakromolekül ist und sowohl die Flüssigkeitsmengen als auch die ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen ein Volumen von bis zu etwa 1 Mikroliter haben.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Flüssigkeitsmengen ein Volumen von etwa 1 Pikoliter bis 30 Nanoliter haben und die ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen ein Volumen von etwa 0,1 Pikoliter bis 10 Nanoliter haben.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin folgendes umfaßt: Abscheiden eines oder mehrerer ein Reagens enthaltenden Flüssigkeitströpfchen an einer Stelle auf einer Substratoberfläche, die eine zuvor an der Stelle abgeschiedene Flüssigkeitsmenge aufweist, mittels fokussiertem Energieausstoß und Erfassen des Vorhandenseins und der Menge an Kristallen der interessierenden Komponente in der Flüssigkeitsmenge an der Stelle.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Stufen der Erfassung weiterhin die periodische Erfassung der Menge und der Größe der Kristalle umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei auf der Substratoberfläche eine Anordnung von Flüssigkeitsmengen mit jeweils bekannter Zusammensetzung und bekannten chemischen und physikalischen Zuständen erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine andere ein Reagens enthaltende Flüssigkeit aus jedem aus einer Mehrzahl von Flüssigkeitsreservoirs auf bestimmten Stellen auf einer Substratoberfläche abgeschieden wird unter Bildung einer kombinatorischen Anordnung von Flüssigkeitströpfchen, die ein interessierendes Biomakromolekül für die Kristallisation enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (a) Positionieren einer akustischen Ausstoßvorrichtung derart, daß sie in einer akustisch gekoppelten Beziehung zu einem ersten Reservoir steht, welches eine erste ein Reagens enthaltende Flüssigkeit enthält, (b) Aktivieren der Ausstoßvorrichtung, um eine akustische Strahlung mit einem Fokus in der Nähe der Oberfläche der ersten Flüssigkeit zu erzeugen, wobei ein erstes Tröpfchen der ersten ein Reagens enthaltenden Flüssigkeit aus dem ersten Reservoir zu der ersten bestimmten Stelle auf der Substratoberfläche hin ausgestoßen wird, wobei das Tröpfchen an der bestimmten Stelle anhaftet, (c) Umpositionieren der Ausstoßvorrichtung derart, daß sie in einer akustisch gekoppelten Beziehung zu einem zweiten Reservoir steht, welches eine zweite ein Reagens enthaltende Flüssigkeit, die sich von der ersten unterscheidet, enthält, (d) Aktivieren der Ausstoßvorrichtung wie in Stufe (b), um ein zweites Tröpfchen der zweiten ein Reagens enthaltenden Flüssigkeit aus dem zweiten Reservoir zu der ersten bestimmten Stelle auf der Substratoberfläche hin auszustoßen, wobei das zweite Tröpfchen an der bestimmten Stelle anhaftet und sich mit dem ersten Tröpfchen vermischt, (e) Wiederholen der Stufen (c) und (d) mit zusätzlichen Reservoirs, von denen jedes eine andere ein Reagens enthaltende Flüssigkeit enthält, bis die erste bestimmte Stelle auf der Substratoberfläche eine daran anhaftende Flüssigkeitsmenge aufweist, und (f) Wiederholen der Stufen (a) bis (e) für die verbleibenden bestimmten Stellen in der Anordnung, bis jede Stelle eine daran anhaftende Flüssigkeitsmenge aufweist, wobei jede Flüssigkeitsmenge in den Tröpfchen der das Reagens enthaltenden Flüssigkeit das interessierende Biomakromolekül für die Kristallisation enthält, wobei jede Flüssigkeitsmenge eine bestimmte Stelle besetzt, wodurch die Flüssigkeitsmengen auf der Substratoberfläche an den bestimmten Stellen angeordnet sind und die Zusammensetzung und die chemischen Bedingungen an jeder Stelle aus den Stufen des Verfahrens und den abgeschiedenen, ein Reagens enthaltenden Flüssigkeiten bekannt sind.
Verfahren nach Anspruch 20, welches weiterhin das Wiederholen der Stufen (a) bis (f), um die Zusammensetzung der Flüssigkeitsmenge an jeder bestimmten Stelle zu verändern, umfaßt.
System für kombinatorische Experimente, um eine interessierende Komponente zu kristallisieren und die Kristallisation der interessierenden Komponente zu erfassen, wobei das System folgendes umfaßt: eine Mehrzahl von auf einem Substrat angeordneten Stellen, eine Mehrzahl von Reservoirs, von denen jedes so ausgestaltet ist, daß es eine ein Reagens enthaltende Flüssigkeit enthält, eine Ausstoßvorrichtung, die einen Generator für akustische Strahlung zum Erzeugen akustischer Strahlung und eine Fokussiervorrichtung zum Fokussieren der akustischen Strahlung an einen Fokus in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche in jedem der Reservoirs umfaßt, und Mittel zum Positionieren der Ausstoßvorrichtung in einer akustisch gekoppelten Beziehung zu jedem der Reservoirs und Mittel zum Erfassen der Kristallisation der interessierenden Komponente, wobei eines oder mehrere der auf dem Substrat angeordneten Materialien durch akustischen Ausstoß mit einer oder mehreren ein Reagens enthaltenden Flüssigkeiten in Kontakt gebracht wird/werden und jegliche physikalische oder chemische Veränderung, die nach diesem Inkontaktbringen an einer Stelle erfaßt wird, ein Screening-Ergebnis für das Material darstellt, das an der Stelle, die mit der einen oder den mehreren ein Reagens enthaltenden Flüssigkeiten in Kontakt gebracht wurde, vorhanden ist.
Räumliche Anordnung, welche eine Mehrzahl von Flüssigkeitsmengen mit bekannter Zusammensetzung und bekannten chemischen und physikalischen Zuständen auf einer Substratoberfläche, die in eine Mehrzahl diskreter Oberflächenstellen unterteilt ist, umfaßt, wobei jede Stelle eine Flüssigkeitsmenge enthält, die in einem lokalisierten Bereich der Stelle liegt, wobei jede Flüssigkeitsmenge eine interessierende Komponente für die Kristallisation enthält und die verschiedenen Stellen in einer Dichte von etwa 1.000 bis etwa 1.500.000 Stellen pro Quadratzentimeter vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die fokussierte akustische Strahlung fokussierte akustische Energie ist, die einen Fokus in der Flüssigkeit hat, und die akustischen Eigenschaften an dem Fokus erfaßt werden, wobei Kristalle anhand von Unterschieden in den akustischen Eigenschaften zu der Flüssigkeit erfaßt werden.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die akustischen Eigenschaften akustische Impedanz oder akustische Dämpfung sind.
Verfahren nach Anspruch 24, welches weiterhin das Unterscheiden von Kristallen und Präzipitaten durch Erfassen von Unterschieden zwischen ihren akustischen Eigenschaften umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 24, welches weiterhin das Bestimmen der Größe der erfaßten Kristalle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 27, welches weiterhin die periodische Erfassung der Menge und der Kristallgröße zur Bestimmung der Kinetiken der Kristallkeimbildung und des Kristallwachstums umfaßt.