DE60020340T2

DE60020340T2 - Syntheseverfahren zum ökonomischen aufbau langer dna-sequenzen und zusammensetzungen hierfür

Info

Publication number: DE60020340T2
Application number: DE60020340T
Authority: DE
Inventors: M. Thomas BRENNAN; L. Herbert HEYNEKER
Original assignee: Metrigen Inc Burlingame; Metrigen Inc
Current assignee: Coda Genomics inc Laguna Hills Calif Us
Priority date: 1999-03-08
Filing date: 2000-03-07
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2020-03-08
Also published as: DE60020340D1; EP1159285A1; US20030186226A1; EP1159285B1; WO2000053617A1; JP2002538790A; US20030068643A1; ATE296310T1; AU3623800A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein kostengünstiges Verfahren zum Zusammensetzen von langen DNA-Sequenzen aus kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Ganz besonders werden kurze Oligonukleotide in situ auf einem festen Träger synthetisiert und anschließend vor oder während des Zusammensetzens zu Sequenzen voller Länge von dem festen Träger abgespalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Einführung der schnellen Sequenzierungstechnik hat zu großen Datenbanken von DNA-Sequenzen, die nützliche Geninformationen enthalten, geführt. Die verbleibenden Herausforderungen sind herauszufinden, was diese Genprodukte wirklich tun, wie sie miteinander in Wechselwirkung stehen, um den gesamten Organismus zu regulieren und schließlich wie sie manipuliert werden können, um in der Gentherapie, Proteintherapie und Diagnose Verwendung zu finden. Die Erhellung der Funktion von Genen erfordert nicht nur das Wissen über die Wild-Typ-Sequenzen, sondern auch die Verfügbarkeit von Sequenzen, die bestimmte Variationen enthalten, um das Verständnis von der Rolle, die verschiedene Gene für die Gesundheit und bei Krankheiten spielen, voranzutreiben. Eine Mutagenese wird routinemäßig im Labor durchgeführt, um willkürliche oder gezielte Bibliotheken von interessanten Sequenzvariationen zu erstellen. Allerdings ist die Fähigkeit, große DNA-Segmente zu manipulieren, um Experimente im Hinblick auf die funktionellen Wirkungen von Änderungen der DNA-Sequenzen durchzuführen, durch die Verfügbarkeit von modifizierten Enzymen und den damit verbundenen Kosten begrenzt worden. Zum Beispiel kann ein Forscher nicht einfach die spezifische Addition oder Deletion von bestimmten DNA-Regionen oder -Sequenzen über herkömmliche Mutageneseverfahren steuern und muss auf die Auswahl von interessanten DNA-Sequenzen aus Bibliotheken mit genetischen Variationen zurückgreifen.
Es wäre äußerst nützlich, wenn ein Forscher systematisch große DNA-Regionen synthetisieren könnte, um die Wirkung von Sequenzunterschieden auf die Funktion von solchen Regionen zu bestimmen. Allerdings ist die DNA-Synthese mit herkömmlichen Verfahren wegen der abnehmenden Gesamtausbeute unpraktisch. Zum Beispiel würde sogar bei einer Ausbeute von 99,5% pro Schritt im Phosphoramidit-Verfahren der DNA-Synthese die Gesamtausbeute einer vollständig langen Sequenz mit 500 Basenpaaren Länge weniger als 1% ausmachen. In ähnlicher Weise würde, wenn zum Beispiel überlappende Stränge eines als Gentherapievektor geeigneten Adenovirus synthetisiert werden sollten, die erforderliche synthetische DNA von 50–70 kb selbst bei einem neuen niedrigen Preis von ungefähr $ 1,00 pro Base über $ 50.000,-- pro vollständige Sequenz kosten, was viel zu teuer ist, um praxisnah zu sein.
Die Ausbeute von langen DNA-Segmenten kann verbessert werden, wenn die chemische DNA-Synthese mit rekombinanter DNA-Technik kombiniert wird. Goeddel u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(1): 106–110 (1979); Itakura u.a., Science 198: 1056–1063 (1977); und Heyneker u.a., Nature 263: 748–752 (1976). Die Synthese eines langen DNA-Segments kann mit der Synthese von mehreren DNA-Fragmenten geringer Größe durch chemische Synthese beginnen und mit der enzymatischen Ligation der Fragmente geringer Größe fortgesetzt werden, um das gewünschte lange DNA-Segment zu erzeugen. Synthetisch hergestellte mäßig große DNA-Fragmente können unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligase auch zu DNA-Plasmiden hybridisiert werden, um die gewünschten langen DNA-Sequenzen zu erhalten, die transkribiert und in einen geeigneten Wirt translatiert werden können. In letzter Zeit wird eine self-priming PCR-Technik verwendet, um große DNA-Sequenz-Segmente aus einem Pool von überlappenden Oligonukleotiden mittels DNA-Polymerase ohne die Verwendung von Ligase zusammenzusetzen. Dillon u.a., Bio Techniques 9(3): 298–300 (1990); Prodromou u.a., Protein Engineering 5(8): 827–829 (1992); Chen u.a., J. Am. Chem. Soc. 116: 8799–8800 (1994); und Hayashi u.a., BioTechniques 17(2): 310–315 (1994). In jüngster Zeit wurde das DNA-Shuffling-Verfahren eingeführt, um Gene aus willkürlichen Fragmenten, die durch teilweisen DNAasel-Verdau erzeugt wurden, oder aus einem Gemisch aus Oligonukleotiden zusammenzusetzen. Stemmer u.a., Nature 370: 389–391 (1994); Stemmer u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747–10751 (1994); Stemmer u.a., Gene 164: 49–53 (1996); Carmeri u.a., Nat. Biotechnol. 15: 436–438 (1997); Zhang u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504–4509 (1997); Crmeri u.a., Nature 391: 288–291 (1998); Christians u.a., Nat. Biotechnol. 17: 259–264 (1999), US-Patente Nr. 5,830,721, 5,811,238, 5,830,721, 5,605,793, 5,834,252 und 5,837,458 und PCT-Veröffentlichungen WO 98/13487, WO 98/27230, WO 98/31837, WO 99/41402, 99/57128 und WO 99/65927.
Verfahren zum Synthetisieren einer großen Auswahl von kurzen oder mäßig großen Oligonukleotiden sind umfassend beschrieben worden. Eines der Verfahren ist es, die Mikroarray-Technik anzuwenden, bei der eine große Zahl von Oligonukleotiden gleichzeitig auf der Oberfläche eines festen Trägers synthetisiert wird. Die Mikroarray-Technik ist in Green u.a., Curr. Opin. in Chem. Biol. 2: 404–410 (1998), Gerhold u.a., TIBS, 24: 168–173 (1999), den US-Patenten Nr. 5,510,270, 5,412,087, 5,445,934, 5,474,796, 5,744,305, 5,807,522, 5,843,655, 5,985,551 und 5,927,547 beschrieben worden. Ein Verfahren zum Synthetisieren von hochdichten Anordnungen bzw. Arrays von DNA-Fragmenten auf Glassubstraten verwendet die mittels Licht gelenkte kombinatorische Synthese. Allerdings liefert das photolithographische Syntheseverfahren weder Oligonukleotide, die rein genug für eine spätere enzymatische Zusammensetzung sind, noch ein Verfahren, das flexibel und kostengünstig ist. Zum Beispiel kann aufgrund der niedrigen chemischen Kopplungsausbeute einer In-situ-Synthese mittels Photolithographie jedes Oligonukleotid zusätzlich zu den Oligonukleotiden gewünschter Länge eine beträchtliche Zahl von gekürzten Produkten enthalten. Zum Beispiel hat in 10-meren und 20-meren nur etwa 40% bzw. 15% der Oligonukleotide die volle Länge. Forman, J. u.a., Molecular Modeling of Nucleic Acids, Kapitel 13, Seite 206–228, American Chemical Society (1998)) und McGall u.a., J. Am. Chem. Soc., 199: 5081–5090 (1997). Darüber hinaus sind mehrere Tausend Dollar für Masken, die für eine bestimmte Sequenzreihe spezifisch sind, für das praktische Zusammensetzen notwendig.
Bestehende Verfahren für die Synthese von langen DNA-Sequenzen besitzen auch viele Nachteile, zum Beispiel die Längenbegrenzungen einer herkömmli chen Festphasen-DNA-Synthese, die Notwendigkeit, beide DNA-Stränge zu synthetisieren, und die Komplexität der mehreren enzymatischen Reaktionen für das schrittweise Zusammensetzen. Diese Nachteile addieren sich unausweichlich zu den Kosten für die Erlangung langer DNA-Sequenzen dazu. Es besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf, um wirtschaftlich mehrere Oligonukleotide zu synthetisieren und sie anschließend zu langen DNA-Sequenzen zusammenzusetzen. Ein solches kostengünstiges und maßgeschneidertes Synthese- und Zusammensetzverfahren hat viele Verwendungen. Es können interessante Gensequenzen zusammengesetzt und auf eine Auswahl von Funktionsweisen getestet werden, zum Beispiel die Funktion der relativen Promotorposition zur Gen kodierenden Sequenz, die Rolle von Introns gegenüber Exons, die Minimierung der Gensequenz, die für die Funktion notwendig ist, die Rolle von Polymorphismen und Mutationen, die Wirksamkeit von Sequenzänderungen von Gentherapievektoren, die Optimierung der Genkodierung für ein Protein für ein bestimmtes Experiment oder eine industrielle Anwendung etc. Diese Funktionsanalyse kann mit den DNA-Anordnungen genau unter der Kontrolle der Forscher erforscht werden. In anderen Fällen können bestimmte Variationen in der zusammengesetzten Sequenz dazu verwendet werden, strukturierte Bibliotheken zu erstellen, die viele mögliche genetische Variationen zum Testen der Funktion oder der Funktionshemmung enthalten. Schließlich könnten ganze Genome leicht synthetisiert, zusammengesetzt und zweckmäßig auf diese Weise getestet werden. In Kürze könnte jedes Experiment, bei dem ein Modellsystem von synthetischen Genen oder Genomen auf bestimmte Weise unter der Kontrolle eines Forschers geändert werden könnte, leicht und weniger teuer durchgeführt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz mit mehr als 200 Basen Länge zur Verfügung gestellt, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Synthetisieren von mindestens zehn Oligonukleotiden aus etwa 10 bis 200 Basen, die entweder für den Sense- oder Antisense-Strang der DNA-Sequenz kodieren, auf einem funktionalisierten festen Träger, wobei die Oligonukleotide kovalent mit einer abspaltbaren Komponente an den festen Träger gebunden sind;
(b) Abspalten der Oligonukleotide vom festen Träger; und
(c) Zusammensetzen der Oligonukleotide zur DNA-Sequenz.

Das vorliegende Verfahren zum Synthetisieren und Zusammensetzen von langen DNA-Sequenzen aus kurzen Oligonukleotiden umfasst die Schritte: (a) Synthetisieren einer Anordnung von Oligonukleotidsequenzen auf einem festen Träger, wobei die Oligonukleotide gesammelt für beide Stränge der Ziel-DNA kodieren und kovalent mittels einer abspaltbaren Komponente an dem festen Träger angebracht sind; (b) Abspalten der Oligonukleotide vom festen Träger; und (c) Zusammensetzen der Oligonukleotide zur DNA-Sequenz voller Länge. Die langen Ziel-DNA-Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen werden, können eine regulatorische Sequenz, ein Gen oder ein Fragment davon, ein Vektor, ein Plasmid, ein Virus, ein vollständiges Genom eines Organismus oder jede andere biologisch funktionsfähige DNA-Sequenz sein, die entweder direkt oder indirekt durch enzymatische Ligation, mittels DNA-Polymerase, mittels Restriktionsenzym oder durch andere geeignete Zusammensetzverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengesetzt sein können.
In bevorzugten Ausführungsformen können Oligonukleotide durch die In-situ-Synthese auf einem festen Träger hergestellt werden. Insbesondere kann die In-situ-Synthese von Oligonukleotiden das „drop-on-demand"-Verfahren verwenden, das die Technik analog zu der verwendet, die in Tintenstrahldruckern benutzt wird. Darüber hinaus können hydrophile/hydrophobe Anordnungen oder Oberflächenspannungsanordnungen, die aus gemusterten Regionen von hydrophilen und hydrophoben Flächen bestehen, verwendet werden. Vorzugsweise liegt die Größe der langen DNA-Sequenz im Bereich von etwa 200 bis 10.000 Basen, das Oligonukleotid kann etwa 10 bis 200 Basen, vorzugsweise etwa 20 bis 100 Basen, lang sein. Es ist bevorzugt, wenn die Zahl der auf dem festen Träger synthetisierten Oligonukleotide etwa 10 bis 200, besonders bevorzugt etwa 10 bis 500, ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt Hydroxylgruppen tragende, nicht abspaltbare Linker, die zur Hybridisierung direkt auf dem Glaschip verwendet werden.
2 zeigt die Kopplung eines chemischen Phosphorylierungsmittels als das spezielle Amidit, um eine Abspaltung des Oligonukleotids nach der Synthese zu ermöglichen.
3 zeigt das Amidit (TOPS), das zur Herstellung des universellen CPG-Trägers verwendet wird, um eine Abspaltung des Oligonukleotids nach der Synthese zu ermöglichen.
4A veranschaulicht die Bildung einer Anordnungsfläche, die zur Festphasensynthese bereit ist.
4B veranschaulicht die O-Nitrocarbamatanordnung maskierende Chemie.
5 veranschaulicht den Oberflächenspannungswandeffekt an der Punkt-Zwischenraum-Trennfläche. Das Tröpfchen, das die Festphasensynthesereagenzien enthält, breitet sich aufgrund der Oberflächenspannungswand nicht über den Umfang des Punkts aus.
6 veranschaulicht die Wasserstoff-Phosphonat-Festphasen-Oligonukleotidsynthese auf einer Anordnungsfläche.
7A veranschaulicht die Draufsicht auf einen piezoelektrischen Impulsstrahl der Art, die verwendet wird, um Festphasen-Synthesereagenzien an einzelne Punkte in den Anordnungsplattensyntheseverfahren abzugeben.
7B veranschaulicht die Seitenansicht eines piezoelektrischen Impulsstrahls der Art, die verwendet wird, um Festphasen-Synthesereagenzien an einzelne Punkte in den Anordnungsplattensyntheseverfahren abzugeben.
8 veranschaulicht die Verwendung eines piezoelektrischen Impulsstrahlkopfs, um blockierte Nukleotide und Aktivierungsmittel an einzelne Punkte auf einer Anordnungsplatte abzugeben. Die gezeigte Konfiguration weist einen Aufbau mit stationärem Kopf und sich bewegender Platte auf.
9 veranschaulicht eine Einfassung für Anordnungsreaktionen und zeigt die Anordnungsplatte, Gleitabdeckung und Verteiler für den Einlass und Auslass von Reagens.
10 veranschaulicht das Genzusammensetzverfahren von kurzen synthetischen Oligonukleotiden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein kostengünstiges Verfahren zum Zusammensetzen von langen DNA-Sequenzen aus kurzen synthetischen Oligonukleotiden. Im Allgemeinen umfasst das vorliegende Verfahren zum Synthetisieren und Zusammensetzen von langen DNA-Sequenzen aus synthetischen Oligonukleotiden die folgenden Schritte: (a) Synthetisieren einer Anordnung von Oligonukleotidsequenzen auf einem festen Träger, wobei die Oligonukleotide gesammelt für beide Stränge der Ziel-DNA kodieren und kovalent mittels einer abspaltbaren Komponente mit dem festen Träger verbunden sind; (b) Abspalten der Oligonukleotide aus dem festen Träger; und (c) Zusammensetzen der Oligonukleotide zu der Zielsequenz voller Länge. Die langen Ziel-DNA-Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen werden, können eine regulatorische Sequenz, ein Gen oder ein Fragment davon, ein Vektor, ein Plasmid, ein Virus, ein vollständiges Genom eines Organismus oder alle anderen DNA-Sequenzen sein, die aus überlappenden Oligonukleotiden entweder direkt oder indirekt durch enzymatische Ligation, mittels einer DNA-Polymerase, mittels eines Restriktionsenzyms oder durch andere geeignete, auf dem Fachgebiet bekannte Zusammensetzverfahren zusammengesetzt sein können.
Anlagerung einer abspaltbaren Komponente an die Oligonukleotide und den festen Träger
In der Festphasen- oder Mikroarray-Oligonukleotidsynthese, die zur diagnostischen oder anderen, auf Hybridisierung beruhenden Analyse ausgebildet wurde, bleiben die endgültigen Oligonukleotidprodukte am festen Träger, wie beispielsweise „controlled-pore glass" (CPG) oder Chips, angelagert. Typischerweise wird ein nicht abspaltbarer Linker, wie beispielsweise der Hydroxyl-Linker I oder II in der 1 verwendet. Diese Hydroxyl-Linker bleiben während der Entschützungs- und Reinigungsverfahren und während der Hybridisierungsanalyse intakt. Die Synthese einer großen Zahl von überlappenden Oligonukleotiden für den abschließenden Zusammenbau zu einem längeren DNA-Segment wird aber auf einem Linker durchgeführt, der die Abspaltung des synthetisierten Oligonukleotids ermöglicht. Die abspaltbare Komponente wird unter Bedingungen entfernt, die die Oligonukleotide nicht abbauen. Vorzugsweise kann der Linker über zwei Ansätze abgespalten werden, entweder (a) gleichzeitig unter denselben Bedingungen wie der Entschützungsschritt oder (b) danach unter Anwendung eines unterschiedlichen Zustands oder Reagens für die Linkerabspaltung nach der Beendigung des Entschützungsschritts. Der erstere Ansatz kann vorteilhaft sein, wenn die Abspaltung des Linkers zur gleichen Zeit wie die Entschützung der Nukleosidbasen durchgeführt wird. Zeit und Mühe werden gespart, um eine zusätzliche nachträgliche Synthesechemie zu vermeiden. Die Kosten werden dadurch gesenkt, dass dieselben Reagenzien für die Entschützung in der Linkerabspaltung verwendet werden. Der zweite Ansatz kann wünschenswert sein, wenn die nachfolgende Linkerabspaltung als Vorreinigungsschritt dienen kann, um vor dem Zusammensetzen alle schützenden Gruppen aus der Lösung zu entfernen.
Alle geeigneten festen Träger können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Materialien umfassen Glas, Silizium, Wafer, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen usw. Typischerweise sind die festen Träger funktionalisiert, um abspaltbare Linker für die kovalente Bindung an die Oligonukleotide zur Verfügung zu stellen. Die Linkerkomponente kann eine Länge von sechs oder mehr Atomen aufweisen. Alternativ kann die abspaltbare Kompo nente in einem Oligonukleotid liegen und während der In-situ-Synthese eingeführt werden. Eine große Auswahl an abspaltbaren Komponenten steht auf dem Fachgebiet der Festphasen- und Mikroarray-Oligonukleotidsynthese zur Verfügung. Pon, R., „Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis" in „Protocols for oligonucleotides and analogs; synthesis and properties," Methods Mol. Biol. 20: 465–496 (1993); Verma u.a., Annu. Rev. Biochem. 67: 99–134 (1998); und US-Patente Nr. 5,739,386, 5,700,642 und 5,830,655. Eine geeignete abspaltbare Komponente kann so ausgewählt werden, dass sie mit der Natur der schützenden Gruppe der Nukleosidbasen, der Auswahl des festen Trägers, der Art der Reagenzabgabe usw. zusammenpasst. Die Abspaltverfahren können eine Auswahl von enzymatischen oder nicht enzymatischen Mitteln, wie beispielsweise die chemische, thermale oder photolytische Abspaltung, umfassen. Vorzugsweise enthalten die Oligonukleotide, die vom festen Träger abgespalten werden, ein freies 3'-OH-Ende. Das freie 3'-OH-Ende kann auch mittels chemischer oder enzymatischer Behandlung anschließend an eine Abspaltung von Oligonukleotiden erhalten werden.
Die kovalente Immobilisierungsstelle kann entweder am 5'-Ende des Oligonukleotids oder am 3'-Ende des Oligonukleotids liegen. In einigen Fällen kann die Immobilisierungsstelle im Oligonukleotid (d.h. an einer anderen Stelle als das 5'- oder 3'-Ende des Oligonukleotids) liegen. Die spaltbare Stelle kann entlang des Oligonukleotidgerüsts liegen, es kann sich dabei zum Beispiel um eine modifizierte 3'-5'-Internukleotidverbindung anstelle einer der Phosphodiestergruppen, wie beispielsweise Ribose-, Dialkoxysilan-, Phosphorthioat- und Phosphoramidat-Internukleotidbindung, handeln. Die abspaltbaren Oligonukleotidanaloge können auch einen Substituenten auf oder Austausch von einer der Basen oder Zucker, wie beispielsweise 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin, Inosin, Uridin und dergleichen aufweisen.
In einer Ausführungsform können spaltbare Stellen, die in dem modifizierten Oligonukleotid enthalten sind, chemisch abspaltbare Gruppen, wie beispielsweise Dialkoxysilan, 3'-(S)-Phosphorthioat, 5'-(S)-Phosphorthioat, 3'-(N)-Phosphoramidat, 5'-(N)-Phosphoramidat und Ribose aufweisen. Die Synthese- und Abspaltbedingungen von chemisch abspaltbaren Oligonukleotiden sind in den US-Patenten Nr. 5,700,642 und 5,830,655 beschrieben. Zum Beispiel kann je nach Wahl der spaltbaren, einzuführenden Stelle zuerst entweder ein funktionalisiertes Nukleosid oder ein modifizierte Nukleosiddimer hergestellt werden, das dann im Laufe der Oligonukleotidsynthese wahlweise in ein wachsendes Oligonukleotidfragment eingeführt wird. Die selektive Abspaltung des Dialkoxysilans kann durch eine Behandlung mit Fluoridionen bewirkt werden. Eine Phosphorthioatinternukleotidbindung kann wahlweise unter milden oxidativen Bedingungen getrennt werden. Die selektive Abspaltung der Phosphoramidatbindung kann unter milden Bedingungen durchgeführt werden, wie beispielsweise 80%ige Essigsäure. Die selektive Abspaltung von Ribose kann durch Behandeln mit verdünntem Ammoniumhydroxid durchgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen kann, um den nicht abspaltbaren Hydroxyl-Linker (1) in einen abspaltbaren Linker umzuwandeln, ein spezielles Phosphoramidit vor der Phosphoramidit- oder H-Phosphonatoligonukleotidsynthese mit der Hydroxylgruppe gekoppelt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen speziellen Phosphoramidits, ein chemisches Phosphorylierungsmittel, ist in der 2 gezeigt. Die Reaktionsbedingungen zum Koppeln der Hydroxylgruppe mit dem chemischen Phosphorylierungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Die Abspaltung des chemischen Phosphorylierungsmittels bei der Beendigung der Oligonukleotidsynthese ergibt ein Oligonukleotid, das am 3'-Ende eine Phosphatgruppe trägt. Das 3'-Phosphat-Ende kann durch Behandlung mit einer Chemikalie oder einem Enzym, wie beispielsweise einer Alkaliphosphatase, die vom Fachmann routinemäßig durchgeführt wird, zu einem 3'-Hydroxylende umgewandelt werden.
Eine andere Klasse von abspaltbaren Linkern ist von McLean u.a. in der PCT-Veröffentlichung WO 93/20092 beschrieben. Diese Klasse von abspaltbaren Linkem, die für zwei Oligonukleotide pro Synthese auch als TOPS bekannt ist, wurde erstellt, um zwei Oligonukleotide pro Synthese zu erzeugen, indem zuerst ein Oligonukleotid auf einem festen Träger synthetisiert wurde, der abspaltbare TOPS-Linker an das erste Oligonukleotid angelagert wurde, ein zweites Oligonukleotid auf dem TOPS-Linker synthetisiert wurde und schließlich der Linker sowohl vom ersten als auch zweiten Oligonukleotid abgespalten wurde. In der vorliegenden Erfindung kann allerdings das TOPS-Phosphoramidit verwendet werden, um eine nicht abspaltbare Hydroxylgruppe auf dem festen Träger in einen abspaltbaren Linker umzuwandeln, der zur Synthese einer großen Zahl von überlappenden Oligonukleotiden geeignet ist. Eine bevorzugte Ausführungsform von TOPS-Reagenzien ist das Universal TOPS^TM Phosphoramidit, das in der 3 gezeigt ist. Die Bedingungen für die Universal TOPS^TM Phosphoramiditherstellung, Kopplung and Abspaltung sind ausführlich in Hardy u.a., Nucleic Acids Research 22(15): 2998–3004 (1994) beschrieben, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das Universal TOPS^TM Phosphoramidit ergibt ein zyklisches 3'-Phosphat, das unter basischen Bedingungen entfernt werden kann, wie beispielsweise der ausgedehnten Ammoniak- und/oder Ammoniak/Methylamin-Behandlung, was zu dem natürlichen 3'-Hydroxyoligonukleotid führt.
Ein abspaltbarer Aminolinker kann auch für die Synthese von überlappenden Oligonukleotiden verwendet werden. Die sich ergebenden Oligonukleotide, die über eine Phosphoramiditverbindung an den Linker gebunden sind, können mit 80%iger Essigsäure abgespalten werden, was zu einem 3'-phosphorylierten Oligonukleotid führt.
In einer anderen Ausführungsform können spaltbare Stellen, die in dem modifizierten Oligonukleotid enthalten sind, Nukleotide aufweisen, die durch ein Enzym, wie beispielsweise Nukleasen, Glycosylasen etc., abspaltbar sind. Eine große Auswahl von Oligonukleotidbasen, z.B. Uracil, kann durch DNA-Glycosylasen entfernt werden, die die N-Glycosylbindung zwischen der Base und Deoxyribose abspaltet und so eine abasische Stelle hinterlässt. Krokan u.a., Biochem. J., 325: 1–16 (1997). Die abasische Stelle in einem Oligonukleotid kann dann durch Endonuklease IV abgespalten werden, was zu einem freien 3'-OH-Ende führt. In einer anderen Ausführungsform kann die abspaltbare Stelle eine abspaltbare Restriktionsendonukleasestelle, wie beispielsweise Restriktionsenzyme der Klasse IIs, sein. Zum Beispiel kann die BpmI-, BsgI-, BseRI-, BsmFI- und FokI-Erkennungssequenz in den immobilisierten Oligonukleotiden aufgenommen sein und anschließend abgespalten werden, um Oligonukleotide freizusetzen.
In einer anderen Ausführungsform kann die abspaltbare Stelle in einem immobilisierten Oligonukleotid einen photospaltbaren Linker aufweisen, wie beispielsweise die ortho-Nitrobenzyl-Klasse von photospaltbaren Linkern. Die Synthese- und Abspaltbedingungen von photolabilen Oligonukleotiden auf festen Trägern sind in Venkatesan u.a., J. of Org. Chem. 61: 525–529 (1996), Kahl u.a., J. of Org. Chem. 64: 507–510 (1999), Kahl u.a., J. of Org. Chem. 63: 4870–4871 (1998), Greenberg u.a., J. of Org. Chem. 59: 746–753 (1994), Holmes u.a., J. of Org. Chem. 62: 2370–2380 (1997) und dem US-Patent Nr. 5,739,386 beschrieben. Auf ortho-Nitrobenzyl basierende Linker, wie beispielsweise Hydroxymethyl-, Hydroxyethyl- und Fmoc-Aminoethylcarbonsäure-Linker, sind auch im Handel erhältlich.
Bestimmung von überlappenden Oligonukleotiden, die für die interessante, lange DNA-Sequenz kodieren
Die vorliegende Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren zum Synthetisieren und Zusammensetzen einer langen DNA-Sequenz aus einer Anordnung von überlappenden Oligonukleotiden dar. Vorzugsweise liegt die Größe der langen DNA-Region im Bereich von etwa 200 bis 10.000 Basen. Besonders bevorzugt liegt die Größe der langen DNA-Region im Bereich von etwa 400 bis 5.000 Basen. Die interessante lange DNA-Sequenz kann in eine Reihe von überlappenden Oligonukleotiden geteilt werden. Bei dem Zusammensetzen der langen DNA-Sequenz ist es nicht notwendig, dass jede Base, sowohl der Sense- als auch Antisense-Strang, der interessanten langen DNA-Sequenz synthetisiert wird. Die überlappenden Oligonukleotide sind üblicherweise erforderlich, um gesammelt für beide Stränge der interessanten DNA-Region zu kodieren. Die Länge von jedem überlappenden Oligonukleotid und das Ausmaß der Überlappung können variieren, je nach den Verfahren und Bedingungen von Oligonukleotidsynthese und -zusammenbau. Mehrere allgemeine Faktoren können berücksichtigt werden, zum Beispiel die Kosten und Fehler im Zusammenhang mit dem Synthetisieren von mäßig großen Oligonukleotiden, die Hybridisierungstemperatur und Ionenstärke der überlappenden Oligonukleotide, die Bildung von einzelnen Überlappungen und die Minimierung einer nicht spezifischen Bindung und intramolekularen Basenpaarung etc. Obwohl es im Prinzip keine inhärente Begrenzung für die Zahl der überlappenden Oligonukleotide gibt, die zu deren Zusammensetzen zur Zielsequenz verwendet werden kann, liegt die Zahl der überlappenden Oligonukleotide vorzugsweise etwa 10 bis 2.000 und besonders bevorzugt etwa 10 bis 500.
Insbesondere ist für das Zusammensetzverfahren mittels DNA-Polymerase eine einzelne Überlappung bevorzugt, um die korrekte Größe der langen DNA-Sequenz nach dem Zusammensetzen zu erzeugen. Einzelne Überlappungen können durch Erhöhen des Überlappungsgrads erzielt werden. Allerdings steigert eine Erhöhung des Überlappungsgrads die Zahl der erforderlichen Basen, was natürlicherweise zusätzliche Kosten bei der Oligonukleotidsynthese verursacht. Der Fachmann wählt die optimale Länge der überlappenden Oligonukleotide und die optimale Länge der Überlappung, die für die Oligonukleotidsynthese und die Zusammensetzverfahren geeignet sind, aus. Insbesondere kann bei den Sequenzen von jeder der überlappenden Regionen eine Computerrecherche von beiden Strängen der Zielsequenz verwendet werden, um den einzelnen Oligonukleotidaufbau mit der geringsten Wahrscheinlichkeit einer gegebenen nicht spezifischen Bindung zu zeigen. Vorzugsweise kann die Länge jedes Oligonukleotids im Bereich von etwa 10 bis 200 Basen liegen. Besonders bevorzugt ist die Länge von jedem Oligonukleotid im Bereich von etwa 20 bis 100 Basen. Vorzugsweise überlappen die Oligonukleotide ihre Komplements um etwa 10 bis 100 Basen. Das unterste Ende des Bereichs, eine Überlappung von mindestens 10 Basen, ist notwendig, um ein stabiles Priming der Polymeraseverlängerung von jedem Strang zu erzeugen. Am oberen Ende enthalten maximal überlappte Oligonukleotide von 200 Basen Länge 100 Basen komplementäre Überlappung. Besonders bevorzugt können die überlappenden Regionen im Bereich von etwa 15–20 Basenpaaren Länge so aufgebaut sein, dass sie eine gewünschte Schmelztemperatur z.B. im Bereich von 52–56°C ergeben, um die Oligonukleotidspezifität sicherzustellen. Es kann auch bevorzugt sein, dass alle überlappenden Oligonukleotide ein ähnliches Ausmaß an Überlappung aufweisen und daher eine ähnliche Hybridisierungstemperatur, die die Hybridisierungsbedingungen während der PCR-Zyklen normalisieren.
Oligonukleotidsynthese
Die Oligonukleotidsynthese kann am besten durch Verwenden einer Auswahl von Chips oder Mikroarrays auf der Grundlage von Oligonukleotidsyntheseverfahren erzielt werden. Eine herkömmliche Festphasen-Oligonukleotidsynthese auf CPG kann angewendet werden, insbesondere wenn die Zahl der Oligonukleotide, die zum Zusammensetzen der gewünschten DNA-Sequenz erforderlich ist, gering ist. Die Oligonukleotide können auf einem automatisierten DNA-Synthetisierer, zum Beispiel auf einem Applied Biosystems 380A-Synthetisierer, mittels 5-Dimethoxytritylnukleosid-β-cyanoethyl-phosphoramidite synthetisiert werden. Die Synthese kann auf einem festen CPG-Träger im 0.2 μM Bereich und einer durchschnittlichen Porengröße von 1000 ' durchgeführt werden. Die Oligonukleotide können durch Gelelektrophorese, HPLC oder andere geeignete, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gereinigt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen können Oligonukleotide durch die In-situ-Synthese auf einem festen Träger schrittweise hergestellt werden. Mit jeder Syntheserunde können Nukleotidbausteine wachsenden Ketten zugefügt werden, bis die gewünschte Sequenz und Länge an jeder Stelle erreicht sind. Insbesondere kann die In-situ-Synthese von Oligonukleotiden die „drop-on-demand"-Methode anwenden, die eine Technik verwendet, die der bei Tintenstrahldruckern verwendeten analog ist. Die US-Patente Nr. 5,474,796, 5,985,551, 5,927,547, Blanchard u.a., Biosensors and Biolelektronics 11: 687–690 (1996) und Schena u.a., TIBTECH 16: 301–306 (1998). Dieser Ansatz verwendet typischerweise piezoelektrische oder andere Formen des Ausstosses, um Reagenzien von Miniaturdüsen auf feste Oberflächen zu übertragen. Zum Beispiel bewegt sich der Druckerkopf über die Anordnung und an jeder Stelle zieht sich das elektrische Feld zusammen und drückt ein Mikrotröpfchen der Reagenzien auf die Anordnungsfläche. Nach dem Waschen und Entschützen wird der nächste Zyklus der Oligonukleotidsynthese durchgeführt. Der Schritt führt zum piezoelektrischen Druckverfahren, das typischerweise gleich und sogar überlegen zur herkömmlichen CPG-Oligonukleotidsynthese ist. Das „drop-on-demand"-Verfahren ermöglicht das hochdichte Rasterverfahren von praktisch allen interessanten Reagenzien. Es ist auch leichter, dieses Verfahren zu verwenden, um die umfangreiche Chemie auszunutzen, die bereits für die Oligonukleotidsynthese entwickelt wurde, zum Beispiel die Flexibilität bei den Sequenzaufbauten, die Synthese von Oligo nukleotidanalogen, die Synthese in der 5'-3'-Richtung etc., Weil die Tintenstrahltechnik keinen direkten Oberflächenkontakt erfordert, ist eine piezoelektrische Abgabe zu einer sehr hohen Durchsatzleistung verbesserungsfähig.
In bevorzugten Ausführungsformen kann eine piezoelektrische Pumpe dazu verwendet werden, Reagenzien der In-situ-Synthese von Oligonukleotiden zuzugeben. Mikrotröpfchen von 50 Pikolitern bis 2 Mikrolitern Reagenzien können an die Anordnungsfläche abgegeben werden. Die Auslegung, Konstruktion und Anlage einer piezoelektrischen Pumpe sind in den US-Patenten Nr. 4,747,796 und 5,985,551 beschrieben. Die piezoelektrische Pumpe kann winzige Tröpfchen Flüssigkeit sehr präzise an eine Oberfläche abgeben. Zum Beispiel ist eine Pikopumpe in der Lage, Pikoliter an Reagenzien bei bis zu 10.000 Hz zu erzeugen, und sie trifft genau ein 250 um großes Ziel in einer Entfernung von 2 cm.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können hydrophile/hydrophobe Anordnungen oder Oberflächenspannungsanordnungen verwendet werden, die aus strukturierten Regionen von hydrophilen und hydrophoben Flächen bestehen. US-Patente Nr. 4,747,796 und 5,985,551. Eine hydrophile/hydrophobe Anordnung kann große Mengen an hydrophilen Regionen auf einem hydrophoben Hintergrund enthalten. Jede hydrophile Region ist räumlich wegen der hydrophoben Matrix zwischen hydrophilen Punkten von der benachbarten hydrophilen Region getrennt. Die beschriebenen Oberflächenspannungsanordnungen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Typischerweise hat die Trägerfläche etwa 10–50 × 10^–15 mol funktionsfähige Bindungsstellen pro mm² und jede funktionalisierte Bindungsstelle hat einen Durchmesser von etwa 50–2000 μm.
Es gibt signifikante Vorteile zur Herstellung von Anordnungen durch Oberflächenspannungslokalisierung und Reagenzmikroabgabe. Die Lithographie und Chemie, die zur Strukturierung der Substratoberfläche verwendet werden, sind allgemeine Verfahren, die nur die Fertigungstechnik und -verteilung definieren. Sie sind vollständig unabhängig von den Oligonukleotidsequenzen, die an jeder Stelle synthetisiert oder abgegeben werden. Darüber hinaus verwendet die Oligonukleotidsynthesechemie Standard- und nicht Kundensynthesereagenzien.
Das kombinierte Ergebnis ist eine vollständige Ausgestaltungsflexibilität sowohl im Hinblick auf die Sequenzen als auch die Längen der Oligonukleotide, die in der Anordnung verwendet werden, die Zahl und Anordnung von Anordnungseinrichtungen und die Chemie, die zu ihrer Herstellung verwendet wird. Es gibt keine Kosten, die mit der Änderung der Zusammensetzung einer Anordnung verbunden sind, sobald sie einmal ausgestaltet wurde. Dieses Verfahren stellt ein kostengünstiges, flexibles und reproduzierbares Verfahren für die Anordnungsherstellung zur Verfügung.
Im Wesentlichen kann die Herstellung von hydrophilen/hydrophoben Anordnungen das Beschichten einer festen Oberfläche mit einer Photoresistsubstanz und dann die Verwendung einer allgemeinen Photomaske beinhalten, um die Anordnungsstrukturen zu definieren, indem sie dem Licht ausgesetzt werden. Positive oder negative Photoresistsubstanzen sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel können eine optische positive Photoresistsubstanz, z.B. AZ 1350 (Novolac^TM Hoechst Celanese^TM, Novalac^TM ist ein geschütztes Novolakharz, das das Reaktionsprodukt von Phenolen mit Formaldehyd in einem Säurekondensationsmedium ist), oder eine positive Elektronenstrahl-Photoresistsubstanz, z.B. EB-9 (Polymethacrylat von Hoya^TM) verwendet werden.
Die mit Photoresistsubstanz beschichte Oberfläche wird anschließend freigelegt und entwickelt, um eine strukturierte Region einer ersten freigelegten Trägerfläche zu erzeugen. Die freigelegte Oberfläche wird dann mit einem Fluoralkylsilan reagiert, um eine stabile hydrophobe Matrix zu bilden. Das verbleibende Photoresist wird dann entfernt und der Glaschip mit einem Aminosilan oder einem eine Hydroxygruppe tragenden Silan reagiert, um hydrophile Punkte zu bilden. Alternativ kann die strukturierte Trägerfläche dadurch hergestellt werden, dass eine Trägerfläche mit einem Hydroxy- oder Aminoalkylsilan reagiert wird, um eine derivatisierte hydrophile Trägerfläche zu bilden. Die Trägerfläche wird dann mit o-Nitrobenzylcarbonylchlorid als temporäre photolabile Blockierung reagiert, um eine photoblockierte Trägerfläche vorzusehen. Die photoblockierte Trägerfläche wird dann dem Licht durch eine Maske ausgesetzt, um nicht blockierte Flächen auf der Trägerfläche mit nicht blockiertem Hydroxy- oder Aminoalkylsilan zu erzeugen. Die freigelegte Oberfläche wird dann mit Perfluoralkanoylhalogenid oder Perfluoralkylsulfonylhalogenid reagiert, um eine stabile hydrophobe (Perfluoracyl- oder Perfluoralkylsulfonamid)alkylsiloxanmatrix zu bilden. Diese verbleibende photoblockierte Trägerfläche wird anschließend freigelegt, um strukturierte Regionen des nicht blockierten Hydroxy- oder Aminoalkylsilans zu erzeugen und so die derivatisierten hydrophilen Bindungsstellenregionen zu bilden. Es kann eine Anzahl von Siloxan funktionalisierenden Reagenzien verwendet werden. Zum Beispiel Hydroxyalkylsiloxane, Diol(dihydroxyalkyl)siloxane, Aminoalkylsiloxane und dimere sekundäre Aminoalkylsiloxane können verwendet werden, um die strukturierten hydropilen Hydroxyl- oder Aminoregionen zu erlangen.
Eine Zahl von festen Trägern kann bei der Oligonukleotidsynthese mittels einer piezoelektrischen Pumpe verwendet werden. Es gibt zwei wichtige Charakteristika der maskierten Oberflächen bei der strukturierten Oligonukleotidsynthese. Zuerst muss die maskierte Oberfläche gegenüber den Bedingungen der gewöhnlichen Oligonukleotidsynthese inert sein. Die maskierte Oberfläche darf keine freien Hydroxy- oder Aminogruppen für die Feststoff/Lösungsmittel-Trennfläche bieten. Zweitens muss die Oberfläche schlecht netzbar durch herkömmliche organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Acetonitril und die Glycolether, im Hinblick auf die polareren funktionalisierten Bindungsstellen sein. Das Netzphänomen ist ein Maß für die Oberflächenspannung oder Anziehungskräfte zwischen Molekülen an einer Fest-Flüssig-Trennfläche und wird in Dyn/cm² definiert. Fluorkohlenstoffe besitzen wegen der einzelnen Polarität (Elektronegativität) der Kohlenstoff-Fluor-Bindung eine sehr niedrige Oberflächenspannung. In eng strukturierten Langmuir-Blodgett-Filmen wird die Oberflächenspannung einer Schicht hauptsächlich durch den prozentualen Anteil von Fluor in der Endstelle der Alkylketten bestimmt. Für fest angeordnete Filme macht eine einzelne terminale Trifluormethylgruppe eine Oberfläche fast so lipophob wie eine Perfluoralkylschicht. Wenn Fluorkohlenstoffe kovalent an einen zugrunde liegenden derivatisierten festen (stark vernetzten polymeren) Träger gebunden sind, wird die Dichte der reaktiven Stellen generell unter der von Langmuir-Blodgett- und Gruppendichte liegen. Allerdings bewahrt die Verwendung von Perfluoralkylmaskierungsmitteln einen relativ hohen Fluorgehalt in der dem Lösungsmittel zugänglichen Region der tragenden Fläche.
Glas (Polytetrasiloxan) ist besonders geeignet für die strukturierte Oligonukleotidsynthese mittels einer piezoelektrischen Pumpe zur Abgabe von Reagenzien wegen der zahlreichen Verfahren, die von der Halbleiterindustrie mittels Dickfilmen (1–5 μm) von Photoresists entwickelt wurden, um maskierte Strukturen von freigelegten Glasoberflächen zu erzeugen. Die erste freigelegte Glasoberfläche kann vorzugsweise mit flüchtigen Fluoralkylsilanen mittels Gasphasendiffusion derivatisiert werden, um eng gepackte lipophobe Monoschichten zu erzeugen. Das polymerisierte Photoresist stellt eine wirksam undurchdringliche Barriere für das gasförmige Fluoralkylsilan während der Zeit der Derivatisierung der freigelegten Region zur Verfügung. Nach einer lipophoben Derivatisierung kann allerdings das verbleibende Photoresist ohne weiteres durch Lösung in warmen, organischen Lösungsmitteln (Methyl, Isobutyl, Keton oder N-Methylpyrrolidon) entfernt werden, um eine zweite Oberfläche des rohen Glases freizulegen, während die erste aufgebrachte Silanschicht intakt bleibt. Dieses Glas der zweiten Region kann dann entweder durch ein Lösungs- oder Gasphasenverfahren mit einem zweiten, polaren Silan derivatisiert werden, das entweder eine Hydroxy- oder eine Aminogruppe enthält, die für ein Verankern der Festphasen-Oligonukleotidsynthese geeignet ist. Siloxane haben unter stark alkalischen Bedingungen eine etwas begrenzte Stabilität.
Eine Zahl von organischen Polymeren besitzt auch gewünschte Charakteristika für strukturierte hydrophile/hydrophobe Anordnungen. Zum Beispiel kann Teflon (Polytetrafluorethylen) eine ideale lipophobe Oberfläche zur Verfügung stellen. Die strukturierte Derivatisierung dieser Art Material kann durch reaktive Ionen- oder Plasmaätzung durch eine physikalische Maske oder mittels eines Elektronenstrahls und anschließende Reduktion zu Oberflächenhydroxymethylgruppen erzielt werden. Polypropylen/Polyethylen kann durch Gammabestrahlung oder Chromsäureoxidation oberflächenderivatisiert werden und zu hydroxy- oder aminomethylierten Oberflächen umgewandelt werden. Stark vernetztes Polystyroldivinylbenzol (etwa 50%) ist nicht quellfähig und kann leicht durch Chlormethylierung oberflächenderivatisiert und anschließend zu anderen funktionellen Gruppen umgewandelt werden. Nylon stellt eine Anfangsoberfläche von Hexylaminogruppen zur Verfügung, die direkt aktiv sind. Die lipophobe Strukturierung dieser Oberflächen kann mittels desselben Typs von auf Lösung basierenden Dünnfilm- Maskierungsverfahren und Gasphasenderivatisierung wie Glas oder durch eine direkte photochemische Strukturierung mittels o-Nitrobenzylcarbonylblockierungsgruppen bewirkt werden. Anschließend an die Strukturierung dieser Oberflächen werden geeignete abspaltbare Linker mit der reaktiven Gruppe, wie beispielsweise der Hydroxy- oder Aminogruppe, vor der Zugabe von Nukleosidphosphoramidit verbunden.
Nach der Derivatisierung des Anfangssilans wie oben beschrieben wird das Zusammensetzen von Oligonukleotiden auf die präparierten Punkte gemäß dem Phosphoramiditverfahren durchgeführt. Acetonitril wird durch ein hochsiedendes Gemisch aus Adiponitril und Acetonitril (4:1) ersetzt, um ein Verdampfen des Lösungsmittels auf einer offenen Glasoberfläche zu verhindern. Die Abgabe der blockierten Phosphoramidite und des Aktivators (S-Ethyltetrazol) wird mittels einer Pikopumpenvorrichtung auf einzelne Stellen gerichtet. Alle anderen Schritte, einschließlich das Detritylieren, Abdecken („capping"), die Oxidation und das Waschen werden auf der Anordnung in einem chargenweisen Verfahren durch Fluten der Oberfläche mit den geeigneten Reagenzien durchgeführt.
Nach dem Abschluss der Synthese können die überlappenden Oligonukleotide vor oder während des Zusammensetzschritts abgespalten werden. Zum Beispiel können die Oligonukleotide von festen Trägern durch Standardentschützungsverfahren, wie beispielsweise Ammoniak- oder Methylamin/Ammoniak-Behandlung, abgespalten werden. Das sich ergebende Gemisch von entschützten Oligonukleotiden kann direkt für das Zusammensetzen verwendet werden.
Zusammensetzen von überlappenden Oligonukleotiden zur Zielsequenz voller Länge
Das Zusammensetzen der langen Ziel-DNA-Sequenz aus einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden kann mittels einer Auswahl von Verfahren in der dem Fachmann bekannter Literatur erreicht werden. Der Standardansatz ist es, die enzymatische Ligation zu verwenden, um zur Ziel-DNA der gewünschten Länge zu kommen. Die überlappenden Oligonukleotide können hybridisiert werden, um eine doppelsträngige DNA-Sequenz mit einzelsträngigen und/oder doppelsträn gigen Brüchen zu bilden. Diese Brüche können dann mit einer DNA-Polymerase gefüllt und/oder enzymatisch mittels DNA-Ligasen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren ligiert werden. Die intermolekulare Ligation der 5'- und 3'-Enden von Oligonukleotiden durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung erfordert typischerweise ein Oligonukleotid, das eine 5'-Phosphoryldonorgruppe und eine andere mit einem freien 3'-Hydroxylakzeptor trägt. Die Oligonukleotide können mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren phosphoryliert werden. Die Ziel-DNA-Sequenz voller Länge kann dann mit auf PCR beruhenden Verfahren amplifiziert oder in einen Vektor nach Wahl mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren kloniert werden. Zusätzliche Zusammensetzverfahren umfassen auch die Verwendung eines Restriktionsenzyms oder einer DNA-Polymerase.
1. Zusammenbau mittels eines Restriktionsenzyms
Restriktionsenzyme können dazu verwendet werden, um kurze Oligonukleotide zu langen DNA-Sequenzen zusammenzusetzen. Ein Restriktionsenzym ist eine Gruppe von Enzymen, die DNA intern an bestimmten Basensequenzen spalten. Als Beispiel kann eine auf ein Oligonukleotid gerichtete Doppelstrangbruchreparatur verwendet werden. Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7177–7181 (1986); Mandecki u.a., Gene 68: 101–107 (1988) und Mandecki u.a., Gene 94: 103–107 (1990). Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren drei Schritte: (1) das Klonieren von geeigneten Inserts in eine Plasmid-DNA; (2) das Erzeugen von Restriktionsfragmenten mit vorstehenden Enden von der das Insert enthaltenden Plasmid-DNA; und (3) das Zusammensetzen der Restriktionsfragmente zu der langen Ziel-DNA-Sequenz.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das Klonieren von Inserts in eine Plasmid-DNA in Schritt 1 mittels auf Oligonukleotid gerichteter Doppelstrangbruchreparatur durchgeführt werden, die auch als das Brücken-Mutageneseprotokoll bekannt ist. Die auf Oligonukleotid gerichtete Doppelstrangbruchreparatur umfasst im Wesentlichen die Transformation von E. coli mit einem denaturierten Gemisch aus einem oder mehr Oligonukleotidinserts und einer linearisierten Plasmid-DNA, wobei die 5'- und 3'-Enden der Oligonukleotidinserts homolog zu Sequenzen sind, die den Doppelstrangbruch (d.h. die Abspaltstelle) der linearisierten Plasmid-DNA flankieren. Die homologen Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden der Oligonukleotidinserts lenken in vivo die Reparatur des Doppelstrangbruchs der linearisierten Plasmid-DNA. Die homologe Sequenz zwischen jeder Seite des Doppelstrangbruchs und jedem Ende des Oligonukleotidinserts ist typischerweise über 10 nt lang. In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die homologen Sequenzen am 5'- und 3'-Ende der Oligonukleotide und den beiden Seiten des Doppelstrangbruchs FokI-Erkennungsstellen (5'-GGATG-3'). Eine Reihe von überlappenden Untersequenzen der Ziel-DNA-Sequenz ist zwischen den beiden FokI-Stellen eingesetzt.
Das FokI-Restriktionsenzym erzeugt einen versetzten Doppelstrangbruch an einer DNA-Stelle 9 und 13 nt weg von seiner Erkennungsstelle, wobei bei Abspaltung der Plasmid-DNA mit FokI eine Restriktion freigesetzt wird, die einzelne 4 nt lange vorstehende 5'-Enden hat. Die Einzigartigkeit der Enden erlaubt eine wirksame und direkte gleichzeitige Ligation der Restriktionsfragmente, um die lange Ziel-DNA-Sequenz zu bilden. Die Oligonukleotidinserts, die das FokI-Verfahren des Genzusammenbaus verwenden, werden durch Teilen der langen Ziel-DNA-Sequenz zu einer Reihe von Untersequenzen von klonierbarer Größe ausgebildet, die typischerweise im Bereich von 20 nt bis 200 nt liegt. Die Teilungsstellen können vorzugsweise zwischen den Kodons des offenen Leserahmens (ORF) der langen Ziel-DNA-Sequenz liegen. Jede Untersequenz kann ihre benachbarte Untersequenz auf beiden Seiten um vier nt überlappen, so dass die überlappenden Regionen komplementäre kohäsive Enden bilden, wenn die klonierten Untersequenzen mit dem FokI-Restriktionsenzym aus der Plasmid-DNA entfernt werden. Insbesondere werden die überlappenden Untersequenzen typischerweise so ausgewählt, dass sie einzigartig sind, was sicherstellt, dass sie aneinander in der richtigen Anordnung während des Zusammensetzens von Untersequenzen zu der langen Ziel-DNA-Sequenz nach der FokI-Abspaltung hybridisiert werden können. Insbesondere kann, wenn es eine FokI-Stelle in der Ziel-DNA-Sequenz gibt, diese vorzugsweise in einer überlappenden Region angeordnet sein, die bewirkt, dass an dieser Stelle eine FokI-Abspaltung außerhalb der klonierten Regionen fällt. Sobald die Untersequenzen, die die vier nt Überlappung enthalten, bestimmt worden sind, können Sequenzen der Oligonukleotidinserts durch Zuga be von zwei Armen erhalten werden, um die notwendige Sequenzhomologie an beiden Seiten des Doppelstrangbruchs des DNA-Plasmids vorzusehen. Die Sequenz der Oligonukleotidinserts nehmen daher die Form von Arm1 + Untersequenz (enthaltend 4 nt Überlappung) + Arm2 an, wobei Arm1 und Arm2, die jeweils die FokI-Stelle enthalten, homolog zur jeweiligen Seite des Doppelstrangbruchs des DNA-Plasmids sind. Die Gesamtlänge der Oligonukleotidinserts kann variiert werden, um die Wirksamkeit der Bruchreparatur zu optimieren. Darüber hinaus kann die Position der Untersequenz im Hinblick auf die homologen Stellen auch variiert werden, um die Wirksamkeit der Reparatur zu optimieren. Es ist bekannt, dass die Wirksamkeit der Reparatur abnimmt, wenn der Abstand zwischen der Untersequenz und der homologen Sequenz größer wird. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen mittels des FokI-Verfahrens des Genzusammenbaus beträgt die durchschnittliche Länge einer Untersequenz etwa 70 nt, und Arm1 und Arm2 der Oligonukleotidinserts betragen jeweils 15 nt, enthaltend die FokI-Stelle und Sequenzen komplementär zu Sequenzen, die den Doppelstrangbruch der Plasmid-DNA flankieren. Daher ist bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die durchschnittliche Länge des Oligonukleotidinserts 100 nt (Arm1 + Untersequenz + Arm2).
Die Oligonukleotidinserts können dann durch das Brücken-Mutageneseprotokoll in einen geeigneten Vektor kloniert werden. Ein geeignetes Plasmidsystem kann beruhend auf dem Bestehen einer Anhäufung von einzelnen Restriktionsstellen zur Abspaltung von Plasmid-DNA und der Durchführbarkeit eines leichten und genauen Screening-Verfahrens für das Insert, enthaltend Kolonien des Plasmids, ausgewählt werden. Ein Farbscreening-Verfahren ist besonders bevorzugt. Es kann das pUC-Plasmid, das mehrere Klonierungsstellen und ein Indikatorgen (das LacZ-Gen oder ein Fragment davon) enthält, verwendet werden. Insbesondere kann eine Frame-shift-Mutation in die Mehrfachklonierungsstelle von pUC eingeführt werden, um ein geeignetes Screening-Verfahren zu bewirken. Zum Beispiel kann eine Deletion von einem Rest an der PstI-Stelle in das pUC-Plasmid eingeführt werden. Das Oligonukleotidinsert, das in das mutierte Plasmid eingeführt wird, kann dann ein extra Nukleotid enthalten, um den Leserahmen von lacZ wiederherzustellen, wenn die Reparatur des Doppelstrangbruchs der Plasmid-DNA stattfindet. Auf diese Weise werden die Insert enthaltenden Plas mide sofort ausgewählt, wenn das reparierte Plasmid (oder enthaltene Insert) blaue Kolonien bildet, während die Zellen, die das Nukleotiddeletions(Vorgänger bzw. Mutter)-Plasmid enthalten, weiße Kolonien erzeugen. Es ist auch vorteilhaft, dass alle Insertionen, die in das Plasmid eingeführt werden, so aufgebaut sind, dass sie eine einzelne Restriktionsstelle in den Mehrfachklonierungsstellen zerstören und gleichzeitig eine neue Restriktionsstelle erzeugen. Dieses Merkmal ermöglicht eine zusätzliche Bestätigung des Insertions-Ereignisses durch den Restriktionsverdau der Plasmid-DNA. Ein geeignetes DNA-Plasmid, das für das FokI-Verfahren des Genzusammenbaus verwendet wird, kann mit einem Restriktionsenzym, vorzugsweise einer einzelnen Restriktionsstelle, geschnitten werden. Während es günstig ist, dass das linearisierte Plasmid durch Restriktionsenzymabspaltung an einer Stelle erhalten wird, zieht die vorliegende Erfindung auch andere Verfahren zur Herstellung von linearisierter Plasmid-DNA zum Beispiel durch Restriktionsenzymabspaltung an mehreren Stellen, durch Rekonstruktion eines linearen Plasmids, durch Ligation von DNA-Fragmenten oder willkürliche Spaltung der DNA mittels DNase-Verdau, Ultraschallbehandlung usw. in Betracht. Das linearisierte DNA-Plasmid kann mit den Oligonukleotid-Inserts unter denaturierenden Bedingungen gemischt werden und das Gemisch kann zu einem geeigneten Organismus, wie beispielsweise E. coli, mit geeigneten kompetenten Zellen unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren transformiert werden. Die Konditionen können variiert werden, um die Wirksamkeit der Reparatur zu verbessern, zum Beispiel das Molverhältnis der Oligonukleotidinserts und der Plasmid-DNA, die denaturierenden Bedingungen etc. Typischerweise ist ein molarer Überschuss von Oligonukleotid gegenüber Plasmid-DNA für eine wirksame Reparatur des Doppelstrangs, typischerweise im Bereich von 10-fach bis 1000-facher molarer Überschuss der Oligonukleotidinserts, notwendig. Es kann auch notwendig sein, die lineare Plasmid-DNA vor der Transformation zu denaturieren, zum Beispiel durch Inkubation des Gemischs aus Plasmid-DNA und Oligonukleotidinserts bei 100°C für 3 min. Plasmidkonstrukte, die die FokI-Fragmente enthalten, können mittels des entwickelten Screening-Verfahrens ausgewählt werden.
Das das Insert enthaltende DNA-Plasmid kann dann mit FokI (New England Bio-Labs) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verdaut werden. Die FokI-Fragmente können dann gereinigt und miteinander in einer einzigen Ligationsreaktion gemäß einem auf dem Fachgebiet bekannten Standardprotokoll verbunden werden. Die FokI-Fragmente der Oligonukleotidinserts enthalten Untersequenzen mit einzelnen komplementären 4-bp Überhängen, die bei Hybridisierung und Ligation die lange Ziel-DNA-Sequenz bildeten. Es ist zu beachten, dass die Ligation des FokI-Restriktionsfragments nicht auf DNA-Fragmente, die durch die Brückenmutagenese eingeführt werden, begrenzt ist. Vorstehende Enden mit 4 nt 5'-Überhängen können durch andere Verfahren erzeugt werden, zum Beispiel durch FokI-Verdau einer DNA-Sequenz. Das erfolgreiche Zusammensetzen der langen Ziel-DNA-Sequenz kann durch DNA-Sequenzierung, ein auf Hybridisierung beruhendes Diagnoseverfahren, molekularbiologische Verfahren, wie beispielsweise Restriktionsverdau, Selektionsmarker oder andere geeignete Verfahren verifiziert werden. DNA-Manipulationen und Enzymbehandlungen werden gemäß etablierten Protokollen auf dem Fachgebiet und von den Herstellern empfohlenen Verfahren durchgeführt. Geeignete Verfahren sind in Sambrook u.a. (2. Ausg.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982, 1989); Methods in Enzymol. (Bd. 68, 100, 101, 118 und 152–155) (1979, 1983, 1986 und 1987); und DNA Cloning, D. M. Clover, Hrsg., IRL Press, Oxford (1985) beschrieben worden.
Ein Zusammensetzverfahren unter Verwendung von Oligonukleotid gelenkter Doppelstrangbruchreparatur ist besonders flexibel, wenn es nicht das Vorhandensein von irgendwelchen Restriktionsstellen in der Ziel-DNA-Sequenz erfordert. Die Kosten dieses Verfahrens sind wegen der Verringerung der Gesamtlänge von synthetischem Oligonukleotid, das benötigt wird, um die lange Ziel-DNA-Sequenz zu konstruieren, niedrig. Nur ein DNA-Strang der Ziel-DNA-Sequenz muss synthetisch erhalten werden – im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren, wo beide DNA-Stränge synthetisch erzeugt werden. Das Verfahren ist genau mit einer geringen Häufigkeit an Sequenzfehler, weil die in vivo Doppelstrangreparatur und nicht die in vitro Ligation eine biologische Selektion der nicht modifizierten Oligonukleotide ermöglichen und das anschließende Screening von Insert enthaltenden Kolonien weiter die unerwünschten Rekombinationprodukte ausschaltet.
2. Zusammensetzen mittels auf PCR beruhender Verfahren
Auf PCR beruhende Verfahren können auch verwendet werden, um kurze Oligonukleotide zu langen DNA-Sequenzen zusammenzusetzen. PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Hrsg. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992. Die Polymerase, die zur Lenkung der Nukleotidsynthese verwendet wird, kann zum Beispiel E. coli DNA Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase, Polymerase-Muteine, wärmestabile Enzyme, wie beispielsweise Taq-Polymerase, Vent-Polymerase und dergleichen aufweisen.
Als Beispiel können self-priming PCR- oder DNA-Shuffling-Verfahren auch dazu verwendet werden, um kurze überlappende Oligonukleotide zu langen DNA-Sequenzen zusammenzusetzen. Dillon u.a., BioTechniques 9(3): 298–300 (1990), Hayashi u.a., BioTechniques 17(2): 310–315 (1994), Chen u.a., J. Am. Chem. Soc. 116: 8799–8800 (1994), Prodromou u.a., Protein Engineering 5(8): 827–829 (1992), Stemmer u.a., Gene 164: 49–53 (1995), US-Patente Nr. 5,830,721, 5,811,238, 5,830,721, 4,605,793, 5,834,252 und 5,837,458 und PCT-Veröffentlichungen WO 98/13487, WO98/27230, WO 98/31837, WO 88/41402, 99/57128 und WO 99/65927. Im Wesentlichen werden überlappende Oligonukleotide, die gesammelt die lange Ziel-DNA-Sequenz darstellen, gemischt und PCR-Reaktionen unterworfen, so dass diejenigen, die an den 3'-Enden überlappen, zu längeren Doppelstrangprodukten verlängert und wiederholt werden, bis die Zielsequenz voller Größe erhalten wird.
Die überlappenden Oligonukleotide können in einem Standard-PCR, enthaltend dNTP, DNA-Polymerase nach Wahl und Puffer, gemischt werden. Die überlappenden Enden der Oligonukleotide erzeugen nach der Hybridisierung kurze Regionen doppelsträngiger DNA und dienen als Primer für die Verlängerung durch DNA-Polymerase in eine PCR-Reaktion. Produkte der Verlängerungsreaktion dienen als Substrate für die Bildung einer längeren doppelsträngigen DNA, was schließlich zur Synthese der Zielsequenz voller Länge führt. Die PCR-Bedingungen können so optimiert werden, dass die Ausbeute der langen Ziel-DNA-Sequenz gesteigert wird. Die Wahl der DNA-Polymerase für die PCR-Reaktionen beruht auf ihren Eigenschaften. Zum Beispiel können thermostabile Polymerasen, wie beispielsweise Taq-Polymerase, verwendet werden. Darüber hinaus kann Vent-DNA-Polymerase vorrangig gegenüber Taq-Polymerase ausgewählt werden, weil es eine 3'-5'-Korrekturleseaktivität, eine Strangversetzaktivität und eine viel geringere terminale Transferaseaktivität besitzt, die alle dazu dienen, die Wirksamkeit und Genauigkeit der PCR-Reaktionen zu verbessern.
Obwohl es möglich ist, die Zielsequenz in einem einzelnen Schritt durch Mischen von allen überlappenden Oligonukleotiden zu erhalten, können PCR-Reaktionen auch in mehreren Schritten durchgeführt werden, so dass größere Sequenzen aus einer Reihe von getrennten PCR-Reaktionen, deren Produkte gemischt und einer zweiten PCR-Runde unterworfen werden, zusammengesetzt werden können. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass die Zugabe von 5'- und 3'-Primern am Ende der ersten Runde der PCR-Reaktionen vorteilhaft ist, um das DNA-Produkt voller Länge zu erzeugen. In anderen Fällen können zusätzliche Sequenzen, wie beispielsweise Restriktionsstellen, eine Shine-Dalgarno-Sequenz und ein Transkriptionsterminator etc. wünschenswert zur Zielsequenz zugefügt werden, um ein anschließendes Klonieren des Zielsequenzgens in Expressionsvektoren zu erleichtern. Diese neuen Sequenzen können zusätzliche Primer und zusätzliche PCR-Reaktionen erforderlich machen. Darüber hinaus kann, wenn die selfpriming PCR kein Produkt voller Länge aus einer einzelnen Reaktion erzeugt, das Zusammensetzen durch getrennt PCR-amplifizierende Paare von überlappenden Oligonukleotiden oder kleineren Abschnitten der Ziel-DNA-Sequenz oder durch das herkömmliche Einfüll- und Ligationsverfahren gerettet werden.
Das erfolgreiche Zusammensetzen der langen Ziel-DNA-Sequenz kann durch DNA-Sequenzierung, ein auf Hybridisierung beruhendes Diagnoseverfahren, molekularbiologische Techniken, wie beispielsweise Restriktionsverdau, Selektionsmarker oder andere geeignete Verfahren verifiziert werden. DNA-Manipulationen und Enzymbehandlungen werden gemäß auf dem Fachgebiet etablierter Protokolle und von Herstellern empfohlenen Verfahren durchgeführt. Geeignete Techniken sind in Sambrook u.a. (2. Ausg.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982, 1989); Methods in Enzymol. (Bd. 68, 100, 101, 118 und 152–155) (1979, 1983, 1986 und 1987); und DNA Cloning, D. M. Clover, Hrsg., IRL Press, Oxford (1985) beschrieben worden.
Es gibt mehrere Vorteile für das Zusammensetzverfahren mittel auf PCR beruhender Verfahren. Es erfordert generell weder eine Phosphorylierung noch eine Ligation und ergibt große Ausbeuten. Die Kosten dieses Verfahrens sind relativ niedrig, weil es die Zahl der Oligonukleotide, die für synthetische Konstruktionen benötigt werden, reduziert. Nur Oligonukleotide, die die teilweise Sequenz von jedem Strang darstellen, werden synthetisiert und die Lücken in den hybridisierten Oligonukleotiden werden mittels DNA-Polymerase während der PCR gefüllt. Das Zusammensetzen von überlappenden Oligonukleotiden kann in einer Eintopf-Einschritt-PCR ohne das Erfordernis einer Isolation und Reinigung von Zwischenprodukten erreicht werden. Insbesondere ist eine Gelreinigung von Oligonukleotiden nicht notwendig und unverarbeitete Oligonukleotidherstellungen können direkt für die PCR verwendet werden. Weiterhin ist dieses Zusammensetzverfahren genau und erfordert nicht das Vorhandensein von Restriktionsenzymstellen in der Zielsequenz.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter. Diese Beispiele sollen die vorliegende Erfindung nur veranschaulichen und sind nicht als einschränkend auszulegen. Die Beispiele sollen besonders das veranschaulichen, was durch das Verfahren im Umfang der vorliegenden Erfindung erreicht wird.
BEISPIEL 1
Herstellung von festen Trägern
Die Oligonukleotide werden auf einer Glasplatte synthetisiert. Die Platte wird zuerst mit dem stabilen Fluorsiloxan 3-(1,1-Dihydroperfluoroctyloxy)propyltriethoxysilan beschichtet. Ein CO₂-Laser wird verwendet, um Regionen des Fluorsiloxans abzudampfen und das darunter liegende Siliziumdioxidglas freizulegen. Die Platte wird dann mit Glycidyloxypropyltrimethoxysilan beschichtet, das nur auf den freigelegten Regionen des Glases reagiert, um Glycidylepoxid zu bilden. Die Platte wird danach mit Hexaethylenglycol und Schwefelsäure behandelt, um das Glycidylepoxid zu einer Hydroxyalkylgruppe umzuwandeln, die als Linkerarm fungiert. Die Hydroxyalkylgruppe ähnelt dem 5'-Hydroxid von Nukleotiden und stellt einen stabilen Anker zur Verfügung, auf dem die Festphasensynthese zu starten ist. Der Hydroxyalkyl-Linkerarm stellt einen durchschnittlichen Abstand von 3–4 nm zwischen dem Oligonukleotid und der Glasoberfläche her. Die Siloxanverbindung mit dem Glas ist bei allen sauren und basischen Entblockierungsbedingungen, die typischerweise in der Oligonukleotidsynthese verwendet werden, vollständig stabil. Dieses Schema zur Herstellung von Anordnungsplatten ist in den 4A und 4B veranschaulicht.
BEISPIEL 2
Oligonukleotidsynthese auf einem festen Träger
Die Hydroxyalkylsiloxanoberfläche in den Punkten hat eine Oberflächenspannung von etwa γ = 47, während das Fluoroxysilan eine Oberflächenspannung von γ = 18 aufweist. Für den Oligonukleotidaufbau sind die Lösungsmittel der Wahl Acetonitril, das eine Oberflächenspannung von γ = 29 hat, und Diethylglycoldimethylether. Die Hydroxyalkylsiloxanoberfläche wird daher von Acetonitril vollständig benetzt, während die mit Fluorsiloxan maskierte Oberfläche zwischen den Punkten sehr schlecht von Acetonitril benetzt wird. Tröpfchen von Oligonukleotidsynthesereagenzien in Acetonitril werden auf die Punktoberflächen aufgebracht und haben die Tendenz sich aufzuwölben, wie in der 5 gezeigt ist. Ein Mischen von benachbarten Punkten wird durch die sehr hydrophobe Barriere der Maske verhindert. Der Kontaktwinkel für Acetonitril an der Masken-Punkt-Trennfläche beträgt etwa θ = 43°. Die Platte fungiert wirksam als eine Anordnungsmikroliterschale, wobei die einzelnen Löcher durch die Oberflächenspannung und nicht die Schwerkraft definiert werden. Das Volumen eines Tröpfchens von 40 μm beträgt 33 Pikoliter. Das maximale Volumen, das durch einen Punkt von 50 μm gespeichert wird, ist ungefähr 100 Pikoliter oder etwa 3 Tröpfchen. Ein Punkt von 100 μm speichert etwa 400 Pikoliter oder etwa 12 Tröpfchen. Bei maximaler Beladung binden Punkte von 50 μm und 100 μm etwa 0,07 bzw. 0,27 Femtomol Oligonukleotid.
Die Oligonukleotidsynthese auf den präparierten Punkten (4B unten) wird gemäß dem H-Phosphonatverfahren (6) oder durch das Phosphoramiditverfahren durchgeführt. Beide Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Christodoulou, C., „Oligonucleotide Synthesis" in „Protocols for oligonucleotides and analogs; synthesis and properties", Methods Mol. Biol. 20: 19–31 (1993) und Beaucage, S., „Oligodeoxyribonucleotides Synthesis" in „Protocols for oligonucleotides and analogs; synthesis and properties", Methods Mol. Biol. 20: 33–61 (1993). Die Abgabe der geeigneten blockierten Nukleotide und Aktivierungsmittel in Acetonitril wird mittels der Pikopumpenvorrichtung, die im Beispiel 3 beschrieben ist, auf einzelne Punkte gerichtet. Alle anderen Schritte (z.B. DMT-Entblockierung, Waschen) werden auf der Anordnung in einem losweisen Verfahren durch Fluten der Oberfläche mit den geeigneten Reagenzien durchgeführt. Ein piezoelektrischer Pumpenkopf mit acht Düsen wird verwendet, um die blockierten Nukleotide und Aktivierungsreagenzien an die einzelnen Punkte abzugeben, und benötigt zur Abgabe von Tröpfchen bei 1000 Hz nur 32 Sekunden, um eine Anordnung von 512-512 (262k) aufzustellen. Da keine der Koppelschritte kritische Zeiterfordernisse aufweist, ist der Unterschied der Reaktionszeit zwischen dem ersten und letzten aufgetragenen Tröpfchen unbedeutend.
BEISPIEL 3
Konstruktion einer piezoelektrischen Impulsstrahlpumpenvorrichtung
Piezoelektrische Impulsstrahlen werden von Photoceram (Corning Glass, Corning, N.Y), einer UV-sensiblen Keramik, mittels photolithographischer Standardverfahren hergestellt, um die Pumpendetails zu erzeugen. Die Keramik wird gebrannt, um sie in einen Glaszustand zu versetzen. Der sich ergebende Rohling wird dann mit Fluorwasserstoff geätzt, das in freigelegten Bereichen schneller als in nicht freigelegten Bereichen wirkt. Nachdem die Mulde und Düsendetails auf die geeignete Dicke in einer Platte geläppt wurden, wird die fertig gestellte Kammer durch Diffusionsbindung einer zweiten (oberen) Platte an die erste Platte gebildet. Die Düsenfläche wird flach geläppt und oberflächenbehandelt, dann wird das piezoelektrische Element mit Epoxidharz an die Außenseite der Pum penkammer geklebt. Wenn das piezoelektrische Element energetisiert wird, verformt es die Mulde ganz wie ein einseitiger Balgen, wie in der 7 gezeigt.
Um die geeignete Öffnungsgröße für das genaue Feuern von Acetonitriltröpfchen zu bestimmen, wird ein Strahlkopf mit einer Reihe von Öffnungen abnehmender Größe hergestellt und getestet. Eine Düse von 40 μm erzeugt etwa 65 Pikoliter.
Ein getrennter Düsenanordnungskopf wird für jedes der vier Nukleotide zur Verfügung gestellt und ein fünfter Kopf wird vorgesehen, um das Aktivierungsreagens für die Kopplung abzugeben. Die fünf Köpfe werden mit einem mechanisch definierten Abstand zusammengesetzt. Jeder Kopf hat eine Anordnung von acht Düsen mit einer Abtrennung von 400 μm.
Die fertig gestellte Pumpeneinheit wird mit den stationär gehaltenen Köpfen zusammengesetzt und die Tröpfchen werden nach unten auf eine sich bewegende Anordnungsplatte geschossen, wie in der 8 gezeigt ist. Der fertig gestellte Pumpeneinheitsaufbau (3) besteht aus Düsenanordnungsköpfen (4–7) für jede der vier Nukleotidasen und einem fünften Kopf (8) für das Aktivierungsreagens. Beim Einschalten wird ein Mikrotröpfchen (9) aus der Pumpendüse ausgestoßen und auf der Anordnungsplatte (1) an einer funktionalisierten Bindungsstelle (2) abgelagert.
Eine Platte, die die Zielanordnung hält, wird in einer mechanischen Stufe gehalten und in der X- und Y-Achse unter den Köpfen durch einen synchronen Schneckenantrieb indexiert. Die mechanische Stufe ist ähnlich denen in kleinen Mahlmaschinen, Mikroskopen und Mikotomen verwendeten, und sieht eine reproduzierbare Positionierungsgenauigkeit von über 2,5 μm oder 0,1 mil vor. Wie in der 9 gezeigt, ist der Plattenhalter (3) mit einem geschlitzten Abstandshalter (4) ausgestattet, der es erlaubt, dass eine Abdeckplatte (5) über die Anordnung (6) geschoben wird, um eine geschlossene Kammer zu bilden. Es sind periphere Öffnungen für den Einlass (1) und Auslass (2) vorgesehen, um ein Fluten der Platte zum Waschen, die Aufbringung von Reagenzien für eine gewöhnliche Anordnungsreaktion oder das Trockenblasen der Platte für den nächsten Punktanordnungsanwendungszyklus zu ermöglichen.
Sowohl die Stufe als auch die Kopfanordnung sind in einer Schutzkammer eingeschlossen, die evakuiert oder mit Argon gereinigt werden kann, um wasserfreie Bedingungen aufrechtzuerhalten. Wenn der Plattenhalter aus dem Weg geschoben wird, können die Einlassleitungen zu den Köpfen für ein positives Verdrängungs-Priming der Kopfkammern oder Spülen mit sauberem Lösungsmittel unter Druck gesetzt werden. Während des Betriebs werden die Reagensfläschchen bei dem Umgebungsdruck der Kammer gehalten.
Bei einer sechsminütigen Zykluszeit kann die Vorrichtung 10-mere Anordnungsplatten mit einer Rate von 1 Platte oder 10⁶ Oligonukleotide pro Stunde erzeugen.
BEISPIEL 4
In-situ-Synthese von abspaltbaren Oligonukleotiden
Eine Oberflächenspannungsanordnungssynthese ist ein zweistufiges Verfahren, wobei eine Substratoberflächenherstellung von einer In-situ-Oligonukleotidsynthese gefolgt wird. Die Substratherstellung beginnt mit einer Glasreinigung in Detergens, dann Base und Säure (2% Micro 90, 10% NaOH und 10% H₂SO₄) gefolgt von Spin-coating mit einer Schicht von Microposit 1818 Photoresist (Shipley, Marlboro, MA), die bei 90°C 30 min. lang leicht gebrannt wird. Das Photoresist wird dann mit UV-Licht bei 60 mWatt/cm² mittels einer Maske strukturiert, die die gewünschte Größe und Verteilung der Anordnungseinrichtungen definiert. Das freigelegte Photoresist wird durch Eintauchen in Microposit 351 Entwickler (Shipley, Marlboro, MA) und anschließendes Härten bei 120°C 20 Minuten lang entwickelt. Die Substrate werden dann in eine 1%ige Lösung von Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan (United Chemical Technology, Bristol, PA) in trockenem Toluol eingetaucht, um eine hydrophobe Silanschicht zu erzeugen, die die Anordnungseinrichtungen umgibt, die noch immer durch das Photoresist geschützt werden. Das Fluorsilan wird bei 90°C 30 Minuten lang gehärtet, dann mit Aceton behandelt, um das verbleibende Photoresist zu entfernen. Die freigelegten Einrichtungsstellen werden mit 1% 4- Aminobutyldimethylmethoxysilan (United Chemical Technology, Bristol, PA) überzogen und dann bei 105°C 30 min. lang gehärtet. Schließlich werden diese Stellen mit TOPS-Amiditen gekoppelt, die die anschließende Oligonukleotidsynthese unterstützen. Ein Schema eines langen DNA-Sequenz-Zusammenbaus ist in der 10 gezeigt.
Die oberflächenspannungsstrukturierten Substrate werden auf einem Spannfutter aufgereiht, das auf der X-Y-Stufe eines Roboter-Anordnungssynthetisierers angebracht ist, wo piezoelektrische Düsen (Microfab Technologies, Plano, TX) verwendet werden, um Lösungen von aktivierten Standard-H-Phosphonatamiditen abzugeben (Froehler u.a., Nucleic Acids Res. 15: 5339–5407 (1986)). Die piezoelektrischen Strahlen werden bei 6,67 kHz mittels einer Zweischritt-Wellenform betrieben, die einzelne Tröpfchen von etwa 50 Pikolitern abfeuert. Waschen, Entblockierung, Abdecken und Oxidierungsreagenzien werden durch losweises Fluten des Reagenz auf die Substratoberfläche abgegeben und die Spannfutterbefestigung gedreht, um überschüssige Reagenzien zwischen den Reaktionen zu entfernen. Die Substratoberfläche wird umweltmäßig die Synthese hindurch durch eine Decke von trockenem N₂-Gas geschützt. Das Lokalisieren und Messen der Amiditabgabe wird durch eine Computerbefehlsdatei vermittelt, die die Abgabe der vier Amidite während jedes Durchlaufs der piezoelektrischen Düsenreihe lenkt, so dass ein vorbestimmtes Oligonukleotid bei jeder Anordnungskoordinate synthetisiert wird.
Die piezoelektrische gedruckte Oligonukleotidsynthese wird mittels der folgenden Reagenzien (Glen Research, Sterling, VA) durchgeführt: Phosphoramidite: pac-dA-CE-Phosphoramidit, Ac-dC-CE-Phosphoramidit, iPr-pac-dG-CE-Phosphoramidit, dT-CE-Phosphoramidit (alle bei 0,1 M); Aktivator: 5-Ethylthiotetrazol (0,45 M). Amidite und Aktivatorlösungen werden vor der Synthese in einer Lösung aus 90% Adiponitril (Aldrich, Milwaukee, WI): 10% Acetontril vorgemischt, 1:1:v/v. Zusätzliche Reagenzien sind Oxidationsmittel (0,1 M Iod in THF/Pyridin/Wasser), Cap mix A (THF/2,6-Lutidin/Essigsäureanhydrid), Cap mix B (10% 1-Methylimidazol/THF) und 3% TCA in DCM.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz mit mehr als 200 Basen Länge, umfassend die folgenden Schritte: (a) Synthetisieren von mindestens zehn Oligonukleotiden aus etwa 10 bis 200 Basen, die entweder für den Sense- oder Antisense-Strang der DNA-Sequenz kodieren, auf einem funktionalisierten festen Träger, wobei die Oligonukleotide kovalent mit einer abspaltbaren Komponente an den festen Träger gebunden sind; (b) Abspalten der Oligonukleotide vom festen Träger; und (c) Zusammensetzen der Oligonukleotide zur DNA-Sequenz; wobei der funktionalisierte feste Träger gemusterte Bereiche von hydrophilen und hydrophoben Flächen umfasst, wobei der funktionalisierte feste Träger funktionalisierte Stellen umfasst, die jeweils 50–2000 um Durchmesser haben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der funktionalisierte feste Träger eine funktionalisierte Glasplatte, ein funktionalisiertes Silizium oder ein funktionalisierter Wafer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der funktionalisierte feste Träger aus der Gruppe bestehend aus funktionalisiertem Polystyrol, funktionalisiertem Polyethylen, funktionalisiertem Polypropylen und funktionalisiertem Polytetrafluorethylen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Abspaltung eine enzymatische Abspaltung, photolytische Abspaltung, chemische Abspaltung oder thermische Abspaltung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Synthese weiter das Koppeln eines Phosphoramidits mit einer reaktiven Gruppe auf dem funktionalisierten festen Träger umfasst, um die reaktive Gruppe in einen abspaltbaren Linker umzuwandeln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der funktionalisierte feste Träger 10 × 10^–15 bis 50 × 10^–15 mol funktionalisierte Bindungsstellen pro mm² umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Synthese mit einer piezoelektrischen Pumpe durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Schritt (c) weiter die enzymatische Ligation umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Schritt (c) weiter die Verwendung einer DNA-Polymerase umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die DNA-Sequenz für ein Gen, ein Plasmid oder ein Virus kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die DNA-Sequenz das Genom eines Organismus ist.
Fester Träger, enthaltend eine abspaltbare Komponente für die Oligonukleotidsynthese, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Anspruch 6 definiert.