DE19782096T9 - Immobiliserung von Nucleinsäuren in hoher Dichte - Google Patents
Immobiliserung von Nucleinsäuren in hoher DichteInfo
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Description
Eintritt in die nationale Phase I/ £ ' ** ° basierend
auf PCT/US97/20 195 .
SEQUENOM, INC., et al.
u.Z.: D 1526 DE
SEQUENOM, INC., et al.
u.Z.: D 1526 DE
Für Zwecke der nationalen US-Phase ist diese Patentanmeldung eine Teilfortführung einer US-Anmeldung, eingereicht
unter der Anwalts-Listennummer 7352-2001B am 8. Oktober 1997, für Maryanne J. O1Donnell-Maloney, Charles R. Cantor, Daniel
P. Little und Hubert Röster, unter dem Titel "Methods of High-Density Immobilization of Nucleic Acids and Uses Thereof"
(Verfahren zur Immobilisierung mit hoher Dichte von Nucleinsäuren und deren Anwendungen) , die eine Teilfortführung der
US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/746 055 ist, eingereicht am 6. November 1996, für Maryanne J. 0'Donnell-Maloney, Charles
R. Cantor und Hubert Köster, unter dem Titel "High-Density Immobilization of Nucleic Acid Molecules" (Immobilisierung mit
hoher Dichte von Nucleinsäuremolekülen). Die vorliegende Patentanmeldung ist außerdem eine Teilfortführung der US-Patentanmeldung,
Serien-Nr. 08/746 055, der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/786 988, eingereicht am 23. Januar 1997,
für Daniel P. Little, Maryanne J. O1Donnell-Maloney, Charles
R. Cantor und Hubert Köster, unter dem Titel "Systems and Methods for Preparing and Analyzing Low Volume Analyte Array
Elements" (Systeme und Verfahren zur Herstellung und Analyse von Analyten-Anordnungselementen mit geringem Volumen), und
der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/787 639, eingereicht am
23. Januar 1997, für Daniel P. Little und Hubert Köster, unter dem Titel "Systems and Methods for Preparing Low Volume Analyte
Array Elements" (Systeme und Verfahren zur Herstellung von Analyten-Anordnungselementen mit geringem Volumen). Für internationale
Zwecke wird der Prioritätsvorteil für jede dieser Patentanmeldungen beansprucht.
Die vorliegende Patentanmeldung steht in Verbindung mit den US-Patentschriften Nr. 5 547 835, 5 622 824, 5 605 798.
DE 197 B2 G56T1
Wo dies zulässig ist, wird der Gegenstand jeder der oben angegebenen Patentanmeldungen und Patente in seiner Gesamtheit
hier einbezogen.
Auf den Gebieten der Molekularbiologie und der Biochemie sowie bei der Diagnose von Krankheiten ist die Nucleinsäure-Hybridisierung
ein leistungsfähiges Werkzeug für den Nachweis, die Isolierung und Analyse von spezifischen Oligonucleotid-Sequenzen
geworden. Typischerweise verwenden derartige Hybridisierungstests eine Oligodesoxynucleotid-Sonde, die auf
einem festen Träger immobilisiert worden ist; wie z. B. beim umgekehrten Dot-Blot-Verfahren bzw. Punkt-Autoradiogramm-Verfahren
(Saiki, R.K., Walsh, P.S., Levenson, CH., und Erlich, H.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6230). In
letzter Zeit sind Anordnungen von immobilisierten DNA-Sonden, die auf einer festen Oberfläche fixiert sind, zum Sequenzieren
mittels Hybridisierung (SBH) entwickelt worden (Dramanac, R., Labat, I., Brukner, I., und Crkvenjakov, R. (1989) Genomics 4,
114-128); Strezoska, Z., Pauneska, T., Radosavljevic, D., Labat, I., Drmanac, R., und Crkvenjakov, R. (1991) Proc. Natl.
Akad. Sei. USA 88, 1008 9-10093). Die SBH verwendet eine
geordnete Anordnung von immobilisierten Oligodesoxynucleotiden auf einem festen Träger. Eine Probe einer unbekannten DNA wird
auf die Anordnung aufgebracht, und das Hybridisierungsmuster wird beobachtet und analysiert, um gleichzeitig viele kurze
Sequenzinformationsstücke zu erzeugen. Es ist eine verbesserte Version der SBH entwickelt worden, die als Positions-SBH
(PSBH) bezeichnet wird und Doppelstrangsonden verwendet, die einzelsträngige 3'-Überhänge enthalten (Broude, N-.E., Sano,
T., Smith, CL., und Cantor,CR. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 91, 3072-3076) . Es ist nunmehr möglich, ein PSBH-Einfangverfahren mit der herkömmlichen Sanger-Sequenzierung zu
verbinden, um Sequenzierungsleitern zu erzeugen, die z. B. durch Gelelektrophorese nachweisbar sind (Fu, D., Broude,
N.E., Köster, H., Smith, CL., und Cantor, CR. (1995) {Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 92, 10162-10166).
DE 197 82 086 T1
Für die in diesen Programmen verwendeten Anordnungen gibt es eine Anzahl von Kriterien, die für eine erfolgreiche
Ausführung erfüllt sein müssen. Zum Beispiel muß die immobilisierte DNA stabil sein und darf während der Hybridisierung,
des Waschens oder der Analyse nicht desorbieren. Die Dichte des immobilisierten Oligodesoxynucleotids muß für die nachfolgenden
Analysen ausreichen. Es muß eine minimale unspezifische Bindung der DNA an die Oberfläche vorhanden sein. Außerdem
sollte der Immobilisierungsprozeß nicht die Fähigkeit der immobilisierten
Sonden stören, zu hybridisieren und als Substrate für eine enzymatische Festphasensynthese zu dienen. Für die
Mehrzahl der Anwendungen ist es am besten, wenn nur ein Punkt der DNA immobilisiert ist, idealerweise ein Endpunkt.
In den letzten Jahren sind eine Anzahl von Verfahren für die kovalente Immobilisierung von DNA auf festen Trägern
entwickelt worden, bei denen versucht wird, alle oben angeführten Kriterien zu erfüllen. Zum Beispiel ist eine geeignet
modifizierte DNA kovalent auf ebenen Oberflächen fixiert worden, die mit Aminosäuren (Running, J.Α., und Urdea, M.S.
(1990) BioTechniques 8, 276-277; Newton, CR. , et al., (1993)
Nucl. Acids Res. 21, 1155-1162; Nikiforov, T.T., und Rogers,
Y.H., (1995) Anal. Biochem. 227, 201-109), Carboxylgruppen
(Zhang, Y., et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 3929-3933), Epoxygruppen (Lamture, J.B., et al., (1994) Nucl. Acids Res.
22, 2121-2125; Eggers, M.D., et al., (1994) BioTechniques 17,
516-524) oder Aminogruppen (Rasmussen, S.R., et al., (1991)
Anal. Biochem. 198, 138-142) funktionalisiert waren. Obwohl viele von diesen Verfahren für ihre jeweiligen Anwendungen
recht erfolgreich waren, war die Dichte der Oligonucleotid-Bindung (maximal etwa 20 fmol DNA pro Quadratmillimeter Oberfläche)
(Lamture, J.B., et al·., (1994) Nucl. Acids Res. 22,
2121-2125; Eggers, M.D., et al., (1994) BioTechniques 17, 516-524)
viel geringer als die theoretische Packungsgrenze von DNA.
Daher wird ein Verfahren zum Erzielen höherer Dichten von immobilisierten Nucleinsäuren auf einer Oberfläche benötigt.
Insbesondere wird ein Verfahren zum Erzielen höherer Dichten von auf einer Oberfläche immobilisierten Nucleinsäuren
DE ]%Ί 82 096 Π
benötigt, das die Verwendung, Manipulation und weitere Reaktion der immobilisierten Nucleinsäuren sowie eine Analyse der
Reaktionen gestattet.
In Verbindung mit dem Bedarf an verbesserten Nucleinsäure-Immobilisierungsverfahren.,
beispielsweise zur Verwendung in Analyse- und Diagnosesystemen steht die Notwendigkeit zur
Entwicklung technisch ausgereifter Laborwerkzeuge, welche die Prüfung und Analyse biologischer Proben automatisieren und beschleunigen.
In vorderster Reihe der jüngsten Bemühungen zur Entwicklung besserer Analysewerkzeuge steht das Ziel, die Analyse
biochemischer Strukturen voranzutreiben. Dies gilt besonders für humangenomische DNA, die sich aus mindestens etwa
einhunderttausend Genen zusammensetzt, die sich auf vierundzwanzig Chromosomen befinden. Jedes Gen codiert ein spezifisches
Protein, das eine spezifische biochemische Funktion innerhalb einer lebenden Zelle erfüllt. Änderungen in einer DNA
-Sequenz sind als Mutationen bekannt und können zu Proteinen mit veränderten oder in bestimmten Fällen sogar verlorengegangenen
biochemischen Aktivitäten führen; dies kann wiederum eine Erbkrankheit verursachen. Gegenwärtig sind mehr als 3000
Erbkrankheiten bekannt. Außerdem läßt zunehmendes Beweismaterial darauf schließen, daß bestimmte DNA-Sequenzen eine Person
für irgendeine aus einer Anzahl von Erbkrankheiten prädisponieren können, wie z. B. Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit,
bestimmte Autoimmunkrankheiten und Krebs. Dementsprechend ist die Analyse der DNA eine schwierige, aber verdienstvolle
Beschäftigung, die verspricht, grundlegende Informationen für die Behandlung vieler lebensbedrohender Krankheiten zu
liefern.
Leider wird die Analyse von DNA durch den Umfang und die Tatsache besonders erschwert, daß genomische DNA sowohl
codierende als auch nichtcodierende Sequenzen aufweist (ζ. Β. Exons und Introns). So gesehen, sind herkömmliche Verfahren
zur Analyse chemischer Strukturen, wie z. B. das manuelle Pipettieren von Quellenmaterial zur Herstellung von Proben für
die Analyse, von minimalem Wert. Um den Umfang der notwendigen Analyse anzusprechen, haben Wissenschaftler Parallelverarbeitungsprotokolle
für DNA-Diagnose entwickelt.
DE 197 82 OSoT]
Zum Beispiel haben Wissenschaftler Robotergeräte entwickelt, die manuelles Pipettieren und Tupfen überflüssig machen,
indem ein Roboterarm bereitgestellt wird, der an seinem proximalen Ende ein Stiftwerkzeug trägt, das aus einer Matrix
von Stiftelementen besteht. Die einzelnen Stifte der Matrix sind so voneinander beabstandet, daß jeder Stift in eine Kavität
einer Mikrotiterplatte getaucht werden kann. Der Roboterarm taucht die Stifte in die Kavitäten der Mikrotiterplatte
und benetzt dadurch jedes der Stiftelemente mit Probenmaterial Dann bewegt der Roboterarm das Stiftwerkzeug in eine Position
oberhalb einer Zieloberfläche, senkt das Stiftwerkzeug auf die Oberfläche ab und bringt die Stifte in Kontakt mit dem Ziel,
um darauf eine Tüpfel- bzw. Spot-Matrix zu bilden. Dementsprechend beschleunigt das Stiftwerkzeug die Herstellung von Proben
durch parallele Abgabe von Probenmaterial.
Obwohl dieses Stiftwerkzeugverfahren gut funktioniert, um die Herstellung von Probenanordnungen zu beschleunigen,
leidet es unter verschiedenen Nachteilen. Erstens kommt das Stiftwerkzeug während der Tüpfeloperation tatsächlich in Kontakt
mit der Oberfläche des Substrats. In Anbetracht dessen, daß jedes Stiftwerkzeug eine feine Spitze benötigt, damit ein
Fleck von geringer Fleckgröße auf das Ziel aufgetupft wird, führt der ständige Kontakt des Stiftwerkzeugs mit der Zieloberfläche
zum Verschleiß und zur Verformung der feinen und empfindlichen Spitzen des Stiftwerkzeugs. Dies führt zu Fehlern,
welche die Genauigkeit und die Produktivität verringern. Ein von Wissenschaftlern entwickeltes Alternativverfahren
verwendet eine chemische Fixierung von Probenmaterial auf der Substratoberfläche. In einem besonderen Verfahren wird DNA
an Ort und Stelle auf einer. Substratoberfläche synthetisiert, um eine Menge von räumlich getrennten und verschiedenen chemischen
Produkten zu erzeugen. Derartige Verfahren sind insofern im wesentlichen photolithographisch, als sie die Festphasenchemie,
photolabile Schutzgruppen und photoaktivierte Lithographie miteinander kombinieren. Diese Systeme funktionieren
zwar gut bei der Erzeugung von Probenmaterialanordnungen, sind aber chemisch intensiv, zeitraubend und teuer.
Ferner ist es lästig, daß keines der obigen Verfahren eine ausreichende Kontrolle über das Volumen des Probenmaterials
bietet, das auf die Oberfläche des Substrats abgegeben wird. Infolgedessen kann ein Fehler daraus entstehen, daß diese
Verfahren keine Probenanordnungen mit gut kontrollierten und genau reproduzierbaren Probenvolumina liefern. In einem
Versuch, dieses Problem zu umgehen, werden beim Herstellungsprozeß häufig reichliche Mengen von Reagensmaterialien abgegeben.
Dies kann zwar ausreichende Probenvolumina sicherstellen, ist aber eine Verschwendung von Probenmaterialien, die oft
teuer und begrenzt verfügbar sind.
Auch nach der Herstellung der Proben sehen sich die Wissenschaftler noch mit dem Bedarf an hochentwickelten Diagnoseverfahren
konfrontiert, um die hergestellten Proben zu analysieren. Dazu nutzen die Wissenschaftler verschiedene Verfahren
zur Identifikation von Materialien, wie z. B. DNA. Zum Beispiel können Nucleinsäuresequenzen durch Hybridisieren mit
einer Sonde identifiziert werden, die zu der zu identifizierenden Sequenz komplementär ist. Typischerweise wird das
Nucleinsäurefragment mit einer empfindlichen Reporter- bzw. Indikatorfunktion markiert, die radioaktiv, fluoreszierend
oder chemilumineszierend sein kann. Diese Verfahren können zwar gut funktionieren, haben aber bestimmte Nachteile. Radioaktive
Markierungen können gefährlich sein, und die von ihnen erzeugten Signale klingen mit der Zeit ab. Nichtisotope (d. h.
fluoreszierende) Markierungen leiden unter mangelnder Empfindlichkeit
und Signalschwund, wenn während des Identifikationsverfahrens Laser mit hoher Intensität verwendet werden. Außerdem
ist das Markieren ein arbeits- und zeitaufwendiges, fehleranfälliges Verfahren. Infolgedessen ist der Prozeß der Herstellung
und Analyse eines biochemischen Probenmaterials komplex und fehleranfällig.
Daher besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, verbesserte Systeme und Verfahren zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen
bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Systemen, welche die schnelle Herstellung
von Probenanordnungen gestatten. Eine weitere Aufgabe
DE 197 82 086 Tl
der Erfindung ist die Bereitstellung von Trägern, an die Nucleinsäuremoleküle in hoher Dichte gebunden werden.
Es werden Verfahren zum Immobilisieren von Nucleinsäuren in hoher Dichte auf einer Oberfläche bereitgestellt, die
auf der schnellen Reaktion einer freien Thiolgruppe einer modifizierten Oberfläche oder einer modifizierten Nucleinsäure
unter geeigneten Bedingungen mit einer thiolreaktiven Funktionalität der anderen Komponente (Oberfläche oder Nucleinsäure)
basieren. Diese Reaktion kann direkt oder über ein bifunktionelles Vernetzungsmittel ablaufen. In einer bevorzugten Ausführungsform
weist die modifizierte Nucleinsäure eine Thiolgruppe auf, und das Vernetzungsmittel enthält eine lodacetylgruppe.
Außerdem werden feste Träger bereitgestellt, an denen "Kügelchen" fixiert sind, die mit Nucleinsäuremolekülen verbunden
sind. Die Kügelchen sind nicht unbedingt kugelförmig, sondern beziehen sich auf Teilchen, die mit dem festen Träger
konjugiert sind, um dadurch die Oberfläche des festen Trägers zu vergrößern und/oder eine alternative Oberfläche für die
Konjugation von Nucleinsäuren oder anderen Molekülen bereitzustellen. Die Kügelchen haben vorzugsweise eine Größe von etwa
1 μπι bis 100 um. Es werden Zusammensetzungen bereitgestellt,
die mindestens ein Kügelchen enthalten, das mit einem festen Träger konjugiert und außerdem mit mindestens einem Molekül
konjugiert ist, insbesondere mit einer Nucleinsäure. Das Kügelchen wird aus irgendeinem geeigneten, dem Fachmann bekannten
Matrixmaterial geformt, wozu quellfähige und nicht quellfähige Materialien gehören. Der feste Träger ist irgendein dem
Fachmann bekannter Träger zur Verwendung als Trägermatrix in chemischen Synthesen und Analysen. In solchen Fällen ist die
Nucleinsäure über ein Schwefelatom an das "Kügelchen" gebunden, wie hierin beschrieben wird. In bestimmten Ausführungsformen können die Kügelchen auf dem festen Träger in Vertie-
fungen oder Grübchen auf der Oberfläche konjugiert sein, oder die Kügelchen können in Form einer regelmäßigen Anordnung auf
dem Träger angeordnet sein.
Vorzugsweise besteht das Kügelchen aus einem Material,
das unter Materialien ausgewählt ist, die als feste Träger für die Synthese und für Biotests bzw. Assays dienen, einschließlich,
aber nicht beschränkt auf: Silicagel, Glas, magnetisches Material, Harze aus Polystyrol/1% Divinylbenzol, wie z. B.
Wang-Harze, d. h. Fmoc-aminosäure-4-(hydroxymethyl)phenoxymethylcopoly(styrol-1%
divinylbenzol)-Harz (DVD-Harz), Chlortrityl (2-chlortritylchloridcopolystyrol-DVB-harz)harz, Merryfield
(chlormethyliertes Copolystyrol-DVB)-Harzmetall, Kunststoff,
Cellulose, vernetzte Dextrane, wie z. B. diejenigen, die unter dem Handelsnamen Sephadex (Pharmacia) vertrieben werden, und
Agarosegel, wie z. B. Gele, die unter dem Handelsnamen Sepharose (Pharmacia) vertrieben werden, das ein wasserstoffgebundenes
Agarosegel vom Polysaccharid-Typ ist, und andere derartige Harze und Festphasenträger, die dem Fachmann bekannt
sind. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Kügelchen eine Größe im Bereich von etwa 0,1 bis 500 μπι Durchmesser,
stärker bevorzugt von etwa 1 bis 100 um Durchmesser.
Der feste Träger hat irgendeine gewünschte Form, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: ein Kügelchen, eine
Kapillare, eine Platte, eine Membran, einen Wafer, einen Kamm, einen Stift, einen Wafer mit Grübchen, eine Anordnung von
Stiften oder Nanoliter-Vertiefungen bzw. -kavitäten sowie andere Geometrien und Formen, die dem Fachmann bekannt sind.
Nach einem weiteren Aspekt werden Ausstattungen bzw. Kits für immobilisierte Nucleinsäuren auf einem unlöslichen
Träger bereitgestellt. In einer Ausführungsform kann der Kit eine geeignete Menge der folgenden Bestandteile aufweisen: i)
ein thiolreaktives Vernetzungsmittel; und ii) ein oberflächenmodifizierendes Reagens zum Modifizieren einer Oberfläche mit
einer Funktionalität, die mit dem thiolreaktiven Vernetzungsmittel reagieren kann. Der Kit kann wahlweise einen unlöslichen
Träger aufweisen, ζ. Β. eine feste Oberfläche, magnetische Mikrokügelchen oder Silicium-Wafer, zur Verwendung beim
Immobilisieren von Nucleinsäuren. Der Kit kann außerdem wahlweise geeignete Puffer sowie Gebrauchsanweisungen enthalten.
Die Anwendung dieser Verfahren zum Immobilisieren von Nucleinsäuremolekülen auf einem festen Träger führt zu einer
DE 197 η 096 Tl
mindestens 12,5 mal höheren Immobilisierung als früher beschriebene
Verfahren. Die Verfahren sind daher besonders gut für die Ausbildung von Nucleinsäure-Abschußrampen für die Massenspektrometrie
verwendbar.
Die Nucleinsäuren, die unter Anwendung der hier bereitgestellten Verfahren auf einer Oberfläche immobilisiert werden,
können in den verschiedensten Festphasen-Nucleinsäurechemie-Anwendungen
eingesetzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Nucleinsäuresynthese (chemische und enzymatisehe),
Hybridisierung und/oder Verlängerung, sowie bei Diagnoseverfahren, die auf dem Nachweis von Nucleinsäuren und PoIymorphismus-Analysen
basieren (siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5 605 798). Dementsprechend werden hier ferner Verfahren
zur Reaktion von Nucleinsäuremolekülen bereitgestellt, bei denen die Nucleinsäuremoleküle auf einer Oberfläche immobilisiert
werden, indem entweder ein thiolhaltiges Derivat des Nucleinsäuremoleküls mit einem unlöslichen Träger zur Reaktion
gebracht wird, der eine thiolreaktive Gruppe enthält, oder indem eine thiolhaltiger unlöslicher Träger mit einem Derivat
des Nucleinsäuremoleküls, das eine thiolreaktive Gruppe enthält, zur Reaktion gebracht wird und danach die immobilisierten
Nucleinsäuremoleküle weiter umgesetzt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Verfahren zur Reaktion immobilisierter Nucleinsäuren wird die immobilisierte
Nucleinsäure ferner durch Hybridisieren mit einer Nucleinsäure zur Reaktion gebracht, die zu der immobilisierten Nucleinsäure
oder zu einem Teil davon komplementär ist. Solche Hybridisierungsreaktionen können verwendet werden, um die Gegenwart einer
spezifischen Nucleinsäure in einer Probe nachzuweisen.
Dies ist von besonderem Nutzen beim Nachweis von Pathogenen in einer Probe, wie z. B. einer biologischen Probe, die bei der
Diagnose von Krankheiten verwendet werden kann.
Daher werden hierin auch Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe bereitgestellt, wobei eine
thiolhaltige Nucleinsäure, die zu der Ziel-Nucleinsäure komplementär ist, unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren
auf einer Oberfläche immobilisiert wird und die Probe unter Bedingungen, durch welche die Ziel-Nucleinsäure in der
Probe mit der immobilisierten Nucleinsäure hybridisiert, in Kontakt mit der Oberfläche gebracht wird. Die hybridisierte
Ziel-Nucleinsäure kann unter Anwendung der verschiedensten
Verfahren nachgewiesen werden, wobei das bevorzugte Verfahren die Massenspektrometrie ist. Ferner werden hierin Verfahren
zum Nachweis von Veränderungen (z. B. von Deletionen, Insertionen und Konversionen) in der Nucleotidsequenz der Ziel-Nucleinsäure
bereitgestellt. Bei diesem Verfahren wird das durch Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht der hybridisierten
Ziel-Nucleinsäure mit dem Molekulargewicht verglichen, das für die Ziel-Nucleinsäuresequenz erwartet wird.
Abweichungen des gemessenen Molekulargewichts von dem erwarteten Molekulargewicht weisen auf eine Veränderung in der
Nucleotidsequenz der Ziel-Nucleinsäure hin.
Bei anderen, hier bereitgestellten Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe wird die Ziel-Nucleinsäure
auf einer Oberfläche immobilisiert, die thiolreaktive Gruppen enthält. Bei diesem Verfahren wird vor der Immobilisierung
die Ziel-Nucleinsäure in einer Reaktion amplifiziert, bei der ein Oligonucleotid-Primer eine 31- oder 5'-Disulfidbindung
enthält, und das entstehende Produkt wird reduziert, um eine thiolhaltige Nucleinsäure zu erzeugen. Die
thiolhaltige Nucleinsäure wird auf einer Oberfläche immobilisiert, die thiolreaktive Gruppen enthält, und mit einer einzelsträngigen
Nucleinsäure in Kontakt gebracht, die·zu der immobilisierten
Nucleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist. Die Hybridisierung der einzelsträngigen Nucleinsäure kann
durch die verschiedensten Verfahren nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann die einzelsträngige Nucleinsäure mit einer
leicht nachweisbaren Komponente markiert werden, z. B. mit radioaktiven oder chemilumineszierenden Markierungen. In einer
bevorzugten Ausführungsform wird die einzelsträngige Nucleinsäure durch Massenspektrometrie nachgewiesen.
In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren zur Reaktion von immobilisierten Nucleinsäuren läßt man die immobilisierte
Nucleinsäure ferner durch Verlängerung einer Nucleinsäure reagieren, die mit der immobilisierten Nucleinsäure oder
einem Teil davon hybridisiert ist. Verlängerungsreaktionen wie
DE 19? 82 09
diese können ζ. B. bei Verfahren zum Sequenzieren von DNA-Molekülen
angewandt werden, die unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren auf einem unlöslichen Träger immobilisiert
werden. Folglich werden hierin auch Verfahren zur Be-Stimmung der Sequenz eines DNA-Moleküls auf einem Substrat bereitgestellt,
bei denen ein thiolhaltiges Derivat des DNA-Moleküls auf der Oberfläche eines unlöslichen Trägers immobilisiert
wird, der thiolreaktive Gruppen enthält, und mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert wird, die komplementär
zu einem Teil des immobilisierten DNA-Moleküls ist, bevor die DNA-Synthese in Gegenwart eines oder mehrerer Didesoxynucleotide
ausgeführt wird.
Die Verlängerung bzw. Extension eines Nucleinsäure-Primers, der mit einer Nucleinsäure hybridisiert ist, die nach
dem hier bereitgestellten Verfahren auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann auch beim Nachweis von Nucleotidsequenz-Veränderungen
(z. B. Deletionen, Insertionen, Konversionen) einer Ziel-Nucleinsäure angewandt werden. Dementsprechend werden
hierin Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Ziel-Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, wobei eine einzelsträngige
Nucleinsäure mit einer thiolhaltigen Ziel-Nucleinsäure hybridisiert wird, die entsprechend den hierin
bereitgestellten Verfahren auf einem festen Träger immobilisiert ist, und wobei die hybridisierte einzelsträngige Nucleinsäure
durch Anlagerung von Nucleotiden an das 3'-Ende des Moleküls verlängert wird. Das Verlängerungsprodukt wird z. B.
durch Massenspektrometrie charakterisiert, um festzustellen, ob sich seine Eigenschaften von denjenigen unterscheiden, die
von einer Sequenz zu erwarten sind, welche zu der immobilisierten Ziel-Nucleinsäure komplementär ist. So wird z. B. das
Molekulargewicht des durch Massenspektrometrie bestimmten Verlängerungsprodukts mit dem erwarteten Molekulargewicht einer
Nucleinsäure verglichen, die zur Ziel-Nucleinsäure komplementär
ist. Abweichungen des erwarteten Molekulargewichts weisen auf eine Veränderung in der Sequenz der Ziel-Nucleinsäure hin.
In bestimmten Ausführungsformen der hierin bereitgestellten
Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Ziel-Nucleinsäuresequenz kann die Ziel-Nucleinsäure vor der
DE 137 SZ 096 Tl
Immobilisierung auf einer thiolreaktiven Oberfläche in einer
Reaktion amplifiziert werden, in der ein Oligonucleotid-Primer
eine 31- oder 5'-Disulfidbindung enthält. Das entstehende Produkt
wird reduziert, um eine thiolhaltige Ziel-Nucleinsäure zu
erzeugen. Die thiolhaltige Ziel-Nucleinsäure wird dann auf einer Oberfläche immobilisiert, die thiolreaktive Gruppen enthält,
und die einzelsträngige komplementäre Nucleinsäure wird daran hybridisiert und verlängert.
In einer weiteren Ausführungsform der hierin bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer
Ziel-Nucleinsäuresequenz wird eine zur Ziel-Nucleinsäure komplementäre,
einzelsträngige Nucleinsäure auf einer Oberfläche durch eine Verbindung immobilisiert, die eine Bindung zwischen
einer Thiolgruppe und einer thiolreaktiven Funktionalität sowie eine spaltbare Linker-Komponente aufweist. Die Probe, welche
die Ziel-Nucleinsäure enthält, wird mit der Oberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht, durch welche das Ziel mit
der immobilisierten einzelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert. Die immobilisierte einzelsträngige Nucleinsäure wird
durch Anlagerung von Nucleotiden an das 3'-Ende des Moleküls
verlängert. Im Anschluß an die Verlängerung wird das doppelsträngige Molekül denaturiert, und das einzelsträngige immobilisierte
Verlängerungsprodukt wird in der Position des Linkers von der Oberfläche abgespalten. Das Verlängerungsprodukt wird
beispielsweise durch Massenspektrometrie charakterisiert, um festzustellen, ob sich seine Eigenschaften von denjenigen unterscheiden,
die von einer Sequenz erwartet werden, die zu der immobilisierten Ziel-Nucleinsäure komplementär ist.
Es versteht sich, daß alle Anwendungen der Festphasen-Nucleinsäurechemie,
die auf Nucleinsäuren basieren, die nach den hierin bereitgestellten Verfahren auf einem festen Substrat
immobilisiert sind, sowohl mit thiolhaltigen Nucleinsäuren
und einer thiolreaktiven Oberfläche als auch mit thiolreaktiven Nucleinsäuren und einem thiolhaltigen Träger ausgeführt
werden können.
Außerdem werden hierin Verfahren zur Ausbildung einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer Substratoberfläche durch
Inkontaktbringen von thiolhaltigen Nucleinsäuren mit einem un-
löslichen Träger bereitgestellt, der thiolreaktive Gruppen
enthält, die in einer regelmäßigen Anordnung auf der Oberfläche des Trägers positioniert sind. In einem hier bereitgestellten
alternativen Verfahren zur Ausbildung einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer Substratoberfläche wird ein unlöslicher
Träger, der Thiol-Funktionalitäten enthält, die in einer
regelmäßigen Anordnung auf der Oberfläche des Trägers positioniert sind, mit Nucleinsäuren in Kontakt gebracht, die
eine thiolreaktive Gruppe enthalten.
Ferner werden hierin Systeme und Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Analyse und insbesondere Systeme und Verfahren
zur Abgabe geringer Volumina von Fluidmaterial auf eine Substratoberfläche für die Herstellung einer Probenanordnung
zur diagnostischen Analyse bereitgestellt. Hier bereitgestellte Systeme und Verfahren zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen
sind im allgemeinen in der Anwendung weniger kostenaufwendig und sparen Reagenzien, wobei sie die schnelle
Herstellung von Probenanordnungen mit hoher Reproduzierbarkeit ermöglichen.
In Bezug auf Systeme und Verfahren zur Abgabe geringer Volumina von Fluidmaterial auf eine Substratoberfläche werden
hierin serielle und parallele Abgabegeräte bereitgestellt, die zur Herstellung von aus mehreren Elementen bestehenden Probenmaterialanordnungen
auf einer Substratoberfläche verwendet werden können. Die Substratoberflächen können eben oder geometrisch
so verändert sein, daß sie Vertiefungen zur Aufnahme von Material aufweisen.
In einer Ausführungsform handelt es sich um ein Gerät, das die parallele Entwicklung einer Probenanordnung ermöglicht.
Zu diesem Zweck kann das Gerät als eine Einheit von Bläschen- bzw. Vesikelelementen oder Stiften aufgefaßt werden,
wobei jeder der Stifte eine enge Innenkammer aufweisen kann, die sich zur Aufnahme von Nanoliter-Volumina eines Fluids eignet.
Jeder der Stifte kann innerhalb eines Gehäuses sitzen, das selbst eine Innenkammer aufweist. Das Innengehäuse kann
mit einer Druckquelle verbunden sein, die den Druck innerhalb der inneren Gehäusekammer steuert, um der Fluiddurchfluß durch
die Innenkammern der Stifte zu regulieren. Dies ermöglicht die gesteuerte Abgabe definierter Fluidvolumina aus den Vesikeln.
In einer alternativen Ausführungsform weist das Gerät
eine Düseneinheit auf, die einen Kapillarstift mit einer inneren Kammer und ein an dem Stift montiertes Wandlerelement aufweisen
kann, das in der Lage ist, Fluid durch die innere Kammer des Stifts zu treiben, um das Fluid aus dem Stift auszustoßen.
Auf diese Weise kann das Gerät einen Fleck bzw. Spot des Fluids auf eine Substratoberfläche abgeben, indem es das
Fluid aus dem Stift herausspritzt. Als Alternative kann der Wandler verursachen, daß ein Fluidtropfen aus der Kapillare
austritt, so daß Fluid auf das Substrat übertragen werden kann, indem der Tropfen mit der Substratoberfläche in Kontakt
gebracht wird.
Ferner kann das Gerät eine Probenmaterialanordnung ausbilden, indem es Probenmaterial in einer Serie von Schritten
abgibt, während es den Stift oberhalb der Substratoberfläche in verschiedene Positionen bewegt, um die Probenanordnung auszubilden.
In einer weiteren Ausführungsform werden die hergestellten
Probenanordnungen an eine Platteneinheit weitergegeben, welche die Probenanordnungen zur Analyse durch Massenspektrometrie
übergibt. Zu diesem Zweck ist ein Massenspektrometer vorgesehen, das ein Signal mit einer Gruppe von Spektren
erzeugt, das als Anzeige für die Zusammensetzung des zu analysierenden
Probenmaterials aufgefaßt werden kann.
Nach einem Aspekt kann die hierin bereitgestellte Abgabevorrichtung
zur Abgabe definierter Fluidvolumina, einschließlich
Nanovolumina und Subnanovolumina des Fluids, in chemischen oder biologischen Verfahren auf die Oberfläche eines
Substrats die folgenden Bestandteile aufweisen: ein Gehäuse mit mehreren Seitenwänden und einem unteren Abschnitt mit
darin ausgebildeten Öffnungen, wobei die Wände und der untere Abschnitt des Gehäuses ein Innenvolumen abgrenzen; eine(n)
oder mehrere fluiddurchlässige Vesikeln oder Stifte, die innerhalb
der Öffnungen montiert sind und eine Fluidaufnahmekammer in Nanovolumen-Größe zur Aufnahme von Nanovolumina des
Fluids aufweisen, wobei die Fluidaufnähmekammer in Fluidverbindung
mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, sowie ein Ab-
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gabeelement, das mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, um selektiv Nanovolumina des Fluids aus den fluiddurchlassigen
Vesikeln von Nanovolumen-Größe abzugeben, wenn das Fluid in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllt
wird. Wie hier beschrieben, wird dadurch ermöglicht, daß das Abgabeelement Nanovolumina des Fluids auf die Substratoberfläche
abgibt, wenn die Vorrichtung über dem Substrat und in Dekkung mit diesem angeordnet wird.
In einer Ausführungsform weist die fluiddurchlässige Vesikel ein offenes proximales Ende und einen distalen Spitzenabschnitt
auf, der über den unteren Abschnitt des Gehäuses hinausreicht, wenn er innerhalb der Öffnungen montiert ist.
Auf diese Weise kann das offene proximale Ende die Fluidaufnahmekammer
bei der Montage innerhalb der Öffnungen in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen bringen. Wahlweise sind die
mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln lösbar und auswechselbar innerhalb der Gehäuseöffnungen montiert oder können alternativ
eine Klebstoffabdichtung zur festen Montage der Vesikeln innerhalb
des Gehäuses aufweisen.
In einer Ausführungsform weist die Fluidaufnähmekammer
eine enge Bohrung auf, die in ihren Abmessungen so angepaßt ist, daß sie durch Kapillarwirkung mit dem Fluid gefüllt wird,
und die so bemessen werden kann, daß sie sich durch Kapillarwirkung im wesentlichen vollständig mit dem Fluid füllt.
In einer Ausführungsform weisen die mehreren fluiddurchlässigen
Vesikeln eine Anordnung von Fluidabgabenadeln auf, die aus Metall, Glas, Siliciumdioxid, Polymermaterial
oder irgendeinem anderen geeigneten Material geformt sein können.
In einer Ausführungsform kann das Gehäuse einen oberen
Abschnitt und mechanische Vorspannelemente aufweisen, um die mehreren flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt
mit dem unteren Gehäuseabschnitt vorzuspannen. In einer besonderen Ausführungsform weist jede fluiddurchlässige Vesikel
einen proximalen Endabschnitt mit einem Flansch und ferner ein Dichtungselement auf, das zwischen dem Flansch und einer
Innenfläche des unteren Gehäuseabschnitts angeordnet ist, um zwischen dem Innenvolumen und einer äußeren Umgebung eine
Dichtung auszubilden. Die Vorspannelemente können mechanische Elemente sein und können mehrere Federelemente aufweisen, die
jeweils an einem Ende mit dem proximalen Ende jedes der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln und am anderen Ende mit einer
Innenfläche des oberen Gehäuseabschnitts verbunden sind. Die Federn können eine mechanische Vorspannkraft auf das proximale
Ende der Vesikel ausüben, um die Dichtung auszubilden.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Gehäuse außerdem einen oberen Abschnitt und ein Befestigungselement auf,
um den oberen Gehäuseabschnitt am unteren Gehäuseabschnitt zu befestigen. Das Befestigungselement kann mehrere Öffnungen zur
Aufnahme von Befestigungsmitteln aufweisen, die innerhalb des oberen oder des unteren Gehäuseabschnitts ausgebildet sind,
sowie mehrere Befestigungsmittel zur Montage innerhalb der Öffnungen, um den oberen Abschnitt und den unteren Abschnitt
des Gehäuses aneinander zu befestigen.
In einer Ausführungsform kann das Abgabeelement eine Druckquelle aufweisen, die in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen
des Gehäuses steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen. Außerdem kann in einer Ausführungsform,
in welcher die fluiddurchlässigen Vesikeln durch Kapillarwirkung gefüllt werden, das Abgabeelement eine Drucksteuereinrichtung
aufweisen, welche die Druckquelle variieren kann, um das Innenvolumen des Gehäuses in wechselnde Druckzustände
zu bringen. Dadurch wird ermöglicht, daß das Regelelement der Steuereinrichtung das Innenvolumen in einen ausgewählten
Druckzustand bringt, der ausreicht, um die Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidaufnahmekammer jeder Vesikel
bis zu einer vorgegebenen Höhe zu füllen, die einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht. Außerdem kann die Steuereinrichtung
ferner ein Fluidauswahlelement zum selektiven Entleeren einer ausgewählten Nanovolumen-Fluidmenge aus der Kammer
jeder Vesikel aufweisen. In einer besonderen Ausführungsform ist eine Drucksteuereinrichtung enthalten, die unter der
Steuerung eines Computerprogramms arbeitet, das in einem Datenverarbeitungssystem
abläuft, um eine variable Steuerung über den an der Innenkammer des Gehäuses anliegenden Druck bereitzustellen.
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In einer Ausführungsform kann die fluiddurchlässige Vesikel
ein proximales Ende aufweisen, das zum Innenvolumen des Gehäuses hin offen ist, und die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln
sind so bemessen, daß sie sich im wesentlichen vollständig durch Kapillarwirkung mit dem Fluid füllen, ohne am proximalen
offenen Ende einen Meniskus zu bilden. Wahlweise kann die Vorrichtung mehrere Vesikeln aufweisen, wobei ein erster
Teil der mehreren Vesikeln Fluidaufnahmekammern einer ersten Größe und ein zweiter Teil Fluidaufnahmekammern einer zweiten
Größe aufweist, wodurch mehrere Fluidvolumina abgegeben werden können.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Abgabevor-■ richtung aufweisen: ein Fluidauswahlelement mit einer Druckquelle,
die mit dem Gehäuse gekoppelt ist und in Verbindung mit dem Innenvolumen steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten
Druckzustand zu bringen, sowie ein mit der Druckquelle gekoppeltes Einstellelement zum Variieren des Drucks im
Innenvolumen des Gehäuses, um an die Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen Überdruck anzulegen und die
daraus abgegebene Fluidmenge zu variieren. Das Auswahlelement und das Einstellelement können Computerprogramme sein, die in
einem Datenverarbeitungssystem ablaufen, das den Betrieb einer mit der Innenkammer verbundenen Drucksteuereinrichtung lenkt.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform dient
die hier bereitgestellte Vorrichtung zur Abgabe eines Fluids bei chemischen oder biologischen Verfahren in eine oder mehrere
Vertiefungen bzw. Kavitäten eines Mehrkavitätensubstrats.
Die Vorrichtung kann aufweisen: ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Abschnitt, in dem mehrere Öffnungen ausgebildet
sind, wobei die Wände und der untere Abschnitt ein Innenvolumen abgrenzen; mehrere fluiddurchlässige Vesikeln,
die innerhalb der Öffnungen montiert sind und eine Fluidaufnahmekammer aufweisen, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses
in Verbindung steht, und eine Fluidauswahl- und Abgabeeinrichtung, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung
steht, zur variablen Auswahl einer in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllten Fluidmenge, die aus einer einzigen
Gruppe der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln abzugeben ist.
if.·
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Dementsprechend gibt die Abgabeeinrichtung eine ausgewählte Fluidmenge in die Kavitäten des Mehrkavitätensubstrats ab,
wenn die Vorrichtung über dem Substrat' und in Deckung mit diesem angeordnet wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird hier eine Fluidabgabevorrichtung
zur Abgabe von Fluid bei chemischen oder biologischen Verfahren in eine oder mehrere Kavitäten eines
Mehrkavitätensubstrats bereitgestellt, welche aufweist: ein Gehäuse mit mehreren Seiten und oberen und unteren Abschnitten,
wobei in dem unteren Abschnitt mehrere Öffnungen ausgebildet sind, wobei die Wände und der obere und der untere Gehäuseabschnitt
ein Innenvolumen abgrenzen; mehrere innerhalb der Öffnungen montierte fluiddurchlässige Vesikeln, die eine
Fluidaufnahmekammer aufweisen, die so dimensioniert ist, daß sie Nanovolumina des Fluids aufnimmt, wobei die Fluidaufnahmekammer
in Fluidverbindung mit dem Gehäusevolumen steht, und ein mechanisches Vorspannelement zum mechanischen Vorspannen
der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt mit dem unteren Gehäuseabschnitt.
Allgemeine Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung
auf einer Substratoberfläche, wie sie hierin beschrieben werden, weisen die folgenden Schritte auf: Bereitstellen
einer Vesikel mit einer Innenkammer, die ein Fluid enthält, Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position
auf der Substratoberfläche, Steuern des Gefäßes zur Abgabe eines Nanolitervoluminens eines Fluids in der ersten Position
der Substratoberfläche, und Bewegen der Vesikel zu einer Gruppe von Positionen, die an die Substratoberfläche angrenzen,
wodurch Fluid in jeder Position der Positionsgruppe abgegeben wird, um eine Probenmaterialanordnung auszubilden.
Substrate, die bei den hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung verwendet
werden, können sowohl ebene Oberflächen zur Aufnahme des Probenmaterials als auch Oberflächen mit darin ausgebildeten
Vertiefungen zum Festlegen von Positionen für die Aufnahme des Fluids aufweisen, das aus den Kammern der Vesikeln ausgestoßen
werden kann. Solche Substrate können Silicium, Metall, Kunststoff, eine Membran, Polymermaterial, ein Metall-
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Propfpolymer sowie ein chemisch funktionalisiertes, mit Kügelchen
funktionalisiertes, mit Dendritstrukturen aus eingefangenem Material funktionalisiertes Substrat oder beliebige Kombinationen
der obigen Substrate oder irgendein ähnliches geeignetes Material zur Aufnahme des abgegebenen Fluids sein.
Es versteht sich, daß bei den hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung
auf einer Substratoberfläche die Vorrichtung sowohl ein Analytenmaterial als auch ein Trägermaterial abgeben kann, wie
z. B. ein Matrixmaterial, das die Analyse des Analyten unterstützt.
Zu diesem Zweck können die hierin bereitgestellten Verfahren die Schritte zur Abscheidung eines Matrixmaterials
auf den Substratstoff aufweisen. Ferner können die Verfahren auch einen Warteschritt über eine vorgegebene Zeitspanne aufweisen,
um ein Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampfen zu lassen. Sobald das Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampft
ist, können die hier beschriebenen Verfahren einen Schritt zum Ausstoßen eines Volumens des Analytenfluids in das eingedampfte
Matrixmaterial aufweisen, um sich zusammen mit dem Matrixmaterial aufzulösen und eine kristalline Struktur auf der Substratoberfläche
zu bilden. Es versteht sich, daß dieser Schritt zum Wiederauflösen des Matrixmaterials zusammen mit
dem Analytenmaterial die Analyse der Zusammensetzung des Materials bei bestimmten Analysenverfahren unterstützt, wie z. B.
bei der Massenspektrometrie.
Bei einer alternativen Verfahrensweise können die hier
beschriebenen Verfahren einen Schritt zur Abgabe eines Gemischs, das aus dem Analytenmaterial und dem Matrixmaterial
besteht, sowie anderer Materialzusammensetzungen aufweisen.
Auf diese Weise werden die Matrix und der Analyt als ein Materialvolumen
auf die Substratoberfläche abgegeben.. In einem weiteren Schritt können die vorbereiteten Probenmaterialanordnungen
einem Diagnosegerät zugeführt werden, um Informationen zu ermitteln, welche die Zusammensetzung des Probenmaterials
darstellen.
Ein derartiges Diagnosegerät kann ein Massenspektrometer aufweisen. Die Massenspektrometer können Laufzeitmassenspektrometer,
Fouriertransformations-Massenspektrometer oder
irgendein anderer geeigneter Massenspektrometertyp sein, der
die Analyse der Zusammensetzung der Probenanordnung gestattet. Bei einer praktischen Ausführung der Verfahren weist
der Schritt zur Bereitstellung einer Vesikel mit einer inneren Kammer den Schritt zur Bereitstellung einer Vesikel mit einem
piezoelektrischen Element auf, um zu bewirken, daß sich das Fluid durch die Kammer bewegt. Dieses Verfahren kann außerdem
den Schritt zur Bewegung der Vesikel durch rasterartiges Führen der Vesikel quer über die Substratoberfläche aufweisen, um
die Probenmaterialanordnung auszubilden.
Bei einer alternativen praktischen Ausführung der Verfahren können Parallelverarbeitungsprotokolle angewandt werden,
wobei die während der Verarbeitung verwendete Vesikel· eine Vesikeleinheit mit mehreren, zu einer Matrix angeordneten
Vesikeln zur Abgabe von Fluid in eine erste Gruppe von mehreren Positionen auf der Substratoberfläche aufweist. Auf diese
Weise sorgt das Verfahren in einer einzigen Operation zur Ausbildung einer Probenmaterialmatrix auf der Substratoberfläche.
Durch Anwendung mehrerer Druckschritte mit der Vesikelmatrix kann zur Ausbildung einer großen Probenmaterialmatrix auch
Offsetdruck angewandt werden. Andere Druckverfahren können durch die vorliegende Erfindung angewandt werden, ohne von ihrem
Schutzumfang abzuweichen.
In einer weiteren Ausführungsform kann Fluid auf die
Oberfläche des Substrats abgegeben werden, indem die Vesikel mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht wird, um die
Substratoberfläche mit Probenmaterial zu betupfen. Als Alternative bieten die Verfahren ein anderes, kontaktfreies Druckverfahren,
wobei die erfindungsgemäßen Verfahren die Ausbildung eines Fluidtropfens an der distalen Spitze der Vesikel
bewirken. Dieser Fluidtropfen wird mit der Substratoberfläche
in Kontakt gebracht, um Probenmaterial darauf abzugeben. Dies sorgt für die kontrollierte Abgabe eines bekannten Fluidvolumens,
ohne zum Kontakt der Vesikel mit der Substratoberfläche zu führen.
In weiteren Ausführungsformen werden Vesikeln mit einer
inneren Kammer bereitgestellt, die in ihren Abmessungen so an-
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gepaßt ist, daß sie das Füllen der Kammer durch Kapillarwirkung zuläßt.
Nach einem weiteren Aspekt werden Verfahren zur Analyse eines Materials bereitgestellt, welche die folgenden Schritte
aufweisen: Bereitstellen einer Vesikel, die sich zum Transport eines Fluids mit darin enthaltenem Material eignet, Anordnen
der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats, Steuern der Vesikel zur Abgabe eines Nanolitervoluminens
des Fluids, um ein definiertes und gesteuertes Fluidvolumen in der ersten Position der Substratoberfläche abzugeben,
Bewegen der Vesikel in eine zweite Position, die an eine zweite Stelle auf der Substratoberfläche angrenzt, um ein
definiertes und gesteuertes Volumen des Materials entlang einer Anordnung von Positionen auf der Substratoberfläche abzugeben,
und Ausführen einer massenspektrometrischen Analyse des Materials in jeder Position der Anordnung. Diese Verfahren
können den Schritt zum Vermischen eines Matrixmaterials und eines Analytenmaterials zur Ausbildung des Fluids aufweisen,
das auf die Substratoberfläche abgegeben wird. Als Alternative kann diese Ausführungsform die Schritte zum Füllen einer in
der Vesikel enthaltenen Kammer mit einem Matrixmaterial und zur Abgabe des Matrixmaterials an die Positionsanordnung aufweisen.
Anschließend kann der Analyt abgegeben werden. Der Schritt zur Ausführung der Massenspektrometrie kann den
Schritt zur Ausführung einer matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie
sowie einer Laufzeit-Massenspektrometrie oder einer Fouriertransformations-Massenspektrometrie
aufweisen.
Nach einem anderen Aspekt wird eine Vorrichtung zur Ausbildung einer Probenmaterialanordnung auf einer Substratoberfläche
bereitgestellt. Eine solche Vorrichtung weist auf: eine Vesikel mit einem distalen Ende, das sich zum Transport
eines Fluids darauf eignet, einen beweglichen Arm mit einem an der Vesikel montierten distalen Abschnitt, eine Steuereinrichtung
zum Bewegen des Arms, um die Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats anzuordnen und
die Vesikel so zu steuern, daß sie ein Nanolitervolumen des Fluids in der ersten Position der Substratoberfläche abgibt,
und ein Diagnosegerät zum Analysieren des Materials, um ein Zusammensetzungssignal zu erzeugen, welches die chemische Zusammensetzung
des Materials darstellt. In dieser Vorrichtung kann die Vesikel einen Schaft aus massivem Material und eine
Vesikel mit einer für den Transport des Fluids geeigneten Innenkammer sowie mit einer Kammer zum Transport eines Fluids in
einem Wandlerelement für das Ausstoßen des Fluids aus der Kammer aufweisen.
Ferner werden hierin Substrate bereitgestellt, die eine Oberfläche zum Tragen einer Anordnung eines Matrixmaterials
aufweisen und nach einem Verfahren mit den folgenden Schritten hergestellt werden: Bereitstellen einer Vesikel, die sich zum
Transport eines Fluids eignet, das ein Matrixmaterial enthält, Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der
Oberfläche des Substrats, Steuern der Vesikel zur Abgabe des Fluids in die erste Position der Substratoberfläche und Bewegen
einer Vesikel zu einer Gruppe von Positionen angrenzend an die Substratoberfläche sowie Abgabe von Fluid in jeder dieser
Positionen, um eine Anordnung von Matrixmaterial auszubilden.
Das Substrat selbst kann ein flaches Siliciumplättchen sowie irgendein anderes geeignetes Material sein und kann mit Grübchen
versehen sein, Vertiefungen bzw. Kavitäten aufweisen und Kavitäten mit rauhen Innenflächen aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen weisen die Verfahren zur Ausbildung einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer
Substratoberfläche, wie sie hier bereitgestellt werden, die folgenden Schritte auf: Inkontaktbringen vorher festgelegter
Positionen der Oberfläche eines unlöslichen Trägers mit thiolhaltigen
Nucleinsäurelösungen, die mit einer Vesikel· in die Positionen abgegeben werden, .die eine innere Kammer aufweist,
weiche die entsprechenden Lösungen enthält, wodurch die vorgegebenen Positionen thiolreaktive Gruppen enthalten. Als Alternative
wird die gesamte Oberfläche des Substrats mit den thioireaktiven Gruppen derivatisiert, und thiolhaltige
Nucieinsäure wird auf eine anordnungsbiidende Weise in vorgegebene
Positionen auf der Oberfiäche abgegeben. Außerdem werden hierin Substrate mit einer Oberfläche bereitgestellt, die
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eine durch die hierin beschriebenen Verfahren ausgebildete Anordnung
von Nucleinsäuren aufweist.
Die obigen und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den nachstehenden Figuren, der
ausführlichen Beschreibung und den Patentansprüchen verständlicher werden.
Fig. 1 zeigt ein System zur Herstellung von Anordnungen eines Probenmaterials zur Analyse.
Fig. 2 zeigt eine Stifteinheit, die sich zur Verwendung mit dem in Fig. 1 abgebildeten System für die Implementierung
eines Parallelverfahrens zur Abgabe von Material an eine Substratoberfläche
eignet.
Fig. 3 zeigt einen unteren Abschnitt der in Fig. 2 dargestellten Einheit.
Fig. 4 zeigt eine alternative Ansicht des unteren Abschnitts der in Fig. 2 abgebildeten Stifteinheit.
Fig. 5A-5D zeigen ein Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung.
Fig. 6A-6B zeigen eine alternative Einheit zur Abgabe
von Material an die Oberfläche eines Substrats.
Fig. 7 zeigt eine Schemazeichnung, welche die kovalente
Bindung von Oligodesoxynucleotiden an eine Siliciumdioxidoberfläche
darstellt, wie in den hier angegebenen Verfahren beschrieben. Im einzelnen wurde Siliciumdioxid mit 3-Aminopropyltriethoxysilan
zur Reaktion gebracht, um eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminogruppen auf der Oberfläche zu erzeugen.
Dann wurde ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel mit dem primären Amin zur Reaktion gebracht, um eine Iodacetamid-Gruppe
einzubauen. Ein Oligodesoxynucleotid, das ein 31- oder 5'-Disulfid enthielt (dargestellt als 5'), wurde mit
Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) behandelt, um das Disulfid
zu einem freien Thiol zu reduzieren, das dann mit der Iodacetamido-Oberflache
verbunden wurde.
Fig. 8 zeigt ein Diagramm, in dem die Konjugation von Oligodesoxynucleotid-Sonden mit einer Siliciumoberflache als
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Funktion der TCEP-Konzentration dargestellt ist, die in de*r
Disulfid-Reduktion verwendet wurde.
Fig. 9 zeigt ein matrixunterstütztes Laserdesorptions/Ionisations-Laufzeit-(MALDI-TOF-)Massenspektrum
eines Silicium-Wafers mit der Oligodesoxynucleotid-Sequenz mit der Bezeichnung
"TCUC" (5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG-S'/ Seq.-ID-Nr. 1),
die im wesentlichen gemäß der Beschreibung in Fig. 7 kovalent gebunden ist, und der daran hybridisierten Oligodesoxynucleotidsequenz
mit der Bezeichnung "MJM6" (5'-CCGGGTACCGAGCTCGaA-TTC-31;
Seq.-ID-Nr. 2).
Fig. 10 zeigt eine Schemazeichnung der Immobilisierung von spezifischen thiolhaltigen DNA-Zielen die durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) auf der Oberfläche eines Silicium-Wafers erzeugt wurden. Ein zu einem Abschnitt der DNA-Zielsequenz
komplementäres Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr. : 7] wurde mit dem immobilisierten DNA-Ziel hybridisiert, und es wurde
eine MALDI-TOF MS-Analyse ausgeführt, die ein vorherrschendes Signal bei einem beobachteten Masse-Ladungs-Verhältnis von
3618,33 zeigte, daß dem hybridisierten Oligonucleotid mit einem theoretischen Masse-Ladungs-Verhältnis von 3622,4 entsprach.
Fig. 11 zeigt eine Ausführungsform eines Substrats mit
darin eingeätzten Kavitäten, die sich zur Aufnahme von Material für die Analyse eignen.
Fig. 12 zeigt ein Beispiel für Spektren, die man von einem linearen Laufzeit-Massenspektrometergerät erhielt und
welche die Materialzusammensetzung des Probenmaterials auf der Oberfläche des in Fig. 11 abgebildeten Substrats darstellen.
Fig. 13 zeigt Molekulargewichte, die für das Probenmaterial mit den in Fig. 12 identifizierten Spektren ermittelt
wurden.
Fig. 14 zeigt ein Schema einer 4 χ 4-DNA-Anordnung (16
Positionen) auf der Oberfläche eines Silicium-Wafers mit den thiolhaltigen Oligonucleotid-Molekülen, bezeichnet als "Oligomer
1" [5'-CTGGATGCGTCGGATCATCTTTTTt-(S)-S'; Seq.-ID-Nr.: 8], Oligomer 2 [5'-(S)-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATt-S'; Seq.-ID-Nr.: 3]
und "Oligomer 3" (Seq.-ID-Nr.: 1; ein Derivat des "TCUC"-Oligonucleotids
mit freiem Thiol von Beispiel 1) , die im we-
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sentlichen gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 in 16 Positionen auf der Oberfläche des Silicium-Wafers !covalent gebunden
sind.
Fig. 15 zeigt ein Schema der Hybridisierung spezifischer Oligonucleotide an jeder der 16 Positionen der DNA-Hybridisierungsanordnung
von Fig. 14, wobei das zu dem Oligomer 1 komplementäre Oligonucleotid (5'-GATGATCCGACGCATCAGa-ATGT-3';
Seq.-ID-Nr.: 9) an das Oligomer 1 gebunden ist, während das zum Oligomer 2 komplementäre Oligonucleotid (51-AATACTACACAG-3';
Seq.-ID-Nr.: 7) an das Oligomer 2 und das zum Oligomer 3 komplementäre Oligonucleotid (5'-CCGGGTACCGAGCTC-GAATTC-3';
Seq.-ID-Nr.: 2) an das Oligomer 3 gebunden ist.
Fig. 16 zeigt ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum einer 4 χ 4-DNA-Anordnung (16 Positionen) auf
einem Silicium-Wafer, die schematisch in Fig. 15 dargestellt ist. Das Spektrum zeigt ein einzelnes, vorherrschendes Signal
eines experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnisses in jeder Position entsprechend den spezifischen hybridisierten Oligonucleotiden.
Die 2+ zeigt die Position eines doppelt geladenen Moleküls an, das als Vergleichsstandard bei der MALDI-TOF MS-Analyse
verwendet wird. Das * bezeichnet Restmengen eines verunreinigenden Oligonucleotids, die nach den Waschverfahren auf
der Oberfläche des Plättchens zurückbleiben. Die relative Position des ^-Signals zeigt die annähernde Größe des verunreinigenden
Oligonucleotids .
Fig. 17 zeigt ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum einer 8 χ 8-DNA-Anordnung (64 Positionen). Das
Spektrum zeigt ein einzelnes, vorherrschendes Signal eines experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnisses, das den vorausgesagten
spezifischen hybridisierten Oligonucleotiden entspricht. Das * bezeichnet Restmengen eines verunreinigenden
Oligonucleotids, die nach den Waschverfahren auf der Oberfläche
des Wafers zurückbleiben. Die relative Position des *- Signals zeigt die ungefähre Größe des verunreinigenden Nucleotids.
Fig. 18 ist eine Darstellung der Nucleotid-Verlängerung eines DNA-Primers, der mit einer thiolhaltigen DNA-Matrize
reassoziiert ist, die auf der Oberfläche eines SIAB-
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derivatisierten Silicium-Wafers immobilisiert ist. Ein komplementärer
12-mer-Oligonucleotid-Primer [Seq.-ID-Nr.: 12] wurde
an ein thiolhaltiges 27-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr. 11]
hybridisiert, das durch das SIAB-Vernetzungsmittel auf einem
Siliciumträger immobilisiert war. Die Siliciumoberflache, die das immobilisierte doppelsträngige DNA-Molekül enthielt, wurde
mit DNA-Polymerase in Gegenwart von dATP, dCTP, dGTP und ddTTP unter Verlängerungsbedingungen inkubiert und einer MALDI-TOF
■ MS-Analyse unterworfen. Das Massenspektrum des Silicium-Wafers
zeigte die Gegenwart von zwei vorherrschenden Signalen; eines mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis gleich dem des unverlängerten
12-mer-Oligonucleotids, sowie ein Signal, das einem 15-mer-DNA-Molekül
entsprach, das auf dem Wafer um 3 Nucleotide bis zur ersten Position in der Sequenz verlängert worden ist,
in der ein ddTTP eingebaut war.
Fig. 19 zeigt ein Diagramm eines Experiments, das entworfen wurde, um den Effekt des Abstands zwischen der SIAB-derivatisierten
Oberfläche und dem bei den Primerverlängerungsreaktionen ausgebildeten doppelsträngigen DNA-Molekül zu
prüfen. Zwei thiolhaltige Oligonucleotide von unterschiedlicher Sequenz [Seq.-ID-Nrn.: 8 & 11] wurden auf einer SIAB-derivatisierten
Siliciumoberflache immobilisiert und mit spezifischen
Oligonucleotiden inkubiert, die ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit Spacern (= nichtcodierenden DNA-Sequenzen) von
0, 3, 6, 9 und 12 Basen zwischen der SIAB-derivatisierten
Oberfläche und dem doppelsträngigen DNA-Molekül ausbilden, das von dem an der immobilisierten thiolhaltigen DNA hybridisierten
Oligonucleotid gebildet wird. Das freie 3'-Ende des hybridisierten
Oligonucleotids wurde entweder mit Sequenase-DNA-Polymerase oder mit ThermoSequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart
der drei Desoxynucleotidtriphosphate und des entsprechenden Didesoxynucleotidtriphosphats unter Verlängerungsbedingungen
verlängert, und die entstehenden Reaktionsprodukte wurden einer MALDI-TOF MS-Analyse unterworfen.
Fig. 20 zeigt ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum
der spezifischen Verlängerungsprodukte des in Fig. 19 dargestellten Primerverlängerungsexperiments (primer extension)
. Die Spektren in der linken Spalte sind diejenigen, die
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sich aus der MALDI-TOF MS-Analyse der Verlängerungsreaktionen
ergeben, in denen Sequenase verwendet wurde. Die Spektren in der rechten Spalte sind diejenigen, die sich aus der Analyse
der Verlängerungsreaktionen ergeben, in denen ThermoSequenase verwendet wurde. ThermoSequenase-DNA-Polymerase konnte das 3y-Ende
des hybridisierten DNA-Primers verlängern, wobei der Abstand zwischen dem doppelsträngigen DNA-Molekül und der Oberfläche
des derivatisierten Silicium-Wafers zwischen 0 und 12 Nucleotiden variierte. Sequenase-DNA-Polymerase konnte gleichfalls
die hybridisierte DNA verlängern, wobei der Abstand zwischen dem doppelsträngigen DNA-Molekül und dem Silicium-Wafer
3 bis 9 Nucleotide betrug.
Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche
Bedeutung, wie sie normalerweise vom Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird, zu dem die vorliegende Erfindung gehört. Alle
Patentschriften und Veröffentlichungen, auf die hierin Bezug genommen wird, werden hier zur Bezugnahme einbezogen.
Der Begriff "Nucleinsäure", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf Oligonucleotide oder Polynucleotide, wie zum
Beispiel Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA), sowie auf Analoge von RNA oder DNA, die beispielsweise
aus Nucleotid-Analogen bestehen, die jeweils in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen können. Nucleinsäuremoleküle
können synthetisch sein oder können aus einer bestimmten biologischen Probe unter Anwendung einer beliebigen
Anzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden, wobei das gewählte spezielle Verfahren für die jeweilige biologische
Probe geeignet ist.
Zu "Nucleotiden", wie sie hierin verwendet werden, gehören Nucleosidmono-, -di- und -triphosphate. Nucleotide
schließen außerdem modifizierte Nucleotide ein, wie zum Beispiel Phosphorthioat-Nucleotide und Deazapurin-Nucleotide. Ein
vollständiger Satz von kettenverlängernden Nucleotiden bezieht
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sich auf vier verschiedene Nucleotide, die an jeder der vier verschiedenen Basen, welche die DNA-Matrize bilden, hybridisieren
können.
Der Begriff "Nucleinsäuresynthese", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf irgendein Verfahren, wodurch
Oligonucleotide oder Polynucleotide erzeugt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Verfahren, die mit chemischen
oder enzymatischen Reaktionen verbunden sind.
Der Begriff "Anordnung" (array) bezieht sich auf eine geordnete Anordnung von Elementen oder Positionen. Die Anordnung
kann eine beliebige Anzahl von Elementen oder Positionen enthalten und kann in den verschiedensten Formen vorliegen. In
bevorzugten Ausführungsformen ist die Anordnung zweidimensional
und enthält η χ m Elemente, wobei m und η ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können. In besonders
bevorzugten Ausführungsformen sind η und m jeweils gleich 4 oder ein Vielfaches davon.
Der Begriff "Vernetzungsmittel" ist ein Fachbegriff und bezieht sich, wie er hier gebraucht wird, auf Reagenzien, die
eine Nucleinsäure an einem unlöslichen Träger immobilisieren können, vorzugsweise durch kovalente Bindungen. So schließen
zur Verwendung hierin geeignete "Vernetzungsmittel" die verschiedensten Mittel ein, die mit einer funktionellen Gruppe,
die auf einer Oberfläche des unlöslichen Trägers vorhanden ist, und mit einer in dem Nucleinsäuremolekül vorhandenen
funktionellen Gruppe reaktionsfähig sind. Reagenzien, die eine solche Reaktionsfähigkeit aufweisen können, sind unter anderem
homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, von denen viele dem Fachmann bekannt sind. Heterobifunktionelle Reagenzien werden
bevorzugt.
Der Begriff "thiolreaktive Funktionalität", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf eine Funktionalität, die zu
einer schnellen Reaktion mit einer nucleophilen Thiolkomponente fähig ist, um eine kovalente Bindung zu erzeugen (z. B. eine
Disulfid- oder Thioetherbindung). Im allgemeinen sind Thiolgruppen gute Nucleophile, und bevorzugte thiolreaktive
Funktionalitäten sind reaktive Elektrophile. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von thiolreaktiven Funktionalitäten bekannt, zu
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denen beispielsweise Halogenacetyle (vorzugsweise Iodacetyl),
Diazoketone, Epoxyketone, α,β-ungesättigte Carbonyle (z. B.
α,β-Enone) und andere reaktive Michael-Akzeptoren (einschließlich Maleinimide), Säurehalogenide, Benzylhalogenide und dergleichen
gehören. In bestimmten Ausführungsformen kann eine freie Thiolgruppe eines Disulfids mit einer freien Thiolgruppe
reagieren (d. h. durch Bildung einer Disulfidbindung, einschließlich
durch Disulfidaustausch). Ein "thiolreaktives" Vernetzungsmittel, wie es hierin verwendet wird, bezieht sich
auf ein Vernetzungsmittel (oder eine Oberfläche) , das (die) mindestens eine thiolreaktive Funktionalität aufweist oder so
modifiziert werden kann, daß es (sie) diese Funktionalität aufweist. Man wird erkennen, daß die Reaktion einer Thiolgruppe
durch Blockieren mit einer geeigneten Schutzgruppe vorübergehend verhindert werden kann, wie es auf diesem Gebiet herkömmlich
ist (siehe z. B. T.W. Greene und P.G.M. Wuts "Protective
Groups in Organic Synthesis" (Schutzgruppen in der organischen Synthese), 2. Aufl., John Wiley & Sons, (1991)).
Der Begriff "selektiv spaltbarer Linker", wie er hier
gebraucht wird, bezeichnet einen Linker, der unter ausgewählten Bedingungen gespalten wird, wie z. B. ein photospaltbarer
Linker, ein chemisch spaltbarer Linker und ein enzymatisch spaltbarer Linker (d. h. eine Restriktionsendonuclease-Stelle
oder ein Ribonucleotid/RNase-AufSchluß) . Der Linker ist zwisehen
dem Träger und der immobilisierten DNA eingebaut.
Die Begriffe "Protein", "Polypeptid" und "Peptid", wie sie hier gebraucht werden, werden austauschbar verwendet, wenn
auf eine translatierte Nucleinsäure (z. B. ein Genprodukt) Bezug genommen wird.
Der Begriff "Probe", -wie er hierin gebraucht wird, soll
eine Zusammensetzung bezeichnen, die ein nachzuweisendes Material enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die
Probe eine "biologische Probe" (d. h. irgendein aus einer lebenden Quelle gewonnenes Material (z. B. von Mensch, Tier,
Pflanze, Bakterien, Pilzen, Einzellern, Viren). Die biologische Probe kann in irgendeiner Form vorliegen, einschließlich
fester Materialien (z. B. Gewebe, Zellpellets und Biopsien) und biologischer Fluide (z. B. Urin, Blut, Speichel, Frucht-
wasser und Mundspülflüssigkeit (die Buccalzellen enthält)). Vorzugsweise werden feste Materialien mit einem Fluid vermischt.
Der Begriff "Substrat", wie er hier gebraucht wird, soll einen unlöslichen Träger bezeichnen, auf den eine Probe
entsprechend den hier beschriebenen Materialien aufgebracht wird. Beispiele geeigneter Substrate sind unter anderem Kügelchen
(z. B. Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Ma-
" gnetwerkstoff, Sephadex/Sepharose, Cellulose), Kapillaren,
ebene Träger, wie z. B. Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen
(Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silicium), Kunststoffmaterialien einschließlich Multi- bzw. Mehrkavitätenplatten
oder Membranen (z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Stifte (z. B. Stiftanordnungen,
die sich für die kombinatorische Synthese oder Analyse eignen) oder Kügelchen in Vertiefungen von ebenen
Oberflächen, wie z. B. von Wafern (z. B. Silicium-Wafern) mit
oder ohne Platten.
Bei den hier bereitgestellten besonderen Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an einem Substrat sind bevorzugte
Substrate diejenigen, die eine Bindung von Nucleinsäuren an das Substrat in hohen Dichten unterstützen können,
vorzugsweise derart, daß die kovalent gebundenen Nucleinsäuren auf dem Substrat in einer Dichte von mindestens etwa 20
2
fmol/mm vorhanden sind, stärker bevorzugt mindestens etwa 75
fmol/mm vorhanden sind, stärker bevorzugt mindestens etwa 75
2 2
fmol/mm , noch stärker bevorzugt mindestens etwa 85 fmol/mm ,
2
noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 150 fmol/mm . Zu den am stärksten bevorzugten Substraten zur Verwendung bei den hier bereitgestellten besonderen Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an Substraten gehört Silicium, während zu den weniger bevorzugten Substraten polymere Materialien gehören, wie z. B. Polyacrylamid. Zu den verwendbaren Substraten bei den hier bereitgestellten Verfahren für die Herstellung von Anordnungen gehören die verschiedensten unlöslichen Trägermaterialien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Cellulose, Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, SiI-
noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 150 fmol/mm . Zu den am stärksten bevorzugten Substraten zur Verwendung bei den hier bereitgestellten besonderen Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an Substraten gehört Silicium, während zu den weniger bevorzugten Substraten polymere Materialien gehören, wie z. B. Polyacrylamid. Zu den verwendbaren Substraten bei den hier bereitgestellten Verfahren für die Herstellung von Anordnungen gehören die verschiedensten unlöslichen Trägermaterialien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Cellulose, Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, SiI-
DF 19? 82 0S6 Tl
ber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Kunststoffmaterialien (ζ. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid)
und Silicon.
Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte auf festen
Trägern
Die hierin beschriebenen Verfahren sorgen für die Immobilisierung von Nucleinsäuremolekülen in hoher Dichte auf einem
unlöslichen (z. B. festen) Träger. Im allgemeinen werden Nucleinsäuremoleküle auf dem unlöslichen Träger entweder direkt
oder mit Hilfe von Vernetzungsmitteln immobilisiert.
Bei Ausführungsformen der Verfahren, bei denen kein Vernetzungsmittel verwendet wird, wird eine modifizierte Nucleinsäure
direkt mit einer geeignet funktionalisierten Oberfläche zu einer immobilisierten Nucleinsäure umgesetzt. So
kann zum Beispiel eine iodacetyl-modifizierte Oberfläche (oder
eine andere thiolreaktive Oberflächen-Funktionalität) mit einer thiolmodifizierten Nucleinsäure zu immobilisierten Nucleinsäuren
reagieren.
Nach den hier bereitgestellten Verfahren wird das Vernetzungsmittel
so ausgewählt, daß es eine hohe Dichte von Nucleinsäuren liefert, die auf den unlöslichen Träger immobilisiert
sind. Ohne die Theorie dadurch einschränken zu wollen, glauben wir, daß die hier beschriebene hohe Dichte von immobilisierten
Nucleinsäuren zumindest teilweise auf eine relativ schnelle Reaktion zurückzuführen ist, die zwischen dem Vernetzungsmittel
und der Nucleinsäure (z. B. einer thiolmodifizierten Nucleinsäure) auftritt, verglichen mit anderen Reaktionen,
die früher zum Immobilisieren von Nucleinsäuren verwendet wurden. Außerdem kann eine hohe Dichte zumindest teilweise auf
einen engen Abstand der reaktiven Gruppen (z. B. Aminogruppen einer anderen reaktiven Funktionalität) auf dem funktionalisierten
unlöslichen Träger zurückzuführen sein. Folglich werden Reagenzien zum Modifizieren der Oberfläche im allgemeinen
so ausgewählt, daß sie dicht beabstandete Funktionalitäten auf dem funktionalisierten Träger liefern. Das Vernetzungsmittel
(und andere Reagenzien, die zum Funktionalisieren der Trägeroberfläche
oder des Nucleinsäuremoleküls verwendet werden)
E Ϊ3? 82 OSS Tl
können so ausgewählt werden, daß sie jeden gewünschten Abstand der immobilisierten Nucleinsäuremoleküle von der Trägeroberfläche
und jeden gewünschten Abstand der immobilisierten Nucleinsäuren voneinander liefern. So kann die sterische Hinderung
der Nucleinsäuremoleküle durch die Wahl eines geeigneten Vernetzungsmittels vermindert oder beseitigt werden. In
bestimmten Ausführungsformen kann das Vernetzungsmittel so gewählt werden, daß es mehrere reaktive Funktionalitäten liefert,
wie sie bei der Dendrimer-Synthese zur Anlagerung von mehreren Nucleinsäuren an eine einzige vernetzende Komponente
verwendet werden. Vorzugsweise wird das Vernetzungsmittel so gewählt, daß es mit dem Nucleinsäuremolekül in hohem Maße reaktionsfähig
ist, um eine schnelle, vollständige und/oder selektive Reaktion zu ergeben. In bevorzugten Ausführungsformen
ist das Reaktionsvolumen der Reagenzien (z. B. der Thiolgruppe und der thiolreaktiven Funktionalität) klein.
Bevorzugte Nucleinsäuren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind "thiolmodifizierte Nucleinsäuren", d. h.
Nucleinsäuren, die so derivatisiert sind, daß sie mindestens eine reaktive Thiolkomponente enthalten. Wie weiter unten im
Beispiel 1 ausführlicher beschrieben, werden Nucleinsäuren, die mindestens ein reaktives Thiol enthalten, vorzugsweise
durch Behandeln einer Nucleinsäure, die ein 3'- oder 51-Disulfid
enthält, mit einem Reduktionsmittel hergestellt, das vorzugsweise nicht in nachfolgenden Reaktionen konkurriert (d.
h. es reagiert nicht mit einer Iodacetimido-Funktionalität). Disulfid-derivatisierte Nucleinsäuren können nach den verschiedensten
Verfahren synthetisiert werden. Zum Beispiel kann eine Nucleinsäure am 3'- oder 5'-Ende durch Reaktion mit einem
disulfidhaltigen Modifikationsmittel modifiziert werden. Alternativ
kann ein thiolierter Primer enzymatisch oder nichtenzymatisch an die Nucleinsäure gebunden werden. Eine 5'-Phosphoramidat-Funktionalität
kann gleichfalls einen Bindungspunkt für ein Thiol oder ein disulfidhaltiges Cytosin oder Desoxycytosin
liefern. Beispiele geeigneter Reduktionsmittel zur Reduktion einer disulfid-modifizierten Nucleinsäure sind unter
-33- DE IS? 82 096 Tl
anderem: Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (vorzugsweise eir
ne Konzentration im Bereich von 1-10OmM (am stärksten bevorzugt etwa 1OmM)) wird bei einem pH-Wert im Bereich von 3-6 (am
stärksten bevorzugt etwa 4,5), einer Temperatur im Bereich von 20-450C (am stärksten bevorzugt etwa 37 0C) über eine Zeit im
Bereich von etwa 1 bis etwa 10 h (am stärksten bevorzugt etwa 5 h) zur Reaktion gebracht; Dithiothreitol (vorzugsweise eine
Konzentration im Bereich von 25 bis 10OmM (je nachdem, ob der Reaktionspartner isoliert ist) wird bei einem pH-Wert im Bereich
von 6-10 (am stärksten bevorzugt etwa 8) und einer Temperatur im Bereich von 25-45°C (am stärksten bevorzugt etwa
37°C) über eine Zeit im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 h (am stärksten bevorzugt etwa 5 h) zur Reaktion gebracht. TCE bietet
einen Vorteil bei dem niedrigen pH-Wert, bei dem es reaktionsfähig ist. Durch diesen niedrigen pH-Wert werden Thiole
wirksam protoniert, so daß nucleophile Reaktionen von Thiolen unterdrückt werden und weniger Nebenreaktionen als bei anderen
Disulfid-Reduktionsmitteln auftreten, die bei höheren pH-Werten
verwendet werden.
Wie weiter unten in Beispiel 1 beschrieben, ist ein bevorzugtes bifunktionelles Vernetzungsmittel N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB). Andere Vernetzungsmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Dimaleinimid,
Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat
(SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiolpropionat
(SPDP) , Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat
(SMCC) und 6-Hydrazinonicotinimid (HYNIC), die gleichfalls in dem neuen Verfahren verwendet werden können.
Wegen weiterer Beispiele von Vernetzungsmitteln siehe z. B.
Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" (Chemie der Proteinkonjugation und -vernetzung), CRC Press
(1991), und Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Biokonjugat-Verfahren),
Academic Press (1995) .
In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird die Nucleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linker-Komponente
immobilisiert, die während der Massenspektrometrie gespalten wird. Typische Beispiele von photolabilen bzw. lichtempfindlichen
Vernetzungsmitteln schließen ein, sind aber nicht be-
schränkt auf 3-Amino(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al.
(1995) Molecular Diversity, S. 4-12, und Rothschild et al.
(1996) Nucleic Acids Res. 24: 361-66)/
In einer weiteren Ausführungsform der hier bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer
Ziel-Nucleinsäuresequenz sowie der Immobilisierungsverfahren
wird eine zur Ziel-Nucleinsäure komplementäre einzelsträngige
Nucleinsäure durch eine Kopplung, die eine Bindung zwischen einer Thiolgruppe und einer thiolreaktiven Funktionalität sowie
eine spaltbare, vorzugsweise eine selektiv spaltbare Linkerkomponente aufweist, an einer Oberfläche immobilisiert.
Linker
Eine Ziel-Nachweisstelle kann über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität
(L1) an dem Ziel-Nucleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten
Funktionalität (L) an dem Einfangmolekül direkt an einen festen Träger gebunden werden. Eine reversible Bindung kann so
beschaffen sein, daß sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie
aufgespalten wird (d. h. eine photospaltbare Bindung, wie z. B. ein Charge-Transfer-Komplex, oder eine instabile
Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen Radikalen gebildet wird).
Photospaltbare Linker sind Linker, die bei Belichtung gespalten werden (siehe z. B. Goldmacher et al. (1992) Bio conj. Chem.
3: 104-107), wodurch das ins Auge gefaßte Agens bei Belichtung freigesetzt wird. Photospaltbare Linker, die
bei Belichtung gespalten werden, sind bekannt (siehe z. B. Hazum et al. (1981) in Pept. , Proc. Eur. Pept. Symp., 16th,
Brunfeldt, K. (Hrsg.), S. 105-110, wo die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als photospaltbare Schutzgruppe für Cystein
beschrieben wird; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69-82, der wasserlösliche photospaltbare Copolymere beschreibt,
zu denen Hydroxypropylmethacrylamid-Copolymer, Glycin-Copolymer, Fluorescein-Copolymer und Methylrhodamin-Copolymer gehören;
Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107, der ein Vernetzungsmittel und ein Reagens beschreibt, das bei Belichtung
mit Licht in nahem UV-Bereich (350nm) eine photolyti-
E 197 82GS6T1
sehe Zersetzung erfährt; und Senter et al. (1985) Photochem.
Photobiol. 42: 231-237, der Nitrobenzyloxycarbonylchlorid-Vernetzungsmittel
beschreibt, die photospaltbare Bindungen erzeugen) , wodurch die Zielsubstanz unter Belichtung freigesetzt
wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nucleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linker-Komponente immobilisiert,
die während der Massenspektrometrie gespalten wird.
Außerdem kann die Bindung mit L' als quartärer Ammoniumgruppe
ausgebildet werden, in welchem Falle die Oberfläche des festen Trägers vorzugsweise negative Ladungen trägt, welche
die negativ geladene Nucleinsäure-Hauptkette abstoßen und auf diese Weise die Desorption erleichtern, die für die Analyse
durch ein Massenspektrometer erforderlich ist. Desorption kann entweder durch die von dem Laserimpuls erzeugte Wärme
und/oder, in Abhängigkeit von L', durch spezifische Absorption von Laserenergie auftreten, die mit dem L'-Chromophor in Resonanz
ist.
So kann die L-L'-Chemie vom Typ einer Disulfidbindung
(chemisch spaltbar, zum Beispiel durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol), eines Biotin/Streptavidin-Systems, eines heterobifunktionellen
Derivats einer Tritylethergruppe sein (siehe z. B. Köster et al. (1990) "A Versatile Acid-Labile
Linker for Modification of Synthetic Biomolecules", Tetrahedron Letters 31:7095), die unter schwach sauren Bedingungen
sowie unter Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden können, einer Lävulinylgruppe, die unter nahezu neutralen
Bedingungen mit einem Hydrazinium/Acetat-Buffer spaltbar ist, einer Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysin-Bindung, die durch ein
Endopeptidase-Enzym wie z. B. Trypsin spaltbar ist, oder einer Pyrophosphat-Bindung, die durch eine Pyrophosphatase spaltbar
ist, oder einer Ribonucleotid-Bindung zwischen der Oligodesoxynucleotid-Sequenz,
die zum Beispiel durch eine Ribonuclease oder Alkali gespalten werden kann.
Die Funktionalitäten L und L1 können auch einen Charge-Transfer-Komplex
und dadurch die zeitweilige L-L'-Bindung bilden. Da in vielen Fällen die "Charge-Transfer-Bande" durch
Spektrometrie im UV/sichtbaren Bereich bestimmt werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes von R. Foster,
Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende
Energie der Charge-Transfer-Wellenlänge abgestimmt werden, und auf diese Weise kann eine spezifische Desorption vom
festen Träger eingeleitet werden. Der Fachmann wird erkennen, daß verschiedene Kombinationen diesen Zweck erfüllen können,
und daß die Donor-Funktionalität entweder auf dem festen Träger vorhanden sein oder mit dem nachzuweisenden Nucleinsäuremolekül
verbunden sein kann, oder umgekehrt.
In einem weiteren Verfahren kann durch homolytische Bildung von relativ stabilen Radikalen eine reversible L-L'-Bindung
erzeugt werden. Unter dem Einfluß des Laserimpulses findet in der Position des Radikals eine Desorption (wie oben
diskutiert) sowie eine Ionisation statt. Der Fachmann wird erkennen, daß andere organische Radikale ausgewählt werden können,
und daß in Bezug auf die Dissoziationsenergien, die zur homolytischen Spaltung der Bindung zwischen ihnen benötigt
werden, eine entsprechende Laser-Wellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z. B. Reactive Molecules von C. Wentrup, Hohn Wiley
& Sons, 1984).
Bei der Ausführung der Exonuclease-Sequenzierung mit Hilfe der MALDI-TOF MS (Massenspektrometrie) wird ein einzelsträngiges
DNA-Molekül, das über sein 5-Ende an einem festen Träger immobilisiert ist, einseitig mit einer 3'-aktiven Exonuclease
abgebaut, und anschließend wird das Molekulargewicht des abgebauten Nucleotids bestimmt. Eine umgekehrte Sanger-Sequenzierung
offenbart die Nucleotidsequenz der immobilisierten DNA. Durch Zugabe eines selektiv spaltbaren Linkers kann
nicht nur die Masse der freien Nucleotide bestimmt, sondern nach Entfernen der Nucleotide durch Waschen auch die Masse des
verbleibenden Fragments mittels MALDI-TOF nach dem Abspalten der DNA vom festen Träger nachgewiesen werden. Unter Verwendung
selektiv spaltbarer Linker, wie zum Beispiel der hierin bereitgestellten photospaltbaren und chemisch spaltbaren Linker,
kann diese Spaltung so gewählt werden, daß sie während der Ionisations- und Verdampfungsschritte der MALDI-TOF-Masenspektrometrie
auftritt. Das gleiche Grundprinzip gilt für einen 5'-immobilisierten Strang einer doppelsträngigen DNA,
die im doppelsträngigen Zustand zersetzt wird. Ebenso gilt
dies auch", wenn eine 5'-aktive Exonuclease verwendet und die
DNA über das 3'-Ende an dem festen Träger immobilisiert wird.
Wie festgestellt wurde, werden hierin mindestens drei Versionen der Immobilisierung ins Auge gefaßt: 1) die Ziel-Nucleinsäure
wird amplifiziert oder gewonnen (die Zielsequenz oder umgebende DNA-Sequenz muß bekannt sein, so daß Primer zum
Amplifizieren oder Isolieren hergestellt werden können); 2) die Primer-Nucleinsäure wird an dem festen Träger immobilisiert,
und die Ziel-Nucleinsäure wird daran hybridisiert (dies
dient zum Nachweis der Gegenwart oder zum Sequenzieren einer Zielsequenz in einer Probe); oder 3) eine doppelsträngige DNA
(amplifiziert oder isoliert) wird durch Bindung an einen vorgegebenen Strang immobilisiert, die DNA wird denaturiert, um
den Doppelstrangzustand zu beseitigen, und dann wird eine hohe Konzentration eines komplementären Primers oder einer stromaufwärts
der Zielstelle identischen DNA zugegeben, und es tritt eine Strangverdrängung auf, und der Primer wird an dem
immobilisierten Strang hybridisiert.
In den Ausführungsformen, wo die Primer-Nucleinsäure
auf dem festen Träger immobilisiert und die Ziel-Nucleinsäure daran hybridisiert wird, ermöglicht der Einbau des spaltbaren
Linkers die Immobilisierung der Primer-DNA am 5'-Ende, so daß
eine freie 3'-OH-Gruppe für die Nucleinsäuresynthese (Verlängerung)
verfügbar ist und die Sequenz der "hybridisierten" Ziel-DNA bestimmt werden kann, da die hybridisierte Matrize
durch Denaturieren entfernt werden kann und die verlängerten DNA-Produkte von dem festen Träger für eine MALDI-TOF MS abgespalten
werden können. Entsprechend kann bei 3) der immobilisierte DNA-Strang verlängert werden, wenn er an der Matrize
hybridisiert ist, und vom Träger abgespalten werden. So können weiter unten diskutierte Verlängerungsreaktionen zur Sanger-Sequenzierung
und zur Primer-Oligo-Basenverlängerung (PROBE = p_rimer oligo base e_xtension) unter Verwendung eines immobilisierten
Primers einer bekannten Stromaufwärts-DNA-Sequenz ausgeführt werden, die komplementär zu einem unveränderlichen Bereich
einer Zielsequenz ist. Die Nucleinsäure von der Person wird gewonnen, und die DNA-Sequenz eines variablen Bereichs
(Deletion, Insertion, Fehlsinnmutation, die genetische Prädis-
-38"- DE 197 82 036T1
position oder Krankheiten verursachen, oder die Gegenwart einer viralen/bakteriellen oder Pilz-DNA) wird nicht nur nachgewiesen,
sondern auch die tatsächliche Sequenz und die Position der Mutation werden bestimmt.
In anderen Fällen müssen die Ziel-DNA immobilisiert und der Primer reassoziiert werden. Dies erfordert die Amplifikation
einer größeren DNA, die auf einer bekannten Sequenz basiert, und das anschließende Sequenzieren der immobilisierten
Fragmente (d. h. die verlängerten Fragmente werden hybridisiert, aber nicht an dem Träger immobilisiert, wie oben beschrieben)
. In diesen Fällen ist der Einbau eines Linkers nicht wünschenswert, da das MALDI-TOF-Spektrum das der hybridisierten
DNA ist; es ist nicht notwendig, die immobilisierte Matrize abzuspalten.
Jeder beliebige, dem Fachmann bekannte Linker zum Immobilisieren von Nucleinsäuren an festen Trägern kann hier verwendet
werden, um die Nucleinsäure mit einem festen Träger zu verbinden. Die hier bevorzugten Linker sind die selektiv
spaltbaren Linker, besonders diejenigen, die hier als Beispie-Ie angegeben wurden. Andere Linker sind unter anderem säurespaltbare
Linker, wie zum Beispiel Bismaleinimidothoxypropan, säureempfindliche Trityl-Linker.
Säurespaltbare Linker, photospaltbare und hitzeempfindliche
Linker können gleichfalls verwendet werden, besonders wo es unter Umständen notwendig ist, daß Ziel-Agens zu spalten,
um es für eine Reaktion leichter zugänglich zu machen. Säurespaltbare Linker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf
Bismaleinimidothoxypropan und Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe z. B. Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-
589) sowie säureempfindliche Transferrin-Konjugate,. die einen
ausreichenden Anteil Transferrin enthalten, um den Eintritt in den intrazellulären Transferrin-Kreislauf zu ermöglichen (siehe
z. B. Welhörner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314).
Photospaltbare Linker
Es werden photospaltbare Linker bereitgestellt. Insbesondere werden photospaltbare Linker in Form ihrer Phosphora-
midit-Derivate zur Verwendung in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden bereitgestellt. Die Linker enthalten o-Nitrobenzyl-Komponenten
und Phosphatbindungen, die unter UV-Bestrahlung innerhalb von Minuten eine vollständige photolytisehe
Spaltung der Konjugate zulassen. Die verwendeten UV-Wellenlängen werden so ausgewählt, daß die Bestrahlung die Oligonucleotide
nicht schädigt, und liegen vorzugsweise bei etwa 350-380 ran, stärker bevorzugt bei 365 nm. Die hierin bereitgestellten
photospaltbaren Linker weisen im Vergleich zu gewöhnlieh verwendeten Phosphoramidit-Monomeren eine vergleichbare
Kopplungsleistung auf (siehe Sinha et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24: 5843-5846; Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res.
12: 4539-4557; Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49: 6123-6194; und Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191).
In einer Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker
die Formel I:
(D
20
wobei R ein ω- (4,4' -Dxmethoxytrityloxy) alkyl- oder ω-
wobei R ein ω- (4,4' -Dxmethoxytrityloxy) alkyl- oder ω-
21
Hydroxyalkylrest ist; R aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl- und Carboxy-Rest aus-
Hydroxyalkylrest ist; R aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl- und Carboxy-Rest aus-
gewählt ist; R ein Wasserstoffatom oder ein (Dialkylamino)
( o-cyanalkoxy)P-Rest ist; t gleich 0-3 ist und R ein Alkyl-,
Alkoxy-, Aryl- oder Aryloxy-Rest ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker die Formel II:
DE 1S782 0S6T1
wobei
.20
22
ein Wasserstoffatora oder ein
20
ein ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl-, ω-
Hydroxyalkyl- oder Alkyl-Rest ist; R aus einem Wasserstoffatom,
Alkyl-, Aryl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und Carboxy-Rest ausgewählt ist; R
(Dialkylamino) ( co-cyanalkoxy) P-Rest
20 stoffatom, Alkylrest oder OR ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist R eine
3-(4, 4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-, 3-Hydroxypropyl- oder Me-
21
thylgruppe; R ist aus einem Wasserstoffatom, einer Methyl
thylgruppe; R ist aus einem Wasserstoffatom, einer Methyl
ist und X
ein Wasser-
10 und Carboxygruppe ausgewählt; R
22
ist ein Wasserstoffatom oder
,20 ..
ist ein
eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; und X
Wasserstoff, eine Methylgruppe oder OR . In einer stärker bevorzugten
Ausführungsform ist R eine 3-(4,4'-Dimethoxy-
21 22
trityloxy)propylgruppe; R ist eine Methylgruppe; R ist ei-
20
ne (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; und X ist ein Wasserstoffatom. In einer weiteren, stärker bevorzugten Ausführungsform ist R eine Methylgruppe; R ist eine Methyl-
ne (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; und X ist ein Wasserstoffatom. In einer weiteren, stärker bevorzugten Ausführungsform ist R eine Methylgruppe; R ist eine Methyl-
22
gruppe; R ist eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe;
20
und X ist eine 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxygruppe.
und X ist eine 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxygruppe.
NO
(IU)
OR
23
DE 197 82 0S6T1
In einer weiteren Ausführungsform haben die photospaltbaren
Linker die Formel III:
(111)
OR23
23
wobei R ein Wasserstoffatom oder ein (Dialkylamino) ( ω-
24
cyanalkoxy)P-Rest ist und R aus einem ω-Hydroxyalkoxy-, ω-(4, 4 '-Dimethoxytrityloxy) alkoxy-, ω-Hydroxyalkyl- und co-4,4'-(Dimethoxytrityloxy)alkylrest ausgewählt und nicht substituiert oder an der Alkyl- oder Alkoxy-Kette mit einer oder mehreren Alkylresten substituiert ist; r und s jeweils unabhängig voneinander 0-4 bedeuten; und R ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryl-
cyanalkoxy)P-Rest ist und R aus einem ω-Hydroxyalkoxy-, ω-(4, 4 '-Dimethoxytrityloxy) alkoxy-, ω-Hydroxyalkyl- und co-4,4'-(Dimethoxytrityloxy)alkylrest ausgewählt und nicht substituiert oder an der Alkyl- oder Alkoxy-Kette mit einer oder mehreren Alkylresten substituiert ist; r und s jeweils unabhängig voneinander 0-4 bedeuten; und R ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryl-
24 oder Aryloxyrest ist. In bestimmten Ausführungsformen ist R
ein ω-Hydroxyalkyl oder ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkylrest
und ist an der Alkylkette mit einer Methylgruppe substituiert.
23
In bevorzugten Ausführungsformen ist R ein Wasserstoffatom oder eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe;
In bevorzugten Ausführungsformen ist R ein Wasserstoffatom oder eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe;
24
und R ist aus einer 3-Hydroxypropoxy-, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy-, 4-Hydroxybutyl-, 3-Hydroxy-lpropyl-, l-Hydroxy-2-propyl-, 3-Hydroxy-2-methyl-l-propyl-, 2-Hydroxyethyl-, Hydroxymethyl-, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl-, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-1-propyl-, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl-, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) 2-propyl-, 3-(4, 4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-l-propyl- und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethylgruppe ausgewählt.
und R ist aus einer 3-Hydroxypropoxy-, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy-, 4-Hydroxybutyl-, 3-Hydroxy-lpropyl-, l-Hydroxy-2-propyl-, 3-Hydroxy-2-methyl-l-propyl-, 2-Hydroxyethyl-, Hydroxymethyl-, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl-, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-1-propyl-, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl-, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) 2-propyl-, 3-(4, 4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-l-propyl- und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethylgruppe ausgewählt.
23
In stärker bevorzugten Ausführungsformen ist R eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; r und s sind gleich
In stärker bevorzugten Ausführungsformen ist R eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; r und s sind gleich
24
0; und R * ist aus einer 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy-,
0; und R * ist aus einer 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy-,
4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl-, 3-(4,4'-
Dimethoxytrityloxy)propyl-, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl-,
DE 13782 CS6T1
1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl-, 3- (4,4'-
Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-l-propyl- und 4,4'-
24
Dimethoxytrityloxymethylgruppe ausgewählt. R ist am meisten bevorzugt eine 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxygruppe.
Dimethoxytrityloxymethylgruppe ausgewählt. R ist am meisten bevorzugt eine 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxygruppe.
Herstellung der photospaltbaren Linker
I oder II
Photospaltbare Linker der Formeln I oder II können durch die nachstehend beschriebenen Verfahren, durch geringfügige
Modifikationen der Verfahren mittels Auswahl der geeigneten Ausgangsmaterialien oder durch irgendwelche anderen, dem
Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.
Bei den photospaltbaren Linkern der Formel II, wo X
ein Wasserstoffatom ist, können die Linker auf die folgende
Weise hergestellt werden. Alkylieren von 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, z. B. 3-Hydroxypropylbromid,
mit anschließendem Schützen des entstehenden Alkohols, beispielsweise in Form eines Silylethers,
liefert ein 5-(ω-Silyloxyalkoxy)-2-nitrobenzaldehyd. Zugabe
einer metallorganischen Verbindung zu dem Aldehyd ergibt einen Benzylalkohol. Verwendbare metallorganische Verbindungen sind
21
u. a. Trialkylaluminiumverbindungen (für Linker, wo R ein Alkylrest ist), wie z. B. Trimethylaluminium; Borhydride (für Linker, wo R ein Wasserstoffatom ist), wie z. B. Natriumbor-
u. a. Trialkylaluminiumverbindungen (für Linker, wo R ein Alkylrest ist), wie z. B. Trimethylaluminium; Borhydride (für Linker, wo R ein Wasserstoffatom ist), wie z. B. Natriumbor-
21
hydrid, oder Metallcyanide (für Linker, wo R ein Carboxy- oder Alkoxycarbonylrest ist), wie z. B. Kaliumcyanid. Im Falle der Metallcyanide würde das Reaktionsprodukt, ein Cyanhydrin, dann entweder unter sauren oder unter basischen Bedingungen in Gegenwart entweder von Wasser oder eines Alkohols hydrolysiert werden, um die interessierenden Verbindungen zu liefern.
hydrid, oder Metallcyanide (für Linker, wo R ein Carboxy- oder Alkoxycarbonylrest ist), wie z. B. Kaliumcyanid. Im Falle der Metallcyanide würde das Reaktionsprodukt, ein Cyanhydrin, dann entweder unter sauren oder unter basischen Bedingungen in Gegenwart entweder von Wasser oder eines Alkohols hydrolysiert werden, um die interessierenden Verbindungen zu liefern.
Die Silylgruppe der Seitenkette der entstehenden Benzylalkohole kann dann durch Desilylieren, beispielsweise mit
Tetrabutylammoniumfluorid, gegen eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe
ausgetauscht werden, um den entsprechenden Alkohol zu ergeben, gefolgt von einer Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid.
Reaktion mit beispielsweise 2-Cyanethyldiisopropyl-
22
chlorphosphoramidit liefert die Linker, wobei R ein (Dialkylamino)(ω-cyanalkoxy)P-Rest
ist.
Ein spezielles Beispiel einer Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist in dem nachfolgenden
Schema dargestellt, das auch die Verwendung des Linkers bei der Oligonucleotid-Synthese demonstriert. Dieses Schema ist
lediglich zur Erläuterung gedacht und soll auf keine Weise den Schutzumfang der Erfindung einschränken. Experimentelle Details
der synthetischen Umwandlungen werden in den Beispielen angegeben.
HO
DE 197 82 086 Tl
NO
Kat. Ki
CHO
tBDMSCI tBDMSO
Et1N
CHO
NO,
CHO
tBDMSO
Me3Al
DMTCI DMTO
DMAP
NO.
ch7 oh
DMTO
Spacer
NO.
O'Oligomer
20 Bei der Synthese der Linker mit der Formel II, wo X
gleich OR ist, wird 3,4-Dihydroxyacetophenon selektiv am 4-Hydroxyl-Ende
geschützt, z. B. durch Reaktion mit Kaliumcarbonat und einem Silylchlorid. Anstelle des Acetophenons können
Benzoesäureester, Propiophenone, Butyrophenone usw. verwendet werden. Das entstehende 4-Silyloxy-3-hydroxyacetophenon wird
dann mit einem Alkylhalogenid (für Linker, wo R ein Alkylrest
ist) am 3-Hydroxyl-Ende alkyliert und z. B. mit Tetrabutylammoniumfluorid
desilyliert, um ein 3-Alkoxy-4-
hydroxyacetophenon zu liefern. Diese Verbindung wird dann am 4-Hydroxyl-Ende durch Reaktion mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid,
z. B. mit 3-Hydroxypropylbromid, zu einem 4- (co-Hydroxyalkoxy) -3-alkoxyacetophenon alkyliert. Der
Seitenkettenalkohol wird dann als Ester, z. B. als Acetat, geschützt.
Diese Verbindung wird dann in der 5-Position nitriert, z. B. mit konzentrierter Salpetersäure, um die entsprechenden
2-Nitroacetophenone bereitzustellen. Verseifung des Seitenkettenesters, z. B. mit Kaliumcarbonat, und Reduktion
des Ketons, beispielsweise mit Natriumborhydrid, in der einen oder der anderen Reihenfolge liefert einen 2-Nitro-4-(ω-hydroxyalkoxy)-5-alkoxybenzylalkohol.
Dann wird durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid
ein selektiver Schutz des Seitenkettenalkohols in Form des entsprechenden 4,4'-Dimethoxytritylethers erzielt. Weitere Reaktion,
z. B. mit 2-Cyanethyldiisopropylchlorphosphoramidit,
22
liefert die Linker, wobei R ein (Dialkylamino) ( ω-cyanalkoxy)P-Rest ist.
liefert die Linker, wobei R ein (Dialkylamino) ( ω-cyanalkoxy)P-Rest ist.
Ein spezielles Beispiel der Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist im nachfolgenden Schema dargestellt.
Dieses Schema ist nur zur Erläuterung gedacht und soll in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung einschränken.
Ausführliche experimentelle Verfahren für die dargestellten Umwandlungen sind in den Beispielen zu finden.
HO
H3C O
- 46 -
OH
K2CO3
konzentr. HNO.
(70%)
AcO
v
O
CH3O
AcO
NO.
NO.
NO.
H3C O
K2CO3 / I NaBH4
ΟΝΑ,Ο-Ρ-0
O- CH3O
NO.
JPr2N O
DNA-Synthese
:n
NO.
H3C OH
-0 -P-ODNA1
Il
DE 19? 82 OSS T1
DMTO
NO
NaBH
AcO
NO
j K2C0:
HO
DMTCI
DMAP
DMAP
Phosphorylierung I
III
Photospaltbare Linker der Formel III können nach den im folgenden beschriebenen Verfahren, durch geringfügige Modifikation
der Verfahren mittels Auswahl geeigneter Ausgangsmaterialien oder durch andere, dem Fachmann bekannte Verfahren
hergestellt werden.
Im allgemeinen werden photospaltbare Linker der Formel III aus co-Hydroxyalkyl- oder Alkoxyalkyl-Verbindungen hergestellt,
insbesondere aus ω-Hydroxyalkyl- oder Alkoxybenzolen.
Diese Verbindungen sind im Handel erhältlich oder können aus einem ω-Hydroxyalkylhalogenid (z. B. aus 3-Hydroxypropylbromid)
und entweder Phenyllithium (für die ω-Hydroxyalkylbenzole)
oder Phenol (für die ω-Hydroxyalkoxybenzole) hergestellt
werden. Acylieren der ω-Hydroxylgruppe (z. B. als Essigsäureester) mit anschließender Friedel-Crafts-Acylierung des aromatischen
Rings mit 2-Nitrobenzoylchlorid liefert ein 4-(co-Acetoxyalkyl-
oder -alkoxy)-2-nitrobenzophenon. Reduktion des Ketons, z. B. mit Natriumborhydrid, und Verseifung des Seitenkettenesters
werden in der einen oder anderen Reihenfolge aus-
DE
geführt, um ein 2-Nitrophenyl-4-(hydroxyalkyl- oder -alkoxy)
phenylmethanol zu erhalten. Der Schutz der terminalen Hydroxylgruppe
in Form des entsprechenden 4,4'-Dimethoxytritylethers wird durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht.
Die Benzyl-Hydroxylgruppe wird dann z. B. mit 2-Cyanethyldiisopropylchlorphosphoramidit
zur Reaktion gebracht, um Linker
23 der Formel II zu erhalten, wobei R ein (Dialkylamino) ( ω-cyanalkoxy)P-Rest
ist. Andere photospaltbare Linker der Formel III können durch Substituieren von 2-Phenyl-l-propanol oder 2-Phenylmethyl-1-propanol
für die ω-Hydroxyalkyl- oder -alkoxybenzole
in der obigen Synthese hergestellt werden. Diese Verbindungen sind im Handel erhältlich, können aber auch beispielsweise
durch Reaktion von Phenylmagnesiumbromid oder Benzylmagnesiumbromid
mit dem notwendigen Oxiran (d. h. Propylenoxid) in Gegenwart von Kupfer(I)-Ionen als Katalysator hergestellt
werden.
Zum Einbau einer spaltbaren Bindung zwischen der immobilisierten Nucleinsäure und dem festen Träger können die verschiedensten
chemisch spaltbaren Linker verwendet werden. Säureempfindliche Linker sind gegenwärtig bevorzugte chemisch
spaltbare Linker für die Massenspektrometrie, insbesondere die MALDI-TOF MS, da die säureempfindliche Bindung beim Konditionieren
der Nucleinsäure nach Zugabe der 3-HPA-Matrixlösung gespalten wird. Die säureempfindliche Bindung kann als separate
Linkergruppe eingebaut werden, z. B. die säureempfindlichen Tritylgruppen, oder sie kann durch Einbringen einer oder mehrerer
Silyl-Internucleosidbrücken unter Verwendung von Diisopropylsilyl
in einen synthetischen Nucleinsäure-Linker eingebaut werden, wodurch diisopropylsilyl-gebundene Oligonucleotid-Analoge
entstehen. Die Diisopropylsilyl-Brücke ersetzt die Phosphodiester-Bindung in der DNA-Hauptkette und führt unter
schwach sauren Bedingungen, wie z. B. 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/l% TFA-MALDI-TOF-Matrixlösung, zum Einbau eines
oder mehrerer Brüche innerhalb eines Strangs im DNA-Molekül. Verfahren zur Herstellung von diisopropylsilylgebundenen
Oligonucleotid-Vorläufern und -Analogen sind dem
-«"DE 197 82 036 Tl
Fachmann bekannt (siehe ζ. B. Saha et al. (1993) J. Orq. Chem.
58: 7827-7831). Diese Oligonucleotid-Analogen können leicht mit Hilfe von Festphasen-Oligonucleotid-Syntheseverfahren unter
Verwendung von diisopropylsilyl-derivatisierten Desoxyribonucleosiden hergestellt werden.
In bestimmten Ausführungsformen können Nucleinsäuren verwendet werden, die in anderen Positionen als dem 3'- oder
5'-Ende modifiziert sind. Die Modifikation der Zuckerkomponente
eines Nucleotids in anderen Positionen als der 3'- und 5'-Position
ist durch herkömmliche Verfahren möglich. Außerdem können Nucleinsäurebasen z. B. durch Modifikation von C-5 von
dT mit einem Linker-Arm modifiziert werden, wie z. B. in F.
Eckstein, Hrsg., "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", IRL Press (1991) beschrieben wird. Ein solcher Linker-Arm
kann so modifiziert werden, daß er eine Thiolkomponente aufweist. Alternativ können Nucleinsäuren mit modifizierter
Hauptkette (z. B. Phosphoramidat-DNA) verwendet werden, so daß die Thiolgruppe an das StickstoffZentrum angelagert werden
kann, das durch die modifizierte Phosphat-Hauptkette bereitgestellt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen beeinträchtigt die Modifikation
einer Nucleinsäure, wie z. B. die oben beschriebene, nicht wesentlich die Fähigkeit der Nucleinsäure oder Nucleinsäuresequenz
zum Hybridisieren an ihr Komplement. Folglich sollte jede Modifikation vorzugsweise eine wesentliche
Modifikation der für die Watson-Crick-Basenpaarung verantwortlichen
Funktionalitäten der Nucleinsäure vermeiden. Die Nucleinsäure kann so modifiziert werden, daß eine nicht terminale
Thiolgruppe vorhanden ist, und die auf dem Träger immobilisierte Nucleinsäure ist zu einer selbstkomplementären Basenpaarung
fähig, um eine "Haarnadel"-Struktur mit einem Doppelstrangbereich zu bilden.
Beispiele unlöslicher Träger und Substrate zur Verwendung hierin schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Kü-
DE 197 82 086 Tl
gelchen ("Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Magnetkügelchen,
Sephadex-Sepharose-Kügelchen, Cellulosekügelchen usw.), Kapillaren, ebene Träger, wie z. B. Glasfaserfilter,
Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, AIuminium,
Silicium und Kupfer), Kunststoffmaterialien einschließlich Mehrkavitätenplatten oder Membranen (z. B. Polyethylen,
Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Wafer, Kämme, Stifte (z. B. Stiftanordnungen, die sich zur kombinatorischen
Synthese oder Analyse eignen) oder Kügelchen in Vertiefungen (Grübchen) von ebenen Oberflächen, wie z. B. von
Wafern (z. B. Silicium-Wafern), mit oder ohne Filterplatten.
Nach dem Immobilisieren können die Nucleinsäuren durch irgendeines der verschiedensten Mittel analysiert werden, zu
denen beispielsweise spektrometrische Verfahren gehören, wie z. B. Spektroskopie im ÜV-/sichtbaren Bereich, IR-, Fluoreszenz-,
Chemolumineszenz- oder NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie oder andere, dem Fachmann bekannte Verfahren oder
Kombinationen davon. Zu bevorzugten Massenspektrometerformaten gehören die Ionisationsverfahren (I-Verfahren), wie z. B. matrixunterstützte
Laserdesorption MALDI), kontinuierliche oder Impuls-Elektronensprühverfahren (ESI) und verwandte Verfahren
(z. B. Ionensprüh- oder Thermosprühverfahren) oder Massivcluster-Stoßverfahren
(MCI); diese Ionenquellen können an Nachweisformate angepaßt werden, zu denen das Linear- oder Reflektron-Laufzeitverfahren
(TOF), Einzel- oder Mehrfachquadrupel-Verfahren, Einzel- oder Mehrfach-Magnetsektorverfahren, Fouriertransformations-Ionencyclotronresonanz
(FTICR), Ionenfallen und Kombinationen daraus gehören, die einen Hybrid-Detektor
ergeben (z. B. Ionenfalle/Laufzeit). Zur Ionisation können
zahlreiche Matrix/Wellenlängen-Kombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen
(ESI) verwendet werden.
-51- DE 197 82 036 Tl
Hierin werden Verfahren und Systeme zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen zur Analyse durch ein Diagnosegerät
bereitgestellt. Zum Beispiel zeigt Fig. 1 ein System zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen zur Analyse durch ein
Diagnosegerät. In Fig. 1 ist ein System 10 abgebildet, das einen Datenprozessor 12, eine Bewegungssteuereinrichtung 14, eine
Roboterarmeinheit 16, ein Monitorelement 18A, eine zentrale Verarbeitungseinheit 18B, eine Mikrotiterplatte mit Quellenmaterial
20, ein Objektträgergehäuse 22, einen Roboterarm 24, einen Objektträger 26, eine Drucksteuereinrichtung 28, eine
Rohrleitung 30, eine Montageeinheit 32, eine Stifteinheit 38 und Substratelemente 34 aufweist. In der in Fig. 1 gezeigten
Ansicht ist außerdem dargestellt, daß die Robotereinheit 16 ein bewegliches Trägerelement 40 und eine horizontale Gleitnut
42 aufweisen kann. Der Roboterarm 24 kann wahlweise um einen Zapfen 36 schwenkbar sein, um den Bewegungsbereich des Arms 24
zu vergrößern, so daß der Arm 24 die Stifteinheit 38 oberhalb der Quellenplatte 20 anordnen kann.
Der in Fig. 1 abgebildete Datenprozessor 12 kann ein herkömmliches digitales Datenverarbeitungssystem sein, wie z.
B. ein IBM-PC-kompatibles Computersystem, das sich zur Verarbeitung von Daten und zur Ausführung von Programmanweisungen
eignet, die Informationen für die Steuerung der Bewegung und des Betriebs der Robotereinheit 16 bereitstellen. Für den
Fachmann wird offensichtlich sein, daß die Datenprozessoreinheit 12 ein System von beliebigem Typ sein kann, das sich zur
Ausführung eines Programms von Anweisungssignalen eignet, welche die in das Robotergehäuse 16 integrierte Robotereinheit
betätigen. Wahlweise kann der Datenprozessor 12 eine mikrogesteuerte Einheit sein, die in das Robotergehäuse 16 integriert
ist. In weiteren alternativen Ausführungsformen braucht das System 10 nicht programmierbar zu sein und kann ein Einkartenrechner
mit einem Firmware-Speicher zum Abspeichern von Anweisungen für die Betätigung der Robotereinheit 16 sein.
In der in Fig. 1 dargestellten Ausführungsform gibt es
eine Steuereinrichtung 14, die elektronisch zwischen den Datenprozessor 12 und die Robotereinheit 16 gekoppelt ist. Die
DE 137 82 0S6T1
abgebildete Steuereinrichtung 14 ist eine Bewegungssteuereinrichtung,
welche die Motorelemente der Robotereinheit 16 zur Positionierung des Roboterarms 24 in einer ausgewählten Position
steuert. Außerdem kann die Steuereinrichtung 14 Anweisungen an die Robotereinheit 16 übermitteln, um die Drucksteuereinheit
28 anzuweisen, das aus den einzelnen Stiftelementen der abgebildeten Stifteinheit 38 ausgestoßene Fluidvolumen zu
steuern. Der Entwurf und die Konstruktion der abgebildeten Bewegungssteuereinrichtung
14 folgen aus Prinzipien, die in der Elektrotechnik bekannt sind, und es kann jedes für die Steuerung
der Robotereinheit 16 geeignete Steuerungselement in die Praxis umgesetzt werden, ohne von Schutzumfang der Erfindung
abzuweichen.
Die in Fig. 1 abgebildete Robotereinheit 16 ist mit der Steuereinrichtung 14 elektronisch gekoppelt. Die abgebildete
Robotereinheit 16 ist ein Gerüst- bzw. Portalsystem, das einen XY-Tisch zum Bewegen des Roboterarms über eine XY-Ebene aufweist
und das ferner einen Z-Achsen-Stellantrieb zum Bewegen des Roboterarms senkrecht zu dieser XY-Ebene aufweist. Die in
Fig. 1 abgebildete Robotereinheit 16 weist einen Arm 24 auf. der an dem XY-Tisch angebracht ist, welcher den Arm innerhalb
einer Ebene bewegt, die durch die XY-Achsen definiert ist. In der abgebildeten Ausführungsform ist der XY-Tisch am Z-Stellantrieb
montiert, um den gesamten Tisch entlang der Z-Achse senkrecht zur XY-Ebene zu bewegen. Auf diese Weise bietet die
Robotereinheit drei Freiheitsgrade, wodurch die Stifteinheit 38 in jeder beliebigen Position oberhalb der Substrate 34 und
der Quellenplatte 20 angeordnet werden kann, die in Fig. 1 auf dem Objektträger 26 aufsitzend dargestellt sind, der an der
Robotereinheit 16 montiert ist.
Die abgebildete Robotereinheit 16 ergibt sich aus Prinzipien, die in der Elektrotechnik bekannt sind, und ist nur
ein Beispiel einer Robotereinheit, die sich zum Bewegen einer Stifteinheit in Positionen eignet, die einem Substrat und einer
Quellenplatte benachbart sind, wie z. B. dem abgebildeten Substrat 34. Dementsprechend wird für den Fachmann offensichtlich
sein, daß nach den hier gegebenen Beschreibungen alterna-
- DE 197 82 086 T1
tive Robotefsysteme in die Praxis umgesetzt werden können, ohne
vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
In Fig. 1 ist eine Ausführungsform einer Robotereinheit
16 abgebildet, die eine Drucksteuereinheit 28 aufweist, die über eine Rohrleitung 30 an die Halterung 32 angeschlossen
ist, die mit der Stifteinheit 38 verbunden ist. In dieser Ausführungsform weist die Halterung 32 einen inneren Kanal zur
Fluidkopplung der Rohrleitung 30 mit der Stifteinheit 38 auf. Dementsprechend stellt die Rohrleitung 30 eine Fluidverbindung
zwischen der Drucksteuereinrichtung 28 und der Halterung 32 der Stifteinheit 38 her. Auf diese Weise kann die Steuereinrichtung
14 Signale an die Drucksteuereinrichtng 28 senden, um einen an die Stifteinheit 38 angelegten Fluiddruck selektiv zu
steuern.
In Fig. 2 ist eine Ausführungsform einer Stifteinheit 50 abgebildet, die sich für die praktische Ausführung zusammen
mit dem in Fig. 1 abgebildeten System eignet, das die Drucksteuereinrichtung 28 aufweist. In der dargestellten Ausführungsform
weist die Stifteinheit 50 ein Gehäuse auf, das aus einem oberen Abschnitt 52 und einem unteren Abschnitt 54 geformt
ist, die durch die Schrauben 56A und 56B miteinander verbunden sind, um ein inneres Kammervolumen 58 abzugrenzen.
Ferner ist in Fig. 2 dargestellt, daß das Gehäuse zur Fluidabdichtung des inneren Kamme rvol urne ns 58 ein in Fig. 2 dargestelltes
Dichtungselement aufweisen kann,- wie z. B. eine O-Ring-Dichtung
60, die zwischen dem oberen Block und dem unteren Block 54 sitzt und den Umfang des inneren Kammervolumens
58 vollständig umgibt. In Fig. 2 ist ferner dargestellt, daß die Stifteinheit 50 mehrere Vesikeln bzw. Bläschen 62A-62D
aufweist, deren jede eine durchgehende Axialbohrung aufweist, um die abgebildeten Aufnahmekammern 64A-64D zu bilden. Jede
der abgebildeten Vesikeln erstreckt sich durch eine entsprechende Öffnung 68A-68D hindurch, die im unteren Block 54 des
Gehäuses angeordnet ist.
Wie ferner in der abgebildeten Ausführungsform dargestellt, weist jede der Vesikeln 62A-62D einen oberen Flanschabschnitt
auf, der an einem Dichtungselement 70A-70D anliegt, um eine fluiddichte Abdichtung zwischen der Vesikel und dem
DE 197 82 086 T1
unteren Block 54 zu bilden und den Durchgang von Fluid durch die Öffnungen 68A-68D zu verhindern. Um die Dichtung dicht zu
halten, weist die abgebildete Stifteinheit 50 ferner einen Satz von Vorspannelementen 74A-74D auf, die in Fig. 2 als Fedem
abgebildet sind, die sich in den dargestellten Ausführungsformen im zusammengedrückten Zustand befinden, um das
Flanschelement der Vesikeln 62A-62D an ihre entsprechenden Dichtungselemente 70A-70D anzudrücken. Wie in Fig. 2 darge-.
stellt, erstrecken sich die Vorspannelemente 74A-74D zwischen den Vesikeln und dem oberen Block 52. Jede der Federn 74A-74D
kann fest in einer Montageunterlage 76A-75D montiert werden,
wobei die Federelemente an dem oberen Block 52 befestigt sein können. Der obere Block 52 weist ferner eine in Fig. 2 abgebildete
Öffnung 78 als zentral angeordnete Öffnung auf, die eine Gewindebohrung zur Aufnahme einer Durchführungsschraube
(Swagelok) 80 aufweist, die innerhalb der Öffnung 78 drehbar montiert werden kann.
Wie ferner in Fig. 2 dargestellt, ist die Durchführungsschraube 8 0 durch eine Rohrleitung an einem Ventil 82 befestigt,
das die Durchführungsschraube 80 mit einer Rohrleitung 84 verbinden kann, die sich mit einer Druckquelle koppeln
läßt oder alternativ die Durchführungsschraube 80 mit einer Rohrleitung 8 6 verbinden kann, die für die Belüftung der inneren
Kammer 58 sorgt. Eine zentrale Bohrung 88 erstreckt sich durch die Durchführungsschraube 80 hindurch und ist mit dem
Rohrleitungselement verbunden, das weiter mit dem Ventil 82 verbunden ist, um dadurch eine selektive Fluidverbindung zwischen dem inneren Kammervolumen 58 und entweder einer Druckquelle
oder einem Belüftungsauslaß herzustellen.
Die oben beschriebene und in Fig. 2 abgebildete Stifteinheit 50 ist über einem Substratelement 90 angeordnet,
das mehrere Vertiefungen bzw. Kavitäten 92 aufweist, die in die obere Fläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie durch
Fig. 2 dargestellt, ist der Abstand der Vesikeln 62A-62D so gewählt, daß jede Vesikel von den benachbarten Vesikeln um eine
Distanz beabstandet ist, die ein ganzzahliges Vielfaches des Teilungsabstandes zwischen den Kavitäten 92 ist, die in
die obere Fläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie man aus
der folgenden Beschreibung erkennen wird, erleichtert dieser
Abstand die parallele Abgabe von Fluid, so daß Fluid in einer einzigen Operation in mehrere Kavitäten abgegeben werden kann.
Jede der Vesikeln kann aus rostfreiem Stahl, Siliciumdioxid, polymerem Material oder irgendeinem anderen, für die Aufnahme
einer Fluidprobe geeigneten Material bestehen. In einem Beispiel werden in der Einheit 16 Vesikeln verwendet, die aus gehärtetem,
goldplattiertem Berylliumkupfer über Nickelblech bestehen. Sie sind 43,2 mm lang, und der Schaft der Vesikel ist
auf einen Außendurchmesser von 0,46 mm mit einer konkaven Spitze abgestuft. Ein solcher Stift wurde gewählt, da die
Zielgenauigkeit etwa 501 μπι betragen kann. Es wird jedoch offensichtlich
sein, daß jede geeignete Stiftausführung für das Gerät verwendet werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt
auf flache, sternförmige, konkave, spitz massive, spitz halbhohle, auf einer oder beiden Seiten winklige oder
andere derartige Geometrien.
Fig. 3 zeigt aus einer seitlichen Perspektive den unteren Block 54 der in Fig. 2 abgebildeten Stifteinheit 50. Fig.
3 zeigt angenäherte Abmessungen für eine Stifteinheit. Gemäß der Darstellung weist der untere Block 54 eine Bodenplatte 98
und eine umgebende Schulter 100 auf. Die Bodenplatte 98 hat eine Dicke von etwa 3 mm, und die Schulter 100 ist. etwa 5 mm
dick.
Fig. 4 zeigt, von oben gesehen, die allgemeine Konstruktion und die Abmessungen für einen unteren Block 54, der
sich zur Verwendung mit der in Fig. 2 dargestellten Stifteinheit 50 eignet. Wie in Fig. 4 dargestellt, weist der untere
Block 54 eine 4 χ 4-Matrix von Öffnungen 68 auf, um·16 Öffnungen
bereitzustellen, die jeweils zur Aufnahme einer Vesikel geeignet sind. Wie oben unter Bezugnahme auf Fig. 2 beschrieben,
ist der Abstand zwischen den Öffnungen 68 typischerweise ein ganzzahliges Vielfaches des Abstandes zwischen Kavitäten
auf einer Substratoberfläche sowie zwischen den Kavitäten einer Quellenplatte. Dementsprechend kann eine Stifteinheit mit
dem unteren Block 54, wie in Fig. 4 abgebildet, Fluid in bis zu 16 Kavitäten gleichzeitig abgeben. Fig. 4 zeigt außerdem
allgemeine Abmessungen eines unteren Blocks 54, der so be-
DE 197 82 036 T1
schaffen "ist, daß jede Seite des Blocks 54 im allgemeinen 22 mm lang ist und der Abstand zwischen den Öffnungen 68 annähernd
4,5 mm beträgt. Ein solcher Abstand eignet sich zur Verwendung bei einem Substrat, wo Fluid in Positionen abzugeben
ist, die etwa 500 μΐη voneinander entfernt sind, wie durch das
Substrat 90 von Fig. 2 veranschaulicht. Fig. 4 zeigt außerdem, daß der untere Block 54 eine optionale O-Ring-Nut 94 aufweisen
kann, die für die Aufnahme eines O-Ring-Dichtungselements angepaßt
ist, wie z. B. des in Fig. 2 abgebildeten Dichtungselements 60. Es versteht sich, daß ein solches Nutenelement 94
die durch das Dichtungselement 60 gebildete Fluiddichtung verstärken und verbessern kann.
Der Stiftblock kann aus rostfreiem Stahl hergestellt werden, da dieses Material mit einer Genauigkeit von etwa +25
pm gebohrt werden kann; es können aber auch die verschiedensten
Sondenmaterialien verwendet werden, wie ζ: B. GlO-Laminat,
Polymethylmethacrylat (PMMA) oder ein anderes geeignetes Material. Der Stiftblock kann jede beliebige Anzahl von
Öffnungen enthalten und ist mit 16 Aufnahmeöffnungen dargestellt, die 16 Stifte in Position halten. Zum Erhöhen der
Zielgenauigkeit jedes Stifts kann unterhalb des Blocks ein wahlfreier Ausrichtungsplatz angeordnet werden, so daß etwa 6
mm der Stiftspitze frei bleiben, um das Eintauchen in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte zu ermöglichen. Die Anordnung
der Sonden in dem abgebildeten Werkzeug ist so ausgelegt, daß sie mit einer Mikrotiterplatte mit 384 Kavitäten koordiniert
ist, so daß der Mittenabstand der Sonden 4,5 mm beträgt. Eine Anordnung von 4x4 Sonden wurde gewählt, da sie eine Anordnung
erzeugt, die in weniger als einen Quadratzoll paßt, der den Bewegungsbereich eines XY-Tisches eines vom Zessionar verwendeten
MALDI-TOF-Massenspektrometers bildet. Die Stiftwerkzeugeinheit wird durch einen Deckel aus rostfreiem Stahl an
der Oberseite des Geräts vervollständigt, die dann am Z-Arm des Roboters angebracht wird.
Wie aus Fig. 5 erkennbar, verwendet die Robotereinheit 16 eine Stiftwerkzeugeinheit 38, die ähnlich wie die in Fig. 2
abgebildete Stiftwerkzeugeinheit 50 konfiguriert ist. Die Drucksteuereinrichtung 28 steuert selektiv den Druck innerhalb
-57~ DE 197 82 0S6 T1
der Kamme"r 58. Bei dieser Ausführungsform läuft im Datenpro-"
zessor 12 ein Steuerprogramm, um die Robotereinheit 16 so zu steuern, daß die Einheit 16 eine Elementanordnung auf die Substrate
34 aufdruckt.
In einem ersten Schritt, Fig. 5A, kann das Programm die Robotereinheit 16 anweisen, die Stifteinheit 38 so zu verschieben,
daß sie oberhalb der Quellenplatte 20 angeordnet ist. Die Robotereinheit 16 taucht dann die Stifteinheit in die
Quellenplatte 20 ein, die eine DNA-Quellenplatte mit 384 Kavitäten sein kann. Wie in Fig. 4 dargestellt, kann die Stifteinheit
16 verschiedene Stifte aufweisen, so daß die Stifteinheit 50 16 Stifte in 16 verschiedene Kavitäten der DNA-Quellenplatte
20 mit 384 Kavitäten eintaucht. Als nächstes weist der Datenprozessor 12 die Bewegungssteuereinrichtung 14
an, die Robotereinheit 16 so zu betätigen, daß die Stifteinheit in eine Position über der Oberfläche des Substrats 34 bewegt
wird. Das Substrat 34 kann irgendein Substrat sein, das für die Aufnahme einer Materialprobe geeignet ist, und kann
aus Silici-um, Kunststoff, Metall oder irgendeinem anderen geeigneten
Material dieser Art bestehen. Wahlweise weist das Substrat eine ebene Oberfläche auf, kann aber alternativ eine
mit Grübchen versehene Oberfläche, eine Oberfläche mit eingeätzten Kavitäten oder irgendeine andere geeignete Oberflächentopographie
aufweisen. Das im Datenprozessor 12 ablaufende Programm kann dann die Robotereinheit anweisen, über die Bewegungssteuereinrichtung
14 die Drucksteuereinrichtung 28 anzuweisen, innerhalb des inneren Kammervolumens 58 einen Überdruck
zu erzeugen. Bei dieser praktischen Ausführung drückt der innere Überdruck Fluid aus den Aufnahmekammern der Vesikein
62 heraus, um das Fluid, aus den Vesikeln in eine entsprechende Vertiefung 92 des Substrats 90 auszustoßen.
Das im Datenprozessor 12 ablaufende Programm kann auch die Steuereinrichtung 14 anweisen, die Drucksteuereinrichtung
28 so zu steuern, daß sie das Füllen der Aufnahmekammern mit Quellmaterial von der Quellenplatte 20 steuert. Die Drucksteuereinrichtung
28 kann innerhalb des inneren Kammervolumens 58 der Stifteinheit 38 einen Unterdruck erzeugen. Dadurch wird
das Ansaugen von Fluid in die Aufnahmekammern der Vesikeln
"58- DE 19782 036T1
62A-62D veranlaßt. Die Drucksteuereinrichtung 28 kann* den
Druck entweder durch Regelung ohne Rückführung oder durch Regelung mit Rückführung regeln, um ein zu starkes Ansaugen von
Fluid durch die Aufnahme kammern und ein Überlaufen in das innere Kammervolumen 58 zu vermeiden. Regelkreissysteme zur
Druckregelung sind dem Fachmann bekannt, und es kann jeder geeignete Regler verwendet werden. Ein solches Überlaufen könnte
eine Kreuzverunreinigung verursachen, besonders wenn das von der Quellenplatte 20 angesaugte Quellenmaterial von Kavität zu
Kavität variiert.
Bei einer alternativen praktischen Ausführung der Erfindung ist jede der Aufnahmekammern 64A-64D klein genug, um
das Füllen der Kammern durch Kapillarwirkung zu ermöglichen. Bei einer solchen praktischen Ausführung kann die Stifteinheit
aus einer Anordnung von Nadeln mit enger Bohrung bestehen, wie z. B. von Nadeln bzw. Kanülen aus rostfreiem Stahl, die durch
die Öffnungen des unteren Blocks 54 hindurchgehen. Die in Quellenlösungen eingetauchten Nadeln werden durch Kapillarwirkung
gefüllt. Bei einer praktischen Ausführungsform ist die
Länge der Kapillare, die bei Atmosphärendruck zu füllen ist, angenähert durch die folgende Beziehung bestimmt:
H = 2l
PGR
wobei H die Höhe, γ die Oberflächenspannung, P die Dichte der
Lösung, G die Schwerkraft und R den Nadelradius bezeichnen.
Auf diese Weise kann das Volumen des von jeder Vesikel aufgenommenen
Fluids durch Auswahl der Abmessungen der inneren Bohrung gesteuert werden. Es versteht sich, daß Wasser bei Raumtemperatur
eine Länge von 15 cm einer Kapillare mit einem Radius von 100 ym füllt. Auf diese Weise wird sich eine Nadel
mit Nanolitervolumen und kurzer Bohrung bis zur vollen Kapazität füllen, dürfte aber nicht überlaufen, da es sich versteht,
daß die Kapillarkraft zu gering ist, um am oberen Ende der Nadelöffnung einen Meniskus zu bilden. Dadurch wird eine Kreuzverunreinigung
infolge Überlaufen verhindert. In einer Ausführungsform können die Vesikeln der Stifteinheit mit inneren
Kammern von" verschiedener Größe versehen werden, um verschiedene
Fluidvolumina aufzunehmen und abzugeben.
Bei einer alternativen praktischen Ausführung kann zur Verringerung des Flüssigkeitsvolumens, das in die Aufnahmekammern
der Vesikeln angesaugt wird, durch die Drucksteuereinrichtung 28 ein geringer Überdruck im inneren Kammervolumen 58
angelegt werden. Die durch den Überdruck erzeugte, abwärtsgerichtete Kraft kann dazu dienen, der aufwärtsgerichteten Kapillarkraft
entgegenzuwirken. Auf diese Weise kann das Fluidvolumen gesteuert werden, das durch Kapillarkraft in die Aufnahmekammern
der Vesikeln angesaugt wird.
Fig. 5B zeigt, daß Fluid innerhalb der Aufnahmekammern
der Nadel durch einen geringen Überdruck abgegeben werden kann, der durch die zentrale Bohrung 88 angelegt wird, die
durch eine Durchführungsschraube (Swagelok) 80 hindurchgeht. Durch Regulieren des Druckimpulses, der dem inneren Kammervolumen
58 zugeführt wird, kann Fluid entweder als Sprühnebel oder durch Tröpfchenbildung an der Nadelspitze ausgestoßen
werden. Es versteht sich, daß die Abgabegeschwindigkeit bei Tröpfchen im Vergleich zu Sprühnebel teilweise von dem Druck
abhängt, der durch die Drucksteuereinrichtung 28 angelegt wird. Bei einer praktischen Ausführungsform wird ein Druck im
Bereich von 10 bis 1000 Torr (Ü) angelegt.
Zu diesem Zweck kann der Datenprozessor 12 ein Computerprogramm
ausführen, welches das Volumen des abgegebenen Fluids steuert und reguliert. Das Programm kann die Steuereinrichtung
28 anweisen, ein definiertes Fluidvolumen auszustoßen, entweder durch Erzeugen eines Sprühnebels oder durch Ausbildung
eines Tröpfchens, das am Ende der Vesikel sitzt und mit der Substratoberflache in Kontakt gebracht werden kann, um
das Fluid an diese abzugeben.
Die Figuren 5C und 5D zeigen, daß die in den Figuren 5A-5B dargestellten früheren Schritte nochmals ausgeführt werden
können, diesmal in einer Position auf der Substratoberfläehe,
die gegenüber der früheren Position versetzt ist. Bei dem abgebildeten Verfahren wird das Stiftwerkzeug um eine Distanz
versetzt, die gleich dem Abstand zwischen zwei Kavitäten 92
DE 197 η 096 Tl
ist. Offensichtlich können andere Offsetdruckverfahren angewandt
werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Man wird erkennen, daß mit der in Fig. 2 abgebildeten
Stifteinheit verschiedene Vorteile erzielt werden. Zum Beispiel ist das Spülen zwischen Abgabevorgängen einfach und erfordert
nur einmalige oder mehrmalige Füll- und Entleerungsvorgänge mit einer Spüllösung. Da außerdem alle Aufnahmekammern
bis zum vollen Fassungsvermögen gefüllt werden, variiert die Genauigkeit der abgegebenen Volumina nur entsprechend den
Innenabmessungen der Nadeln, die bei der Stiftherstellung sorgfältig kontrolliert werden können. Ferner ist das Gerät
kosteneffektiv, wobei die größten Kosten auf die Nadeln entfallen;
da jedoch kein Kontakt mit einer Oberfläche erforderlich ist, sind die Nadeln einer geringen mechanischen Deformation
oder Beanspruchung ausgesetzt, wodurch ein seltenes Auswechseln und eine lange Lebensdauer gewährleistet sind.
Als Alternative kann das Aufbringen von Probenmaterial auf die Substratoberfläche Verfahren einschließen, bei denen
Stiftwerkzeugeinheiten verwendet werden, die von einem Block ausgehende massive Stiftelemente aufweisen, wobei eine Robotereinheit
die massiven Stiftelemente der Stifteinheit in eine Probenmaterialquelle taucht, um die distalen Enden der Stifte
mit den Probenmaterialien zu benetzen. Anschließend kann die Robotereinheit die Stifteinheit zu einer Position oberhalb des
Substrats bewegen und dann die Stifteinheit auf die Substratoberfläche absenken, um die einzelnen benetzten Stifte mit der
Oberfläche in Kontakt zu bringen und Material auf die Substratoberfläche aufzutupfen.
In den Figuren 6A und 6B ist eine weiteres alternatives
System zur Abgabe von Material auf oder an die Oberfläche des Substrats abgebildet. Im einzelnen zeigt Fig. 6A eine Strahldruckvorrichtung
110, die ein Kapillarelement 112, ein Wandlerelement 114 und eine Öffnung (nicht dargestellt) 118, eine
Fluidrohrleitung 122 und eine Halterung 124 aufweist, die mit einer Roboterarmeinheit verbunden ist, wie z. B. dem in Fig. 1
abgebildeten Roboterarm 24. Wie weiter in Fig. 6A dargestellt, eignet sich die Strahleinheit 110 zum Ausstoßen einer Reihe
von Tröpfchen 120 eines Probenmaterials aus der Öffnung 118, um Probenmaterial auf die Oberfläche 128 abzugeben.
Die Kapillare 112 der Strahleinheit 110 kann eine Glaskapillare, eine Kunststoffkapillare oder irgendeine andere geeignete
Aufnahmeeinrichtung sein, die eine Fluidprobe befördern kann und das Ausstoßen der Fluidprobe durch die Wirkung
eines Wandlerelements ermöglicht, wie z. B. des Wandlerelements 114. Das in Fig. 6A abgebildete Wandlerelement 114 ist
ein piezoelektrisches Wandlerelement, das rund um den äußeren Umfang der Kapillare 112 ausgebildet ist und einen elektrischen
Impuls, den es von dem Impulsgenerator innerhalb einer Robotereinheit 16 empfängt, umwandeln kann, um das Ausstoßen
von Fluid aus der Öffnung 118 der Kapillare 112 zu bewirken. Eine solche Strahleinheit mit einem piezoelektrischen Wandlerelement
wird von MicroFab Technology, Inc., Deutschland, hergestellt. Hierin kann jedoch jede Strahleinheit verwendet
werden, die sich zur Abgabe definierter und kontrollierter Fluidvolumina eignet, einschließlich derjenigen, die piezoelektrische
Wandler, elektrische Wandler, elektrostriktive Wandler, magnetostriktive Wandler, elektromechanische Wandler
oder irgendein anderes geeignetes Wandlerelement verwenden. In der abgebildeten Ausführungsform weist die Kapillare 112 eine
Fluidröhre 122 zur Aufnahme von Fluidmaterial auf. In einer wahlfreien Ausführungsform kann Fluid durch die Wirkung eines
Unterdrucks in die Kapillare angesaugt werden, der Fluid durch die Öffnung 118 ansaugt, wenn die Öffnung 118 in eine Fluidmaterialquelle
eingetaucht wird. Bei der Erfindung können andere Ausführungsformen der Strahleinheit 110 in die Praxis umgesetzt
werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Fig. 6B veranschaulicht eine weitere alternative Einheit, die sich zum Transport auf dem Roboterarm einer Robotereinheit
eignet, wie z. B. der in Fig. 1 abgebildeten Einheit 16. Fig. 6B zeigt vier miteinander verbundene Strahleinheiten
130A-130D. Ähnlich der Stifteinheit in Fig. 2 kann die in Fig. 6B abgebildete Strahleinheit zur parallelen Abgabe von
Fluidmaterial verwendet werden. Für den Durchschnittsfachmann der Elektrotechnik wird offensichtlich sein, daß jede der
Strahleinheiten 130A-130D unabhängig von den anderen betrieben
DE IS? 82 096T1
werden kann, um die selektive Abgabe von Fluid aus ausgewählten
Strahleinheiten zu ermöglichen. Außerdem kann jede der Strahleinheiten 130A-130D unabhängig gesteuert werden, um das
Fluidvolumen zu wählen, das aus der jeweiligen Einheit 130A-130D abgegeben wird. Weitere Modifikationen und Änderungen
können an der in Fig. 6B abgebildeten Einheit vorgenommen werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Verfahren zur Schnellanalyse von Probenmaterialien werden gleichfalls bereitgestellt. Zu diesem Zweck können auf einer
Substratoberfläche nach irgendeinem der oben beschriebenen
Verfahren Probenanordnungen ausgebildet werden. Die Probenanordnungen werden dann durch Massenspektrometrie analysiert, um
spektrale Daten zu sammeln, die repräsentativ für die Zusammensetzung der Proben in der Anordnung sind. Es versteht sich,
daß die obigen Verfahren Prozesse liefern, die eine schnelle Abgabe definierter und gesteuerter Volumina des Analytenmaterials
ermöglichen. Insbesondere gestatten diese Prozesse die Abgabe von Fluidvolumina im Subnanoliter- bis zum unteren
Nanoliterbereich. Diese Aufbringungsverfahren für kleine VoIumina
erzeugen Probenanordnungen, die sich gut für die Analyse durch Massenspektrometrie eignen. Zum Beispiel liefern die
kleinen Volumina Reproduzierbarkeit der Fleck- bzw. Spot-Eigenschaften, wie z. B. der Verdampfungsgeschwindigkeiten,
und eine geringere Abhängigkeit von atmosphärischen Bedingungen, wie z. B. der Umgebungstemperatur und dem Licht.
Um mit dem in Fig. 5 dargestellten Beispiel fortzufahren, die Anordnungen können durch Einfüllen von Oligonucleotiden
(0,1-50 ng/μΐ) verschiedener Sequenzen oder Konzentrationen
in die Kavitäten einer Quellen-Mikrotiterplatte 20 mit 96 Kavitäten hergestellt werden; die erste Kavität kann für die
Aufnahme einer Matrixlösung reserviert werden. Ein Substrat 34, wie z. B. ein mit Grübchen versehenes Siliciumchip-Substrat,
kann auf den Objektträger 26 der Robotereinheit 16 aufgelegt und von Hand so ausgerichet werden, daß die Matrix der
Kavitäten um einen Satz von Bezugsachsen herum orientiert ist. Das im Datenprozessor 12 ablaufende Steuerprogramm kann die
Koordinaten der ersten Kavität der Quellenplatte 20 empfangen. Der Roboterarm 12 kann die Stifteinheit 38 in die Quellenplat-
-63DE 19782 0S6 T1
te 20 eintauchen, so daß jeder der 16 Stifte in eine der Kavitäten
eingetaucht wird. Jede Vesikel kann sich durch Kapillarwirkung so füllen, daß das volle Volumen der Aufnahmekammer
Fluid enthält. Wahlweise kann das im Datenprozessor 12 ablaufende Programm die Drucksteuereinrichtung anweisen, die innere
Kammer 58 der Stifteinheit 38 mit einem Vorspannungs-Überdruck zu füllen, der teilweise der Kapillarkraft entgegenwirkt, um
das in die Aufnahmekammer angesaugt Fluidvolumen zu begrenzen
oder zu verringern.
Wahlweise kann die Stifteinheit 38 in die gleichen 16 Kavitäten der Quellenplatte 20 eingetaucht und auf ein zweites
Zielsubstrat aufgetupft werden. Dieser Zyklus kann auf so vielen Zielsubstraten wie gewünscht wiederholt werden. Als nächstes
kann der Roboterarm 12 die Stifteinheit 38 in eine Waschlösung und danach in 16 andere Kavitäten der Quellenplatte
20 eintauchen und um eine Distanz gegen den anfänglichen Satz von 16 Punkten versetzt auf das Zielsubstrat auftupfen.
Dies kann wiederum für so viele Zielsubstrate wie gewünscht wiederholt werden. Der gesamte Zyklus kann wiederholt werden,
um von jeder Vesikel eine 2 χ 2-Anordnung herzustellen und eine Anordnung (bzw. Matrix) von 8x8 Punkten zu erzeugen (2 χ
2 Elemente/Vesikel χ 16 Vesikeln = insgesamt 64 aufgetupfte Elemente). Für den Durchschnittsfachmann wird jedoch offensichtlich
sein, daß bei der vorliegenden Erfindung irgendein geeignetes Verfahren zur Ausbildung von Anordnungen ausgeführt
werden kann, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Oligonucleotide verschiedener Sequenzen oder Konzentrationen können in die Kavitäten von bis zu 3 verschiedenen
Quellen-Mikrotiterplatten mit 384 Kavitäten eingefüllt werden; ein Satz von 16 Kavitäten kann für eine Matrixlösung reserviert
werden. Die Kavitäten von zwei Platten werden mit Waschlösung gefüllt. Auf den Tisch bzw. Objektträger der Robotereinheit
16 können 5 Mikrotiterplatten geladen werden. Mehrere Zielsubstrate können angrenzend an einen wahlfreien Satz
von Anschlag- oder Paßstiften aufgelegt werden, die auf dem Objektträger 26 angeordnet und zum Ausrichten der Zielsubstrate
entlang einem Satz von Bezugsachsen vorgesehen sind. Wenn die Matrix und das Oligonucleotid nicht vorgemischt sind, kann
die Stift'eihheit verwendet werden, um zuerst Matrixlösung auf alle gewünschten Zielsubstrate aufzutupfen. In einem anschließenden
Schritt kann die Oligonucleotidlösung in das gleiche Muster wie das Matrixmaterial getupft werden, um die Matrix
wiederaufzulösen. Als Alternative kann eine Probenanordnung
hergestellt werden, indem zunächst die Oligonucleotidlösung auf den Wafer aufgebracht wird, gefolgt von der Matrixlösung,
oder indem die Matrix- und die Oligonucleotidlösungen vorher . vermischt werden.
Nach dem Aufbringen der Probenanordnungen auf die Oberfläche des Substrats können die Anordnungen unter Anwendung
irgendeines der verschiedensten Mittel analysiert werden (z. B. spektrometrische Verfahren, wie z. B. Spektrometrie im UV-/sichtbaren
Bereich, IR-Spektrometrie, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz-,
NMR-Spektrometrie oder Massenspektrometrie). Zum Beispiel können anschließend an das eine oder das andere Abgabeverfahren
mit Proben beladene Substrate auf eine MALDI-TOF-Quellenplatte aufgelegt und dort mit einem Satz abgeschrägter,
mit Schrauben befestigter Polycarbonat-Halterungen festgehalten werden. In einer Ausführungsform kann die Platte dann auf
das Ende einer Sonde übertragen werden, die auf einen XY-Tisch (Newport) mit 1 μπι Auflösung und 1" Bewegungsbereich im Quellenbereich
eines Laufzeit-Massenspektrometers aufgenommen
wird. Für den Durchschnittsfachmann wird offensichtlich sein, daß bei der vorliegenden Erfindung jedes geeignete Massenspektrometriegerät
verwendet werden kann, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Bevorzugte Massenspektrometerformate zur Verwendung bei
den hier beschriebenen Anordnungen sind u. a. Ionisationsverfahren (I), einschließlich, aber nicht beschränkt auf matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI), kontinuierliche oder Impuls-Elektronensprühverfahren
(ESI) und verwandte Verfahren (z. B. Ionensprüh- oder Thermosprühverfahren) oder Massivcluster-Stoßverfahren
(MCI); diese Ionenquellen können an Nachweisformate angepaßt werden, zu denen lineare oder nichtlineare
Reflektron-Laufzeit-(TOF), Einzel- oder Mehrfach-Quadrupel-,
Einzel- oder Mehrfach-Magnetsektorverfahren, Fouriertransformations-Ionencyclotronresonanz
(FTICR), Ionenfallen
-65DE 197 82 0S6 T1
und Kombinationen daraus (z. B. Ionenfalle/Laufzeit) gehören.
Zur Ionisation können zahlreiche Matrix/Wellenlänge-Kombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI)
verwendet werden. Subattomol-Proteinkonzentrationen (atto =
— 18
10 ) sind z. B. unter Anwendung von ESI (Valaskovic, G. A.
10 ) sind z. B. unter Anwendung von ESI (Valaskovic, G. A.
et al. (1996) Science 273: 1199-1202) oder MALDI-Massenspektrometrie
(Li, L. et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 1662-1663) nachgewiesen worden.
Man wird folglich erkennen, daß in hier beschriebenen Verfahren eine völlig kontaktfreie Tröpfchenbildung durch
Hochdrucksprühen oder eine Niederdruck-Tröpfchenbildung mit teilweisem Kontakt verwendet werden kann. Bei der letzteren
tritt der einzige Kontakt zwischen dem Tröpfchen und den Wänden der Kavität oder einer hydrophilen ebenen Oberfläche des
Substrats 34 auf. Bei keiner der beiden Ausführungsformen braucht irgendein Kontakt zwischen der Nadelspitze und der
Oberfläche aufzutreten.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Nucleinsäuremolekül
auf einem Siliciumdioxid-Träger kovalent immobilisiert werden, indem der Träger mit einer Amino-Funktionalität
funktionalisiert wird (z. B. durch Derivatisieren des Trägers mit einem Reagens, wie z. B. 3-Aminopropyltriethoxysilan
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI); siehe Fig.
7). Es können andere funktionalisierte Oxysilane oder Orthosilikate
verwendet werden, die im Handel erhältlich sind (z. B. von Gelest, Inc. Tullytown, PA) . Zum Beispiel kann 3-Mercaptopropyltriethoxysilan
zum Funktionalisieren einer SiIiciumoberflache
mit Thiolgruppen verwendet werden. Das aminofunktionalisierte Siliciumdioxid kann mit einem heterobifunktionellen
Reagens zur Reaktion gebracht werden, wie z. B. mit N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB) (Pierce, Rockford,
IL) . Weitere homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, die verwendet werden können, sind im Handel erhältlich, z. B.
von Pierce. Schließlich wird eine Nucleinsäure, die mit einer Thiolgruppe (z. B. am 5'-Ende) funktionalisiert ist, durch Reaktion
der Thiol-Funktionalität des Nucleinsäuremoleküls mit
der Iodacetyl-Funktionalität des Trägers kovalent an den derivatisierten
Siliciumdioxidträger gebunden.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Nucleinsäure mit dem Vernetzungsmittel zur Reaktion gebracht werden, um ein
Vernetzungsmittel/Nucleinsäure-Konjugat zu bilden, das dann mit einem funktionalisierten Träger zur Reaktion gebracht
wird, um eine immobilisierte Nucleinsäure zu bilden. Als Alternative
kann das Vernetzungsmittel in einer Einstufenreaktion mit der Nucleinsäure und einem funktionalisierten festen
Träger kombiniert werden, um eine im wesentlichen gleichzeitige Umsetzung des Vernetzungsmittels mit der Nucleinsäure und
dem festen Träger zu bewirken. In dieser Ausführungsform wird im allgemeinen die Verwendung eines heterobifunktionellen Vernetzungsmittels
notwendig sein, d. h. eines Vernetzungsmittels mit zwei verschiedenen reaktiven Funktionalitäten, die zur selektiven
Reaktion mit der Nucleinsäure bzw. dem funktionalisierten festen Träger fähig sind.
Die hier bereitgestellten Verfahren sind verwendbar zum Erzeugen von räumlich adressierbaren Anordnungen von Nucleinsäuren,
die auf unlöslichen Trägern immobilisiert sind. Zum Beispiel können die Verfahren angewandt werden, um Anordnungen
verschiedener Nucleinsäuren bereitzustellen, die auf Stifte immobilisiert sind, welche in einer Anordnung bzw. Matrix angeordnet
sind. In einer weiteren Ausführungsform kann eine photospaltbare Schutzgruppe auf dem unlöslichen Träger selektiv
gespalten werden (z. B. durch Photolithographie), um Abschnitte einer Oberfläche bereitzustellen, die für die Immobilisierung
einer Nucleinsäure aktiviert sind. Zum Beispiel kann eine Siliciumoberflache, die durch Behandlung mit 3-Mercaptopropyltriethoxysilan
zur Bildung von Thiolgruppen modifiziert ist, mit einer photospaltbaren Schutzgruppe blockiert werden
(Beispiele photospaltbarer Schutzgruppen siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 92/10092 oder McGray et al. (1989) Ann.
Rev. Biophys. Chem. 18: 239-270) und durch Bestrahlen ausgewählter
Bereiche der Oberfläche, z. B. unter Verwendung einer Photolithographiemaske, selektiv deblockiert werden. Eine
Nucleinsäure, die so modifiziert ist, daß sie eine thiolreaktive Gruppe enthält, kann dann direkt an dem Träger fixiert
werden, öder alternativ kann ein thiolreaktives Vernetzungsmittel
mit dem thiolmodifizierten Träger zur Reaktion gebracht werden, gefolgt von (oder im wesentlichen gleichzeitig mit)
einer Reaktion mit einer Nucleinsäure zur Bildung immobilisierter Nucleinsäuren. Eine Nucleinsäurebase oder -sequenz
kann nach der Immobilisierung auf einem Träger gemäß den hierin beschriebenen Verfahren weiter nach bekannten Verfahren modifiziert
werden. Zum Beispiel kann die Nucleinsäuresequenz durch Ausführen einer Festphasen-Nucleinsäuresynthese nach
herkömmlichen Verfahren einschließlich kombinatorischer Verfahren verlängert werden.
Hierin werden unlösliche Träger bereitgestellt, die Nucleinsäuren aufweisen. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuren
über mindestens ein Schwefelatom kovalent an eine Oberfläche des unlöslichen Trägers gebunden, d. h. die Nucleinsäuren sind
über eine Linker-Komponente, die mindestens ein Schwefelatom aufweist, kovalent an die Oberfläche gebunden. Solche kovalent
gebundenen Nucleinsäuren lassen sich leicht nach den hier beschriebenen Verfahren herstellen. Die unlöslichen Träger können
in den verschiedensten Anwendungen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die mit Hybridisierung und Sequenzierung
verbunden sind. Beispielhafte Anwendungen werden in den Beispielen dargestellt.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die kovalent gebundenen Nucleinsäuren in einer Dichte von mindestens etwa 20
2 2
fmol/mm , stärker bevorzugt von mindestens etwa 75 fmol/mm ,
noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 85 fmol/mm , noch
stärker bevorzugt von mindestens etwa 100 fmol/mm und am
stärksten bevorzugt von mindestens etwa 150 fmol/mm auf der Oberfläche des unlöslichen Trägers vorhanden.
Nach einem anderen Aspekt werden kombinatorische Banken von immobilisierten Nucleinsäuren bereitgestellt, die kovalent
an einen festen Träger gebunden sind, wie oben beschrieben.
Nach einem weiteren Aspekt wird ein Kit für immobilisierte Nucleinsäuren auf einem festen Träger bereitgestellt.
In einer Ausführungsform weist der Kit eine geeignete Menge i) eines thiolreaktiven Vernetzungsmittels und ii) eines oberflächenmodifizierenden
Mittels zur Modifikation einer Oberfläche
-DE 19782 O 9 6 T1
mit einer Funktionalität auf (vorzugsweise einer anderen als der Thiol-Funktionalität), die mit dem thiolreaktiven Vernetzungsmittel
reagieren kann. Der Kit kann wahlweise einen unlöslichen Träger, z. B. eine feste Oberfläche, z. B. magnetisehe
Mikrokügelchen, zur Verwendung bei immobilisierten Nucleinsäuren
aufweisen. Der Kit kann außerdem ein Reagens zur Modifikation einer Nucleinsäure mit einer Thiol-Funktionalität
aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform weist der Kit ein Reagens zur Modifikation der Oberfläche eines Trägers mit einer
Thiolkomponente und ein thiolreaktives Vernetzungsmittel auf, das mit einer Thiolkomponente eines Trägers reagieren kann. In
bestimmten Ausführungsformen weist der Kit außerdem einen unlöslichen Träger auf, z. B. eine feste Oberfläche, beispielsweise
magnetische Mikrokügelchen, zur Verwendung beim Immobilisieren von Nucleinsäuren.
Die hierin beschriebenen Kits können auch wahlweise geeignete Puffer; Behälter zur Aufnahme der Reagenzien und/oder
Gebrauchsanweisungen enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform können die unlöslichen Träger mit kovalent gebundenen Nucleinsäuren, z. B. die
gesamte Oberfläche oder räumlich adressierbare oder voradressierbare Anordnungsformate, in den verschiedensten Festphasen-Nucleinsäurechemie-Anwendungen
verwendet werden, einschließlieh, aber nicht beschränkt auf Nucleinsäuresynthese (chemisch
oder enzymatisch) Hybridisierung und/oder Verlängerung, sowie bei diagnostischen Verfahren, die auf Nucleinsäurenachweis und
Polymorphismus-Analysen basieren (siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5 605 798) . Dementsprechend werden hierin ferner
Verfahren zur Umsetzung von, Nucleinsäuremolekülen bereitgestellt, bei denen die Nucleinsäuremoleküle entweder durch Reaktion
eines thiolhaltigen Derivats des Nucleinsäuremoleküls mit einem unlöslichen Träger, der eine thiolreaktive Gruppe
enthält, oder durch Reaktion eines thiolhaltigen unlöslichen Trägers mit einem Derivat des Nucleinsäuremoleküls, das eine
thiolreaktive Gruppe enthält, auf einer Oberfläche immobilisiert werden und danach die immobilisierten Nucleinsäuremoleküle
weiter umgesetzt werden.
- DE 197 82 086T1
In" einer besonderen Ausführungsform wird die immobilisierte Nucleinsäure weiter umgesetzt, indem sie mit einer Nucleinsäure
hybridisiert wird, die zu der immobilisierten Nucleinsäure oder zu einem Abschnitt davon komplementär ist. In
einer weiteren Ausführungsform wird die immobilisierte Nucleinsäure durch Verlängern einer Nucleinsäure weiter umgesetzt,
die an die immobilisierte Nucleinsäure oder einen Abschnitt davon hybridisiert ist. Verlängerungsreaktionen wie diese können
z. B. bei Verfahren zum Sequenzieren von DNA-Molekülen verwendet werden, die mit Hilfe der hierin beschriebenen Verfahren
an einem unlöslichen Träger immobilisiert sind. Folglich werden hier auch Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines
DNA-Moleküls auf einem Substrat bereitgestellt, bei denen ein thiolhaltiges Derivat des DNA-Moleküls auf der Oberfläche
eines unlöslichen Trägers immobilisiert wird, der thiolreaktive Gruppen enthält, und vor der Ausführung der DNA-Synthese in
Gegenwart eines oder mehrerer Didesoxynucleotide mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert wird, die zu einem
Abschnitt der immobilisierten DNA komplementär ist.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, die lediglich zur näheren
Erläuterung gedacht sind und nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten. Der gesamte Inhalt aller Quellen (einschließlich
Literaturstellen, erteilte Patente, veröffentlichte Patentanmeldungen und gleichzeitig anhängige Patentanmeldungen),
die in der gesamten vorliegenden Anmeldung zitiert werden, wird hiermit ausdrücklich zur Bezugnahme einbezogen.
Fixierung von DNA in hoher Dichte an Silicium-Wafern
30
Alle Reagenzien wurden, wenn nicht anders angegeben, von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI, bezogen.
Vorbereitung der Siliciumoberflache
Silicium-Wafer wurden mit Ethanol gewaschen, über einem
Bunsenbrenner abgeflammt und 3 Stunden in eine wasserfreie Lö-
- DE I97 82Q96T1
sung von "25" Vol.-% 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol eingetaucht.
Dann wurde die Silanlösung entfernt, und die Wafer wurden dreimal mit Toluol und dreimal mit Dimethylsulfoxid
(DMSO) gewaschen. Die Wafer wurden dann in einer wasserfreien 10 mM Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB) (Pierce Chemical, Rockford, IL) in wasserfreiem DMSO inkubiert. Nach der Reaktion wurde die SIAB-Lösung entfernt,
und die Wafer wurden dreimal mit DMSO gewaschen.
Da es unmöglich war, die Kondensation des SIAB und der Aminogruppe auf dem festen Träger des Wafers zu überwachen,
wurde die Reaktion in Lösung ausgeführt, um die optimale Reaktionsdauer zu bestimmen. Durch Anwendung der Dünnschichtchromatographie
(TLC) (Siliciumdioxidplatten mit Glasunterlage mit einem 254 nm-Fluoreszenzindikator) (Baker, Phillipsburg, NJ)
mit Verwendung von Chloroform:Methanol im Verhältnis von 95:5 (Baker, Phillipsburg, NJ) wurde die Trennung der beiden Ausgangsmaterialien
ermöglicht. Das SIAB-Ausgangsmaterial konnte unter langwelligem Ultraviolettlicht (302 nm) sichtbar gemacht
werden; 3-Aminopropyltriethoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv, daher wurde die Platte mit einer Lösung von
Ninhydrin besprüht, das mit primären Aminen reagiert und bei Erhitzen einen purpurfarbenen Fleck erscheinen läßt. Unter
Verwendung eines leichten molaren Überschusses von SIAB gegenüber 3-Aminopropyltriethoxysilan wurde eine Mikroreaktion in
Chloroform/DMSO ausgeführt und unter den obenerwähnten TLC-Bedingungen
überwacht.
01igonucleotid-Modifikationen
Die Reduktion des Disulfids von 3'- oder 5'-disulfidhaltigen
Oligodesoxynucleotiden (Operon Technologies, Alameda, CA, oder Oligo Etc., Wilsonville, OR) wurde mittels Umkehrphasen-FPLC
(Pharmacia, Piscataway, NJ) überwacht; in der Verweilzeit des Oligodesoxynucleotids nach Abspaltung des Disulfids
ist eine Verschiebung zu erkennen. Es wurden verschiedene Reduktionsverfahren untersucht, um die optimalen Bedingungen
zu ermitteln. In einem Fall wurde das disulfidhaltige Oligodesoxynucleotid (31,5 nmol, 0,5 mM) mit Dithiothreitol (DTT)
(Pierce Chemical, Rockford, IL) (6,2 mmol, 100 mM) bei pH 8,0
DE 197 82 0S6T1
und 370C inkubiert. Nachdem die Spaltungsreaktion im wesentlichen
abgeschlossen war, wurde das freies Thiol enthaltende Oligodesoxynucleotid unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule
(Clontech, PaIo Alto, CA) isoliert, da DTT in der nachfolgenden
Reaktion konkurrieren kann. Als Alternative ist Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Pierce Chemical, Rockford,
IL) zum Spalten des Disulfids verwendet worden. Das disulfidhaltige
Oligodesoxynucleotid (7,2 nmol, 0,36 mM) wurde mit TCEP in Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bei 37°C inkubiert.
Das Produkt braucht nach der Reaktion nicht isoliert zu werden, da TCEP nicht konkurrierend mit der Iodacetamido-Funktionalität
reagiert. Es wurden verschiedene Konzentrationen von TCEP für die Spaltungsreaktion verwendet, um die optimalen
Bedingungen für die Konjugationsreaktion zu ermitteln.
Jedem Wafer, der gemäß der obigen Beschreibung so derivatisiert worden war, daß er die Iodacetamido-Funktionalität
enthielt, wurde eine wäßrige 10 niM-Lösung des freies Thiol enthaltenden Oligodesoxynucleotids in 100 mM Phosphatpuffer,
pH 8, zugesetzt; man ließ die Reaktion mindestens 5 Stunden bei Raumtemperatur in 100% relativer Feuchte ablaufen. Anschließend
an die Reaktion wurde die Oligodesoxynucleotid-Lösung
entfernt, und die Wafer wurden zweimal in 5 X SSC-Puffer (75 mM Natriumeitrat, 750 mM Natriumchlorid, pH 7) mit 50%
Formamid (USB, Cleveland, OH) bei 650C jeweils eine Stunde gewaschen.
Um die Menge der kovalent an eine Oberfläche gebundenen DNA oder die Menge einer hybridisierten komplementären Sequenz
zu bestimmen, wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet. In Fällen, wo ein 5'-disulfidhaltiges Oligodesoxynucleotid zu immobilisieren
war, wurde das 3'-Ende unter Verwendung von terminalem
Transferase-Enzym und eines radioaktiv markierten Didesoxynucleosidtriphosphats
radioaktiv markiert; in einer Standardreaktion wurden 15 pmol (0,6 μΜ) des 5'-disulfidhaltigen
Oligodesoxynucleotids mit 50 μθί (16,5 pmol, 0,66* μΜ) [α-
- 72 32
DE 197 82 036 Tl
P] -Dide'soxyadenosin-5'-triphosphat (ddATP) (Amersham, Arlingtom
Height, IL) in Gegenwart von 0,2 raM 2-Mercaptoethanol
inkubiert. Nach Zugabe von 40 Einheiten des terminalen Desoxynucleotidyltransferase-Enzyms
(USB, Cleveland, OH) ließ man die Reaktion eine Stunde bei 37*C ablaufen. Nach dieser
Zeit wurde die Reaktion angehalten, indem das Fläschchen 10 Minuten in ein Wasserbad mit 75°C eingetaucht wurde, und das
Produkt wurde unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule
(Clontech, PaIo Alto, CA) isoliert. Auf ähnliche Weise wurde
ein 5'-disulfidhaltiges Oligodesoxynucleotid mit S radioaktiv
markiert.
In Fällen, wo ein 3'-disulfidhaltiges Oligodesoxynucleotid
zu immobilisieren war, wurde das 5'-Ende mit Hilfe von T4-Polynucleotidkinase und eines radioaktiv markierten Nucleosidtriphosphats
radioaktiv markiert. Zum Beispiel wurden 15 pmol (0,6 μΜ) des 3'-disulfidhaltigen Oligodesoxynucleotids
mit 50 uCi (16,5 pmol, 0,66 μΜ) [λ32Ρ]-Adenosin-5'-triphosphat
(ATP) (Amersham, Arlingtom Height, IL) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert.
Nach Zugabe von 40 Einheiten T4-Polynucleotidkinase ließ man die Reaktion 1 Stunde bei 370C ablaufen. Die Reaktion
wurde angehalten, indem das Fläschchen 10 Minuten in ein Wasserbad von 750C eingetaucht wurde, dann wurde das Produkt mit
Hilfe einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, PaIo Alto, CA) isoliert.
Zur Bestimmung der Dichte der kovalent immobilisierten Sonde wurde das gewählte disulfidhaltige Oligodesoxynucleotid
einer Spurenmenge der gleichen Spezies zugesetzt, die gemäß der obigen Beschreibung radioaktiv markiert worden war. Das
Disulfid wurde gespalten, die Sonde wurde auf iodacetamidofunktionalisierten Wafern immobilisiert, die Wafer wurden gewaschen
und dann einem Leuchtstoffabbildungsschirm (phosphorimager
screen) (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) ausgesetzt. Für jedes verwendete, unterschiedliche Oligodesoxynucleotid
wurden Vergleichs-Spots auf Polystyrol hergestellt, bei denen der molare Anteil des Oligodesoxynucleotids bekannt war. Diese
Vergleichs-Spots wurden gleichfalls dem Leuchtstoffabbildungsschirm
ausgesetzt. Beim Abtasten des Schirms wurde die Menge
-"- DE 19? 82 OS8 Tl
(in mol) "des an jeden Chip gebundenen Oligodesoxynucleotids"
durch Vergleich der Zähleranzeigen mit den spezifischen Aktivitäten der Vergleichsproben bestimmt.'
Hybridisierung und Ausbeute
Einem Wafer, der mit einer immobilisierten Sonde funktionalisiert worden war, wurde eine Lösung einer komplementären
Sequenz (10 μΜ) in IM NaCl und TE-Puffer zugesetzt. Der
Wafer und die Lösung wurden auf 750C erhitzt, wonach man sie 3
Stunden lang auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Nach dieser Zeit wurde die Lösung entfernt, und der Wafer wurde zweimal
mit TE-Puffer gewaschen.
Zur Bestimmung der Menge des hybridisierten Oligonucleotids
wurde zunächst gemäß der obigen Beschreibung die Immobilisierung der Sonde ausgeführt, wobei aber die Sonde mit
35 32
S statt mit P markiert wurde. Die Dichte der immobilisierten Sonde wurde mit dem Leuchtstoffabbildungsschirm (phosphorimager)
bestimmt. Als nächstes wurde der gleiche Wafer in TE-Puffer, IM NaCl und ihrem (der Sonde) komplementären Strang
(10 μΜ) inkubiert, der mit P radioaktiv markiert worden war.
Die Hybridisierung wurde ausgeführt, wie weiter oben beschrieben. Nach einem Waschvorgang zum Entfernen unspezifischer Bindungen
wurden der Wafer und die Vergleichsprobe einem Leuchtstoffabbildungsschirm
ausgesetzt, wobei ein Stück Kupferfolie zwischen den Schirm und dem Wafer gelegt·wurde. Die Kupferfolie
dient zum Blockieren des Signals von S, während sie das
P-Signal durchläßt. Dann wird der molare Anteil des hybridisierten
Oligonucleotids bestimmt, wodurch sich der prozentuale Anteil der kovalent immobilisierten Sonde ermitteln läßt, die
zur Hybridisierung verfügbar ist.
Massenspektrometrische MALDI-TOF-Analyse
Wie oben beschrieben, wurden Wafer synthetisiert, die nicht radioaktiv markiertes Oligodesoxynucleotid enthielten (Name: TCUC; Sequenz: GAATTCGAGCTCGGTACCCGG; Molekulargewicht: 6455 Da; Seq.-ID-Nr. 1), und eine komplementäre Sequenz (Name: MJM6; Sequenz: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC; Molekulargewicht: 6415 Da, Seq.-ID-Nr. 2) wurde hybridisiert. Die Wafer .wurden zum
Wie oben beschrieben, wurden Wafer synthetisiert, die nicht radioaktiv markiertes Oligodesoxynucleotid enthielten (Name: TCUC; Sequenz: GAATTCGAGCTCGGTACCCGG; Molekulargewicht: 6455 Da; Seq.-ID-Nr. 1), und eine komplementäre Sequenz (Name: MJM6; Sequenz: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC; Molekulargewicht: 6415 Da, Seq.-ID-Nr. 2) wurde hybridisiert. Die Wafer .wurden zum
Kationenaustausch in 50 mM Ammoniumcitratpuffer gewaschen, um
Natrium- und Kaliumionen an der DNA-Hauptkette zu entfernen
(Pieles, U. et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191-3196). Eine
Matrixlösung von 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA, 0,7 M in 50% Acetonitril, 10% Ammoniumcitrat; (Wu, K.J., et al. (1993) Ra
pid Commun. Mass Spectrom. 7: 142-14 6) wurde auf den Wafer getupft
und bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen. Die Wafer wurde unter Verwendung eines leitfähigen Bandes direkt an der
Probensonde eines Vision 2000 Reflectron-TOF-Massenspektrometers von Finnigan MAT (Bremen, Deutschland) befestigt. Das Reflectron
besitzt eine 5 keV-Ionenquelle und eine 20 keV-Nachbeschleunigung;
es wurde ein Stickstofflaser verwendet, und alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen.
Oberflächenchemie
Unter Anwendung der normalen Siliciumdioxid-Modifikationschemie
wurde ein Silicium-Wafer mit 3-Aminopropyltriethoxysilan
zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminogruppen zu erzeugen.
Wie in Fig. 7 dargestellt, wurde die Oberfläche dann einem heterobifunktionellen
Vernetzungsmittel ausgesetzt, wodurch Iodacetamido-Gruppen
auf der Oberfläche entstanden. Die optimale Reaktionsdauer dieser Reaktion konnte in Lösung mit Hilfe der
Dünnschichtchromatographie (TLC) bestimmt werden. Das SIAB-Vernetzungsmittel
wurde unter langwelligem ultraviolettem Licht (302 nm) sichtbar gemacht und zeigte einen Fleck mit einem
Rf-Wert von 0,58. 3-Aminopropyltriethoxysilan war unter
ultraviolettem Licht nicht aktiv, daher wurde Ninhydrin verwendet, um einen purpurfarbenen Fleck sichtbar zu machen, der
die Gegenwart eines primären Amins an der Bezugslinie anzeigte. Unter Verwendung eines leichten molaren Überschusses von
SIAB gegenüber 3-Aminopropyltriethoxysilan wurde eine Mikroreaktion ausgeführt; die TLC-Analyse nach etwa einer Minute
zeigte einen neuen, unter langwelligem Ultraviolettlicht sichtbaren Fleck mit einem Rf-Wert von 0,28. Nach Besprühen
mit Ninhydrin wurde kein purpurfarbener Fleck nachgewiesen, folglich war das gesamte 3-Aminopropyltriethoxysilan-Ausgangs-
material "in" der Reaktion verbraucht worden. UV-Licht zeigte auch das überschüssige SIAB an, das nach der Reaktion zurückblieb.
Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, daß die Reaktion nach etwa einer Minute abgeschlossen ist. In allen Fällen
wurden die iodacetamido-funktionalisierten Wafer sofort verwendet, um die Hydrolyse der instabilen Iodacetamido-Funktionalität
zu minimieren. Außerdem wurden alle weiteren Wafer-Manipulationen im Dunklen ausgeführt, da die Iodacetamido-Funktionalität
lichtempfindlich ist.
Die Disulfid-Reduktion des modifizierten Oligonucleotids
wurde überwacht, indem eine Verschiebung der Verweilzeit bei der Umkehrphasen-FPLC beobachtet wurde. Es wurde festgestellt,
daß nach fünf Stunden in Gegenwart von DTT (100 mM) oder TCEP (10 mM) das Disulfid vollständig zu freiem Thiol reduziert
war. Wenn man die DTT-Reaktion längere Zeit weiterlaufen ließ, bildete sich ein Oligonucleotid-Dimer, in welchem
Paare von freien Thiolen miteinander reagiert hatten. Eine solche Dimerisierung wurde auch beobachtet, wenn das DTT nach
Beendigung der Spaltungsreaktion entfernt wurde. Diese Dimerisierung
wurde nicht beobachtet, wenn TCEP als Spaltreagens verwendet wurde, da diese Reaktion bei pH 4,5 ausgeführt wird,
so daß die freien Thiole vollständig protoniert wurden und die Dimerisierung gehemmt wurde.
Unmittelbar nach der Disulfidspaltung wurde das modifizierte Oligonucleotid mit den iodacetamido-funktionalisierten
Wafern inkubiert. Um eine vollständige Thiol-Deprotonierung sicherzustellen, wurde die Kopplungsreaktion bei pH 8,0 ausgeführt.
Die durch diese Chemie von Silicium-Wafern erzielte Sonden-Oberflächendichte wurde mit Hilfe radioaktiv markierter
Sonden und eines Leuchtstoffabbildungsschirms (phosphorimager) analysiert. Die Sonden-Oberflächendichte wurde außerdem als
Funktion der TCEP-Konzentration überwacht, die bei der Disulfidspaltungsreaktion
verwendet wurde (Fig. 8). Unter Verwendung von 10 mM TCEP zur Spaltung des Disulfids sowie der anderen,
oben beschriebenen Reaktionsbedingungen war es möglich,
2 reproduzierbar eine Oberflächendichte von 250 fmol pro mm
Oberfläche zu erhalten. Es wurden die gleichen Experimente wie oben beschrieben ausgeführt, außer daß die Oligonucleotid-
Sonde keine' Thiolmodifikation aufwies; Oberflächendichten von
weniger als 5 fmol pro mm Oberfläche bewiesen, daß die unspezifische
Bindung minimal ist und die Sondenkopplung sehr wahrscheinlich so auftrat, wie in Fig. 7 vorgeschlagen.
5
5
Nach dem Fixieren von S-markierten Sonden an der Oberfläche von Wafern und der Bestimmung der Konjugationsdichte
gemäß der obigen Beschreibung wurde die Hybridisierung von
32
P-markierten Oligonucleotiden ausgeführt; die Hybridisierungsausbeute und -dichte wurden mit Hilfe des Leuchtstoffabbildungsschirms (phosphorimager) und einer Kupferfolie bestimmt. Es wurde experimentell ermittelt, daß Kupferfolie 98,4% eines S-Signals blockiert, während sie ein nachzuweisendes P-Signal vollständig durchläßt. Die komplementäre Sequenz hybridisierte reproduzierbar mit einer Ausbeute von 105
P-markierten Oligonucleotiden ausgeführt; die Hybridisierungsausbeute und -dichte wurden mit Hilfe des Leuchtstoffabbildungsschirms (phosphorimager) und einer Kupferfolie bestimmt. Es wurde experimentell ermittelt, daß Kupferfolie 98,4% eines S-Signals blockiert, während sie ein nachzuweisendes P-Signal vollständig durchläßt. Die komplementäre Sequenz hybridisierte reproduzierbar mit einer Ausbeute von 105
2
fmol pro mm Oberfläche; dies entspricht etwa 4 0% der für die Hybridisierung verfügbaren konjugierten Sonden. Auf ähnliche Weise wurde in diesem Schema eine nichtkomplementäre Sequenz
fmol pro mm Oberfläche; dies entspricht etwa 4 0% der für die Hybridisierung verfügbaren konjugierten Sonden. Auf ähnliche Weise wurde in diesem Schema eine nichtkomplementäre Sequenz
verwendet, die weniger als 5 fmol pro mm Oberfläche bei unspezifischer
Bindung ergab.
Es wird vermutet, daß die sterische Hinderung zwischen dem dichtgepackten Oligonucleotid auf der ebenen Oberfläche
höhere Hybridisierungsausbeuten als 40% verhindert. Unter Berücksichtigung dessen wurde zwischen dem Ende des Hybridisierungsbereichs
des Oligonucleotids und dem Träger ein Spacer-Molekül eingebaut. Die gewählten Spacer waren eine Serie von
Poly-dT-Sequenzen mit Längen im Bereich von 3 bis 25. Bei Untersuchung
dieser Proben mit radioaktiven Markierungen und dem Leuchtstoffabbildungsschirm wurde festgestellt, daß die erzielbare
maximale Hybridisierung immer noch 40% betrug
Wafer wurden mit Sonden funktionalisiert, komplementäre Sequenzen wurden hybridisiert, und die Proben wurden unter
normalen MALDI-Bedingungen analysiert, wie oben beschrieben. Die Analyse zeigte, daß nur der reassoziierte bzw. wieder verbundene
Strang (MJM6) im Massenspektrum mit einem experimen-
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teilen Masse/Ladungs-Verhältnis von 6415,4 beobachtet wurde; das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis beträgt 6415 (Fig.
9). Da bei einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6455 kein Signal vorhanden war, wurde festgestellt, daß der wafer-konjugierte
Strang (TCUC) nicht desorbiert wurde; folglich war die Iodacetamido-Bindung
stabil genug, um dem Laser zu widerstehen und intakt zu bleiben. Ein zusätzliches Signal wurde bei einem
Masse/Ladungs-Verhältnis von 6262.0 beobachtet. Dieses Signal ergibt sich aus einer Depurinierung von Guanosinen, da DNA bekanntlich
anfällig für den Verlust von Purinbasen während des MALDI-Verfahrens ist (Nordoff, E. et al. (1992) Rapid Commun.
Mass Spectrom. 6: 771-776). Die Probenkristalle auf dem Wafer waren nicht homogen verteilt, daher mußte ein guter Spot aufgespürt
werden. Wegen dieser Inhomogenität schwankte die Masseauflösung, lag aber in den Massenspektren im allgemeinen im
Bereich von 200-300 für das desorbierte Oligonucleotid. In einer Gruppe von Experimenten wurden nichtkomplementäre Sequenzen
an den Wafer hybridisiert; nach einem Waschvorgang, wie weiter oben beschrieben, zeigte die Analyse mittels MALDI-TOF
MS, daß eine minimale unspezifische Anlagerung stattgefunden hatte, da kein Signal nachgewiesen wurde.
Immobilisierung von amplifizierten DNA-Zielen auf Silicium-Wafern
Die SIAB-konjugierten Silicium-Wafer wurden gleichfalls
zur Analyse spezifischer, freies Thiol enthaltender DNA-Fragmente einer bestimmten amplifizierten DNA-Zielsequenz verwendet.
Wie in Fig. 10 dargestellt, wurde ein 23-mer-Oligodesoxynucleotid,
das eine 5'-Disulfidbindung enthält [bezogen von Operon Technologies; Seq.-ID-Nr.: 3], die zum 3'-Bereich einer
112 bp-Humangenom-DNA-Matrize [Genbank-Zugriffsnummer: Z52259; Seq.-ID-Nr.: 4] komplementär ist, in Verbindung mit einem im
Handel erhältlichen 4 9-mer-Primer, der zu einem Abschnitt des 5'-Endes der genomischen DNA komplementär ist [bezogen von
Operon Technologies; Seq.-ID-Nr.: 5], in PCR-Reaktionen als Primer zur Amplifikation eines 135bp-DNA-Produkts verwendet,
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das eine "5'-Disulfidbindung enthält, die nur an einem Strang
des DNA-Doppelstrangs [Seq.-ID-Nr.: 6] fixiert ist.
Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung
eines Amplitaq GoldKit [Perkin Eimer, Katalog-Nr. N808-0249] ausgeführt. Kurz gesagt, 200 ng einer 112bp-Humangenom-Matrize
wurden mit 10 μΜ 23-mer-Primer und 8 μΜ des im Handel
erhältlichen 49-mer-Primers, 10 mM dNTPs, 1 Einheit Amplitaq Gold DNA-Polymerase in dem vom Hersteller gelieferten Puffer
inkubiert, und die PCR (Polymerasekettenreaktion) wurde in einer Temperaturwechseleinrichtung (Thermocycler) ausgeführt.
Die 5'-Disulfidbindung des entstehenden PCR-Produkts
wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 10 mM TCEP vollständig reduziert, um eine freie 5'-Thiolgruppe zu
erzeugen. Der die freie Thiolgruppe enthaltende DNA-Strang wurde über den SIAB-Linker an die Oberfläche des Silicium-Wafers
konjugiert, wie im wesentlichen in Fig. 7 skizziert.
Der mit der thiolhaltigen 135bp-DNA konjugierte Silicium-Wafer
wurde mit einem komplementären 12-mer-Oligonucleotid
[Seq.-ID-Nr.: 7] inkubiert, und spezifisch hybridisierte DNA-Fragmente wurden mittels MALDI-TOF MS-Analyse nachgewiesen.
Das Massenspektrum zeigte ein Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse/Ladungs-Verhältnis von 3618,33; das
theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis der 12-mer-0ligomersequenz beträgt 3622,4 Da.
Folglich kann ein spezifisches DNA-Zielmolekül amplifiziert werden, das eine 5'-Disulfidbindung enthält. Die Moleküle
werden unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren auf einem SIAB-derivatisiertem Silicium-Wafer immobilisiert,
und an diese Zielmoleküle können spezifische komplementäre Oligonucleotide hybridisiert und mittels MALDI-TOF MS-Analyse
nachgewiesen werden.
Dieses Beispiel beschreibt die Hybridisierung einer immobilisierten
Matrize, Primerverlängerung (primer extension) und Massenspektrometrie zum Nachweis des Wildtyp- und Mutanten-Apolipoprotein
Ε-Gens für diagnostische Zwecke. Dieses
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Beispiel zeigt, daß immobilisierte DNA-Moleküle, die eine spezifische
Sequenz enthalten, mittels Primerverlängerung von nichtmarkierten allelspezifischen Primern und Analyse der Verlängerungsprodukte
durch Massenspektrometrie nachgewiesen und unterschieden werden können.
Eine synthetische 50-Basen-DNA-Matrize, die komplementär zu der codierenden Sequenz von Allel 3 des Wildtyp-Apolipoprotein
Ε-Gens ist:
5' -GCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-S'
5' -GCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-S'
[Seq.-ID-Nr.: 17],
oder ein Komplement zu dem Mutanten-Apolipoprotein Ε-Gen, das eine G—»Α-Transition am Codon 158 trägt:
5' -GCCTGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-S'
[Seq.-ID-Nr.: 18]
[Seq.-ID-Nr.: 18]
das eine freie 3' -Thiolgruppe enthält, wurde mit separaten
SIAB-derivatisierten Silicium-Wafern gekoppelt, wie im wesentlichen
in Fig. 7 skizziert und in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Ein 21-mer-Oligonucleotid-Primer:
5'-GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-31 [Seq.-ID-Nr.: 19] wurde an
jede der immobilisierten Matrizen hybridisiert, und der Primer wurde mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Kits [z. B. Sequenase
oder Thermosequenase, U.S. Biochemical Corp.] verlängert. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder Thermosequenase-DNA-Polymerase
in Gegenwart von drei Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dTTP) und Didesoxyribonucleosidcytosintriphosphat
(ddCTP) in Puffer nach den vom Hersteller gegebenen Anweisungen ergab eine Verlängerung um
eine Base des 21-mer-Primers, der an die immobilisierte Matrize gebunden ist, die das Wildtyp-Apolipoprotein Ε-Gen codiert,
und eine Verlängerung um drei Basen des 21-mer-Primers, der an die immobilisierte Matrize gebunden ist, welche die Mutantenform
des Apolipoprotein Ε-Gens codiert.
Die Wafer wurden mittels Massenspektrometrie analysiert,
wie hierin beschrieben. Die Wildtyp-Apolipoprotein E-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, das den Primer mit einbasiger
Verlängerung (22-mer) mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6771,17 Da (das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis be-
-DE 19*/ 82 GS6 Tl
trägt 6753,5 Da) von dem ursprünglichen 21-mer-Primer mit einem
Masse/Ladungs-Verhältnis von 6499,64 Da unterscheidet. Die Mutanten-Apolipoprotein Ε-Sequenz ergibt ein Massenspektrum,
das den Primer mit dreibasiger Verlängerung (24-mer) mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 7386,9 (das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis
beträgt 7386,9) von dem ursprünglichen 21-mer-Primer mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6499,64
Da unterscheidet.
Herstellung von DNA-Anordnungen unter Verwendung von seriellen und parallelen Abgabewerkzeugen
Robotergesteuerte serielle und parallele pL-nL-Abgabewerkzeuge wurden zur Herstellung von DNA-Anordnungen von 10
bis 10 Elementen auf quadratischen Chips von < 1 Zoll Seitenlänge mit ebenen oder geometrisch veränderten Oberflächen (z.
B. mit Kavitäten) für die massenspektrometrische Analyse mit matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation verwendet. Bei
den ersteren gibt eine "piezoelektrische Pipette" (Kapillare von 7 0 μπι Innendurchmesser) ein oder mehrere Tröpfchen von
-0,2 nl der Matrix und danach des Analyten auf den Chip ab;
Spektren von so geringen Mengen wie 0,2 fmol einer 36-mer-DNA sind mit Hilfe dieses Verfahrens erfaßt worden. Trotz der
schnellen Verdampfung (<5 s) werden routinemäßig Mikrokristal-Ie
der 3-Hydroxypicolinsäure-Matrix erzeugt, die den Analyten enthält, woraus sich eine höhere Reproduzierbarkeit ergibt,
als man routinemäßig bei Präparaten mit größerem Volumen erzielt; alle 100 Spots von jeweils 5 fmol eines 23-mers in 800
μΐη-Kavitäten ergaben leicht interpretierbare Massenspektren
mit 99/100 Ausgangsionensignälen mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von >5. In einem zweiten Verfahren werden Sonden
von einer Mikrotiterplatte mit 384 Kavitäten in Gruppen zu je 16 in Chip-Kavitäten oder auf ebene Oberflächen gegeben, wobei
eine Anordnung von federgespannten Stiften verwendet wird, die ~20 nl durch Oberflächenkontakt auf den Chip übertragen; die
MS-Analyse von Anordnungselementen, die mit dem Parallelverfahren aufgebracht wurden, ist hinsichtlich der Empfindlich-
- DE-197 8-2 086 T1
keit und" der Auflösung mit den Elementen vergleichbar, die nach dem seriellen Verfahren aufgebracht werden.
Beschreibung der piezoelektrischen seriellen Abgabeeinrichtung.
Das experimentelle System wurde aus einem System entwickelt, das von der Microdrop GmbH, Norderstedt, Deutschland,
bezogen wurde, und kann aufweisen: einen Treiber für piezoelektrische Elemente, der ein Impulssignal an ein piezoelektrisches
Element sendet, das an eine Glaskapillare angeklebt ist und diese umgibt, welche die abzugebende Lösung enthält;
einen Druckwandler zum Füllen (durch Unterdruck) oder Entleeren (durch Überdruck) der Kapillare; einen XYZ-Robotertisch
und Robotertreiber zum Manövrieren der Kapillare zum Beladen, Entladen, zur Abgabe und zum Reinigen, ein Stroboskop mit
Treiber, das mit der Frequenz des Piezoelements impulsgesteuert wird, um das Betrachten der Eigenschaften von schwebenden
Tröpfchen zu ermöglichen; separate Tische bzw. Objektträger für Quellen- und Zielplatten oder Zielproben (d. h. einen Si-
- Chip); eine am Roboterarm montierte Kamera zum Betrachten des Beladens der Zielplatte und eine Datenstation, welche die
Druckeinheit, den XYZ-Roboter und den piezoelektrischen Treiber steuert.
Das Roboter-Stiftwerkzeug besteht aus 16 Sonden, die in
einem Sondenblock untergebracht und auf einem XYZ-Robotertisch montiert sind. Der Robotertisch ist ein Portalsytem, das die
Anordnung von Probentabletts unter den Armen des Roboters ermöglicht. Die Portaleinheit selbst besteht aus X- und Y-Armen,
die sich über 250 bzw. 400 mm bewegen, geführt von bürstenlosen Linearservomotoren mit Positionsrückführung durch lineare
optische Codierer. Eine leitspindelgetriebene Z-Achse (50 mm Vertikalhub) ist auf dem XY-Schlitten der Portaleinheit montiert
und wird durch einen Reihen-Drehservomotor mit Positionsrückführung durch einen am Motor montierten optischen Drehcodierer
gesteuert. Der Arbeitsbereich des Systems ist mit einer herausziehbaren Bestückungsplatte ausgestattet, die fünf
Mikrotiterplatten (am häufigsten zwei Platten mit Waschlösung
und drei Probenplatten für maximal 1152 verschiedene Oligonucleotid-Lösungen)
und bis zu zehn 20 χ 20 mm-Wafer aufnimmt. Die Wafer werden in der Platte genau an zwei Anschlag&tiften
angeordnet und mittels Unterdruck festgehalten. Das gesamte System ist zur Sicherheit in ein Plexiglasgehäuse eingeschlossen
und zur Wärme- und Schwingungsdämpfung auf einem Stahltragrahmen
montiert. Die Bewegungssteuerung erfolgt unter Verwendung einer handelsüblichen Bewegungssteuereinrichtung, die
eine 3-Achsen-Servosteuerung darstellt und in einen Computer integriert ist; das Programm für spezielle Anwendungen wird
nach Bedarf geschrieben.
Proben wurden mit dem seriellen System auf verschiedene Oberflächen abgegeben, die bei der MALDI-TOF-Analyse als Ziele
dienten, zu denen gehörten: [1] ein ebenes Probenziel aus rostfreiem Stahl, wie es zur Routine-Anwendung in einem Thermo
Bioanalysis Vision 2000 verwendet wird; [2] ein Ziel aus rostfreiem Stahl von gleicher Konstruktion mit mikrobearbeiteten
Nano-Grübchen; [3] ebene Silicium-Wafer (Si-Wafer); [4] polierte
ebene Si-Wafer; [5] Si-Wafer mit rauhen Grübchen (Merkmale von 3-6 pm Größe), [6] (a) Si-Chips von 12 χ 12 (oder 18
χ 18 mm mit Anordnungen von 10 χ 10 (oder 16 χ 16) chemisch
geätzten Vertiefungen bzw. Kavitäten von jeweils 800 χ 800 pm
Seitenlänge, mit Tiefen von 99-400 pm (oder (b) 120 pm), Abstand (a) 1,0 (oder (b) 1,125) mm; [7] Si-Chips von 15 χ 15 mm'
mit Anordnungen von 28 χ 28 chemisch geätzten Kavitäten von jeweils 450 χ 450 pm Seitenlänge, mit Tiefen von 48-300 pm,
Abstand 0,5 mm; [8] ebenes Polycarbonat oder andere Kunststoffe; [9] Gold und andere Metalle; [10] Membranen; [11] mit Gold
oder anderen leitfähigen Materialien gesputterte Kunststoffoberflächen. Das abgegebene Volumen wird durch Einstellen der
Anzahl der abgegebenen Tröpfchen von 10 bis 10 1 gesteuert.
Probenherstellung und Abgabe
1. Seriell
1. Seriell
Oligonucleotide (0,1-50 ng/pl) mit unterschiedlicher
Sequenz oder unterschiedlichen Konzentrationen wurden in Kavi-
'S:
täten einer 96-Kavitäten-Mikrotiterplatte - eingefüllt; die er-
ste Kavitaf wurde für Matrixlösung reserviert. Ein mit Grübchen
versehener Chip (Ziel 6a im obigen Abschnitt über MALDI-Ziele)
wurde auf den Tisch aufgelegt und von Hand ausgerichtet. In die Roboter-Steuersoftware (auf Windows-Basis) wurden
die Koordinaten der ersten Kavität, die Größe der Anordnung (d. h. die Anzahl der Spots in x- und y-Richtung) und der Abstand
zwischen den Elementen sowie die Anzahl von 0,2 Nanoliter-(nl-)Tröpfchen
pro Anordnungselement eingegeben. Die Ka-. pillare wurde mit ~10 μΐ H2O zum Spülen gefüllt, automatisch
im Blickfeld einer Kamera mit Stroboskop-Beleuchtung bewegt, um im Dauerimpulsbetrieb die Unversehrtheit und Sauberkeit der
Spitze zu kontrollieren, und dann entleert. Dann wurde die Kapillare mit Matrixlösung gefüllt, wieder unter dem Stroboskop
geprüft und dann zum Auftupfen einer Anordnung auf ebene oder mit Grübchen versehene Oberflächen verwendet. Für Reproduzierbarkeitsuntersuchungen
in verschiedenen Massenspektrometrie-(MS-)Betriebsarten wurde typischerweise eine 10 χ 10-Anordnung
von 0,2-20nl-Tröpfchen abgegeben. Die Kapillare wurde durch Anlegen von Überdruck entleert, wahlweise mit H2O gespült und
zur Quellen-Oligonucleotid-Platte geführt, wobei ~5 μΐ synthetische
0,05-2,OmM Oligonucleotide angesaugt wurden. Dann wurde die Kapillare rasterartig der Reihe nach über jeden der Matrix-Spots
bewegt, wobei jedem Spot 0,2 bis 20 nl wäßrige Lösung zugesetzt wurden.
2. Parallel
Es wurden Parallelprogramme geschrieben, um die Herstellung von Anordnungen durch Offsetdruck zu steuern; zur
Herstellung einer Anordnung von 64 Elementen auf 10 Wafern wurde zum Beispiel das Werkzeug in 16 Kavitäten einer DNA-Quellenplatte
mit 384 Kavitäten eingetaucht, zum Ziel (z. B. Si, Kunststoff, Metall) bewegt, und die Probe wurde durch
Oberflächenkontakt aufgetupft. Das Werkzeug wurde dann in die gleichen 16 Kavitäten eingetaucht und auf das zweite Ziel aufgetupft;
dieser Zyklus wurde auf allen zehn Wafern wiederholt. Als nächstes wurde das Werkzeug in Waschlösung getaucht, dann
in 16 andere Kavitäten der Quellenplatte getaucht und um 2,25 mm gegen die ursprüngliche Gruppe von 16 Spots versetzt auf
das Ziel aufgetupft; dies wurde wiederum auf allen 10 Zielen wiederholt; der gesamte Zyklus wurde wiederholt, um eine 2 χ
2-Anordnung von jedem Stift herzustellen und eine 8x8 Spot-Anordnung
(2x2 Elemente/Stift χ 16 Stifte = insgesamt 64 aufgetupfte Elemente) zu erzeugen.
Zur Herstellung von Anordnungen für die massenspektrometrische
Analyse (MS-Analyse) wurden Oligonucleotide mit unterschiedlichen Sequenzen oder Konzentrationen in die Kavitäten
von bis zu drei verschiedenen 384-Kavitäten-Mikrotiterplatten eingefüllt; eine Gruppe von 16 Kavitäten wurde für Matrixlösung
reserviert. Die Kavitäten von zwei Platten wurden mit Waschlösung gefüllt. Die fünf Mikrotiterplatten wurden auf
die ausziehbare Bestückungsplatte geladen. Zehn Wafer wurden angrenzend an die Anschlagstifte auf der Bestückungsplatte angeordnet,
und das Vakuum wurde eingeschaltet. In Fällen ohne Vormischen der Matrix und des Oligonucleotids wurde das Stiftwerkzeug
benutzt, um zuerst Matrixlösung auf alle gewünschten Anordnungselemente der zehn Wafer aufzutupfen. Für dieses Beispiel
wurde eine 16 χ 16-Anordnung erzeugt, folglich mußte das Werkzeug jeden der zehn Wafer 16 mal betupfen, mit einer Versetzung
von jeweils 1,125 mm. Als nächstes wurde die Oligonucleotidlösung im gleichen Muster aufgetupft, um die Matrix
wieder aufzulösen. Auf ähnliche Weise konnte eine Anordnung hergestellt werden, indem zuerst die Oligonucleotidlösung auf
den Wafer aufgebracht wurde, gefolgt von der Matrixlösung, oder durch Vormischen der Matrix- und der Oligonucleotidlösung.
Anschließend an das eine oder das andere Abgabeprogramm wurden beladene Chips mit einem Satz abgeschrägter, mit
Schrauben befestigter Polycarbonat-Halterungen auf einer MAL-DI-TOF-Quellenplatte
festgehalten. Die Platte wurde auf das Ende einer Sonde übertragen, die auf einem XY-Tisch mit Ιμπι
Auflösungsvermögen und 1" Bewegungsbereich (Newport) im Quellenbereich eines Laufzeit-Massenspektrometers fixiert werden
sollte. Das Gerät, das normalerweise mit 18-26 kV Saugspannung betrieben wird, konnte im Reflectron-Betrieb mit linearem oder
DE iS7 82 0S6
gekrümmtem Feld und im kontinuierlichen oder verzögerten Saugbetrieb
gefahren werden.
Während die Abgabe einer gesättigten 3-HPA-Lösung zum Verstopfen der Spitze führen kann, da das Lösungsmittel an der
Grenzfläche zwischen Kapillare und Luft verdampft, wird die Matrix durch Vormischen von DNA und Matrix ausreichend verdünnt,
so daß sie in Lösung bleibt, wobei beständige Sprühnebei erzielt wurden, die bis zur Entleerung der Kapillare aufrechterhalten
werden konnten; mit einer im Verhältnis von 1:1 (in H2O) verdünnten Matrixlösung war ein kontinuierliches
Sprühen über >> 10 Minuten möglich. Abschalten des piezoelektrischen Elements, so daß die Kapillare über
> 5 Minuten deaktiviert war, und Reaktivieren des piezoelektrischen Elements führte ebenfalls nicht zum Verstopfen der Kapillare.
Bei ersten Experimenten unter Verwendung von Probenzielen aus rostfreiem Stahl, wie sie durch das Finnigan Vision
2000 MALDI-TOF-System bereitgestellt werden, das im Reflectron-Betrieb
gefahren wird, wurde eine Lösung verwendet, die vor der Abgabe auf das Probenziel aus der Matrix und DNA vorgemischt
wurde. In einer einzelnen Mikrotiterplatte wurden 50 μΐ gesättigte Matrixlösung, 25 μΐ einer 51ul-Lösung des 12-mers
(ATCG)3 und 25μ1 einer 51pl-Lösung des 28-mers (ATCG)7
vermischt. Eine Menge von 10 χ 10-Anordnungen von Ο,βμΐ-Tröpfchen
wurde direkt auf eine Finnigan Vision 2000-Probenzielscheibe abgegeben; ein MALDI-TOF-Massenspektrum wurde
von einem einzelnen Anordnungselement aufgenommen, das 750 Attomol jedes der beiden Oligonucleotide enthielt. Unter Anwendung
dieses Verfahrens erhielt man interpretierbare Massenspektren für so große DNAs wie ein 53-mer (350 amol geladen,
nicht dargestellt).
Es wurden auch Massenspektren von DNAs gewonnen, die in die Kavitäten eines Siliciumchips mikrodosiert wurden. Fig. 11
zeigt einen 12 χ 12 mm-Siliciumchip mit 100 chemisch geätzten
Kavitäten; Maskenabmessungen und Ätzdauer wurden so eingestellt, daß pyramidenstumpfförmige Kavitäten (d. h. mit der
Df 19? 82 GiS J)
Geometrie" eines umgekehrten Pyramidenstumpfs) mit Abmessungen von 800 χ 800 pm (obere Fläche) und ΙΟΟμίη Tiefe erzielt wurden.
Wahlweise können die Kavitäten aufgerauht oder mit Grübchen versehen sein. Wie oben beschrieben, wurde der Chiprand
an einer erhöhten Fläche auf dem Tisch ausgerichtet, um die x- und y-Koordinatensysteme bezüglich der Kapillare festzulegen.
(Alternativen sind unter anderem eine optische Ausrichtung, Mustererkennungsroutinen durch künstliche Intelligenz und eine
manuelle Ausrichtung mittels Paßstiften). In jede Kavität wurden 20 Tröpfchen (~5 nl) 3-HPA-Matrixlösung ohne Analyten abgegeben;
für die verwendete 50%ige CH3CN-Lösung lagen die Verdunstungszeiten für jedes Tröpfchen in der Größenordnung von
5-10 Sekunden. Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels erschien jedes mikrodosierte Matrixtröpfchen bei der Betrachtung unter
einem 120X-Steromikroskop im allgemeinen als amorphe und 'milchige'
flache Scheibe; ein solches Aussehen stimmt mit dem der Tröpfchen überein, von denen das in Fig. 3b gezeigte Spektrum
gewonnen wurde. Nach dem Entleeren der Spitze, Spülen und Nachfüllen mit 1,4μΜ wäßriger Lösung einer 23-mer-DNA
(Mr (berechn.) = 6967 Da) wurde die Kapillare über jeden der
100 Matrix-Spots gelenkt, wo 5 nl der wäßrigen DNA-Lösung direkt auf die Matrixtröpfchen abgegeben wurden. Durch Sichtbarmachen
mit einer CCD-Kamera zeigte sich, daß die Analytenlösung sich mit der Matrix vermischte und wiederauflöste (die
vollständige Verdunstung dauerte -10 Sekunden bei Umgebungstemperatur
und normaler Feuchtigkeit). Die amorphen Matrixoberflächen wurden in echte mikrokristalline Oberflächen mit
kristallinen Merkmalen in der Größenordnung von <1μΐη umgewandelt.
In Übereinstimmung mit_ der durch das Matrix-Wiederauflösungsverfahren
erzielten besseren Kristallisation ergab sich eine bessere Reproduzierbarkeit der Erfassung des Massenspektrums
als bei vorgemischten Matrix-Analyt-Lösungen; jeder der 100 Spots von jeweils 5 fmol des 23-mers lieferte interpretierte
Massenspektren (Fig. 12) mit 99/100 Ausgangsionensignalen mit Signal-Rausch-Verhältnissen von
>5; eine solche Reproduzierbarkeit wurde auch mit den ausprobierten ebenen Silicium-
und Metalloberflächen (nicht dargestellt) erreicht. Die
DE 197 82 0S6T1
Spektren von Fig. 12 wurden an einem linearen Laufzeitgerät
(TOF) aufgenommen, das mit 2 6 kV betrieben wurde. Bei interner Eichung des oberen linken Spektrums (Kavität 'kl') mittels
einfach und doppelt geladener Molekülionen und Anwendung dieser Eichdatei auf alle anderen 99 Spektren als externe Eichung
(Fig. 13) erhielt man eine Standardabweichung von <9 Da vom mittleren Molekulargewicht, was einer relativen Standardabweichung
von -0,1% entspricht.
Parallelabgabe mit dem Roboter-Stiftwerkezuq
Es wurden Anwendungen mittels Offsetdruck hergestellt, wie oben beschrieben. Die Geschwindigkeit der X- und Y-Tische
beträgt 35 Zoll/s (88,9 cm/s), und die Geschwindigkeit des Z-Tischs beträgt 5,5 Zoll/s (14 cm/s). Die X- und Y-Tische können
mit Höchstgeschwindigkeit bewegt werden, um die Zykluszeiten zu verkürzen, jedoch muß die Geschwindigkeit des Z-Tischs
vor dem Oberflächenkontakt mit dem Wafer verringert werden, um dessen Beschädigung zu vermeiden. Bei solchen Achsengeschwindigkeiten
beträgt die ungefähre Zykluszeit für das Auftupfen von 16 Elementen (ein Werkzeugeindruck der gleichen Lösungen)
auf alle zehn Wafer 20 Sekunden, so daß die Herstellung einer Anordnung von 256 Elementen ~5,3 Minuten dauert. Wenn verschiedene
Oligonucleotidlösungen auf die Anordnung aufgebracht werden, muß vor dem Eintauchen in eine andere Lösung ein zusätzlicher
Waschschritt zum Reinigen der Stiftspitze eingefügt werden, so daß die Zykluszeit auf 25 Sekunden oder auf 6,7 Minuten
für die Herstellung von 10 Wafern zunehmen würde.
Die Probenabgabe durch das Werkzeug wurde unter Verwendung radioaktiv markierter Lösungen und des Leuchtstoffabbildungsschirms,
wie weiter oben beschrieben, überprüft; es wurde festgestellt, daß jeder Stift annähernd 1 nl Flüssigkeit abgibt.
Die Reproduzierbarkeit von Spot zu Spot ist hoch. Unter Verwendung des Stiftwerkzeugs wurde eine Anordnung von 256
Oligonucleotidelementen von unterschiedlicher Sequenz und Konzentration auf ebenen Silicium-Wafern hergestellt, und der Wafer
wurde mittels MALDI-TOF-MS analysiert.
Anwendung der Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte zum Erzeugen von Nucleinsäure-Anordnungen
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Fixierverfahren mit hoher Dichte wurde auf einem Silicium-Wafer
mit mehreren Positionen, d. h. Vertiefungen oder Flecken, auf seiner Oberfläche eine Anordnung von DNA-Oligomeren erzeugt,
die für die massenspektrometrische MALDI-TOF-Analyse zugänglich
waren. Zum Erzeugen der Anordnung wurde ein freies Thiol enthaltender Oligonucleotid-Primer nur in den ausgewählten Positionen
des Wafers immobilisiert [siehe z. B. Fig. 14]. Jede Position der Anordnung enthielt eines von drei verschiedenen
Oligomeren. Um zu zeigen, daß die unterschiedlich immobilisierten Oligomere getrennt nachgewiesen und unterschieden werden
konnten, wurden drei verschiedene Oligomere von unterschiedlicher Länge, die zu einem der drei Oligomere komplementär
sind, an die Anordnung auf dem Wafer hybridisiert und mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
Oligodesoxynucleotide
Es wurden drei Sätze von komplementären Oligodesoxynucleotid-Paaren
synthetisiert, in denen ein Element des komplementären Oligonucleotid-Paars eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung
enthält [bezogen von Operon Technologies oder Oligos Etc.]. Zum Beispiel enthält das Oligomer 1 [d(CTGATGC-GTCGGATCATCTTTTTT-SS);
Seq.-ID-Nr.: 8] eine 3'-Disulfidbindung, während das Oligomer 2 [d(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGT-ATT);
ein 5'-Disulfid-Derivat von Seq.-ID-Nr.: 3] und das Oligomer
3 [d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG); ein 5'-Disulfid-Derivat
von Seq.-ID-Nr.: 1] jeweils eine 5'-Disulfidbindung enthalten.
Die zu den Oligomeren 1-3 komplementären Oligonucleotide wurden so konstruiert, daß sie verschiedene Längen aufwiesen,
die sich bei der MALDI-TOF MS-Analyse leicht voneinander trennen lassen. Zum Beispiel wurde ein 23-mer-Oligonucleotid
[Seq.-ID-Nr. : 9] komplementär zu einem Abschnitt von Oligomer 1 synthetisiert, ein 12-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 7]
wurde komplementär zu einem Abschnitt von Oligomer 2 syntheti-
DE 137 82 096 Tl
siert, und ein 21-mer [Seq.-ID-Nr.: 2; Sequenz wurde in Beispiel
1 mit "MJM6" bezeichnet] wurde komplementär zu einem Abschnitt
von Oligomer 3 synthetisiert. Außerdem wurde ein viertes 29-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 10] synthetisiert, das
zu keinem der drei Oligomere komplementär ist. Dieses vierte Oligonucleotid wurde als negative Kontrolle verwendet.
(a) 4 χ 4-Anordnung (16 Positionen)
Ein Silicium-Wafer von 2 χ 2 cm mit 256 Einzelvertiefungen
oder Kavitäten in Form einer Anordnung von 16 χ 16 Kavitäten
wurde von einem kommerziellen Lieferanten bezogen [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Die Kavi-
2
täten hatten Abmessungen von 800 χ 800 um , 120 μπι Tiefe, auf einem Abstand von 1,125 mm. Der Silicium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, wodurch auf der Oberfläche Iodacetamido-Funktionalitäten entstanden [siehe z. B. Fig. 7].
täten hatten Abmessungen von 800 χ 800 um , 120 μπι Tiefe, auf einem Abstand von 1,125 mm. Der Silicium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, wodurch auf der Oberfläche Iodacetamido-Funktionalitäten entstanden [siehe z. B. Fig. 7].
Um die Oligomere zur Bindung an die verschiedenen Positionen der Silicium-Anordnung herzustellen, wurde die Disulfidbindung
jedes Oligomers unter Verwendung von 10 mM TCEP vollständig reduziert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und die
DNA wurde mit einer Endkonzentration von 10 μΜ in einer Lösung
von 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, resuspendiert. Unmittelbar nach der Reduktion der Disulfidbindung wurde die freie
Thiolgruppe des Oligomers in 16 Positionen auf dem Wafer an die Iodacetamido-Funktionalität gebunden, wobei im wesentlichen
die in Fig. 7 beschriebenen Sondenbindungsbedingungen angewandt wurden. Um die getrennte Bindung in 16 verschiedenen
Positionen des Wafers zu bewerkstelligen, wurde nicht die gesamte Oberfläche des Wafers mit einer Oligonucleotidlösung
überspült, sondern statt dessen wurde in jede von 16 Positionen (d. h. Vertiefungen) von den 256 Kavitäten auf dem Wafer
ein Aliquot von -30 nl eines vorgegebenen modifizierten Oligomers
gegeben, um eine 4 χ 4-Anordnung von immobilisierter DNA zu erzeugen, wobei ein hierin beschriebenes Stiftwerkzeug ver-
- DE 197 82G86T1
wendet wurde (siehe ζ. B. die Ausführliche Beschreibung und das hierin angegebene Beispiel 4).
So wurde, wie in Fig. 14 dargestellt, in jeder der 16 separaten Kavitäten von den 256 Kavitäten auf dem Silicium-Wafer
eines der modifizierten Oligomere 1-3 !covalent immobilisiert,
wodurch eine 4 χ 4-Anordnung von immobilisierter DNA erzeugt wurde. Zum Beispiel wurde das Oligomer 1 in einer Kavitätenposition
in der oberen linken Ecke der 4 χ 4-Anordnung konjugiert, und das Oligomer 2 wurde in der benachbarten Position
konjugiert, und so weiter. Fig. 14 zeigt eine Darstellung der vollständigen Anordnung.
Beim Ausführen der Hybridisierungsreaktion wurden die drei komplementären Oligonucleotide und das Oligonucleotid für
die negative Kontrolle in einer Endkonzentration von 10 mM jedes
Oligonucleotids in 1 ml TE-Puffer [10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA] vermischt, mit 1 M NaCl ergänzt, und die Lösung
wurde 10 min auf 650C erhitzt. Unmittelbar danach wurde die
gesamte Oberfläche des Silicium-Wafers mit 800 μΐ der erwärmten
Oligonucleotidlösung überspült. Die komplementären Oligonucleotide
wurden an die immobilisierten Oligomere angelagert, indem die Silicium-Anordnung 1 Stunde bei Umgebungstemperatur
inkubiert und anschließend mindestens 10 Minuten bei 40C inkubiert
wurde. Alternativ kann die Oligonucleotidlösung dem Wafer zugesetzt werden, den man dann erhitzt und zum Hybridisieren
abkühlen läßt. Fig. 15 zeigt eine Darstellung der komplementären Oligonucleotide, die an die in jeder Position kovalent
immobilisierten spezifischen Oligomere angelagert sind.
Die hybridisierte Anordnung wurde dann zum Kationenaustausch mit einer Lösung von 50 mM Ammoniumeitratpuffer gewasehen,
um Natrium- und Kalium-Ionen aus der DNA-Hauptkette zu
entfernen (Pieles, U. et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191-3196).
Ein 6 nl-Aliquot einer Matrixlösung von 3-Hydroxypicolinsäure
[0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure - 10% Ammoniumeitrat in 50% Acetonitril; siehe Wu et al. Rapid Commun. Mass. Spectrom.
7: 142-146] wurde unter Verwendung der hier beschriebenen piezoelektrischen
Pipette in jede Position der Anordnung gegeben. Die Lösung ließ man bei Umgebungstemperatur trocknen,
und danach wurde mit einer piezoelektrischen Pipette ein 6 nl-
-DE 197 82 036 T1
Aliquot Wasser in jede Position gegeben, um den getrockneten
Matrix-DNA-Komplex zu resuspendieren, so daß nach dem Trocknen bei Umgebungstemperatur der Matrix-DNA-Komplex an der Bodenfläche
jeder Position eine gleichmäßige kristalline Oberfläche bildet.
Die MALDI-TOF MS-Analyse wurde der Reihe nach in jeder der 16 Positionen der in Fig. 15 dargestellten Hybridisierungsanordnung
ausgeführt/ wie im wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende Massenspektrum der Oligonucleotide,
die spezifisch an jede der 16 Positionen der DNA-Hybridisierungsanordnung
hybridisiert waren, ist in Fig. 16 dargestellt. Das Massenspektrum zeigte ein spezifisches Signal
in jeder Position, welches das beobachtete experimentelle Masse-Ladungs-Verhältnis
darstellt, das der spezifischen komplementären Nucleotidsequenz entspricht.
Zum Beispiel zeigte das Massenspektrum in den Positionen, an die nur das Oligomer 1 konjugiert ist, ein vorherrsehendes
Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 7072,4, das annähernd gleich dem des
23-mers ist; das theoretische Masse-Ladungs-Verhältnis des 23-mers
ist gleich 7072,6 Da. Entsprechend wurde die spezifische Hybridisierung des 12-mer-Oligonucleotids an die Anordnung,
mit einem beobachteten experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 3618,33 Da (theoretisch 3622,4 Da) nur in den
mit dem Oligomer 2 konjugierten Positionen nachgewiesen, während die spezifische Hybridisierung von MJM6 (beobachtetes experimentelles
Masse-Ladungs-Verhältnis von 6415,4) nur in den mit dem Oligomer 3 (theoretisch 6407,2 Da) konjugierten Positionen
nachgewiesen wurde.
Keine der Positionen der Anordnung wies ein Signal auf, das dem 29-mer-Oligonucleotid zur negativen Kontrolle (theoretisches
Masse-Ladungs-Verhältnis 8974,8) entspricht, was darauf schließen läßt, daß spezifische DNA-Zielmoleküle mit Oligomeren
hybridisiert werden können, die kovalent in spezifischen Positionen auf der Oberfläche der Silicium-Anordnung im-
DE 197 82 036 T1
mobilisiert 'sind, und daß mehrere Hybridisierungstests individuell
mittels MALDI-TOF MS-Analyse überwacht werden können.
(b) 8 χ 8-Änordnung (64 Positionen)
Ein Silicium-Wafer von 2 χ 2 cm mit 256 einzelnen Vertiefungen
oder Kavitäten die eine 16 χ 16-Kavitätenanordnung
bilden, wurde von einem kommerziellen Lieferanten bezogen [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Die Kavi-
2
täten hatten Abmessungen von 800 χ 800 μτα , 120 μπι Tiefe, in einem Abstand von 1,125 mm. Der Silicium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, wodurch auf der Oberfläche lodacetamido-Funktionalitäten entstanden [siehe z. B. Fig. 7].
täten hatten Abmessungen von 800 χ 800 μτα , 120 μπι Tiefe, in einem Abstand von 1,125 mm. Der Silicium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, wodurch auf der Oberfläche lodacetamido-Funktionalitäten entstanden [siehe z. B. Fig. 7].
Im Anschluß an die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung einer DNA-Anordnung von 16 Positionen wurden die
Oligomere 1-3 in 64 Positionen immobilisiert, die auf dem Silicium-Wafer mit 256 Positionen eine 8 χ 8-Anordnung bildeten,
mit komplementären Oligonucleotiden hybridisiert und mittels MALDI-TOF MS-Analyse analysiert. Fig. 17 zeigt das Massenspektrum
der DNA-Anordnung von 64 Positionen, die der Reihe nach mittels MALDI-TOF-Analyse analysiert wurden. Wie für die Anordnung
von 16 Positionen dargestellt, wurde in jeder Position der DNA-Anordnung eine spezifische Hybridisierung des komplementären
Oligonucleotids an jedes der immobilisierten thiolhaltigen Oligonucleotide beobachtet.
Verlängerung von hybridisierten DNA-Primern, die an DNA-Matrizen gebunden sind, welche auf einem Silicium-Wafer immo
bilisiert sind
Die SIAB-derivatisierten Silicium-Wafer können auch für
Primer-Verlängerungsreaktionen der immobilisierten DNA-Matrize verwendet werden, wobei die im wesentlichen in der US-Patentschrift
Nr. 5 605 7 98 beschriebenen Verfahren angewandt werden.
- 93 - D E 197 82 086 T1
Wie in Fig. 18 dargestellt, wurde ein 27-mer-Oligonucleotid
[Seq.-ID-Nr.: 11], das eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt,
mit einem SIAB-derivatisierten' Silicium-Wafer verbunden,
wie oben z. B. in Beispiel 1 beschrieben. Ein 12-mer-5
Oligonucleotid-Primer [Seq.-ID-Nr.: 12] wurde an das immobilisierte
Oligonucleotid hybridisiert, und der Primer wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits [z. B. Sequenase
oder ThermoSequenase, U.S. Biochemical Corp.] verlängert. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder ThermoSequenase-DNA-Polymerase
in Gegenwart von drei Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP) und von Didesoxyribonucleosidthymidintriphosphat
(ddTTP) in Puffer entsprechend den vom Hersteller gegebenen Anweisungen führte zu einer 3-Basen-Verlängerung
des 12-mer-Primers, der immer noch an den Silicium-Wafer gebunden war. Der Wafer wurde dann mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
analysiert, wie oben beschrieben. Wie in Fig. 18 dargestellt, unterscheiden die Ergebnisse des Massenspektrums
klar das 15-mer [Seq.-ID-Nr. : 13] von dem ursprünglichen, nicht verlängerten 12-mer, und lassen folglich darauf
schließen, daß auf der Oberfläche eines Silicium-Wafers eine spezifische Verlängerung ausgeführt und mittels MALDI-TOF MS-Analyse
nachgewiesen werden kann.
Effekt der Linker-Länge auf die Polymerase-Verlängerung von
hybridisierten DNA-Primern, die an DNA-Matrizen gebunden sind, welche auf einem Silicium-Wafer immobilisiert sind
Es wurden der Effekt des Abstands zwischen der SIAB-konjugierten
Siliciumoberflache und der Doppelstrang-DNA, die durch Hybridisieren der Ziel-DNA an der immobilisierten Oligomer-Matrize
gebildet wird, sowie die Auswahl des Enzyms untersucht [siehe z. B. Fig. 19].
Zwei SIAB-derivatisierte Silicium-Wafer wurden an das
3'-Ende von zwei freies Thiol enthaltenden Oligonucleotiden
konjugiert, deren DNA-Sequenz mit Ausnahme einer am 3'-Ende
eingebauten 3-Basen-Poly-dT-Spacersequenz identisch war [Seq.-ID-Nrn.:
8 & H]. Diese beiden Oligonucleotide wurden synthetisiert, und jedes wurde separat über das SIAB-Vernetzungsmit-
tel an der' Oberfläche eines Silicium-Wafers immobilisiert
[siehe ζ. B. Fig. 7] . Jeder Wafer wurde durch Denaturieren bei 75°C und langsames Abkühlen des Silicium-Wafers mit einem 12-mer-Oligonucleotid
[Seq.-ID-Nrn. : 12, 14 und 15], das zu Abschnitten der beiden Oligonucleotiden gemeinsamen Nucleotidsequenzen
komplementär ist, inkubiert. Die Wafer wurden dann, wie oben beschrieben, mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
analysiert.
Wie früher in Fig. 18 gezeigt, wurde eine spezifische 3-Basen-Verlängerung des gebundenen 12-mer-Oligonucleotids unter
Verwendung des Oligomer-Primers beobachtet, wobei zwischen dem Doppelstrang und der Oberfläche ein 9-Basen-Spacer auftritt
[Seq.-ID-Nr.: 12]. Wie in Fig. 19 dargestellt, wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn die DNA-Spacer-Längen
zwischen der SIAB-Komponente und dem DNA-Doppelstrang 0, 3, 6
und 12 Basen betrugen. Die Ergebnisse der massenspektrometrischen MALDI-TOF-Analyse der Wafer sind in Fig. 20 dargestellt.
Außerdem zeigt Fig. 19 auch, daß die Verlängerungsreaktion unter Verwendung der verschiedensten DNA-Polymerasen ausgeführt
werden kann. So kann der SIAB-Linker direkt mit der DNA-Matrize verbunden werden oder kann eine Linker-Sequenz aufweisen,
ohne eine Primer-Verlängerung der hybridisierten DNA zu bewirken.
Nachweis von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen mittels
Strangverdrängung und Hybridisieren einer immobilisierten komplementären Nucleinsäure
Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisierung eines 24-mer-Primers und die spezifische Hybridisierung eines
Strangs eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, wodurch die Amplifikation eines ausgewählten Zielmoleküls in der Lösungsphase
und der Nachweis des Doppelstrangmoleküls ermöglicht werden.
Ein 24-mer-DNA-Primer CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT [Seq.-ID-Nr.: 8], der eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt, wurde an
einen SIAB-derivatisierten Silicium-Wafer gebunden, wie im we-
sentlicheh in Fig. 7 skizziert und in den Beispielen 1 und 2
beschrieben.
Ein synthetischer 18-mer-Primer 5'-CTGATGCGTCGGATCATc-3'
[Seq.-ID-Nr.: 16] wurde mit einem 12-mer-Oligonucleotid 5'-GATGATCCGACG-3'
[Seq.-ID-Nr.: 12] vorgemischt, das eine zum 12-Basen-Abschnitt des 18-mer-Oligonucleotids komplementäre
Sequenz aufweist. Das Oligonucleotid-Gemisch wurde auf 750C
erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Bildung eines Doppelstrangmoleküls zu erleichtern:
5I-CTGATGCGTCGGATCATC-3I [Seq.-ID-Nr.: 16]
5I-CTGATGCGTCGGATCATC-3I [Seq.-ID-Nr.: 16]
3'-GCAGCCTAGTAG-S' [Seq.-ID-Nr.: 12]
Die spezifische Hybridisierung des 12-mer-Strangs des
Doppelstrangmoleküls an den immobilisierten 24-mer-Primer wurde durch Mischen von ΙμΜ des Doppelstrangmoleküls unter Anwendung
der in Beispiel 6 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen ausgeführt.
Die Wafer wurden mittels Massenspektrometrie analysiert,
wie oben beschrieben. In einem Massenspektrum des 12-mers wurde eine spezifische Hybridisierung mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis
von 3682,78 Da nachgewiesen.
1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan
3-Brom-l-propanol (3,34 g, 24 mmol) wurde in 80 ml wasserfreiem
Acetonitril mit 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd (3,34 g, 20 mmol), K2CO3 (3,5 g) und KI (100 mg) über Nacht (15 h)
unter Rückflußkühlung erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und es wurden 150 ml Methylenchlorid
zugesetzt. Das Gemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die kombinierte organische
Lösung wurde bis zur Trockne eingedampft und in 100 ml Methylenchlorid wiederaufgelöst. Die entstehende Lösung
wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat
getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 4,31 g (96%) des gewünschten Produkts.
Rf = 0,33 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Rf = 0,33 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
DE 19? 8Z 096 Tl
UV (Methanol), Maximum: 313, 240 (Schulter)", 215 nm; Minimum:
266 nm
1H NMR (DMSOd6) δ 10,28 (s, IH), 8,17 (d, IH), 7,35 (d, IH),
7,22 (s, IH), 4,22(t, 2H), 3,54 (t, 2H), 1,90 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,9, 153,0, 141,6, 134,3, 127,3, 118,4, 114,0, 66,2, 56,9, 31,7.
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,9, 153,0, 141,6, 134,3, 127,3, 118,4, 114,0, 66,2, 56,9, 31,7.
B. 2-Nitro-5-(3-Q-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd
2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd (1 g, 4,44 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Dieser
Lösung wurden 1 ml Triethylamin, 200 mg Imidazol und 0,8 g (5,3 mmol) tBDMSCI zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur
gerührt. Zum Anhalten der Reaktion wurde Methanol (1 ml) zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt,
und der feste Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid wiederaufgelöst. Die entstandene Lösung wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung
und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde mit Methylenchlorid durch eine schnelle Silicagelsäule geschickt
und ergab 1,44 g (96%) 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd.
Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm; Minimum: 235, 267 nm 1K NMR (DMSO-d6) δ 10,28 (s, IH), 8,14 (d, IH), 7,32 (d, IH),
7,20 (s, IH), 4,20(t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85
(s, 9H), 0,02 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2, 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5,, -3,1, -5,7.
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2, 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5,, -3,1, -5,7.
C. 1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)-phenyl)ethanol
Im Hochvakuum getrockneter 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd
(1,02 g, 3 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid aufgelöst. 2 M Trimethylaluminium
in Toluol (3 ml) wurden innerhalb von 10 min tropfenweise zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtempe-
DE 197 82 086 T1
ratur gehalten. Es wurde weiter 10 min gerührt, und das Gemisch wurde in 10 ml eisgekühltes Wasser gegossen. Die Emulsion
wurde von der Wasserphase getrennt und über 100 g Natriumsulfat getrocknet, um das restliche Wasser zu entfernen. Das
Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und das Gemisch wurde in eine Silicagelsäule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid
eingebracht. 0,94 g (86%) des gewünschten Produkts wurden isoliert.
Rf = 0,375 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm; Minimum: 255, 220
nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8.00 (d, IH), 7,36 (s, IH), 7,00 (d, IH),
1H NMR (DMSO-d6) δ 8.00 (d, IH), 7,36 (s, IH), 7,00 (d, IH),
5.49 (b, OH), 5,31 (q, IH), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95
(m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5,
64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
1-(2-Nitro-5- (3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)-
ethanol (0,89 g, 2,5 mmol) wurde in 30 ml THF aufgelöst, und
0,5 mmol nBu4NF wurden unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch
wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde in
eine Silicagelsäule mit einem Methanol-Gradienten in Methylen-Chlorid
eingebracht. Man erhielt 0,6 g (99%) 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol.
Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol), 95/5).
Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol), 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm; Minimum: 255, 219 nm.
1H NMR (DMSO-dg) δ 8.00 (d, IH), 7,33 (s, IH), 7,00 (d, IH),
5.50 (d, OH), 5,28(t, OH), 4,59 (t, IH), 4,17 (t, 2H), 3,57
(m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6,
65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
35
35
DE 197 82 036 T1
phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,482 g,
2mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal eingedampft
und in 20 ml wasserfreiem Pyridin wiederaufgelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad abgekühlt, und es wurden 7 50 mg
(2,2 mmol) DMTCl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion
wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol
zweimal eingedampft, um Pyridinspuren zu entfernen. Der Endrückstand wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient
in Methylenchlorid eingebracht, das Tropfen von Triethylamin enthielt, und ergab 0,96 g (89%) des gewünschten Produkts
1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-ethanol.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter),
233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8.00 (d, IH), 6,82-7,42 (ArH), 5,52 (d,
OH), 5,32(111, IH), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H),
2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 162,5, 157,9, 157,7, 146,2, 144,9, 140,1,,
139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
F. 1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl) -1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)-ethan
1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-ethanol
(400 mg, 0,74 mmol) wurde im Hochvakuum getrocknet und in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid aufgelöst. Dieser Lösung
wurden 0,5 ml N, N-Diisopropylethylamin und 0,3 ml (1,34 mmol)
2-Cyanethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und
zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen
und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und eine schnelle Silicagelsäule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin
enthielt, lieferte 510 mg (93%) des gewünschten Phosphoramidits.
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)diisopropylaminophosphin)ethan
Ä. 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
3-Brom-l-propanol (53 ml, 33 irunol) wurde in 100 ml wasserfreiem
Acetonitril mit 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (5 g, 30 mmol), K2CO3 (5 g) und KI (300 mg) über Nacht (15 h) unter
Rückflußkühlung erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde dem Reaktionsgemisch Methylenchlorid (150 ml) zugesetzt.
Das Gemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte organische Lösung
wurde bis zur Trockne eingedampft und in 100 ml Methylenchlorid wiederaufgelöst. Die entstandene Lösung wurde mit gesättigter
NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man
6,5 g (96,4%) des gewünschten Produkts.
Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 273, 277, 210 nm; Minimum: 291,
244, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) 5 7,64 (d, IH), 7,46 (s, IH), 7,0.4 (d, IH),
4,58 (b, OH), 4,12(t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5,
110,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9/ 26,3.
B. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon·
4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6 mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Diesem Gemisch wurden 6 ml Triethylamin und 6 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt. Nach 4 h wurden 6 ml Methanol zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan aufgelöst, und die Lö-
4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6 mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Diesem Gemisch wurden 6 ml Triethylamin und 6 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt. Nach 4 h wurden 6 ml Methanol zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan aufgelöst, und die Lö-
sung wurde niit verdünnter Natriumbicarbonatlösung und dann mit
Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der feste
Rückstand wurde in eine Silcagelsäule mit Methylenchlorid eingebracht und ergab 4,1 g 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
(98, 6%) .
Rf = 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nra; Minimum: 290,
243, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,62 (d, IH), 7,45 (s, IH), 7,08 (d, IH),
4,12 (m, 4H), 3,82(s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00
(s, 3H) .
13C NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0,
111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
C. 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy^-nitroacetophenon
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15 mmol) wurden portionsweise 15 ml 70%ige HNO3 im Wasserbad zugesetzt, und die Reaktionstemperatur wurde auf Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und 30 g zerkleinertes Eis wurde zugegeben. Dieses Gemisch wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert, und die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht und ergab 3,8 g (81,5%) des gewünschten Produkts 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitroacetophenon und 0,38 g (8%) des selbstsubstituierten Produkts 5-(3-Acetoxypropoxy)-4-methoxy-l,2-dinitrobenzol.
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15 mmol) wurden portionsweise 15 ml 70%ige HNO3 im Wasserbad zugesetzt, und die Reaktionstemperatur wurde auf Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und 30 g zerkleinertes Eis wurde zugegeben. Dieses Gemisch wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert, und die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht und ergab 3,8 g (81,5%) des gewünschten Produkts 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitroacetophenon und 0,38 g (8%) des selbstsubstituierten Produkts 5-(3-Acetoxypropoxy)-4-methoxy-l,2-dinitrobenzol.
Selbstsubstituiertes Nebenprodukt: 5-(3-Acetoxypropoxy) -4-methoxy-l,2-dinitrobenzol:
Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum:
Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum:
310, 282, 263, 223 nm.
1H NMR (CDCI3) δ 7,36 (s, IH), 7,34 (s, IH), 4,28 (t, 2H),
4,18 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
DE 197 82 086 Tl
C NMR (CDCl3) δ 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9,
107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Gewünschtes Produkt 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitroacetophenon:
Rf = 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Rf = 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
1H NMR (CDCl3) δ 7,62 (s, IH), 6,74 (s, IH), 4,28 (t, 2H),
4,20 (t, 2H), 3,96(s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H) .
13C NMR (CDCl3) δ 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0,
108,8, 108,0, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
ethanol
4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitroacetophenon (3,73
g, 12 mmol) wurden 150 ml Ethanol und 6,5 g K2CO3 zugesetzt.
Das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt, und TLC mit 5% Methanol in Dichlormethan zeigte die Beendigung der Reaktion
an. Diesem gleichen Reaktionsgemisch wurden 3,5 g NaBH4 zugesetzt,
und das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Aceton (10 ml) wurde zugesetzt, um mit dem restlichen NaBH4 zu
reagieren. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 50 g Silicagel aufgenommen. Das Silicagel-Gemisch
wurde mit 5% Methanol in Methylenchlorid von oben in eine Silicagelsäule gegeben und lieferte 3,15 g (97%) des gewünschten
Produkts 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol.
Zwischenprodukt 4- (3-Hydroxypropoxy)-S-methoxy-e-nitroacetophenon nach Entfernung der Schutzgruppe:
Rf = 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Zwischenprodukt 4- (3-Hydroxypropoxy)-S-methoxy-e-nitroacetophenon nach Entfernung der Schutzgruppe:
Rf = 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Endprodukt 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-ethanol:
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol·, 95/5).
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol·, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317, 264, 233 nm.
1H NMR (DMSÖ-d6) δ 7,54 (s, IH), 7,36 (s, IH), 5,47 (d, OH),
5,27 (m, IH), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55
(q, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) 5 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1,
68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
nitrophenyl)ethanol
1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitrophenyl)ethanol (0,325 g, 1,2 mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal eingedampft und in 15 ml wasserfreiem Pyridin aufgelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad abgekühlt, und es wurden 450 mg (1,33 mol) DMTCl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol zweimal eingedampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der Endrückstand wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht, das Tropfen von Triethylamin enthielt, und ergab 605 mg (88%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitrophenyl)ethanol (0,325 g, 1,2 mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal eingedampft und in 15 ml wasserfreiem Pyridin aufgelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad abgekühlt, und es wurden 450 mg (1,33 mol) DMTCl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol zweimal eingedampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der Endrückstand wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht, das Tropfen von Triethylamin enthielt, und ergab 605 mg (88%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,54 (s, IH), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH),
5,27 (m, IH), 4,16 (t, 2H), 3,85( s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) 6 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 12,7,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
13C NMR (DMSO-d6) 6 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 12,7,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan
1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-S-methoxy-ö-nitrophenyl)ethanol
(200 mg, 3,5 mmol) wurde unter Hochvakuum getrocknet und in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid aufge-
löst. Dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,2 ml (0,89 mmol) 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5
ml Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung
gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und eine
schnelle Silicagelsäule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, lieferte 247 mg (91,3%)
des gewünschten Phosphoramidits 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan.
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Oligonucleotid-Synthese
Die Oligonucleotid-Konjugate, die einen photospaltbaren
Linker enthielten, wurden durch Festphasen-Nucleinsäuresynthese (siehe: Sinha et al. Tetrahedron Lett. (1983) 24, 5843-5846;
Sinha et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12, 4539-4557; Beaucage et al., Tetrahedron (1993) 49, 6123-6194; und Matteucci
et al., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103, 3185-3191) unter
Standardbedingungen hergestellt. Außerdem wurde eine längere KopplungsZeitspanne für den Einbau der photospaltbaren Einheit
und der 5'-terminalen Aminogruppe verwendet. Die Kopplungsausbeute
wurde durch Messen des Absorptionsvermögens des freigesetzten DMT-Kations nachgewiesen, und die Ergebnisse zeigten
eine Kopplungsausbeute von Phosphoramidit 1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytrxtylpropoxy)phenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan
oder 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-ö-nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diiso-
propylaminophosphin)ethan an, die mit der von gewöhnlichen
Nucleosid-Phosphoramiditen vergleichbar war. Die Entfernung des Basenschutzes und die Freisetzung der Konjugate vom festen
Träger wurde über Nacht bei 55°C mit konzentriertem Ammonium ausgeführt. Die Entfernung des Basenschutzes anderer Konjugate
erfolgte durch schnelle Schutzentfernung mit AMA-Reagenzien. Die Reinigung der MMT-on-Konjugate erfolgte durch HPLC (Tri-
.DE 13782 086 Π
tyl-on) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH
7,0, und eines Acetonitril-Gradienten (5% bis 25% in 20 Minuten) . Das gesammelte MMT- oder DMT-geschützte Konjugat wurde
volumenreduziert, mit 80%iger wäßriger Essigsäure (40 min, 00C) detrityliert, entsalzt, bei -200C gelagert.
In einem typischen Fall wurden 2 nmol Oligonucleotid-Konjugat,
das photospaltbaren Linker enthielt in 200 μΐ destilliertem
Wasser mit einer langwelligen UV-Lampe (Blak Ray XX-15 UV-Lampe, Ultraviolet Products, San Gabriel, CA) aus einer
Entfernung von 10 cm bestrahlt (Emissionsmaximum 3 65 nm,
Intensität der Lampe = 1,1 mW/cm in einem Abstand von 31 cm) . Das entstehende Gemisch wurde durch HPLC (Trityl-off) unter
Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, und eines Acetonitril-Gradienten analysiert. Die Analyse zeigte, daß das
Konjugat bei UV-Bestrahlung innerhalb von Minuten vom Linker abgespalten wurde.
Der Fachmann wird erkennen oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten zahlreiche Äquivalente für
die hier beschriebenen spezifischen Verfahren feststellen können. Derartige Äquivalente sind als innerhalb des Schutzumfangs
der vorliegenden Erfindung liegend anzusehen und sind durch die folgenden Patentansprüche erfaßt.
105-DE 197 82 G96T1
(1) Allgemeine Informationen (i) Anmelder:
(A) Name: SEQUENOM, INC. (B) Straße: 11555 Sorrento Valley Road
(C) Stadt: San Diego
(D) Staat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 92121 (i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Maryanne J. O'Donneil
(B) Straße: 3855 Nobel Drive
(C) Stadt: San Diego
(D) Staat: Kalifornien (E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 92122 (i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Charles A. Cantor
(B) Straße: 11 Bay State Road (C) Stadt: Boston
(D) Staat: Massachusetts
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 02215 (i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Daniel P. Little
(B) Straße: 393 Glendale Lake Rd.
(C) Stadt: Patton
(D) Staat: Pennsylvania
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 18668
(i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Hubert Köster
(B) Straße: 8636 Via Mallorca Drive
(C) Stadt: La Jolla
(D) Staat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 92037
- DE 197 82 0S6 Tl
(il) ' Titel der Erfindung: Verfahren zu Immobilisierung
von Nucleinsäuren in hoher Dichte und Systeme und Methoden zur Herstellung und Analyse von Analyten-Anordnungselementen
mit geringem Volumen
(iü) Anzahl der Sequenzen: 15 (iv) Korrespondenzadresse:
(iü) Anzahl der Sequenzen: 15 (iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Brown, Martin, Haller & McClain
(B) Straße: 1660 Union Street
(C) Stadt: San Diego (D) Staat: CA
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 92102-2926 (v) Computerlesbare Form:
(A) Datenträgertyp: Diskette (B) Computer: IBM-kompatibel
(C) Betriebssystem: DOS
(D) Software: keine
(vi) Gegenwärtige Anmeldedaten:
(A) Anmeldungsnummer: Anwalts-Listennummer 7352-2001PC
(B) Einreichungsdatum: 06. November 1997
(C) Klassifikation: (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: Anwalts-Listennummer
7352-2001B
(B) Einreichungsdatum: 08. Oktober 1997
(C) Klassifikation: (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 08/746
(B) Einreichungsdatum: 06.11.96 (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 08/786
(B) Einreichungsdatum: 23.01.97 (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 08/787
(B) Einreichungsdatum: 23.01.97 (viii) Informationen über Anwalt/Agenten:
(A) Name: Seidman, Stephanie L.
(B) Registriernummer: 33
(C) Referenz-/Listennummer: 7352-2001PC (ix) Telekommunikations-Informationen:
(A) Telefon: 619-238-0999
(B) Telefax: 619-238-0062
(C) Telex:
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 1: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 1: GAATTCGAGC TCGGTACCCG G
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 2: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.:2:
CCGGGTACCG AGCTCGAATT C
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 3: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
DE 197 82 036 Tl
(C) Strangform: unbekannt
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (ν) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 3: CCTCTTGGGA ACTGTGTAGT ATT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 4: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 112 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure (C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 4:
AGGCTGTCTC TCTCCCTCTC TCATACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACA-CACAC
ACACACACAC TCACACTCAC CCACANNNAA ATACTACACA GTTCCCAAGA GG
112
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 5: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 49 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(χι)' Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 5:
TAATACGACT CACTATAGGG CGAAGGCTGT CTCTCTCCCT CTCTCATAC 4
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 6:
(i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 135 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.:
TAATACGACT CACTATAGGG CGAAGGCTGT CTCTCTCCCT CTCTCATACA CACACA-CACA
CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACTCACACT CACCCACANN NAAA-TACTAC ACAGTTCCCA AGAGG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 7: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 7: AATACTACAC AG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 8: (i) Sequenzeigenschaften:
-110- DE 197 82 036 T1
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangforra: unbekannt
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 8: CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 9: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iü) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 9: GATGATCCGA CGCATCAGAA TGT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 10: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 29 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: unbekannt
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
- Ill -
(x'i)' Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 10: GATCTAGCTG GGCCGAGCTA GGCCGTTGA
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 11:
(i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 27 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 11: CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTTTTT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 12: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: GATGATCCGA CG *
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 13: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (ν) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 13: GATGATCCGA CGCAT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 14: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: AAAAAAGATG AT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 15: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: GATCCGACGC AT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 16: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel- '
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 16: CTGATGCGTC GGATCATC
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 17: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 17: GCCTGGTACA CTGCCAGGCG CTTCTGCAGG TCATCGGCAT CGCGGAGGAG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 18: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare"
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: "Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 18: GCCTGGTACA CTGCCAGGCA CTTCTGCAGG TCATCGGCAT CGCGGAGGAG
-114- DE 19782 036 Tl
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 19: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 19: GATGCCGATG ACCTGCAGAA G
Claims (121)
1. Verfahren umfassend
Reaktion einer thiolhaltigen Nucleinsäure mit einem unlöslichen Träger, der eine thiolreaktive Gruppe aufweist, unter
solchen Bedingungen, daß eine kovalente Bindung entsteht; und
dadurch Immobilisieren der Nucleinsäure auf dem unlöslichen Träger.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion bei einer Temperatur zwischen etwa 25°C und etwa 1000C ausgeführt
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den Schritt der Reaktion eines unlöslichen Trägers mit dem thiolreaktiven
Vernetzungsmittel zur Bildung eines thiolreaktiven festen Träger umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das thiolreaktive Vernetzungsmittel N-Succinimidyl(4-iodacetyl) aminobenzoat
(SIAB) ist.
5. Verfahren zum Immobilisieren einer Nucleinsäure auf einem unlöslichen Träger, wobei das Verfahren umfaßt:
Reaktion eines thiolhaltigen unlöslichen Trägers mit einer Nucleinsäure, die eine thiolreaktive Gruppe aufweist,
unter solchen Bedingungen, daß eine kovalente Bindung entsteht;
dadurch Immobilisieren der Nucleinsäure auf dem unlöslichen
Träger.
6. Verfahren nach Anspruch 5, das ferner den Schritt der Modifikation des unlöslichen Trägers mit einem thiolreaktiven
Reagens zur Bildung eines thiolhaltigen unlöslichen Trägers umfaßt.
7. Unlöslicher Träger mit Nucleinsäuren, wobei die Nucleinsäuren durch mindestens ein Schwefelatom kovalent an
eine Oberfläche des unlöslichen Trägers gebunden sind.
DE 197 82 G86T1
8. Unlöslicher Träger mit Nucleinsäuren, wobei die
2
Nucleinsäuren in einer Dichte von mindestens 20 fmol/mm kovalent an eine Oberfläche des unlöslichen Trägers gebunden sind.
Nucleinsäuren in einer Dichte von mindestens 20 fmol/mm kovalent an eine Oberfläche des unlöslichen Trägers gebunden sind.
9. Kit mit i) einem thiolhaltigen Vernetzungsmittel und ii) einem oberflächenmodifizierenden Reagens zur Modifikation
einer Oberfläche mit einer Funktionalität, die mit dem thiolhaltigen Vernetzungsmittel reagieren kann.
10. Kit nach Anspruch 9, wobei das oberflächenmodifizierende Reagens keine Thiolkomponente aufweist.
11. Kit nach Anspruch 9, der ferner einen unlöslichen Träger mit einer Oberfläche aufweist, die mit dem oberflächenmodifizierenden
Reagens reaktionsfähig ist.
12. Kit, der ein Reagens zum Modifizieren der Oberfläche
eines Trägers mit einer Thiolkomponente sowie ein thiolreaktives Vernetzungsmittel aufweist, das mit einer Thiolkomponente
eines Trägers reagieren kann.
13. Verfahren zum Ausbilden einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer Oberfläche eines Substrats, das umfaßt:
Inkontaktbringen von thiolhaltigen Nucleinsäuren mit der Oberfläche eines unlöslichen Trägers, der thiolreaktive
Gruppen enthält, die in Positionen in einer geordneten Anordnung auf der Oberfläche des Trägers angeordnet sind, wodurch
auf der Substratoberfläche eine Nucleinsäure-Anordnung gebildet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die thiolreaktiven Gruppen auf der Trägeroberfläche durch ein Verfahren erzeugt
werden, das die folgenden Schritte umfaßt:
Bereitstellen einer Vesikel oder einer Vesikelanordnung
zur Übertragung von Fluiden,
Anordnen der Vesikel oder einer Vesikelanordnung angrenzend
an eine erste Position bzw. Positionen auf der Substratoberfläche,
Steuern der Vesikel oder einer Vesikelanordnung zur Abgäbe
eines Fluidvolumens in die erste Position bzw. erste Positionen auf der Substratoberfläche, und
/ι Λ 8
Bewegen der Vesikel zu einer Gruppe von Positionen auf dem Substrat und Abgabe von Fluid in jeder Position der Gruppe,
wobei
das Fluid Lösungen enthält, die bei der Erzeugung thiolhaltiger Gruppen verwendet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei
die Lösungen eine erste Lösung, die 3-Aminopropyltriethoxysilan
zur Erzeugung von primären Aminen in Gruppenpositionen auf der Oberfläche des Substrats enthält, und eine
zweite Lösung aufweisen, die N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB) zum Derivatisieren der Substratoberfläche mit Iodacetamido-Funktionalitäten in den Gruppenpositionen enthält,
und
wobei das Verfahren wiederholt wird, so daß die erste Lösung separat zuerst in jede Position der Positionsgruppe abgegeben
wird und anschließend die zweite Lösung separat in jede Position der Positionsgruppe abgegeben wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die thiolhaltigen
Nucleinsäuren nach einem Verfahren mit den folgenden Schritten in den Gruppenpositionen mit der Oberfläche des unlöslichen
Trägers in Kontakt gebracht werden:
Bereitstellen einer Vesikel, die sich zur Übertragung von Fluiden eignet,
Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Substratoberfläche,
Steuern der Vesikel zur Abgabe eines Fluidvolumens in die erste Position auf der Substratoberfläche, und
Bewegen der Vesikel zu der Gruppe von Positionen auf dem Substrat, und
Abgabe von Fluid in jeder Position der Gruppe, wobei
das Fluid die thiolhaltigen Nucleinsäuren enthält.
das Fluid die thiolhaltigen Nucleinsäuren enthält.
17. Verfahren zum Herstellen einer Anordnung von Nucleinsäuren auf der Oberfläche eines Substrats, umfassend:
Reaktion der Substratoberfläche mit einer Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan
zum Erzeugen einer gleichmäßigen Schicht aus primären Aminen auf der Substratoberfläche,
Derivatisieren der Substratoberfläche mit Iodacetamido-Funktionalitäten
durch Reaktion der gleichmäßigen Schicht aus
//5
- 3*8 -
DE 197 82 086T1
primären Aminen mit einer Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB), und
Inkontaktbringen einer Gruppe von Positionen auf dem
Substrat mit thiolhaltiger Nucleinsäure, wodurch die thiolhaltige Nucleinsäure auf der Oberfläche des Substrats in jeder
Position der Gruppe immobilisiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die thiolhaltigen Nucleinsäuren mit der Gruppe von Positionen auf dem Substrat
nach einem Verfahren in Kontakt gebracht werden, das umfaßt:
Bereitstellen einer Vesikel oder einer Vesikelanordnung zur Übertragung von Fluiden,
Anordnen der Vesikel oder der Vesikelanordnung angrenzend an eine erste Position bzw. Positionen auf der Substratoberfläche,
Steuern der Vesikel oder der Vesikelanordnung zur Abgabe eines Fluidvolumens in die erste Position bzw. Positionen
auf der Substratoberfläche, und
Bewegen der Vesikel oder der Vesikelanordnung zu den
Gruppenpositionen und
Abgabe von Fluid in jeder Position der Gruppe,
Abgabe von Fluid in jeder Position der Gruppe,
wobei das Fluid eine thiolhaltige Nucleinsäure enthält.
19. Anordnung von Nucleinsäuren, die durch das Verfahren nach Anspruch 13 erzeugt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Prozeß vor dem Immobilisieren umfaßt:
Amplifikation der Nucleinsäure in einer Reaktion, in der ein Oligonucleotid-Starter eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung
enthält;
Reduktion der 3'- oder 5'-Disulfidbindung eines Stranges
der amplifizierten Nucleinsäure, um eine thiolhaltige Nucleinsäure zu erzeugen.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Immobilisieren ausgeführt wird durch:
Reaktion der Oberfläche des unlöslichen Trägers mit einer Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan, um auf der Oberfläche
des unlöslichen Trägers eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen,
StZO
DE 19782 G86T1
Derivatisieren der Oberfläche des unlöslichen Trägers mit Iodacetamido-Funktionalitäten durch Reaktion der gleichmäßigen
Schicht aus primären Aminen mit einer Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB), und
Inkontaktbringen der Trägeroberfläche mit dem thiolhaltigen Strang der Nucleinsäure, wodurch die thiolhaltige
Nucleinsäure durch eine kovalente Bindung zwischen der Thiolgruppe der thiolhaltigen Nucleinsäure und der Iodacetamido-Funktionalität
auf der Oberfläche des Trägers auf der Substratoberfläche immobilisiert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20, das ferner aufweist:
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die
zu einem Abschnitt der immobilisierten thiolhaltigen Nucleinsäure komplementär ist,
Zugabe eines Matrixmaterials zur Oberfläche des Substrats, wodurch die immobilisierten Hybride kristallisieren;
und
Bestimmen des Molekulargewichts der hybridisierten einzelsträngigen
Nucleinsäure mittels massenspektrometrischer Analyse, wodurch amplifizierte Zielnucleinsäuren nachgewiesen
werden.
23. Verfahren zum Nachweis von Zielnucleinsäuren, umfassend:
Reaktion der Oberfläche eines Substrats mit einer Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan zum Erzeugen einer
gleichmäßigen Schicht aus primären Aminen auf der Substratoberfläche,
Derivatisieren der Oberfläche eines Substrats mit Iodacetamido-Funktionalitäten
durch Reaktion der gleichmäßigen Schicht aus primären Aminen mit einer Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB),
Amplifikation eines oder mehrerer Zielnucleinsäurenmoleküle unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern, wobei eine
Oligonucleotid-Primerreaktion eine 31- oder 5'-Disulfidbindung
enthält,
Reduktion der 3'- oder 5'-Disulfidbindung eines Stranges
der amplifizierten Nucleinsäuresequenz, um daraus eine freie Thiolgruppe zu erzeugen,
Denaturieren der amplifizierten- Zielnucleinsäuresequenz,
Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit dem
thiolhaltigen Strang der Nucleinsäure, wodurch die thiolhaltige Nucleinsäure durch eine kovalente Bindung zwischen der
Thiolgruppe der thiolhaltigen Nucleinsäure und der an die Substratoberfläche derivatisierten Iodacetamido-Funktionalität
auf der Oberfläche des Substrats immobilisiert wird,
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die zu einem Abschnitt der immobilisierten thiolhaltigen Nucleinsäure
komplementär ist,
Zugabe eines Matrixmaterials an die Substratoberfläche, und
Bestimmen des Molekulargewichts der hybridisierten einzelsträngigen
Nucleinsäure mittels massenspektrometrischer Analyse.
24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die massenspektrometrische Analyse aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisations-Laufzeitanalyse
(MALDI-TOF-Analyse), Elektronensprüh-(ES-), Ionencyclotronresonanz-(ICR-)
und Fouriertransformations-Analyse besteht.
25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die thiolhaltigen Nucleinsäuren auf der Oberfläche des Substrats in Form einer
Anordnung immobilisiert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner umfaßt:
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die
zu einem Abschnitt der immobilisierten thiolhaltigen Nucleinsäure komplementär ist, und
Anlagern mindestens eines Nucleotids an das 3'-Ende der
hybridisierten einzelsträngigen Nucleinsäure durch Nucleinsäuresynthese,
wodurch Nucleinsäuren auf der Oberfläche synthetisiert werden.
27. Verfahren zum Synthetisieren von Nucleinsäuren auf der Oberfläche eines Trägers, umfassend die folgenden Schritte:
-VZl-
Reaktion der Trägeroberfläche mit einer Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan,
um auf der Substratoberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen,
Derivatisieren der Trägeroberfläche mit lodacetamido-Funktionalitäten
durch Reaktion der gleichmäßigen Schicht aus primären Aminen mit einer Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB),
Inkontaktbringen der Trägeroberfläche mit einem thiolhaltigen
Strang der Nucleinsäure, wodurch die thiolhaltige Nucleinsäure durch eine kovalente Bindung zwischen der
Thiolgruppe der thiolhaltigen Nucleinsäure und der auf der Oberfläche vorhandenen Iodacetamido-Funktionalität auf der
Oberfläche des Trägers immobilisiert wird,
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die
zu einem Abschnitt der immobilisierten thiolhaltigen Nucleinsäure komplementär ist, und
Anlagern mindestens eines Nucleotids an das 3'-Ende der
hybridisierten einzelsträngigen Nucleinsäure durch Nucleinsäuresynthese, wodurch auf der Oberfläche Nucleinsäuren synthetisiert
werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die immobilisierte Nucleinsäure in Form einer Anordnung auf dem Träger positioniert
ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27, das ferner aufweist: Zugabe eines oder mehrerer Didesoxynucleosidtriphosphate während
der Nucleinsäuresynthese.
30. Verfahren nach Anspruch 27, das ferner umfaßt:
Bestimmung des Molekulargewichts der synthetisierten
Bestimmung des Molekulargewichts der synthetisierten
einzelsträngigen Nucleinsäure mittels Massenspektrometrie.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die massenspektrometrische Analyse aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation, Laufzeitanalyse (MALDI-TOF-Analyse), Elektronensprüh- (ES-), Ionencyclotronresonanz-
(ICR-) und Fouriertransformations-Analyse besteht.
32. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner umfaßt:
/112
„_ DE 19? 82 0S6T1
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die zu einem Abschnitt der immobilisierten thiolhaltigen Nucleinsäure
komplementär ist;
Anlagern mindestens eines Desoxynucleotids oder Didesoxynucleotids
an das 3'-Ende der hybridisierten einzelsträngigen Nucleinsäure durch enzymatische Nucleinsäuresynthese;
Zugabe eines Matrixmaterials zur Oberfläche des Trägers, wodurch die immobilisierten Hybride kristallisieren; und
Bestimmung des Molekulargewichts der hybridisierten einzelsträngigen Nucleinsäure mittels massenspektrometrischer
Analyse, wodurch die Sequenz der Nucleinsäure auf der Oberfläche eines Trägers bestimmt wird.
33. Verfahren zum Sequenzieren einer Nucleinsäure auf der Oberfläche eines Trägers, umfassend:
Reaktion der Oberfläche des Trägers mit einer Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Herstellung einer gleichmäßigen
Schicht aus primären Aminen auf der Trägeroberfläche,
Derivatisieren der Oberfläche eines Trägers mit Iodacetamido-Funktionalitäten
durch Reaktion der gleichmäßigen Schicht aus primären Aminen mit einer Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB),
Inkontaktbringen der Trägeroberfläche mit einem thiolhaltigen
Strang der Nucleinsäure, wodurch die thiolhaltige Nucleinsäure durch eine kovalente Bindung zwischen der
Thiolgruppe der thiolhaltigen Nucleinsäure und der auf der Trägeroberfläche derivatisierten Iodacetamido-Funktionalität
auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert wird,
Hybridisieren einer einzelsträngigen Nucleinsäure, die zu einem Abschnitt der immobilisierten thiolhaltigen Nucleinsäure
komplementär ist,
Ausführen einer Nucleinsäuresynthese in Gegenwart eines
oder mehrerer Didesoxynucleotide, wobei mindestens ein Desoxynucleotid
oder Didesoxynucleotid durch enzymatische Nucleinsäuresynthese an das 3'-Ende der hybridisierten einzelsträngigen
Nucleinsäure angelagert wird;
Zugabe eines Matrixmaterials zur Oberfläche des Trägers, und
- -3:23 -
DE 197 82 0S6T1
Bestimmung des Molekulargewichts der hybridisierten einzelsträngigen Nucleinsaure mittels massenspektrometrischer
Analyse.
34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die massenspektrometrische Analyse aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation, Laufzeitanalyse (MALDI-TOF-Analyse), Elektronensprüh- (ES-), Ionencyclotronresonanz-
(ICR-) und Fouriertransformations-Analyse besteht.
35. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die immobilisierte
Nucleinsaure auf dem Träger in Form einer Anordnung positioniert ist.
36. Substrat, das eine Anordnung von immobilisierten Nucleinsäuren aufweist, die durch ein Verfahren mit den folgenden
Schritten hergestellt wird:
Reaktion der Oberfläche des Substrats mit einer Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Herstellung einer gleichmäßigen
Schicht aus primären Aminen auf der Substratoberfläche,
Derivatisieren der Substratoberfläche mit Iodacetamido-Funktionalitäten
durch Reaktion der gleichmäßigen Schicht aus primären Aminen mit einer Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat
(SIAB), und
Inkontaktbringen des Substrats mit thiolhaltiger Nucleinsaure, wodurch die thiolhaltige Nucleinsaure durch eine
kovalente Bindung zwischen der Thiolgruppe der thiolhaltigen Nucleinsaure und der an der Oberfläche des Substrats derivatisierten
Iodacetamido-Funktionalität in einer vorgegebenen Gruppe von Positionen auf der Oberfläche an der Substratoberfläche
immobilisiert wird.
37. Unlöslicher Träger nach Anspruch 7, wobei die Nucleinsäuren auf dem Träger in Form einer Anordnung positioniert
sind.
38. Unlöslicher Träger nach Anspruch 8, wobei die Nucleinsäuren auf dem Träger in Form einer Anordnung positioniert
sind.
39. Anordnung von Nucleinsäuren, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 17.
/>ZS
DE 197 82 006T1
- ISrA -
40. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Träger Silicium ist.
41. Abgabevorrichtung zur Abgabe von Nanolitervolumina eines Fluids bei chemischen oder biologischen Verfahren auf
die Oberfläche eines Substrats, wobei die Vorrichtung aufweist:
ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Abschnitt, in dem mehrere Öffnungen ausgebildet sind, wobei die
Seiten und der untere Abschnitt des Gehäuses ein Innenvolumen abgrenzen,
eine oder mehrere, in den Öffnungen montierte fluiddurchlässige
Vesikeln, die eine Fluidaufnahmekammer in Nanovolumen-Größe
zur Aufnahme von Nanovolumina eines Fluids aufweisen, wobei die Fluidaufnahmekammer in Fluidverbindung mit dem
Innenvolumen des Gehäuses angeordnet ist, und
eine Abgabeeinrichtung, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, zur selektiven Abgabe von Nanovolumina
des Fluids aus den fluiddurchlässigen Vesikeln in Nanovolumen-Größe, wenn das Fluid in die Fluidaufnahmekammern
der Vesikeln eingefüllt ist, wodurch die Abgabeeinrichtung Nanovolumina des Fluids auf die Oberfläche des Substrats abgibt,
wenn die Vorrichtung über dem Substrat und in Deckung mit diesem angeordnet wird.
42. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei jede der fluiddurchlässigen
Vesikeln ein offenes proximales Ende und einen distalen Spitzenabschnitt aufweist, der sich über den unteren
Abschnitt des Gehäuses hinaus erstreckt, wenn die Vesikeln innerhalb der Öffnungen montiert sind, wobei das offene proxima-Ie
Ende bei der Montage innerhalb der Öffnungen die Fluidaufnahmekammer
in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen bringt.
43. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln lösbar und auswechselbar innerhalb
der Öffnungen des Gehäuses montiert sind.
44. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln eine Klebstoffdichtung zur festen
Montage der Vesikeln innerhalb des Gehäuses aufweisen.
45. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die Fluidaufnahmekammer eine enge Bohrung aufweist, die in ihren Abmessun-
DE 197 82 0S6T1
gen so angepaßt ist, daß sie durch Kapillarwirkung mit dem Fluid gefüllt wird.
46. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei jede Fluidaufnahmekammer
der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln so bemessen ist, daß sie sich durch Kapillarwirkung im wesentlichen
vollständig mit dem Fluid füllt.
47. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln eine Anordnung von Fluidabgabenadeln
aufweisen.
48. Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei die Fluidabgabenadeln aus Metall geformt sind.
49. Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei die Fluidabgabenadeln aus Glas geformt sind.
50. Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei die Fluidabgabenadeln aus Siliciumdioxid geformt sind.
51. Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei die Fluidabgabenadeln aus polymerem Material geformt sind.
52. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die Anzahl der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln kleiner oder gleich der
Anzahl der Kavitäten eines Substrats mit mehreren Kavitäten ist.
53. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei das Gehäuse ferner einen oberen Abschnitt aufweist, und die außerdem eine
mechanische Vorspanneinrichtung zum mechanischen Vorspannen der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt
mit dem unteren Abschnitt des Gehäuses aufweist.
54. Vorrichtung nach Anspruch 53, wobei jede der fluiddurchlässigen
Vesikeln einen proximalen Endabschnitt mit einem Flansch und ferner ein Dichtungselement aufweist, das zwischen
dem Flansch und einer Innenfläche des unteren Gehäuseabschnitts angeordnet ist, um eine Abdichtung zwischen dem Innenvolumen
und einer äußeren Umgebung zu bilden.
55. Vorrichtung nach Anspruch 54, wobei die mechanische Vorspanneinrichtung mehrere Federelemente aufweist, die jeweils
an einem Ende mit dem proximalen Ende jeder der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln und am anderen Ende mit einer Innenfläche
des oberen Gehäuseabschnitts gekoppelt sind, wobei
MT-
das Federelement eine mechanische Vorspannkraft auf das proximale
Ende der Vesikel ausübt, um die Abdichtung zu bilden.
56. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei das Gehäuse ferner einen oberen Abschnitt aufweist, und die außerdem eine
Befestigungseinrichtung zum Befestigen des oberen Gehäuseabschnitts am unteren Gehäuseabschnitt aufweist.
57. Vorrichtung nach Anspruch 56, wobei die Befestigungseinrichtung
mehrere, im oberen oder im unteren Gehäuseabschnitt ausgebildete Öffnungen zur Aufnahme von Befestigungsmitteln
und mehrere Befestigungsmittel zur Montage innerhalb der Öffnungen aufweist, um den oberen und den unteren Gehäuseabschnitt
aneinander zu befestigen.
58. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die Abgabeeinrichtung eine Druckquelle aufweist, die in Fluidverbindung mit
dem Innenvolumen des Gehäuses steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen.
59. Vorrichtung nach Anspruch 58, wobei die fluiddurchlässigen Vesikeln durch Kapillarwirkung gefüllt werden, und
wobei die Abgabeeinrichtung ferner eine Einrichtung zum Regeln der Druckquelle aufweist, um das Innenvolumen des Gehäuses in
wechselnde Druckzustände zu bringen, wobei die Regeleinrichtung das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand
bringt, der ausreicht, um die Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidauf nähme kammer jeder Vesikel bis zu einer
vorgegebenen Höhe zu füllen, die einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht.
60. Vorrichtung nach Anspruch 59, wobei die Regeleinrichtung
ferner eine Fluidauswahleinrichtung zum selektiven Entleeren einer ausgewählten Nanovolumen-Fluidmenge aus der
Kammer jeder Vesikel aufweist.-
61. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die fluiddurchlässige
Vesikel ein proximales Ende aufweist, das zum Innenvolumen des Gehäuses führt, und wobei die Fluidaufnahmekammern
der Vesikeln so bemessen sind, daß sie sich durch Kapillarwirkung im wesentlichen vollständig mit dem Fluid füllen, ohne an
dem proximalen offenen Ende einen Meniskus zu bilden.
62. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die Abgabeeinrichtung eine Fluidauswahleinrichtung zur selektiven Änderung
MB
der Fluidmenge aufweist, die aus der Fluidaufnahmekammer jeder
Vesikel abgegeben wird.
63. Vorrichtung nach Anspruch 41, die mehrere Vesikeln
aufweist, wobei ein erster Teil der mehreren Vesikeln Fluidaufnahmekammern
einer ersten Größe und ein zweiter Teil Fluidaufnähmekammern
einer zweiten Größe aufweisen, wodurch mehrere Fluidvolumina abgegeben werden können.
64. Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Fluidauswahleinrichtung
aufweist: ein Druckquelle, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist und mit dem Innenvolumen in Verbindung steht, um
das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen, und
eine mit der Druckquelle gekoppelte Einstelleinrichtung
zum Variieren des Drucks innerhalb des Innenvolumens des Gehäuses,
um an die Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen Überdruck anzulegen und die Menge des daraus abgegebenen
Fluids zu variieren.
65. Fluidabgabevorrichtung zur Abgabe eines Fluids bei chemischen oder biologischen Verfahren in eine oder mehrere
Kavitäten eines Mehrkavitätensubstrats, wobei die Vorrichtung aufweist:
ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Abschnitt, in dem mehrere Öffnungen ausgebildet sind, wobei die
Seiten und der untere Abschnitt des Gehäuses ein Innenvolumen abgrenzen,
mehrere in den Öffnungen montierte fluiddurchlässige
Vesikeln, die eine Fluidaufnahmekammer in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses aufweisen, und
eine Fluidauswahl- und -abgabeeinrichtung, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, zur variablen
Auswahl einer in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllten Fluidmenge, die aus einer einzelnen Gruppe von mehreren
fluiddurchlässigen Vesikeln abzugeben ist, und
wodurch die Abgabeeinrichtung eine ausgewählte Fluidmenge
in die Kavitäten des Mehrkavitätensubstrats abgibt, wenn die Vorrichtung über dem Substrat und in Deckung mit diesem
angeordnet wird.
Mti
66. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 65, wobei die
Fluidauswahl- und -abgabeeinrichtung so angepaßt ist, daß sie verschiedene Fluidmengen auswählt, die aus der einen Vesikelgruppe
abzugeben sind.
67. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 65, wobei die
Fluidauswahl- und -abgabeeinrichtung eine Druckquelle aufweist, die in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses
steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen.
68. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 67, die ferner
eine Einrichtung zum Regeln des Drucks innerhalb des Innenvolumens des Gehäuses aufweist, um die aus den fluiddurchlässigen
Vesikeln abzugebende Fluidmenge zu wählen.
69. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 67; wobei die fluiddurchlässigen Vesikeln durch Kapillarwirkung mit dem
Fluid gefüllt werden, und die ferner eine Einrichtung zum Regeln der Druckquelle aufweist, um das Innenvolumen des Gehäuses
in wechselnde Druckzustände zu bringen, wobei die Regeleinrichtung das Innenvolumen in einen Druckzustand bringt, der
ausreicht, um die Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidaufnahmekammer jeder Vesikel bis zu einer vorgegebenen
Höhe zu füllen, die einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht.
70. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 65, wobei die Fluidauswahleinrichtung aufweist:
eine Druckquelle, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist und
in Verbindung mit dem Innenvolumen steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen, und
eine mit der Druckquelle gekoppelte Einstelleinrichtung zum Variieren des Drucks innerhalb des Innenvolumens des Gehäuses,
um in der Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen Überdruck anzulegen und die daraus abgegebene
Fluidmenge zu variieren.
71. Fluidabgabevorrichtung zur Abgabe von Fluid bei chemischen und biologischen Verfahren in eine oder mehrere Kavitäten
eines Mehrkavitätensubstrats, wobei die Vorrichtung aufweist:
ein Gehäuse mit mehreren Seiten und oberen und unteren Abschnitten, wobei in dem unteren Abschnitt mehrere Öffnungen
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-we- DE 197 82 GS6 Tl
ausgebildet sind, wobei die Seiten und der obere und der untere Abschnitt des Gehäuses ein Innenvolumen abgrenzen,
mehrere innerhalb der Öffnungen montierte, fluiddurchlässige Vesikeln mit einer Fluidaufnahmekammer, die so bemessen
ist, daß sie Nanovolumina des Fluids aufnimmt, wobei die
Fluidaufnahmekammer in Fluidverbindung mit dem Volumen des Gehäuses steht, und
eine mechanische Vorspanneinrichtung zum mechanischen Vorspannen der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt
mit dem unteren Gehäuseabschnitt.
72. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 71, wobei jede fluiddurchlässige Vesikel einen proximalen Endabschnitt mit
einem Flansch und ferner ein Dichtungselement aufweist, das zwischen dem Flansch und einer Innenfläche des unteren Gehauseabschnitts
angeordnet ist, um eine Druck- und Fluidabdichtung zwischen der inneren und äußeren Umgebung zu bilden.
73. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 7Ix wobei die
mechanische Vorspanneinrichtung mehrere Federelemente aufweist, die jeweils an einem Ende mit dem proximalen Ende der
fluiddurchlässigen Vesikel und am anderen Ende mit einer Innenfläche des oberen Gehäuseabschnitts gekoppelt sind, wobei
die Federelemente eine mechanische Vorspannkraft auf das proximale
Ende der Vesikel ausüben, um die Fluid- und Druckabdichtung zu bilden.
74. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 71, die ferner eine Befestigungseinrichtung zum Befestigen des oberen Gehäuseabschnitts
an dem unteren Gehäuseabschnitt aufweist.
75. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 74, wobei die Befestigungseinrichtung mehrere, im unteren oder im oberen Abschnitt
des Gehäuses ausgebildete Öffnungen zur Aufnahme von Befestigungsmitteln und mehrere Befestigungsmittel zur Montage
innerhalb der Öffnungen aufweist, um den oberen und den unteren Gehäuseabschnitt aneinander zu befestigen.
76. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 71, die ferner eine Abgabeeinrichtung aufweist, die mit dem Innenvolumen des
Gehäuses in Verbindung steht, um das Fluid selektiv aus den fluiddurchlässigen Vesikeln abzugeben, wenn das Fluid in die
Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllt ist, wodurch die
. DE 197 82 086T1
Abgabeeinrichtung das Fluid in die Kavitäten des Mehrkavitätensubstrats
abgibt, wenn die Vorrichtung über dem Substrat und in Deckung mit diesem angeordnet ist.
77. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 76, wobei die
Abgabeeinrichtung ein Druckquelle aufweist, die in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, um das Innenvolumen
in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen.
78. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 71, wobei die
mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln lösbar und auswechselbar in den Öffnungen des Gehäuses montiert sind.
79. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 71, wobei die mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln eine Anordnung von Fluidabgabenadeln
aufweist.
80. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 7 6, wobei die fluiddurchlässigen Vesikeln durch Kapillarwirkung mit dem
Fluid gefüllt werden, und wobei die Abgabeeinrichtung ferner eine Einrichtung zum Regeln der Druckquelle aufweist, um das
Innenvolumen des Gehäuses in wechselnde Druckzustände zu bringen, wobei die Regeleinrichtung das Innenvolumen in einen ausgewählten
Druckzustand bringt, der ausreicht, um die Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidaufnahmekammer jeder Vesikel
bis zu einer vorgegebenen Höhe zu füllen, die einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht.
81. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 7 6, wobei die Abgabeeinrichtung eine Fluidauswahleinrichtung zum selektiven
Variieren der Fluidmenge aufweist, die aus der Fluidaufnahmekammer jeder Vesikel abgegeben wird.
82. Fluidabgabevorrichtung nach Anspruch 71, die ferner aufweist: eine Druckquelle, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist
und mit dem Innenvolumen in Verbindung steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen, und
eine mit der Druckquelle gekoppelte Einstelleinrichtung zum Variieren des Drucks innerhalb des Innenvolumens des Gehäuses,
um an die Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen Überdruck anzulegen und die Menge des daraus abgegebenen
Fluids zu variieren.
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- «χ - D E 197 82 086Τ1
83. Verfahren zum Ausbilden einer Anordnung von Probenmaterial
auf einer Oberfläche eines Substrats, mit den folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Vesikel mit einer inneren Kammer, die ein Fluid enthält,
Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats,
Steuern der Vesikel zum Ausstoßen eines Nanolitervolumens des Fluids, um das Fluid in die erste Position der Substratoberfläche
abzugeben, und
Bewegen der Vesikel in eine Gruppe von Positionen, die an die Oberfläche des Substrats angrenzen, wodurch Fluid in
jede Position der Gruppe abgegeben wird, um die Probenmaterialanordnung auszubilden.
84. Verfahren nach Anspruch 83, das den weiteren Schritt zum Bereitstellen eines Substrats mit auf der Substratoberfläche
ausgebildeten Vertiefungen bzw. Kavitäten aufweist, um Positionen für die Aufnahme des aus der Kammer ausgestoßenen
Fluids zu definieren.
85. Verfahren nach Anspruch 83, das den weiteren Schritt aufweist:
Aufbringen eines Matrixmaterials auf eine Oberfläche des Substrats.
86. Verfahren nach Anspruch 85, das den weiteren Schritt aufweist:
Abwarten einer vorgegebenen Zeitspanne, um das Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampfen zu lassen.
87. Verfahren nach Anspruch 8 6, wobei der Schritt zum
Ausstoßen eines Nanoliter-Fluidvolumens den Schritt zum Ausstoßen des Fluids auf das eingedampfte Matrixmaterial aufweist,
um sich zusammen mit dem Matrixmaterial aufzulösen und eine kristalline Struktur auf der Substratoberfläche zu bilden.
88. Verfahren nach Anspruch 83, das den Schritt zum Vermischen eines Analytenmaterials mit einem Matrixmaterial
zur Bildung einer Lösung und zum Füllen der inneren Kammer mit der Lösung aufweist.
//33
89. Verfahren nach Anspruch 83, das den weiteren Schritt zum Bereitstellen des Substrats mit der darauf angeordneten
Probenmaterialanordnung für ein Diagnosegerät aufweist, um Informationen zu ermitteln, die für die Zusammensetzung
des Probenmaterials repräsentativ sind.
90. Verfahren nach Anspruch 89, wobei der Schritt zum Bereitstellen des Substrats für ein Diagnosegerät den folgenden
Schritt aufweist:
Bereitstellen des Substrats für ein Diagnosegerät, das ein Massenspektrometer aufweist. .
91. Verfahren nach Anspruch 83, wobei der Schritt zum Bereitstellen einer Vesikel mit einer inneren Kammer den
Schritt zum Bereitstellen einer Vesikel mit einem piezoelektrischen Element aufweist, um zu bewirken, daß sich das Fluid
durch die Kammer bewegt.
92. Verfahren nach Anspruch 91, wobei der Schritt zum Bewegen der Vesikel den Schritt zum rasterartigen Bewegen der
Vesikel quer über die Oberfläche des Substrats aufweist.
93. Verfahren nach Anspruch 83, wobei der Schritt zum Bereitstellen einer Vesikel den Schritt zum Bereitstellen einer
Vesikeleinheit mit mehreren, in einer Matrix angeordneten Vesikeln zur Abgabe von Fluid in eine erste Gruppe von mehreren
Positionen auf der Substratoberfläche aufweist.
94. Verfahren nach Anspruch 93, wobei der Schritt zum Bewegen der Vesikelanordnung den Schritt zum Festlegen eines
Verschiebungssignals aufweist, das eine Distanz zum Bewegen der Vesikeleinheit in eine Position darstellt, die der ersten
Gruppe von mehreren Positionen benachbart ist.
95. Verfahren nach Anspruch 94, wobei der Schritt zum Bewegen der Vesikeleinheit den Schritt zum Bewegen der Vesikeleinheit
über die Oberfläche des Substrats aufweist, um eine Matrix von Positionen mit darauf ausgestoßenem Fluid auszubilden.
96. Verfahren nach Anspruch 83, das den weiteren Schritt zum Ansaugen von Waschfluid in die Kammer aufweist, um
die Kammer zu spülen.
97. Verfahren nach Anspruch 83, das den weiteren Schritt zum Inkontaktbringen der Vesikel mit einer Fluidmate-
-»«-DE 197 82 086 T1
rialquelle und zum Füllen der Kammer durch Kapillarwirkung aufweist.
98. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das Silicium aufweist.
99. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das einen Metallwerkstoff
aufweist.
100. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das einen Kunststoff aufweist.
101. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das eine Membran aufweist.
102. Verfahren nach Anspruch 8 3 mit dem Schritt zum Bereitstellen
eines Substratmaterials, das ein Polymermaterial aufweist.
103. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das Metall-Propfpolymere
aufweist.
104. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines chemisch funktionalisierten Substratmaterials.
105. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das mit Kügelchen funktionalisiert
ist.
106. Verfahren nach Anspruch 83 mit dem Schritt zum Bereitstellen eines Substratmaterials, das mit einem dendritischen
Material funktionalisiert ist.
107. Verfahren zur Analyse eines Materials, mit den folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Vesikel, die zum Transport eines Fluids mit dem darin enthaltenem Material geeignet ist,
Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf einer Oberfläche eines Substrats,
Steuern der Vesikel zur Abgabe eines Nanolitervolumens
des Fluids, um ein definiertes und gesteuertes Volumen des Fluids in der ersten Position der Substratoberfläche bereitzustellen,
Bewegen der Vesikel in eine zweite Position, die einer
zweiten Stelle auf der Substratoberfläche benachbart ist, um
ein definiertes und gesteuertes Volumen des Materials entlang einer Anordnung von Positionen auf der Substratoberfläche abzugeben,
und
Ausführen einer massenspektrometrischen Analyse für das Material in jeder Position der Anordnung.
108. Verfahren nach Anspruch 107, wobei der Schritt zum
Bereitstellen einer Vesikel den folgenden Schritt aufweist:
Vermischen eines Matrixmaterials und eines Analytenmaterials
zu dem Fluidmaterial.
109. Verfahren nach Anspruch 107, mit den Schritten:
Bereitstellen einer Vesikel mit einer inneren Kammer,
Bereitstellen einer Vesikel mit einer inneren Kammer,
die sich zur Aufnahme eines Fluids eignet, und
Füllen der Kammer mit einem Matrixmaterial und Abgabe des Matrixmaterials in die Positionsanordnung.
110. Verfahren nach Anspruch 107, wobei der Schritt zum Ausführen der Massenspektrometrie den Schritt zum Ausführen
einer matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie aufweist.
111. Verfahren nach Anspruch 107, wobei der Schritt zum Ausführen der Massenspektrometrie den Schritt zum Ausführen
einer massenspektrometrischen Laufzeitanalyse aufweist.
112. Verfahren nach Anspruch 107, wobei der Schritt zum Ausführen der Massenspektrometrie den Schritt zum Ausführen
einer massenspektrometrischen Fouriertransformations-Analyse aufweist.
113. Vorrichtung zum Ausbilden einer Anordnung von Probenmaterial auf einer Oberfläche eines Substrats, die aufweist:
eine Vesikel mit einem distalen Ende, das sich zum Transport eines Fluids darauf eignet,
einen beweglichen Arm mit einem an der Vesikel montierten distalen Abschnitt,
eine Steuereinrichtung zum Bewegen des Arms, um die Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Substratoberfläche
anzuordnen und die Vesikel zur Bereitstellung eines
DE 19782 0S6 T1
Nanolitervolumens des Fluids in einer ersten Position der Substratoberfläche
zu steuern, und
ein Diagnosegerät zum Analysieren des Materials, um ein Zusammensetzungssignal zu erzeugen, das die chemische Zusammensetzung
des Materials darstellt.
114. Vorrichtung nach Anspruch 113, wobei die Vesikel einen Schaft aus massivem Material aufweist.
115. Vorrichtung nach Anspruch 113, wobei die Vesikel eine innere Kammer aufweist, die sich zum Transport eines
Fluidmaterials eignet.
116. Vorrichtung nach Anspruch 113, wobei die Vesikel eine Kammer und ein Wandlerelement zum Ausstoßen von Fluid aus
der Kammer aufweist.
117. Vorrichtung nach Anspruch 113, wobei das Diagnosegerät ein Massenspektrometer aufweist.
118. Substrat mit einer Oberfläche, die eine Matrixmaterialanordnung
trägt, die nach einem Verfahren mit den folgenden Schritten ausgebildet ist:
Bereitstellen einer Vesikel, die sich zum Transport eines Fluids eignet, das ein Matrixmaterial enthält,
Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats,
Steuern der Vesikel zur Abgabe eines Fluidvolumens in die erste Position der Substratoberfläche, und
Bewegen der Vesikel in eine Gruppe von Positionen, die der Oberfläche des Substrats benachbart sind, und Abgabe von
Fluid in jeder Position der Gruppe, um eine Anordnung von Matrixmaterial auszubilden.
119. Substrat nach Anspruch 118, das auf der Oberfläche angeordnete Vertiefungen bzw. -Kavitäten aufweist.
120. Substrat nach Anspruch 119, wobei die Oberfläche mit Grübchen versehen ist.
121. Substrat nach Anspruch 118, wobei die Kavitäten eine rauhe Innenfläche aufweisen.
- Leerseite -
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