JP4783874B2 - 遺伝子長ポリヌクレオチドのマイクロアレイ合成及びそのアセンブリ - Google Patents
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Description
本発明は、マイクロアレイ基板上でその場で合成された多数の短鎖オリゴヌクレオチドのアセンブリに基づく長い遺伝子長ポリヌクレオチドの試験管内合成のための方法及びそのアセンブリを提供する。具体的には、本発明は、固相マイクロアレイ基板上でのオリゴヌクレオチド配列フラグメントの in situ 合成のための方法及び、その後の複数の短鎖オリゴヌクレオチド配列フラグメントからなる長鎖ポリヌクレオチドの「チップ上」アセンブリを提供する。
マイクロアレイの世界では、生体分子(例えば、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドなど)は、ヌクレオチド又は受容体の標的試料との見込まれる結合のために所定位置の表面上に設置される。マイクロアレイは、様々な基板上で利用できる又はその上で生じる生体分子の小型のアレイである。これらのマイクロアレイについての初期の焦点の多くは、一塩基多型(SNPs)とゲノムDNAの検出/評価とに重点を置いたゲノミクス、機能ゲノミクス及びプロテオミクスにあてられてきた(Wilgenbus及びLichter, J.Mol.Med.77:761,1999;Ashfari他,Cancer Res.59:4759,1999;Kurian他,J.Pathol.187:267,1999;Hacia,Nature Genetics 21 suppl.:42,1999;Hacia他,Mol.Psychiatry 3:483,1998;並びにJohnson,Curr.Biol.26:R171,1998)。
任意のポリヌクレオチド配列の調製は、「ポストゲノム」段階には有用である。というのは、これは、任意の所望の遺伝子オリゴヌクレオチド若しくはそのフラグメント又はさらにプラスミド、ファージ及びウイルスの全ゲノム物質を与えるからである。このようなポリヌクレオチドは長い(例えば長さが1000塩基を超える)。オリゴヌクレオチドの試験管内合成(ホスホラミダイト化学の最良の収量条件を与えた)は実現可能ではないであろう。というのは、それぞれの塩基付加反応が100%未満の収率だからである。従って、遺伝子長又はそれ以上の長さの長鎖ポリヌクレオチドを得ることを望む研究者は、このような長さのポリヌクレオチドを得るためには自然又は遺伝子単離技術に頼らなければならなかった。この特許出願の目的上、用語「ポリヌクレオチド」は、試験管内で一塩基付加によって作るのが実際的に実現可能でないように十分に長い核酸(単鎖又は二重鎖のいずれか)をいうために使用する。ホスホラミダイト化学のような核酸合成化学からの収率の指数関数的な減少を考慮すれば、このようなポリヌクレオチドは、一般に、100塩基以上、多くの場合200塩基以上の長さを有する。多くの市販の有用なゲノムcDNAは、多くの場合、1000塩基を超える長さを有していることに留意すべきである。
本発明は、マイクロアレイ上でポリヌクレオチド配列に合成されるオリゴヌクレオチドのアセンブリ方法を提供する。所望の標的ポリヌクレオチド配列は、重複するオリゴヌクレオチドの断片に切断される。第1の具体例では、これらのオリゴヌクレオチドは、開裂できない形でマイクロアレイチップ上に平行な状態でその場で合成される。プライマー伸長法により標的ポリヌクレオチドをアセンブルする。このプライマー伸長法は、適切な配列に対して特異的な開始プライマーを使用する。最後の工程は、最終ポリヌクレオチド産物のPCR増幅である。好ましくは、このポリヌクレオチド産物は、転写の目的のために好適で且つ転写のためのプロモーターをさらに含むcDNAである。
(a)複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面を有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、第1のオリゴヌクレオチド配列が第2のオリゴヌクレオチド配列の領域と同一又は実質的に同一である約10〜約50塩基の重複配列を有し、そして該第2のオリゴヌクレオチド配列が第3のオリゴヌクレオチド配列との重複領域を有する(以下同様)ものとし(以下、第1オリゴヌクレオチドをオリゴ1、第2オリゴヌクレオチドをオリゴ2・・・とする。)、
(b)オリゴ1に相補的なプライマー1を伸長させることによって相補オリゴ1を形成させ、
(c)オリゴ1から相補オリゴ1を解離させ、そして相補オリゴ1をオリゴ1とオリゴ2の該重複配列との両方にアニーリングさせ、ここで、該相補オリゴ1のオリゴ2へのアニーリングが相補オリゴ1+2を形成させるための伸長用プライマーとしての役割を果たすものとし、
(d)工程(c)のプライマー伸長サイクルを全長ポリヌクレオチドが生成するまで繰り返し、及び
(e)アセンブルした相補全長ポリヌクレオチドを増幅させて所望量の全長ポリヌクレオチドを生成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。
(a)複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該配列内に次のオリゴヌクレオチド配列に相当する重複領域を有し、且つ、2個のフランキング配列であって一方がそれぞれのオリゴヌクレオチドの3'末端にあり他方が5'末端にあるものをさらに含むものとし、そしてこの際に、それぞれのフランキング配列は、約7〜約50塩基であり、且つ、プライマー領域と制限酵素開裂部位を有する配列セグメントとを含むものとし、
(b)該フランキング配列のプライマー領域を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させて二重鎖(ds)オリゴヌクレオチドを形成させ、
(c)該オリゴヌクレオチド配列を該制限酵素開裂部位で開裂させ、及び
(d)該開裂オリゴヌクレオチド配列を該重複領域を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチド配列を形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。
(a)複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該配列内に次のオリゴヌクレオチド配列に相当する重複領域を有し、且つ、開裂性のリンカー部分を有する配列セグメントをさらに含むものとし、
(b)該マイクロアレイ又はビードの固体表面からそれぞれのオリゴヌクレオチド複合体を開裂させるように該オリゴヌクレオチド配列を該開裂性リンカー部位で開裂させてそれぞれ重複配列を有するオリゴヌクレオチドの可溶性混合物を形成させ、及び
(c)該オリゴヌクレオチド配列を該重複配列を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。
(a)複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、末端に該固体又は多孔性表面に結合したフランキング領域と、ポリヌクレオチド配列を複数の重複オリゴヌクレオチド配列に切断することによってデザインされる特定の領域とを有し、そしてこの際に、第1のオリゴヌクレオチド上の第1の重複配列が第2のオリゴヌクレオチドの第2の重複配列に相当し、しかも該フランキング配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼ(RE)酵素によって開裂し得るRE認識配列を有する配列セグメントを含むものとし、
(b)該フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて対応するRE酵素と相互作用し得る二重鎖配列を形成させ、
(c)該複数のオリゴヌクレオチドを消化させてこれらのものを該マイクロアレイ又はビードから溶液にまで開裂させ、及び
(d)該オリゴヌクレオチド混合物を該重複領域を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。
(a)複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、2個のフランキング配列であってその一方がそれぞれのオリゴヌクレオチドの3'末端にあり他方が5'末端にあるものをさらに含み、そしてこの際に、それぞれのフランキング配列は、約7〜約50塩基であり、且つ、プライマー領域と制限酵素開裂部位を有する配列セグメントとを含むものとし、
(b)該フランキング配列のプライマー領域を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させて二重鎖(ds)オリゴヌクレオチドを形成させ、及び
(c)該二重鎖オリゴヌクレオチド配列を該制限酵素開裂部位で開裂させること
を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法を提供する。
(a)複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかもそれぞれのオリゴヌクレオチド配列は開裂性リンカー部分を有する配列セグメントを有するものとし、
(b)該マイクロアレイ又はビードの固体表面からそれぞれのオリゴヌクレオチド配列を開裂させるように該オリゴヌクレオチド配列を該架橋性リンカー部位で開裂させて可溶性のオリゴヌクレオチド混合物を形成させること
を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法を提供する。
(a)固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該固体又は多孔性表面に結合する末端にあるフランキング領域と、特定領域とを有し、この際に、該フランキング配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼ(RE)酵素によって開裂し得るRE認識配列を有する配列セグメントを含むものとし、
(b)該フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて該対応するRE酵素と相互作用し得る二重鎖配列を形成させ、
(c)該複数のオリゴヌクレオチドを消化させてこれらのものを該マイクロアレイ装置又はビードから溶液にまで開裂させること
を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法を提供する。
図1は、マイクロアレイ装置の表面又は多孔性マトリックス上での遺伝子アセンブリの概要を示している。図1Aでは、標的遺伝子配列は、多数の重複オリゴヌクレオチドに切断されている。3'及び5'は、示される鎖の末端である。また、図1Aは、標的配列を基準にして、プライマーPrl、プライマーPr1の伸長産物(相補オリゴヌクレオチド1)及び相補オリゴヌクレオチド1の伸長産物(相補オリゴヌクレオチド1+2)も示している。図1Bは、アセンブリ方法の初期工程の一具体例を例示している。アセンブリの工程1では、プライマーPr1をオリゴヌクレオチド1にアニーリングさせ、そして適切なポリメラーゼ酵素によってオリゴヌクレオチド1に相補的な産物に伸長させる。第2工程は、大量のPr1伸長産物(相補オリゴヌクレオチド1)の生成、該相補オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド1との再会合及び該相補オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2とのアニーリングをもたらし、その後オリゴヌクレオチド1+2に相補的な産物へのその伸長をもたらすための融解、再アニーリング及び伸長(即ち増幅)である。図1Cは、図1Bからのアセンブリ方法の続きを示している。具体的には、該方法の工程3(即ち、融解、再アニーリング及び伸長)は、工程2と同一の産物に加えて、オリゴヌクレオチド1+2+3に相補的な産物をもたらす。サイクル(工程)は、全長相補ポリヌクレオチドが形成されるまで繰り返される。最終工程は、最終標的ポリヌクレオチド分子の末端に相補的な2個のプライマー(PrX及びPrY)を使用した増幅(即ちPCR)による所望量の該最終標的分子の調製である。
本発明は、マイクロアレイ装置若しくは固体表面ビード装置上で合成され又はその上にスポットされた重複短鎖オリゴヌクレオチドのアセンブリを使用したポリヌクレオチド配列(遺伝子とも呼ばれる。)の調製を説明する。この短鎖オリゴヌクレオチドとしては、所望のポリヌクレオチドの配列へのアセンブリを助成するための重複領域を有する配列領域が挙げられる。重複領域とは、第1のオリゴヌクレオチド配列であって、第2のオリゴヌクレオチドの一部分と同一であり、同一の方向を有し(3'から5'又は5'から3'の方向に対して)、及び第2オリゴヌクレオチド配列又はその相補配列(第2の具体例)の5'末端又は3'末端にハイブリダイズするであろうもの(この第2オリゴヌクレオチド配列は第3のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする:以下同様)の3'末端又は5'末端のいずれかにある配列領域をいう。マイクロアレイ装置又はビード装置をポリヌクレオチドアセンブリのために使用するようにデザインし又は開発するためには、ポリヌクレオチド配列は、多数の重複オリゴヌクレオチドセグメントであってそれぞれ20〜1000塩基、最も好ましくは20〜200塩基の長さを有するものに分割(又は切断)される(図1A)。オリゴヌクレオチドセグメント間での重複は、第1から第2、第2から第3、第3から第4(以下同様)の適切なハイブリダイゼーションが生じるように5以上の塩基、好ましくは15〜25塩基である。これらのオリゴヌクレオチド(又はオリゴ)は、好ましくは、任意の利用可能な方法(即ち、電気化学的 in situ 合成法、フォトリソグラフィー in situ 合成法、インクジェット印刷法、スポッティング法など)を使用してマイクロアレイ装置上で合成される。マイクロアレイ装置の表面又はマイクロアレイ装置を覆う多孔性マトリックスに対する合成の方向は、3'から5'又は5'から3'であることができる。好ましくは、in situ 合成は、3'から5'の方向で行われる。
この例は、本発明の方法の第1の具体例(図4及び5)に従う、マイクロアレイ装置上で合成された非開裂性オリゴヌクレオチド配列からの172merポリヌクレオチド配列のアセンブリを例示する。3種のオリゴヌクレオチド(図5に示す配列)を電気化学的方法に従ってマイクロアレイ装置上でその場で合成した(例えば、米国特許第6093302号を参照されたい。ここに引用して説明に代える。)。合成されたオリゴヌクレオチド配列をプライマーX(オリゴ#1の鎖に相補的)及びZ(オリゴ#3と同一の鎖)(図5)を使用したRCR反応によって増幅させた。AmplyGold(商標)酵素を有するPCRキット(アプライドバイオシステムズ社)を使用した45サイクルのPCRの後に、172bpの正確なDNAフラグメントが合成された(図4)。その後の消化により、この酵素の特異性を確認した(HpaIIにより106bpと68bpの二つのフラグメントが生じた)。
この例は、全長ポリヌクレオチドへのアセンブリ用のオリゴヌクレオチドをPCR及びREII(制限酵素)消化により調製するための本発明の方法の第2の具体例を例示する。単鎖オリゴヌクレオチド配列を例1の手順に従ってマイクロアレイ装置上で合成した(図2及び6参照)。このオリゴヌクレオチド配列は、2個のフランキング配列をさらに含んでおり、そしてそのそれぞれはMlyI制限酵素に対する認識部位を有していた。このマイクロアレイ装置を2つのプライマー(図7に示した)を使用したPCR(25サイクル)反応に付して増幅PCRフラグメントの混合物を生成させた。この得られた増幅PCRフラグメントをMlyI制限酵素で消化し、そしてPCR精製キット(Qiagen社)で精製してアセンブリの準備が整った特定オリゴヌクレオチドを生成させた(図7)。同様に、この特定オリゴヌクレオチドをストレプタビジン−アガロース(シグマ社)による消化混合物の吸収によってフランキング配列から精製した。
この例は、それぞれMlyI制限部位を含むフランキング配列を有する9種のオリゴヌクレオチドからの290bpのポリヌクレオチド配列のアセンブリを例示する。この9種の異なるオリゴヌクレオチド配列のぞれぞれを例1で説明したような in situ 電気化学法によってマイクロアレイ装置上で合成した。
9種の特定のオリゴヌクレオチド配列(図8に示されるようなフランキング配列を有する)を含むマイクロアレイ装置を、図6に記載される2つのプライマーであるプライマー1及び2を使用したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列のPCR増幅のために使用してdsオリゴヌクレオチド配列の混合物を形成させた。これらのプライマーは、フランキング配列に相補的であった。増幅されたdsオリゴヌクレオチド配列の混合物をMlyI酵素で消化させた。特定のdsオリゴヌクレオチド配列を精製し、次いで、図2に記載され且つ図9に図式的に示されるような2つの工程で最終290bpポリヌクレオチド配列にアセンブルさせた。第1のアセンブリ工程では、20サイクルの融解−アニーリング−伸長を使用した。最終産物を、2つのプライマーFP1及びFP2(図9)を使用して25サイクルのPCRで290bpのポリヌクレオチドDNAに増幅させた。
この例は、38種の重複オリゴヌクレオチド配列(図10)を使用した、融合蛋白質MIP−GFP−FLAG(マクロファージ炎症蛋白質−緑色蛍光蛋白質−FLAGペプチド)についての発現を暗号化できるcDNAポリヌクレオチド配列の作製を例示する。この38種のオリゴヌクレオチドを、例1に記載したように、電気化学的 in situ 合成方法を使用してマイクロアレイ装置上で合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、それらの3'末端に開裂性リンカー部分(図3A参照)を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチド配列を濃アンモニアで同時に脱保護及び開裂させた後に、このオリゴヌクレオチド配列の混合物をスピンカラムによるゲル濾過によって精製した。この精製されたオリゴヌクレオチド配列を図3に図式的に示した方法によってポリヌクレオチドにアセンブルした。得られたDNAポリヌクレオチドは965bpであり、またT7RNAポリメラーゼプロモーターとMIP−GFP−FLAG融合蛋白質についてのコード配列との両方を含んでいた。この例でアセンブルされたポリヌクレオチドを標準的な転写/翻訳反応で使用し、そしてこのものは適切なMIP−GFP−FLAG融合蛋白質を生成した。翻訳蛋白質を、抗FLAG樹脂(シグマ社)を使用して反応混合物から精製した。この機能性蛋白質は、好適な青色光下で緑色蛍光シグナルを有していた。従って、この例から、本発明の遺伝子アセンブリ方法は、機能性蛋白質をコードする正確なDNA配列を与えることが立証された。
Claims (37)
- 複数のオリゴヌクレオチドから全長ポリヌクレオチドをアセンブルするための方法において、次の工程:
(a)それぞれのオリゴヌクレオチド配列が該全長ポリヌクレオチド配列の断片からなる複数の異なるオリゴヌクレオチド配列を準備し、ここで、該オリゴヌクレオチドのそれぞれは、次の重複オリゴヌクレオチドにおける配列領域に相当する重複配列を有し、該複数のオリゴヌクレオチドは、それらの3'末端及び5'末端にフランキング配列領域をさらに含み、しかも該フランキング配列領域は、同一のプライマー対のためのプライマー結合部位をその3’末端及び5’末端に有し、かつ、該プライマー結合部位を除去するための制限酵素認識配列を有する配列セグメントを含み、ここで、該制限酵素認識配列は、その対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂できるII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列であるものとし、
(b)該フランキング配列領域の該プライマー結合部位に相補的な一対のプライマーを使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させ、
(c)該オリゴヌクレオチド配列を該II型エンドヌクレアーゼ制限酵素で開裂させて該プライマー結合部位を除去し、及び
(d)該開裂オリゴヌクレオチド配列を該重複配列を介してアセンブルして該全長ポリヌクレオチドを形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドから全長ポリヌクレオチドをアセンブルするための方法。 - 工程(a)の前に、マイクロアレイ装置又はビード装置であってそれぞれ固体表面又は多孔性表面を有するものの上に複数のオリゴヌクレオチドをその場で合成させ又はこれを固定させることをさらに含み、ここで、該複数のオリゴヌクレオチドが該固体表面又は多孔性表面に結合していることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列が、開裂性リンカー部分を有する配列セグメントをさらに含み、該開裂性リンカーは、開裂によって3'ヒドロキシヌクレオチドが生成されるようにスクシネート部分をヌクレオチド部分に結合してなる化学成分である、請求項2に記載の方法。
- マイクロアレイ又はビードの固体表面から前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれを開裂させるように該複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれを開裂性リンカー部位で開裂させてオリゴヌクレオチドの可溶性混合物を形成させることをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 開裂性リンカーが、5'−ジメトキシトリチルチミジン−3'−スクシネート、4−N−ベンゾイル−5'−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−3'−スクシネート、1−N−ベンゾイル−5'−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−3'−スクシネート、2−N−イソブチリル−5'−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−3'−スクシネート及びそれらの2種以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項3又は4に記載の方法。
- 固体表面又は多孔性表面に結合した末端部のフランキング配列が、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂できる制限酵素認識配列を有する配列セグメントを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記固体表面又は多孔性表面に結合した末端部のフランキング配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて前記対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素と相互作用できる二重鎖配列を形成させ、そして前記マイクロアレイ装置又はビーズから前記複数のオリゴヌクレオチドを開裂させるように該複数のオリゴヌクレオチドを消化してオリゴヌクレオチドの可溶性混合物を形成させることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- フランキング配列領域が7〜50塩基の長さである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- II型エンドヌクレアーゼ制限部位が、MlyI、BspMI、BaeI、BsaXI、BsrI、BmrI、BtrI、BtsI、FokI及びそれらの2種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- フランキング配列領域が、該フランキング配列領域から開裂オリゴヌクレオチドを精製するために使用される結合部分をさらに含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記増幅工程(b)中に、結合部分で標識されたプライマー配列を使用してフランキング配列領域を標識する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 結合部分が、アビジン若しくはストレプタビジンによって捕獲されるビオチン及び抗フルオレセイン抗体によって捕獲できるフルオレセインから選択される、捕獲できる小分子である、請求項11に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列についてのフランキング配列領域が同一である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 同一のプライマー対を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅する、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 全長ポリヌクレオチド配列を、その末端に相補的なプライマーを使用して増幅することをさらに含む、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記フランキング配列領域が前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列に対して最小の相同性を有するように設計された、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- アセンブルが、融解、自己アニーリング及びポリメラーゼ伸長の反復サイクルを含む、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 開裂したオリゴヌクレオチドをフランキング配列領域から寸法に基づいて精製する、請求項1〜9又は13〜17のいずれかに記載の方法。
- 複数の異なるオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってそれぞれのオリゴヌクレオチド配列が該ポリヌクレオチドの配列の断片からなるものの製造用組成物において、該複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列が次のオリゴヌクレオチドにおける配列領域に相当する重複配列領域を有し、しかも該複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、それらの3'末端及び5'末端にフランキング配列をさらに含み、ここで、フランキング配列領域のそれぞれの対が、同一のプライマー対によって該複数のオリゴヌクレオチドの増幅を可能にするプライマー結合部位をその3’末端及び5’末端に有し、かつ、該プライマー結合部位の除去を可能にする制限酵素認識配列セグメントを含み、ここで、該制限酵素認識配列は、その対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂できるものである、前記組成物。
- オリゴヌクレオチドが、固体表面又は多孔性表面を有するマイクロアレイ装置又はビード装置に結合しており、かつ、それから分離できる、請求項19に記載の組成物。
- それぞれのオリゴヌクレオチド配列が開裂性リンカー部分を有する配列セグメントを含み、該開裂性リンカーは、開裂によって3'ヒドロキシヌクレオチドが生成されるようにスクシネート部分をヌクレオチド部分に結合してなる化学成分である、請求項20に記載の組成物。
- 開裂性リンカーが、5'−ジメトキシトリチルチミジン−3'−スクシネート、4−N−ベンゾイル−5'−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−3'−スクシネート、1−N−ベンゾイル−5'−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−3'−スクシネート、2−N−イソブチリル−5'−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−3'−スクシネート及びそれらの2種以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 固体表面又は多孔性表面に結合した末端のフランキング配列領域が、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂できる制限酵素認識配列を有する配列セグメントを含む、請求項20に記載の組成物。
- フランキング配列領域が7〜50塩基の長さである、請求項19〜23のいずれかに記載の組成物。
- II型エンドヌクレアーゼ制限部位が、MlyI、BspMI、BaeI、BsaXI、BsrI、BmrI、BtrI、BtsI、FokI及びそれらの2種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する、請求項19〜24のいずれかに記載の組成物。
- フランキング配列領域が、該フランキング配列領域から開裂オリゴヌクレオチドを精製するために使用される結合部位をさらに含む、請求項19〜25のいずれかに記載の組成物。
- 結合部分が、アビジン若しくはストレプタビジンによって捕獲されるビオチン及び抗フルオレセイン抗体によって捕獲できるフルオレセインから選択される、捕獲できる小分子である、請求項26に記載の組成物。
- それぞれのオリゴヌクレオチドについてのフランキング配列領域が同一である、請求項19〜27のいずれかに記載の組成物。
- 前記フランキング配列領域が前記オリゴヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有するように設計された、請求項19〜28のいずれかに記載の組成物。
- 複数のオリゴヌクレオチドからポリヌクレオチドをアセンブルするための方法において、次の工程:
(a)固体表面又は多孔性表面を有するマイクロアレイ装置又はビード装置上で複数の異なるオリゴヌクレオチドを合成し又は該装置上に該複数のオリゴヌクレオチドを固定し、ここで、該複数のオリゴヌクレオチドは、該固体表面又は多孔性表面にそれらの3’末端で結合し、しかも該複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列は、次のオリゴヌクレオチドの3’末端の配列領域と同一である10〜50塩基の配列領域をその5’末端に含むものとし、
(b)第1オリゴヌクレオチドに相補的な第1相補オリゴヌクレオチドを第1プライマーの伸長によって形成させ、ここで、該プライマーは、該第1オリゴヌクレオチドの3’末端に相補的であるものとし、
(c)該第1相補オリゴヌクレオチドを該第1オリゴヌクレオチドから解離させ、そして該第1相補オリゴヌクレオチドを、該第1オリゴヌクレオチドの5’末端の配列領域と同一の配列領域をその3’末端に含む第2オリゴヌクレオチドにアニーリングさせ、
(d)該第1相補オリゴヌクレオチドを伸長させ、そして解離、アニーリング及び伸長のサイクルを繰り返して1本鎖の全長相補ポリヌクレオチドを生成させ、及び
(e)該1本鎖全長相補ポリヌクレオチドを増幅させることによって所望量の2本鎖全長ポリヌクレオチドを生成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからポリヌクレオチドをアセンブルするための方法。 - 固体表面又は多孔性表面がマイクロアレイ装置の形である、請求項30に記載の方法。
- マイクロアレイ装置が、ヌクレオチドの塩基をカップリング及びデカップリングさせるための電気化学的手段を使用してオリゴヌクレオチドをその場で合成させるための複数の電極を有する半導体装置である、請求項31に記載の方法。
- 工程(b)を、融解、アニーリング及びその後の伸長の連続方法によるプライマー伸長反応によって行う、請求項30に記載の方法。
- プライマー伸長反応を、複数のオリゴヌクレオチドを結合してなるマイクロアレイを使用して熱循環型PCR増幅装置で実施する、請求項33に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの製造用組成物において、該組成物中における別のオリゴヌクレオチドの3’末端の配列領域と同一の10〜50塩基の配列領域をその5’末端に含む第1オリゴヌクレオチドと、該組成物中における別のオリゴヌクレオチドの5’末端の配列領域と同一の10〜50塩基の配列領域をその3’末端に含む第2オリゴヌクレオチドと、複数の異なるオリゴヌクレオチドであって、該複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、該組成物の第1の異なるオリゴヌクレオチドの3’末端の配列領域と同一の10〜50塩基の第1配列領域をその5’末端に有し、かつ、該組成物の第2の異なるオリゴヌクレオチドの5’末端の配列領域と同一の10〜50塩基の第2の別個の領域をその3’末端に有するものとを含み、ここで、該組成物のオリゴヌクレオチドが固体表面又は多孔性表面に結合し、これらのオリゴヌクレオチド配列が該ポリヌクレオチドの配列の断片からなる、ポリヌクレオチドの製造用組成物。
- 固体表面又は多孔性表面がマイクロアレイ装置の形である、請求項35に記載の組成物。
- マイクロアレイ装置が、ヌクレオチドの塩基をカップリング及びデカップリングさせるための電気化学的手段を使用してオリゴヌクレオチドをその場で合成させるための複数の電極を有する半導体装置である、請求項36に記載の組成物。
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