JPH03505966A - 生物高分子の固相組立及び再構築方法 - Google Patents
生物高分子の固相組立及び再構築方法Info
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- JPH03505966A JPH03505966A JP50757189A JP50757189A JPH03505966A JP H03505966 A JPH03505966 A JP H03505966A JP 50757189 A JP50757189 A JP 50757189A JP 50757189 A JP50757189 A JP 50757189A JP H03505966 A JPH03505966 A JP H03505966A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
生物高分子の固相組立及び再構築方法
発明の背景
発明の分野
この発明は、例えばオリゴヌクレオチドから遺伝子、オリゴペプチドからのポリ
ペプチド、オリゴ糖類からの多糖類の組立てのような短い生物高分子の組立を介
して、生物高分子を構築する方法に関する。この発明はまた生物高分子の改造又
は再構築に関し、生物高分子シーケンスのセクションがあり、改変セグメントに
よって置換される。
発明の背景
DNAは化学物質であって、もっとも多くのライフ フオームを作り上げる。D
NAの2つの性質ビボ(vivo)機能において基礎的であって、ビトラ(vi
tr)において、科学的可能性を操作し、(i)DNA4つの異ったサブユニッ
ト(ベース)すなわちアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミ
ン(T)が長い高分子ストランドを形成するために糖類リン酸エステルによって
連鎖されて組成され、(ii)特殊な水素結合ベースに対(AとTとの対及びC
tとCとの対)によって、DNAの2つの「補助的」ストランドが複合ヘリカル
DNA分子を形成する。この特殊なベース対は、染色複製において重要な役割を
演じ、その2種中に染色体の2つのDNAストランドは分離し、DNA酵素重合
体は補足的ストランドを合成するための「鋳型」として各ストランドに用いられ
、鋳型ストランドとベース対をもち、それによって1つから2つの染色体が形成
される。
ベース対はまた「転写」工程において作用し、ここではRNA酵素重合体が遺伝
子の1ストランドのベース対を用い、「伝令RNAJ分子(核酸であってその中
においてウラシルはチミンと置換し、筒数は2′−デオキシリボースの代りのリ
ボースである)に合成する。伝令RNAはついで遺伝子コード(伝令RNA内の
各3−ベース「コードン」はあるアミノ酸をタンパク酸生成物に組合わされるよ
うに指定する)によって指向されるように、タンパク質中に「はん訳」される。
このようにして各遺伝子に対して結合された転写/はん訳工程は、アミノ酸シー
ケンスを含むタンパク質分子の生合成をもたらし、DNA内のベース シーケン
スによってコード化される。タンパク質内のアミノ酸シーケンスは、タンパク質
がどのようにして指定構造物にフォルト(fold) L、いかにしてそれが例
えば酵素の場合指定化学反応の生化学的触媒中において他の分子と反応するかを
決定する。
最終的にはベース対は「なまし」反応のベースを形成し、この反応は各種の研究
機関のDNA操作に用いられる。2つの分離されたDNAス]・ランドは相補性
のレジオンを通じてデュプレックス構造物を形成するために自然にペアアップさ
れ、それらは相補ベース シーケンスの1つまたはそれ以上のストレッチを含む
。
遺伝子及びタンパク質の操作のための最近の技術の進歩は、遺伝子の技術分野に
おいて大規模に用いられ、生物工学はDNA分子を他の所望のペースシーケンス
に化学的に合成することを許し、そこでは存在する遺伝子又は新しく創生された
ものの変換が用いられている。この能力すなわち「タンパク質技術」における基
本的な道具は、タンパク質、酵素創生物、生物工学及び薬学的工業における葉内
に、構造的/機能的関係の合成を許す。
過去13年間にDNAの化学的合成のための方法は急速に進歩した。ミカエルソ
ン(Michelson)及びトッド(Todd)が最初に化学的に合成したヂ
ヌクレオチドは正しいホスボヂエスタ(pbosphodiester)連鎖(
ミヵエルソン・トッド、J 、 CheIll、 Soc : 2632 ヘ2
638 (1955))を含む。コーラナ(Korana)が開発し、リン酸エ
ステル トリエステル(τ、riester)を使用したDNA合成方法は、遺
伝子符号化転写RN A (Agarwal他、Nature (Lond)
227 : 27〜40(1970) )を生成する。さらに充分なリン酸エス
テル トリエステル DNA合成方法がついで開発された(しトシンガ(Let
singer)及びオギリビ(Ogil−vie) 、J 、 Am。
Chem、 Sac、、 89 : 4801〜4803 <1967) ;
ナロング(Narong外、Meth、EnyyIIlol、 、 65 :
610〜620 (レトシンガ外、J。
Am Chem、 Soc、、 97 : 3278〜3279 (1975)
:ビュヶージ(Beaucage )及びキャルザーズ(Caruther
s)、T6t、 Lett、。
22 : 1.859〜1862. (+981) )。DNAの化学的合成
物のための同相サポートの使用が開示された(マツチウシ(Matteucci
)及びキャルザーズ、J 、Am、 Chew、 Soc、。
103:3185〜3191 (1981) ;スプロート(Sproat)
及びパンワース(Banwarth) 、Tet、 Lett、、 24 :
5771〜5774(1983) ) 。
DNAの化学的合成のための固相サポートの使用は、急速かつ効率よ<DNAを
化学的に合成することに対して重要な貢献をし、それは生長鎖が不溶解性のサポ
ートに共用的に取付けられ、試薬が化学的工程中に洗浄され、このようにして各
単量体の付加後にポリヌクレオチドを精製する必要を減少する。さらに固相合成
は工程の自動化をもたらし、各ベース付加(複合ステップ反応サイクル)が室温
で約10秒間実施される(スミス(Smith) 、 AmericanBjo
technology Laboratory (Dec、、 1983)
; Caruthers。
5cience、 230 : 281〜285(1955) )。
タンパク質またはその一部としてコード化されたデュプレックスDNAを構築す
ることができ、新規な遺伝子生成物を表現することができる組換えDNAを構築
するために合成デュプレックス破片を使用することができる。しがし遺伝子合成
の広範囲の適用は、っぎの(i)平均的な遺伝子(典型的には5,000ないし
20.000ドル)を組立てるために必要なすべてのオリゴヌクレオチドの合成
物が高価であり、(ii)合成オリゴヌクレオチドから遺伝子組立体の遅くて労
働集約的作業によって遅らせられた。DNAの化学的合成は長さが100ないし
150ベースまでポリヌクレオチドまで一般に生成される(上限において核出力
は非常に低い)。しかし平均的な遺伝子のコード化部分は、1000ベース対を
含む。このようにして遺伝子を組立てるために、一連の重複、相補的なオリゴヌ
クレオチドは合成されねばならず、「なまし」が行われる(すなわちともに混合
され、2つのストランド内の補足的シーケンス間の複合ねじりの形成条件下でふ
化する)、、デュプレックスDNAは2つのストランドに沿って交換位置にスト
ランド中断を含み、酵素結合によって接在デュプレックス セグメントにコンバ
ートされる。
それからはデュプレックスD N 、Aは続いての分析と表現(タンパク質生成
物)のための進路に栄養化される。実際にはオリゴヌクレオチドの相補的混合物
からの遺伝子の正しい組立体は、単一のなまし工程ではその達成が困難であり、
それは各種の望ましくないなまし生成物が形成されるからである。一連の困難な
浄化と分析工程とが、遺伝子が隔離される前に通常実行されなければならない。
ペプチドの化学的合成のための固相生成物は、メリフイルド(Merrifie
ld)のプロトコルに基いており、酵素作用の複合のために順次用いられる(ガ
ラl−(Gutte及びメリフィールド、J 、 Biol、Chem、、 2
46 : 1922〜1941(1971)) 、。
この方法はボリスチ1ノンーデビニールベンゼン サポート、し−プチルロキシ
ーカーボニル(tboc)アミノ群防御、及び対称的アンハイドライド中間体と
のDCC−活性化凝縮を用い、ベプタイド合成を充分に自動化するのに適してい
る。
ベプタイドの化学的合成のための他の方法(rFmocJ方法として知られてい
る)は、集成ポリアミド−けいそう土サポート(連続流式合成に適している)を
用い、それとともにフルオレニールメソ々シカーボニル(Fluorenyle
methoxy−Carbonyl) (Fmoc)アミノ群防御及びN−hy
doxy−benzatriayole−活性凝縮ペンタフルオロフェニール(
PFPE)中間体または対称的アンハイドライド中間体(オーフレット(Auf
fret、)及びメート(meade)、5ynthetic Peptide
s in Biology andMerlj、cine、アリタロ(Alit
alo)外、(Eds、) ElsevierScience Publish
ers、 Amsterdam、 (1985) ’)が用いられる。
D N Aとともにペプチドの化学的合成は、この発明に先立って100ないし
200残留物(これらの上限において非常に低い核出力)の鎖の長さのために可
能である。特に20ないし30の残留物のペプチドが生成される。大きなポリペ
プチドへのペプチドの組立は、指示された階段的なペプチドの凝縮後のFmoc
工程によって技術的には可能である。しかしこの方法は高価で労力と各ブロック
の凝縮反応後の生成物の浄化とを必要とする。
合成が高価であり、多量のポリヌクレオチド及びペプチドが遺伝子とタンパク質
とが必要なことは、アメリカ特許出願第071000,716号(1987年1
月6日出願に開示されたセグメント合成技術を使用することによって克服され、
これらの生物高分子の破片を遺伝子及びタンパク質に組合わせると厄介な残留物
を生じ時間を消耗する。
遺伝子工学及び生物工学における他の技術は、組換えDNA研究において遺伝物
質を操作する酵素を用いるものである。限定されたエンドヌイリース(endo
nucheases )(承認され特殊シーケンスにおける割裂DNA、4ない
し8ベース対長さ)がクロモサム(chromosome)の隔離指定レジオン
に用いられ、DNAリガーゼ(限定酵素の作用からDNA破片と結合する酵素)
が指定DNA破片が過剰染色体複製ゲノム(核外遺伝子又はパイラル(vira
l)DNAs)への「栄養素」として用いられ、このことは「進路」Berg、
5cience 213 : 296〜303 (1981)として知られて
いる。この結果組換えDNAは栄養素破片のペースシーケンスを分析すること、
又は栄養素遺伝子によってコード化された大量のタンパク質を生成する。前記の
ようにこの技術の力強い発展は組換えDNAの形成に、「限定破片」が自然に発
生するところに化学的に合成されたデュプレックスDNA破片を用いることであ
る。
組換えDNA技術は高分子生物研究及び遺伝子技術に強力な道具を表わすが、労
働集約浄化工程又は多量の反応生成物の分析が所望の組換えDNA生成物が隔離
される前に必要となる。
組換えDNA方法に相似のタンパク質直接操作(offord。
Protein Engineering、 1 : 151〜157 (1
987) )は、タンパク質から指定セグメントを削除する指定エンドペプチド
の使用を許し、天然ペプチドから化学的に異った合成ピースによってこれらを置
換する。この1組換えタンパク質技術」はまた労働力の必要な浄化工程及び所望
の加工されたタンパク質を隔離するために異った反応生成物を分析することが必
要となる。
このようにして一般に役立つ遺伝子エンジニャリング技術の大きな力にもかかわ
らず、生物高分子操作の速度、効率及び経済性が必要とされる。したがって現在
の方法のもつ欠点、これらは急速実施、低コスト、それらのサブコンポーネント
からの生物高分子の精密な組立て及び生物高分子シーケンスの改造を急速かつ便
利よい方法が必要であり、それによって所望の加工された生物高分子の隔離が最
少の浄化及び分析工程によって達成される。
発明の概要
この発明の目的は、サブコンポーネントから生物高分子を組立てる改良された方
法を提供するにある。
この発明の他の目的は、合成オリゴヌクレオチドの幅広いなましによって、遺伝
子又は遺伝子セグメントを急速に組立てる方法を提供するにある3゜
さらにこの発明の他の目的は、少い労力と材料を必要とする合成オリゴヌクレオ
チドの幅広いなましによって、遺伝子又は遺伝子セグメントの組立のための経済
的な方法を提供するにある。
さらにこの発明の他の目的は、少い浄化及び分析工程を必要とする幅広いなまし
によって、遺伝子又は遺伝子セグメントの組立てのための効率のよい方法を提供
するにある。
さらにこの発明の他の目的は、大きな核出力の所望の最終生成物を提供し、合成
オリゴヌクレオチドの幅広いなましによって、遺伝子又は遺伝子セグメントの組
立てのための効率のよい方法を提供するにある。
付加的なこの発明の目的は、ペプチドをポリペプチドに組立てる迅速で、効率よ
く、しかもコストの安い方法を提供するにある。
さらにこの発明の他の目的は、DNA分子の指定セグメントを相似の、改変され
たセグメント又は異ったセグメントで置換するための改良された方法を提供する
にある。
さらにこの発明の他の目的は、ポリペプチドの指定セグメントを相似の、改変セ
グメント又は新規の、無関係なセグメントで置換するための改良された方法を提
供するにある。
さらにこの発明の他の目的は、核酸又はタンパク質的の1つ又はそれ以上のセグ
メントを除去するための改良された方法を提供するにある。
付加的なこの発明の目的は、核酸またはタンパク質的の指定場所において、1つ
又はそれ以上のオリゴマセグメントの加入のための改良された方法を提供するに
ある。
このようにして前記の目的を達成するために、この発明の1つの特徴により、改
良された生物高分子の構築のための方法を提供し、この方法はつぎの工程を有す
る。(1)生物高分子サブコンポーネントを固相サポートに取付ける工程、(2
)次の生物高分子シーケンスをサポート−バウンド構成材の一端に取付ける工程
、(3)工程(2)において付加された余分な束取付生物高分子シーケンスを洗
浄する工程、(4)サポート−バウンド構成材の自由端に(工程(2)(3)を
反覆することによって)減数性生物高分子シーケンスを取付け、生物高分子を組
立てる工程、(5)サポートから組立てられた生物高分子を離間する工程。
前記の方法における全工程はサポート、又はこれに代るフロースルーシステムを
提供する両端に有孔手段が設けられた充填ベッドコラムで実施される。この方法
によって構築される生物高分子はDNA (遺伝子又は遺伝子セグメント)、ポ
リペプチド(タンパク質)、多糖類又は互いに結合できる他の生物高分子のサブ
セクションからなる群の中から選ばれる。最初にサポートに取付けられる「スタ
ート」生物高分子構成材は、長さにおいて例えば1−100残基という広い範囲
であってよく、その長さは選択事項であるが、サポート−バインドスタート構成
材は、典形的にはその長さが10〜50残基である。固相サポートの性質は選択
事項であり、サポートの構造は所望の高分子重量生物高分子を組立てるのを遅ら
せない。「スタート」生物高分子構成材を固相サポートに連鎖させることは、当
業者によって容易に達成することができ、その際各種の従来技術が用いられる。
組立中における減数性生物高分子セグメントの段階的連鎖は、サポートから最終
生成物の割裂方法と同様に、構築される生物高分子の種類により、その詳細は下
記の実施例で説明される。
この発明の特定の特徴に関連し、合成オリゴヌクレオチドから遺伝子(又は遺伝
子破片)の組立てについて改良された方法を提供し、この方法はっぎの工程を有
する。(1)「スタート」オリゴヌク1/オチドを固相サポートの両端のうちの
一端またはその近くに取付ける工程、(2)組立てられる遺伝子の中に次のオリ
ゴヌクレオチドの1モル余分を加え、加えられたオリゴヌクレオチドの一端はサ
ボ・−トーバウンドの自由端にペースシーケンス内において相補的であって、分
子を形成し、この分子内において付加オリゴヌクレオチドの一端は、サポート−
バウンド オリゴマとペース対となり、付加オリゴマの他端で単一ストランド尾
を離間する工程、(3)末なまし自由オリゴヌクレオチドを洗浄する工程。(4
)オリゴヌクレオチドの付加、なまし、洗浄工程を繰返えし、所望の遺伝子又は
遺伝子破片が組立てられるまで実行される工程、(5)組立てられたD N A
をサポートから離間する工程。
この実施例の(+、)工程において、固相サポートは最初ヌクレオシドでデバタ
イズ(clerivati、ze)され、「スタート」オリゴヌクレオチドは固
相サポートに合成され、標準的なリン酸トリエステル又は亜リン酸i・リエステ
ル方法を用い、この合成オリゴヌクレオチドをサポートへの連鎖は、続く遺伝子
組立体内に保留されて使用される。この実施例の固相サポートは、好ましくは小
さな直径(5〜50マイクロメータ)の無孔ガラスピーズ、又は小さな直径(5
〜50マイクロメータ)で大きな直径ciooo〜5000A)の孔をもつガラ
スピーズからなる。ヌクレオジオをもつガラスピーズのデリバタイゼーションは
当業者によく知られている各種の従来技術によって達成される。例えば長い連鎖
アルキルアミン(alkylamine)間隔腕(スブロート(sproat)
及びブラウン(Brown) 、Nucl、 Ac1ds Re5113 :
2979〜2987゜(1985) )を介してガラスにヌクレオシドの3#−
ウレタン連鎖が、標準的なフォスフォラアミダイド(phosphoramid
ite)又はリン酸トリエステ法によって「スタート」オリゴヌクレオチドの合
成のための固相サポートが種出力のために使用される。ウレタン連鎖が環外アミ
ノ群のデプロテクション(deprotectio口)の開広範囲に維持され、
ついで固相遺伝子組立のために用いられる。これとは反対に「スタート」オリゴ
ヌクレオチドの固相合成は標準3″−〇−スクシニル連鎖を介してヌクレオシド
とガラスピーズがデリバタイズされる前記のロアミグイト法、又はリン酸トリエ
ステ法を介して遂行され、提供された「スタート」オリゴヌクレオチドのシーケ
ンスは、環外アミノ群を含むヌクレオシド残基を避けるために選ばれ、通常環外
アミノ群のデブロテクションに必要とされるアルカリン(alkaline)状
態は、サポートからD N Aを割裂する。0−スクシニル連鎖を使用するため
に、チミジン及び・イノシン残基を含むスタートオリゴヌク1ノオチド シーケ
ンスが適当である。
他の実施例(「スタート」オリゴヌクレオチドを固相サポートに取付ける)の工
程(1)において、オリゴヌクレオチドはサポートの一端又はその近くに結合さ
れる。この実施例において、固相サポート及びサポートと「スタート」オリゴヌ
クIノオチドとの間の連鎖の特徴は、当業者によってよく知られた浄化作用を伴
う公知の方法によって容易に達成され、固相構造体は遺伝子の組立を遅らせない
ようになっていなければならず、及びオリゴヌク1/オチドのサボ・−トへの連
鎖は次の遺伝子組立に用いられる広範囲のなまし作用に耐えなければならない。
この実施例の工程(1)のための固相サポートは、(1)官能基によってデリバ
ライズされた無孔ラテックス マイクロスフェア(microsphere)を
有し、化学的連鎖及び凝縮を組立内のスタートオリゴヌク1ノオチドの一端に、
ビーズと反応グループとの間に生じさせる。
再びオリゴヌクレオチドをラテックス パーティクルに連鎖することは、当業者
にとってよく知られている各種の完成された方法によって達成される。例えばヒ
ドラジドーデリバタイズド ラテック パーティクルはクレムスキイ(Krem
sky)外、、 Nucleic Ac1ds Re5115 : 2891〜
2909゜(1987)に開示されたように、アルデヒド又はカルボン酸群で5
′一端部にデリバタイズされたオリゴヌクレオチドに容易に連鎖される。これと
は別にアルキルアミンーデリバタイズド ピースがアルキルアミンーデリバタイ
ズド オリゴヌクレオチドに連鎖することができ、その際ビルチ(Pilch)
及びチェッチ(Czech) 、 J 、 Biol、 Chew、 254
:3375〜3381 (1979)に開示されたようなディスクシニルメゾイ
ル(disuccinimedyl )スベレート(suberate )のよ
うな2重架橋試剤が用いられる。さらにアルキルアミンーデリバタイズド ラテ
ックス バ・−テ・rクルがグツドフライド(Goodfrjed)外、、 5
cience 144 : 1344 (1964)によって開示されたよう
な活性化されたグルタールアルデビドによってアビジン又はストレプトアビジン
に連鎖されることができ、5′一端部でビオチンにラベルされた組立体中の最初
のオリゴヌクレオチドが、公知のアジピン−ビオチン親和性を介してビーズに取
付けられる。
固相サポート(遺伝子組立体の方向性を指令する)に取付けられるスタート オ
リゴヌクIノオチド(5′又は3′)の端部が5′か3′かの決定は、全体とし
て選択の問題であるが、サポートに連鎖されるスタート オリゴヌクレオチドの
連鎖が、オリゴヌクレオチドの一端で通常のように連鎖されることは除かれる。
遺伝子組立方法(所望の遺伝子又は遺伝子破片における次のオリゴヌクレオチド
のなまし)は、当業者によって周知の標準的なまし条件のいずれかの下で実行さ
れ、この場合例えば0.2〜IMNacl又はKCI塩プラプラス50%ホルム
アミド在のもので50〜65℃の位置となっている。オリゴヌクレオチドのベー
ス シーケンスが下記の記述を満足するように選ばれる。(′1)遺伝子の所望
ベースシーケンスは組立方法によって創造され、(2)相補重複(付加的オリゴ
ヌクレオチドを保持するデュプレックス セグメントをサポート−バウンド構成
材に析出させる)の広がりが、組立体の必要な安定度を提供する長さとすること
ができる。
提示実施例において、相補重複シーケンスは少くとも10ベースであって、50
ベースまで上げることができ、(3)なまし後の単一ストランド「尾」の突出長
さは、好ましくは少くとも10ベース(つぎの付加オリゴヌクレオチドをもつ析
出安定ベース対の長さ)であり、(4)オリゴヌクレオチドシーケンスは好まし
くはオリゴヌクレオチド内の第2構造体を避けるために選ばれるのがよく(ヘア
ピン内にイントラストランド(intrastrand)ベース対が生ずる)、
サポート−バウンド構成材に付加オリゴヌクレオチドのなましで干渉でき、(5
)シーケンスは1回のなまじより多くの生成物が発生するのを避けるように選ば
れる(ベース対可能性の複合を介して)。
遺伝組立の工程(3)(余分で末なまし付加オリゴヌクレオチドの洗浄)は、例
えば両端に有孔部材を含む反応チャわれる。それとは別に工程(3)はマイクロ
セントリフユズ(microc−entrifuge)チューブの中で1連の遠
心分離・デカント作用を行うことによって達成される。
この発明の1実施例の工程(4)(所望の遺伝子又は遺伝子破片を作るため工程
(2)(3)を段階的に繰返えす)において、組立てられたオリゴヌクレオチド
は両ストランドの取換え位置においてストランド抑制で完全なデュプレックスD
NAを生ずるように設計されている。他の実施例では、オリゴヌクレオチドは部
分的DNA分子の組立のために設計され、両ストランドに沿って交互の位置に単
一ストランドのギャップが存在する。このギャップはDNA重合体の作用によっ
て埋められる。
工程(4)はまた各なまし工程において、各種(約2−5)のオリゴヌクレオチ
ドを各なまし工程に付加することによって実施される。この方法は所望の遺伝子
又は遺伝子破片の組立のために必要ななまし工程の合計数を減少するが、なまじ
の複合生成物が発生しないことを達成するための注意が払われなければならず、
すべてのサポート−バウンド組立体は、同一の所望のデュプレックスDNAシー
ケンスを発生する。
工程(5)(サポートからの組立られた遺伝子の離間)が、DNAのサポートへ
の連鎖性及び組立てられたDNAの構造をコンパチブルとするように選ばれた手
段によって実行される。提示の1実施例において、段階的ななましが1つを除い
て5′−ホスホリレーテッド(phosphorylated )なすべてのオ
リゴヌクレオチドで実行され、完全にデュレックスDNAが形成され、その中で
はすべてのストランド中断がDNAリガーゼの使用によって密封されることがで
き、これはサポート一連鎖オリゴヌクレオチドに隣接する単−非結さつストラン
ド中断のために除外される。それから連続デュプレックスセグメントは、80〜
100℃の簡単な加熱によってサポートから除去される。これとは反対に隣接す
る非結さつ性ストランド中断は、組立てられたDNA内におけるこの位置で、1
つ又はそれ以上のヌクレオシド残基のギャブを離すことによって行うことができ
る。
他の実施例の工程5において、適当なオリゴヌクレオチドが組立のために選ばれ
、限定酵素承認シーケンスを含むデュプレックスDNAセグメントが、遺伝子又
は遺伝子破片とサポートとの間に発生され、サポートからのDNAの除去は限定
されたエンドヌクリーズによる割裂を介して通常のように行われる。
遺伝子組立方法のすべての実施例において、サポートから離間されたDNAは、
セル及びDNAシーケンス分析において表現のためにベクトルにクローンされる
。
この発明の他の特徴に関連し、ポリペプチドを組立てる方法が提供され、この方
法は次の工程を有する。(1)固相サポート物質にペプチドを取付ける工程、(
2)初期のサポート−バウンド ペプチドにペプチドを段階的に端部一対一端部
凝縮又は結さつを行い、これに代えて長いポリペプチドを構築するために洗浄す
る工程、(3)サポートからポリペプチドを割裂する工程。
提示された実施例において、固相サポートは小さな直径(5〜50マイクロメー
タ)の無孔ガラスピーズを含み、このビーズに長鎖アルキラミン間隔腕を介して
、第1アミノ酸残基が化学的に取付けられる。他の実施例において、固相サポー
トは小さな直径(5〜50マイクロメータ)で、大径(1000〜5000A)
の孔を有するガラスピーズを含む。両サポートは長ポリペプチドを組立てる間ス
テリック(steric)遅延を避ける役目をする。ペプチドの合成後ペプチド
はサポートに取付けられ、又はその代りにガラスピーズがアミノ酸残基と最初に
デリバタイズされることができ、それから固相ペプチド合成物が組立方法におい
て次第に延びているサポート−バウンド ペプチドを作るのに用いられる。前記
の実施例は固相サポートであってサポートへのペプチドの連鎖のために用いられ
るサポートの例を示しているが、これらのパラメータは選択事項である。当業者
は代りのペプチド一連鎖サポートを考案することができ、それはポリペプチド組
立体のために適したすぐれたステリック性能をもっている。ペプチド一連鎖無孔
ラテックスマイクロスフエヤがまた固想サポートとして用いられる。
この発明の固相ポリペプチド組立体(段階的ブロック凝縮)の実施例の1実施例
において、アミノ終端−防御ペプチドをカルボキシ終端を経てサポートに連鎖さ
れたベプチドの自由アミノ端末への段階的凝縮は、標準的なFmoc方法を用い
て実行される。他の実施例において、固相サポートへの段階的凝縮は化学的に遂
行され、その場合ジクロルフェノールのようなペプチド ボンド−フォーミング
試剤を使用し、または酵素的に「リバース タンパク質加水分解」 (オフオー
ド(Offord) 、Protein Engineering、 l :
151〜157. (1987) )が用いられる。
まだこの発明の他の特徴に関して、固相サポート上の生物高分子シーケンスの複
製のための方法を提供し、この方法は次の工程を具えている。(1)固相サポー
トに生物高分子シーケンス内の1つ又はそれ以上の位置において、高分子重量生
物高分子を取付ける工程、(2)生物高分子の指定セグメントを延ばす工程、(
3)割裂したエージェント及び削除された生物高分子破片を洗浄する工程、(4
)化学的に合成された生物高分子シーケンス、又は天然物から分離された破片を
付加し、生物高分子に付加セグメントを加入して削ったセグメントを置換する工
程、(5)余分の付加生物高分子セグメント及びボンド−再生エージェントを洗
浄する工程、(6)サポートから複製された生物高分子を割裂する工程。生物高
分子複製のための前記の方法は、又生物高分子内の指定位置における生物高分子
セグメントの加入又は除去のために使用される。
生物高分子複製の工程(1)において、固相サポートの性質及びサポートへの取
付けは選択事項であって、生物高分子の構造によって選択され、当業者によって
容易に選択される。例えばアビジン−被覆ビーズが強固にビオチンーラベルドD
NA又はビオチンーラベルド タンパク質に結合するのに用いられる。
それに代って指定されたアンチボディーバウンド サポートがエピトープ(ep
itope)をタンパク質又は核酸に結合するのに使用される。又サポート一連
鎖オリゴヌクレオチド(好ましくは20〜5o残基長)が単−一ストランドD
”N 、A分子を水素結合ベース対を介して、サポートに連鎖するのに使用され
る。付加的に可逆クロスリンク エージェントが生物高分子及びサポート内で化
学的に反応群に連結するのに使用される。
生物高分子の部位−指定割裂(固相生物高分子複製の工程(2))が、好ましく
は酵素的手段によって遂行され、この際1つ又はそれ以上のDNAの場合におけ
る限定エンドヌクリーズ、又はタンパク質の場合における指定エンドヌクリーズ
が用いられる。サポートに取付けられた単−一ストランドDNAの指定の場合に
おいて、エンドヌクリーズによる゛割裂はオリゴヌクレオチドを付加することに
よって遂行することができ、これは酵素承認シーケンスを含む短デュプレックス
レジオンを提供するために、DNAをなます。又指定化学的割裂手段(例えば
臭化シアンによるタンパク質の割裂)が工程(2)において用いられる。
固相生物高分子複製の工程(3)において、割裂エージェント及び削除された生
物高分子セグメントはサポートから洗浄され、好ましくは両端に有孔手段が設け
られたチャンバ内に含まれたサポート−バウンド生物高分子をソルベントを流す
ことである。
これの代りに反覆する簡単な遠心分離・デカント作用工程が、遠心分離チューブ
内に含まれたサポート−バウンド生物高分子のための工程(3)に用いられるこ
とができる。
固相生物高分子複製の工程(4)において、「置換」生物高分子セグメントが付
加され、この際好ましくはサポート−バウンド生物高分子が適当なボンド−再生
エージェントに沿ってモール超えており、工程(4)においてセグメントを付加
することにより、工程(2)で削除された生物高分子セグメントの置換を行う。
例えばDNAの複製において自然物から分離された限定破片、又は適当な端末を
含む化学的に合成されたデュプレックス セグメントが付加され、D N Aリ
ガーゼの作用により工程(2)で削除されたセグメントによって占められていた
位置に結さっされる。タンパク質の場合には、付加ペプチドによる削除セグメン
トの置換は、「可逆タンパク質加水分解」によって化学的に遂行され、オフオー
ド、 ProteinEngineering、 1 : 151〜157(
1987)に開示されたような反応条件の下で指定エンドオベプチダス(end
opep+jdases)によって分析され、又はデクロロフェノールのような
ペプチド ボンド−形成エージェントの作用によって化学的に遂行される。
サポート−ボンド生物高分子から余分な反応構成材を洗浄すること(工程(5)
)が、工程(3)におけると同様の手段によって遂行される。
複製生物高分子をサポートか割裂すること(工程(6))が、各種の手段によっ
て遂行され、その手段は当業者には知られており、どの方法を選択するかは固相
サポートと、生物高分子と、それらの間の連鎖の形態によって決められる。例え
ばアビジン:SS−ビオチン親和性を介してサポートに生物高分子を取付けるた
めに、連鎖はジンカス(Shimkus)外、、 Proc、 Natl、Ac
ad、 Sci。
(U S A) 82 : 2593〜2597 (1985)の100mMジ
シオシジントル(dithiothreitol )を含む緩衝材を付加するこ
とにより容易に裂断され、複製生物高分子のアンチボディ(antibody)
親和性サポートからの解離は通常のタンパク質変性剤によって遂行でき、DNA
分子ベース対のサポート−バウンド オリゴヌクレオチドの離間は80〜100
℃に簡単に加熱することによって遂行できる。
この発明の外の目的、特徴及び利点は、下記の提示実施例の詳細な説明から明ら
かであり、この詳細な説明は図面を参照して後記される。
好適具体例の詳細な記述′
本発明を図面を対照して詳細に説明する。しかしここに記載される具体例は本発
明の僅がな、特定の使用であって、この方法の多くの変形もまた当業者で自明で
あるものは本発明の範囲に含まれる。
第1図は固相サポート上の遺伝子又は遺伝子破片の集合の概念を示すものである
。「スタート」オリゴヌクレオチド3は固相サポート1に始めに接触される。先
に討議したように、サポートlの正確な性質及びスタート オリゴヌ。
クレオチドとサポートの間の結、合2の形は選択される物質、及び当業者間で既
に知られている。しかしながら、固相サポートの幾何学は遺伝子の集合が立体的
障害でないような場合は、固相サポート材料が一般に使用されることが要件であ
る。この要求を満足させるには、同相サポートは小径(5〜50ミクロメーター
)の孔のないガラスピーズ又は非常に大きな孔(1000〜5000A)を有す
るビーズの何れかを遺伝子の固相集合に使用することが推奨される。
スタート オリゴヌクレオチドとビーズとの結合2は当該技術で知られた種々の
形で行うことができる。好適な結合の次の例は実施例として挙げる。そして結合
の選択は当業者が本発明の範囲内から行うことは強調される。
ガラスピーズに対する一つの好適な結合2は先の久ボート(sproat)及び
ブロウン(・Brown)及び引用により本文中に記載したウレタン結合である
。ウレタン結合は遺伝子集合に先立って如何なる塩基配列のスタート オリゴヌ
クレオチドの合成に最も適している。ウレタン結合はこの塩基を脱保護に用いる
条件下サポート上にオリゴヌクレオチドが残るおそれがあるA、G及びCのエキ
ソサイクリックアミノ基のアシル結合保護より一層安定である。
もし遺伝子集合中のスタート オリゴヌクレオチドはI(イノシン)とT(チミ
ジン)ヌクレオチドの配列を含むことで定義されるなら、標準3′−〇−サクシ
ニル結合がスタート オリゴヌクレオチドの合成に用い、アルカリ塩基−脱保護
段階(これは3′−〇−サクシニル結合を加水分解する)はオリゴ(I、T)の
合成後は必要ないであろう。
数種の方法は固体ラテックス微粒子表面に予備合成されたスタート オリゴヌク
レオチドを結合すると好都合である。これは遺伝子集合に対して適したサポート
に接合したオリゴヌクレオチドが提供される。例えば、共有結合のアビデンをア
ルキルアミン−誘導された小さなラテックスビーズ(0,1〜10ミクロン径)
にグルタルアルデヒド活性又は他の当該技術で公知の方法で結合することにより
公知のアビデンービオチン親和性のものが使用される。得られたアビデンー被覆
ビーズは51−ビオチン−ラベルされたオリゴヌクレオチドを結合している。
ラテックス微粒子はまた他の方法によって遺伝子集合に対するスタート オリゴ
ヌクレオチドを共有結合することもできる、ジサクシニミジルスベレートのよう
なホモニ官能性交差結合剤を用いアルキルアミン−誘導化されたう・テックスビ
ーズと51−アルキルアミノ−誘導化されたオリ・ゴヌクレオチドを結合する、
ヒドラジド−誘導化されたラテックスと5′−アルデヒド−オリゴヌクレオチド
と又は5′−力ルボキシレートーオリゴヌクレオチドの結合及び他のこのような
方法は当該技術で知られている〔クレムスキイ(Kremsky)ら、スボロー
ト(Sproat)及びブロウン(Brown)、シムカス(Shimkus)
ら、ビリチ(Pilch)及びチェチ(Czech)、及びグツドフリント(G
oodfriend)ら、先に全て引用により本文中に記載した〕。
固相遺伝子集合の概略は第1図に示した、それはオリゴヌクレオチド4,5,6
.7及びnを用いて希望する遺伝子又は遺伝子破片を作成する段階毎アニーリン
グの一連のふされしい例である。各アニーリング段階の“重複”塩基の程合は加
えられたオリゴヌクレオチドとサポート−結合一本領“尾”との間の少くとも2
0個塩基の対を形成する場合好適な結果が得られるであろう。第1図に示される
実施例において、スタート オリゴヌクレオチドはサポートにその3一端を介し
て接触されそしてリン酸化されていない。
アニーリング段階の反応中に加えられるオリゴヌクレオチドは5″−リン酸化さ
れそして完全に二本鎖集合DNA(一本領“ギャップ”を含まない)その中の一
つの鎖中モの鎖は中断(3’70Hに隣接した5′−リン酸塩)され他の鎖より
成るオリゴヌクレオチドの略々中間に位置している。これらの条件下で、′切れ
目”はサポートから集合遺伝子が離れる前にDNAリガーゼの作用壜こよって酵
素的に閉鎖することができる。
遺伝子集合の段階的アニーリングはゆるやかな撹拌により懸濁液中に固相サポー
トを保持(望ましくは、ブラウン運動により亜微細ラテックス粒子の懸濁液に保
持)して少量(例えば、0.02〜0.10d)中で好適に行われる。サポート
に接触されているスタート オリゴヌクレオチドの量は種々の巾がある、例えば
、ビーズのダラム当り0.01〜1.0ミクロモルである。ビーズの“荷重容量
”の様なものでは、本質的に量に関する段階的アニーリングは次の反応条件(0
,IOdアニーリング容量)下数分間以内に生ずる: 50mMカリウム又はナ
トリウムリン酸塩、pH7,5,400mM KCQ又はNaCQ、 0.1−
1.0ノナモルのサポート−接合オリゴヌクレオチド、0.2〜2.0ノナモル
の添加オリゴヌクレオチド、50〜60℃。又は、同じ反応混合物に50%ホル
ムアミドを加えた物を37℃で培養した。前記条件下でアニーリングDNA(2
0塩基対が重複していると推定される)の濃度は20〜200マイクログラム/
72である。この遺伝子集合に各加えられたオリゴヌクレオチドの量は極めて低
い、精製された生成物の低収率を与えるオリゴヌクレオチド合成の安価な方法を
用いることを推奨する。
一度に一つのオリゴヌクレオチドの段階的アニーリングをアニーリングを特定的
に定量的に生ずる確立が高いので推奨する。しかしながら、第1図に示す方法は
一度に数個のオリゴヌクレオチドを加えることを適合させて成功させることがで
きた。これによって、遺伝子集合段階一層少なくすることができる。しかしなが
ら、それぞれのアニーリングでさえも1000塩基対遺伝子は6時間以内に50
40mersの集合ど推定される、5分間のアニーリング時間と2分の洗浄時間
で集合することができる。
洗浄工程は各アニーリング反応後行い、過剰のアニールしないオリゴヌクレオチ
ドを除去する、かくして各サイクルにおいて希望するアニーリング生成物の確実
な形成はサポートを溶媒(例えば、アニーリングバッファー)の流下によって好
適に実施される、サポートは米国特許出願1booO,7]6号に記載されてい
るような浴端に孔を多く有する反応槽中に固相サポートを入れることによって提
供することができる。
或いは、2〜3短時間の遠心分離/傾瀉工程が確実に洗浄を達成することができ
る(サポートは小型遠心分離管中に保持される)a
明らかに、正しい遺伝子の集合及び構造を得るためにはオリゴヌク1ノオチドを
各段階に均一に加えることが必須である。
遺伝子集合の完成後DNA生成物はサポートから離さなければならない。第1図
に示された例に於て、これは短時間加熱段階(80〜90℃)により簡単に行わ
れる、これによりサポートに支持された集合遺伝子の短い二重破片は変性され、
長い集合重複DNAの完全な変性は生じない(後者はDNAリガーゼの活性によ
り隣接した長い鎖に転換されている)。閉封されていない鎖の集合遺伝子の開始
における中断はく第1図のオリゴヌクレオチド3及び5の結合においてサポート
に接合したスタート オリゴヌクレオチド上の5′−リン酸塩の不存在から生ず
る)またこの位置の少くとも一つの塩基のりガーゼの作用を受けない“ギャップ
”の形成により変性することもできる。
或いは、集合遺伝子又は遺伝子破片は制限酵素の作用によりサポートから好都合
に離すことができる、この配列はサポートの近くの重複DNAとして設計され提
供される(例えば、その中、重複破片は第1図のオリゴヌクレオチド4により形
成される)。後者の場合において、オリゴヌクレオチドの51−加リン酸化は適
宜の遺伝子集合を使用する。
第1図に示すように、遊離された遺伝子(又は遺伝子破片)9は多くの目的に使
用することができる、例えば、それは次にシーケンス分析のベクターにクローン
化、表示(遺伝子によるコード化された蛋白の生産)等。
本発明の遺伝子合成及び/又は集合からの最も有用な点は、オリゴヌクレオチド
の塩基配列が次の計画を持って綿密に計画されることである:(1)配列がオリ
ゴヌクレオチド中の4又はそれ以上の塩基対のヘアピンの形成を除くように計画
される場合は、アニーリング段階中原図となる分子間塩基対を妨害する。(2)
化学的合成中にカップリング能力の弱い配列は(4又はそれ以上の連続したG残
留物のような)除去される。(3)遺伝子に“遺伝性コドン”を導入した配列は
除去される、もし必要なら、この目的は遺伝子表示の高いレベルでなされる。′
遺伝性コドン”は天然においてまれにして見出されないニヌクオタイド配列であ
る、そして成るホスト中では正しく翻訳されない。(4)オリゴヌクレオチドは
推奨されるDNA技術によってマニビレーションの結果集合遺伝子中に特殊な制
限位置を持つように設計される。例えば、もし突然変異化学的合成遺伝子内に見
出されたら、特殊制限位置を制限酵素で各個のクローンした遺伝子を開裂する、
そして希望する突然変異株−遊離遺伝子を形成し再結合する。
第1図で示した方法における集合した重複DNAの長さは百個の塩基対より小か
ら+側の塩基対より大までの広い範囲である。労力の必要とする精製及び遺伝子
集合中の中間体の分析は固相手段の使用により除かれる、遺伝子構成に伴う時間
及び費用は本発明の使用によって削減される。
更に、本方法の高収率はDNAの極めて少量の使用ですみ、更に遺伝子合成の費
用を削減する。平均の大きさの遺伝子は合成し、集合できそして1週間以内に発
現ベクターにクローン化される、材料、労力の全費用は1,000ドル以下、も
し破片DNA合成装置として開示されそして1987年1月6日出願米国特許N
ctOOO’、716のクレームを使用すればオリゴヌクレオチドの合成に50
ノナモルのスケールで行い、そして後本発明を遺伝子集合に使用する。好適の方
法により同じ遺伝子の製造費用は20,000ドル〜50,000ドルでそして
典型的には約2ケ月の仕事を必要とする。
本発明は遺伝子集合に関する方法として実例を挙げたが、他のポリペプチド及び
ポリサッカライドを含む生物高分子の構成に同様に使用できる。本発明をポリペ
プチド集合に使用する方法を第2図に示す。蛋白質分子は次の順序で構成するこ
とができる、そのカルボキシ端がサポートに結合したペプチドの遊離アミノ端と
連続的に加えたアミノ端末−保護されたペプチドの間で標準Fmocを使用し当
業者が知られた化学的濃縮を段階的に行う。
本発明はまた生物高分子のIノモデル化にも適用できる、もし適宜の方法によっ
て溶液中で行ったら、希望する生成物を得る前に時間の消費及び労力を要する精
製並びに分析段階をしばしば必要とする多段方法である。同じ多段方法を溶液中
でなく固相サポート上で行うことによって、精製及び中間生成物の分析は除かれ
、これによって時間及び労力が削減される。固相サポート上で生物高分子を再構
成する利点は第3図に示される。
生物高分子11は生物高分子配列中の1又はそれ以上において固相サポートに始
めに接触される。生物高分子集合の方法について先に説明したように、固相サポ
ートの正確な性質及びそれに生物高査子を結合する方法は選ばれた物質による、
固相サポートの一つの制約は生物高分子に対する反応成分の制限し易くないこと
を必要とすることである。
好適な固相サポート、結合形、反応成分の洗浄方法及びサポートから生物高分子
の最高の分離方法は生物高分子集合の利用についての先に述べた通りである。
サポート−接合生物高分子11 (例えば、二重鎖プラスミドDNA)は少くと
も一つの試薬(例えば、制限酵素)で処理され生物高分子破片中に1又はそれ以
上の特定位置13に割裂を生成する。もし生物高分子が2個の特定位lで割裂し
た場合、1又はそれ以上の特定破片12が分離する(例えば、制限破片)。分離
された破片12及び割裂剤は生物高分子集合に対して先に記載したように洗浄し
去り、後破片14(例えば、制限破片又は合成重複DNA)を加える、そして結
合を形成しく例えば、DNAリガーゼによる)、再モデル化された生物高分子1
5を生成する。
この方法は分離した切片12を除き、置換する破片を加えずに後結合を形成して
生物高分子から除いたものを生成するにも使用できる。
加えるに、この方法はサポートに接合した生物高分子中の特定位置にこの生物高
分子中の単一位置を割裂しそして後この位置で生物高分子破片を結び付けること
によって追加された生物高分子切片を挿入するのに用いることができる(例えば
、“外”重複切片又は合成重複DNAをクローンベクター中の特殊制限位への挿
入により再構成りNAが製造される)。
本発明の適用は他の配列で置換する前にDNA破片を分離して除くことにより典
型的に実施するから時間の消費する精製段階を除くため組み替えDNA技術とし
て有用である。
実施例1
バグテリオファージM13ベクターの再モデル化一本鎖環DNA (バクテリオ
ファージM13ベクターのような)の操作について本発明の特定の適用を第3図
を引用して説明する。環、一本領ファージDNAIIは適宜固相サポートと塩基
対を介してサポート−接合合成オリゴヌクレオチドと接触する(長さが20〜5
0塩基、が−重鎖ベクター中の特定の位置に補足しである)。次に、2個の合成
オリゴヌクレオチド(例えば、20mers )を加えそしてベクター配列でア
ニールする、制限位置13を含む短い重複域を生産する。
制限酵素は後にDNAの破片12を制限位で割裂するのに使用する、そして制限
酵素及び分離した破片は洗い除かれる。後置換破片14(端末に短い重複域を含
み、除かれた破片と同じ端末を持っている)を加えそしてDNAリガーゼの活性
によりサポート−接合DNAと接合させる。サポート−接合一本領ベクターの割
裂の時一つの、特殊の位置において行わせ、制限破片又は合成りNAはこの位置
に挿入される。これらの操作を行った後、DNAはDNAポリメラーゼの作用に
よって完全に二本鎖を作成することができる、そしてポリマ化は短い重複域をベ
クターと接触しサポート−接合オリゴヌクレオチドとして行われる、ベクターは
前者から公知の方法“標準置換”雰囲気により分離される。最後に、DNAはD
NAリガーゼの作用によって閉環形に変えられる。
実施例2
E、コリー 1acl遺伝子の破片の合成及び集合固相サポート:
“スタート”オリゴヌクレオチドの合成及び次の遺伝子集合の両者に使用するサ
ポートは6マイクロメーター径の固体ガラスピーズを長鎖アルキルアミン−誘導
化されたものよりなる、5′−トリチル、2′−デオキシチミジンで誘導化し3
′−〇−ウレタン結合を形成する[スプロート(sproat)及びブロウン(
BroWn) 、1985)。このサポートの“負荷”容量は、濃縮水酸化アン
モニウム中55℃で24時間サポートからヌクレオチドの分離液のHPLC分析
により決定して、サポートのダラム当り2.2マイクロモルのヌクレオチドであ
った。
オリゴヌクレオチドの合成
サポートの45■をスブロート及びブロウンにより記載された方法により第1ヌ
クレオチド(A)の0,1 umolで誘導する。非−加リン酸化オリゴヌクレ
オチド(3’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGTCGCACGC
T−’ 5 ’ )をホスホロアミディト法【バウケイジ(Beaucage
)及びカルザース(Caruthers) 1981)によりミリゲン(Mil
ligen) 7500D N Aシンセサイザーを用いサポート上で合成する
。最後の脱トリチル化段階に次いで、サポート材料はガラス小びんに入れそして
濃縮水酸化アンモニウム1.52IQ、 55℃で1時間処理しエクソサイクリ
ックアミノ基から保護基を離脱する。サポート材料を後1.5dエペンドロフ
チューブに入れそしてアニール バッファー(下記に記載)で5回洗う(遠心分
離1傾瀉)。
遺伝子集合におけるアニーリング条件
1.5威エベンドロフ チューブに0.5■のオリゴヌクレオチド−サポート(
約1nmo1.6) 、5’−加リン酸オリゴヌクレオチドの2ノナモルを加え
る。
5’−PTT丁CGCAGCGTGCGAGCGTGCCCGGGTGGT−3
’及び充分なアニーリング バッファー (50mM KH,PO4,pH7,
5,400mMKCQ、 1mM EDTA)を0.10mの容量にする。チュ
ーブを随時ゆるやかな撹拌で55℃で5分間培養する、後チューブを工ペンドロ
フ ミクロ遠心分離機で1分間遠心分離し、そしてビーズを172のアニーリン
グ バッファーで2回洗う。
スタート アニーリング及び洗浄段階後の生成物は5up−U−0−3’ −A
AAAAAAAAAAAAAAAAAGCGTCGCACGCT−5’5’ −
9TTTCGCAGCGTGCGAGCGTGCCCGGGTGGTである。
アニーリング/洗浄順環は各々に次の5′−加リン酸オリゴヌクレオチドを連続
して使用し、繰り返す。
3’ −CGCACGGGCCCACCACTTGGTCCGGTCGGTp−
5’ (3)5’ −pGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCG
AAAAC−3’ (4)3’ −GCAAAGACGCTTTTGAGCTp
−5’ (5)最終生成物は1acl遺伝子破片が固体サポートにカップルした
もので第4図に表わす。
サポートから重複DNAのリゲーション及び割裂サポートをリガーゼ バッファ
ー(50mM トリジルーHCl2 。
pH7,8,20mMジチオトレイトール、 10mM MgCQ、、 1m
M ATP。
0.05mg/m12牛の血清アルブミン)で2回洗浄し、後0.098m12
リガーゼ バッファーに再懸濁する。2マイクロリツトルのDNAリガーゼを加
える[ニューイングランド バイオラボ(NewEngland Bjolab
s)高活性品質]。
随時ゆるやかに撹拌しつ)37℃で30分間培養した後、サポートをAva、1
バ・ソフy−(10m間 トリス−HCQ、 pH8、50mMNaCl2.
lomM Mg(4,、5mM 2−メルカプトエタノール、0.lq/mQ牛
血清アルブミン)で2回洗浄する、後このバッファーの0.098mf2に再懸
濁する。制限酵素Avalにニュー イングランド バイオラボ)の2マイクロ
リツトルを加える、そして混合物を30分間37℃で培養しサポートからDNA
を割裂する。チューブを遠心分離しそして上澄液を集める。ビーズを0.1mQ
Avalバッファーで2回洗浄し、そして上澄液中のDNAをエタノールで沈澱
しそして1 mM EDTAを含むl101lIトリス−)ICQ、 p)17
.5の0.1−に溶かす。
合成遺伝子破片のクローニング及び分析上述で得られた重複1acl遺伝子破片
の約1 nmolを先にAva 1で割裂したM2S−1acl−SAXBのl
nmolと混合しそしてセファロース2Bカラム上を通し1acl遺伝子の4O
−bp1片を除く。DNAは上述のように4%DNAリガーゼでリゲートする。
DNAはE、コリイJM107株中に伝達した後、後代ファージをE、コリイD
P8株中にプレートする。この遺伝子システムは1acl遺伝子破片の化学的合
成中突然変異の可能性のある世代の評価の機会を与える(突然変異は誘導物質の
不存在下青いプラークとして見られる)。この実験による突然変異の頻度は自然
頻度では確認されなかった。
半合成MI3−1aclのDNAは“ジデオキシ”法により配列されそして化学
合成の域中に希望する広い形の配列を含むことを見出した。このように、本発明
の方法により合成したDNA重複は天然に生じた広い形の1aclの突然変異の
配列と同一である。
第2図は生物高分子再構成(レモデリング)の一般的方法を示したものではある
が、この方法の多くの変形、特に異なった生物高分子及び操作の異なった形も本
発明の範囲内であることは当業者において明らかなことである。例えば、固相レ
モデリング法は特殊の異なった蛋白質の破片、変形した破片を置換えて使用する
ことができる面相“組み換え蛋白質“技術類似の先に述べた固相組み替えDNA
を使用することもできる。
当業者は既に本技術を理解したように、本発明は前述のような目的及び目的物を
得る実施を適宜採用でき利用性を有するものである。こ)に述べた成分、方法及
び技術は好適な具体化を示したものであり、本発明の範囲内で限定されるもので
はない。その内での変形及び他の用途は本発明の概念中で当業者が考えられるこ
とである。
1(z) 未アニールオリゴの洗浄除去覗
IC3)集合全遺伝子の段階的アニーリング/洗浄固相ポリペプチド集合
j(2)過剰ペプチドの洗浄除去
1(3)濃縮/洗浄を段階的に行い希望する1 ポリペプチド集合
とするバイオポリマーの固相レモデリング
PC丁/υ589102915
工、CLASSIFICATrON AffD 5UBJECT MATTER
(CONT?NUED)IPC(4): Cl2N xsloo; C07
His/12u、s、cl、: 43S/172.3; S36/27図面
の簡単な説明
第1図は遺伝子又は遺伝子破片の構築に適用される固相生物高分子組立方法の線
図的な説明図である。
第2図はポリペプチドの構築に適用される固相生物高分予組立方法の線図的な説
明図である。
第3図は固相サポート上の生や高分子の複製の方法を線図的に示す説明図である
。
Claims (13)
- 1.オリゴメリツクサブコンポーネントから生物高分子を組立てる方法であって 、(1)生物高分子オリゴメリックサブコンポーネントの一端を固相支持体に取 付ける工程、(2)次の生物高分子シーケンスをサポートーバウンド(sapp ort−bound)コンポーネントの自由端又はその近くに取付ける工程、( 3)取付けられない余分なオリゴメリックシーケンスを除去する工程、(4)指 示されてオリゴメリック生物高分子をサポートーバウンドコンポーネントの自由 端又はその近くに順次オリゴメリック生物高分子を順次取付け、生物高分子の組 付けを行う工程、(5)前記支持体から組付けられた他物高分子を離間する工程 とを有する。
- 2.オリゴメリックサブコンポーネントから生物高分子を組立てる方法であって 、(1)第1オリゴヌクレオチドをその第1端またはその近くにおいて固相支持 体に組付ける工程、(2)取付けられない余分なオリゴヌクレオチドを除去すあ 工程、(3)少くとも5−100ベース対を含む次のオリゴヌクレオチドを前記 バウンドオリゴヌクレオチドの自由端に補足的に混成する工程であって、その際 前記次のオリゴヌクレオチドは前記補足シーケンスより多い少くとも5−100 ベース対を含む工程、(4)取付けられない余分なオリゴヌクレオチドを除去す る工程、(5)指示されてオリゴヌクレオチドシーケンスをサポートーバウンド コンポーネントの自由端又はその近くに順次混成するために工程(3)(4)を 繰り返す工程と、(6)組付けられた遺伝子または遺伝子断片をサポートから離 間する工程とを具えている。
- 3.前記生物高分子は、遺伝子又はその一部分、ゲノム又はその一部分、リボ核 酸、ポリペプチド、多糖類からなる群から選ばれる請求の範囲1に記載の組立方 法。
- 4.順次付加されるコンポーネントは水素結合、静電的相互作用または疎水性相 互作用を含む非共有力によってサポートーバウンド生物高分子に非共有的に取付 けられる請求のの範囲1に記載の組立方法。
- 5.順次付加されるコンポーネントは、化学反応又は酵素力によってサポートー バウンド生物高分子に非共有的に結合される請求の範囲1に記載の組立方法。
- 6.前記固相サポートは、ポーラスでなく、シリカ(ガラス)、ラテックス、ポ リスチレン、プラスチックからなる群から選ばれた粒状物からなる請求の範囲1 に記載の組立方法。
- 7.前記固相サポートは、生物高分子組立体の立体障害を避けるのに充分な大き さのイントラマトリックススペース(孔)を有するマクロ細孔物からなる請求の 範囲1に記載の組立方法。
- 8.生物高分子の部分的入換または改変の改造方法であって、固相サポート物質 と、生物高分子を前記サポートに生物高分子シーケンス内の1つまたはそれ以上 の位置において取付ける手段と、サポートーバウンド生物高分子の少くとも1つ の特殊セグメントを除去し、その除去されたセグメントを洗浄し、改変されて置 換されたセグメントを付加することによって置換し、置換セグメントはサポート ーバウンド生物高分子に特別に取付けられ、このようにして生物高分子の部分的 置換を行う手段と、サポートから改造された生物高分子を離間する手段とを具え ている。
- 9.サポートーバウンド生物高分子は、複合ストランドDNA分子であり、除去 手段は限定されたうちヌクレアーゼを含み、置換セグメントは複合ストランドD NAセグメントを含んでいて、天然物から合成又は分離されて生成され、置換セ グメントをDNAリガーゼからなるサポートーバウンドに再結合するための手段 を含む請求の範囲8に記載の改造方法。
- 10.サポートーバウンド生物高分子は単一ストライドDNA分子であり、除去 手段は1つまたは多くの限定された内ヌクレアーゼ及び1つ又は多くの合成オリ ゴヌクレオチドを含み、内ヌクレアーゼの反応のために割裂部位を造るため単一 ストランドDNAをなまし、置換セグメントは複合ストランドDNAセグメント を含んでいて、天然物から合成又は分離して生成され、サポートーバウンドDN Aに置換セグメントを再結合する手段はDNAリガーゼを含む請求の範囲8に記 載の改造方法。
- 11.サポートーバウンド生物高分子は、ポリペプチドからなり、除去手段は特 殊な内ヌクレアーゼを含み、置換セグメントはペプチドを含んでいて、天然物か ら合成又は分離して生成され、サポートーバウンドポリペプチドに付加セグメン トを連鎖するための手段は、化学的凝縮、酵素的結さつを含む請求の範囲8に記 載の改造方法。
- 12.生物高分子の細結合は置換セグメントなしに行われ、生体高分子から1つ 又は多くのセグメントが除去される請求の範囲8に記載の改造方法。
- 13.生物高分子の割裂は単一部位で生じ、付加生物高分子セグメントの加入は この部分に生ずる請求の範囲8に記載の改造方法。
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