EA024849B1 - Конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, и способ ее получения - Google Patents

Abstract

Описана конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, причем указанная конструкция образует звездообразную структуру, определяемую тремя или более стеблями, простирающимися из реакционного центра. Стебли образованы дуплексом нуклеиновой кислоты, и химическое соединение образовалось в реакционном центре в качестве продукта реакции трех или более химических групп. Преимущество конструкции заключается в том, что обеспечивается тесная близость между химическими группами в реакционном центре с промотированием посредством этого реакции образования химического соединения. Настоящее изобретение относится также к способу получения конструкции. Преимущество данного способа заключается в том, что он не требует предварительного синтеза большого количества матриц и не зависит от узнавания кодон/антикодон для кодируемой молекулы, которая должна быть синтезирована.

Description

Изобретение обеспечивает композиции и способы для технологии ДНК-дисплея ίη νίΐτο, позволяющие осуществлять дисплей различных молекул, таких как неприродные полимеры и малые молекулы. Преимуществами таких способов является то, что комбинаторные библиотеки могут быть сконструированы и подвергнуты раундам отбора на желаемые активности, амплификации и диверсификации, что делает возможной молекулярную эволюцию.

Уровень техники

Технологии дисплея были разработаны для объединения способностей хранения информации и амплификации нуклеиновых кислот с функциональными активностями другого соединения. Технологии дисплея основываются на связи между функциональной частицей и последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей информацию о структуре этой функциональной частицы. Преимущество таких способов заключается в том, что очень большие библиотеки могут быть сконструированы и протестированы на желаемую активность функциональных частиц. Члены библиотеки, имеющие желаемую активность, могут быть отделены от членов библиотеки, не имеющих желаемой активности, с получением обогащенной библиотеки с более высокой долей членов, имеющих желаемую активность. Такой процесс называют отбором. Затем структуры членов библиотеки в обогащенной библиотеке могут быть идентифицированы по их родственной последовательности нуклеиновой кислоты, что делает возможной идентификацию даже из незначительных количеств материала.

Кроме того, некоторые технологии дисплея делают возможной амплификацию обогащенной библиотеки без знания идентичности ее членов; не только последовательностей нуклеиновых кислот, но также функциональных частиц. Такие технологии дисплея называют амплифицируемыми технологиями дисплея. Указанные технологии являются особенно выгодными при работе с большими библиотеками, так как могут выполняться итеративные (повторяющиеся) раунды отбора и амплификации, делающие возможным увеличенное обогащение желаемых активностей. Другое преимущество амплифицируемых технологий дисплея заключается в том, что могут выполняться раунды отбора, амплификации и диверсификации, т.е. использование того же принципа, что и принцип естественного отбора, для развития молекул с желаемой функцией. Процесс называют молекулярной эволюцией.

Были разработаны технологии дисплея, использующие биологические системы, наиболее значительной из которых является фаговый дисплей (διηίΐΐι. §с1епсе, 228, 1315-7, 1985). Однако такие системы ограничиваются дисплеем природных продуктов, таких как белки и пептиды.

Были описаны технологии дисплея ίη νίΐτο, использующие гибкость органической химии. Один пример описан в США 5723598. Данный способ использует бифункциональную молекулу; одна функциональная группа способна присоединять химическую группу, а другая функциональная группа способна присоединять последовательность нуклеиновой кислоты. Способ синтеза такой библиотеки обычно известен как расщепление и смешивание и состоит из раундов смешивания и расщепления бифункциональных молекул в компартментах. Добавляют специфическую в отношении компартмента пару химической группы и последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, последовательности нуклеиновых кислот кодируют химические группы. Затем все бифункциональные молекулы смешивают и процесс повторяют для создания большой комбинаторной библиотеки. Затем библиотеку подвергают отбору и отобранные последовательности нуклеиновых кислот амплифицируют при помощи ПЦР, которая может быть использована для идентификации при помощи общепринятых способов молекулярной биологии: клонирования и секвенирования ДНК.

Другой пример описан в νθ 04/039825А2, где комбинаторную библиотеку создают с использованием раундов направляемого близостью присоединения родственных пар химической группы и кода нуклеиновой кислоты к бифункциональной молекуле; одна функциональная группа способна присоединять химическую группу, а другая функциональная группа способна присоединять последовательность нуклеиновой кислоты. Кроме того, используют репертуары так называемых единиц переноса, где химическая группа присоединена к олигонуклеотиду, содержащему кодирующий сегмент и сегмент, способный отжигаться с бифункциональной молекулой. Репертуар единиц переноса отжигают с бифункциональными молекулами, что позволяет коду переноситься ферментативно в бифункциональную молекулу, а также направлять химическую группу на реакцию с той же самой бифункциональной молекулой. Указанный процесс может повторяться циклически для создания большой комбинаторной библиотеки.

Описанные выше библиотеки могут быть подвергнуты отбору для образования обогащенной библиотеки. История синтеза членов обогащенных библиотек может быть затем расшифрована через кодирующую нуклеиновую кислоту. Однако ограничением этих подходов является то, что обогащенная библиотека не может быть амплифицирована.

Были описаны технологии дисплея ίη νίΐτο, использующие гибкость органической химии и раунды отбора, амплификации и диверсификации. Эти способы основаны на применении матриц.

Один пример описан в νθ 00/23458, использующий принцип расщепления и смешивания. Используют библиотеку одноцепочечных ДНК(55ПЫА)-матриц, каждая из которых содержит сайт химической реакции и несколько положений сегментов кодонов. Матрицы компартментализуют на основании гибридизации с репертуаром последовательностей антикодонов для конкретного положения кодона. За- 1 024849 тем компартмент-специфическую реакцию осуществляют модификацией реакционного сайта на матрицах. Затем матрицы смешивают и процесс повторяют циклически с использованием других положений кодонов для образования комбинаторной библиотеки.

В \νϋ 02/074929А2 описан другой пример, использующий принцип единственного сосуда. Используют библиотеку олигонуклеотидных матриц, каждая из которых содержит сайт химической реакции и несколько положений сегментов кодонов. Кроме того, с использованием репертуара единиц переноса, данный способ включает использование олигонуклеотидной последовательности антикодона и химической реакционноспособной группы. Библиотеку матриц гибридизуют с репертуаром единиц переноса для конкретного положения кодона. Это вводит химическую группу на гибридизованную единицу переноса вблизи реакционного сайта на гибридизованной матрице, которая затем направляет химическую реакцию родственных пар. Затем процесс циклически повторяют с использованием других положений кодонов для образования комбинаторной библиотеки.

Недостаток вышеописанного направления по принципу близости родственных пар кода и химической группы заключается в линейной структуре матричного олигонуклеотида. Вследствие линейности расстояние между кодоном и сайтом химической реакции будет различаться от одного положения кодона к другому положению кодона. Для положений кодонов, расположенных дальше от сайта реакции, направление по принципу близости становится компромиссным, так как локальная концентрация падает до показателя степени 3 в зависимости от расстояния. Этот недостаток становится более ярко выраженным для комплексных библиотек, с большим количеством положений кодонов и более сложными кодонами.

Эту проблему пытаются решить авторы νθ 04/016767А2, где единицы переноса, наряду с сегментом антикодона, содержат также константный сегмент, который комплементарен константной последовательности на матрице вблизи реакционноспособного сайта. Таким образом, гибридизация единицы переноса с матрицей приводит к тому, что последовательность матрицы между положением рассматриваемого кодона и константным сегментом выпячивается с образованием так называемой омегаструктуры. Такая концепция предполагает, что сегмент кодона является ответственным за специфичность, и константный сегмент является ответственным за близость. В νθ 04/016767А2 предполагается также так называемая Т-структура матриц, где реакционноспособный сайт на матрице расположен в середине матрицы, и положения кодонов расходятся на каждой стороне. Таким образом, проблема расстояния, как говорится, уменьшена наполовину.

В νθ 2004/056994А2 описан способ, аналогичный способу νθ 02/074929А2 или νθ 04/016767А2, с той разницей, что матрица разрезана на минорные последовательности, называемые в данном описании соединительными полинуклеотидами. Соединительные полинуклеотиды соединяют единицы переноса для приведения их в реакционную близость. В некоторых вариантах осуществления соединительные полинуклеотиды могут содержать реакционноспособную химическую группу. Для получения кодируемой молекулы способ зависит от узнавания кодон/антикодон перед реакцией.

Затем направляемые матрицами библиотеки, описанные выше, подвергают отбору для образования обогащенных библиотек. Впоследствии история синтеза членов обогащенных библиотек может быть расшифрована через кодирующую нуклеиновую кислоту. Обогащенные библиотеки могут быть также амплифицированы и диверсифицированы, например, склонной к ошибкам ПЦР, что делает возможной молекулярную эволюцию.

Недостаток таких подходов заключается в том, что должно быть создано большое количество матриц, что является трудоемким, так как матрицы должны иметь значительную длину, чтобы гарантировать правильную гибридизацию кодон/антикодон. В способах, использующих множество минорных последовательностей для осуществления конечного направленного синтеза, количество последовательностей, которые должны быть синтезированы, является даже более высоким, чем фактический размер библиотеки.

Способы предшествующего уровня техники, использующие матрицы, страдают вследствие недостатка, заключающегося в том, что кодирование зависит от гибридизации последовательностей кодонов и антикодонов. Иногда гибридизация между одноцепочечными олигонуклеотидами будет происходить без точных комплементарностей. В случае конструирования библиотек результатом является потеря связи между кодированием и историей синтеза. В результате, после отбора положительные коды могут быть не отобранными, и отрицательные клоны могут быть отобраны. Для более сложных библиотек этот недостаток становится более важным, так как сложность одноцепочечных олигонуклеотидов также увеличивается как в отношении количеств, длины, так и в отношении последовательностей. Это делает указанные способы более трудным для контролирования.

Как описано выше, были разработаны технологии дисплея ίη νίίτο, допускающими проявление (дисплей) различных классов соединений, отборов, амплификации и диверсификаций. Однако все еще существует растущая потребность в улучшении, особенно в отношении качества в конструировании библиотек и диверсификации. Настоящее изобретение предоставляет способ получения кодируемой молекулы, причем данный способ не требует предварительного синтеза большого количества матриц. Кроме того, данный способ не зависит от узнавания кодон/антикодон для кодируемой молекулы, которая должна быть образована.

- 2 024849

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к технологии дисплея ίη νίΐτο, использующей преимущество гибкости органической химии и допускающей раунды отбора, амплификации и диверсификации.

В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей нуклеиновую кислоту и химическое соединение, причем указанная композиция образует звездообразную структуру, определяющую 3 или более стеблей, простирающихся из реакционного центра, причем стебли образованы дуплексом нуклеиновой кислоты, и химическое соединение образовывалось в реакционном центре в виде продукта реакции 3 или более химических групп.

Нуклеиновая кислота образует сверхструктуру, в которой различные сегменты гибридизуются друг с другом таким образом, что образуется структура, похожая на звезду. Звездообразная структура содержит реакционный центр и множество стеблей. В реакционном центре химическое соединение получали в виде продукта реакции из 3 или более химических групп. Стебли являются дуплексами нуклеиновых кислот, т.е. стебель содержит два гибридизующихся сегмента, комплементирующих друг друга в достаточной степени для образования дуплекса в условиях, благоприятствующих реакции химических групп, таким образом, чтобы образовалось химическое соединение.

По меньшей мере один из стеблей простирается радиально от центра. Предпочтительно, 3 или более стеблей простираются радиально наружу от реакционного центра. Считают, что дуплексная нуклеиновая кислота стеблей собирает химические группы вместе таким образом, что образуется реакционная близость. Близость, установленная между химическими группами, увеличивает локальную концентрацию и увеличивает шансы протекания реакции. Присутствие 3 или более стеблей в звездообразной структуре создает сильную сверхструктуру, которая является стабильной даже в условиях, в которых единый дуплекс будет разделяться на две дискретные одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Таким образом, звездообразная структура дает возможность использовать гибкие условия реакции для промотирования реакции между химическими группами. Эксперименты, о которых сообщается, показывают, что трехстебельная звездообразная структура является достаточно стабильной для направления органического синтеза в средах, содержащих более 35% ацетонитрила и тетрагидрофурана и более 40% ДМФА. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения звездообразная структура включает 4, 5, 6, 7 или более стеблей, соединенных с общим реакционным центром. При увеличении количества стеблей стабильность звездообразной структуры также увеличивается.

Нуклеиновая кислота сегментирована на различные части с определенными функциями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит один или несколько кодонов, идентифицирующих одну или несколько химических групп, которые участвуют в образовании образуемого химического соединения. Присутствие сегмента кодона допускает не только использование нуклеиновой кислоты для промотирования реакционной близости, но также использование нуклеиновой кислоты для кодирования одной или нескольких химических групп, которые участвуют в образовании химического соединения. Присутствие одного или нескольких кодонов особенно полезно для целей декодирования. Когда образованное химическое соединение присутствует в малом количестве или присутствует в смеси с другими соединениями, легкая идентификация может быть выполнена с использованием молекулярно-биологических способов.

Кодон, идентифицирующий химическую группу, может присутствовать в любом месте в нуклеиновой кислоте, образующей звездообразную структуру, т.е. кодон может присутствовать в реакционном центре или вблизи от реакционного центра, в сегментах гибридизации или в других частях звездообразной структуры. В определенном аспекте настоящего изобретения кодон расположен на конце стебля. Кодон, расположенный на конце стебля, направленном от центра, дает большую свободу в конструировании звездообразной структуры нуклеиновой кислоты, так как кодон на конце не должен обязательно принимать участие в образовании дуплекса или в образовании окружения для реакционного центра.

Стебли могут иметь затупленные концы, липкие концы или может присутствовать петля. Стебель с затупленным концом или липким концом может быть предпочтительным, когда предполагается лигирование стебля с другой нуклеиновой кислотой. В определенном варианте осуществления на конце стебля образована петля. Петля образует физическую связь между двумя цепями, образуя таким образом ковалентную связь между различными частями сверхструктуры нуклеиновой кислоты. В определенном варианте осуществления петли присутствуют на всех концах стеблей, образуя таким образом кольцевую нуклеиновую кислоту. В другом варианте осуществления петля присутствует на всех концах стеблей, за исключением одного конца, образуя таким образом непрерывную последовательность нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, непрерывная последовательность содержит сайт праймирования для ферментативного удлинения нуклеиновой кислоты с использованием полимеразы или другого активного в отношении нуклеиновой кислоты фермента. В подходящих случаях сайт праймирования присутствует в стебле, не имеющем петли. Предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит сайт праймирования для ДНКполимеразы, РНК-полимеразы или обратной транскриптазы. Таким образом, петли допускают получение двухцепочечного продукта удлинения, демонстрирующего образованное химическое соединение.

Важно, что продукт удлинения содержит обычно линейный дуплекс, т.е. комплементирующая цепь была образована реакцией удлинения. Реакция удлинения разрушает реакционный центр, так что хими- 3 024849 ческое соединение, ранее образованное реакцией в реакционном центре, проявляется в среде. Проявление (дисплей) химического соединения дает возможность использовать различные стратегии отбора на библиотеке продуктов удлинения, как обсуждается позднее в данном описании.

После отбора возможность амплификации нуклеиновой кислоты особенно важна для целей идентификации, так как химическое соединение может быть идентифицировано даже в случаях, в которых оно встречается только в незначительных количествах. Непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит кодоны всех реагентов, которые участвуют в образовании кодируемого химического соединения.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кодон расположен в части, не имеющей спаривания оснований, структуры стебель-петля. Присутствие в петле кодона допускает использование любой комбинации нуклеотидов в данном конструировании, так как конкретная последовательность кодона не оказывает существенного влияния на гибридизацию и реакционные свойства.

В некоторых аспектах настоящего изобретения в структуре стебель-петля присутствует сайт ферментативной рестрикции. В зависимости от конкретной используемой зндонуклеазы одна или обе цепи структуры стебель-петля могут быть разорваны. В определенном варианте осуществления только одна из цепей вблизи петли разрывается с образованием сегмента одноцепочечной нуклеиновой кислоты. Сегмент одноцепочечной нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит кодон. Приемлемым для этой цели ферментом является Ы.ВЬус ΙΑ. В другом варианте осуществления обе цепи разрываются и образуется липкий конец, т.е. выступ одноцепочечной нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, кодон присутствует в одноцепочечном выступе. В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительно добавлять хелперный (вспомогательный) олигонуклеотид, комплементарный петле по меньшей мере части последовательности нуклеиновой кислоты. В подходящих условиях хелперный олигонуклеотид гибридизуется с последовательностью петли и образует субстрат для фермента рестрикции (рестриктазы).

Стебли звездообразной структуры могут иметь любую подходящую длину. Обычно, стебель содержит два сегмента гибридизации, имеющих по меньшей мере 80% комплементарность, и каждый сегмент гибридизации состоит из 12 или более нуклеотидов. Комплементарность обычно составляет 90% или более, например, 95% или более. Сегменты гибридизации могут содержать менее чем 12 нуклеотидов, для определенных применений, в которых стабильность звездообразной структуры может осуществляться, например, 11, 10, 9, 8, 7 или 6 нуклеотидами. Однако обычно желательно более высокая стабильность. Подходящую стабильность в большинстве условий получают, когда каждый сегмент гибридизации содержит 18 или более нуклеотидов. При использовании условий, которые не благоприятствуют гибридизации, т.е. температур, гораздо более высоких, чем температура окружающей среды, высоких концентраций соли или присутствия органических растворителей, обычно используют сегменты гибридизации из 20 или более нуклеотидов.

После реакции отдельных химических групп образованное химическое соединение предпочтительно присоединяют к нуклеиновой кислоте. В некоторых применениях может быть желательным использование гибридизации для присоединения образованного химического соединения к нуклеиновой кислоте звездообразной структуры; однако ковалентное присоединение гарантирует, что химическое соединение и часть, являющаяся нуклеиновой кислотой, остаются вместе во время последующего отбора.

Химическая группа, которая должна реагировать в реакционном центре, может быть связана с нуклеиновой кислотой любым подходящим способом. Например, химические группы перед реакцией ковалентно присоединяют к нуклеиновой кислоте. Обычно одно или несколько из ковалентных присоединений расщепляются одновременно с реакцией или после реакции. Ковалентная связь может быть сконструирована таким образом, что она является расщепляемой или долговременной. Кроме того, расщепляемая связь может быть сконструирована таким образом, что она расщепляется сразу же после реакции, или сконструирована таким образом, что она расщепляется на стадии после реакции.

Обычно химическое соединение образуется реакцией химических групп, присоединенных к нуклеиновой кислоте, и, необязательно, одного или нескольких дополнительных реагентов. Реагенты могут происходить из любого источника, включая соединение, добавленное к среде в виде свободного реагента, не связанного с нуклеиновой кислотой. Дополнительный реагент или дополнительные реагенты могут быть каркасами, сшивающими агентами, активирующими агентами, удаляющими защитные группы агентами и т.д.

Звездообразные структуры в соответствии с данным изобретением полезны в генерировании библиотек различных химических соединений, ассоциированных с генетическим кодом. Таким образом, настоящее изобретение относится также к библиотеке звездообразных структур. Каждая из звездообразных структур может присутствовать в нескольких копиях в среде, и среда обычно содержит звездообразные структуры, содержащие различные химические соединения. Например, библиотека согласно изобретению может содержать по меньшей мере 1000 различных химических соединений, предпочтительно 10⁶ различных химических соединений и более предпочтительно 10⁹ различных химических соединений.

В другом аспекте настоящее изобретение может быть описано как относящееся, например, к способу синтеза больших библиотек, связанных с кодирующими нуклеиновыми кислотами через звездооб- 4 024849 разную структуру, образованную взаимокомплементарными олигонуклеотидами. Ее получают гибридизацией олигонуклеотидов, содержащих два сегмента, где сегмент около 3'-конца одного олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца в следующем олигонуклеотиде и т.д. Наконец, сегмент около 3'-конца последнего олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца первого олигонуклеотида. Таким образом, средняя зона между двумя сегментами гибридизации на каждом олигонуклеотиде направлена к центру образованного кольца, тогда как концы направлены наружу, что образует звездообразную структуру. Таким образом, при использовании трех типов олигонуклеотидов образуются три стебля, при использовании четырех типов олигонуклеотидов образуются четыре стебля и т.д. Химическая реакционноспособная группа ассоциирована со средней зоной на каждом олигонуклеотиде, что допускает протекание химических реакций, направляемых близостью к центру. Кроме того, кодон предпочтительно расположен снаружи от гибридизуемого сегмента на каждом олигонуклеотиде, что допускает кодирование химических групп, участвующих в создании продукта реакции. Олигонуклеотиды с ассоциированными химическими группами называют здесь модулями-носителями. Таким образом модуль-носитель имеет химическую группу, два положения специфических сегментов и кодон. Образование кодированных комбинаторных библиотек становится возможным при использовании репертуаров модулей-носителей для каждого положения. Согласно определенному варианту осуществления собранные олигонуклеотиды становятся удлиняемыми или амплифицируемыми при лигировании концов в каждом стебле, за исключением одного, посредством образования петель для образования непрерывного олигонуклеотида с 5'- и 3'-концами. Таким образом, состоящая из одного стебля и ряда структур стебельпетля звездообразная структура может быть амплифицирована при помощи ПЦР или удлинена подходящим ферментом. Таким образом, комбинаторная библиотека-дисплей может быть подвергнута отбору, и члены обогащенной библиотеки могут быть идентифицированы по кодирующим их олигонуклеотидам.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к способу создания одной или нескольких химических структур, предусматривающему стадии:

(ί) обеспечения N (N=3-100) модулей-носителей, содержащих:

(1) модуль-носитель первого положения, имеющий

ί) сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуля-носителя положения Ν, и ίί) сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя второго положения, (2) модуль-носитель (модули-носители) положения η (η равен от 2 до Ν-1), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты модуляносителя η-1, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя η+1, и (3) модуль-носитель положения Ν, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного модуля-носителя Ν-1, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя, где по меньшей мере три из указанных модулей-носителей содержат ассоциированную химическую группу (СО), расположенную в средней зоне между сегментами гибридизации или вблизи нее, и, необязательно, сегмент кодона, расположенный снаружи относительно одного из сегментов гибридизации;

(ίί) приведения в контакт указанных модулей-носителей в условиях, допускающих гибридизацию указанных сегментов гибридизации, с приведением таким образом указанных химических групп в близость, причем образованное химическое соединение связано по меньшей мере с одним из указанных модулей-носителей.

Ν обозначает общее количество модулей-носителей, используемых в образовании химической структуры. Так, при использовании трех модулей-носителей в образовании химической структуры Ν равно 3, при использовании четырех модулей-носителей в образовании химической структуры N равно 4, и т.д. η обозначает конкретное положение модуля-носителя.

Таким образом, когда N равно 3, (1) используют модуль-носитель первого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуляносителя третьего положения, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя второго положения; (2) используют модуль-носитель второго положения (η=2), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты первого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом третьего модуля-носителя; и (3) используют модуль-носитель третьего положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты второго модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя.

Когда N равно 4, (1) используют модуль-носитель первого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуля-носителя четвертого положения, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуляносителя второго положения; (2) используют модуль-носитель второго положения (η=2), имеющий сег- 5 024849 мент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты первого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом третьего модуля-носителя; и используют модуль-носитель третьего положения (п=3), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты второго модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом четвертого модуля-носителя, и (3) используют модуль-носитель четвертого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного третьего модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя.

Когда N равно 5, (1) используют модуль-носитель первого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуля-носителя пятого положения, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя второго положения; (2) используют модуль-носитель второго положения (п=2), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты первого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом третьего модуля-носителя; и используют модуль-носитель третьего положения (п=3), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты второго модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом четвертого модуля-носителя (п=4), и используют модуль-носитель четвертого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного третьего модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного пятого модуля-носителя; и (3) используют модуль-носитель пятого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного четвертого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя.

Вышеописанный способ может сопровождаться стадией обеспечения условий, делающих возможным лигирование концов модуля п-1 с модулем п и модуля N-1 с модулем Ν, с образованием посредством этого молекулы непрерывной нуклеиновой кислоты со структурами стебель-петля и ассоциированным химическим соединением. Таким образом, когда N равно 3, концу первого модуля позволяют лигироваться с концом второго модуля, а концу второго модуля позволяют лигироваться с третьим модулем. Когда N равно 4, концу (п=2) первого модуля позволяют лигироваться с концом второго модуля, концу (п=3) второго модуля позволяют лигироваться с третьим модулем и концу третьего модуля позволяют лигироваться с четвертым модулем. Когда N равно 5, концу (п=2) первого модуля позволяют лигироваться с концом второго модуля, концу (п=3) второго модуля позволяют лигироваться с третьим модулем, концу (п=4) третьего модуля позволяют лигироваться с четвертым модулем и концу четвертого модуля позволяют лигироваться с концом пятого модуля.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, модули-носители положения N могут быть лигированы с первым модулем-носителем с образованием таким образом кольцевой нуклеиновой кислоты.

Композиция, содержащая структуру нуклеиновой кислоты и ассоциированных химических соединений, полученная в соответствии с вышеописанным способом, является новой, так как модули-носители создают новую звездообразную структуру, которая отличается от структур, созданных в предшествующем уровне техники. См., например, предшествующий уровень техники, описанный в разделе Уровень техники выше.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения обеспечен способ, который гарантирует тесную близость между реакционными химическими группами и амплификацию полного генетического кода истории синтеза образованного химического соединения. Таким образом, в предпочтительном аспекте данный способ предусматривает приведение в контакт модулей-носителей в условиях, допускающих гибридизацию сегментов гибридизации, приводящее таким образом к приведению реакционных групп в необходимую для реакции близость; и обеспечение условий, допускающих реакцию реакционноспособных групп, причем образованное химическое соединение ассоциировано по меньшей мере с одним модулем-носителем; и условий, делающих возможным лигирование концов модуля п-1 с модулем п и модуля N-1 с модулем N с образованием посредством этого молекулы непрерывной нуклеиновой кислоты со структурами стебель-петля и ассоциированным химическим соединением.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, N равно 3, 4, 5, 6, 7. Предпочтительно, каждый из модулей-носителей содержит ассоциированную химическую группу (СС), расположенную в средней зоне между сегментами гибридизации или вблизи от нее, и сегмент кодона снаружи от одного из сегментов гибридизации.

Контактирование модулей-носителей может выполняться последовательно, т.е. модули-носители могут приводиться в контакт в любом порядке между отдельными модулями-носителями, или указанный контакт может выполняться одновременно, т.е. все модули-носители или по меньшей мере существенное

- 6 024849 количество модулей-носителей смешивают вместе в условиях гибридизации таким образом, чтобы образовывался надмолекулярный комплекс. При выполнении последовательной реакции химических групп и использовании только части из общего количества модулей-носителей, требуемых для сборки полной звездообразной структуры, могут быть использованы вспомогательные олигонуклеотиды для сборки звездообразной структуры, посредством которой образуется реакционный центр. Таким образом, когда стадия образования химического соединения включает сборку двух модулей-носителей посредством гибридизации соответствующих сегментов гибридизации, вспомогательный олигонуклеотид, имеющий сегменты, обратно комплементарные негибридизовавшимся гибридизационным сегментам, может быть добавлен для образования звездообразной структуры.

После того как химические группы, присоединенные к модулям-носителям, приведены в тесную близость в реакционном центре, осуществляют реакцию. Химические группы могут быть сконструированы таким образом, что реакция происходит мгновенно, как только указанные группы приходят в необходимое для реакции расстояние друг от друга, или указанные группы могут быть сконструированы таким образом, что необходим дополнительный (внешний) компонент для того, чтобы произошла реакция. Таким дополнительным (внешним) компонентом может быть реагент, фотон, электромагнетизм или любые другие промоторы, которые влияют на реакцию. В определенном аспекте настоящего изобретения используют ортогональную химию, т.е. химические группы конструируют таким образом, что регулируется последовательность реакции.

Реакционный центр определяется стеблями, окружающими указанный центр. Было сделано предположение, что расстояние между двумя реагирующими веществами в реакционном центре составляет меньше 10 нм. Если предположить, что реакционный центр является сферическим, то можно рассчитать, что концентрация реагентов равна 1 мМ. В биологическом контексте концентрация такого размера считается высокой, и можно предположить, что реакция протекает в пределах разумного времени. Кроме того, концентрация свободного реагирующего вещества в среде является очень низкой, когда модулиносители вводят в корректируемых молярных количествах, так что реакция в реакционном центре является в значительной степени превосходящей ненаправленную реакцию.

Средняя зона модуля-носителя может содержать любые подходящие химические группы. Для создания возможности ферментативного удлинения, например, полимеразой, средняя зона модуля-носителя предпочтительно содержит химическую связь или 1-20 нуклеотидов. Нуклеотиды могут быть модифицированы для получения определенных условий реакции в реакционном центре.

Например, нуклеотиды средней зоны могут быть модифицированы липофильными группами для обеспечения высокой мобильности и реактивности ассоциированных химических групп. Химическая группа может быть ассоциирована с модулем-носителем в различных положениях. В одном аспекте химическая группа ассоциирована с нуклеиновым основанием средней зоны. В другом аспекте, химическая группа ассоциирована с фосфодиэфирной связью средней зоны.

Когда химическая группа присоединена к скелету молекулы, точка присоединения обычно находится при фосфоре межнуклеозидной связи. При использовании нуклеинового основания для присоединения химической группы точка присоединения обычно находится в положении 7 пуринов или 7деазапуринов или в положении 5 пиримидинов. Нуклеотид может быть дистанцирован от реакционноспособной группы химической группы спейсерной молекулой. Спейсер может быть построен таким образом, что конформационное пространство, занимаемое реакционноспособной группой, является оптимизированным для реакции с реакционноспособной группой другой химической группы в реакционном центре. Обычно химическая группа ассоциирована со средней зоной посредством одной или нескольких ковалентных связей.

Цитирование может выполняться перед реакцией, одновременно с реакцией или после реакции, и лигирование может выполняться ферментативно или химически по выбору экспериментатора. Для уменьшения количества свободных негибридизующихся модулей-носителей в среде обычно желательно лигировать модули-носители перед реакцией.

Образованное химическое соединение может быть ассоциировано с молекулой нуклеиновой кислоты посредством химических взаимодействий. В соответствии с предпочтительным аспектом образованное химическое соединение ковалентно ассоциировано по меньшей мере с одной из указанных молекулносителей или непрерывной молекулой нуклеиновой кислоты. Относительно сильная ассоциация между образованным химическим соединением и нуклеиновой кислотой, такая как ковалентная связь, полезна во время скрининга библиотеки, так как может быть желательным применение жестких условий, которые могут разрушать более слабые связи, такие как водородные связи.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения один или несколько модулей-носителей обеспечиваются сайтом праймирования для ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или обратной транскриптазы. Присутствие сайта праймирования способствует амплификации генетического кода для химической группы, которая прореагировала при образовании химического соединения. В случае отсутствия лигирования, т.е., когда генетический код для каждой из химических групп остается в виде отдельных частиц, удерживаемых вместе гибридизацией, предпочтительно, чтобы каждый модуль-носитель содержал сайт праймирования. После выполнения отбора библиотеки можно получить информацию в отно- 7 024849 шении каждой из химических групп, которые участвовали в образовании успешных химических соединений, т.е. соединений с желаемым свойством. Одним путем получения такой информации является определение количества продукта амплификации с использованием хорошо известных способов, таких как фРСР или стандартная ПЦР, комбинированная с микроматрицей. Данная информация может быть использована в образовании библиотеки второй генерации с уменьшенным расхождением, так как она должна включать только модули-носители в библиотеке, которые являются успешными. Библиотека с уменьшенным расхождением является также сфокусированной библиотекой, так как изобилие химических соединений с желаемым свойством является более высоким.

При лигировании вместе двух или более модулей-носителей можно получить информацию о реагентах, которые вместе участвуют в образовании химических соединений с желаемым свойством. Предпочтительно, все модули-носители лигируются вместе таким образом, что образуется линейная нуклеиновая кислота или кольцевая нуклеиновая кислота. Таким образом, при лигировании вместе двух или более модулей-носителей необходим единственный сайт праймирования для амплификации непрерывной нуклеиновой кислоты, содержащей два кодона. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления способ настоящего изобретения предусматривает сайт праймирования для ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или сайт обратной транскриптазы по меньшей мере в первом модуле-носителе и/или в модуле-носителе N. При лигировании вместе всех модулей-носителей, т.е. когда первый модульноситель лигирован с модулем-носителем η (п=2 до N-1), который лигирован с модулем-носителем Ν, нуклеиновая кислота может быть удлинена, когда сайт праймирования расположен в одном из ее концов. Для уменьшения риска того факта, что образованное химическое соединение останется скрытым в его реакционном центре, удлинение выполняют предпочтительно перед процессом отбора. Удлинение непрерывной нуклеотидной последовательности эффективно демонстрирует образованное химическое соединение среде и любой мишени, которая может присутствовать в ней.

Предпочтительно, сайт праймирования для гибридизации прямого праймера расположен на одном конце, а сайт праймирования для гибридизации обратного праймера расположен на другом конце, чтобы сделать возможной амплификацию в соответствии с протоколом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-амплификацию выполняют предпочтительно после выполнения отбора для генерирования большего количества копий генетического материала структур, имеющих желаемые свойства.

Таким образом, второй аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей структуру нуклеиновой кислоты и ассоциированного химического соединения, или библиотеку более чем одной из таких структур, получаемых по описанному выше способу.

Библиотека химических соединений, ассоциированная с нуклеиновой кислотой, кодирующей химические группы, которые могут участвовать в образовании химического соединения, может быть образована с использованием репертуара модулей-носителей на одном или нескольких положениях.

Библиотека, описываемая в данном описании, может быть использована для скрининга на представляющее интерес соединение. Обычно желательно иметь настолько большую библиотеку, насколько это возможно, для увеличения возможности нахождения соединения с желаемыми свойствами. В определенном аспекте настоящего изобретения таким свойством представляющего интерес соединения является его способность связываться с мишенью. Обычно предполагается, что возможность нахождения соединения с высокой аффинностью и специфичностью в отношении мишени увеличивается с увеличением размера библиотеки. Так, библиотека в соответствии с данным изобретением предпочтительно содержит более чем 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ и 10¹⁴ различных химических соединений, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, кодирующей историю синтеза.

Для получения библиотеки репертуара модулей-носителей может быть использован ряд положений. В одном аспекте настоящего изобретения, репертуар по меньшей мере в одном положении содержит по меньшей мере 10 различных модулей-носителей. В определенном аспекте, репертуар по меньшей мере в двух положениях содержит по меньшей мере 10 различных модулей-носителей. Для получения библиотеки одного миллиона различных химических соединений в одном и том же контейнере, многочисленные структуры настоящего изобретения могут быть образованы со 100 модулями-носителями в 3 различных положениях. Другими словами, синтез всего лишь 300 модулей-носителей допускает образование библиотеки миллиона соединений. Подобным образом, библиотека 100 миллионов соединений может быть образована с использованием 100 модулей-носителей в 4 различных положениях.

Настоящее изобретение относится также к способу выполнения замены модуля. Данный способ предусматривает стадии:

a) обеспечения последовательности одноцепочечной непрерывной нуклеиновой кислоты, содержащей N сегментов гибридизации и комплементирующих сегментов гибридизации, а также Ν-1 негибридизующихся сегментов между сегментами гибридизации и комплементирующими сегментами гибридизации,

b) гибридизации нуклеиновой кислоты в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации с образованием посредством этого непрерывной нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере Ν-1 структур стебель-петля и один стебель;

c) введения разрыва в указанный стебель или петлю с образованием посредством этого выступа, ко- 8 024849 торый содержит по меньшей мере один сегмент кодона;

ά) обеспечения первой группы модулей-носителей, имеющих, по меньшей мере, сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным стеблем, сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться со стеблем соседней структуры стебель-петля, необязательно ассоциированную реакционноспособную группу и сегмент антикодона;

ά) обеспечения условий, допускающих гибридизацию сегментов кодона и антикодона; и е) обеспечения условий, делающих возможным ферментативное или химическое лигирование указанного гибридизованного модуля-носителя с отступающими концами указанного выступа; и проведения стадий:

ί) расщепления ферментом рестрикции стебля или структуры стебель-петля, смежных с указанной последовательностью кодона, с образованием посредством этого выступов, которые содержат по меньшей мере следующий сегмент кодона; и ϊϊ) денатурации нуклеиновых кислот; и ίίί) гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием посредством этого N-1 структур стебель-петля и одного стебля с выступом, содержащим по меньшей мере следующий сегмент кодона; и ίν) необязательно обеспечения условий, допускающих реакцию указанных реакционноспособных групп, причем образованное химическое соединение ассоциировано по меньшей мере с одним из указанных модулей-носителей; и

ν) обеспечения следующей группы модулей-носителей, имеющих, по меньшей мере, сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным стеблем, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться со стеблем соседней структуры стебель-петля, и необязательно имеющих ассоциированную реакционноспособную группу и сегмент антикодона; и νΐ) обеспечения условий, делающих возможным ферментативное или химическое лигирование гибридизованного модуля-носителя с отступающими концами указанного выступа; и повторение стадий ι)(νί) N-1 раз; и

ί) введения разрыва в указанную структуру стебель-петля, состоящую частично из первой группы модулей-носителей, с оставлением по меньшей мере указанного сегмента антикодона, соединенного с указанным первым модулем-носителем; и

д) денатурации нуклеиновых кислот; и

1ι) гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием посредством этого N-1 структур стебель-петля и одного стебля; и (ί) необязательно обеспечения условий, допускающих реакцию указанных реакционноспособных групп, причем образованное химическое соединение ассоциировано по меньшей мере с одним из указанных модулей-носителей.

Непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты, используемая на стадии а), может быть обеспечена из ряда источников. В соответствии с первым аспектом, нуклеиновую кислоту обеспечивают описанным выше способом, но с использованием фиктивных модулей-носителей, не несущих химических групп. При лигировании вместе нуклеиновых кислот, представляющих модули-носители, образуется линейная или кольцевая нуклеиновая кислота. В соответствии со вторым аспектом, непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты, используемая на стадии а), может быть получена выполнением ферментативной реакции удлинения для проявления (дисплея) образованного химического соединения. Таким образом, после образования звездообразной структуры одноцепочечный продукт удлинения или цепь, комплементирующая продукт удлинения, могут быть использованы на стадии а). Если желательно, продукт удлинения может быть подвергнут полинуклеотидной амплификации, например, ПЦР, для амплификации количества копий нуклеиновой кислоты.

В определенном аспекте, непрерывную последовательность нуклеиновой кислоты на стадии а), Ь) или с) получают иммобилизацией смысловой цепи ПЦР-продукта на твердом носителе, выделением твердого продукта, позволяя смысловой цепи самогибридизоваться таким образом, чтобы образовалась звездообразная структура, и, необязательно, разрыванием стебля, соединяющего самогибридизующуюся звездообразную структуру с твердым носителем, с освобождением посредством этого звездообразной структуры от твердого носителя.

Подходящим способом иммобилизации смысловой цепи является присоединение биотина к праймеру, продуцирующему смысловую цепь. Затем эту смысловую цепь присоединяют к твердым носителям, таким как гранулы, покрытые стрептавидином. В зависимости от свойства твердого носителя он может быть выделен из остальной среды рядом способов. В настоящее время предпочтительным является использование магнитных гранул, которые могут быть легко отделены при помощи магнита. После промывания этого твердого носителя несколько раз смысловой цепи позволяют самогибридизоваться с образованием снова звездообразной структуры. В предпочтительном аспекте, рефолдинг выполняют посредством мгновенного охлаждения. Звездообразная структура может сохраняться на твердом носителе во время всего процесса замены модулей, или звездообразная структура может быть отщеплена от твердого носителя. Предпочтительно, расщепление стебля, присоединяющего твердый носитель и подверг- 9 024849 нутую рефолдингу звездообразную структуру, выполняют с использованием фермента рестрикции (рестриктазы). Способность рестриктазы выполнять это расщепление является тестом, подтверждающим внутримолекулярную укладку.

В определенных аспектах настоящего изобретения может быть удобным расщепление звездообразной структуры в петле. Поскольку большинство рестриктаз узнают только двухцепочечные нуклеиновые кислоты в качестве субстратов, расщепление в петле с использованием рестриктазы сразу является невозможным. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает дополнительную стадию добавления вспомогательного (хелперного) олигонуклеотида, комплементарного последовательности петли, перед стадией расщепления для создания двухцепочечного субстрата для рестриктазы в петле.

Настоящее изобретение относится также к способу скрининга библиотеки более чем одного химического соединения, предусматривающему:

зондирование библиотеки на члены библиотеки, имеющие химическое соединение с желаемым свойством;

отделение членов библиотеки, имеющих химическое соединение с желаемым свойством; и получение посредством этого обогащенного пула членов библиотеки, имеющих желаемое свойство. Обогащенный пул членов библиотеки, имеющих желаемое свойство, может быть выделен и охарактеризован, если желательно. Однако одним из преимуществ данного способа является то, что необязательно выделять обогащенный пул. В предпочтительном варианте осуществления обогащенный пул подвергают амплификации для увеличения генетического материала, показывающего историю синтеза химических соединений, имеющих желаемое свойство. Пул амплифицированной нуклеиновой кислоты, представляющей обогащенную библиотеку соединений с желаемым свойством, может быть декодирован (расшифрован) для идентификации реагентов, которые участвовали в синтезе химического соединения с желаемым свойством. Однако если обогащенный пул является большим, чем пул, который позволяет легко декодировать все количество нуклеиновой кислоты, настоящее изобретение предоставляет возможность повторной сборки химических соединений, кодируемых членами обогащенной библиотеки или нуклеиновой кислотой, представляющей такую обогащенную библиотеку, с использованием вышеописанного способа выполнения замены модулей.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации обогащенного пула членов библиотеки, имеющих желаемое свойство. Данный способ предусматривает то, что амплифицированным при помощи ПЦР олигонуклеотидам позволяют гибридизоваться в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, посредством чего повторно создают звездообразную структуру, состоящую из стебля и ряда структур стебель-петля. Стебель без петли содержит сайт узнавания для рестриктазы, которая разрезает вне его сайта узнавания и генерирует выступ после расщепления. Избыточность последовательности в созданном выступе может быть удобным образом использована для содержания в ней кодона. Затем расщепление стебля ферментом рестрикции генерирует кодон-специфические выступы для первого положения. Затем отщепленные ферментом рестрикции звездообразные структуры гибридизуют с репертуаром модулей-носителей, содержащих два константных сегмента для первого положения и родственную пару химической группы и антикодона. Затем гибридизации кодон/антикодон допускают лигирование подходящих пар модулей-носителей и звездообразных структур ДНК-лигазой. Соседняя структура стебель-петля также содержит сайт узнавания для другой рестриктазы, способной оставлять кодон-специфическиий выступ для второго положения. Таким образом, расщепление вторым ферментом рестрикции удаляет ковалентную связь ПЦР-амплифицированного первого модуля с остальной частью данной структуры. Звездообразные структуры денатурируют и затем позволяют им гибридизоваться в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации. Посредством этого звездообразные структуры воссоздаются, но теперь с новым модулем-носителем в положении один (с ассоциированной химической группой), и стебель, без петли, теперь расположен в положении два. Могут быть выполнены раунды указанного процесса для замены всех положений, чтобы сделать возможными направляемые близостью химические реакции правильных комбинаций химических групп. Таким образом, раунды отбора и амплификации могут выполняться, пока не будет достигнуто желаемое обогащение.

Разрывы в стеблях могут вводиться рядом способов, например, при помощи ферментов рестрикции (рестриктаз), при помощи РНКазы, Эндонуклеазы III, эндонуклеазы VIII, ЛРЕс|. Ррд или химическим расщеплением или фоторасщеплением.

Непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты, используемая на стадии а) способа замены модулей, описанного выше, может быть обеспечена скрещиванием. В определенном варианте осуществления способ скрещивания предусматривает стадии:

расщепления структур межмолекулярных гибридизованных нуклеиновых кислот, полученных из обогащенной библиотеки, двумя последовательными рестриктазами, которые удаляют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой, денатурации расщепленных структур, создания возможности повторной гибридизации фрагментов нуклеиновых кислот из расщепленных структур и, следовательно, создания возможности обмена части нуклеиновой кислоты, определяющей рассматриваемый модуль, для получения скрещивания, и лигирования соответствующих концов.

- 10 024849

В соответствии с данным способом, модули-носители или части нуклеиновых кислот, представляющих модули-носители, могут быть перетасованы. Перетасовка делает возможной диверсификацию (создание разнообразия) пула генов, сходную со скрещиванием в мейотической биологической системе. Данный способ может быть модифицирован, когда фрагменты нуклеиновых кислот, представляющие модули-носители, не присутствующие в образовании библиотеки первой генерации, добавляют перед созданием возможности повторной гибридизации. Альтернативно, модуль-носитель как таковой может быть добавлен перед созданием возможности повторной гибридизации. Когда к пулу генов добавляют новый генетический материал, это похоже на мутацию в биологической системе. Возможности выполнения скрещивания и операций мутации между генерациями библиотек делают эволюцию поразительно похожей на естественный процесс эволюции в поиске новых лекарственных средств-кандидатов.

Таким образом, в определенном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ диверсификации обогащенной библиотеки, создавая, таким образом, возможность молекулярной эволюции. В способе, описанном выше, для амплификации библиотеки-дисплея фракцию библиотеки в каждом раунде замены модуля расщепляют двумя последовательными рестриктазами, которые элиминируют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой. Звездообразные структуры денатурируют и гибридизуют с репертуаром модулей-носителей для рассматриваемого положения. Таким образом, специфические в отношении положения константные сегменты направляют гибридизации, эквивалентно созданию первичной библиотеки. Подходящие концы лигируют и образованный продукт объединяют с направляемой кодоном собранной фракции библиотеки, что приводит к диверсификации (созданию разнообразия). Таким образом, раунды отбора, амплификации и диверсификации могут выполняться, создавая возможность молекулярной эволюции.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ скрещивания обогащенной библиотеки, что, следовательно, делает возможной молекулярную эволюцию. В описанном выше способе для амплификации библиотеки-дисплея фракцию библиотеки в каждом раунде для замены модуля расщепляют двумя последовательными рестриктазами, которые элиминируют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой. Звездообразные структуры денатурируют и гибридизуют. Таким образом, специфические для положения константные сегменты направляют гибридизации и допускают обмен рассматриваемого модуля, т.е. скрещивание. Подходящие концы лигируют и образованный продукт объединяют с направляемой кодоном собранной фракцией библиотеки, что приводит к диверсификации. Таким образом, раунды отбора, амплификации, диверсификации и скрещивания могут выполняться, создавая возможность молекулярной эволюции.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ создания комбинаторных библиотек-дисплеев полимеров или малых молекул. Химические реакции могут выполняться либо одновременно, либо последовательно, с использованием, например, способов ортогональной химии, защитных/маскирующих групп, последовательного смешивания модулей-носителей или модулейносителей без СКО.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ создания комбинаторных библиотек-дисплеев каталитической активности. В этом аспекте модули-носители ассоциированы с функциональными группами с реакционноспособными сайтами, и звездообразная структура обеспечивает каркас для трехмерного размещения функциональных групп.

Описанные выше аспекты и варианты осуществления показывают явные преимущества в сравнении с предшествующим уровнем техники. Например, различные возможные варианты осуществления настоящего изобретения обнаруживают одно или несколько из следующих преимуществ: 1) уникальный способ сборки комбинаторной библиотеки-дисплея, 2) уникальную структуру близости, направляющую химические реакции, 3) химические реакции являются в высокой степени независимыми от последовательностей кодонов, так как они отделены от реакционного сайта константными сегментами, 4) высокую точность амплификации библиотеки-дисплея, так как только кодоны в релевантном положении способны направлять новые модули-носители, поскольку только они содержат концы для облегчения лигирования, и 5) если случайно произошло неправильное направление кодона/антикодона, ассоциация между кодированием и дисплеем все еще будет существовать, так как новые модули-носители обеспечивают как СКО, так и код.

Краткое описание рисунков

На фиг. 1а описаны стадии в образовании звездообразной структуры, в котором химические группы реагируют одновременно.

На фиг. 1Ь описаны стадии в образовании звездообразной структуры, в котором химические группы реагируют последовательно.

На фиг. 1с описан способ, который использует конвергентный синтез химического соединения.

На фиг. 16 показан способ в 5 стадиях для образования библиотеки, в которой каждый из членов демонстрирует эффективно образованное химическое соединение.

На фиг. 1е описан способ, в котором петли добавляются после реакции химических групп.

На фиг. 2а описан способ самосборки комбинаторной библиотеки с использованием репертуаров биспецифических олигонуклеотидов.

- 11 024849

На фиг. 3 показаны 5 стадий в аффинном отборе.

На фиг. 4а описаны стадии в образовании библиотеки.

На фиг. 4Ь описаны принципы скрещивания и мутации обогащенной библиотеки.

На фиг. 5 описаны стадии в способе, приводящем к образованию обогащенной библиотеки.

На фиг. 6 показан принцип молекулярной эволюции.

На фиг. 7 показан вариант изобретения с вовлечением иммобилизованного субстрата.

На фиг. 8 описаны экспериментальные результаты примера 1.

На фиг. 9 показаны результаты экспериментов, сообщенных в примере 2.

На фиг. 10 показан результат экспериментов в соответствии с примером 3.

На фиг. 11 описаны результаты экспериментов, сообщенных в примере 4.

На фиг. 12 показан гели, полученные в экспериментах, описанных в примере 5.

На фиг. 13 показан гель нативного электрофореза в ПААГ из примера 6.

На фиг. 14 показан гель из экспериментов, сообщенных в примере 7.

На фиг. 15 описан гель эксперимента рефолдинга примера 8.

Фиг. 16 является схематической диаграммой плана примера 9.

На фиг. 17 показан гель, полученный из экспериментов, сообщенных в примере 9.

На фиг. 18 описан гель, полученный из экспериментов, сообщенных в примере 9.

На фиг. 19 показаны различные структуры схемы реакций, сообщенных в примере 10.

На фиг. 20 показаны два геля, полученных из экспериментов, описанных в примере 12.

На фиг. 21 описан гель из эксперимента, сообщенного в примере 13.

На фиг. 22 показан гель из эксперимента, сообщенного в примере 14.

На фиг. 23 показан гель из эксперимента, сообщенного в примере 15.

На фиг. 24 описан гель из эксперимента, описанного в примере 16.

На фиг. 25 показаны результаты эксперимента, показанного в примере 17.

На фиг. 26 описана схему экспериментальной стратегии, используемой в примере 18.

На фиг. 27 показан гель ненативного электрофореза в ПААГ отдельных стадий в способе, используемом в примере 18.

На фиг. 28 показан гель ненативного электрофореза анализа связывания, сообщенного в примере

18.

На фиг. 29 показана ПЦР-амплификацию геля, сообщенную в примере 18.

На фиг. 30 показана картину геля, свидетельствующую о прохождении восстановительного аминирования.

На фиг. 31 описана картину геля, свидетельствующую о прохождении присоединения мочевины.

На фиг. 32 показаны гели исследования электроподвижности звездообразной структуры.

На фиг. 33 показано схематическое представление процесса трансляции.

На фиг. 34 показан результат экспериментов, сообщенных в примере 22.

На фиг. 35 показан результат экспериментов, сообщенных в примере 22.

На фиг. 36 показан результат экспериментов, сообщенных в примере 22.

Подробное описание изобретения

Нуклеиновая кислота

Кодируемый нуклеиновой кислотой химический синтез, описанный в данном описании, допускает получение комбинаторных библиотек-дисплеев и выполнение отбора, амплификации и эволюции большого разнообразия химических соединений, таких как малые молекулы и неприродные полимеры. Нуклеиновая кислота выполняет множественные функции, например, собирает химические реагенты вместе, направляет трехмерное размещение химических реагентов, хранит информацию, касающуюся истории химического синтеза, направляет правильный подбор выбранных комбинаций химических реагентов и допускает диверсификацию и скрещивание химических соединений.

Данный способ может быть использован для одновременной сборки одной молекулы, триллионов молекул или даже большего количества молекул.

Данный способ позволяет выделять лиганды или лекарственные средства со свойствами, превосходящими свойства лигандов или лекарственных средств, выделенных традиционным рациональным образом и комбинаторными способами обнаружения лекарственных средств, так как химическое пространство может быть подвергнуто системному поиску лигандов, имеющих желаемые свойства.

Было показано, что направляемый нуклеиновой кислотой химический синтез является феноменом широкого диапазона, не только ограничиваемый соединениями, имеющими природу нуклеиновых кислот, но также применимый для направления широкого диапазона химических реакций в широком диапазоне условий (νθ 2004/0167 67, νθ 2002/074929А2). Особенно важно, когда большинство представляющих интерес молекул не похожи на нуклеиновую кислоту или аналоги нуклеиновых кислот. Химические группы, участвующие в образовании конечного химического соединения, могут переноситься в одну стадию для получения химической частицы на скелете молекулы, или химическая группа может переноситься в две стадии, в которых первая стадия включает сшивание между химической группой и принимающей частицей, и вторая стадия включает отщепление химической группы от модуля-носителя для завершения переноса. Примером первого типа реакции является модуль-носитель, имеющий

- 12 024849 завершения переноса. Примером первого типа реакции является модуль-носитель, имеющий присоединенное 5-членное замещенное Ν-гидроксисукцинимидное (ΝΗδ) кольцо, служащее в качестве активатора, т.е. образуется лабильная связь между атомом кислорода, соединенным с ΝΗδ-кольцом, и подлежащей переносу химической группой. Химические группы могут переноситься к реципиентной нуклеофильной группе, обычно аминогруппе, которая может быть представлена на скелете молекулы. Остаток фрагмента превращают в уходящую группу данной реакции. Когда химическая группа соединена с активатором через карбонильную группу и реципиентной группой является аминогруппа, связь, образуемая на данном скелете, будет амидной связью.

Примером двухстадийной реакции является так называемая аллилглициновая реакция. На первой стадии химическую группу, содержащую карбоновую кислоту или ее производное, подвергают взаимодействию с нуклеофильной группой, такой как аминогруппа. Химическую группу присоединяют к аллилглициновой группе, которая на второй стадии может быть отщеплена йодом для высвобождения указанной химической группы. Способ двухстадийной реакции описан более подробно в νθ 2004/039825, содержание которого включено в данное описание в качестве ссылки. Другой пример стратегии двухстадийной реакции показан более подробно в примере 10.

Центральным важным признаком для направляемого нуклеиновой кислотой синтеза комбинаторных библиотек-дисплеев является направляемое создание пространственной близости реагентов, которая гарантирует эффективность реакции и правильную ассоциацию кодирования и дисплея. Пространственную близость реагентов получают ассоциацией вместе реагентов посредством линкера некоторого рода. Близость может быть также описана как локальная концентрация, которая зависит от длины и гибкости линкера. Если предполагается свободная гибкость линкера, локальная концентрация может быть рассчитана с использованием объема сферы с длиной линкера в качестве радиуса. Формула для расчета объема сферы такова: у=4/3*пи*т³. Таким образом, близость или локальная концентрация падает в 3-ей степени как функция длины линкера. Например, длина линкера около 10 нм будет эквивалентна концентрации около 1 мМ, тогда как линкер 100 нм будет эквивалентен концентрации около 1 мкМ. Эффективные способы органической химии обычно выполняют в диапазоне миллимолярных-молярных концентраций. Таким образом, для гарантии эффективности в таких химических реакциях длина линкера не должна быть существенно большей, чем 10 нм.

Предпочтительно, реакционноспособные группы приводят в требуемую для реакции близость, меньшую, чем 100 нм, более предпочтительно, меньшую, чем 50 нм, даже более предпочтительно, меньшую, чем 25 нм, еще более предпочтительно, меньшую, чем 10 нм, и, наиболее предпочтительно, меньшую, чем 5 нм.

В предшествующем уровне техники для синтеза в одном сосуде ДНК-кодируемых библиотекдисплеев использовали ДНК-матрицы с кодонами, простирающимися по всей длине матрицы (νθ 2004/016767, νθ 2002/074929А2). Матрицы являются ответственными за рекрутинг единиц переноса, имеющих правильные последовательности антикодонов, из репертуара единиц переноса, и, следовательно, сводящими вместе химические группы на матрице и единицы переноса. Таким образом, одноцепочечная матрица действует также в качестве линкера между химической группой на матрице и химической группой на единице переноса, гибридизованной с матрицей. Таким образом, длина линкера и посредством этого локальная концентрация будут зависеть от того, какое положение кодона используется. Развернутый (удлиненный) олигонуклеотид, имеющий, например, 20 нуклеозидов, будет иметь длину приблизительно 10 нм (расстояние шести связей равно приблизительно 0,63 нм), и олигонуклеотид, имеющий 200 нуклеозидов, будет иметь длину приблизительно 100 нм. Таким образом, развернутые олигонуклеотиды, значительно более длинные, чем 200 нуклеозидов (10 нм, эквивалентные концентрации приблизительно 1 мМ), обычно не будут приемлемыми для направления создания близости химических реакций.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение устраняет необходимость применения чрезмерно удлиненной структуры нуклеиновой кислоты в приведении реагентов в требуемую для реакции близость. Это достигается выбором подходящих последовательностей олигонуклеотидов, способных укладываться в стабильные трехмерные структуры, и посредством этого управлением создания близости посредством положений последовательности, разделенных многими нуклеозидами. Как показано на фиг. 1а, это достигается при использовании биспецифических олигонуклеотидов (взаимокомплементарных), которые могут гибридизоваться в звездообразную структуру. Биспецифические олигонуклеотиды содержат два сегмента: один сегмент около З'-конца одного олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца в следующем олигонуклеотиде и т.д. Наконец, сегмент около З'-конца последнего олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца первого олигонуклеотида. Таким образом, средняя зона между двумя сегментами на каждом олигонуклеотиде ориентирована в направлении центра. Средней зоной может быть связь или сегмент. В противоположность этому, концы ориентированы наружу с образованием таким образом звездообразной структуры. Таким образом, при использовании трех типов олигонуклеотидов образуются три стебля, при использовании четырех типов олигонуклеотидов образуются четыре стебля и т.д. Таким образом химические реакционноспособные группы приводятся в требуемую для реакции близость, так как диаметр двойной спирали ДНК равен приблизительно 2 нм, что

- 13 024849 допускает протекание направляемых близостью химических реакций в центре или вблизи центра.

Химическую реакцию осуществляют таким образом, что образованный продукт ассоциирован по меньшей мере с одним олигонуклеотидом. Кроме того, кодон предпочтительно расположен снаружи от одного или обоих гибридизованных сегментов на каждом олигонуклеотиде, что допускает кодирование химических групп. Олигонуклеотиды с ассоциированной химической группой, двумя положениями сегментов гибридизации и кодоном называют модулями-носителями.

Для получения созданной комбинации олигонуклеотидов, амлифицируемых, например, посредством ПЦР, концы в каждом стебле, за исключением одного, лигируют посредством образования петли с образованием непрерывного олигонуклеотида с 5'- и З'-концами. В одном аспекте структура состоит из одного стебля и ряда структур стебель-петля, которые могут быть амплифицированы при наличии сайтов ПЦР-праймирования на концах (фиг. 16 и фиг. 1е). Альтернативно, все концы лигируют с образованием замкнутого кольца, которое может быть амплифицировано удлинением праймера ДНК-полимеразой без активности вытеснения цепи.

Способ, использующий постадийную реакцию химических групп, показан на фиг. 1Ь. Сначала два модуля-носителя приводят в контакт в условиях гибридизации. Модуль-носитель А содержит сегмент гибридизации а, который отжигается с гибридизационным сегментом а' модуля-носителя В. После стадии отжига позволяют протекать химической реакции между химической группой С_А на модуленосителе А и С_в на модуле-носителе В. На третьей стадии добавляют модуль-носитель С в условиях гибридизации. Модуль-носитель С содержит сегмент гибридизации Ь', который комплементирует сегмент гибридизации 6 модуля-носителя В. Требуемая для реакции близость продукта С_А-С_В к химической группе С_с допускает протекание химической реакции таким образом, что образуется продукт С_а-С_в-С_с. Добавляют четвертый модуль-носитель в условиях гибридизации. Модулю-носителю Ό позволяют гибридизоваться с растущей звездообразной структурой, чтобы привести реагент Св в тесную близость с продуктом предыдущей реакции, посредством чего реакция промотируется для образования конечного химического соединения С_а-С_в-С_с-С_в.

На фиг. 1с описан способ конвергентного синтеза, в котором начальные стадии реакции протекают в виде двух отдельных путей. На первой серии реакций модули-носители А и В приводят в контакт отдельно в условиях гибридизации в первом контейнере. Сегмент гибридизации модуля-носителя А и сегмент гибридизации модуля-носителя В будут отжигаться друг с другом и будет выполняться реакция между химическими группами С_А и С_в. Во втором контейнере модули-носители С и Ό смешивают в условиях гибридизации таким образом, чтобы образовывался продукт гибридизации, в котором сегмент гибридизации с модуля-носителя С отожжен с гибридизационным сегментом с' модуля-носителя Ό. Затем происходит реакция между химической группой С_с и химической группой Св с образованием промежуточного продукта С_с-Св. Промежуточным продуктам позволяют отжигаться друг с другом в условиях гибридизации, посредством чего образуется звездообразная структура. Затем или одновременно с образованием звездообразной структуры реакции между двумя промежуточными продуктами реакции С_А-С_В и С_с-Св позволяют образовываться конечному химическому соединению С_а-С_в-С_с-С_в. При выполнении постадийного или конвергентного синтеза может быть полезным перед реакцией химических групп обеспечение вспомогательного олигонуклеотида для образования реакционного центра.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к образованию петли в структурах стебель-петля, обеспечиваемых модулями-носителями, как показано на фиг. 16.

Альтернативно, петли образуются лигированием структур стебель-петля, обеспечиваемых другими олигонуклеотидами, как показано на фиг. 1е, или любой их комбинацией вариантов осуществления, показанных на фиг. 16 и 1е. Конечные модули-носители могут содержать сайты ПЦР-праймирования, или сайты праймирования могут быть обеспечены лигированием других олигонуклеотидов.

Вариант осуществления, описанный на фиг. 16, показан пятью стадиями. На первой стадии четыре модуля-носителя, каждый из которых несет реакционноспособные группы К и биспецифические олигонуклеотиды, подвергаются контакту в условиях гибридизации. Модули-носители находятся в равновесии со звездообразной структурой. На второй стадии гибридизационный комплекс лигируют на концах модулей-носителей таким образом, чтобы образовывалась непрерывная нуклеиновая кислота. Близость химических групп в центре звездообразной структуры промотируют данную реакцию, и на стадии 3 образуется продукт, который присоединен линкерной частицей к нуклеиновой кислоте, кодирующей химические группы, которые участвовали в образовании химического соединения. На стадии 4 сайт праймирования для полимеразы лигируют со звездообразной структурой для обеспечения удлинения нуклеиновой кислоты. Последняя стадия показывает продукт удлинения, в котором двухцепочечная ДНК была образована с использованием нуклеиновой кислоты звездообразной структуры в качестве матрицы.

На фиг. 1е показана версия варианта осуществления фиг. 16, в которой структуру стебель-петля добавляют отдельно и лигируют со звездообразной структурой. На первой стадии смешивают четыре модуля-носителя. Вследствие существования сегментов гибридизации звездообразная структура образуется в условиях гибридизации. После образования гибридизационного комплекса осуществляют реакцию с образованием химического соединения. После образования соединения реакцией четырех химических групп, добавляют 3 структуры стебель-петля и сайт праймирования для полимеразы. Структуры стебель- 14 024849 петля и сайт праймирования содержат выступ, который комплементарен выступу звездообразной структуры. При добавлении лигазы структуры стебель-петля и сайт праймирования лигируют в звездообразную структуру с образованием таким образом непрерывной нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к лигированию модулейносителей, например, с использованием ферментов, таких как ДНК-лигаза Т4, ДНК-лигаза Тас|, РНКлигаза Т4 или ДНК-лигаза Е. Сой, или химическому лигированию (ЗйаЬагот с1 а1., Νυοίοίο Ас1бк Кек, 19, 4247-51, 1991).

Модули-носители - олигонуклеотидная часть

В данном изобретении для направления химических реакций используют олигонуклеотиды. Олигонуклеотидами в данном контексте называют модули-носители, которые содержат по меньшей мере два положение-специфических олигонуклеотидных сегмента гибридизации, необязательно олигонуклеотидный сегмент кодона и реакционноспособную химическую группу.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, в которых олигонуклеотидная часть состоит из ДНК, РНК или их аналогов в любых их комбинациях. Олигонуклеотидная часть способна, по меньшей мере после модификации, быть подходящей матрицей в стандартных протоколах для репликации нуклеиновой кислоты и/или амплификации.

Модули-носители могут быть синтезированы с использованием методологий, известных в данной области. Например, олигонуклеотид может быть получен любым способом, известным в данной области для синтеза олигонуклеотидов, например, твердофазным синтезом с использованием автоматического синтезатора. После синтеза олигонуклеотиды могут быть ассоциированы, если желательно, (например, ковалентно или нековалентно связаны), с представляющей интерес СКС с использованием стандартных химических способов связывания, известных в данной области.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация СКС с олигонуклеотидом находится в средней зоне между сегментами гибридизации или вблизи нее. Средняя зона может быть фосфодиэфирной связью, ее производными или сегментом нуклеиновой кислоты. Вблизи средней зоны обозначает местоположения на стебле дуплексной нуклеиновой кислоты, предпочтительно местоположения, близкие к средней зоне. Предпочтительно, термин вблизи от средней зоны относится к менее чем 20 нуклеотидам, более предпочтительно, менее чем 10 нуклеотидам, даже более предпочтительно, менее чем 5 нуклеотидам, и наиболее предпочтительно, менее чем 2 нуклеотидам.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация СКС с олигонуклеотидом происходит посредством линкеров или спейсеров, которые являются достаточно длинными и гибкими, чтобы позволить реагирующим веществам приходить в требуемую для реакции близость (реакционную близость). Линкеры предпочтительно имеют длину и состав, которые допускают реакции между реагентами, спаренными с олигонуклеотидами, но все еще минимизируют реакции с неспаренными молекулярными частицами. Кроме того, ассоциация между олигонуклеотидом и СКС может осуществляться через ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления могут присутствовать более чем одна ковалентная связь.

Связь может быть расщепляемой, например, светом, окислением, гидролизом, действием кислоты, действием основания или восстановлением. Разнообразие связей, полезных в практике настоящего изобретения, описано в предшествующем уровне (РгисЬ1е1 апб 1ипд, Апдете СЬет Ιηί Еб Епд1, 35, 17, 1996). Линкер способствует контакту реагентов и в определенных вариантах осуществления в зависимости от желаемой реакции, определяет местоположение ДНК в качестве уходящей группы, причем линкер расщепляется как природное следствие данной реакции. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от желаемых обстоятельств, за реакцией одной реакционноспособной группы следует расщепление линкера, присоединенного ко второй реакционноспособной группе, с образованием продуктов, не оставляя дополнительных атомов, способных обеспечиватьхимическую функциональную группу.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация СКС с олигонуклеотидом осуществляется через скелет молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация СКС с олигонуклеотидом осуществляется посредством основания. В предпочтительном варианте осуществления СКС ассоциирована с частями водородных связей не-Уотсона-Крика.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация СКС с олигонуклеотидом допускает прочитывание ДНК-полимеразой, по меньшей мере после его удаления.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация СКС с олигонуклеотидом является нековалентной. Например, если биотин присоединен к олигонуклеотиду, а стрептавидин присоединен к СКС, следовательно, взаимодействие между биотином и стрептавидином ассоциирует олигонуклеотид и СКС друг с другом нековалентно.

- 15 024849

Модули-носители - химия

С использованием описываемых способов может быть получен широкий диапазон соединений и/или библиотек соединений. В некоторых вариантах осуществления соединения, которые не являются нуклеиновыми кислотами или их аналогами или не похожи на нуклеиновые кислоты или их аналоги, синтезируют в соответствии со способом настоящего изобретения. В некоторых других варианте осуществления соединения, которые не являются белками или их аналогами или не похожи на белки или их аналоги, синтезируют в соответствии со способами настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к последовательным химическим реакциям направляемых пространственной близостью реагентов, например, с использованием способов ортогональной химии или с использованием ортогональных защитных/маскирующих групп или последовательной сборки и реакции молекул-носителей.

Сборка модулей-носителей без образования кольца, т.е. без образования непрерывной нуклеиновой кислоты, может сама приводить подходящим образом расположенные СКО в пространственную близость, так как диаметр двойной спирали равен приблизительно 2 нм, что, следовательно, позволяет помещать несколько последовательных СКО в требуемую для реакции близость. Условия реакции, линкеры, реагенты и сайт реакции выбирают таким образом, чтобы избежать не направляемых олигонуклеотидом реакций и ускорить направляемые олигонуклеотидом реакции.

Последовательное или одновременное приведение в контакт молекул-носителей может выполняться в зависимости от конкретного соединения, которое должно быть синтезировано. В определенном представляющем особый интерес варианте осуществления предполагается многостадийный синтез химических соединений, в котором три или более молекул-носителей приводят в контакт последовательно для облегчения многостадийного синтеза комплексных химических соединений.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к отжигу модулей-носителей, который дает возможность использовать модули-носители при концентрациях, более низких, чем концентрации, используемые во многих традиционных химических синтезах. Таким образом, модулиносители могут быть использованы в субмиллимолярных концентрациях. Предпочтительно, концентрации модулей-носителей могут быть использованы в субмиллимолярных концентрациях, меньших, чем 100-микромолярные, более предпочтительно, меньших, чем 10-микромолярные, даже более предпочтительно, меньших, чем 1-микромолярные, еще более предпочтительно, меньших, чем 100-наномолярные, и наиболее предпочтительно, меньших, чем 10-наномолярные концентрации.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к СКО, образующим малые молекулы или полимеры. В практике настоящего изобретения могут быть использованы известные химические реакции для синтеза полимеров или малых молекул. Выбранные реакции являются предпочтительно совместимыми с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК и РНК или их аналоги. Применимые реакции включают, например, реакции замещения, реакции образования углерод-углеродной связи, реакции элиминирования и реакции присоединения.

СКО или реагенты включают разнообразные реагенты и могут быть любой химической группой или реакционноспособной частью молекулы (например, электрофилы, нуклеофилы), известной в области химии.

В синтезе малых молекул с использованием способа настоящего изобретения модуль-носитель может иметь скелет, с которым ассоциирована малая молекула, которая должна быть собрана. Таким скелетом может быть любое химическое соединение с двумя или более сайтами для функциональных групп. Защитные группы могут быть ортогональными относительно друг друга, чтобы они могли удаляться по отдельности. Реагентами для модификации скелета могут быть, например, электрофилы (например, ацетил, амиды, хлорангидриды кислот, сложные эфиры, имины), нуклеофилы (например, амины, гидроксильные группы, тиолы) или боковые цепи.

В некоторых вариантах осуществления полимеры, в частности неприродные полимеры, синтезируют в соответствии со способом настоящего изобретения. Неприродные полимеры, которые могут быть синтезированы с использованием способа и системы настоящего изобретения, включают любые неприродные полимеры. Например, неприродные полимеры включают, но не ограничиваются ими, пептиднуклеиновую кислоту (ПНК), полимеры, поликарбаматы, полимочевины, сложные полиэфиры, полиакрилаты (например, полиэтилен, полипропилен), поликарбонаты, полипептиды с неприродной стереохимией, полипептиды с неприродными аминокислотами и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления полимеры включают по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 мономерных звеньев или более. В некоторых вариантах осуществления мономерные звенья могут содержать димеры, тримеры или тетрамеры, или олигомеры. Полимеры, синтезированные с использованием системы настоящего изобретения, могут быть использованы, например, в качестве катализаторов, фармацевтических веществ или диагностических аффинных лигандов.

При получении некоторых неприродных полимеров мономерные звенья присоединяют к модулюносителю. Такими мономерными звеньями могут быть, например, карбаматы, Ό-аминокислоты, неприродные аминокислоты, ПНК, мочевины, гидроксикислоты, сложные эфиры, карбонаты, акрилаты или простые эфиры. В некоторых вариантах осуществления мономерные звенья имеют две реакционноспо- 16 024849 собные группы, используемые для связывания мономерного звена в растущую цепь полимера. Предпочтительно, две реакционноспособные группы не являются одинаковыми, так что мономерное звено может быть включено в полимеры направленным образом, например, на одном конце может быть электрофил, и на другом конце может быть нуклеофил. Реакционные группы могут включать, но не ограничиваются ими, сложные эфиры, амиды, карбоксильные кислоты, активированные карбонильные группы, хлорангидриды кислот, амины, гидроксильные группы и тиолы. В некоторых вариантах осуществления СКО являются маскированными или защищенными (Огееп с1 а1., (1999) Рго1ссйус Огоирк ίη Огдаше 8уйЬе515 3^Γά Εάίίίοη, ХУПеу), так что полимеризация может не происходить до желаемого времени, когда СКО будут освобождены от защитных групп. Как только мономеры собирают вместе посредством сборки с использованием модулей-носителей, инициирование полимеризации приводит к каскаду стадий полимеризации и удаления защитных групп, где полимеризация приводит к удалению защитной группы реакционноспособной группы, которая должна быть использована на последующей стадии полимеризации. Мономерные звенья, подлежащие полимеризации, могут включать два или более мономеров.

Мономерные звенья могут содержать любые химические группы, известные в данной области. Реакционноспособные химические группы, особенно группы, которые могут препятствовать полимеризации, гибридизации и т.д., предпочтительно маскируют с использованием известных защитных групп (Огееп е1 а1. , (1999) Рго1еейуе Огоирк ίη Огдаше 8уйЬе515 3'¹ Εάίίίοη, \МПеу). Обычно, защитные группы, используемые для маскирования реакционноспособных групп, являются ортогональными относительно защитных групп, используемых в защите групп, используемых на стадиях полимеризации.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, причем реакционноспособный сайт ассоциирован с одним и тем же модулем-носителем для всех химических реакций. Например, скелет малой молекулы ассоциирован с одним модулем-носителем, и остальные модули-носители обеспечивают частицы, модифицирующие данный скелет.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где реакционноспособный сайт будет смещать положения во время химических реакций.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к ассоциации образованного химического соединения с олигонуклеотидом, при сохранении считывания ДНК-полимеразой, например, по меньшей мере после его удаления.

Получение комбинаторной библиотеки

Важным практическим различием между традиционным и направляемым нуклеиновой кислотой синтезом библиотеки является масштаб каждой манипуляции. Вследствие количеств материала, необходимого для скрининга и идентификации соединений, традиционные комбинаторные синтезы обычно протекают в масштабе наномолей-микромолей на один член библиотеки. В отличие от этого, направляемый нуклеиновой кислотой синтез может иметь место в масштабе фемптомолей-пикомолей, так как для отбора и ПЦР-амплификации требуются лишь незначительные количества (например, приблизительно 10^-30 моль) каждой из связанных с нуклеиновой кислотой синтетических молекул. Это огромное различие в масштабе, в соединении с форматом одного раствора в направляемом нуклеиновой кислотой синтезе библиотек существенно упрощает получение требуемых материалов.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к образованию комбинаторной библиотеки-дисплея. Библиотеки могут быть получены с использованием репертуаров модулейносителей на некоторых или на всех положениях (фиг. 2а). На первой стадии обеспечивают репертуар модулей-носителей для каждого положения. При смешивании модулей-носителей в условиях гибридизации они будут собираться в звездообразную структуру, направляемую последовательностью сегментов гибридизации. После сборки модулей-носителей выполняют лигирование и реакцию в любом порядке. В одном аспекте настоящего изобретения лигирование выполняют перед реакцией для увеличения стабильности звездообразной структуры. После направляемой пространственной близостью реакции сайт праймирования полимеразы лигируют со звездообразной структурой и осуществляют реакцию удлинения для проявления (дисплея) образованного химического соединения наружной среде.

Как будет понятно специалисту в данной области, библиотеки малых молекул и полимеров могут быть синтезированы с использованием описываемых принципов. Таким образом, комбинаторная библиотека-дисплей может быть подвергнута отбору и члены обогащенной библиотеки могут быть идентифицированы посредством кодирующего их олигонуклеотида.

В зависимости от обстоятельств репертуары модулей-носителей для двух или более положений сначала объединяют и подвергают направляемым нуклеиновыми кислотами химическим реакциям между присоединенными СКО. В зависимости от обстоятельств библиотека может быть образована множественными химическими реакциями, в которых каждый промежуточный продукт очищают перед следующим раундом реакций. Предпочтительно, требуются менее чем 20 стадий химических реакций, для создания библиотеки. В других вариантах осуществления требуются менее чем 10 стадий химических реакций и, более предпочтительно, требуются 3-9 стадий для создания библиотеки.

Отбор

Отбор и/или скрининг на продукты реакции с желаемыми активностями (такими как каталитическая активность, аффинность связывания, специфичность связывания или конкретное действие в анализе

- 17 024849 активности) может быть выполнен в соответствии с любым стандартным протоколом. Например, могут быть выполнены аффинные отборы (см. фиг. 3) в соответствии с принципами, используемыми в способах на основе библиотек, таких как фаговый дисплей (διηίΐΐι. 8с1спсс. 228, 1315-7, 1985), рибосомный дисплей (Напек с1 а1., Ргос №й1 Асай 8с1 И8Л, 95, 14130-5, 1998), мРНК-дисплей (КоЬейк апй 8/оз1ак, Ргос №·ι11 Асай 8с1 И8А, 94, 12297-302, 1997) или ДНК-кодируемые химические библиотеки (ДО 2004/016767, ДО 2002/074929А2). Отбор на каталитические активности может, например, выполняться аффинным отбором на аффинных колонках с аналогом переходного состояния (Васа е1 а1., Ргос №·ι11 Асай 8с1 И8А, 94, 10063-8, 1997) или с использованием схем отбора на основе функции (Рейегкеп е1 а1., Ргос №·ι11 Асай 8с1 И8А, 95, 10523-8, 1998). Поскольку при помощи ПЦР могут быть амплифицированы незначительные количества ДНК (~100 молекул), такие отборы, следовательно, могут проводиться в масштабе данного размера, что допускает действительно широкий поиск на желаемые активности, как экономичный, так и эффективный.

Библиотека-дисплей может быть отобрана или отделена по связыванию с молекулой-мишенью. В данном контексте отбор и отделение означают любой процесс, посредством которого член библиотеки, связанный с молекулой-мишенью, может быть отделен от членов библиотеки, не связанных с молекулами-мишенями. Отбор может выполняться различными способами, известными в данной области. В большинстве применений предпочтительно селективным является связывание с молекулой-мишенью, так что связывание с мишенью является предпочтительным в сравнении с другими событиями связывания. В конечном счете, связывающая молекула, идентифицированная с использованием настоящего изобретения, может быть применима в качестве терапевтического реагента и/или диагностического реагента.

Стратегия отбора может проводиться таким образом, чтобы сделать возможным отбор против почти любой мишени. Важным является то, что стратегия отбора не требует какой-либо подробной структурной информации о молекуле-мишени или о членах библиотеки-дисплея. Весь процесс запускается аффинностью связывания и специфичностью, участвующих в связывании членов библиотеки с конкретной молекулой-мишенью.

Отобранные члены библиотеки могут быть легко идентифицированы через кодирующую их нуклеиновую кислоту с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Настоящее изобретение допускает широкую идентификацию связывающих молекул для любой известной молекулымишени. Кроме того, новые неизвестные мишени могут быть обнаружены выделением связывающих молекул отобранных членов библиотек и использованием их для идентификации и валидизации молекулы-мишени.

Отбор связывающих молекул из библиотеки-дисплея может выполняться в любом формате для идентификации связывающих членов библиотек. Отбор с использованием связывания обычно включает иммобилизацию желаемой молекулы-мишени, добавление библиотеки-дисплея, предоставление возможности связывания и удаление не связывающихся/слабо связывающихся членов промыванием. Остающаяся библиотека, связанная с мишенью, может быть элюирована, например, кислотой, хаотропными солями, нагреванием, конкурентным элюированием известным лигандом, высокой концентрацией соли, основанием, протеолитическим высвобождением мишени, ферментативным высвобождением нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления элюированные члены библиотеки подвергают дополнительным раундам связывания и элюирования с использованием тех же самых условий или более жестких условий или с использованием другого формата связывания, который будет увеличивать обогащение. В других вариантах осуществления связывающие члены библиотеки не элюируют из мишени. Для отбора на члены библиотеки, которые связываются с белком, экспрессируемым на поверхности клетки, например, ионным каналом или трансмембранным рецептором, клетки могут быть сами по себе использованы в качестве агентов отбора. Процедура отбора может также включать отбор на связывание с рецепторами поверхности клетки, которые интернализуются таким образом, что рецептор вместе со связывающей молекулой проходит в цитоплазму, ядро или другой клеточный компартмент, например, в аппарат Гольджи или лизосомы. Выделение рассматриваемого компартмента приводит к отделению членов библиотеки, являющихся интернализованными, от неинтернализованных членов библиотеки (Най е1 а1., ί. Вю1. Сйет., 269, 12468-74, 1994). Процедура отбора может также включать отбор ш У1уо. Например, посредством нацеливания на орган ш У1уо, при котором библиотеку инъецируют в животное, и затем представляющий интерес орган выделяют и посредством этого получают обогащенный пул членов библиотеки, нацеленный на указанный орган (Раксщайш апй ВиозкйИк №1ите, 380, 364-6, 1996). Часть, содержащая нуклеиновую кислоту, обогащенной библиотеки может быть амплифицирована, например, при помощи ПЦР, что приводит ко многим порядкам амплификации, что делает возможной идентификацию, например, посредством клонирования и секвенирования ДНК.

Согласно конкретному варианту аффинного отбора, показанному на фиг. 3, библиотеку продуктов реакции, полученную из варианта, показанного на фиг. 2а, приводят в контакт с мишенью в условиях связывания. Если одно или несколько образованных химических соединений имеют аффинность в отношении мишени, будет происходить связывание. На следующей стадии связывающие члены библиотеки или нуклеиновую кислоту, полученную из них, разделяют. Затем нуклеиновую кислоту, присоединен- 18 024849 ную к образованному химическому соединению, амплифицируют, например, при помощи ПЦР для получения множественных копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует историю синтеза соединения, проявляющего желаемую аффинность. Амплифицированная нуклеиновая кислота может быть секвенирована рядом хорошо известных способов декодирования, для определения какие химические группы участвовали в образовании успешно полученного соединения. Альтернативно, амплифицированная нуклеиновая кислота может быть использована для образования библиотеки следующей генерации.

Другие отборы

Могут выполняться отборы по другим свойствам, таким как каталитическая или другая функциональная активность. Обычно отбор должен быть спланирован таким образом, чтобы члены библиотеки с желаемой активностью могли быть отделены от других членов библиотеки. Например, отбор членов библиотек со способностью катализировать расщепление связи, может выполняться, когда биотин присоединен к каждому члену библиотеки рассматриваемой связью. Разделение с использованием стрептавидина может затем отделить члены библиотеки, имеющие каталитическую активность, от других членов. Другим примером отбора является отбор членов библиотеки со способностью образования связи. Он может выполняться присоединением субстрата к каждому члену библиотеки и затем добавлением субстрата, к которому присоединен биотин. Реакция между двумя субстратами, образующими связь, будет присоединять биотин к каталитическим членам библиотеки. Затем использование стрептавидина может отделить члены библиотеки, имеющие каталитическую активность, от других членов. Отбор по другим свойствам, таким как димеризация и/или полимеризация, также может выполняться. В этом случае члены библиотеки могут быть разделены по размеру образованного комплекса, с использованием, например, ВЭЖХ, акриламидного или агарозного геля или гель-фильтрационных колонок.

Амплификация нуклеиновых кислот

Амплификация части, являющейся нуклеиновой кислотой, членов обогащенной библиотеки может выполняться с использованием стандартных протоколов для амплификации нуклеиновых кислот. Указанные способы включают, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (8а1к1 с1 а1., Заепсе, 230, 1350-4, 1985), амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (ΝΑ8ΒΑ) (СотрЮп, №Циге, 350, 91-2, 1991), амплификацию с вытеснением цепи ^ус/ е1 а1., Апа1 Вюсйет, 259, 226-34, 1Ϊ998), самоподдерживаемую репликацию (Мие11ег е1 а1., НЬЮсНет Се11 ΒίοΙ, 108, 431-7, 1997), праймерное удлинение и плазмидную амплификацию (см., например, ЗатЬгоок, ί., РгйксН, Е.Р. апй Матайк, Т. (1989) ίη Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогаЮгу.

Сборка библиотеки-дисплея посредством замены модулей

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к повторной сборке/амплификации членов обогащенной библиотеки для повторного создания дисплея. Таким образом в случае обогащенной библиотеки обогащенную библиотеку-дисплей образуют, выполняя раунды отбора и амплификации и повторной сборки. Например, как показано на фиг. 4а, вышеописанным ПЦР-амплифицированным олигонуклеотидам членов обогащенной библиотеки позволяют гибридизоваться в условиях, благоприятствующих внутримолекулярной гибридизации, посредством чего снова создается звездообразная структура, состоящая из стебля и ряда структур стебель-петля. Стебель без петли может содержать сайт узнавания для фермента рестрикции (рестриктазы), который генерирует выступ с неопределенным основанием (неопределенными основаниями). Неопределенное основание (неопределенные основания) в созданном выступе предпочтительно используется для того, чтобы содержать кодон. Таким образом, расщепление ферментом рестрикции стебля генерирует кодон-зависимые выступы для первого положения. Затем расщепленные ферментом рестрикции звездообразные структуры гибридизуют с репертуаром модулей-носителей, содержащих два константных сегмента для первого положения и родственную пару СКС и антикодона. Следовательно, гибридизация кодон/антикодон допускает возможность лигирования подходящих пар модулей-носителей и звездообразных структур. Соседние структуры стебель-петля могут также содержать сайт узнавания для другой рестриктазы, способной оставлять кодонспецифический выступ для второго положения. Таким образом, расщепление вторым ферментом рестрикции удаляет ковалентную связь ПЦР-амплифицированного первого модуля с остальной частью структуры. Звездообразную структуру денатурируют и затем позволяют гибридизоваться в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации. Посредством этого повторно создаются звездообразные структуры, но теперь с новым модулем-носителем в положении 1 (с СКС), и стебель, без петли, локализован теперь в положении 2. Раунды данного процесса выполняют для замены всех положений, для создания возможности направляемых пространственной близостью реакций правильных комбинаций СКС; посредством этого библиотека-дисплей амплифицируется и повторно собирается. Наконец, сайты ПЦР-праймирования могут быть лигированы со звездообразной структурой. Таким образом, раунды отбора и амплификации и повторной сборки могут выполняться до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое обогащение (см. фиг. 5).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к образованию кодонспецифических выступов, создаваемых ферментами рестрикции (рестриктазами). Подходящие рестриктазы способны образовывать выступы с более чем одной конкретной последовательностью. Такие ферменты включают ί) рестриктазы с неопределенными основаниями в их последовательности узнавания, и)

- 19 024849 рестриктазы, разрезающие снаружи относительно их последовательности узнавания, и ίίί) рестриктазы, выполняющие разрывы в одной цепи (ники) (образующие ники эндонуклеазы). Примеры таких рестриктаз включают:

ΑΙμΝΙ,

АраВ1, АзиХ, ΒΡνΙ, ΒΒνΙΙ, Всс1, Все831, Все£1, Βσίνΐ, Вд11,

ΒίηΙ, ВзеМИ, ВзеК1, Взд1, Β3ΪΥΙ, ВзшА1, ВзрМ1, Взг01, Вз£Е11,

Вз£Х1, В1дг1, ϋάβΐ, Ога11, ОгаШ, ϋπ1Ι, Еат11051, ЕсЫ, Есо311,

Есо571, ЕСО57М1, ЕсоЫ1, Езр1, Езр31, Епи4Н1, Гок1, Ези1, ΗΐηίΙ,

Нру178Ш, Нру1881, Кзр6321, МаеШ, МЬо11, Мте1, Мыо1, Р£1М1,

Р£о1, Р1е1, Зар1, 5аи1, 8сгГ1, Зес1, ЗГаШ, 3£ίΙ, 3£М321,

Тзр4С1, Τ3ρϋΤΙ, ТэрСШ, ТзрК1, Т1Ы111, Т£Ь11111, Хсш1, Ν.ΑΙηΙ,

Ν.Β36ΝΒΙ, Н.ВЪ’,-С1А и Ν.ΒΡνΟΙΒ.

Кодирующая емкость (количество различных возможных кодонов) выступа дана в виде количества неопределенных оснований в выступе, созданном ферментом рестрикции. Следовательно, для любого N (Ν=Α, Т, С или С) могут быть выбраны четыре различных остатка, для каждого Н (Н=А, С или Т), V (ν=Α, С или С), В (В=С, С или Т) и Ό (Ό=Α, С или Т) могут быть выбраны три различных остатка, и для любого К (Κ=Α или С), К (К=С или Т), Υ (У=С или Т), δ (δ=Ο или С) и М (М=А или С) и V (ν=Α или Т) могут быть выбраны два различных остатка. Следовательно, кодирующую емкость рассчитывают умножением количества различных остатков в каждом положении друг на друга. Например, δίιΐ:

5'- ... сессшш/цеесс... -3'

3'- ...ссеат/ыиннссее... -5' создает выступ 5'-ΝΝΝ-3', состоящий, следовательно, из трех Ν, имеющий, следовательно, кодирующую емкость (=4x4x4). Другой пример, Αναίΐ:

5'- ... в/внес... -3'

3'- ...ссие/е... -5' создает выступ 5'-С^С-3', имеющий, следовательно, кодирующую емкость 2.

Другой пример, ВЫ:

5'- ... 6ААеЛСЫЫ/ННИЫ... -3'

3'- ...сттстбыытганы/ ... -5' создает выступ из четырех Ν, имеющий следовательно, кодирующую емкость 256 (=4х4х4х4).

Особой группой рестриктаз являются рестриктазы, разрезающие только одну цепь (разрезающая одну цепь эндонуклеаза). Такие ферменты могут, в принципе, иметь неопределенную кодирующую емкость; например, когда ί) последовательность узнавания расположена в стебле структуры стебель-петля, или ίί) используется для создания концевого выступа, или ίίί) в комбинации с другим ферментом рестрикции. Это связано с тем, что длина созданного выступа может быть, в принципе, неопределенной длины.

Например, Ν.ΒόνίΊΛ. расположенная в стебле структуры стебель-петля:

5' -...СС/ТСАбСГОШ

3' -...белетсегош

Расщепление приводит к:

5' - ...СС -3'

3'- ...беАбтсеышип®1СбАст-5' в данном примере шесть Ν присутствуют в образованном выступе, давая, следовательно, кодирующую емкость 1024 (=4х4х4х4х4х4). Однако очевидно, что количество Ν может быть выбрано произвольно, что дает, следовательно, неопределенную кодирующую емкость. Небольшая доля общего количества возможных последовательностей в данном примере не может быть использована, а именно, последовательности, образующие последовательность узнавания используемой рестриктазы.

Кроме того, разрезающая только одну цепь эндонуклеаза может создавать концевой выступ произвольной длины, например, Ν.ΒΒνΟΙΑ

5'- ...сс/тсАвсотптантго-з' расщепление приводит к:

...ΟΕΑΟΤΟΟΝΝΝΝΝΝΝΝ- 5'

- 20 024849 и в данном примере восемь N присутствуют в образованном выступе, давая, следовательно, кодирующую емкость 65536 (= 4 в восьмой степени). Однако очевидно, что количество N может быть выбрано произвольно, что дает, следовательно, неопределенную кодирующую емкость. Небольшая доля общего количества возможных последовательностей в данном примере не может быть использована, а именно, последовательности, образующие последовательность узнавания используемой рестриктазы.

Кроме того, разрезающая только одну цепь эндонуклеаза в комбинации с ферментом рестрикции может создавать концевой выступ произвольной длины без какой-либо необходимости структуры стебель-петля. Например, Ν.ΒϋνΟΙΑ в комбинации с ЕсоКЕ

5' - ...СС/ТСΑδΟΝΝΝΝΝΝΝΝΟ/ΑΑΤΤε - 3'

3'- ...ебАбтсет»п11ппшсттАА/е-5' расщепление приводит к

5'- ...СС -3'

3' - ...ввАбТСвШИгаИНСТТАА- 5' и:

5' -...ΤΟΑΟΟΝΝΝΝΝΝΝΝΘ-3' и

5'-ААТТС-3'

З'-б-З' в данном примере восемь N присутствуют в образованном выступе, давая, следовательно, кодирующую емкость 65536 (=4 в восьмой степени). Однако очевидно, что количество N может быть выбрано произвольно, что дает, следовательно, неопределенную кодирующую емкость. Небольшая доля общего количества возможных последовательностей в данном примере не может быть использована, а именно, последовательности, образующие последовательность узнавания используемой рестриктазы.

Хотя длина сегментов кодонов может варьироваться, сегменты кодонов могут быть в диапазоне 150 нуклеотидов, 1-40, 1-30, 1-15, 1-10. Но предпочтительно сегменты кодонов имеют длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов.

Хотя длина образующих стебель сегментов может варьироваться, сегменты стебля могут быть предпочтительно в диапазоне 5-50 нуклеотидов, 5-40, 5-30, 5-15, 5-10. Но предпочтительно сегменты стебля имеют длину 10, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Длина средней зоны между образующими стебель сегментами может варьироваться. Средняя зона может быть предпочтительно в диапазоне от единственной фосфодиэфирной связи (или аналогичной связи) до отрезка из 20 нуклеотидов. Однако предпочтительно средняя зона является единственной фосфодиэфирной связью или имеет длину 1, 2, 3 4, 5 или 6 нуклеотидов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где звездообразные структуры после расщепления ферментом рестрикции дополнительно обрабатывают фосфатазой, которая удаляет 5'-фосфат и, следовательно препятствует лигированию двух звездообразных структур. Несколько подходящих фосфатаз известны в данной области, например, антарктическая (аШатсйс) фосфатаза и щелочная фосфатаза кишечника теленка.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где модули-носители содержат 5'-фосфат для облегчения лигирования со звездообразной структурой.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где модули-носители являются фосфорилированными после лигирования со звездообразной структурой. Это препятствует лигированию между свободными модуляминосителями.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где 5'-конец ПЦР-амплифицированной звездообразной структуры может быть создан другими средствами, отличными от рестриктазы, например: с использованием РНКазы, эндонуклеазы III, эндонуклеазы VIII, АРЕ1, Ррд, химическим расщеплением или фоторасщеплением. ПЦР-продукт состоит из праймера в его 5'-конце и остальной последовательности, образованной ДНК-полимеразой. Праймер может содержать остатки, не обнаруживаемые в сегменте, образуемом ДНК-полимеразой, такие как ЙИТР или РНК. Такие остатки могут специфически узнаваться и отщепляться подходящим образом с образованием определенного точного конца (διηίΐΐι с1 а1., РСК Мс1коЙ5 Арр1, 2, 328-32, 1993).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея. ПЦР-амплифицированные концы обогащенной библиотеки могут быть модифицированы перед образованием звездообразной структуры любым из вышеуказанных способов.

- 21 024849

Диверсификация

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обсуждает способ диверсификации демонстрируемого соединения или библиотеки демонстрируемых соединений, который делает возможной молекулярную эволюцию. Это может достигаться рядом способов без отклонения от объема настоящего изобретения. Например, (см. фиг. 4Ь) фракцию молекул в раунде для замены модуля расщепляют двумя последовательными рестриктазами, которые удаляют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой. Звездообразные структуры денатурируют и гибридизуют с репертуаром модулей-носителей для рассматриваемого положения. Таким образом, положение-специфические константные сегменты направляют гибридизации таким же образом, как и при создании первичной библиотеки. Подходящие концы лигируют и образованный продукт объединяют с направляемой кодоном фракцией, что приводит к диверсификации. Это может выполняться в одном, нескольких или всех раундах замены модулей. В другом примере одну фракцию молекул в раунде для замены модуля подвергают удалению кодон-специфических выступов для рассматриваемого положения, например, экзонуклеазой. Затем репертуар модулей-носителей для рассматриваемого положения гибридизуют и лигируют. Затем образованные не направляемые кодоном продукты объединяют с направляемой кодонами собранной фракцией, что приводит к диверсификации. Это может выполняться в одном, некоторых или всех раундах замены модулей.

Диверсификацию можно выполнять также перетасовкой/рекомбинацией (скрещиванием) модулей между членами библиотеки перед процессом замены модулей. Например, являющуюся нуклеиновой кислотой часть члена обогащенной библиотеки амплифицируют и расщепляют ферментом рестрикции, разрезающей в константном сегменте (константных сегментах), с образованием, следовательно, двух или более фрагментов. Фрагменты могут быть лигированы с фрагментами, происходящими из других членов библиотеки, с образованием полноразмерного продукта, посредством чего произошли перетасовка/рекомбинации. Другим примером способов перетасовки/рекомбинаций является способ с использованием звездообразной структуры (см. фиг. 4Ь).

Звездообразную структуру расщепляют двумя последовательными рестриктазами, денатурируют и позволяют гибридизоваться, что приводит к обмену рассматриваемого модуля. Таким образом, могут быть выполнены раунды отбора, амплификации и диверсификации, делающие, следовательно, возможной молекулярную эволюцию (см. фиг. 6).

Отбор на каталитическую активность

Описанный принцип может быть также применен к отбору на каталитическую активность. В этом случае модули-носители включают функциональные группы реакционноспособного сайта, и звездообразная структура обеспечивает скелет для трехмерного размещения функциональных групп, имитируя посредством этого белки-ферменты.

Обсуждаются схемы отбора на различные каталитические активности. Например, ί) отбор на связывание с аналогом переходного состояния, ίί) отбор на образование связи посредством ассоциации одного субстрата со звездообразными структурами, тогда как другой субстрат иммобилизован, например, с гранулами (вследствие чего члены библиотеки, ассоциированные с этими гранулами способны к образованию связи), или ίίί) отбор на расщепление связи посредством присутствия субстрата, ассоциированного как со звездообразной структурой, так и гранулой (вследствие чего члены библиотеки, не ассоциированные с гранулой, способны к расщеплению связи). (См. фиг. 7).

Кодон-специфическая компартментализация

Звездообразная структура позволяет каждому положению кодона становиться концевым и одноцепочечным посредством использования, например, подходящей рестриктазы, делая, таким образом, возможной высокоспецифическую компартментализацию посредством гибридизации и необязательно лигирования для конкретного положения кодона. Различные способы компартментализации известны в данной области, например, микроматрицы последовательностей антикодонов (Ьосккай с1 а1., Ναι Вю1ескпо1, 14, 1675-80, 1996), столбцы последовательностей антикодонов (На1рш апй НагЬигу, РЬо8 ΒίοΙ, 2, Е173, 2004) или использование гранул, где отдельные гранулы содержат последовательность антикодонов и флуоресцентную метку, которая затем допускает сортинг, например, посредством сортинга клеток с возбуждением флуоресценции (1аппопе е1 а1., Су1оте1гу. 39, 131-40, 2000).

Такая компартментализация может быть полезна в практике настоящего изобретения, например: ί) во время синтеза библиотеки для модификаций после химической реакции, ίί) анализа отдельных клонов, ίίί) анализа прогрессирования в отборах или ίν) анализа разнообразия. Следовательно, компартментализация в ситуации ίί)-ίν) может быть быстрой и экономичной альтернативой секвенированию ДНК для обращения свертки единственной последовательности или библиотеки последовательностей.

Во всем данном описании, где композиции описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные компоненты, или где процессы описаны, как имеющие, включающие или содержащие конкретные стадии процесса, предполагается, что композиции настоящего изобретения также состоят по существу или состоят из перечисленных компонентов и что способы настоящего изобретения также состоят по существу или состоят из перечисленных стадий процессинга. Кроме того, должно быть понятно, что последовательность стадий или последовательность выполнения определенных действий является

- 22 024849 несущественной, пока настоящее изобретение остается действующим. Кроме того, две или более стадий или два или более действий могут проводиться одновременно.

Способ и композиции настоящего изобретения представляют собой новые пути генерирования молекул с желаемыми свойствами. Такой подход объединяет чрезвычайно чувствительную и эффективную молекулярную биологию с гибкостью органической химии. Способность получать, амплифицировать и развивать (эволюционировать) неприродные полимеры и малые молекулы посредством молекулярной эволюции может привести к новым классам катализаторов, новым лигандам или лекарственным средствам со свойствами, превосходящими свойства продуктов, выделенных с использованием более медленных традиционных способов обнаружения.

Настоящее изобретение обеспечивает также наборы и композицию для применения в способах настоящего изобретения.

Определения

Термины нуклеиновая кислота или олигонуклеотид относятся к полимеру нуклеотидов. Полимер может включать, без ограничения, природные нуклеозиды (т.е. аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин), аналоги нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-уроуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, О(6)-метилгуанин и 2-тиоцитидин), химически модифицированные основания, биологически модифицированные основания (например, метилированные основания), интеркалированные основания, модифицированные сахара (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) или модифицированные фосфатные группы (например, фосфоротиоатные и 5'-Ы-фосфорамидитные связи). Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды могут также включать другие полимеры оснований, имеющие модифицированный скелет, такие как замкнутая нуклеиновая кислота (ΕΝΑ), пептиднуклеиновая кислота (ΡΝΑ), треозонуклеиновая кислота (ΤΝΑ) и любые другие полимеры, способные служить в качестве матрицы для реакции амплификации, использующей способ амплификации, например, полимеразной цепной реакции или лигазной цепной реакции.

Термин сегмент, используемый в данном описании, относится к непрерывному участку олигонуклеотидной последовательности.

Термины кодон и антикодон, используемые в данном описании, относятся к олигонуклеотидной последовательности, которая кодирует определенную химическую группу, ассоциированную с указанным кодоном или антикодоном. Ряд кодонов кодирует комбинацию конкретных химических реагентов, которые участвуют в образовании кодированной молекулы.

Термин структура стебель-петля, используемый в данном описании, относится к любой вторичной структуре, включающей по меньшей мере одну нуклеотидную часть, в которой цепь последовательности нуклеиновой кислоты, связана через внутримолекулярные водородные связи, с другой частью той же самой молекулы нуклеиновой кислоты для образования самоспаренной области, называемой стеблем, большей частью двухцепочечной природы, и неспаренной области петли, расположенной на одном конце указанного стебля. Когда длина петли равна нулю, это приводит к особому случаю, называемому шпилькой или палиндромом.

Термин малая молекула, используемый в данном описании, относится к органическому соединению, либо синтезированному в лаборатории, либо обнаруженному в природе, имеющему молекулярную массу, меньшую, чем 10000 г/моль, необязательно, меньшую, чем 5000 г/моль, и, необязательно, меньшую, чем 2000 г/моль, например, меньшую, чем 1000 г/моль. Предпочтительные малые молекулы пригодны для перорального введения.

Термины скелет малой молекулы или молекулярный скелет, используемые в данном описании, относятся к химическому соединению, имеющему по меньшей мере один сайт или химическую группу, пригодные для функционализации. Скелет малой молекулы или молекулярный скелет может иметь два, три, четыре, пять или более сайтов или химических групп, пригодных для функционализации. Сайты функционализации могут быть защищенными или маскированными, как это будет понятно квалифицированному специалисту в данной области. Сайты могут быть также обнаружены на лежащих в основе кольцевой структуры или кольцевом скелете.

Термины химическая реакционноспособная группа или химические группы или реакционноспособная единица, используемые в данном описании, относятся к любой химической группе, способной к модификации другой химической группы, присоединению к другой химической группе или отделению от другой химической группы. Они включают, но не ограничиваются ими, элемент структуры, мономер, мономерное звено макромолекулы, молекулярный скелет или другой реагент, применимый в опосредованном близостью химическом синтезе. В некоторых случаях химическая группа не является нуклеотидом или его производным. В другом аспекте по меньшей мере одной из химических групп, которые участвуют в синтезе образуемого химического, является неприродная аминокислота.

Термин ассоциированная с, используемый в данном описании, описывает взаимодействие между двумя или более группами, частями молекул, соединениями, мономерами и т.д. Когда две или более мо- 23 024849 лекулярных частиц ассоциированы друг с другом, как описано в данном описании, они связаны прямым или опосредованным ковалентным или нековалентным взаимодействием. Предпочтительно, ассоциация является ковалентной. Ковалентная ассоциация может осуществляться, например, но без ограничения, через амидную, углерод-углеродную, дисульфидную, карбаматную, простую эфирную, простую тиоэфирную, мочевинную, аминную или карбонатную связь. Ковалентная ассоциация может также включать линкерную часть, например, фоторасщепляемый линкер. Желаемые нековалентные взаимодействия включают образование водородных связей, ван-дер-ваальсовы межмолекулярные взаимодействия, диполь-дипольные взаимодействия, взаимодействия пи-упаковки, гидрофобные взаимодействия, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия и т.д. Две или более частицы или два или более агентов могут быть ассоциированы друг с другом будучи присутствующими вместе в одной и той же композиции.

Термин модуль-носитель, используемый в данном описании, относится к химической группе, ассоциированной с олигонуклеотидом, и сегменту около З'-конца, который может гибридизоваться с сегментами около 5'-конца во втором олигонуклеотиде, и сегменту около 5'-конца, который может гибридизоваться с сегментом около З'-конца третьего олигонуклеотида. Модуль-носитель необязательно содержит сегмент кодона или антикодона. Термин сегмент гибридизации, используемый в данном описании, относится к указанному сегменту олигонуклеотида.

Термин звездообразная структура, используемый в данном описании, относится к любой вторичной структуре, включающей по меньшей мере три стебля в основном двухцепочечной природы. 0, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 или более нуклеотидных остатков могут разделять стебли. В особом случае, где нуль остатков разделяют четыре стебля, точку соединения называют соединением Но11убау. Звездообразная структура может состоять из одной молекулы нуклеиновой кислоты, или она может состоять из множества молекул нуклеиновых кислот.

Термин реакционная близость, используемый в данном описании, относится к расстоянию между реагирующими веществами, при котором реакция между указанными реагирующими веществами может происходить контролируемым, эффективным и удобным по времени образом.

Термин направляемая близостью реакция, используемый в данном описании, относится к химическим реакциям между реагирующими веществами (реагентами), которые приведены в реакционную близость гибридизацией нуклеиновых кислот, с которыми ассоциированы реагенты.

Примеры

Пример 1. Демонстрирует образование тримерной и тетрамерной звездообразной структуры ДНК взаимокомплементарными биспецифическими олигонуклеотидами.

ДНК-олигонуклеотиды (получаемые ΌΝΆ ТесЬпо1оду Лг1ш5. Эсптагк) смешивали, как показано в таблице на фиг. 8, в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1х лигазном буфере (№ν Еп§1апб Вю1аЬ§), 50 мМ №С1. Полученные смеси инкубировали при 80°С в течение 2 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане. Продукты анализировали нативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид) с последующим окрашиванием этидийбромидом с использованием стандартных протоколов (8атЬгоок, I., РгШск, Е.Р. апб Матабк, Т. (1989) ίη Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб Ε6ίбоп, Со1б 8рг1пд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге88, Со1б 8ргшд НагЬог, №\ν Уогк).

Олигоб и олиго7 (соответствующие νίρ006 и νίρ007, соответственно), олигоб и олиго8 (соответствующие νίρ006 и νίρ008, соответственно) и олиго7 и олиго8 (соответствующие νίρ007 и νίρ008, соответственно), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент, способный, следовательно, образовывать отожженный димер. Таким образом, полосы, соответствующую димерам, наблюдали на дорожках 1-3. νίρ006, νίρ007 и νίρ008, каждый имеет взаимокомплементарный сегмент в отношении двух соседних олиго, способный, следовательно, образовывать замкнутую отожженную тримерную структуру (см. фиг. 8). Таким образом, полосу, соответствующую тримеру, наблюдали на дорожке 4.

Олиго6, олиго7 и олиго9 (соответствующие νίρ006, νίρ007 и νίρ009, соответственно), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент в отношении двух соседних олиго, способный, следовательно, образовывать замкнутую отожженную тримерную структуру. Однако структура является открытой, так как νίρ008 и νίρ006 не имеют комплементарных сегментов (см. фиг. 8). Таким образом, полосу, соответствующую тримеру, наблюдали на дорожке 5. Ожидается, что этот открытый тример имеет слегка более низкую подвижность в данном геле, чем более компактная замкнутая форма тримера. Различие в подвижности действительно наблюдается при сравнении дорожки 4 с дорожкой 5.

Равноценное наблюдение медленно мигрирующей тримерной полосы получали с использованием олиго6, олиго7 и олиго10 (соответствующих νίρ006, νίρ007 и νίρ010, соответственно), где νίρ006 и νίρ010 не отжигаются непосредственно друг с другом (сравните дорожку 4 и дорожку 6). Для оценки эффективности образования замкнутых тримерных форм, олиго6, олиго7 и олиго8 (соответствующие νίρ006, νίρ007 и νίρ008, соответственно) отжигали в присутствии двукратного избытка олиго9 или олиго10 (соответствующих νίρ009 или νίρ010, соответственно).

Представляет интерес то, что основная полоса в обеих дорожках 7 и 8 соответствует замкнутым тримерным быстро мигрирующим частицам, состоящим из νίρ006, νίρ007 и νίρ008. Успешное образование замкнутого терамера выполняли отжигом олиго6, олиго7, олиго9 и олиго10 (соответствующих

- 24 024849 νίρ006, νίρ007, νίρ009 и νίρ010, соответственно) и наблюдали в виде одной основной полосы на дорожке 9. Следует обратить внимание, что предполагаемую валентность во всех классах получали с высокой эффективностью; наблюдаемую в виде единственной основной полосы.

Пример 2. Превращение тримерной звездообразной структуры ДНК в единственную непрерывную цепь ДНК с использованием ДНК-лигазы Т4.

В данном примере продемонстрировано успешное создание трехстебельной звездообразной структуры ДНК, состоящей из единственной непрерывной цепи ДНК. Взаимокомплементарные биспецифические олигонуклеотиды отжигали и затем лигировали для образования непрерывной цепи ДНК. ДНКолиго (получаемые ΌΝΑ ТесЬпо1о§у Лг1ш5, Эептагк) смешивали, как показано на фиг. 9, в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1х лигазном буфере (№ν Епд1апй Вю1аЬ8), 50 мМ №гС1. Полученные смеси инкубировали при 80°С в течение 2 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане.

5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т4. Готовили смесь, состоящую из 1,67 мкМ звездообразной структуры, 1х ДНК-лигазного буфера (№ν Епд1апй Вю1аЬ8), 50 мМ №С1 и 0,2 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т4 (Ναν Епд1апй Вю1аЬ8, саΐ# М0201) и инкубировали в течение 30 минут при 37°С.

Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т4 (№ν Епд1апй Вю1аЬ8, саΐ# М0202). 1/3 объема лигазной смеси, 1хДНКлигазный буфер (№ν Епд1апй Вю1аЬ8), 50 мМ №гС1 и 100 Е/мкл ДНК-лигазы Т4 (№ν Епд1апй Вю1аЬ8, саΐ# М0202) добавляли к описанной выше обработанной киназой смеси и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Продукты анализировали ненативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид, мочевина 8М) с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (ЗатЬгоок, ί., кпйюк Е.Р. апй Матайк, Т. (1989) ш Мо1еси1аг С1отпд: А каЬогаЮгу Мапиа1, 8есопй ЕйШоп, Со1й δρηπβ НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Со1й δρηπβ НагЬог, №ν Уогк).

νίρ076 (25 нт) и νίρ017 (42 нт), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент, в который после отжига помещают 3'-конец νίρ076 рядом с 5'-концом νίρ017, образуя таким образом субстрат для ДНКлигазы Т4. Таким образом, заметную полосу, соответствующую νίρ076-νίρ017 (67 нт), наблюдали на дорожке 1 (ненативный электрофорез в ПААГ). Подобным образом, образование заметной полосы, соответствующей νίρ017-νίρ078 (100 нт), наблюдали на дорожке 3. В отличие от этого, νίρ017-νίρ078 (58 нт), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент, но не образуют отожженных соседних концов, и не ожидается, что они должны быть лигированы. Таким образом, на дорожке 2 наблюдали только полосы, соответствующие мономерам νίρ076 и νίρ078. Следует обратить внимание, что полоса, соответствующая νίρ076, является более слабой, и поэтому ожидается, что νίρ076 является меньшим, и олигонуклеотиды находятся в эквимолярных концентрациях. Кроме того, νίρ078 (58 нт) мигрирует медленнее, чем νίρ076νίρ017 (67 нт), в геле, что не является неожиданным, так как νίρ076-νίρ017 содержит последовательности для создания структуры стебель-петля, дающие более компактную укладку и, следовательно, более высокую подвижность в геле.

νίρ076, νίρ017 и νίρ078, каждый имеют взаимокомплементарный сегмент, в который после отжига помещают 3'-конец νίρ076 рядом с 5'-концом νίρ017, и 3'-конец νίρ017 рядом с 5'-концом νίρ078, образуя, следовательно, два субстрата для ДНК-лигазы Т4. Таким образом, значительную полосу, соответствующую νίρ07 6-νίρ017-νίρ078, наблюдали на дорожке 4.

Таким образом, продемонстрировано создание тримерной звездообразной структуры ДНК, состоящей из непрерывной цепи ДНК.

Пример 3. Амплификация трехстебельнрой звездообразной структуры ДНК.

В данном примере продемонстрирована успешная амплификация тримерной звездообразной структуры ДНК, состоящей из одной непрерывной цепи ДНК. Взаимокомплементарные биспецифические олигонуклеотиды отжигали, лигировали и затем использовали в качестве матрицы в праймерной реакции удлинения. ДНК-олиго (получаемые ^NΑ Тес1по1оду Агкик, Эептагк) смешивали, как указано ниже, в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1х лигазном буфере (Νρν Епд1апй Вю1аЬ8), 50 мМ №С1. Полученные смеси инкубировали при 80°С в течение 2 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане.

5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т4. Готовили смесь, состоящую из 1,67 мкМ звездообразной структуры, 1х ДНК-лигазного буфера (№ν Епд1апй Вю1аЬ8), 50 мМ №гС1 и 0,2 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т4 (Νον Епд1апй Вю1аЬ8, саΐ# М0201) и инкубировали в течение 30 минут при 37°С.

Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т4 (№ν Епд1апй Вю1аЬ8, саΐ# М0202). 1/3 объема лигазной смеси, 1хДНКлигазный буфер (№ν Епд1апй Вю1аЬ8), 50 мМ №гС1 и 100 Е/мкл ДНК-лигазы Т4 (№ν Епд1апй Вю1аЬ8, саΐ# М0202) добавляли к описанной выше обработанной киназой смеси и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре.

Праймерную реакцию удлинения выполняли добавлением 3 объемов смеси для удлинения, 1, 33хVеηΐ-буфер (№ν Епд1апй Вю1аЬ8), 1,33 мкМ νίρ038, 2,67 мМ йЭТР с 1,33 Е/мкл ДНК-полимеразой

- 25 024849 νοηΐίοχυ-) (Ыете Епд1апб Бю1аЪз, са!#М0257) или без ДНК-полимеразы к 1 объему реакционной смеси для лигирования. Раствор инкубировали в течение 1 мин при 92°С, 1 мин при 50°С и 10 мин при 74°С и помещали на лед.

Реакции анализировали нативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид) с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (ЗатЪгоок, I., Ргйзсй, Е.Р. апб Машайз, Т. (1989) ίη Мо1еси1аг С1оптд: А РаЪога1огу Мапиа1, Зесопб Ебйюп, Со1б Зрппц НагЪог РаЪога1огу Ргезз, Со1б Зргпщ НагЪог, Ыете Уогк).

Результаты экспериментов показаны на фиг. 10. νίρ038 является обратно комплементарным относительно 20 наиболее 5'-концевых (левых) оснований в νιρ078 и, следовательно, может праймировать реакцию удлинения с использованием νιρ078 или слияний νιρ078 в качестве матриц. Таким образом, получали единственную явную полосу, соответствующую двухцепочечному νιρ078, в реакции удлинения, содержащей νιρ038, νιρ076 и νιρ078 (дорожка 2). Следует обратить внимание, что полоса не присутствовала на дорожке 6, которая является эквивалентной, но без включенной ДНК-полимеразы. В отличие от этого, дорожка 6 содержит две полосы, которые предположительно состоят из отожженных νίρ076/νίρ078/νίρ038 и отожженных νίρ078/νίρ038.

Специфичность данной реакции продемонстрирована с использованием νιρ038, νιρ07 6 и νιρ017, где не было видимого различия между вариантами с ДНК-полимеразой и без ДНК-полимеразы, сравните дорожки 1 и 5.

Успешное удлинение праймера наблюдали также с использованием реакции лигирования νιρ017νιρ078, иллюстрируемое заметной полосой на дорожке 3. Следует обратить внимание, что наблюдали также более слабую полосу, соответствующую двухцепочечному νιρ078, что является иллюстрацией того, что не весь νιρ078 был лигирован с νιρ017. На соответствующей дорожке 7 без ДНК-полимеразы наблюдали более слабую полосу почти с такой же подвижностью, что и подвижность двухцепочечного νίρ017-νίρ078. Данная полоса предположительно состоит из отожженного νίρ038/νίρ017-νίρ078.

Успешное удлинение праймера наблюдали также с использованием реакционной смеси νιρ076νίρ017-νίρ078 в качестве матрицы. Наблюдали две полосы с более низкой подвижностью в данном геле, чем в случае двухцепочечного νίρ017-νίρ078. Нижняя полоса соответствует отожженному νίρ038/νίρ076νίρ017-νίρ078, как видно при сравнении с эквивалентной дорожкой 8 без ДНК-полимеразы. Однако верхняя полоса на дорожке 4 является уникальной и, следовательно, состоит из двухцепочечного νιρ076νίρ017-νίρ078. Таким образом, данный пример демонстрирует, что ДНК-структуры могут быть превращены в двухцепочечную ДНК и, следовательно, являются амплифицируемыми.

Пример 4. Химическая реактивность в центре звездообразной структуры.

Химическая реактивность в центре звездообразных структур проявлялась при использовании следующего трехфункционального сшивающего линкера (ТЗАТ, Трис-сукцинимидиламинотриацетат, ГРегсе сак Ыо. 33063):

’О о

ТЗАТ

Мол. Масса (Μ.Ν.) 482,36 Спейсерное плечо 4,4 Ангстрем

ДНК-олиго: νίρ016/νίρ017 или νίρ016/νίρ017/νίρ018 (получаемые ΌΝΑ Тесйпо1оду Атйиз, Оептатк), все имеющие внутренний амино-модифицированный бТ (ОкепКезеатсй, сак Ыо.: 10-1038-хх) смешивали в 150 мМ ЫаС1, 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2 с получением 20 мкМ общей концентрации олиго. Полученные смеси инкубировали при 80°С в течение 2 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане. ТЗАТ растворяли в ДМФА. Готовили 10-кратное серийное разведение в ДМФА. 1 объем ДМФА или разведение ТЗАТ смешивали с 9 объемами буфера с получением конечной концентрации буфера 150 мМ ЫаС1, 100 мМ фосфат натрия, рН 7,2. 1 объем забуференного ДМФА или забуференного ТЗАТ разведения смешивали с 1 объемом отожженной смеси ДНК-олиго с получением конечных соотношений олиго:ТЗАТ: 1:0, 1:10, 1:100, 1:1000, 1: 10000 и давали возможность инкубироваться в течение 2 часов при комнатной температуре.

Данные реакции анализировали электрофорезом в ПААГ: как нативным (7,5% полиакриламид), так и ненативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид, 8М мочевина), с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (ЗатЪгоок, I., ΡπΙχο-Ρ, Е.Р. апб Машабз, Т. (1989) 1п Мо1еси1аг С1оптц: А РаЪога1огу Мапиа1, Зесопб Ебйюп, Со1б Зρ^^пд НагЪог 1,аЪога1огу Ргезз, Со1б Зρ^^пд НагЪог, Ыете Уогк).

- 26 024849

νΐρ016 и νΐρ017, каждый имеет взаимокомплементарный сегмент и способен, следовательно, образовывать отожженную димерную структуру. νΐρ016, νΐρ017 и νΐρ018, каждый имеет взаимокомплементарный сегмент относительно соседнего олиго и способен, следовательно, образовывать замкнутую отожженную тримерную структуру (см. фиг. 12).

Как и ожидалось, на дорожках 1-5 нативного геля основная полоса соответствует димерной структуре, тогда как основная полоса на дорожках 6-10 соответствует тримерной структуре. В ненативном геле отжиг разрушается. Как и ожидалось, наблюдали полосу на дорожках 1 и 6 в ненативном геле, соответствующую мономеру. Однако при включении Т8АТ наблюдали структуры более высокой упорядоченности (дорожки 2-5, 7-10, ненативный гель), свидетельствующие о том, что Т8АТ действительно сшивал данные олиго. Интересно, что, когда присутствовали только νΐρ016 и νΐρ017, сшитая структура наивысшей упорядоченности была димерной (ненативный гель, дорожки 2-5), тогда как, когда присутствовали νΐρ016, νΐρ017, νΐρ018, наблюдали дополнительную тримерную структуру (ненативный гель, дорожки 7-10), что свидетельствует, следовательно, о том, что сшивание зависит от отжига ДНКолигонуклеотидов. Заслуживающим внимания является также то, что, как и ожидалось, наблюдали куполообразную реакцию доза-ответ; при низкой концентрации Т8ЛТ реакция будет медленно ведущей к низким выходам, когда концентрация Т8АТ увеличивается, реакция будет протекать быстрее, приводя к более сшитому продукту, однако при более высоких концентрациях Т8АТ сшивание будет конкурировать с молекулами Т8АТ, реагирующими только с одним ДНК-олиго, приводя к снижению сшитого продукта. Таким образом, наивысший выход сшитого продукта наблюдали с использованием 1000 эквивалентов Т8АТ (дорожки 4 и 9, ненативный гель). Кроме того, преимущество замкнутой отожженной структуры для сшивания иллюстрировалось гораздо более высокими общими выходами, полученными на дорожках 7-10, в сравнении с их копиями на дорожках 2-5 с такой же концентрацией Т8АТ.

Пример 5. Химические реакции, направляемые звездообразной структурой ДНК.

Олигонуклеотид, νΐρ017, функционализировали сшиванием аминокислоты (Ь-Ьеи или О1у Ииса, #61820 и #50052) через альфа-аминогруппу с первичной аминогруппой на внутреннем модифицированном бТ в νΐρ017, гомобифункциональным линкером В8ОСОЕ8 ((Бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси) этил]сульфон), Пегсе са!# 21600) обработкой олигонуклеотида (5 нмоль) в 200 мМ рН 7,4 растворе фосфата натрия (200 мкл) 0,1 объемами 100 мМ раствора В8ОСОЕ8 в ДМФА в течение 10 мин при 25°С с последующей обработкой 0,3 объемами 300 мМ раствора аминокислоты (Ьеи или О1у) в 300 мМ №ОН в течение 2 часов при 25°С. Общий объем реакций составлял 200 мкл. Неочищенные связанные аминокислотные реагенты выделяли осаждением Е!ОН и использовали без дополнительной очистки. ДНК осаждали №ОАс/Е!ОН в соответствии с (8ашЬгоок, I., ТгбзсН, Е.Р. апб Машабз, Т. (1989) ίη Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬогаФту Маηиа1, 8есоηб Еббющ Со1б 8ρηη§ НагЬог ЬаЬогаФту Ргезз, Со1б 8ρηη§ НагЬог, Ье\у Уогк). Осадок ресуспендировали в воде.

Олигонуклеотиды отжигали приготовлением: 3,125 мкМ каждого из олигонуклеотидов, 125 мМ МЕ8 рН 6,0, 187,5 мМ №С1. Полученную смесь инкубировали при 80°С в течение 2 мин с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры на водяной бане. ДНК-направляемую химическую реакцию (образование амидной связи) выполняли добавлением ЕИС и зИН8 к предварительно отожженным олигонуклеотидам: 2,5 мкМ предварительно образованных звездообразных структур, 100 мМ МЕ8 рН 6,0, 150 мМ №С1, 20 мМ ЕИС и 15 мМ зИН8 (конечные концентрации). Полученную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и осаждали Е!ОН, как описано выше.

Данные реакции анализировали электрофорезом в ПААГ: как нативным (7,5% полиакриламид), так и ненативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид, 8М мочевина) с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (8атЬгоок, I., Рп!зсН, Е.Е апб Маша!1з, Т. (1989) ίη Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬога!огу Маηиа1, 8есогк1 Еббющ Со1б 8ρηη§ НагЬог ЬаЬогаФту Ргезз, Со1б 8ρίΐη§ НагЬог, Ье\у Уогк).

- 27 024849

Олигонуклеотид, νίρ017, функционализировали сшиванием аминокислоты, Ьеи или С1у, через альфа-аминогруппу с первичной аминогруппой на модифицированном внутреннем бТ в νίρ017, гомобифункциональным линкером В8ОСОЕ8. Модифицированный бТ расположен между двумя сегментами гибридизации в νίρ017. νίρ076 имеет модифицированный бТ, содержащий первичную аминогруппу, за которой следует 3'-сегмент гибридизации, комплементарный 5'-сегменту гибридизации в νίρ017. Таким образом, отжигом νίρ017 и νίρ076 создается близость между аминокислотой, конъюгированной с νίρ017, и первичной аминогруппой на νίρ076. Таким образом, полосу, соответствующую димеру, наблюдали на дорожках 4-6 в нативном геле. νίρ008 имеет комплементарные сегменты в отношении как νίρ076, так и νίρ017 и, следовательно, способен образовывать замкнутую тримерную звездообразную структуру и размещать химические функциональные группы νίρ017 и νίρ076 в реакционной камере в центре звездообразной структуры. Таким образом, полосу, соответствующую тримеру, наблюдали на дорожках 1-3 в нативном геле.

После активации с использованием ΕΌ0κΝΗδ может быть образована амидная связь между аминокислотой, конъюгированной с νίρ017, и первичной аминогруппой в νίρ076 и посредством этого сшивание νίρ017 и νίρ076. Как и ожидалось, когда образовывались звездообразные структуры (в присутствии νίρ008), действительно появлялась уникальная полоса, соответствующая сшитым νίρ076/νίρ017 как с νίρ017^φ, так и с νίρ017-Ραι (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожки 2 и 3, соответственно), которая не присутствовала без активации ΕΌ0κΝΗδ (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожки 8 и 9) или в неацетилированным νίρ017 (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожка 1). Интересно, что эта уникальная полоса не детектировалась, когда не присутствовал νίρ008 (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожки 5 и 6). Это является иллюстрацией того, что химическая реакция может направляться звездообразной структурой и что звездообразная структура, является, по-видимому, более эффективной в направлении химических реакций, чем два отожженных олиго.

Пример 6. Сборка и лигирование звездообразной структуры.

В данном примере продемонстрирована успешная амплификация тримерной звездообразной структуры ДНК, состоящей из двухцепочечной ДНК (6κΌΝΑ). Взаимокомплементарные специфические олигонуклеотиды отжигали, лигировали и затем использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции. Использовали следующие олигонуклеотиды: νίρ029-νίρ031-νίρ0132-νίρ0133-νίρ030. На фиг. 13 показана схематически гибридизация указанных олигонуклеотидов.

ДНК-олигонуклеотиды (получаемые ΌΝΑ ТесЬпо1оду АтЬик, Иептатк) смешивали в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1х лигазном буфере Епд1апб В|о1аЬк), 50 мМ №С1. Полученные смеси инкубировали следующим образом: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С до следующей стадии. Процедуру отжига выполняли на ПЦР-установке Αρρ^6 ВюкуЧетк АВ2720.

5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т4. Готовили смесь, состоящую из 1,5 мкМ звездообразной структуры, 1х ДНК-лигазного буфера (№те Епд1апб В1о1аЬк), 50 мМ №С1 и 0,17 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т4 Епд1апб Вю1аЬ8, са!# М0201) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С.

Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т4 (№те Епд1апб Вю1аЬк, са!# М0202) в 1хДНК-лигазном буфере Епд1апб В1о1аЬк), содержащем 50 мМ №С1 и 200 Е ДНК-лигазы Т4 Епд1апб Вю1аЬ8, са!# М0202), в объеме 10 мкл и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.

ПЦР-амплификацию выполняли с использованием следующих условий.

Реакцию выполняли в 1хТЬегтоРо1-буфере (№те Епд1апб В1о1аЬк В90048) с 0,2 мМ бЭТР (№те Епд1апб В1о1аЬк О4478), 8 мМ Мд§О₄, 0,2 мкМ СМЫСЛОВЫМ праймером и 0,2 мкМ антисмысловым праймером, 1М бетаином (§1дта В0300), 1 Е/100 мкл Vеη! (ехо-) (№те Епд1апб В1о1аЬк М0257Ь). Используемыми праймерами были νίρ027 и νίρ028. Биотинилированными версиями двух праймеров являются νίρ034 и νίρ038, соответственно. ПЦР-амплификацию выполняли с использованием следующих условий проведения циклов: 2 мин при 95°С и 20 циклов 95°С/30 с, 60°С/30 с, 74°С/30 с. Очистку ПЦР-продукта, который должен использоваться для фолдинга, и одноцепочечной ДНК (κκΌΝΑ), сообщенную в примере 7 ниже, выполняли с праймерами νίρ034 и νίρ028. ПЦР-продукт анализировали нативным электрофорезом в ПААГ. Полоса 201 п.н. ясно виден на геле, изображенном на фиг. 13.

Пример 7. Рефолдинг ПЦР-продукта.

Фолдинг (укладку) ПЦР-продуктов выполняли следующим образом. Процедуру очистки ПЦР выполняли с использованием Ре^ίес!Р^еρ (Έρρеηбο^Γ. са!# 0032 007.740) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. Фолдинг выполняли в 0,1М №С1, 0,1% Тритоне Х-100, 0,1 мкМ νίρ027, 0,1 мкМ νίρ028, в объеме 10 мкл (5 мкл на продукт, смешанный с 5 мкл 2х смеси буфер/праймер). ПЦР-продукт использовали в 4 различных концентрациях (в диапазоне от 1:2 до 1:20). В одной серии полученную смесь инкубировали в течение 2 мин в кипящей воде и затем охлаждали на бане со смесью воды и льда. Во второй серии полученную смесь нагревали и охлаждали с использованием следующей программы ПЦР-установки Αρρ^6 В1о5у5!ет5 АВ2720: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30

- 28 024849 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С до следующей стадии. В третьей серии не проводили нагревание и охлаждение.

Полученные продукты анализировали на геле 20% ТВЕ-мочевина (1иуЬгодеи). Гель окрашивали красителем 8УВК зеленым (Мо1еси1аг РгоЬек 87563, разведение 1:10000 в буфере 1хТВЕ, в соответствии с инструкциями).

На фиг. 14 дорожки геля содержат следующее:

Дорожка 1: ПЦР-продукт, разведенный 1:2, быстрое охлаждение;

Дорожка 2: ПЦР-продукт, разведенный 1:4, быстрое охлаждение;

Дорожка 3: ПЦР-продукт, разведенный 1:10, быстрое охлаждение;

Дорожка 4: ПЦР-продукт, разведенный 1:20, быстрое охлаждение;

Дорожка 5: ПЦР-продукт, разведенный 1:2, ступенчатое охлаждение;

Дорожка 6: ПЦР-продукт, разведенный 1:4, ступенчатое охлаждение;

Дорожка 7: ПЦР-продукт, разведенный 1:10, ступенчатое охлаждение;

Дорожка 8: ПЦР-продукт, разведенный 1:20, ступенчатое охлаждение;

Дорожка 9: ПЦР-продукт, разведенный 1:2, без обработки;

Дорожка 10: ПЦР-продукт, разведенный 1:4, без обработки;

Дорожка 11: ПЦР-продукт, разведенный 1:10, без обработки;

Дорожка 12: ПЦР-продукт, разведенный 1:20, без обработки;

Дорожка 13: Только ПЦР-продукт.

Данный эксперимент показывает, что одноцепочечная структура ДНК мигрирует при приблизительно 1000 п.н. в отличие от двухцепочечного ДНК-продукта (άδΌΝΑ) 201 п.н. По-видимому, оптимальным условием для образования звездообразной структуры является нагревание с последующим быстрым охлаждением указанных реакций.

Пример 8. Очистка подвергнутой рефолдингу (повторной укладке) звездообразной структуры.

Звездообразную структуру двухцепочечной ДНК (δδΌΝΑ) очищали с использованием покрытых стрептавидином магнитных гранул (Όνηαΐ Са1# 650.02). 10 мкл гранул промывали два раза 2х ΒνΤ (2М ЫаС1, 10 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ΕΌΤΑ, 0,2% Тритон-Х-100). После конечного промывания гранулы суспендировали в одном объеме 2х ΒνΤ и добавляли один объем подвергнутого рефолдингу ПЦРпродукта. Полученную суспензию инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, перемешивая время от времени. Пробирку помещали в магнит и после сбора гранул супернатант удаляли. Гранулы суспендировали в теплом (50°С) промывном буфере (2М мочевина, 0,1% Тритон Х-100) и инкубировали в течение 2 мин при 50°С. Пробирку помещали на магнит и процедуру промывки выполняли в целом три раза. Одну конечную промывку выливали в 1х ΒνΤ (1М ЫаС1, 5 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 0,5 мМ ΕΌΤΑ, 0,1% Тритон-Х-100). После удаления конечного промывного буфера гранулы суспендировали в 1,5 мл ΝΤ (10 мМ ЫаС1, 0,1% Тритон Х-100) и инкубировали при 50°С в течение 5 мин. Пробирку переносили на баню со смесью воды со льдом для быстрого охлаждения и процедура приводила к образованию звездообразной структуры, иммобилизованной на покрытых стрептавидином магнитных гранулах. Пробирку после быстрого охлаждения помещали на магнит и супернатант удаляли. Гранулы суспендировали в 50 мкл ΝΤ, и они были готовы для расщепления Вза1 для освобождения одноцепочечной ДНК от гранул.

К 17 мкл гранул добавляли 2 мкл 10х ЫЕВ3-буфера и 1 мкл Вза1 (10 Е/мкл; ΝΕΒ Κ0535Ό). Реакцию инкубировали 14 ч при 50°С. Продукт расщепления анализировали денатурирующим электрофорезом в полиакриламиднром геле (гель 10% ТВЕ-мочевина, 1пуПгодеп) добавлением денатурирующего буфера для нанесения к пробам и нанесением всей смеси, включающей гранулы, в лунки геля. Гель окрашивали красителем 8УВК зеленым (Мо1еси1аг РгоЬез 87563, разведение 1:10000 в буфере 1хΤΒΕ, в соответствии с инструкциями).

На фиг. 15 наблюдается одна полоса на дорожке 1 (+Вза1) и отсутствие полос на дорожке 2 (-Вка1). Таким образом, δδΌΝΑ подверглась укладке на покрытых стрептавидином магнитных гранулах с образованием таким образом субстрата для ΒδаI, демонстрируемым способностью данного фермента расщеплять одноцепочечный продукт.

Пример 9. Формат расщепления петли.

Конструировали два генома, оба из которых могли расщепляться в петлях звездообразных структур. Рестриктазы обычно не способны расщеплять одноцепочечную ДНК (δδΌΝΑ). Однако отжиг 10-мерных олигонуклеотидов с петлями генерируют субстраты для ферментов, и посредством этого последовательности узнавания для указанных ферментов становятся двухцепочечными. План данного эксперимента схематически показан на фиг. 16.

Собирали две структуры, δ129 и δ149. δ129 состояла из следующих олигонуклеотидов: νίρ029νίρ161-νίρ162-νίρ163-νίρ170. δ149 состояла из следующих олигонуклеотидов: νίρ029-νίρ161-νίρ192νίρ193-νίρ070. νίρ162, νίρ163, νίρ192 и νίρ193, все содержали последовательности узнавания двух рестриктаз (νίρ162: ΑρаI и ВагаН1, νίρ163: ЕсоК1 и ΚρηΙ, νίρ192: ΡνιιΙΙ и 8ас1, νίρ193: 8та1 и νδρΐ).

ДНК-олиго (получаемые ΤΑΟί'.’. СоцепНадеп. Эептагк) смешивали в концентрациях 2 мкМ, каж- 29 024849 дый, в 1х лигазном буфере (Яете Епд1ап6 Вю1аЬ5), 50 мМ ИаС1. Полученные смеси инкубировали следующим образом: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С до следующей стадии. Процедуру отжига выполняли на ПЦР-установке АррПеб Вю5У51ет5 АВ2720.

5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т4. Готовили смесь, состоящую из 1,5 мкМ звездообразной структуры, 1х ДНК-лигазного буфера (Иете Епд1ап6 Вю1аЬ5), 50 мМ ИаС1 и 0,17 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т4 (Яете Епд1ап6 Вю1аЬ5, са!# М0201) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С.

Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т4 (Νρ» Епд1ап6 Вю1аЬ5, са!# М0202) в 1хДНК-лигазном буфере (Яете Епд1ап6 Вю1аЬ5), содержащем 50 мМ ИаС1 и 200 Е ДНК-лигазы Т4 (Яете Епд1ап6 Вю1аЬ5, са!# М0202), в объеме 10 мкл и инкубировали в течение ночи при 16°С.

ПЦР-амплификацию выполняли с использованием следующих условий.

Реакцию выполняли в 1 хТЬегтоРо1-буфере (ИЕВ В90048) с 0,2 мМ 6ΝΤΡ (ИЕВ 04478), 8 мМ Мд80₄, 0,2 мкМ смысловым праймером и 0,2 мкМ антисмысловым праймером, 1М бетаином (81дта В0300), 1 Е/100 мкл Уеп! (ехо-) (ИЕВ М0257Ь). Используемыми праймерами были νίρ027 и νίρ028. Биотинилированными версиями двух праймеров являются νίρ034 и νίρ038, соответственно. ПЦРамплификацию выполняли с использованием следующих условий проведения циклов: 2 минуты при 95°С и 20 циклов 95°С/30 с, 60°С/30 с, 74°С/30 с.

Результат данного эксперимента показан на фиг. 17.

На дорожках 1 и 3 видно, что оба генома успешно амплифицировались. Дорожки 2 и 4 являются отрицательными контролями без добавления лигазы для двух геномов.

Очистка структур 55ΌΝΛ 5129 и 5149.

мкл ПЦР-продукта (полученного с использованием праймеров νίρ034 и νίρ028) каждого генома очищали с использованием РегРес^не} (Еρρеη6ο^Р, са!# 0032 007.740) в соответствии с инструкциями набора. Элюирование выполняли в 40 мкл буфера для элюирования. Для рефолдинга этих ПЦРпродуктов выполняли следующее: к 4 0 мкл ПЦР-продукта добавляли 750 мкл 0,2М ИаС1, 0,2% Тритон Х-100, 7,5 мкл νίρ027 и 7,5 мкл νίρ028 и 695 мкл Н₂0. Полученную смесь инкубировали в кипящей воде в течение 5 мин и быстро охлаждали на бане со смесью воды и льда.

мкл покрытых стрептавидином гранул (Όνικιΐ Са!# 650.02) промывали два раза 2х ΒνΤ (2М ИаС1, 10 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЕОТА. 0,2% Тритон-Х-100). После конечного промывания гранулы суспендировали в одном объеме 2х ΒνΤ и добавляли один объем подвергнутого рефолдингу ПЦРпродукта. Полученную суспензию инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, перемешивая время от времени. Пробирку помещали в магнит и после сбора гранул супернатант удаляли. Гранулы суспендировали в теплом (50°С) промывном буфере (2М мочевина, 0,1% Тритон Х-100) и инкубировали в течение 2 мин при 50°С. Пробирку помещали на магнит и процедуру промывки выполняли в целом три раза. Одну конечную промывку выливали в 1х ΒνΤ (1М ИаС1, 5 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 0,5 мМ ЕОТА, 0,1% Тритон-Х-100). После отделения на магните гранулы суспендировали в 50 мкл 10 мМ ИаС1, 0,1% Тритон Х-100).

мкл гранул каждого препарата отделяли на магните и суспендировали в 10 мкл 100 мМ ИаС1, 0,1% Тритоне Х-100. Каждый препарат делили на две трубки по 5 мкл каждая, и расщепленные олиго добавляли следующим образом:

1: 5129 - νίρ164 - Ара1 2:з 129 - νίρ165 - ΚρηΙ 3: 5149 - νίρ!94 - ΡνιιΙΙ 4: 5149 - νίρ195 - Узр!

Добавляли 0,25 мкл олиго (из исходного раствора 20 мкМ), что давало конечную концентрацию 1 мкМ. Отжиг выполняли на ПЦР-установке АВ2720 с использованием программы: 50°С - 2 мин; 40°С - 2 мин; 35°С - 2 мин, 30°С - 2 мин; 30°С - 2 мин; 25°С - 2 мин; 20°С - 2 мин.

Гранулы промывали в 100 мкл 100 мМ ИаС1, 0,1% Тритоне Х-100. Затем гранулы суспендировали в 18 мкл 1, 1 х буфера для расщепления. Реакционные смеси делили на две пробирки по 9 мкл каждая и в каждую пробирку добавляли 1 мкл фермента (10 Единиц), что давало 1хбуфер для расщепления для каждого расщепления. Одну серию расщеплений выполняли при 30°С, и другую серию расщеплений выполняли при 37°С. Инкубацию выполняли в течение 5 часов с перемешиванием время от времени для суспендирования гранул со дна пробирок.

После расщепления продукты анализировали на геле 10% ТВЕ-мочевина Опуйгодеп). К продуктам расщепления добавляли буфер для нанесения и всю реакционную смесь, включающую гранулы, наносили на гель. Этот гель окрашивали красителем 8ΥΒΚ зеленым (Мо1еси1аг РгоЬе5 87563, разведение 1:10000 в буфере 1хТВЕ, в соответствии с инструкциями).

Результат данного эксперимента показан на фиг. 18.

- 30 024849

Дорожка	1	показывает	продукт	расщепления	Ара1	з129	при	37°С
Дорожка	2	показывает	продукт	расщепления	ΚρηΙ	з129	при	37°С
Дорожка	3	показывает	продукт	расщепления	ΡνιιΙΙ	з149	1 при	: 37°С
Дорожка	А	показывает	продукт	расщепления	Узр1	з149	при	37°С
Дорожка	5	показывает	продукт	расщепления	Ара1	з129	при	30°С
Дорожка	6	показывает	продукт	расщепления	Крш	з129	при	30°С
Дорожка	7	показывает	продукт	расщепления	ΡνιιΙΙ	з149	1 при	: 30°С
Дорожка	8	показывает	продукт	расщепления	Узр!	з149	при	30°С

Ожидаемыми размерами полос являются следующие:

АраГ: 163 нт, Крп!: 80 нт, ΡνιιΙΙ: 165 нт, Узр!: 83 нт

На данном геле полосы ожидаемых размеров действительно появляются для всех четырех ферментов. Следует обратить внимание, что фрагменты, содержащие биотин, не входят в этот гель, так как они связаны с гранулами. Обе температуры дают продукт, свидетельствуя о надежности данной методики.

Пример 10. Направляемое ДНК образование амидных связей в различных топологиях.

Олигонуклеотид, νίρ017, функционализировали сшиванием аминокислоты (О1уеше, Р1иеа #50052) через альфа-аминогруппу с первичной аминогруппой на внутреннем модифицированном άΤ в νίρ017, гомобифункциональным линкером В8ОСОЕ8 ((Бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон), йегее еа1# 21600) обработкой олигонуклеотида (5 нмоль) в 200 мМ рН 7,4 растворе фосфата натрия (200 мкл) 0,1 объемами 100 мМ раствора В8ОСОЕ8 в ДМФА в течение 10 минут при 25°С с последующей обработкой 0,3 объемами 300 мМ раствора аминокислоты (глицина) в 300 мМ ЫаОН в течение 2 часов при 25°С. Общий объем реакций составлял 200 мкл. Неочищенные связанные аминокислотные реагенты выделяли осаждением ЕЮН и использовали без дополнительной очистки.

ДНК осаждали ЫаОАе/ЕЮН в соответствии с (8атЬгоок, 1., РгЪкеЬ, Е.Р. ;·ιηά Матайк, Т. (1989) ίη Мо1ееи1аг Оошнд: А ЬаЬогаФгу Маηиа1, 8ееонй ЕЙ111оп, Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Со1й 8ргтд НагЬог, №\ν Уогк). Осадок ресуспендировали в воде.

Олигонуклеотиды отжигали приготовлением: 0,556 мкМ каждого из олигонуклеотидов, 111 мМ МОР8 рН 6,5 (Р1ика 69947), 1,11М ЫаС1 Р1ика 71376) и затем инкубировали следующим образом: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С до следующей стадии. Процедуру отжига выполняли на ПЦР-установке Аррйей Вюкуйетк АВ2720.

ДНК-направляемую химическую реакцию (образование амидной связи) выполняли добавлением 100 мМ ΌΜΤΜΜ (Аегок, еа1# А017657001) к предварительно отожженным олигонуклеотидам. ΌΜΤΜΜ растворяли в воде при концентрации 1 М. Перед добавлением ΌΜΤΜΜ реакционные смеси предварительно нагревали до 50°С. Конечная концентрация каждого олигонуклеотида была 0,5 мкМ. Реакции осуществляли в 100 мМ ΜОР8 рН 6,5, 1М ЫаС1, 100 мМ ΌΜΤΜΜ (конечная концентрация), в объеме 20 мкл при 50°С в течение 3 ч.

Данные реакции анализировали электрофорезом в ПААГ: как нативным (20% полиакриламид, Ιηνίйодей), так и денатурирующим электрофорезом в ПААГ (10% полиакриламид, 7М мочевина) с последующим окрашиванием красителем 8ΥΒΚ зеленым (Μο1ееи1а^ РгоЬек 87563, разведение 1:10000 в 1хРВЕ-буфере, в соответствии с инструкциями).

Олигонуклеотид, \ар017, функционализировали сшиванием аминокислоты (глицина) через альфааминогруппу с первичной аминогруппой на модифицированном внутреннем άΤ в \ар017, гомобифункциональным линкером В8ОСОЕ8. Модифицированный άΤ расположен между двумя сегментами гибридизации в \ар017. У1р008 не содержит акцепторной аминогруппы на модифицированном άΤ, он содержит один сегмент гибридизации, с использованием которого он будет гибридизоваться с \тр017 и, следовательно, не будет ковалентно связанным с У1р017-О1у после добавления ΌΜΤΜΜ. Таким образом, на дорожке 1 нет видимой полосы.

У1р018-МН₂ имеет модифицированный άΤ, содержащий первичную аминогруппу, за которой следует сегмент гибридизации, комплементарный 5'-сегменту гибридизации в \Тр017. Поэтому отжигом \тр()17-С1у и у|р018-УН2 создается близость аминогруппы на \Тр018. Таким образом, на дорожке 2 наблюдали полосу, соответствующую димеру, состоящему из сшитого \тр017-С1уЛтр018-УН₂.

У1р006 имеет комплементарные сегменты относительно как У1р017-С1у, так и \зр018-УН₂ и, следовательно, он способен образовывать замкнутую тримерную звездообразную структуру и помещать химические группы \зр017-С1у и \тр018-УН₂ в реакционную камеру в центре звездообразной структуры. Таким образом, на дорожке 3 наблюдали полосу, соответствующую димеру, состоящему из сшитого \тр017-С1уЛтр018-УН₂. Кроме того, дорожка 3 содержала больше красителя, чем дорожка 2, свидетельствуя о том, что замкнутая тримерная звездообразная структура создает лучшие условия реакции, чем

- 31 024849 условия реакции, создаваемые открытой димерной структурой.

У1]з020ЛН₂ имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу, но не содержит сегментов гибридизации с У1р017-С1у. Таким образом, на дорожке 4 не появляются полосы, так как реагенты зз]з020ЛН₂ и У1р017-С1у не приводятся в реакционную близость посредством спаривания оснований.

νίρ006 имеет один сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом У1р017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с У1р-20ЛН₂, который имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу между его двумя сегментами гибридизации. Таким образом, νίρ006 приводит функциональные группы в близость, и на дорожке 5 видна полоса, составляющая сшитые 3р017-С1у и зз]3020ЛН₂.

νίρ009 имеет один сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом З1р017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с У1р020ЛН₂, который имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу между его двумя сегментами гибридизации. Таким образом, νίρ009 приводит функциональные группы в близость. Таким образом, на дорожке 6 наблюдали полосу, составляющую сшитые З1р017-С1у и ν^ρ020-NН₂.

νίρ006 имеет один сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом З1р017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с ν^ρ020-NН2, который имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу между его двумя сегментами гибридизации. νίρ009 имеет один сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом З1р017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с 33)3-20^^, который имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу между его двумя сегментами гибридизации. Гибридизация таких четырех олигонуклеотидов приводит к образованию тетрамерной звездообразной структуры. На дорожке 7 наблюдали полосу, свидетельствующую о том, что функциональные группы на зз]з017-С1у и νίρ020 приведены в близость друг с другом гибридизацией четырех олигонуклеотидов. Кроме того, дорожка 7 содержала больше красителя, чем как дорожка 5, так и дорожка 6, свидетельствуя о том, что замкнутая тетрамерная звездообразная структура создает лучшие условия реакции, чем условия реакции, создаваемые открытыми тримерными структурами.

У1]з048ЛН₂ имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу, и содержит один сегмент гибридизации, способный связываться с зз]з017-С1у. Между модифицированным йТ с первичной аминогруппой и сегментом гибридизации, способным отжигаться с З1р017-С1у, встроены 6 нуклеотидов, не участвующих в гибридизации (нуклеотиды нестрогого соответствия). На дорожке 8 наблюдали полосу, что указывало на сшивание двух олигонуклеотидов. Однако 6 лишних введенных нуклеотидов действительно снижали количество полученного сшитого продукта, как видно из сравнения дорожки 8 и дорожки 2.

νίρ006 имеет один сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом зз]з017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с νίρ048. V^ρ048-NН₂ имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу, и содержит один сегмент гибридизации, способный связываться с зз]з017-С1зз Между модифицированным йТ с первичной аминогруппой и сегментом гибридизации, способным отжигаться с З1р017-С1у, встроены 6 нуклеотидов, не участвующих в гибридизации (нуклеотиды нестрогого соответствия).

Присутствие νίρ006 приводит две реакционноспособные группы в близость, и образуется продукт, как видно на дорожке 9. Интенсивность данной полосы более сильная, чем полосы, наблюдаемой на дорожке 8, что свидетельствует о том, что νίρ006 стабилизирует данную структуру (тримерную звездообразную структуру), и реакция протекает лучше, чем реакция, обнаруженная в димерном формате данной реакции.

У1]з048ЛН₂ имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу, и содержит один сегмент гибридизации, способный связываться с зз]з017-С1у. Между модифицированным йТ с первичной аминогруппой и сегментом гибридизации, способным отжигаться с З1р017-С1у, встроены 6 нуклеотидов, не участвующих в гибридизации (нуклеотиды нестрогого соответствия). νίρ056 содержит сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с З1р017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом зз]з048ЛН₂, содержащим 6 нуклеотидов нестрогого соответствия. Таким образом, после отжига трех олигонуклеотидов первичная аминогруппа на модифицированном йТ на νίρ04 8 перемещается на 6 нуклеотидов от реакционной камеры и теперь находится в двухцепочечном плече. Двухцепочечная ДНК, в отличие от одноцепочечной ДНК, является очень жесткой и, следовательно, предотвращающей свободное перемещение конъюгированной части молекулы и, следовательно, ее реакционную способность. Таким образом, на дорожке 10 наблюдали только очень слабое окрашивание.

У1]з018ЛН₂ имеет модифицированный йТ, содержащий первичную аминогруппу, за которой следует 3'-сегмент гибридизации, комплементарный 5'-сегменту гибридизации в зз]з017-С1зз νίρ056 имеет один сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с сегментом зз]з017-С1у, и другой сегмент гибридизации, способный гибридизоваться с зз]з018ЛН₂. Между двумя сегментами гибридизации νίρ056 содержится лишние б нуклеотидов (нуклеотидов нестрогого соответствия). На дорожке 11 видна димерная полоса, свидетельствующая о том, что данные реакционноспособные группы при- 32 024849 ведены в близость друг с другом для протекания химической реакции, и б нуклеотидов нестрогого соответствия в νίρ056 не ухудшают реакционной близости с существующей структурой в данном эксперименте.

Пример 11. Химическое получение различных олигонуклеотидов.

Пример 11.1 Ацетилирование олигонуклеотида, имеющего внутренний модифицированный йТ (амино-С6-йТ) (положение п=1).

Ацетилирование с использованием Ртос-АА-ОН, промотируемого ЭМТ-ММ.

Олигонуклеотид νίρ068, имеющий внутренний амино-С₆-йТ, ацилировали с использованием РтосЬеи-ОН, промотируемого ЭМТ-ММ (4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолинийхлоридом, Р1ика #74104), обработкой олигонуклеотида (500 пмоль), растворенного в смеси 1:1 ДМФА и 300 мМ №С1, вместе с одним из следующих буферов: фосфат натрия 4 00 мМ, рН 7,0, МОРЗ 4 00 мМ, рН 7,5, НЕРЕЗ 400 мМ, рН 8,0, фосфат натрия, рН 8,8, с ЭМТ-ММ 50 мМ. Общий реакционный объем был 20 мкл. Реакционные смеси инкубировали 16 часов при 25°С. Реакционную смесь разбавляли до 50 мкл и очищали на центрифугируемой колонке (Атегкйат Вюкаепсе #27-5325-01) в соответствии с протоколом изготовителя с последующей очисткой ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом.

Общий способ очистки.

Функционализированные олигонуклеотиды очищали с использованием прибора ВЭЖХ Не\у1е11 Раскагй Адйеп! с автоматическим дозатором для ввода пробы и коллектором фракций на колонке С18 ХТегга (Аа1егк #186000602) с использованием смесей ацетонитрил/ТЕАА 100 мМ рН 7,0 в качестве элюента. Подходящие фракции лиофилизировали и разбавляли до 20 мМ водой.

Общий масс-спектрометрический анализ.

Функционализированные олигонуклеотиды анализировали при помощи МАЬО1-ТОР-массспектрометрии на приборе Вгикег АиЮР1ех в матриксе НРА/цитрат аммония с использованием режима отражателя отрицательных ионов.

ДНК Рассчитанная масса Найденная масса νϊρΟбЗ-ЬеиГтос 6843,340 6844,5

Пример 11.2. Ацетилирование олигонуклеотида, имеющего внутренний модифицированный йТ (амино-С6-йТ) (положение п=1).

Ацетилирование с использованием Ртос-АА-ОЗи.

Олигонуклеотид νίρ04 6 ацилировали Ртос-АА-ОЗи (АА=С1у или Ьеи) обработкой олигонуклеотида (125 пмоль), растворенного в смеси 1:1 ДМФА и натрий-фосфатного буфера 100 мМ, рН 7,4, 25 мМ Ртос-С1у-ОЗи (СНет1трех #02420) или Ртос-Ьеи-ОЗи (СНет1трех #02429) в течение 2 ч при 25°С. Функционализированный олигонуклеотид осаждали ХН₄ОАс/Е1ОН в соответствии с (ЗатЬгоок, ί., Рй1ксй, Е.Р. апй Мапгайк, Т. (1989) т Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Зесопй Еййюп, Со1й Зрйпд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Со1й Зрйпд НагЬог, №ν Уогк). Осадок ресуспендировали в воде и анализировали при помощи МАЬО1-ТОР-масс-спектрометрии.

ДНК Рассчитанная масса Найденная масса у1р046-ЬеиГшос 6932,3642 6932,1 νίρ04 6-61иГлюс 6876,3016 6876,1

Пример 11.3. Ацетилирование олигонуклеотидов, имеющих внутренний модифицированный йТ (амино-С6-йТ) (положение п=1).

Синтез конъюгатов пептид-олигонуклеотид (однобуквенные аббревиатуры, используемые для аминокислот): УССРЬА1р068, СЬРУСА1р068, УССРЬ-РЕСА1р068, СЬРУС-РЕСА1р068, С.ЕЕ-\!р016 и СРЬ-РЕС-Ар016: Ацетилирование с использованием Ртос-АА-ОЗи с последующим удалением защитных групп на сефарозе.

Пептиды синтезировали из первичной аминогруппы на внутреннем модифицированном йТ на олигонуклеотидах,абсорбированных на ДЕАЕ-сефарозе (З1дта #ЭРР100). Аминокислоты связывали посредством раундов ацилирования с Ртос-АА-ОЗи (АА=С1у, Ьеи, РНе, Туг, С6, РЕС) (Νгидроксисукцинимидный эфир Ртос-Ь-глицина, СНет1трех #02420; Ν-гидроксисукцинимидный эфир Ртос-Ь-лейцина, СНет1трех #02429; Ν-гидроксисукцинимидный эфир Ртос-Ь-фенилаланина, СНет1трех #02446; Ν-гидроксисукцинимидный эфир Ртос-Ь-тирозина, СНет1трех #11972; Νгидроксисукцинимидный эфир Ртос-6-аминогексановой кислоты, СНет1трех #7296; Νгидроксисукцинимидный эфир Ртос-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты, синтезированной из Ртос8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (СНет1трех #7310) связыванием ЕЭС с Ν-гидроксисукцинимидом) с последующим удалением Ртос в соответствии с процедурой На1рш апй НагЬигу (Р1ок Вю1оду 2004, 2, 1-8). После элюирования ДНК из сефарозы смесь обессоливали на центрифугируемой колонке (Атегкйат Вюкаепсек #27-5325-01) в соответствии с протоколом изготовителей с последующей очисткой при помощи ВЭЖХ. Выходы определяли с использованием ВЭЖХ.

- 33 024849

ДНК

ΥΕ6ΕΊ,-νΐρΟ68

ΥΕΕΡ1,-ΡΕ(3-νίρΟ68

Полученный при выделении выход 19%

32%

5ΣΓΥΕ-νίρΟ68 11%

ΟΣΓΥ6-ΡΕΕ-νίρ068 18%

5ϊΤ-νίρΟ16 30%

6ΕΊ,-ΡΕ(3-νίρΟ16 36%

Пример 11.4. Ацетилирование олигонуклеотида, имеющего внутренний модифицированный ЙТ (амино-С6-йТ) (положение п=1).

Синтез акцепторного олигонуклеотида с С6-NΗ₂-, РЕС-NΗ₂- и С1у-NΗ₂-линкером.

Олигонуклеотид, νίρ016, абсорбированный на ДЕАЕ-сефарозе (81дта #ΌΡΡ100), ацилировали на первичной аминогруппе на внутреннем модифицированном ЙТ в νίρ016 с использованием РтосМН-С₆СО₂8и ^-гидроксисукцинимидный эфир Ртос-6-аминогексановой кислоты, СЬетПпрех #7296), РтосNН-РЕС-Οδи ^-гидроксисукцинимидный эфир Ртос-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты, синтезированной из Ртос-8-амино-3,6-диоксаоктанровой кислоты (СЬет1трех #7310) связыванием ЕЭС с ^гидроксисукцинимидом) или Ртос-С1у-О8и ^-гидроксисукцинимидный эфир Ртос-Ь-глицина, СЬет1трех #02420) с последующим отщеплением защитной группы Ртос в соответствии с методикой На1рш апй НагЬиту (Р1о8 Вю1оду 2004, 2, 1-8). Реакции осуществляли на 1 ммоль ДНК. После элюирования ДНК из сефарозы смесь обессоливали на центрифугируемой колонке (АтетзЬат Вюзаепсез #275325-01) в соответствии с протоколом изготовителей с последующей очисткой ВЭЖХ. Выходы определяли ВЭЖХ.

ДНК Полученный при выделении выход

Η2Ν-ΡΕΕ-νϊρΟ16 39% Η2Ν-Ο6-νίρ016 39% Η-Ε-νίρ016 45%

Пример 11.5. Конъюгирование аминокислот с олигонуклеотидами, имеющими внутренний модифицированный ЙТ (амино-С6-йТ) через В8ОСОЕ8 или Όδδ в положении пМ.

Олигонуклеотиды, \1р046. улр017„ У1р047 и У1р048. функционализировали сшиванием аминокислоты (С1у, Ь-Ьеи, Ь-РЬе, Ь-Тут, Р1ика, #50052, #61820, #78020, #93829) через альфа-аминогруппу с первичной аминогруппой на внутреннем модифицированном ЙТ в олигонуклеотиде с использованием гомобифункциональных линкеров ΒδΟСΟЕδ ((Бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон), Р1етсе са!#21600) и Όδδ (дисукцинимидилсуберат, Р1етсе са!#21655) обработкой олигонуклеотида (0,5 нмоль) и аминокислоты (15 мМ) в смеси 1:1 ДМФА и 400 мМ рН 8,4 натрий-фосфатного буфера линкером (10 мМ). Общий объем реакции составлял 20 мкл. Реакционные смеси инкубировали 4 ч при 25°С. Реакционную смесь разбавляли до 50 мкл и очищали на центрифугируемой колонке (АтетзЬат Вюзаепсез #275325-01) в соответствии с протоколом изготовителей с последующей очисткой ВЭЖХ. Выходы определяли ВЭЖХ. Идентичность определяли МАЬОРТОР-масс-спектрометрией.

ДНК	Полученный выход	Рассчитанная масса	Найденная масса
νίρ04 6-ВЗОСОЕЗ-Е1у	32%	6878,2325	6879,3
У1р046-ВЗОСОЕЗ-Ееи	48%	6934,2951	6936,1
У1р04ё-ВЗОСОЕЗ-РЬе	49%	6968,2795	6969,0
νίρ04 6-ВЗОСОЕЗ-Туг	51%	6984,2744	6985,5

Пример 12. Стабильность реакции ацилирования в реакционном центре при различных температурах.В данном примере демонстрируется, каким образом перенос аминокислоты может выполняться при повышенных температурах в тримерной звездообразной структуре. Результаты показаны на фиг. 20.

Олигонуклеотиды У1р006, улр018 и У1р017-Ьеи (^NΑ ТесЬпо1оду АтЬиз, Оептагк, улр017„ дериватизованный, как описано в примере 11), в виде 20 мМ исходных растворов смешивали в буферном растворе, содержащем конечную композицию морфолинопропансульфоновой кислоты (ΜΟРδ, 100 мМ, рН 7,0) и №С1 (1М). Растворы подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). В каждую реакцию добавляли химический активатор ЮМТММ, Р1ика #74104, 100 мМ водный раствор, конечная концентрация 5 мМ) и инкубировали в течение указанного времени при 25°С или 70°С.

Реакционные смеси анализировали денатурирующим электрофорезом в 10% ПААГ и полосы визуализировали окрашиванием красителем δΥΒΚ зеленым (фиксация на геле в 50% ЕЮН в течение 5 мин, промывка на водяной бане 5 мин, затем инкубировали в течение 10 мин в 10000-кратно разбавленном исходном ДМСО-растворе δΥΒΚ зеленого в 1хТВЕ-буфере).

Для реакций, выполняемых при 25°С, недетектируемое количество наблюдали после первых 2 ч (реакции 1-5). В 4-ой реакции (реакции 6) наблюдали небольшое количество. Существенные количества

- 34 024849 наблюдали после ночной инкубации с наивысшей интенсивностью, наблюдаемой в случаях с более высоким количеством добавленного активатора.

Для реакций, выполняемых при 70°С, первые следы продукта наблюдали после 5 мин (реакция 2). Увеличивающиеся количества наблюдали до 240 мин, затем уменьшающиеся количества для ночных реакций.

Желаемый сшитый продукт У1р017-Ьеи и νίρ018 явно образовывался как при 25°С, так и при 70°С, демонстрируя, таким образом, что звездообразные структуры способны опосредовать реакции, выполняемые при повышенных температурах. Скорость реакции явно различается при двух температурах, используемых в данном эксперименте. Однако это можно было ожидать, так как начальная активация содержащей аминогруппу карбоновой кислоты посредством ΌΜΤΜΜ регулируется только межмолекулярными коллизиями, а не управлением посредством ДНК.

Пример 13. Стабильность реакции ацилирования в реакционном центре при различных рН.

В данном примере демонстрируется, каким образом аминокислота может переноситься в тримерную звездообразную структуру в диапазоне рН 5,2-8,0. При низком рН акцепторная аминогруппа может быть частично протонированной, следовательно, с инактивацией ее в качестве сильного нуклеофила. При более высоком рН реакционноспособные промежуточные продукты, продуцируемые активацией содержащей аминогруппу карбоновой кислоты, могут гидролизоваться с деактивацией ее и разрушением химического активатора. И то, и другое может препятствовать образованию желаемой амидной связи. Результаты показаны на фиг. 21.

Олигонуклеотиды νίρ016, νίρ008 и νίρ017-Τ\τ (ΌΝΑ ТесЬпо1оду ЛгЬик, Эептагк, νίρ017, дериватизованный, как описано в примере 11), в виде 20 мМ исходных растворов смешивали в Ν;·ιί'.Ί и подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). Полученную смесь для отжига разбавляли буферными растворами до конечной композиции морфолинопропансульфоновой кислоты (ΜΟΡ8, 100 мМ, рН 5,2, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 или 8,0), Ν;·ιΟ (1Μ) и химического активатора (ΌΜΤΜΜ, Иика #74104, 1,0М водный раствор, конечная концентрация 75 мМ) и инкубировали в течение 1 часа при 50°С. Конечная концентрация ДНК была 0,5 мМ. Реакционные смеси анализировали денатурирующим электрофорезом в ПААГ (10% гель), который инкубировали с красителем 8УВР зеленым (разбавление 10000 в ТВЕ-ЕЮН (96%) 1:1 из исходного ДМСО-раствора) в течение 10 мин.

Все семь дорожек, включающих рН 5,2-8,0, показали сильную полосу для сшитых олиго νίρ016νίρ017-Τ\τ, что свидетельствует о широком рН-окне, в котором можно работать.

Таким образом, протонирование акцепторной аминогруппы или гидролиз реакционноспособных промежуточных продуктов не является существенной проблемой при использовании вышеописанных условий.

Пример 14. Стабильность реакции ацилирования в реакционном центре при различных уровнях органического растворителя.

Для демонстрации стабильности звездообразных структур ДНК перенос одной аминокислоты проводили в смеси Н₂О и органического растворителя, следовательно, в условиях, сходных с условиями, используемыми в органических химических синтезах. Если спаривание оснований и звездообразная структура разрушались в данных условиях, сшитый продукт не мог быть образован.

Растворители диоксан, ацетонитрил и тетрагидрофуран выбирали с учетом смешиваемости с водой и обычной применимости в органических синтезах.

Олигонуклеотиды νίρ016, νίρ008 и νίρ017-Ρ1κ (ΌΝΑ ТесЬпо1оду АгЬик, Эептагк, νίρ017, дериватизованный, как описано в примере 11), в виде 20 мМ исходных растворов смешивали в буфере ΜΟΡ8 (200 мМ, рН 6,5; Иика #69947) и №-1С1 (2 М; Р1ика #71376) и подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 сд, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). Полученную смесь для отжига разбавляли в смеси растворителя и воды до конечной композиции морфолинопропансульфоновой кислоты (ΜΟΡ8, 100 мМ, рН 6,5), №С1 (1М), растворителя (0, 10, 20, 30 или 35 об.%) и химического активатора (ΌΜΤΜΜ, Иика #74104, 1,0М водный раствор, конечная концентрация 75 мМ), которую инкубировали при 50°С в течение 1 ч. Конечная концентрация ДНК была 0,5 мкМ. Реакционные смеси анализировали денатурирующим электрофорезом в ПААГ (10% гель), который окрашивали красителем 8ΥΒΚ зеленым (Μο1еси1а^ РгоЬек, #87563) в соответствии с инструкциями изготовителей. Полученные результаты показаны на фиг. 22.

Для диоксана сшитый продукт образовывался до 20% растворителя. С другой стороны, для всех реакций, содержащих ацетонитрил или тетрагидрофуран, образовывались сходные количества продукта, что свидетельствует о том, что присутствие по меньшей мере до 35% органического растворителя хорошо переносилось, и спаривание оснований ДНК было интактным.

Пример 15. Стабильность реакционного центра при различных уровнях ДМФА.

Для демонстрации стабильности звездообразных структур ДНК перенос одной аминокислоты проводили в смеси Н2О-ДМФА, следовательно, в условиях, сходных с условиями, используемыми в органических химических синтезах. Если спаривание оснований и звездообразная структура разрушались в данных условиях, сшитый продукт не мог быть образован.

- 35 024849

Олигонуклеотиды νίρ016, νίρ008 и у|р017-РНе (ΌΝΑ ТесЬпо1о§у АгЬик, Эептагк, νίρ017, дериватизованный, как описано в примере 11), в виде 20 мМ исходных растворов смешивали в буфере ΜΟΡδ (500 мМ, рН 6,5; Иика #69947) и ΝαΟ (4Μ; Иика #71376) и подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). Полученную смесь для отжига разбавляли в смесях ДМФА и воды до конечной композиции морфолинопропансульфоновой кислоты (ΜΘΡδ, 12,5 мМ, рН 6,5), ΝαΟ (100 мМ), ДМФА (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 70 об. % ДМФА) и химического активатора (ΌΜΤΜΜ, Иика #7 4104, 1,0М водный раствор, конечная концентрация 75 мМ), которую инкубировали в течение ночи при 25°С. Конечная концентрация ДНК составляла 0,5 мкМ. Реакционные смеси анализировали денатурирующим электрофорезом в ПААГ (10% гель), который окрашивали красителем δΥΒΚ зеленым (Μο0ιι1;·π РгоЬек, #δ7563) в соответствии с инструкциями изготовителей. Полученные результаты показаны на фиг. 23.

Полосы продукта, образуемые на первых пяти дорожках, имели сходную интенсивность, указывая, таким образом, на то, что присутствие по меньшей мере до 40% этого органического растворителя, ДМФА, хорошо переносилось, и спаривание основания ДНК было интактным. При 50% ДМФА все еще наблюдали слабую полосу, но от 60% и выше сшитый продукт не детектировался.

Пример 16. Различные активаторы для опосредования химической реакции.

Данный пример служит для иллюстрации, каким образом химические активаторы и вспомогательные нуклеофилы могут быть использованы для опосредования ацилирования акцепторной аминогруппы аминокислотой. Из химии пептидов известно, что добавление вспомогательного нуклеофила может в значительной степени увеличивать скорость ацилирования и/или изменять конечный выход данной реакции. В данном примере реакции осуществляли с использованием вспомогательного нуклеофила, Νгидроксисукцинимида (ΝΗδ, например, Иика #56480), натриевой соли Ν-гидроксисульфосукцинимида (5-ΝΗδ, Иика #56485), или использовали гидрат Ν-гидроксибензотриазола (например, Иика #54804) с ΌΜΤΜΜ (Иика #74104) или БИС (например, Иика #03449) в качестве активаторов.

Олигонуклеотиды νίρ016, νίρ008 и νίρ017-Τ\τ (ΌΝΑ ТесЬпо1о§у АгЬик, Эептагк, νίρ017, дериватизованный, как описано в примере 11), в виде 20 мМ исходных растворов смешивали в буфере ΜΟΡδ (200 мМ, рН 6,5; Иика #69947) и №С1 (2 νίρ()46-ΒδΟίΌΕδ-Ο1\·) и подвергали программе отжига (ПЦРустановка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). Полученную смесь для отжига разбавляли водой и растворами добавок до конечной композиции морфолинопропансульфоновой кислоты (ΜΟΡδ, 100 мМ, рН 6,5), ΝαΟ (1М), вспомогательного нуклеофила (конечная концентрация 25 мМ) и химического активатора (ΌΜΤΜΜ или ЕЭС, 0,5М водный раствор, конечная концентрация 75 мМ). Конечная концентрация ДНК была 0,5 мМ. Реакционные смеси инкубировали в течение 1 ч при 50°С.

Реакционные смеси анализировали денатурирующим электрофорезом в ПААГ (10% гель), который инкубировали с красителем δΥΒΚ зеленым (разбавление 10000 в ΤΒΕ-ΕΐΟΗ (96%) 1:1 из исходного ДМСО-раствора) в течение 10 мин. Результаты показаны на фиг. 24.

Реакции 1-4 с использованием ΌΜΤΜΜ в качестве активатора не обнаружили различий с использованием добавки или без добавки. Наиболее ясно это видно для одного ΕΩΟ так как в этом случае не наблюдали присутствие продукта или наблюдали только слабое присутствие продукта. Однако добавление любого вспомогательного нуклеофила давало опять сравнимое количество сшитого продукта. Это показывает, что вспомогательный нуклеофил является необходимым при использовании ЕЭС в качестве активатора и в ином случае он хорошо переносится в реакционной смеси.

Пример 17. Перенос аминокислоты к другим акцепторам.

Данный пример демонстрирует, каким образом аминокислота может эффективно переноситься к ряду акцепторных аминогрупп, связанных различными путями. νίρ016, несущий С6-ЫН2, служил в качестве контроля, как и прежде. Другими акцепторами были трипептид ΟΡΕ-νίρ016, ПЭГ-связанный трипептид ΟΡΕ-ΡΕΟ-νίρ016, функционализированный аминогруппой ΝΗ₂-ΡΕΟ-νίρ016, функционализированный аминогруппой ΝΗ₂-ί''6-νίρ016 и глицин в Ο-νίρ016 (все приготовленные, как описано в примере XX).

Олигонуклеотиды νίρ016-ΝΗ₂, νίρ008 и νίρ017-Ο1\· (ΌΝΑ ΤесЬηο1ο§у ΑγΗη5, Эептагк, νίρ017, дериватизованный, как описано в примере XX), в виде 20 мМ исходных растворов смешивали в буфере ΜΟΡδ (200 мМ, рН 6,5) и ΝαΟ (2Μ) и подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). Полученную смесь для отжига разбавляли водой и раствором активатора до конечной композиции морфолинопропансульфоновой кислоты (ΜΟΡδ, 100 мМ, рН 6,5), ΝαΟ (1М) и химического активатора (ΌΜΤΜΜ, Иика #7 4104, 1,0М водный раствор, конечная концентрация 75 мМ). Конечная концентрация ДНК была 0,5 мМ. Реакционные смеси инкубировали в течение 1 ч при 50°С.

Реакционные смеси анализировали денатурирующим электрофорезом в ПААГ (10% гель), который инкубировали с красителем δΥΒΚ зеленым (разбавление 10000 в ΤΒΕ-ΕΐΟΗ (96%) 1:1 из исходного ДМСО-раствора) в течение 10 мин. Результаты показаны на фиг. 25.

Все шесть реакций показывают сильную полосу из сшитого продукта. Наблюдали, что дорожки 4 и

- 36 024849 идут несущественно более медленно в сравнении с другими вследствие более крупного пептида (тетрапептида). Таким образом, перенос одного глицина к аминогруппе, связанной через линкер трипептид +/РЕО, сам линкер РЕО, С₆-линкер, или перенос непосредственно глицина дает согласующиеся результаты. Это демонстрирует надежность в реакторе, образованном звездообразными структурами. Увеличение размера акцептора оказывает незначительное действие или не оказывает никакого действия на результат сшивания.

Пример 18. Сборка и последующее связывание двух продуктов Дисплея Структурных ДНК.

Были образованы два продукта Дисплея Структурных ДНК: Ьеи-энкефалин (Туг-О1у-О1у-РЬе-ЬеиΌΝΑ) и перетасованный Ьеи-энкефалин (О1у-Реи-РЬе-Туг-О1у-ОИА). Последний включали в качестве отрицательного контроля для анализа определения с использованием Ьеи-энкефалин-специфического моноклонального антитела 3Е7. Ключевые стадии данного способа иллюстрируются на фиг. 26.

ДНК-олигонуклеотиды получали из ΌΝΑ ТесЬпо1оду (Агйи8, Эептагк) и функционализировали, как описано в примере 11.

Первая стадия включала отжиг следующих олиго, в двух отдельных реакциях, для образования модулей Ьеи-энкефалин-ДНК и перетасованный Ьеи-энкефалин-ДНК. В реакции 1 (К1): О1у-Р1е-РЕОνίρ231, О1у-ВδОСОΕδ-ν^ρ262 и νίρ088 (положения 1, 2 и 3 в 3-направленной звездообразной структуре ДНК, соответственно) и в реакции 2 (К2): О1у-Ту^-РЬе-РΕО-ν^ρ238, ^еи-ВδОСОΕδ-ν^ρ269 и νίρ088 (положение 1, 2 и 3 в трехсторонней звездообразной структуре ДНК, соответственно). Три олиго в данных реакциях будут гибридизоваться друг с другом, образуя таким образом трехстороннее место соединения, где присоединенные аминокислоты расположены в центре структуры. Обратите внимание, что νίρ088 не имеет присоединенной химической функциональной группы. Функция νίρ08 8 состоит просто в гибридизации с двумя другими олиго для образования замкнутого трехстороннего места соединения.

200 пмоль каждого олиго смешивали в 100 мМ морфолинопропансульфоновой кислоты (МОР§, Р1ика #69947) рН 6,5 и 1М №С1 в общем объеме 370 мкл. Отжиг указанного олиго выполняли инкубированием в течение пяти минут при 95°С перед охлаждением до комнатной температуры на протяжении приблизительно 30 минут. Активатор ЭМТ-ММ (Р1ика #74104) растворяли в воде и добавляли до конечной концентрации 75 мМ. Конечный объем реакции составлял 400 мкл. Химическую реакцию инкубировали в течение 1 ч при 50°С. Затем продукт осаждали этанолом добавлением 2,5 объемов этанола и 1 мкл ОепЕ1н1е (81дта 56575) к каждой реакции и центрифугированием пробирок в течение 30 минут при 20000хд при 4°С. Осадки промывали 70% этанолом перед сушкой на воздухе и ресуспендированием в воде.

Затем пробы подвергали препаративному ненативному электрофорезу в полиакриламидном геле (РАОЕ); в геле 10% ТВЕ-мочевина в соответствии с инструкциями изготовителей. Полосу, соответствующую сшитому продукту, вырезали и продукт экстрагировали по способу измельчения и замачивания (ЗатЬгоок, I., РгФск Е.Р. апб Матабк, Т. (1989) ш Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 8есопб ЕбШоп, Со1б δρηπβ НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со1б δρηπβ НагЬог, №ν Уогк); кусочек геля измельчали и замачивали в течение ночи в 400 мкл ТВЕ-буфера. Пробы осаждали этанолом, как описано выше. Осадки растворяли в 1хлигазном буфере (№ν Епд1апб Вю1аЬ8), 50 мМ №С1. Затем 5'-концы фосфорилировали полинуклеотидкиназой: 50 единиц полинуклеотидкиназы (ИЕВ М0201) включали в общий реакционный объем 200 мкл. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37°С.

Затем два сшитых олиго превращали в непрерывную цепь ДНК ДНК-лигазой, которая образовывала фосфодиэфирную связь между расположенными рядом 3'-концом νίρ231 и 5'-концом νίρ262 для К1 и расположенными рядом 3'-концом νίρ238 и 5'-концом νίρ269 для К2. ДНК-лигазу Т4 (ИЕВ М0202Ь) добавляли в 1х лигазный буфер, 50 мМ ИаС1 и добавляли 5 единиц/мкл фермента с получением конечного реакционного объема 300 мкл. Полученную смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 16°С.

Затем удаляли отщепляемый линкер ВδОСОΕδ. Содержащий 3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновую кислоту буфер (СΑРδ, Р1ика #29338) (рН 11,8) и 2-меркаптоэтанол (Р1ика #63689) добавляли с получением конечных концентраций 100 и 60 мМ, соответственно, в конечном реакционном объеме 600 мкл. Реакционные смеси инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Затем данные реакции нейтрализовали добавлением 200 мкл 1М МОРδ-буфера, рН 6,5. Затем ДНК осаждали этанолом в соответствии со стандартной процедурой. После сушки осадков на воздухе эта ДНК была готова для следующей стадии, которая представляет собой введение функционализированных олигонуклеотидов на положение 3. Следует обратить внимание, что посредством удаления линкера ВδОСОΕδ образуются две первичных аминогруппы: одна находится в конце растущей пептидной цепи на первоначальном положении 1 олигонуклеотида, и другая находится на первоначальном положении 2 олигонуклеотида. Так называемую стратегию нестрогого соответствия (или неоднозначного спаривания) (стратегию качелей) использовали для облегчения последующей реакции между растущей пептидной цепью и входящей аминокислотой на положении 3 в следующей стадии: олигонуклеотиды в положении 2 содержат слева от модифицированного основания участок оснований (оснований нестрогого соответствия), которые являются неспаренными во время первого химического переноса, однако во втором процессе переноса они являются основаниями,

- 37 024849 спаренными с олиго положения 3. Таким образом, первичная аминогруппа на первоначальном олигонуклеотиде положении 2 теперь отделена от центра структуры участком двухцепочечной ДНК (б5^NА), что будет снижать ее реакционоспособность в отношении групп в центре звездообразной структуры вследствие того, что двухцепочечная ДНК является жесткой.

Продукт К1 отжигали с Ту^-В8ОСОЕ8-ν^ρ263 и продукт К2 отжигали с О1у-В8ОСОЕ8-ν^ρ270 в следующих условиях: 200 пмоль олиго, в 100 мМ МОР8, рН 6,5, 1М №-1С1 в общем объеме 240 мкл.

Полученную смесь инкубировали 5 мин при 95°С перед охлаждением до комнатной температуры в течение приблизительно 30 мин. Затем добавляли активатор ЭМТ-ММ (Р1ика #74104) до конечной концентрации 75 мМ для промотирования химической реакции между аминокислотами. Химическую реакцию инкубировали в течение 1 ч при 50°С. Пробы осаждали этанолом и затем подвергали препаративному ненативному электрофорезу в ПААГ (как описано выше), где полосу, соответствующую сшитому продукту, вырезали из геля. Затем каждый сшитый продукт превращали в непрерывные цепи ДНК ДНКлигазой, которая образовывала фосфодиэфирную связь между расположенными рядом 3'-концом первоначального νίρ232 и 5'-концом νίρ2 63 для К1 и расположенными рядом 3'-концом первоначального νίρ269 и 5'-концом νίρ270 для К2, соответственно.

Кроме того, в той же самой реакции ДНК-лигазы вводили концевые сайты ПЦР-праймирования. ДНК-олиго, имеющие сайты ПЦР-праймирования νίρ029/νίρ070 и νίρ029/νίρ03 для К1 и К2, соответственно, подвергали предварительному отжигу в следующих условиях: 200 пмоль каждого олиго в 1хлигазном буфере и 50 мМ №С1 в общем объеме 40 мл, и инкубировали в ПЦР-установке в течение 5 мин при 95°С и в течение 30-секундных стадий при следующих температурах: 80°С, 65°С, 50°С, 45°С, 30°С, 20°С.

Когда νίρ070 отожжен с νίρ029, четыре наиболее 5'-концевых (левых) нуклеотидов νίρ070 являются отступающими. Такие четыре нуклеотида являются обратно комплементарными четырем наиболее 5'концевым (левым) нуклеотидам в νίρ231, которые являются также отступающими при отжиге νίρ231 с νίρ2 63. Таким образом, отступающие концы могут отжигаться и образовывать субстрат для ДНКлигазы. Подобным образом, когда νίρ0300 отожжен с νίρ029, четыре наиболее 5'-концевых (левы) нуклеотидов νίρ070 являются отступающими. Четыре нуклехотида являются обратно комплементарными четырем наиболее 5'-концевым (левым) нуклеотидам в νίρ238, которые являются также отступающими при отжиге νίρ238 с νίρ270. Сшитые, очищенные в геле продукты ресуспендировали в 1хлигазном буфере, 50 мМ №С1 и смешивали с предварительно отожженными ПЦР-сайтами ДНК-олиго: νίρ029/070 и νίρ029/νίρ3030 для К1 и К2, соответственно. 5' -концы ДНК сначала фосфорилировали 50 единицами полинуклеотидкиназы (NЕВ 02101Ь) в конечном объеме 200 мкл. Реакции давали возможность инкубироваться в течение 30 мин при 37°С.

Затем ДНК превращали ДНК-лигазой Т4 в непрерывную цепь ДНК, состоящую из νίρ029-νίρ231νίρ262-νίρ263-νίρ070 и νίρ029-νίρ238-νίρ269-νίρ270-νίρ030 в К1 и К2, соответственно. 1500 единиц ДНКлигазы Т4 (NЕВ 0201Ь) в 1хлигазном буфере, 50 мМ №С1 добавляли к реакциям с получением конечного реакционного объема 300 мкл. Реакции лигирования инкубировали при 16°С в течение ночи. Затем линкер В8ОСОЕ8 удаляли, как описано выше. Пробы осаждали этанолом и затем подвергали препаративному ненативному электрофорезу в ПААГ, снова осаждали этанолом и растворяли в 20 мкл воды, как описано выше. Собранные продукты были теперь готовы для праймерного удлинения.

На протяжении вышеописанной процедуры небольшие пробы брали для анализа при помощи ненативного электрофореза в ПААГ, как описано выше. Картина геля показана на фиг. 27. Дорожки 1 и 2 показывают успешно образованные сшитые функционализированные олиго νίρ231 (35 нт)/ν^ρ262 (68 нт) и сшитые νίρ238 (35 нт)/ν^ρ269 (68 нт) для К1 и К2, соответственно. Сшитые продукты мигрируют со средним (кажущимся) размером приблизительно 200 п.н. Наблюдаемое различие между истинным размером и средним (кажущимся) размером не было неожиданным вследствие сильных вторичных структур в образованных продуктах, которые присутствуют даже в ненативном геле вследствие обратно комплементарных последовательностей. Кроме того, наблюдали полосы меньшего размера, которые, наиболее вероятно, происходят из деградации полноразмерных молекулярных частиц.

Дорожки 3 и 4 показывают продукты как после лигирования двух олиго, так и после удаления линкера В8ОСОЕ8 для К1 и К2, соответственно. Основные продукты мигрируют со средним (кажущимся) размером 150 п.н. Кроме того, наблюдали полосы меньшего размера, которые, наиболее вероятно, генерированы деградацией молекулярных частиц. Следует обратить внимание, что молекулярные частицы как на дорожке 1, так и на дорожке 3 (и на дорожке 2 и дорожке 4) являются почти равными по размеру, но мигрируют значимо различным образом в данном геле. Это не являются неожиданным, так как молекулярные частицы на дорожках 1 и 2 являются в основном разветвленными молекулами ДНК, тогда как молекулярные частицы на дорожках 3 и 4 являются линейными молекулами ДНК.

Дорожки 5 и 6 показывают продукт после сшивания положения 3 олигонуклеотидов для К₁ и К₂, соответственно. В обеих реакциях положение 3 олиго равно 74 нт. Таким образом, ожидаемые продукты равны 177 нт. Однако средний размер в геле сшитых молекулярных частиц равен приблизительно 600 п.н. Это не является неожиданным, так как молекулярные частицы состоят из сшитых линейных молекул

- 38 024849

ДНК с очень сильными вторичными структурами вследствие обратно комплементарных последовательностей в плечах звездообразной структуры ДНК. Даже электрофорез в содержащем мочевину полиакриламидном геле не способен денатурировать данную структуру.

Дорожки 7 и 8 содержат продукты как после лигирования олиго положения 3 и содержащих сайты ПЦР-праймирования олиго, так и после удаления линкера ВЗОСОЕЗ для К1 и К2, соответственно. Содержащие сайты ПЦР-праймирования олиго добавляют в целом 64 нт, следовательно, желаемые продукты имеют 241 нт. Наблюдали две сильно выраженные полосы среднего размера, превышающего 1000 п.н. Верхняя полоса, наиболее вероятно, содержит полноразмерные продукты, тогда как нижняя полоса, наиболее вероятно, содержит молекулы, лишенные одного из двух содержащих сайты ПЦРпраймирования олигонуклеотидов. Кроме того, на дорожке 8 наблюдали полосу, мигрирующую со средним размером 600 п.н. Данная полоса, наиболее вероятно, представляет молекулярную частицу без лигированных содержащих сайты ПЦР-праймирования олиго (сравните дорожки 8 и 6). Дорожка 9 содержит лэддер (лестницу молекулярных масс) ДНК 100 п.н. (Реттейаз, ЗМ0248).

Праймерное удлинение.

Продукты с упорядоченной структурой подвергали праймерному удлинению, которое превращает ДНК, уложенную в звездообразную структуру с химическим продуктом в центре в линейные двухцепочечные молекулы с химическим продуктом, выставленным (демонстрируемым) на данной поверхности. Реакцию праймировали νίρ038, который обратно комплементарен 3' собранных молекул. Данные реакции проводили в 1xТЬе^тоρо1-буфере, 0,2 мМ бЫТР, 8 мМ М§ЗО₄, 1М бетаине (Зфта, В-0300), 0,4 мкМ νίρ038, 0,2 Е/10 мкл Vеηΐ (ехо-) (ЫЕВ М0259Ь) и 5 мкл собранной молекулы в качестве матрицы в 10 мкл реакционной смеси для реакции праймерного удлинения. Реакционную смесь инкубировали при 95°С в течение 2 мин, 60°С в течение 30 с и при 74°С в течение 5 мин.

Анализ связывания.

ДНК, демонстрирующую синтезированные пептиды, анализировали в анализе смещения электрофоретической подвижности (ЕМЗА). Демонстрация связывания будет подтверждать возможность корректного синтеза соединения из модулей-носителей, направляемого Структурной ДНК.

Данный анализ заимствован из литературы (Нафт апб НагЪигу, Р1оз Вю1, 2, Е174, 2004). 10 мкл продукта праймерного удлинения К1 (Ьеи-энкефалин-ДНК) или К2 (перетасованный Ьеи-энкефалинДНК) помещали в 4 пробирки в каждом случае. В пробирки К1-1 и К2-1 добавляли 1 мкл 0,5 мг/мл моноклонального анти-Ьеи-энкефалин-антитела 3Е7 (СЬетюоп, са!# МАВ5276), 1 мкл 1М Трис-НС1 рН 7,2 и 1 мкл 0,1% Тритон-Х/РВЗ. В пробирки К1-2 и К2-2 добавляли 1 мкл 0,5 мг/мл моноклонального антитела \У6/32 (Зфта, Н1650), 1 мкл 1М Трис-НС1 рН 7,2 и 1 мкл 0,1% Тритон-Х/РВЗ. В пробирки К1-3 и К2-3 добавляли 1 мкл 0,5 мг/мл моноклонального анти-Ееи-энкефалин-антитела ЗЕ7, 1 мкл 20 мкМ Ьеиэнкефалина (Тут-О1у-О1у-РЬе-Ьеи) (ЗсйаГег-Ы, Оептагк) и 1 мкл 1М Трис-НС1 рН 7,2. В пробирки К1-4 и К2-4 добавляли 1 мкл 0,5 мг/мл моноклонального анти-Ьеи-энкефалин-антитела 3Е7, 1 мкл 20 мкМ перетасованного Ьеи-энкефалина (О1у-Ьеи-РЬе-Тут-О1у) (ЗсЬаГет-Ν, Оептагк) и 1 мкл 1М Трис-НС1 рН 7,2. Все пробы инкубировали с перемешиванием в течение одного часа при комнатной температуре. В каждую пробу добавляли 1,4 мкл 10х красителя для нанесения Дпуйтодеп, Са!# 10816-015) и все количество наносили на гель. Наносили также 1 мкл лэддеров 100 п.н. и 1 т.п.н. (Реттейаз #ЗМ0248 и #ЗМ0318). Электрофорез в 10% ПААГ-ТВЕ-геле Опуйгоцеп) проводили на холоду при 220 мВ и 15 мА в течение 45 минут. Г ель проявляли в течение 20 минут в красителе для нуклеиновых кислот ЗУВК Огееп™ (Мо1еси1аг РгоЪез) в соответствии с инструкциями изготовителей. Картина геля показана на фиг. 28. Результаты: на всех дорожках наблюдали две сильно выраженные полосы, имеющие средние размеры 200-250 п.н. Данные полосы наиболее вероятно содержат молекулярные частицы двухцепочечной ДНК (дополнительное доказательство может быть найдено, например, в примере 21). Верхняя полоса соответствует хорошо предполагаемому полноразмерному продукту 241 п.н., тогда как нижняя полоса наиболее вероятно содержит молекулярные частицы, лишенные νίρ029, который будет давать меньший продукт 30 п.н. Две сильно выраженные полосы со средними размерами около 1000 п.н. наблюдали на всех дорожках. Наиболее вероятно, данные полосы содержат молекулярные частицы, имеющие уложенную в звездообразную структуру ДНК: верхняя полоса, наиболее вероятно, содержит полноразмерные продукты, тогда как нижняя полоса, наиболее вероятно, содержит молекулы, лишенные одного из двух содержащих ПЦРсайты олигонуклеотидов.

На дорожке 1, содержащей К.1-1, наблюдали полосу среднего размера около 1500 п.н. Полоса, наиболее вероятно, содержит продукт связывания Ьеи-энкефалин-ДНК с антителом 3Е7, который замедляет электрофоретическую миграцию целого комплекса. Полоса отсутствует, когда продукт К1 инкубируют с антителом отрицательного контроля с совпадающим изотипом фО2А, как показано на дорожке 2 (К1-2). Специфичность данного взаимодействия дополнительно доказывается конкуренцией связывания свободным растворимым Ьеи-энкефалином: на дорожке 3 смещенная в геле полоса отсутствует при совместной инкубации продукта К1, 3Е7 и свободного пептида Ьеи-энкефалина. Конкуренция не видна на дорожке 4, содержащей К1-4, когда присутствует свободный растворимый перетасованный Ьеи-энкефалин. Дорожки 5-8, содержащие К2-1, К2-2, К2-3 и К2-4, соответственно показывают, что продукт К2 отрица- 39 024849 тельного контроля (перетасованный Ьеи-энкефалин-ДНК) не связывается с 3Е7, как и ожидалось.

Амплификация.

Для демонстрации того, что ДНК смещенной в геле полосы и других полос является интактной, кусочки геля вырезали и ДНК экстрагировали для использования в качестве матриц для ПЦР.

Кусочки геля, изображенные в блоках на фиг. 29, вырезали и продукт экстрагировали по способу измельчения и замачивания (ЬатЪгоок, I., Ргйксй, Е.Р. апб Машайк, Т. (1989) ίη Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЪогаЮгу Мапиа1, δесоηб ЕбШоп, Со1б δριϊη§ НагЬог ЬаЪогаЮгу Ргекк, Со1б δριϊη§ НагЬог, Νον Υογ1<); кусок геля измельчали и замачивали в течение ночи в 400 мкл ТЕ-буфера. Пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 20000хд и супернатант переносили в новые пробирки. Затем выполняли ПЦР [1х буфер для полимеразы, 0,2 мМ 6ΝΤΡ, 6 мМ Μ§δΟ₄, 0,2 мкМ νίρ028, 0,5М бетаин Ыдта, В-0300), 0,1 мг/мл ΒδΑ, 0,08 единиц/мкл Vеηΐ(еxо-) (ΝΕΒ М0259Ь)] с использованием 5 мкл супернатанта, разбавленного в 200 раз, в 20 мкл объема реакции. Выполняли 20 циклов по 30 с при 95°С, 30 секунд при 60°С и 30 с при 74°С в термоциклере и 2 мкл пробы анализировали электрофорезом на нативном 10% ПААГ (йц'Цгодеп) и окрашивали δΥΒΚ зеленым (Мо1еси1аг РгоЪек) в соответствии с инструкциями изготовителей и получали фотоснимок электрофореза. Полученный результат показан на фиг. 29. Дорожка М содержит 100 п.н. ДНК-лэддер (Регтейак, δΜ02468). Дорожки 1-5 содержат реакции, имеющие очищенные в геле матрицы: на всех дорожках наблюдается хорошо выраженная полоса около 250 п.н., соответствующая ожидаемому размеру полноразмерного продукта. В отличие от этого, на дорожке 6, которая содержит отрицательный контроль без добавленной матрицы, указанная полоса отсутствует. Таким образом, посредством этого показано, что продукт дисплея структурной ДНК может быть образован, отделен и амплифицирован.

В заключение следует отметить, что специфическое связывание продукта К1 с анти-Ьеи-энкефалинантителом 3Е7 убедительно демонстрирует, что пептид Ьеи-энкефалина был правильно собран посредством данного способа. Кроме того, показано, что отделение продукта, демонстрирующего лиганд, от продукта, не демонстрирующего лиганд, является действительно выполнимым. Например, это проиллюстрировано просто выделением смещенной в геле полосы. Кроме того, отделенный продукт может быть амплифицирован для последующей идентификации, например, секвенированием ДНК, или использован в качестве матрицы в процессе трансляции, что позволяет выполнять циклы отбора и амплификации.

Пример 19. Направление восстановительного аминирования звездообразной структурой ДНК.

Данный пример служит для иллюстрации, что структурная ДНК может направлять восстановительное аминирование.

Восстановительное аминирование выбрано в качестве примера важной и широко применимой хемоселективной реакции.

Олигонуклеотиды получали из ΌΝΑ ТесЬпо1оду (ΑΛ^, Эептагк). Олигонуклеотид νίρ046 ацетилировали ΌδΤ (дисукцинимидилтартратом, Р1егсе #20589) в первичной аминогруппе на внутреннем модифицированном бТ в олигонуклеотиде, с последующим окислительным расщеплением с использованием Ν;6Ο.·| (ΑΠΛΗ #31,144-8) с получением функционализированного глиоксилатом олиго. Олигонуклеотид (2,5 нмоль) обрабатывали ΌδΤ (10 мМ) в смеси 40% ДМФА/вода, содержащей 400 мМ натрийфосфатный буфер, рН 8,8. Общий объем реакции составлял 100 мкл. Реакции инкубировали 2 часа при 25°С. Затем добавляли ΝΠΟ₄ (50 мкл 150 мМ раствора) и инкубировали в течение дополнительных 2 часов при 25°С. Реакционную смесь разбавляли до 200 мкл и очищали на центрифугируемой колонке ^те^кат Вюкаепсек #27-5325-01) в соответствии с протоколом изготовителей с последующей очисткой ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом в соответствии с примером 11. Выход: 36%.

ДНК Рассчитанная масса Найденная масса νίρΟ46-ЦНСОСНО 6653,202 6656,1

Синтез функционализированного бензальдегидом олиго, имеющего внутренний модифицированный бТ (амино-С₆-бТ) (положение п=1) (νίρ046-ΝΗ^^Η^ΗΟ).

Олигонуклеотид νίρ046 ацилировали 4-карбоксибензальдегидом (Ьапсайег #8192), промотируемым ОМТ-ММ (4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолинийхлоридом, Р1ика #74104) обработкой олигонуклеотида (2,5 нмоль), растворенного в смеси 40% ДМФА/вода, содержащей 150 мМ №С1, 200 мМ натрий-фосфатный буфер рН 8,8, 50 мМ ОМТ-ММ. Общий объем реакции составлял 100 мкл. Реакцию инкубировали 4 ч при 25°С. Реакционную смесь очищали на центрифугируемой колонке ^^^ккат Вюкаепсек #27-5325-01) в соответствии с протоколом изготовителей с последующей очисткой при помощи ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа в соответствии с примером 11. Выход: 53%.

ДНК Рассчитанная масса Найденная масса νίρ04б-ЦНСОСбЩСНО 6729,233 6729,9

Восстановительное аминирование, направляемое структурной ДНК.

В реакциях 1 и 5 два производных νίρ046, несущих амид глиоксиловой кислоты и 4-формилбензойную кислоту, соответственно, смешивали с эквимолярными количествами (10 пмоль, каждый) νίρ017 и νίρ008 в буферном растворе, содержащем конечную композицию морфолинопропансульфоновой кисло- 40 024849 ты (Иика #69947; М0Р8, 100 мМ, рН 5,2) и ЫаС1 (Иика #71376, 1М). Растворы подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). К смеси для отжига добавляли восстановитель (ЫаСЫВН₃; §1§та #156159, 1М водный раствор, конечная концентрация 100 мМ; общий объем 20 мкл) и инкубировали в течение 2 ч при 30°С.

Контроли обрабатывали параллельно для обоих альдегидов: νίρ017 вместо νίρ007, который не несет аминогруппы (реакции 2+6).

νίρ008 исключали для испытания эффективности димера в сравнении с тримепром (реакции 3+7). νίρ046-0Η0 пытались сшить с νίρ019, проводя, таким образом, реакцию между олигонуклеотидами, которые не могут спаривать основания (реакции 4 + 8).

Все восемь реакционных смесей разбавляли до 50 мкл и осаждали ΕΐΟΗ (добавляли СепЕ1и1е 0,5 мкл; δίβΐηη 56575) и 96% ΕΐΟΗ (ВюсНеппка дгайе; 250 мкл), инкубировали 15 мин на льду, затем центрифугировали при 14000 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Супернатант декантировали, пробирки центрифугировали в течение короткого периода времени, оставшуюся жидкость удаляли пипеткой и осадку давали высохнуть в токе воздуха).

Неочищенную ДНК растворяли в воде и анализировали электрофорезом в денатурирующем 10% ПААГ (ЧпуПгодеп) и затем окрашивали красителем 8УВК зеленым (Мо1еси1аг Ρ^оЬеδ) в соответствии с инструкциями изготовителей. Фотоснимок геля показан на фиг. 30. Образование новой полосы с подвижностью, соответствующей 60-70 нт, подтверждает сшивание νίρ046 (21 нт) и νίρ017 (42 нт) (дорожки 5 и 9). Сшивания не наблюдали в контрольных экспериментах с νίρ007, который идентичен νίρ017, за исключением того, что он не имеет аминогруппы на внутреннем άΤ), что свидетельствует о селективной реакции (дорожки 6 и 10) . Тот же самый продукт образовывался в димере, но наблюдали слегка менее интенсивные полосы (дорожки 7+11). Продукт не наблюдали для олигонуклеотидов, которые не могут спаривать основания, указывая на то, что для образования продукта требуются соответствующие (спариваемые) основания (дорожки 8+12).

Таким образом, структурная ДНК способна направлять восстановительное аминирование высокоспецифическим образом.

Пример 20. Направление структурной ДНК образования мочевины.

Данный пример служит для иллюстрации, что структурная ДНК может направлять образование мочевины. Образование мочевины между двумя аминами было выбрано в качестве примера важной, широко применимой реакции. Мочевины являются известными изостерами в медицинской химии.

Олигонуклеотиды получали из ΌΝΑ ΤесЬηо1о§у Αιΐκΐδ, Иептатк.

Собирали звездообразную структуру ДНК, состоящую из трехстороннего места соединения ДНК, содержащую два амино-функционализированных олиго и один вспомогательный олиго. Олигонуклеотиды νίρ046, νίρ017 и νίρ008 смешивали в эквимолярных количествах в буферном растворе, содержащем конечную композицию морфолинопропансульфоновой кислоты (Иика #69947; М0Р8, 100 мМ, рН 8,0) и ЫаС1 (Иика #71376, 1М). Растворы подвергали программе отжига (ПЦР-установка: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С в течение 30 с). Смесью для отжига были образующие мочевину реагенты (Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат, Α1ά^^сН #225827 (0,45М в ДМФА) или бис(4-нитрофенил)карбонат, ΑίάτίΛ #16191 (1,0М в ДМФА)) до конечной концентрации 10, 50 или 100 мМ (общий реакционный объем 20 мкл) и полученную смесь инкубировали в течение 90 мин при 37°С.

Отбирали аликвоту каждой реакционной смеси и анализировали денатурирующим электрофорезом в 10% ПААГ (ЧпуПгодеп). Полосы визуализировали красителем 8УВК зеленым ((Мо1еси1аг Ρ^оЬеδ) в соответствии с инструкциями изготовителей.

Фотоснимок геля электрофореза в ПААГ показан на фиг. 31. Образование новой полосы с подвижностью, соответствующей 60-70 нт, подтверждает ожидаемое сшивание νίρ046 (21 нт) и νίρ017 (42 нт) на дорожках 5-10. Интересно, что уменьшающееся количество продукта образовывалось с увеличивающимися количествами связывающего реагента. Однако это наблюдение может быть объяснено реакциями молекул реагентов с обеими аминогруппами, что превращает обе аминогруппы в нуклеофилы. Таким образом, более низкая концентрация реагирующего вещества может сделать возможным образование только одной из аминогрупп промежуточного карбамата, который быстро реагирует с другой аминогруппой с образованием ожидаемой мочевины.

Таким образом, структурная звездообразная ДНК способна направлять образование мочевины.

Пример 21. Электроподвижность звездообразной структуры ДНК.

Данный пример демонстрирует электроподвижность структурной ДНК в нативных полиакриламидных гелях.

Структурная ДНК имеет особую, иную конформацию, чем двухцепочечная ДНК. Последняя является линейной удлиненной молекулой, тогда как структурная ДНК имеет более глобулярную структуру. Таким образом, ожидаются различные картины миграции двух конформаций в гелях: структурная ДНК имеет средний размер, намного превышающий средний размер двухцепочечной линейной ДНК-копии. Для демонстрации этого феномена проводили следующий эксперимент.

- 41 024849

Тримерную звездообразную структуру ДНК с концевыми сайтами ПЦР-праймирования образовывали лигированием пяти олиго νίρ029, νίρ161, νίρ192, νίρ193 и νίρ207. Схематическое изображение указанной организации показано на фиг. 32.

ДНК-олиго (получаемые ЭИА ТесЬпо1оду АгЬи5, Эептагк) смешивали в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1х лигазном буфере (№ν Епд1апб Вю1аЬ5), 50 мМ ИаС1. Полученные смеси инкубировали следующим образом: 94°С в течение 5 мин, 80°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с, 35°С в течение 30 с, 20°С в течение 30 с, 10°С до следующей стадии. Процедуру отжига выполняли на ПЦР-установке Λρρ1^е6 Вю5у5!ет5 АВ2720. 5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНКполинуклеотидкиназой Т4. Готовили смесь, состоящую из 1,5 мкМ звездообразной структуры, 1х ДНКлигазного буфера (№ν Епд1апб Вю1аЬ5), 50 мМ ИаС1 и 0,17 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т4 (№ν Епд1апб Вю1аЬ5, са!# М0201) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т4 (Иете Епд1апб Вю1аЬ5, са!# М0202) в 1х ДНК-лигазном буфере (№ν Епд1ап6 Вю1аЬ5), содержащем 50 мМ ИаС1 и 200 Е ДНК-лигазы Т4 (№ν Епд1ап6 Вю1аЬ5, са!# М0202), в объеме 10 мкл и инкубировали в течение ночи при 16°С.

ПЦР-амплификация.

0,04 мкл реакционной смеси для лигирования использовали в качестве матрицы в 400 мкл смеси для ПЦР-реакции [1хТЬегтоРо1-буфер (№ν Епд1ап6 Вю1аЬ5 В90048), 0,2 мМ 6ИТР (№ν Епд1ап6 Вю1аЬ5 04478), 8 мМ Мд80₄, 0,2 мкМ νίρ202 и νίρ224, 0,5М бетаин (81дта В0300), 1 Е/100 мкл Уеп! (ехо-) (№ν Епд1ап6 Вю1аЬ5 М0257Ь)]. ПЦР-амплификацию выполняли в аликвотах 50 мкл с использованием следующих условий проведения циклов: 30 с при 92°С и 25 циклов 92°С/15 с, 50°С/15 с, 70°С/30 с.

Пробу осаждали этанолом добавлением 1 мл этанола и 1/10 3М ацетата натрия (рН 5,2), инкубировали 30 мин на льду и центрифугировали 30 мин при 20000д, супернатант выбрасывали и осадок ресуспендировали в 1х буфере для нанесения проб (Iην^!^οдеη), подвергали препаративному нативному электрофорезу в 10% ПААГ (Iην^!^οдеη) и окрашивали красителем 8ΥΒΚ зеленым (Мо1еси1аг РгоЬе5) в соответствии с инструкциями изготовителей. Фотоснимок геля показан на фиг. 32. Дорожка М содержит 100 п.н. ДНК-лэддер (Регтеп!а5, 8М0248). Были выделены две полосы: полоса около 250 п.н. (А) и полоса со средним размером, превышающим 1000 п.н. Кусочки геля, показанные в блоках на фиг. 32, вырезали и продукт экстрагировали по способу измельчения и замачивания (8атЬгоок, ί., РгЙ5сЬ, Е.Р. апб Маша!15, Т. (1989) ш Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Ебйюп, Со16 8ρππ§ НагЬог ЬаЬога!огу Рге55, Со16 8ρππ§ НагЬог, Νον Уогк); кусок геля измельчали и замачивали в течение ночи в 400 мкл ТЕ-буфера. Пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 20000хд, супернатант переносили в новую пробирку, осаждали этанолом, как описано выше, и ресуспендировали в 100 мкл воды.

Праймерное удлинение.

Затем выполняли праймерные удлинения с использованием выделенной ДНК в качестве матриц. 2 мкл матрицы использовали в 20 мкл реакции, содержащей [1хТЬегтоРо1-буфер (Νον Епд1апб Вю1аЬ5 В90048), 0,2 мМ 6ИТР Υ» Епд1апб Вю1аЬ5 04478), 8 мМ Мд80₄, 0,5М бетаин (81дта В0300), 1 Е/100 мкл Уеп! (ехо-) (Νον Епд1апб Вю1аЬ5 М0257Ь)]. В реакции 1 и 5 не включали праймер, в реакции 2 и б включали 0,2 мкМ νίρ202, в реакции 3 и 7 включали 0,2 мкМ νίρ224 и в реакции 4 и 8 включали 0,2 мкМ νίρ202 и νίρ224. Праймерные удлинения выполняли инкубированием проб при 95°С в течение одной минуты, при 50°С в течение 15 с и при 70°С в течение 30 с. 10 мкл реакционных смесей анализировали электрофорезом в 10% ПААГ, как описано выше.

Обсуждение и вывод.

Во-первых, ПЦР выполняли с использованием тримерной звездообразной структуры ДНК с концевыми сайтами ПЦР-праймирования в качестве матрицы. Во-вторых, пробу подвергали препаративному электрофорезу в ПААГ, где выделяли две полосы: полосу (А) со средним размером около 250 п.н. (ожидаемый размер двухцепочечного продукта ПЦР равен 241 п.н.) и полосу (В) со средним размером, превышающим 1000 п.н. Наконец, выделенную ДНК использовали в качестве матриц в реакциях праймерного удлинения и анализировали при помощи электрофореза в ПААГ. Как показано на фиг. 32, обе матрицы вызывают появление двухцепочечного продукта с размером около 250 п.н. как с прямым (дорожки 2 и 6), так и с обратным праймером (дорожки 3 и 7) . Кроме того, в присутствии обоих праймеров образуется больше продукта (дорожки 4 и 8) . Это является иллюстрацией того, что как полоса А, так и полоса В содержат предполагаемый продукт 241 п.н., и различие в подвижности в геле обусловлено, следовательно, укладкой: предположительно, А является двухцепочечным линейным продуктом, тогда как В является уложенной в звездообразную структуру ДНК.

Представляет интерес, что в отсутствие каких-либо праймеров в реакции праймерного удлинения наблюдается только ограниченная двухцепочечная полоса около 250 п.н., даже в том случае, когда исходным материалом была двухцепочечная ДНК, как показано на дорожке 1. Это обусловлено тем, что проба была подвергнута циклу термической денатурации и ренатурации двухцепочечной ДНК, который будет приводить к образованию смешанного продукта двухцепочечной ДНК и уложенной в виде звездообразной структуры ДНК. Тот же самый феномен наблюдается на дорожке 5, где исходным материалом

- 42 024849 является полоса В.

Таким образом, посредством этого показано, что молекула ДНК с длиной 241 нт может быть уложена в конформацию (звездообразную структуру), которая приводит к среднему размеру в нативном геле, превышающему 1000 п.н.

Пример 22. Трансляция звездообразных структур ДНК.

Данный пример демонстрирует принцип процесса трансляции Звездообразных Структур ДНК. В данном контексте, процесс трансляции является процессом, в котором отдельные модули в различных положениях заменяют новыми модулями и процесс замены направляется узнаванием кодон/антикодон. Новые модули могут иметь химическое реагирующее вещество, присоединенное таким образом, что оно будет расположено в центре или вблизи центра после правильной укладки новой звездообразной структуры ДНК, частью которой будут новые модули. Таким образом, трансляция допускает синтез химического соединения, кодируемого звездообразной структурой ДНК.

Исходным материалом для процесса трансляции может быть продукт ПЦР, полученный с использованием результата процесса отбора, в качестве матрицы, например, как показано в примере 18. Это допускает повторяющиеся циклы отбора и амплификации, которые, в свою очередь, допустят получение другой библиотеки для перехода к решениям в отношении применяемого давления отбора.

Схема процесса трансляции.

Схематическое изображение основных стадий процесса трансляции с использованием продукта ПЦР в качестве исходного материала представлено на фиг. 33.

Сначала звездообразную структуру ДНК амплифицировали при помощи ПЦР с использованием биотинилированного обратного праймера, который допускает разделение двух цепей. Это разделение выполняли с использованием магнитных покрытых стрептавидином гранул. Представляющую интерес цепь (верхнюю цепь) элюировали из гранул и укладывали в звездообразную структуру ДНК, имеющую две структуры стебель-петля и стебель. Затем стебель положения 1 (без петли) расщепляли ферментом рестрикции Вка1, которая расщепляет снаружи от его последовательности узнавания, и образовывали 5'выступ. Выступ представлял собой кодон для положения 1.

Затем со звездообразной структурой лигировали новый модуль-носитель для положения 1, имеющий подходящую 5'-последовательность антикодона. Для промотирования лигирования и очистки, справа включали биотинилированный вспомогательный (хелперный) олиго. Хелперный олиго гибридизуется с новым модулем-носителем положения 1 таким образом, что он создает 5'-выступ, который являлся антикодоном. Таким образом, последующее лигирование (хелперный олиго/звездообразная структура/модуль 1 будет направляться узнаванием кодон/антикодон.

Затем первоначальный модуль на положении 1 высвобождали из звездообразной структуры проведением сначала стадии денатурации, в которой новый модуль-носитель заменял первоначальный модуль положения 1 в звездообразной структуре, и затем выполняли расщепление ферментом рестрикции в последовательности, которая была первоначально расположена в дистальной петле во втором стебле. Посредством этого действия удалялась ковалентная связь между первоначальным модулем положения 1, а также спаривание оснований со звездообразной структурой. Расщепление ферментом рестрикции проводили на звездообразной структуре, захваченной на покрытых стрептавидином магнитных гранулах. Таким образом, звездообразные структуры, высвобожденные из гранул, успешно транслировались для положения 1.

Следует обратить внимание, что после укладки в звездообразную структуру 3'-конец нового модуля положения 1 участвовал в образовании второго стебля и концов стебля непосредственно перед кодоном на положении 2. Таким образом, 3'-конец нового модуля 1 выстраивался для принятия нового модуляносителя для положения 2, направляемого взаимодействиями кодон/антикодон для положения 2. Таким образом, структура была готова для второй направляемой гибридизацией кодон/антикодон замены модуля. Таким образом, посредством повторения описанного процесса замены для всех положений в звездообразной структуре выполняется полная трансляция.

Образование звездообразной структуры.

Первая стадия включала отжиг пяти олиго: νίρ206, νίρ161, νίρ192, νίρ193 и νίρ207. Схематическое изображение организации показано на фиг. 34А. Пять олиго в данной реакции будут гибридизоваться друг с другом, образуя таким образом трехстороннее место соединения, состоящее из двух структур стебель-петля и одного стебля с 5'- и 3'-негибридизованными последовательностями в конце, дистальном относительно центра трехстороннего места соединения. Негибридизованные последовательности представляют собой последовательности ПЦР-праймирования (5'-сегмент νίρ206 и 3'-сегмент νίρ207). Олиго смешивали в 1хлигазном буфере (ΝΈΕ! В0202δ), 50 мМ №С1, с 20 пмоль каждого олигонуклеотида в объеме 10 мкл. Отжиг выполняли инкубированием в ПЦР-установке в течение 5 минут при 95°С и в течение 30-секундных стадий при следующих температурах: 80°С, 65°С, 50°С, 45°С, 30°С, 20°С.

Затем 5'-концы фосфорилировали полинуклеотидкиназой: 2,5 единиц полинуклеотидкиназы (ЦЕВ М0201) инкубировали в реакционном объеме 15 мкл в 1хлигазном буфере, 50 мМ ЦаС1. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Отожженные олиго преобразовывали в непрерывную

- 43 024849

ДНК-цепь ДНК-лигазой, которая образовывала фосфодиэфирные связи между расположенными рядом 3'-концом νίρ206 и 5'-концом νίρ161 и между расположенными рядом 3'-концом νίρ161 и 5'-концом νίρ192, и между расположенными рядом 3'-концом νίρ192 и 5'-концом νίρ193, и между расположенными рядом 3'-концом νίρ193 и 5'-концом νίρ207, соответственно. ДНК-лигазу Т4 (]№ЕВ М0202Ь) добавляли в 1хлигазный буфер, 50 мМ №С1, и добавляли 20 единиц/мкл фермента с получением конечного реакционного объема 20 мкл. Полученную смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 16°С.

Звездообразную структуру ДНК амплифицировали в общем реакционном объеме 400 мкл, в 1хТЬегтоРо1-буфер (ЯЕВ М0257Ь), 8 мМ Мд§О₄, 0,2 мМ бЭТР, 0,5М бетаин (§1дта В0300), 1 мкг/мл В8А (ЯЕВ В90018), 0,1 мкМ праймеры (νίρ202 и νίρ224) и 32 единицы Vеη! (ехо-) (№те Епд1апб Вю1аЬ8 М0257Ь). νίρ224 имел биотин на 5'-конце, позволяя захватывать ПЦР-продукт на покрытых стрептавидином магнитных гранулах. Амплификацию выполняли с начальной стадией денатурации в течение 30 с при 92°С с последующими 25 циклами с инкубациями при 92°С в течение 30 с, при 60°С в течение 15 с и при 70°С в течение 30 с. Выполняли конечное удлинение при 70°С в течение 1 мин. После ПЦРамплификации ПЦР-продукты очищали с использованием набора Эппендорфа (0032 007.740) в соответствии с инструкциями. Использовали две колонки. Элюирование выполняли с использованием 150 мкл ТЕ-буфера для каждой колонки. Затем очищенный ПЦР-продукт добавляли к покрытым стрептавидином магнитным гранулам (Нупа1 МуОпе, 605.02). 100 мкл гранул промывали два раза в 2хВ\УТ-буфере (10 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЕЭТА, 2М №С1, 0,1% Тритон Х-100). Гранулы суспендировали в 300 мкл 2хВ\УТ и 300 мкл очищенного ПЦР-продукта добавляли к гранулам. Гранулы инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с медленным встряхиванием. Гранулы захватывали на магните и супернатант удаляли. Гранулы промывали 3 раза 1 хВ\УТ (половина концентрации 2хВ\УТ). ДНК элюировали из комплементарной биотинилированной цепи ДНК, захваченной на магнитных гранулах, добавлением 50 мкл 10 мМ №ОН и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Гранулы захватывали на магните, супернатант, содержащий верхнюю цепь ДНК, удаляли и немедленно нейтрализовали 20 мкл 1М Трис-НС1, рН 7,2.

Чистоту элюированной ДНК испытывали реакциями праймерного удлинения с прямым и обратным праймерами в отдельных реакциях. Реакции праймерного удлинения проводили с использованием Vеη! (ехо-) в реакциях 10 мкл, в 1хТЬегтоРо1-буфер (ЯЕВ М0257Ь), 8 мМ Мд§О₄, 0,2 мМ бЭТР, 1М бетаин и 0,2 единиц Vеη!(ехо-) и 0,2 мкл матрицы и 0,4 мкМ νίρ202 или 0,4 мкМ νίρ203 на реакцию. Реакция праймерного удлинения была следующей: 95°С в течение 2 мин, 60°С в течение 30 мин и 74°С в течение 5 мин.

Схема указанной процедуры показана на фиг. 34А. На протяжении процедуры отбирали пробы для анализа электрофорезом в ПААГ. Фотоснимок геля показан на фиг. 34В. Этот гель содержит также реакции праймерного удлинения контроля качества. На дорожке 2 видна полоса ожидаемого размера 241 п.н., которая не присутствует в отрицательном контроле без добавленной матрицы (дорожка 1). Таким образом, звездообразная структура ДНК была успешно собрана и амплифицирована. Кроме того, две полосы среднего размера, превышающего 1000 п.н. наблюдаются на дорожке 2, которые представляют уложенную звездообразную структуру ДНК (в качестве ссылки см. пример 21). Дорожка 3 показывает продукт после ПЦР-очистки.

Продукт захватывали через биотиновую часть молекулы на нижней цепи ПЦР-продукта. Проходящая через колонку часть показана на дорожке 4. Здесь обнаруживали нижнюю из двух полос со средним размером, превышающим 1000 п.н., которая, следовательно, не содержит биотин и не гибридизуется с биотинилированной цепью. После промывания гранул небиотинилированная цепь элюировалась при высоком рН, который уничтожал спаривание оснований. Продукт элюирования показан на дорожке 5. Наблюдали единственную полосу, эквивалентную нижней из двух полос со средним размером, превышающим 1000 п.н., что указывает на успешное выделение небиотинилированной верхней цепи ПЦРпродукта. Интересно, что верхняя полоса из двух полос со средним размером, превышающим 1000 п.н., обнаруживалась только, когда присутствовали обе цепи ПЦР-продукта (дорожки 1 и 2). Таким образом, наиболее вероятно, верхняя полоса представляет собой две гибридизованные молекулы звездообразной структуры ДНК, гибридизованные посредством концевых сайтов ПЦР-праймирования.

В качестве контроля производили два праймерных удлинения очищенной ДНК. В одной реакции использовали прямой праймер (νίρ202), и во второй реакции использовали обратный праймер (νίρ203), которые праймируют на нижней и верхней ПЦР-цепях, соответственно. Таким образом, если выделенная ДНК является чистой, только вторая реакция должна приводить к появлению продукта праймерного удлинения. В соответствии с этим, на дорожке 7 наблюдали только полосу, соответствующую ожидаемому размеру 241 п.н., в то время как на дорожке б не обнаруживали продукта праймерного удлинения. Таким образом, была достигнута успешная очистка желаемой цепи ПЦР-продукта в высокоочищенном препарате.

Выставление (дисплей) кодона на положении 1.

Звездообразная структура ДНК содержала две структуры стебель-петля и один стебель. Стебель без петли содержал кодон для положения 1. Кодон выставляется расщеплением ферментом рестрикции Вка1,

- 44 024849 которая разрезает снаружи от его последовательности узнавания, и образует 4-нуклеотидный 5'-выступ, последовательность которого может быть выбрана без рестрикций и, следовательно, является идеальной для целей кодирования. В данном контексте указанный выступ называют кодоном для положения 1.

Звездообразную структуру ДНК подвергали расщеплению Вка1. Двухцепочечный субстрат для Вка1 был обнаружен в первом стебле (стебле без петли), генерированном гибридизацией 5'-сегмента νίρ161 и 3'-сегментов νίρ193. Следует обратить внимание, что продукт, полученный после расщепления Вка1, соответствует последовательности νίρ161-νίρ192-νίρ193, описанной в начале данного примера.

110 мкл очищенной звездообразной структуры ДНК смешивали с 20 мкл 10х№В3-буфера и 200 единицами Вка1 (№1В К0535Б) в общем объеме 200 мкл. Реакцию расщепления инкубировали при 50°С в течение 2,5 ч. ДНК подвергали стандартному осаждению этанолом перед нанесением ее на гель 10% ТВЕ-мочевина (Зпуйгодеп) для очистки в геле.

На фиг. 35 показан фотоснимок геля после окрашивания 8УВК зеленым. Неразрезанную ДНК наносили на дорожке 1 в качестве эталона. Наблюдали ярко выраженную полосу, мигрирующую со средним размером, превышающим 1000 п.н. (следует обратить внимание на выход за пределы дорожки на дорожке М). Множественные полосы наблюдали на дорожках 2-7, где наносили продукт расщепления Вка1, которые показывают, что Вка1-расщепление не было полным. Однако представляющую интерес полосу вырезали из геля (показано блоком на указанной фигуре) и ДНК экстрагировали из данного куска геля по способу измельчения и замачивания, осаждали этанолом и повторно растворяли в 40 мкл Н₂О, как описано выше.

Лигирование нового (свежего) модуля положения 1, направляемое взаимодействием кодон/антикодон.

Новый модуль положения 1 лигировали на Вка1-расщепленную и очищенную звездообразную структуру ДНК. νίρ066 включали в данную реакцию лигирования в качестве вспомогательного агента лигирования и для введения молекулы биотина в продукт лигирования и, следовательно, облегчения дальнейшей очистки. Отжиг νίρ271 и νίρ066 будет давать продукт с 4-нуклеотидным 5'-выступом (νίρ271), который в данном контексте называют антикодоном. Следовательно, последовательность выбирают таким образом, что она является обратным комплементом относительно кодона на положении 1 в звездообразной структуре ДНК. Таким образом, гибридизация кодон/антикодон способна направлять лигирование двух входящих олиго с использованием звездообразной структуры ДНК.

νίρ271 и νίρ066 смешивали в 1хлигазном буфере (ЖВ В02028), 50 мМ №-1С1 с 50 пмоль каждого олигонуклеотида в объеме 10 мкл. Отжиг выполняли на ПЦР-установке с использованием программы отжига, описанной выше.

Затем отожженные νίρ271/νίρ066 смешивали с Вка1-расщепленной и очищенной звездообразной структурой ДНК (30 мкл) и 5'-концы фосфорилировали полинуклеотидкиназой: 12,5 единиц полинуклеотидкиназы (NΕВ М0201) включали в реакционный объем 50 мкл в 1хлигазном буфере, 50 мМ №С1. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°С.

Затем родственные (узнаваемые) концы молекул соединяли ДНК-лигазой, что создавало фосфодиэфирную связь между расположенными рядом 3'-концом νίρ066 и 5'-концом Вка1-расщепленной ДНК и между расположенными рядом 3'-концом Вка1-расщепленной ДНК и 5'-концом νίρ271. ДНК-лигазу Т4 ЛЕВ М0202Б) добавляли в 1хлигазный буфер, 50 мМ №-1С1 и добавляли 20 единиц/мкл фермента с получением конечного реакционного объема 60 мкл. Полученную смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 16°С.

Замена.

Следующей стадией было удаление первоначального модуля положения 1 из звездообразной структуры ДНК. Молекулу подвергали рефолдингу, что позволяло новому модулю положения 1 стать частью трехстороннего места соединения, и ковалентную связь между первоначальным модулем положения 1 и звездообразной структурой ДНК устранялась. Кроме того, вводили хелперный олиго (νίρ194), который не отжигался с сайтом РуиП в первоначальной петле в дистальном конце 2-го стебля (см. фиг. 36), образуя, таким образом, двухцепочечный субстрат для Рзи11. Таким образом, как ковалентная связь, так и спаривание оснований разрушались между первоначальным модулем положения 1 и звездообразной структурой. Кроме того, новый модуль положения 1 был введен в виде части трехстороннего места соединения.

мкл реакционной смеси для лигирования смешивали с 200 пмоль νίρ194 в 10 мМ Трис-НС1 рН 8, 1 мМ БОТА, 100 мМ №С1, 0,1% Тритон Х-100 в общем объеме 60 мкл. Денатурацию и отжиг выполняли в ПЦР-установке в течение 5 минут при 95°С и в течение 30-секундных стадий при следующих температурах: 80°С, 65°С, 50°С, 45°С, 30°С, 20°С.

Затем ДНК захватывали на покрытых стрептавидином магнитных гранулах (Эупа1). 30 мкл гранул промывали 2 раза в 2хВДТ (2М №С1, 10 мМ Трис-НС1, рН 8, 1 мМ БОТА, 0,1% Тритон-Х-100). После конечного промывания гранулы суспендировали в 60 мкл 2хВДТ и добавляли 60 мкл реакционной смеси для отжига У1р194/звездообразная структура. Инкубирование выполняли в течение 15 мин при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Гранулы теперь с присоединенной к ним ДНК улав- 45 024849 ливали на магните и затем суспендировали в буфере для ΡνιιΙΙ-расщепления; к гранулам добавляли 22 мкл Н₂О и 3 мкл 10хбуфера для ΡνιιΙΙ-расщепления и 5 мкл ΡνιιΙΙ (10 единиц/мкл; Регтейак ЕК0637). Реакционную смесь для расщепления инкубировали в течение 6 часов при 37°С. После расщепления гранулы отделяли от супернатанта на магните.

Во всей приведенной процедуре сохраняли аликвоты для анализа электрофорезом на геле 10% ТВЕмочевина, окрашенном красителем 8УВР зеленым (Μο1еси1а^ Ριό^κ), в соответствии с протоколом изготовителей. Фотоснимок геля показан на фиг. 36.

Очищенную ВкаЪрасщепленную звездообразную структуру наносили на дорожку 1; наблюдали хорошо выраженную полосу ожидаемого среднего размера около 600 нт. Продукт лигирования ВкаЬ расщепленной звездообразной структуры с новым модулем для положения 1/хелперным олиго (νίρ066) наносили на дорожке 2. Наблюдали хорошо выраженную полосу среднего размера, превышающего 1000 нт, что указывало на успешное лигирование. Гранулы после ΡνиII-расщепления наносили на дорожке 4. Наблюдали полосу среднего размера, превышающего 1000 нт. Полоса соответствует нерасщепленной ДНК, которая видна при сравнении с дорожкой 2. Однако в супернатанте от реакционной смеси для ΡνιιΙΙ-расщепления (дорожка 5) наблюдали полосу среднего размера около 600 нт продукта успешной замены. Этот факт, который был обнаружен в супернатанте, показывает, что новый модуль в положении 1 был заменен первоначальным модулем в положении 1 в звездообразной структуре.

Таким образом, продемонстрирована успешная трансляция, т.е. направляемая взаимодействием кодон/антикодон замена модуля.

Список олигонуклеотидов, используемых в примерах

Название Последовательность Модификация νϊρϋΟύ СТССТТТГСОАСАСССАСТСТОСААОТОТСАССССАТСТОС νίρ007 ТТСОАААААССААССАОАТССООТОАСТОТСААОССТОАОСТ νίρΟΟβ САОаСАОАОССТСАССТСАОССГГОАСТСТТССАОАСЗТСССТ Ир009 ОАОССАОАСССТСАССТСАСССТТОАСТОСАОААСССАТТСТ νίρΟΙΟ асасааоаастстаоаатосоттстсстсттссасаотсост νίρΟΙβ СТСОТТТГССАаАСССАСТСТааААСХОТСАСССОАТСТОО νίρθ!7 ТтаОАААААССААССАОАТССОСТОАСХСТСААОССТОАООТ νίρΟΙβ САССОАОАОССТСАССТСАСССГГСАСХСТТССАОАОТСОСТ νίρ019 оаоооаоаосстсасстсаосстгоасхооаоаасосаттст νίρ020 АСАСААОАЛСТСТАОАЛТОСОГГСТССХСГГССАОАСТСОСТ νίρ027 АСТАТСАООССТСТСТОТСО νΐρΟ28 ТАОСААССССААТАООААСС νϊρ029 АСТАтсзАсассгатсгатаосАстсАсаАа νίρΟ30 ААААСТССТСАСТСССТГССТАТТОСОСГТОСТА νίρ031 ТТГТСОАОАССОАСТСТОаААОТОТСАСССОАТСТОО νίρ034 АСТАТОАОООСТОТСТОТОО νίρ038 ТАОСААОСССААТАОСААСС νίρ046 АСТСТООААОХОТСАСССОАТ νίρ048 ОАОСОАОАОССТСАССТСАОССТТОАСАСАСАСХСТТССАОА стсоат νίρΟίβ СТСОТПТССАОАСССАСТСТООААОАОТСТОТТОТСАСССОА тстоо νίρ068 САСССТТОАСХСТТССАОАСТ νΐρ070 СТСТСТСОТСАСТООСГТССТАТТОСОСТТССТА νίρ076 АСТСТООААОХОТСАССООАТСТСО νίρ078 ОАОССАОАСССТСАССТСАОССТТОАСТСТГССАОАСТОСТТ сстаттооосттоста νίρ!32 тгсоааааассаассаоатссостоастототототсаасо СТОАОСГ νίρ!33 ОАОООАОАООСТСАССТСАОССТТОАСАСАСАСТСТГССАС аотсоотстсо νψΐόΐ АОАОСОАСАСССАСТСТООААОТСТСАССООАТСТ νίρ162 ООТГСССАОСОСССАСТАОСТСАООАТССАСССААССАСАТСС оотоастототототсааосстоао

5Т

УР

5Т

УР

5Т

Х-амин-Сб-ЙТ амин -С6-4Т

Х»аминЮб-4Т Х-амиж-Сб-ЙТ X” амин -С6-ЙТ

Нет

Нет

Неф

УР

УР

5' биотин 5' биофин X» амин -С6-ЙТ 5Т,Х= амин. С6-ЙТ

Х-амих-СбЙТ

Храмин -С6-ЙТ

- 46 024849 νΐρ163 СТСАОССТСААТТСТСТСТАССТССТАССТСССТСАССТСА ОССТТСАСАСАСАСТСТТССАОАОТСО(ЗТСТСа νίρ164 ОТОСССССТС νίρ165 СТООАТССТО νίρ192 ООТТСОСАСАССТОАСТАОСТСАОАССГСАСССААССАСАТ ССОСТОАСТСТОТСТСТСААООСТСАО νίρ193 ОТОАСССТССССССТСТСТАССТАТГААТТСССТСАССТСАС ССТТОАСАСАСАСТСТТССАСАСТСОСТСТСС νίρ!94 ОТСАССТОТС νΐρΙ95 СТОАОСТСТО νίρΟόθ ХСТТССАОАОТСООТСТСС νίρ088 ХСАСССТТСАСГСТТССАОАСТ νΐρ202 САООТСОСТОАОАООТТОАС «р2ОЗ АСОТСССАОТСАСААСТСТО νίρ206 САООТСОСТОАОАООТТОАССАОТСАСОАО νίρ207 СТСТсТСОТОАСТОСАСАСТТСТОАСТСООАСОТ йр224 ХАСОТССОАОТСАОААОТОТО νϊρ231 АОАОСОАОАССОАСТСТООААОХОТСАССОСАТСТ νίρ238 ТТТТСОАОАССОАСТСТООААСХСТСАССООАТСТ νϊρ262 ООТГООСАСАОСТОАСТАОСТСАОАОСТСАСССААССАОАТССООТОАСТОТОТОХОТСААООСТСАО νίρ263 ОТОАООСТСССОООТСТОГГАССТАТГААТТСССГСАССТСАОССТТОАСАСАСАСХСТТССАОАОТСООТСТСО νίρ269 ОСГТООСАСАОСТОАСАААААСАОАОСТСАСССАЛССАОАТССООТОАСТОТОТОХОТСААООСТОАО νϊρ27Ο ОТОАООСТСССОООТСОАОАОСТАТТААТТСССТСАССТСАОССТТОАСАСАСАСХСТТССАОАОТСООТСТСО νίρ271 СТСТСОАОАССОАСТСТООААОХОТСАССООАТСТСОТТОООТоаостсто

Х**У био Χ-5'био

Χ-5'био

Χ^βΝΗ2-Ο6-άΤ

Х=-ЫН2-С6-4Т х-шг-Сб-сгг

Х»№42-С6чГГ

Χ=ΝΗ2·€6-<ΙΤ

Χ-ΝΗ2-06-ίΓ х-лт-смт

- 47 024849

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> 71регдеп РЬагтасеиР1са1з Арз <120> Химический синтез, направляемый структурной нуклеиновой кислотой <130> 130636 <160> 49 <170> РаЬепЫп νβτείοη 3.3 <210 1 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> ш1зс_ГеаРиге <223> 5’Р <400> 1 сРсдРРССсд адассдасРс РддаадРдРс ассддаРсРд д 41 <210> 2 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Искусственный синтез <220 <221> т1зс_£еаЬиге <223> 5’Р <400 2

РРддааааас саассадаРс сддРдасРдР сааддсРдад др 42 <210> 3 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> т1зс_ГеаРиге <223> 5'Р <400> 3 дадддададс сРсассРсад ссРРдасРсР РссададРсд др 42 <210> 4

- 48 024849

<211> <212> <213>	42 ДНК Искусственная
<220 <223>	Искусственный синтез
<220 <221> <223>	шхзс £еа£иге 5’Р
<400	4

дадддададс сСсассСсад ссЕ£дас£дд адаасдсаъе ст 42 <210> 5 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> т1ес_£еаМ]ге <223> 5’Р <400> 5 асасаадаад ^д^адаа'Ьдс д^Ьс^ссЬсЬ £ссадад£сд дЬ 42 <210 6 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Искусственный синтез <220 <221> га1зс_£еа£иге <222> (27) .. (27) <223> п=амин-Сб-йТ <400 6 с£сд££££сд адассдас£с £ддаадпд£с ассдда£с£д д 41

<210	7
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Искусственный

<220>
<221>	тхзс £еа£иге
<222>	(28) . . (28)
<223>	п=амин-С6-0Т

- 49 024849 <400> 7

Иддааааас саассада£с сдд1:даспд1 сааддс£дад д£ 42 <210> 8 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> т1зс_£еа£иге <222> ¢28)..(28} <223> п=амин-С6-ДТ <400> 8 дадддададс с!сасс£сад ссИдаспс! 1ссадад1сд д£ 42 <210> 9 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> д1зс_£еа1иге <222> (28)..(28) <223> п=амин-С6-ДТ <400> 9 дадддададс сЬсассОсад ссИдаспдд адаасдса£Ь с£ 42

<210>	10
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Искусственный синтез

<220>

<221> т.1зс_£еа1иге <222> (28)..(28) <223> п=амин-С6-с!Т <400> 10 асасаадаад ^дГадааЬдс дРЬсОсспсО 1ссадад1сд д£

<210>	11
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	Искусственная

- 50 024849 <22О>

<22 3> Искусственный синтез <400> 11 ас£а£даддд с£д£с£д£дд <210> 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 12

Садсаадссс аа£аддаасс 20 <210> 13 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <22О>

<223> Искусственный синтез <400> 13 ас£а£даддд с£д£с1:д£дд садДсасдад <210> 14 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> га15с_£еа£иге <223> 5'Р <400> 14 аааасСсдГд асТдддПсс £а£СдддсС£ дс£а 34 <210> 15 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220>

<221> т1зс_£еа1иге <223> 5’Р <400> 15

СТ'ЬГсдадас сдас£с£дда ад£д£сассд да£сДдд

- 51 024849

<2Ι0>	16
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<22Ο
<223>	Искусственный синтез
<220
<221>	тазе ГеаЬиге
<223>	5' биотинилированная
<400	16
ас£а£даддд сГдГсСдГдд
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Искусственный синтез
<220>
<221>	Ш1зс £еа£иге
<223>	5' биотинилированная
<4 00>	17
^адсзадссс аабаддаасс
<210	18
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220
<223>	Искусственный синтез
<220
<221>	Ш1зс £еа£иге
<222>	(11)·(11)
<223>	п=амин-С6-<1Т
<4 00>	18
асЬсбддаад пдЬсассдда ύ
<210	19
<211>	48
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220
<223>	Искусственный синтез
<220>
<221>	пиве £еабиге
<223>	5' Р

- 52 024849 <220>

<221> Ш1зс_£еа1:иге <222> (34)..(34) <223> п=амин-С6-е1Т <400 19 дадддададс сбсассбсад ссОдасаса саспсОсса дадбсддЦ 48 <210> 20 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 20 сбсдбЕЬСсд адассдасЕс Еддаадад£д 1д££д£сасс ддаЕсЕдд 48 <210> 21 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Искусственный синтез <220 <221> т15с_£еа1:иге <222> (11)..(11) <223> п=амин-Сб-ДТ <400 21 садссЕЕдас псЕЪссадад 1: 21 <210 22 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Искусственный синтез <400> 22 с£сЬс1сд£д ассдддОсс £а££дддс££ дс£а 34 <210> 23 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <220 <221> т1зс_£еа£иге <222> (11)..(11)

- 53 024849 <223> п=амин-С6-сЗТ <400> 23 аскскддаад пдксассдда ТсСдд 25 <210> 24 <211> 58 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<22 3> Искусственный синтез <400> 24 дадддададс сЕсассЬсад ссЬЕдасЬсЪ кссададкдд ЪкссЬаТкдд дссЪдс^а 58 <210> 25 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 25

Мддааааас саассада^с сддЕдаскдб дкдкдксаад дскдаддк 48 <210> 26 <211> 52 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 26 дадддададс сЬсассСсад ссТЕдасаса сасбсСЕсса дадТсдд^сб сд 52 <210> 27 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 27 ададсдадас сдасНскдда ад£дЪсассд даЕск 35 <210> 28 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 28 ддЕ^ддсадд дсссасЕадс ЕсаддаЬсса сссаассада Ъссдд^даск дЕд'Ьд'ЕдЕса 60

- 54 024849 аддсбдад <210> 29 <211> 74 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <4С0> 29 дбдаддсбда аббсбсбдба ссбддбассб сссбсассбс адссббдаса сасасбсббс 60 сададбсддб сЬсд 74 <210> 30 <211> 10 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400 30 дбдддсссбд 10 <210> 31 <211> 10 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 31 дбддабссбд 10 <210> 32 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 32 ддббддсаса дсбдасбадс бсададсбса сссаассада (:009969301: дбдбдбдбса 60 аддсбдад <210> 33 <211> 74 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез

- 55 024849 <400> 33 дРдаддсРсс сдддрсрдра ссРаРРааРр сссРсассРс адссРРдаса сасасРсРРс 60 сададРсддР сРсд 74 <210> 34 <211> 10 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 34 дрсадсРдРд 10 <210> 35 <211> 10 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Искусственный синтез <400> 35 дрдадсрсрд 10 <210> 36 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> 5' биотин <222> (1)..(1) <220>

<221> 1ш1зс_£еаРиге <222> (1)..(1) <223> η является а, с, д или р <400 36 <210 37 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> пйзс ГеаРиге

- 56 024849 <222>

<223>

(1) - (1) п= 5¹ биотин <400> 37 псадссбРда с^сЬЬссада дЪ <210> 38 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <400> 38 садд£сдсрд ададдбрдас 20 <210> 39 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <400> 39 асдЬссдадЪ садаадрд^д <210> 40 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <400> 40 садд£сдсЪд ададдГЪдас садЪсасдад 30 <210> 41 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <400> 41 сЪсЪФсдЬд ас£дсасасЬ ЕсДдасЬсдд асд£ <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Искусственная

- 57 024849 <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221>

<222>

<223>

т13С_£еаРиге (1) · . (1) п= 5' биотин пасдбссдад £садаад£д£ д <210> 43 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> т15с_£еаРиге <222> (23)..(23) <223> п=ЫН2-Сб-0Т <400> 43 ададсдадас сдас£с£дда адпд£сассд дабсб 35 <210> 44 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <221> το.ί эс_£еа£иге <222> (23)..(23) <223> п=11Н2-С6-с1Т <400> 44

Н(:Д£сдадас сдасссРдда адпд£сассд да£с1:

<210> 45 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> т13С_£еа£иге <222> (56)..(56)

- 58 024849 <223> η-ΝΙ12-Сб-άΤ <400> 45 ддЕЕддеаса дсЕдасЕадс ЕсададсЕса сссаассада ЕссддЕдасЕ дЕдЕдпдЕса 60 аддсЕдад 68 <210> 46 <211> 74 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> т1зс_£еаЕиге <222> (56),.(56) <223> п=ЫН2-С6-йТ <400> 46 дЕдаддсЕсс сдддЕсЕдЕа ссЕаЕЕааСЕ сссЕсассЕс адссЕЕдаса сасаспсЕЕс 60 сададЕсддЕ сЕсд 74 <210> 47 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> т1зс_£еаЕиге <222> (56)..(56) <223> η=ΝΗ2-Ο6-άΤ <400 47 ддЕЕддеаса дсЕдасаааа асададсЕса сссаассада ЕссддЕдасЕ дЕдЕдпдЕса 60 аддсЕдад 68 <210> 48 <211> 74 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> гп1зс_£еаЕиге <222> (56)..(56) <223> п=МН2-Сб-ДТ

- 59 024849 <400> 48 дбдаддсбсс сдддбсдада дсСаккаакк ссс(:сасс1:с адссг.Г.ддса сасаспсббс 60 сададЬсддб сбсд 14 <210> 49 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Химически синтезированные, необязательно дериватизированные олигонуклеотиды <220>

<221> 1П15с_Геабиге <222> (23) .. (23) <223> η=ΝΗ2-Ο6-άΤ <400> 49 сбсбсдадао сдасбсбдда адпдксассд дабсбддбкд ддбдадсбсб д 51

Claims (36)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, как указано на фиг. 1а-1с, где указанная конструкция образует структуру звезды, определяемую тремя или более стеблями, идущими от реакционного центра, причем по меньшей мере один стебель идет радиально от центра и каждый стебель содержит дуплекс нуклеиновой кислоты, а химическое соединение расположено в реакционном центре и сформировано в нем как продукт реакции трех или более химических групп и, по меньшей мере, ковалентно связано с нуклеиновой кислотой, указанная нуклеиновая кислота образована тремя или более олигонуклеотидами, ассоциированными с указанными химическими группами, где по меньшей мере одна из указанных ассоциированных химических групп ковалентно связана с одним из указанных трех или более олигонуклеотидов и где конструкция используется для технологии ДНКдисплея ш уйго.
2. 2. Конструкция по п.1, где три или более стебля идут от реакционного центра наружу радиально.
3. 3. Конструкция по п.1 или 2, где нуклеиновая кислота содержит один или несколько кодонов, идентифицирующих одну или несколько химических групп, которые участвуют в образовании указанного химического соединения.
4. 4. Конструкция по п.3, где кодон расположен на конце стебля.
5. 5. Конструкция по любому из пп.1-4, где на конце стебля образована петля.
6. 6. Конструкция по любому из пп.1-5, где кодон расположен в части структуры стебель-петля, в которой не образуются пары оснований.
7. 7. Конструкция по любому из пп.1-6, где в структуре стебель-петля присутствует сайт ферментативной рестрикции.
8. 8. Конструкция по любому из пп.1-7, где петля способна гибридизоваться со вспомогательным олигонуклеотидом, образуя субстрат для фермента рестрикции.
9. 9. Конструкция по п.8, в которой дуплексные связи денатурированы с образованием непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты и на всех стеблях, кроме одного, присутствует петля.
10. 10. Конструкция по любому из пп.1-9, где непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты может быть ферментативно удлинена.
11. 11. Конструкция по п.10, где нуклеиновая кислота содержит сайт праймирования ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или обратной транскриптазы.
12. 12. Конструкция по п.11, где сайт праймирования находится в стебле, не имеющем петли.
13. 13. Конструкция по любому из пп.1-12, где стебель содержит два сегмента гибридизации, которые по меньшей мере на 80% комплементарны и каждый состоит из 12 или более нуклеотидов.
14. 14. Конструкция по п.13, где каждый сегмент гибридизации содержит 18 или более нуклеотидов.
15. 15. Конструкция по любому из пп.1-14, где один или несколько реагентов, таких как каркасы, сшивающие агенты, активирующие агенты, удаляющие защитные группы, являются свободными реагентами, не ассоциированными с нуклеиновой кислотой.
16. 16. Библиотека конструкций, содержащая множество различных конструкций по любому из пп.115.
17. 17. Способ получения одной или нескольких конструкций, содержащих нуклеиновую кислоту и химическое соединение, как представлено на фиг. 1а-1с, по любому из пп.1-15, включающий:

    (ί) стадию получения N (N=3-100) олигонуклеотидов с ассоциированной химической группой, со- 60 024849 держащих:

    (1) олигонуклеотид с ассоциированной химической группой первого положения, имеющий

    ί) сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида положения Ν, и ίί) сегмент, способный к гибридизации с сегментом олигонуклеотида второго положения, (2) указанный(ые) олигонуклеотид(ы) положения п (п равен от 2 до Ν-1), имеющий(ие) сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида п-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида п+1, и (3) указанный олигонуклеотид положения Ν, имеющий сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида Ν-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного первого олигонуклеотида, где по меньшей мере три из указанных нуклеотидов содержат ассоциированную химическую группу, где по меньше мере одна указанная ассоциированная химическая группа ковалентно связана с одним из указанных по меньшей мере трех олигонуклеотидов;

    (ίί) стадию приведения в контакт указанных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами в условиях, при которых возможна гибридизация указанных сегментов олигонуклеотидов, так, что олигонуклеотиды образуют нуклеиновую кислоту, имеющую структуру звезды, определенную Ν стеблями, идущими от реакционного центра, таким образом обеспечивая взаимодействие химических групп и образование химических соединений, где указанное образованное химическое соединение ассоциировано с нуклеиновой кислотой, что приводит к образованию конструкции по любому из пп.1-17, ассоциированной по меньшей мере с одним из указанных олигонуклеотидов.
18. 18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию обеспечения условий, при которых возможно лигирование концов олигонуклеотида п-1 с олигонуклеотидом п и олигонуклеотида Ν-1 с олигонуклеотидом Ν, с образованием, таким образом, непрерывной молекулы нуклеиновой кислоты со структурами стебель-петля и ассоциированным химическим соединением.
19. 19. Способ по п.17 или 18, где образованное химическое соединение ковалентно ассоциировано по меньшей мере с одним из указанных олигонуклеотидов или с непрерывной молекулой нуклеиновой кислоты.
20. 20. Способ по п.17, где химические реакции осуществляют последовательно или одновременно и/или где указанное лигирование осуществляют ферментативно или химически и последовательно или одновременно.
21. 21. Способ по любому из пп.1-20, включающий проведение дополнительной стадии ферментативной реакции удлинения для проявления (дисплея) образованного химического соединения при условии, что, по меньшей мере, первый олигонуклеотид и/или, по меньшей мере, Ν-олигонуклеотид содержит сайт праймирования для ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или сайт обратной транскриптазы.
22. 22. Способ по любому из пп.17-21, где Ν равно 3, 4, 5, 6 или 7.
23. 23. Способ по любому из пп.17-22, где синтезируют более одной конструкции из различных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами с образованием библиотеки различных конструкций.
24. 24. Способ по п.23, где олигонуклеотиды с ассоциированными химическими группами, полученные на стадии (ί) п.17, представляют собой по меньшей мере 10 различных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами для каждого конкретного положения.
25. 25. Способ по любому из пп.23 или 24, где олигонуклеотиды с ассоциированными химическими группами, полученные на стадии (ί) п.17, представляют собой по меньшей мере 10 различных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами для каждого из двух положений.
26. 26. Способ осуществления олигонуклеотидной замены в конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-15, включающий:

    a) стадию получения одноцепочечной непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты, как указано на стадии (ί) п. 17, то есть:

    (ί) получение Ν (Ν=3-100) олигонуклеотидов с ассоциированной химической группой, содержащих:

    (1) олигонуклеотид с ассоциированной химической группой в первом положении, имеющий

    ί) сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида положения Ν, и ίί) сегмент, способный к гибридизации с сегментом олигонуклеотида второго положения, (2) указанный(ые) олигонуклеотид(ы) положения п (п равен от 2 до Ν-1), имеющий(ие) сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида п-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида п+1, и (3) указанный олигонуклеотид положения Ν, имеющий сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида Ν-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного первого олигонуклеотида, где по меньшей мере три из указанных нуклеотидов содержат ассоциированную химическую группу, где по меньше мере одна указанная ассоциированная химическая группа ковалентно связана с одним из указанных по меньшей мере трех олигонуклеотидов;

    b) стадию гибридизации одноцепочечной непрерывной нуклеиновой кислоты, полученной на ста- 61 024849 дии а), в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием конструкции, содержащей непрерывную нуклеиновую кислоту, содержащую, по меньшей мере, N-1 структуру стебель-петля и один стебель;

    с) стадию введения разрыва либо в указанный стебель, либо в N-1 структуру стебель-петля с образованием первого стебля с первым одноцепочечным выступом и первым отступающим концом указанного первого стебля;

    й) стадию получения первого олигонуклеотида с ассоциированными химическими группами, имеющего, по меньшей мере, сегмент, способный к гибридизации с указанным первым стеблем, и сегмент, способный к гибридизации со следующим стеблем, или структурой стебель-петля, расположенной рядом с первым стеблем с ассоциированной химической группой, и первый антикодон, способный к гибридизации с первым одноцепочечным выступом указанного первого стебля;

    е) стадию обеспечения условий, при которых возможна гибридизация первого антикодона первого олигонуклеотида с ассоциированной химической группой и первого одноцепочечного выступа; и

    ί) стадию обеспечения условий, при которых возможно ферментативное или химическое лигирование указанного олигонуклеотида с ассоциированной химической группой с первым отступающим концом указанного первого стебля с образованием первой структуры стебель-петля;

    и осуществление стадий:

    ί) стадии расщепления ферментом рестрикции следующего стебля или структуры стебель-петля с образованием следующего стебля с одноцепочечным выступом и следующим отступающим концом указанного следующего стебля; и ίί) стадии денатурации нуклеиновых кислот; и ίίί) стадии гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием N-1 структуры стебель-петля и одного стебля с указанным следующим одноцепочечным выступом; и ίν) стадии обеспечения условий, при которых возможна реакция указанных химических групп, с образованием химического соединения, ассоциированного по меньшей мере с одним из указанных олигонуклеотидов конструкции; и

    ν) стадии получения следующего олигонуклеотида с ассоциированной химической группой, имеющего, по меньшей мере, сегмент, способный к гибридизации с указанным следующим стеблем, и сегмент, способный к гибридизации со стеблем или структурой стебель-петля, расположенной рядом со стеблем, и имеющий следующий сегмент антикодона, способный к гибридизации со следующим одноцепочечным выступом; и νί) стадии обеспечения условий, при которых возможно ферментативное или химическое лигирование гибридизованного следующего олигонуклеотида со следующим отступающим концом указанного следующего стебля; и повторение стадий ί)-νί) N-1 раз; и

    д) стадии введения разрыва в указанную первую структуру стебель-петля, частично состоящую из указанного первого олигонуклеотида, оставляя по меньшей мере указанный первый антикодон, соединенный с указанным первым олигонуклеотидом, с ассоциированной первой химической группой; и

    й) стадии денатурации нуклеиновых кислот; и

    ί) стадии гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием конструкции, содержащей по меньшей мере N-1 структуру стебель-петля и один стебель; и

    _)) стадии обеспечения условий, при которых возможна реакция указанных химических групп с образованием химического соединения, где образованное химическое соединение ковалентно присоединено по меньшей мере к одной из указанных конструкций.
27. 27. Способ по п.26, где разрывы в стеблях или петлях вводят ферментами рестрикции, РНКазой, эндонуклеазой III, эндонуклеазой VIII, АРЕ1, Ррд, химическим расщеплением или фоторасщеплением.
28. 28. Способ по п.26, где непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты стадии а) может быть получена способом по пп. 17-25, но без включения химических групп (фиктивная библиотека).
29. 29. Способ по п.26, где непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты стадии а) может быть получена способом по п.21.
30. 30. Способ по п.29, где продукт удлинения по п.24 амплифицируют при помощи ПЦР.
31. 31. Способ по любому из пп.26-30, где непрерывную последовательность нуклеиновой кислоты стадии а), Ь) или с) получают путем иммобилизации смысловой цепи продукта ПЦР на твердом носителе, отделения твердого носителя, что делает возможным самогибридизацию смысловой цепи, с образованием, таким образом, структуры звезды, и путем разрыва стебля, соединяющего самогибридизованную структуру звезды с твердым носителем, освобождая, таким образом, структуру звезды от твердого носителя.
32. 32. Способ по п.31, где самогибридизацию проводят мгновенным охлаждением.
33. 33. Способ по п.31 или 32, где разрыв стебля, соединяющего твердый носитель и повторно уложенную структуру звезды, осуществляют с использованием фермента рестрикции.

    - 62 024849
34. 34. Способ по любому из пп.26-33, дополнительно включающий стадию добавления вспомогательного олигонуклеотида, комплементарного последовательности петли, перед стадией расщепления для создания двухцепочечного субстрата для фермента рестрикции в петле.
35. 35. Способ скрининга библиотеки на химическое соединение, которое образует часть конструкции и обладает желаемым свойством, где указанная библиотека содержит более одной конструкции, полученной, как описано в п.21, где каждая указанная конструкция содержит нуклеиновую кислоту, образованную тремя или более стеблями, и химическое соединение, ковалентно связанное с указанной нуклеиновой кислотой, включающий стадию зондирования библиотеки на конструкции, имеющие ковалентно присоединенное химическое соединение с желаемым свойством;

    отделение конструкций, обладающих желаемым свойством, от конструкций, не обладающих желаемым свойством; и получая пул, обогащенный конструкциями, обладающими желаемым свойством.
36. 36. Способ по п.35, где способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты конструкций обогащенного пула.