KR20070085977A - 구조적 핵산에 의해 가이드되는 화학적 합성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 반응 중심으로부터 연장되는 3개 이상의 스템을 특징짓는 별 구조물을 형성하는, 핵산 및 화학적 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 스템은 핵산 듀플렉스에 의해 형성되며, 상기 화학적 화합물은 3개 이상의 화학적 그룹의 반응 생성물로서 반응 중심에 형성되어 있다. 상기 조성물은 반응 중심에 있는 화학적 그룹 사이에 가까운 근접성을 제공하여 반응을 촉진하는 이점을 갖는다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다수의 템플레이트를 합성할 필요가 없으며 형성될 암호화된 분자에 대한 코돈/안티-코돈 인식에 비의존적인 이점을 갖는다.
별 구조물, 스템, 핵산, 화학적 화합물

Description

구조적 핵산에 의해 가이드되는 화학적 합성{Structural nucleic acid guided chemical synthesis}
본 발명은 비-천연 중합체 및 소분자와 같은 다양한 분자를 디스플레이하도록 하는 시험관 내 DNA 디스플레이 기술을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 방법은 조합식 라이브러리 (combinatorial library)를 제작하여 목적하는 활성, 증폭 및 다양화에 대한 수회의 선별을 수행함으로써 분자 진화를 가능하게 하는 이점이 있다.
디스플레이 기술은 핵산의 정보 저장 및 증폭 능력을 다른 화합물의 기능적 활성과 조합하도록 개발되었다. 디스플레이 기술은 작용 실체와 작용 실체 (entity)의 구조에 대한 정보를 제공하는 핵산 서열 사이의 연합에 의존한다. 이러한 방법의 이점은 매우 큰 라이브러리가 제작되어 작용 실체의 목적하는 활성을 탐침할 수 있다는 것이다. 이때, 목적하는 활성을 갖는 라이브러리 구성물은 목적하는 활성을 갖지 않는 라이브러리 구성물로부터 분할되어 목적하는 활성을 갖는 구성물의 분획이 보다 풍부한 농축된 라이브러리를 제조할 수 있다. 이러한 과정 을 선별이라 한다. 이러한 농축된 라이브러리 중의 라이브러리 구성물의 구조는 이들의 동종 (cognate) 핵산 서열에 의해 확인되어 미소량의 물질로부터도 확인이 가능할 수 있다.
또한, 일부 디스플레이 기술은, 이들의 구성물 (핵산 및 작용성 실체물)에 대한 정체를 알지 못하면서도 농축된 라이브러리를 증폭시킨다. 이러한 디스플레이 기술은 "증폭성 디스플레이 기술"로 불린다. 이들 기술은, 목적하는 활성물의 농축을 증가시키는 반복적 횟수의 선별 및 증폭이 수행될 수 있기 때문에, 큰 라이브러리를 다루는 경우 특히 유리하다. 증폭성 디스플레이 기술의 또 다른 이점은, 수회의 선별, 증폭 및 다양화(diversification)을 수행함으로써 자연적 선별에서와 동일한 원리로 목적하는 작용을 갖는 분자를 진화시킬 있다. 이러한 과정은 분자 진화라 한다.
생물학적 시스템을 이용하는 디스플레이 기술이 개발되었으며, 이중 가장 주목적인 것은 파즈 디스플레이이다 (Smith, Science, 228, 1315-7, 1985). 그러나, 이러한 시스템은 단백질 및 펩티드와 같은 자연 발생적 생성물의 디스플레이에 국한된다.
유기 화학의 적응성 (flexibility)을 이용하는 시험관내 디스플레이 기술이 기술되어 있다. 일 예가 미국특허 제 5,723,598에 기술되어 있다. 이 방법은 이작용성 분자 (하나의 작용기는 화학적 그룹을 수용할 수 있고, 다른 작용기는 핵산 서열을 수용할 수 있다)를 이용한다. 이러한 라이브러리를 합성하는 방법은 통상 "스플릿 및 믹스 (split and mix)" (수회에 걸친 이작용성 분자의 혼합 및 구획물 로의 분할로 구성됨)로 알려져 있다. 화학적 그룹 및 핵산 서열에 대한 구획 특이적 쌍이 추가된다. 따라서, 핵산 서열은 화학 그룹을 암호화하고 있다. 이어서, 이작용성 분자를 혼합하고, 큰 조합식 라이브러리가 만들어지도록 상기 과정을 반복한다. 이어서, 라이브러리를 선별하고, 선별된 핵산 서열을 통상적인 분자 생물학, 클로닝 및 DNA 서열분석에 의한 확인에 이용될 수 있는 PCR에 의해 증폭시킨다.
또 다른 예가 WO04/039825A2에 기술되어 있다. 이 문헌에서, 조합식 라이브러리는 화학적 그룹과 핵산 코드의 동종 쌍을 이작용성 분자 (하나의 작용기는 화학적 그룹을 수용할 수 있고 다른 작용기는 핵산 서열을 수용할 수 있다)에 수회의 근접성으로 가이드되는 첨가 (proximity-guided addition)를 함으로써 제조된다. 또한, 화학적 그룹이 코딩 분절 (segment) 및 이작용성 분자에 어닐링할 수 있는 분절을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 부착되는 경우, 소위 전달 단위 (transfer unit)의 레퍼토리들이 이용된다. 일 레퍼토리의 전달 단위가 이작용성 분자에 어닐링되며, 이는 상기 코드가 이작용성 분자에 효소적으로 전달되도록 할 뿐만 아니라 화학적 그룹이 동일한 이작용성 분자와 반응하게 가이드한다. 이러한 과정은 큰 조합식 라이브러리가 생길 때까지 반복될 수 있다.
상술된 라이브러리는 농축된 라이브러리를 형성하도록 선별될 수 있다. 이어서, 농축된 라이브러리 구성물의 합성 내역 (history)은 암호화 핵산을 통해 유추될 수 있다. 그러나, 이러한 접근의 한계는 농축된 라이브러리가 증폭될 수 없다는 것이다.
유기 화학의 적응성 및 수회의 선별, 증폭 및 다양화의 이점을 갖는 시험관내 디스플레이 기술이 기술되어 있다. 이러한 방법은 템플레이트 (template)의 사용에 의존한다.
일 예가 "스플릿 및 믹스" 원리를 이용하는 WOOO/23458에 기술되어 있다. 각각 화학적 반응 부위 및 코돈 분절에 대한 수개의 부위를 포함하는 ssDNA 템플레이트의 라이브러리가 사용된다. 상기 템플레이트는 지정된 코돈 위치에 대한 일 레퍼토리의 안티-코돈 서열에 하이브리드화하기 때문에 구분될 수 있다. 템플레이트 상의 반응 부위를 변형시키는 구획 특이적 화학 반응이 수행된다. 이어서, 템플레이트가 혼합되고 조합식 라이브러리를 형성하기 위해 다른 코돈 위치를 사용함으로써 이 과정이 반복된다.
또 다른 예가 "단일-포트 (single-pot)" 원리를 이용하는 WO02/074929A2에 기술되어 있다. 각각 화학적 반응 부위 및 수개 위치의 코돈 분절을 포함하는 올리고뉴클레오티드 템플레이트의 라이브러리가 사용된다. 또한, 일 레퍼토리의 전달 단위를 사용하는 이 방법은 올리고뉴클레오티드 안티-코돈 서열 및 화학적 반응 그룹으로 이루어진다. 템플레이트의 라이브러리는 지정된 코돈 위치에 대한 일 레퍼토리의 전달 단위와 하이브리드화된다(hybridized). 이는 하이브리드화되는 전달 단위에 화학적 그룹을 하이브리드화되는 템플레이트의 반응 부위에 근접시켜, 결국 동종 쌍의 화학적 반응을 가이드한다. 이어서, 이러한 과정은 조합식 라이브러리를 형성하도록 다른 코돈 위치를 사용하여 반복된다.
코드와 화학적 그룹의 동종 쌍을 형성하기 위한 상기한 근접성 가이드의 한 계는, 템플레이트 올리고뉴클레오티드의 선형 구조에 의한다. 상기한 선형성 때문에 코돈과 화학적 반응 부위 사이의 거리가 코돈 위치마다 상이할 것이다. 반응 부위로부터 보다 멀리 떨어진 코돈 위치에 대해, 국소 농도가 거리의 함수로서 3의 거듭제곱으로 떨어지기 때문에, 근접성 유도가 떨어진다. 이러한 단점은, 보다 많은 코돈 위치 및 보다 복잡한 코돈을 갖는 복잡한 라이브러리에 대해서는 보다 두드러진다. 이러한 문제를 WO04/016767A2에서 해결하고자 하며, 이 문헌에서 안티-코돈 분절로부터의 떨어진 전달 단위는 또한 반응성 부위 가까이에 있는 템플레이트 상의 불변 서열 (constant sequence)에 상보적인 불변 분절을 포함한다. 따라서, 전달 단위가 템플레이트에 하이브리드화되어 문제의 코돈 위치와 불변 분절 사이의 템플레이트 서열이 밖으로 돌출하여 소위 오메가 구조를 형성한다. 이러한 개념은 코돈 분절이 특이성에 중요하고 불변 분절이 근접성에 중요하다는 것이다. 또한, WO04/016767A2에는, 템플레이트 상의 반응 부위가 템플레이트의 중간에 위치되고 각각의 측면에 전개된 코돈 위치를 갖는, 소위 템플레이트의 T-구조 (T-architecture)가 제시되어 있다. 그 결과, 거리 문제는 "절반으로 준다 (cut in half)"고 생각된다.
WO 2004/056994A2는 WO02/074929A2 또는 WO04/016767A2와 유사한 방법을 기술하나, 템플레이트가 보다 작은 서열 (이 출원에서는 연결 폴리뉴클레오티드로 불림)으로 잘린다는 것이 상이하다. 연결 폴리뉴클레오티드는 전달 단위를 반응에 근접시키도록 이들을 연결한다. 특정 양태에서, 연결 폴리뉴클레오티드는 반응성 화학 그룹을 포함할 수 있다. 암호화된 분자를 수득하기 위해, 이 방법은 반응 전 코돈/안티-코돈 인지에 의존적이다.
이어서, 상술된 템플레이트 지시된 라이브러리는 농축된 라이브러리를 형성하도록 선별된다. 농축된 라이브러리 구성물의 합성 내역은 암호화 핵산을 통해 유추될 수 있다. 또한, 농축된 라이브러리는, 예를 들어 에러 프론 PCR (error prone PCR)에 의해 증폭되고 다양화되어, 분자 진화를 가능하게 할 수 있다.
이러한 접근에 있어 제한은, 적절한 코돈/안티-코돈 화이브리드화를 확보하도록 템플레이트가 상당한 길이를 가져야 하므로, 많은 수의 템플레이트가 제조되어야 한다는 것이며, 이는 번거로운 일이다. 최종의 지시된 합성을 형성하기 위해 다수의 작은 서열을 사용하는 방법에서, 합성될 서열의 수는 실제 라이브러리의 크기보다 훨씬 많다.
템플레이트를 사용하는 이전 기술의 방법은, 암호화가 코돈 및 안티-코돈 서열의 하이브리드화에 의존적인 단점이 있다. 때로는, 완전한 상보성 없이도 단일 스트랜드의 올리고뉴클레오티드 사이에 하이브리드화가 발생한다. 라이브러리 제작 시, 암호화와 합성 내역 사이에 연합이 상실된다. 그 결과, 선별 시 포지티브 코드가 탈락되고 네가티브 코드가 선별될 수 있다. 보다 복잡한 라이브러리에 대해서는, 단일 스트랜드의 올리고뉴클레오티드의 수, 길이 및 서열의 면에서 이들의 복잡성이 증가하기 때문에, 이러한 문제점이 보다 심각해진다. 이는 과정의 조절을 더욱 어렵게 한다.
상술된 바와 같이, 다양한 화합물 부류의 디스플레이, 선별, 증폭 및 다양화를 가능하게 하는 시험관내 디스플레이 기술이 개발되었다. 그러나, 특히 라이브러 리 제작에 있어서 품질 및 다양화에 대한 개선이 여전히 요구된다. 본 발명은 다수의 템플레이트의 예비-합성을 필요로 하지 않는 암호화된 분자를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 형성될 암호화되는 분자에 대한 코돈/안티-코돈 인식에 의존하지 않는다.
도 1a는 별 구조물의 형성 단계를 도시하며, 여기서 화학적 그룹은 동시에 반응된다.
도 1b는 별 구조물의 형성 단계를 도시하며, 여기서 화학적 그룹은 연속적으로 반응된다.
도 1c는 화학적 화합물의 수렴식 합성을 이용하는 방법을 도시한다.
도 1d는 각각의 구성물이 형성된 화학적 화합물을 효과적으로 디스플레이하는 라이브러리의 형성을 위한 5 단계의 방법을 도시한다.
도 1e는 화학적 그룹의 반응 후 루프가 가해지는 방법을 도시한다.
도 2a는 양특이성 올리고뉴클레오티드의 레퍼토리에 의한 조합식 라이브러리의 자가-조립 방법을 도시한다.
도 3은 친화적 선별에서의 5 단계를 도시한다.
도 4a는 라이브러리의 형성 시의 단계를 도시한다.
도 4b는 농축된 라이브러리의 브리딩 및 돌연변이화의 원리를 도시한다.
도 5는 농축된 라이브러리의 형성을 이끄는 방법에서의 단계들을 도시한다.
도 6은 분자 진화의 원리를 도시한다.
도 7은 고정화된 기질을 수반하는 본 발명의 양태를 도시한다.
도 8은 실시예 1의 실험 결과를 도시한다.
도 9는 실시예 2의 실험 결과를 도시한다.
도 10은 실시예 3의 실험 결과를 도시한다.
도 11은 실시예 4의 실험 결과를 도시한다.
도 12는 실시예 5에 기술된 실험으로 얻어지는 겔을 도시한다.
도 13은 실시예 6으로부터의 천연 PAGE 겔을 나타낸다.
도 14는 실시예 7에 보고된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 15는 실시예 8의 재폴딩 실험의 겔을 도시한다.
도 16은 실시예 9의 디자인의 도식적 다이아그램이다..
도 17은 실시예 9에 보고된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 18은 실시예 9에 보고된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 19는 실시예 10에 보고된 반응 디자인의 다양한 구조를 도시한다.
도 20은 실시예 12에 기술된 실험으로 생기는 2개의 겔을 도시한다.
도 21은 실시예 13에 보고된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 22는 실시예 14에 보고된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 23은 실시예 15에 보고된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 24는 실시예 16에 기술된 실험으로부터의 겔을 도시한다.
도 25는 실시예 17에 나타낸 실험의 결과를 도시한다.
도 26은 실시예 18에 이용된 실험적 전략의 개요를 기술한다.
도 27은 실시예 18에 이용된 과정에서 각각의 단계에 대한 비-천연 PAGE 겔을 도시한다.
도 28은 실시예 18에서 보고된 결합 어세이에 대한 비-천연 PAGE 겔을 도시한다.
도 29는 실시예 18에 보고된 PCR 증폭 겔을 도시한다.
도 30은 환원적 아미노화의 발생을 입증하는 겔의 사진을 도시한다.
도 31은 우레아 부착의 발생을 입증하는 겔의 사진을 도시한다.
도 32는 별 구조물의 전기이동성의 연구에 대한 겔을 도시한다.
도 33은 해독 과정에 대한 도식도이다.
도 34는 실시예 22에 보고되는 실험의 결과는 도시한다.
도 35는 실시예 22에 보고되는 실험의 결과는 도시한다.
도 36은 실시예 22에 보고되는 실험의 결과는 도시한다.
본 발명은 유기 화학의 적응성에 대한 이점을 취하고 수회의 선별, 증폭 및 다양화를 가능하게 하는 시험관내 디스플레이 기술에 관한 것이다.
특히, 본 발명은, 핵산 및 화학적 화합물을 포함하는 조성물로서, 이 조성물은 반응 중심으로부터 연장되는 3개 이상의 스템을 특징짓는 별 구조를 형성하며, 상기 스템은 핵산 듀플렉스에 의해 형성되고, 상기 화학적 화합물은 3개 이상의 화학적 그룹의 반응 생성물로서 반응 중심에 형성되어 있는 조성물에 관한 것이다.
핵산은 별 유사 구조를 형성하도록 상이한 분절들이 서로 하이브리드화된 슈퍼 구조를 형성한다. 별 구조는 반응 중심 및 다수의 스템을 포함한다. 반응 중심에서, 화학적 화합물은 3개 이상의 화학적 그룹의 반응 생성물로서 제조되어 있다. 스템은 핵산 듀플렉스이며, 즉 스템은 화학적 화합물을 형성하도록 화학적 그룹의 반응에 유리한 조건 하에서 형성될 듀플렉스에 대해 충분히 서로 상보적인 2개의 하이브리드화 분절을 포함한다.
스템 중 하나 이상은 중심으로부터 방사상으로 연장된다. 적합하게는, 3개 이상의 스템이 반응 중심으로부터 밖으로 방사상으로 연장된다. 스템의 듀플렉스 핵산은 반응 근접성이 달성되도록 화학적 그룹들을 함께 모으는 것으로 믿어진다. 화학적 그룹들 사이에 확립된 근접성은 국소 농도를 증가시키고, 반응이 진행될 기회를 증가시킨다. 별 구조에서 3개 이상의 스템의 존재는 강력한 슈퍼 구조를 만들며, 이때 별 구조물은 단일 듀플렉스가 2개의 분리된 단일 스트랜드의 핵산으로 분리되는 조건에서도 안정하다. 따라서, 별 구조물은 화학적 그룹들 사이의 반응 촉진을 위해 다양한 반응 조건을 이용할 수 있다. 본 명세서에 보고된 실험에서는, 3-스템 별 구조물이 과량의 35 % 아세토니트릴 및 테트라히드로푸란 및 과량의 40% DMF를 포함하는 매질에서 유기 합성을 진행하기에 충분히 안정함을 보여준다. 본 발명의 특정 양태에서, 별 구조물은 서로 반응 중심에 연결된 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 스템을 포함한다. 스템의 수가 증가하는 경우, 별 구조물의 안정성도 증가된다.
핵산은 다양한 기능을 갖는 다양한 부분으로 분절화된다. 본 발명의 특정 양태에서, 핵산은 형성된 화학적 화합물의 반응에 참여했던 하나 이상의 화학적 그룹을 확인하는 하나 이상의 코돈을 포함한다. 코돈 분절의 존재는, 반응 근접성을 촉진하기 위해 핵산 사용을 가능하게 할 뿐만 아니라 화학적 화합물의 형성에 참여했던 화학적 그룹 중 하나 이상을 암호화할 핵산의 사용을 가능하게 한다. 하나 이상의 코돈의 존재는 탈암호화 목적에 특히 유용하다. 형성된 화학적 화합물이 소량으로 존재하거나 다른 화합물과의 혼합물로서 존재하는 경우, 분자 생물학 기술을 통해 쉽게 확인될 수 있다.
화학적 그룹을 확인하는 코돈은 별 구조물을 형성하는 핵산 중 어디에도 존재할 수 있다. 즉, 코돈은 반응 중심에 또는 인접부에, 하이브리드화 분절에, 또는 별 구조물의 다른 부분에 존재할 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서, 코돈은 스템의 말단에 위치된다. 중심으로부터 멀어지는 스템 말단에 위치되는 코돈은, 말단의 코돈이 듀플렉스의 형성 또는 반응 중심에 대한 환경 형성 참여에 반드시 필요한 것이 아니기 때문에, 핵산 별 구조물의 고안에 보다 많은 재량을 부여한다.
스템은 평활 말단화되거나, 점착 말단화되거나 루프가 존재할 수 있다. 평활 말단 또는 점착 말단 스템은, 스템을 또 다른 핵산에 결합시키고자 하는 경우 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, 루프는 스템의 말단에 형성된다. 상기 루프는 2개의 스트랜드 사이에 물리적 연결을 형성하여 핵산 슈퍼 구조물의 다양한 부분 사이에 공유적 연결을 형성한다. 특정 양태에서, 상기 루프는 고리형 핵산을 형성하도록 스템의 모든 말단에 존재한다. 또 다른 양태에서, 루프는 연속적인 핵산 서열을 형성하도록 하나의 스템을 제외한 모든 스템의 말단에 존재한다. 적합하게는, 연속적인 서열이 중합효소 또는 또 다른 핵산 활성 효소를 사용하여 핵산을 효소적으로 연장시키기 위해 프라이밍 부위(priming site)를 포함한다. 적합한 예로서, 프라이밍 부위는 루프를 갖지 않는 스템에 존재한다. 적합하게, 핵산은 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소에 대한 프라이밍 부위를 포함한다. 따라서, 루프는 형성된 화학적 화합물을 디스플레이하는 이중 스트랜드 연장 생성물의 제조를 가능하게 한다.
중요하게도, 연장 생성물은 일반적으로 선형인 듀플렉스를 포함한다. 즉, 상보적 스트랜드는 연장 반응에 의해 형성되었다. 연장 반응은 반응 중심에서의 반응에 의해 이전에 형성된 화학적 화합물이 매질에 디스플레이되도록 반응 중심을 파괴한다. 화학적 화합물의 디스플레이는 하기에서 설명되는 바와 같이 연장 생성물의 라이브러리에 다양한 선별 전략의 이용을 가능하게 한다.
선별에 이어서, 핵산의 증폭 가능성은, 핵산의 증폭이 아주 낮은 농도에서 일어나는 경우에서도 화학적 화합물이 확인될 수 있기 때문에, 확인 목적에 특히 적합하다. 연속적인 핵산 서열은 적합하게는 암호화되는 화학적 화합물의 형성에 참여했던 모든 반응물의 코돈을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 코돈은 스템-루프 구조물의 비-염기 쌍 부분에 위치된다. 코돈의 루프에의 존재는, 코돈에 대한 특정 서열이 하이브리드화 및 반응 능력에 대해 실질적 영향을 끼치지 않기 때문에, 디자인할 때 임의의 조합의 뉴클레오티드 이용을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 양상에서, 효소적 제한 부위가 스템-루프 구조물에 존재한다. 사용되는 특정 엔도뉴클레아제에 따라, 스템-루프 구조물의 하나 또는 2개의 스트랜드가 분해될 수 있다. 특정 양태에서, 루프에 가까운 스트랜드 중 단지 하나만이 닉을 형성하여 단일 스트랜드의 핵산 분절을 형성한다. 단일 스트랜드의 핵산 분절은 적합하게는 상기 코돈을 포함한다. 이러한 목적에 유용한 효소는 N. Bbvc IA이다. 또 다른 양태에서, 2개의 스트랜드가 분해되어 점착 말단, 즉 단일 스트랜드의 핵산의 돌출이 형성된다. 적합하게는, 코돈은 단일 스트랜드의 돌출부에 존재한다. 본 발명의 양상에서, 적어도 루프의 핵산 서열의 일부에 대해 상보적인 헬퍼 (helper) 올리고뉴클레오티드를 가하는 것이 바람직하다. 적합한 조건 하에서, 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 루프 서열에 하이브리드화하고, 제한 효소에 대한 기질을 형성한다.
별 구조물의 스템은 임의의 적당한 길이를 가질 수 있다. 일반적으로, 스템은 80% 이상 상보적인 2개의 하이브리드화 분절을 포함하며, 각각의 하이브리드화 분절은 12개 이상의 뉴클레오티드로 구성된다. 상보성은 일반적으로 90% 이상, 예를 들어 95% 이상이다. 하이브리드화 분절은 별 구조물의 안정성이 면제될 수 있는 특정 적용에서, 예를 들어 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나, 일반적으로 높은 안정성이 필요하다. 대부분의 조건 하에서 적합한 안정성은, 일반적으로 각각의 하이브리드화 분절이 18개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 경우 얻어진다. 하이브리드화에 불리한 조건이 이용되는 경우, 즉 온도가 주위 온도 이상이거나, 염의 농도가 높거나, 유기 용매가 존재하는 경우, 20개 이상의 뉴클레오티드의 하이브리드화 분절이 통상 이용된다.
개별적인 화학적 그룹의 반응 후, 형성된 화학적 화합물은 바람직하게는 핵산에 공유적으로 부착된다. 특정 적용에서, 별 구조물의 핵산에 형성된 화학적 화합물을 부착하기 위해 하이브리드화를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 공유 부착은 화학적 화합물 및 핵산 부분이 후속한 선별 동안 함께하는 것을 보증한다.
반응 중심에서 반응될 화학적 그룹은 임의의 적합한 방식으로 핵산과 결합될 수 있다. 예를 들어, 반응 전 화학적 그룹은 핵산에 공유적으로 부착된다. 통상적으로, 하나 이상의 공유 부착물이 반응과 동시에 또는 후속적으로 절단된다. 공유 연결은 절단가능하거나 영속적이게 고안될 수 있다. 또한, 절단가능한 연결은 반응 시 즉시 절단되거나 반응 후의 단계에서 절단되도록 고안될 수 있다.
통상적으로, 화학적 화합물은 핵산 및 임의로 하나 이상의 추가의 반응물에 부착되는 화학적 그룹의 반응에 의해 형성된다. 반응물은 핵산과 결합되지 않은 유리 반응물로서 매질에 첨가되는 화합물을 포함하여 임의의 공급원으로부터 기원할 수 있다. 추가의 반응물(들)은 스캐폴드, 가교결합제, 활성화제, 탈보호제 등일 수 있다.
본 발명에 따른 별 구조는 유전적 코드와 연합된 상이한 화학적 화합물의 라이브러리의 발생에 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 별 구조물의 라이브러리에 관한 것이다. 각각의 별 구조물은 매질 중 수개의 카피로 존재할 수 있으며, 매질은 일반적으로 상이한 화학적 화합물을 포함하는 별 구조물을 포함한다. 예로써, 본 발명의 라이브러리는 1000개 이상의 화학적 화합물, 바람직하게는 106개의 상이한 화학적 화합물, 보다 바람직하게는 109개의 상이한 화학적 화합물을 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 예를 들어 서로 상보적인 올리고뉴클레오티드에 의해 형성되는 "별-구조"를 통해 암호화 핵산과 연관된 거대 라이브러리를 합성하는 방법에 관련되는 것으로 기술될 수 있다. 이는 2개의 분절을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화하여 수득되며, 이때 하나의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 향한 분절은 다음의 올리고뉴클레오티드의 5'를 향하는 분절과 하이드리드화된다. 마지막으로, 마지막 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 향한 분절은 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 향하는 분절과 하이브리드된다. 그 결과, 각각의 올리고뉴클레오티드에 있는 2개의 하이브리드화 분절 사이의 중간부는 형성된 환의 중심을 향하며, 말단은 바깥을 향한다. 따라서, 3가지 타입의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 경우, 3개의 스템이 형성되고, 4가지 타입의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 경우 4개의 스템이 형성된다. 화학적 반응 그룹이 각각의 올리고뉴클레오티드 상의 중간부와 결합됨으로써 근접성으로 가이드된 화학적 반응이 중심에서 일어나게 한다. 또한, 코돈은 편리하게는 각각의 올리고뉴클레오티드 상의 하이브리드화된 분절에 대해 외부에 위치되어, 반응 생성물의 생성에 참여하는 화학적 그룹의 암호화를 가능하게 한다. 본 발명에서 화학적 그룹과 결합된 올리고뉴클레오티드는 캐리어 모듈로 불린다. 그 결과, 캐리어 모듈은 화학적 그룹, 2개의 위치 특이적 분절 및 코돈을 갖는다. 각각의 위치에 대한 캐리어 모듈의 레퍼토리가 사용되는 경우 암호화된 조합식 라이브러리의 형성이 가능해진다. 특정 양태에 따라, 하나의 스템을 제외한 각각의 스템에 있는 말단이 루프 형성을 통해 5' 및 3' 말단을 갖는 연속식 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 결합되는 경우, 조립된 올리고뉴클레오티드는 연장가능하거나 증폭가능하게 된다. 따라서, 하나의 스템 및 다수의 스템-루프로 이루어진 별 구조물이 PCR에 의해 증폭되거나 적합한 효소로 연장된다. 그 결과, 조합식의 디스플레이 라이브러리가 선별될 수 있으며, 농축된 라이브러리 구성물이 이들의 암호화 올리고뉴클레오티드를 통해 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상은
(i) (1) i) N 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 ii) 제2 위치의 캐리어 모듈의 분절에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는 제1 위치의 캐리어,
(2) n-1 캐리어 모듈의 핵산 분절에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 n+1 캐리어 모듈의 분절에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는 n 위치의 캐리어 모듈(들) (n은 2 내지 N-1이다), 및
(3) N-1 캐리어 모듈의 핵산 분절에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제1 캐리어 모듈의 분절에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는 N 위치의 캐리어 모듈을 포함하고,
상기 캐리어 모듈 중 3개 이상이 하이브리드화 분절 사이의 중간부나 이에 인접하게 위치되는 결합된 화학적 그룹 (CG) 및 임의로 하이브리드화 분절 중 하나에 대해 외부로 위치되는 코돈 분절을 포함하는,
N (N = 3 내지 100)개의 캐리어 모듈을 제공하는 단계;
(ii) 상기 하이브리드화 분절을 하이브리드화시키는 조건 하에 상기 캐리어 모듈을 접촉시켜, 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 모듈 중 하나 이상과 결합되는 경우, 상기 화학적 그룹을 근접시키는 단계를 포함하여, 하나 이상의 화학적 구조물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
N은 화학적 구조물의 형성에 사용되는 캐리어 모듈의 총수를 나타낸다. 따라서, 3개의 캐리어 모듈이 화학적 구조물의 형성에 사용되는 경우, N은 3이고, 4개의 캐리어 모듈이 화학적 구조물의 형성에 사용되는 경우, N은 4이다. n은 캐리어 모듈의 특정 위치를 나타낸다.
따라서, N이 3인 경우, (1) 제3 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제2 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제1 위치의 캐리어 모듈이 사용되고; (2) 제1 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제3 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제2 (n=2) 위치의 캐리어 모듈이 사용되며; (3) 제2 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제1 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제3 위치의 캐리어 모듈이 사용된다.
N이 4인 경우, (1) 제4 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제2 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제1 위치의 캐리어 모듈이 사용되고; (2) 제1 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제3 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제2 (n=2) 위치의 캐리어 모듈이 사용되며; 제2 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제4 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제3 (n=3) 위치의 캐리어 모듈이 사용되고; (3) 제3 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제1 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제4 위치의 캐리어 모듈이 사용된다.
N이 5인 경우, (1) 제5 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제2 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제1 위치의 캐리어 모듈이 사용되고; (2) 제1 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제3 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제2 (n=2) 위치의 캐리어 모듈이 사용되며; 제2 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제4 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제3 (n=3) 위치의 캐리어 모듈이 사용되고; 제3 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제5 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제4 (n=4) 위치의 캐리어 모듈이 사용되며; (3) 제4 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절 및 제1 위치의 캐리어 모듈의 분절과 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절을 갖는, 제5 위치의 캐리어 모듈이 사용된다.
이어서, 상기 방법은 모듈 n-1의 말단을 모듈 n에 결합시키고 모듈 N-1을 모듈 N에 결합시키는 조건을 제공하는 단계를 수행하여, 스템-루프 구조물 및 결합되는 화학적 화합물을 갖는 연속적인 핵산 분자를 형성한다. 따라서, N이 3인 경우, 제1 모듈의 말단은 제2 모듈의 말단에 결합되고, 제2 모듈의 말단은 제3 모듈에 결합된다. N이 4인 경우, 제1 모듈의 말단 (n=2)은 제3 모듈에 결합되고, 제2 모듈의 말단 (n=3)은 제3 모듈에 결합되며, 제3 모듈의 말단은 제4 모듈에 결합된다. N이 5인 경우, 제1 모듈의 말단 (n=2)은 제2 모듈의 말단에 결합되고, 제2 모듈의 말단 (n=3)은 제3 모듈에 결합되며, 제3 모듈의 말단 (n=4)은 제4 모듈에 결합되고, 제4 모듈의 말단은 제5 모듈의 말단에 결합된다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, N 위치의 캐리어 모듈은 제1 캐리어 모듈에 결합되어 고리형 핵산을 형성할 수 있다.
상기 방법에 따라 제조되는 핵산 구조물 및 결합된 화학적 화합물을 포함하는 조성물은, 캐리어 모듈이 선행 기술에서 제조된 구조물과 다른 새로운 "별 구조물"을 만들기 때문에, 새로운 것이다. 예를 들어, 상기 배경기술에서 논의된 선행 기술을 참조한다.
본 발명의 바람직한 양상에서, 반응의 화학적 그룹들 사이의 높은 근접성 및 화학적 화합물의 합성 내역의 전체 유전자 코드의 증폭을 보증하는 방법이 제공된다. 따라서, 바람직한 양상에서, 본 발명의 방법은 캐리어 모듈을 하이브리드화 분절의 하이브리드화를 가능하게 하는 조건 하에 접촉시켜 반응성 그룹을 반응적으로 근접시키고; 반응성 그룹을 반응시키는 조건 (이때, 형성된 화학적 화합물은 하나 이상의 캐리어 모듈과 결합된다) 및 모듈 n-1의 말단을 모듈 n에 결합시키고 모듈 N-1을 모듈 N에 결합시키는 조건을 제공하며; 이로써 스템-루프 구조물 및 결합된 화학적 화합물을 갖는 연속적인 핵산 분자를 형성하는 것을 포함한다.
바람직한 양태에 따라, N은 3, 4, 5, 6, 7이다. 또한, 각각의 캐리어 모듈은 하이브리드 분절 사이의 중간부에 위치되거나 이에 근접하게 위치되는 결합된 화학적 그룹 (CG) 및 하이브리드화 분절 중 하나에 대해 외부로 위치되는 코돈 분절을 포함하는 것이 바람직하다.
캐리어 모듈의 접촉은 연속적으로 수행, 즉 캐리어 모듈은 각각의 캐리어 모듈 사이의 임의의 순서로 접촉될 수 있거나, 동시에 수행, 즉 모든 캐리어 모듈 또는 캐리어 모듈 중 적어도 실질적인 양이 하이브리드화 조건에서 함께 혼합되어 슈퍼분자 컴플렉스를 형성할 수 있다. 화학적 그룹의 연속 반응이 수행되고 전체 별 구조물을 조립하는데 필요한 캐리어 모듈의 총량 중 단지 일 분획만이 사용되는 경우, 보조적 올리고뉴클레오티드가 별 구조물을 조립하는데 사용될 수 있으며, 이로써 반응 중심이 형성된다. 따라서, 화학적 화합물의 형성 시의 단계가 각각의 하이브리드화 분절의 하이드리드화에 의한 2개의 캐리어 모듈의 조립을 수반하는 경우, 비-하이브리드화된 하이브리드화 분절에 상보적인 분절을 갖는 보조적 올리고뉴클레오티드가 첨가되어 별 구조물을 형성할 수 있다.
캐리어 모듈에 부착되는 화학적 그룹이 반응 중심에 매우 근접하게 된 후, 반응이 수행된다. 화학적 그룹은 그룹들이 서로에 대해 반응 거리에 있게 되는 때에 즉시 반응이 일어나도록 고안되거나, 반응이 일어나는데 외부 성분이 필요하도록 고안될 수 있다. 외부 성분은 반응물, 광자, 전자기 또는 반응을 일으키는 임의의 다른 자극일 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서, 직교하는 화학적 성질이 이용될 수 있다. 즉, 화학적 그룹은 반응의 순서가 지시되도록 고안된다.
반응 중심은 상기 중심을 둘러싸는 스템에 의해 특징지어진다. 반응 중심에 있는 2개의 반응물 사이의 거리는 10 nm 미만이다. 반응 중심이 구형이라고 가정할 때, 반응물의 농도는 1 mM로 계산될 수 있다. 생물학적 견지에서, 이러한 크기의 농도는 매우 높은 것으로 간주되며, 반응이 합리적인 시간 내에 진행되는 것으로 추정될 수 있다. 또한, 반응 매질 중의 유리 반응물의 농도는, 캐리어 모듈이 조절된 몰량으로 투여되었을 때 반응 중심에서의 반응이 비-지시된 반응에 비해 상당히 유리할 정도로, 매우 낮다.
캐리어 모듈의 중간부는 임의의 적합한 화학적 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제를 사용한 효소적 연장을 위해서 캐리어 모듈의 중간부는 적합하게는 화학적 결합 또는 1 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드는 반응 중심에서 특정한 반응 조건을 수득하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 중간부의 뉴클레오티드는 결합된 화학적 그룹의 높은 이동성 및 반응성을 제공하도록 친유성 그룹으로 변형될 수 있다. 화학적 그룹은 다양한 위치에서 캐리어 분자와 결합될 수 있다. 하나의 양상에서, 화학적 그룹은 중간부의 뉴클레오염기와 결합될 수 있다. 또 다른 양상에서, 화학적 그룹은 중간부의 포스포디에스테르 연결과 결합된다.
화학적 그룹이 골격 (backbone)에 부착되는 경우, 부착점은 일반적으로 뉴클레오시드간 연결의 인광물질(phosphor)에 있다. 뉴클레오염기가 화학적 그룹의 부착에 사용되는 경우, 부착점은 통상적으로 퓨린 및 7-데아자-퓨린의 7번째 위치 또는 피리미딘의 5번째 위치이다. 뉴클레오티드는 스페이서 잔기에 의해 화학적 그룹의 반응성 그룹으로부터 거리를 둘 수 있다. 스페이서는 반응성 그룹에 의해 샘플링되는 구조적 공간이 반응 중심에 있는 또 다른 화학적 그룹의 반응성 그룹과의 반응에 최적화되도록 고안될 수 있다. 일반적으로, 화학적 그룹은 하나 이상의 공유 결합을 통해 중간부에 결합된다.
결합은 반응 전, 반응과 동시에 또는 반응 후에 수행될 수 있으며, 결합은 실험자의 선택에 따라 효소적으로나 화학적으로 수행될 수 있다. 매질 중 유리되는 비-하이브리드화 캐리어 모듈의 양을 감소시키기 위해, 일반적으로 반응 전에 캐리어 모듈을 결합시키는 것이 바람직하다.
형성된 화학적 화합물은 다양한 화학적 상호작용을 통해 핵산과 결합될 수 있다. 바람직한 양상에 따라, 형성된 화학적 화합물은 캐리어 분자 또는 연속적인 핵산 분자 중 하나 이상과 공유적으로 결합된다. 형성된 화학적 화합물과 핵산 사이의 비교적 강한 결합, 예를 들어 공유 연결은, 약한 결합, 예를 들어 수소 결합을 깰 수 있는 혹독한 조건이 바람직할 수도 있기 때문에, 라이브러리를 스크리닝하는 동안 유용하다.
본 발명의 바람직한 양상에서, 하나 이상의 캐리어 모듈은 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 위한 프라이밍 부위가 제공된다. 프라이밍 부위의 존재는 화학적 화합물의 형성 시 반응했던 화학적 그룹에 대한 유전자 코드의 증폭을 돕는다. 결합이 부재할 때, 즉 각각의 화학적 그룹에 대한 유전자 코드가 하이브리드화에 의해 한데 모아지는 실체물을 분리된 상태로 유지하는 경우, 각각의 캐리어 모듈은 프라이밍 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 라이브러리의 선별을 수행한 후, 성공적인 화학적 화합물, 즉 목적하는 특성을 갖는 화학적 화합물의 형성에 참여했던 화학적 그룹에 대한 정보를 모을 수 있다. 이러한 정보를 얻는 한가지 방법은 QPCR 또는 마이크로어레이와 조합된 표준 PCR과 같은 널리 공지된 방법을 통해 증폭 산물을 정량화하는 것이다. 라이브러리에 캐리어 모듈을 포함하는 것만이 필요하므로, 정보는 감소된 다양성을 갖는 제1 세대 라이브러리의 형성에 사용될 수 있다. 또한, 감소된 다양성은 목적하는 특성을 갖는 많은 화학적 화합물이 보다 높기 때문에 집중된 라이브러리이다.
2개 이상의 캐리어 모듈이 함께 결합되는 경우, 목적하는 특성을 갖는 화학적 화합물의 형성에 함께 참여했던 반응물의 정보를 얻는 것이 가능하다. 바람직하게는, 선형 핵산 또는 고리형 핵산을 형성하도록 모든 캐리어 모듈이 함께 결합된다. 따라서, 2개 이상의 캐리어 모듈이 함께 결합되는 경우, 2개의 코돈을 포함하는 연속적인 핵산을 증폭시키는데 단일 프라이밍 부위가 필요하다. 바람직한 양태에 따라, 본 발명의 방법은 적어도 제1 캐리어 모듈 및/또는 적어도 N 캐리어 모듈에 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소 부위에 대한 프라이밍 부위를 포함한다. 모든 캐리어 모듈이 함께 결합되는 경우, 즉 제1 캐리어 모듈이 캐리어 모듈 N에 결합되는 캐리어 모듈 n (n=2 내지 N-1)에 결합되는 경우, 프라이밍 부위가 말단 중 하나에 위치되는 경우 핵산은 연장될 수 있다. 형성된 화학적 화합물이 반응 중심에 숨는 위험을 감소시키기 위해, 선별 과정 전에 연장을 수행하는 것이 바람직하다. 연속적인 뉴클레오티드의 연장은 매질 및 이에 존재할 수 있는 임의의 표적물에 대해 형성된 화학적 화합물을 디스플레이한다.
바람직하게는, 폴리머라제 쇄 반응 (PCR)의 프로토콜에 따른 증폭을 위해 전방 (forward) 프라이머의 하이브리드화를 위한 프라이밍 부위는 말단에 위치되며, 후방 (reverse) 프라이머의 하이브리드화를 위한 프라이밍 부위는 다른 말단에 위치된다. PCR 증폭은 목적하는 특성을 갖는 구조물에 대한 유전 물질의 보다 많은 카피를 생성하도록 선별을 수행한 후 수행하는 것이 적합하다.
따라서, 본 발명의 제2 양상은 핵산 및 결합된 화학적 화합물의 구조물 또는 상기한 방법에 의해 수득 가능한 이러한 구조물 하나 초과의 라이브러리를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
화학적 화합물의 형성에 참여했던 화학적 그룹을 암호화하는 핵산과 결합된 화학적 화합물의 라이브러리는, 하나 이상의 위치에 일 레퍼토리의 캐리어 모듈을 사용하여 형성될 수 있다.
본원에 기술된 라이브러리는 목적하는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 목적하는 특성을 갖는 화합물을 발견할 가능성을 가능한 한 크게 증가시키는 라이브러리를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 특정 양상에서, 목적하는 화합물의 특성은 표적물에 결합하는 능력이다. 일반적으로, 표적 화합물에 대해 고친화성 및 특이성을 갖는 화합물을 발견할 가능성은 라이브러리 크기를 증가시킴으로써 증가되는 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명에 따른 라이브러리는 적합하게는 합성 내역을 암호화하는 핵산과 결합되는 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 또는 1014개 초과의 상이한 화학적 화합물을 포함한다.
라이브러리를 수득하기 위해, 일 레퍼토리의 캐리어 모듈이 다수의 위치에 사용될 수 있다. 본 발명의 양상에서, 하나 이상의 위치에서의 레퍼토리는 10개 이상의 상이한 캐리어 모듈을 포함한다. 특정 양상에서, 2개 이상의 위치에서의 레퍼토리는 10개 이상의 캐리어 모듈을 포함한다. 동일한 용기에 1,000,000개의 상이한 화학적 화합물의 라이브러리를 수득하기 위해서, 3개의 상이한 위치에서 100개의 캐리어 모듈을 갖는 본 발명의 복수 구조물이 형성될 수 있다. 달리 표현하면, 단지 300개의 캐리어 모듈의 합성이 1,000,000개 화합물의 라이브러리의 형성을 가능하게 한다. 유사하게, 4개의 상이한 위치에서 100개 캐리어 모듈을 갖는 100,000,000개 화합물의 라이브러리가 형성될 수 있다.
또한, 본 발명은 모듈 치환을 수행하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) N개의 하이브리드화 분절과 상보적 하이브리드화 분절 및 하이브리드화 분절과 상보적 하이브리드화 분절 사이의 N-1개의 비-하이브리드화 분절을 포함하는 단일 스트랜드의 연속적인 핵산 서열을 제공하는 단계;
b) 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 핵산을 하이브리드화하여 적어도 N-1개의 스템-루프 및 하나의 스템을 포함하는 연속적인 핵산을 형성하는 단계;
c) 상기 스템 또는 루프에 브레이크를 도입하여 적어도 코돈 분절을 포함하는 돌출부를 생성하는 단계;
d) 적어도 상기 스템에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절, 인접 스템-루프의 스템에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분절, 임의의 결합된 반응성 그룹, 및 안티-코돈 분절을 갖는 제1 그룹의 캐리어 모듈을 제공하는 단계;
d) 코돈 및 안티-코돈 분절을 하이브리드화시키는 조건을 제공하는 단계;
e) 상기 하이브리드화된 캐리어 모듈을 상기 돌출부의 역행 말단에 효소적으로나 화학적으로 결합시키는 조건을 제공하고,
i) 상기 코돈 서열에 인접한 스템-루프의 스템 또는 루프를 제한 효소로 분해하여 적어도 다음 코돈 분절을 포함하는 돌출부를 만드는 단계;
ii) 핵산을 변성시키는 단계;
iii) 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화시켜 적어도 상기의 다음 코돈 분절을 포함하는 돌출부를 갖는 N-1개의 스템-루프 및 하나의 스템을 형성하는 단계;
iv) 임의로 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 모듈 중 하나 이상과 결합되는 경우 상기 반응성 그룹을 반응시키는 조건을 제공하는 단계;
v) 적어도 상기 스템에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절, 및 인접한 스템-루프의 스템에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절을 갖고, 임의로 결합된 반응성 그룹을 갖고, 안티-코돈 분절을 갖는, 다음 그룹의 캐리어 모듈을 제공하는 단계;
vi) 하이브리드화된 캐리어 모듈을 상기 돌출부의 역행 말단에 효소적으로나 화학적으로 결합시키는 조건을 제공하는 단계를 수행하고; 단계 i) 내지 vi)를 N-1회 반복하는 단계;
f) 상기 제1 그룹의 캐리어 모듈로 부분적으로 이루어진 상기 스템-루프 구조물에 브레이크를 도입하여 적어도 상기 제1 캐리어 모듈에 연결된 상기 안티-코돈 분절은 남기는 단계;
g) 상기 핵산을 변성시키는 단계;
h) 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화시켜 N-1개의 스템-루프 및 하나의 스템을 형성하는 단계;
i) 임의로 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 모듈 중 하나 이상과 결합되는 경우 상기 반응성 그룹을 반응시키는 조건을 제공하는 단계.
단계 a)에 사용되는 연속적인 핵산 서열은 다수의 공급원으로부터 제공될 수 있다. 제1 양상에 따라, 핵산은 화학적 그룹을 수반하지 않는 모형 (dummy) 캐리어 모듈을 이용하면서 상기 방법에 의해 제공된다. 캐리어 모듈을 나타내는 이들 핵산은 함께 결합되는 경우, 선형 또는 고리형 핵산이 형성된다. 제2 양상에 따라, 단계 a)의 연속적인 핵산 서열은 형성된 화학적 화합물을 디스플레이하도록 효소적 연장 반응을 수행함으로써 수득 가능하다. 따라서, 별 구조물의 형성 후, 단일 스트랜드의 연장 생성물 또는 연장 생성물에 상보적인 스트랜드가 단계 a)에 사용될 수 있다. 필요한 경우, 다수의 핵산 카피를 증폭시키기 위해 연장 생성물에 대해 PCR과 같은 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행할 수 있다.
특정 양상에서, 단계 a), b) 또는 c)의 연속적인 핵산 서열은 고체 지지체에 PCR 생성물의 센스 스트랜드를 고정화시키고, 고체 지지체를 분리시키며, 별 구조물을 형성하도록 센스 스트랜드를 자가-하이브리드화시키고, 임의로 자가-하이브리드화된 별 구조물을 부착하는 스템을 고체 지지체와 분리시켜 고체 지지체로부터 별 구조물을 방출시킴으로써 수득된다.
센스 스트랜드를 고정화하는 적합한 방법은 센스 스트랜드를 생성하는 프라이머에 바이오틴을 부착시키는 것이다. 이어서, 센스 스트랜드를 고체 지지체, 예를 들어 스트렙트아비딘으로 커버된 비드에 부착시킬 수 있다. 고체 지지체의 특성에 따라, 다수의 방법으로 매질의 나머지로부터 분리시킬 수 있다. 현재, 자석에 의해 용이하게 분리될 수 있는 자석 비드를 사용하는 것이 바람직하다. 고체 지지체를 수회 세척한 후, 별 구조물을 형성하도록 센스 스트랜드를 자가-하이브리드화시킨다. 바람직한 양상에서, 재폴딩은 순간 냉각에 의해 수행된다. 별 구조물은 모듈 치환 동안 내내 고체 지지체에 유지될 수 있거나, 고체 지지체로부터 절단될 수 있다. 적합하게는, 고체 지지체를 부착하는 스템 및 재폴딩된 별 구조물의 절단은 제한 효소로 수행된다. 절단을 수행할 제한 효소의 능력은 실제로 분자간 폴딩을 확인하는 시험이다.
본 발명의 특정 양상에서, 루프에 있는 별 구조물을 절단하는 것이 적합할 수 있다. 대부분의 제한 효소는 단지 기질로서 이중 스트랜드의 핵산을 인식하기 때문에, 제한 효소를 사용하여 루프에서 절단하는 것이 즉각적으로 가능하지는 않다. 따라서, 본 발명은 루프에서 제한 효소에 대한 이중 스트랜드의 기질을 생성하기 위해 분해 단계 전에 루프의 서열에 상보적인 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 가하는 추가 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 목적하는 특성의 화학적 화합물을 갖는 라이브러리 구성물에 대해 라이브러리를 탐침하고; 목적하는 특성을 지니지 않는 라이브러리 구성물로부터 목적하는 특성을 갖는 라이브러리 구성물을 분할시켜 목적하는 특성을 갖는 라이브러리 구성물의 농축 푸울 (pool)을 수득하는 방법에 관한 것이다.
목적하는 특성을 갖는 라이브러리 구성물의 농축 푸울은 필요한 경우 분리되고 특징지어 질 수 있다. 그러나, 이러한 방법의 이점 중의 하나는, 농축된 푸울을 분리할 필요가 없다는 것이다. 바람직한 양태에서, 농축된 푸울은 목적하는 특성을 갖는 화학적 화합물의 합성 내역을 표시하는 유전 물질을 증가시키기 위해 핵산 증폭시킬 수 있다. 목적하는 특성을 갖는 화합물의 농축된 라이브러리를 나타내는 증폭된 핵산의 푸울은, 목적하는 특성을 갖는 화학적 화합물의 합성에 수반되었던 반응물을 확인하기 위해 탈암호화될 수 있다. 그러나, 핵산의 전량을 탈암호화하는 것이 실행가능하게 용이한 것보다 농축된 푸울이 큰 경우, 본 발명은 모듈 치환을 수행하는 상기 방법을 이용하여 농축된 라이브러리 구성물 또는 이러한 농축된 라이브러리를 나타내는 핵산에 의해 암호화되는 화학적 화합물을 재조립하는 능력을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 목적하는 특성을 갖는 라이브러리 구성물의 농축된 푸울을 증폭시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 PCR 증폭된 올리고뉴클레오티드가 분자간 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화되어 스템 및 다수의 스템-루프로 이루어진 별-구조물이 재생성되는 것을 포함한다. 루프가 없는 스템은 바람직하게는 제한 효소에 대한 인지 부위를 포함하며, 이때 제한 효소는 바깥에서 이의 인지 서열을 절단하여 분해 시 돌출부를 생성한다. 생성된 돌출부에 있는 서열의 여분은 편리하게는 코돈을 포함하는데 이용된다. 이어서, 스템의 제한 효소 분해는 이러한 제1 위치에 대해 코돈 특이적 돌출부를 생성한다. 이어서, 제한 효소 분해된 별 구조물은 제1 위치에 대한 2개의 불변 분절 및 화학적 그룹과 안티-코돈의 동종 쌍을 포함하는 일 레퍼토리의 캐리어 모듈과 하이브리드화된다. 그 결과, 코돈/안티-코돈 하이브리드화로 캐리어 모듈과 별-구조물의 적합한 쌍이 DNA 리가제에 의해 결합된다. 또한, 이웃하는 스템-루프는 제2 위치에 대한 코돈 특이적 돌출부를 남길 수 있는 또 다른 제한 효소에 대한 인지 부위를 포함한다. 이러한 제2의 제한 효소로의 분해로, 구조물의 나머지에 대한 PCR 증폭된 제1 모듈의 공유 연결을 제거한다. 별 구조물은 변성되고, 이어서 분자간 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화된다. 이로써, (결합된 화학적 그룹을 갖는) 위치 1 상에 새로운 캐리어 모듈을 갖는 별 구조물이 재생성되며, 루프가 없는 스템이 위치 2에 위치된다. 이러한 과정을 수회 수행하여 모든 위치를 치환시킴으로써 적절한 조합의 화학적 그룹에 대해 근접성으로 가이드되는 화학적 반응을 수행할 수 있다. 그 결과, 목적하는 농축이 달성될 때까지 수회의 선별 및 증폭이 수행될 수 있다.
다수의 방법, 예를 들어 제한 효소, 예를 들어 RNase, 엔도뉴클레아제 III, 엔도뉴클레아제 VIII, APE1, Fpg 또는 화학적 절단 또는 광 절단에 의해 스템에 브레이크가 도입될 수 있다.
상술된 모듈 치환 방법의 단계 a)에 사용되는 연속적인 핵산 서열은 "브리딩 (breeding)"에 의해 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 브리딩 방법은
농축된 라이브러리로부터 유도된 분자간 하이브리드화 핵산 구조물을 2개의 연속적인 제한 효소로 분해하여 문제의 모듈과 나머지 구조물 사이의 공유 결합을 제거하고,
분해된 구조물을 변성시키며,
분해된 구조물로부터의 핵산 단편 (fragment)을 재하이브리드화시킴으로써 문제의 모듈을 구체화하는 핵산 분획을 교환시켜 브리딩을 수득하고,
적합한 말단을 결합시키는 단계를 포함한다.
이러한 방법에 따라, 캐리어 모듈 또는 캐리어 모듈을 나타내는 핵산 부분이 셔플링 (shuffling)될 수 있다. 셔플링은 감수분열적인 생물학적 시스템에서의 브리딩과 유사하게 유전자 푸울을 다양화시킨다. 이 방법은 제1 세대의 라이브러리 형성에는 존재하지 않는 캐리어 모듈을 나타내는 핵산 단편을 재하이브리드화 전에 가하는 경우, 이러한 방법이 변형될 수 있다. 달리, 캐리어 모듈은 그 자체로서 재하이브리드화 전에 가해질 수 있다. 새로운 유전 물질이 유전자 푸울에 가해지는 경우, 이는 생물학적 시스템에서의 돌연변이와 유사하다. 라이브러리의 세대들 사이의 브리딩 및 돌연변이 작업의 수행 가능성은 새로운 약물 후보물에 대한 탐색에 있어 천연적 진화 과정과 눈에 띄게 유사한 진화를 가능하게 한다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 농축된 라이브러리의 다양화하여 분자 진화를 가능하게 하는 방법을 제공한다. 디스플레이 라이브러리의 증폭에 대한 상술된 공정에서, 모듈 치환을 위한 각 라운드에서의 일 분획의 라이브러리가 문제의 모듈과 나머지 구조물 사이의 공유 연결을 제거하는 2개의 연속한 제한 효소로 분해된다. 별 구조물은 변성되고 문제의 위치에 대한 일 레퍼토리의 캐리어 모듈과 하이브리드화된다. 따라서, 위치 특이적 불변 분절이 1차 라이브러리의 생성과 동등하게 하이브리드화를 가이드한다. 적합한 말단이 결합되고, 형성된 생성물은 라이브러리의 코돈 가이드되는 조립된 분획과 함께 푸울링되어 다양화를 이끈다. 그 결과, 수회의 선별, 증폭 및 다양화가 수행되어 분자 진화할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 농축된 라이브러리를 브리딩하여 분자 진화하는 방법을 제공한다. 디스플레이 라이브러리의 증폭을 위한 상술된 방법에서, 모듈 치환을 위한 각 라운드에서의 일 분획의 라이브러리가 문제의 모듈과 나머지 구조물 사이의 공유 연결을 제거하는 2개의 연속한 제한 효소로 분해된다. 별 구조물은 변성되고 하이브리드화된다. 따라서, 위치 특이적 불변 분절은 하이브리드화를 가이드하고 문제의 모듈을 교환, 즉 브리딩한다. 적합한 말단이 결합되며, 형성된 생성물은 라이브러리의 코돈 가이드되는 조립된 분획의 라이브러리와 함께 푸울링되어 다양화를 이끈다. 그 결과, 수회의 선별, 증폭, 다양화 및 브리딩이 수행되어 분자 진화할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 중합체 또는 작은 분자의 조합식 디스플레이 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 화학적 반응은, 예를 들어 직교 화학, 보호/마스킹 그룹, 캐리어 모듈이 연속 혼합 또는 CRG 없는 캐리어 모듈을 이용하여 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 촉매적 활성의 조합식 디스플레이 라이브러리를 생성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 양상에서, 캐리어 모듈은 반응적 부위 작용기와 결합하고, 별 구조물은 이들 작용기의 3차원 배열을 위한 프레임웍 (framework)을 제공한다.
상술된 양상 및 양태는 선행 기술에 비해 분명한 이점을 나타낸다. 일부를 제시하기 위해, 본 발명의 다양한 가능한 양태는 하기의 이점 중 하나 이상을 나타낸다: 1) 조합식 디스플레이 라이브러리의 조립을 위한 독특한 방법, 2) 화학적 반응의 근접성 가이드를 위한 독특한 구조, 3) 코돈 서열들이 불변 분절에 의해 반응 부위로부터 분리되어 있기 때문에 화학적 반응이 코돈 서열에 대해 고도로 독립적임, 4) 새로운 캐리어 모듈만이 결합을 촉진할 말단을 포함하기 때문에 관련 위치의 코돈만이 새로운 캐리어 모듈을 가이드할 수 있는 것과 같이, 디스플레이 라이브러리의 증폭 시의 높은 정확성, 및 5) 뜻하지 않게 부정확한 코돈/안티-코돈 가이드가 발생하는 경우, 새로운 캐리어 모듈이 CRG 및 코드를 모두 제공하는 것과 같이 암호화와 디스플레이 사이의 연합이 여전히 존재함.
핵산
본원에 기술되는 바와 같은 핵산 암호화된 화학적 합성은 조합식 디스플레이 라이브러리의 생성 및 소분자 및 비-천연 중합체와 같은 매우 다양한 화학적 화합물의 선별, 증폭 및 진화를 가능하게 한다. 핵산은 다수의 기능을 하며, 예를 들어 화학적 반응물을 한데 모으고, 화학적 반응물의 3차원 배열을 가이드하며, 화학적 합성에 대한 정보를 저장하고, 선택된 조합의 화학적 반응물의 적절한 매칭을 가이드하며, 화학적 화합물을 다양화하고 브리딩한다.
본 방법은 한번에 하나의 분자 또는 수많은 분자를 조립하는데 이용될 수 있다.
본 방법은, 목적하는 특성을 갖는 리간드에 대한 화학적 공간이 체계적으로 조사될 수 있기 때문에, 통상적인 합리적 디자인 및 조합식의 약물 개발 방법에 의해 분리되는 것들보다 뛰어난 리간드 또는 약물의 분리를 가능하게 한다.
핵산 가이드되는 화학적 합성은, 핵산 특성의 화합물에 제한될 뿐만 아니라 다양한 범위의 조건 하에서 다양한 범위의 화학적 반응을 가이드하는 것에 적용할 수 있는, 다양한 범위의 현상인 것으로 알려져 있다 (WO 2004/016767, WO 2002/074929A2). 관심의 대상인 대부분의 분자가 핵산 또는 핵산 동족체를 닮지 않기 때문에, 핵산 가이드되는 화학적 합성이 특히 중요하다. 마지막 화학적 화합물의 형성에 참여하는 화학적 그룹은 1 단계로 스캐폴드 상의 수용 화학적 실체물에 전달되거나, 화학적 그룹은 2 단계 (제 1 단계는 화학적 그룹과 수용 실체물 사이의 가교결합을 포함하고, 제2 단계는 캐리어 모듈로부터 화학적 그룹의 절단을 포함하여 전달을 완성한다)로 전달될 수 있다. 전자의 반응 유형의 예는, 활성화제로서 5원의 치환된 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 환을 부착한 캐리어 모듈이며, 즉 불안정한 결합이 NHS에 연결되는 산소 원자와 전달될 화학적 그룹 사이에 형성된다. 화학적 그룹은 수용 친핵성 그룹, 통상적으로 스캐폴드에 존재할 수 있는 아민 그룹에 전달될 수 있다. 단편의 나머지는 반응물의 이탈 그룹으로 전환된다. 화학적 그룹이 카보닐 그룹을 통해 활성화제에 연결되고 수용 그룹이 아민인 경우, 스캐폴드 상에 형성되는 결합은 아미드 결합일 것이다.
2 단계 반응의 예는 소위 알릴글리신 반응이다. 제1 단계에서, 카복실산 또는 이의 유도체를 포함하는 화학적 그룹은 친핵성 그룹, 예를 들어 아민과 반응된다. 화학적 그룹은 알릴글리신 그룹에 부착되며, 이는 제2 단계에서 요오드로 절단되어 화학적 그룹을 방출할 수 있다. 2 단계 반응 방법은 WO 2004/039825 (이의 내용이 본원에 참조로 삽입됨)에 보다 상세히 기술되어 있다. 2 단계 반응 전략의 또 다른 예가 실시예 10에 보다 상세히 기술되어 있다.
암호화 및 디스플레이의 반응 효율 및 적합한 연관을 보증하는 반응물의 근접성 가이드가 조합식 디스플레이 라이브러리의 핵산 가이드되는 합성에 대해 중요하다. 반응물의 근접성은 수종의 링커에 의해 반응물을 함께 결합시킴으로써 수득된다. 또한, 근접성은 국소 농도로서 기술될 수 있으며, 이는 링커의 길이 및 적응성에 의존적이다. 링커의 자유로운 적응성을 추정하는 경우, 국소 농도는 반경으로의 링커 길이를 갖는 구형의 용적을 이용하여 계산될 수 있다. 구의 용적을 계산하기 위한 화학식은 v = 4/3 * pi * r3이다. 그 결과, 근접성 또는 국소 농도는 링커 길이의 함수로서 3의 거듭제곱으로 떨어진다. 예를 들어, 약 10 nm의 링커 길이는 약 1 밀리몰의 농도에 상당하고, 100 nm의 링커는 약 1 마이크로몰의 농도에 상당한다. 효과적인 유기 화학이 통상적으로 밀리몰 내지 몰 농도 범위에서 수행된다. 그 결과, 화학적 반응을 효과적으로 하기 위해, 링커 길이는 10 nm 보다 길어서는 안된다.
바람직하게는, 반응성 그룹은 100 nm 미만, 보다 바람직하게는 50 nm 미만, 보다 더 바람직하게는 25 nm 미만, 보다 더욱 더 바람직하게는 10 nm 미만, 가장 바람직하게는 5 nm 미만으로 반응적으로 근접한다.
증폭을 가능하게 하는 DNA 암호화된 디스플레이 라이브러리의 단일-포트 합성에 대한 선행 기술에서는, 템플레이트의 길이 이상으로 전개되는 코돈을 사용하는 단일 스트랜드의 DNA 템플레이트가 사용된다 (WO 2004/016767, WO 2002/074929A2). 템플레이트는 일 레퍼토리의 전달 단위로부터의 적당한 안티-코돈 서열을 갖는 전달 단위를 모아 템플레이트 상의 화학적 그룹과 전달 단위를 함께하도록 하는데 중요하다. 그 결과, 단일 스트랜드의 템플레이트는 템플레이트 상의 화학적 그룹과 템플레이트에 하이브리드화될 전달 단위 상의 화학적 그룹 사이의 링커로서 작용한다. 따라서, 링커 길이 및 반응물의 국소 농도는 어떠한 코돈 위치가 이용되는가에 의존할 것이다. 예를 들어 20개의 뉴클레오시드를 갖는 폴딩되지 않은 (연장된) 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 10 nm일 것이고 (6-결합 골격의 간격은 약 0.63 nm이다), 20개의 뉴클레오시드보다 상당히 긴 200개의 뉴클레오시드는 약 100 nm의 길이일 것이다. 그 결과, 20개의 뉴클레오시드 보다 상당히 긴 폴딩되지 않은 올리고뉴클레오티드 (10 nm, 약 1 밀리몰의 농도에 상당)는 일반적으로 화학적 반응의 근접성 가이드를 만드는데 적합하지 않을 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 반응물을 근접하게 하기 위해 사용 중인 핵산의 길어진 구조를 회피한다. 이는 안정한 3차원 구조물로 폴딩될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 적합한 서열을 선택하여 많은 뉴클레오시드에 의해 분리되는 서열 위치에 의해 근접성 가이드를 가능하게 함으로써 달성된다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 이는 "별 구조물"로 하이브리드화할 수 있는 이-특이적 올리고뉴클레오티드 (서로 상보적)를 사용하여 달성된다. 이-특이적 올리고뉴클레오티드는 2개의 분절을 포함하며; 하나의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 향한 분절은 다음 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 향한 분절에 하이브리드화한다. 마지막으로, 최종의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 향한 분절은 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 향한 분절에 하이브리드화한다. 그 결과, 각각의 올리고뉴클레오티드 상의 2개의 분절 사이의 중간부는 중심을 향한다. 이러한 중간부는 결합이거나 분절일 수 있다. 이와는 대조적으로, 말단은 바깥을 향하며 이로써 별 구조물을 만든다. 따라서, 3가지 타입의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 3개의 스템이 형성되며, 4가지 타입의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 4개의 스템이 형성된다. 화학적 반응 그룹 (CRG)는 편리하게는 각각의 올리고뉴클레오티드 상의 중간부에 또는 이에 인접하게 결합된다. 따라서, 화학적 반응 그룹은 DNA 이중 나선의 직경이 약 2 nm인 것과 같이, 반응 근접성을 갖게 되어 근접성 가이드되는 화학적 반응이 중심에서 또는 이에 인접하게 발생한다.
화학적 반응은 형성된 생성물이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 결합되도록 수행된다. 또한, 코돈은 편리하게는 각각의 올리고뉴클레오티드 상의 하이브리드화된 분절 중 하나 또는 모두에 대해 외부로 위치되어 화학적 그룹의 암호화를 가능하게 한다. 결합된 화학적 그룹, 2개 위치의 특이적 하이브리드화 분절 및 코돈을 갖는 올리고뉴클레오티드를 캐리어 모듈이라 부른다.
올리고뉴클레오티드의 생성된 조합물이, 예를 들어 PCR에 의해 증폭가능하게 하기 위해서, 하나의 스템을 제외한 각각의 스템에 있는 말단은 5' 및 3' 말단을 갖는 연속적인 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위해 루프 형성을 통해 결합된다. 하나의 양상으로, 구조물은 하나의 스템 및 다수의 스템-루프 (말단에 PCR 프라이밍 부위를 가짐으로써 증폭될 수 있다)로 구성된다 (도 1d 및 도 1e). 달리, 모든 말단은 폐쇄환을 형성하도록 결합되며, 폐쇄환은 스트랜드 대체 활성 없이 DNA 폴리머라제에 의한 프라이머 연장에 의해 증폭될 수 있다.
화학적 그룹의 단계적 반응을 이용한 방법이 도 1b에 나타나 있다. 먼저, 2개의 캐리어 모듈이 하이브리드화 조건 하에 접촉된다. 캐리어 모듈 A는 하이브리드화 분절 a를 포함하며, 이는 캐리어 모듈 B의 하이브리드화 분절 a에 어닐링한다. 어닐링 단계 후, 캐리어 모듈 A 상의 화학적 그룹 CA와 캐리어 모듈 B 상의 CB 사이에 화학적 반응이 수행된다. 제3 단계에서, 캐리어 모듈 C가 하이브리드화 조건 하에 첨가된다. 캐리어 모듈 C는 하이브리드화 분절 b'를 포함하며, 이는 캐리어 모듈 B의 하이브리드화 분절 d에 상보적이다. 화학적 그룹 Cc에 대한 생성물 CA-CB의 반응 근접성은 생성물 CA-CB-CC을 생성하도록 화학적 반응을 진행시킬 수 있다. 제4의 캐리어 모듈 D가 하이브리드화 조건 하에 가해진다. 캐리어 모듈 D를 성장하는 별 구조물에 하이브리드화시켜, 반응물 CD가 이전 반응의 반응 생성물과 매우 근접하여 함으로써 최종 화학적 화합물 CA-CB-CC-CD을 생성하는 반응을 촉진시킨다.
도 1c는 개시 반응 단계가 2개의 분리된 경로를 따르는 수렴식 합성 방법이다. 제1 시리즈의 반응에서, 캐리어 모듈 A 및 B는 제1 용기에서 하이브리드화 조건 하에 별도로 접촉된다. 캐리어 모듈 A의 하이브리드화 분절 a 및 캐리어 모듈 B의 하이브리드화 분절 a'가 서로 어닐링하여, 화학적 그룹 CA와 CB 사이의 반응이 수행된다. 제2 용기에서, 캐리어 모듈 C 및 D가 하이브리드화 조건 하에 혼합되어 캐리어 모듈 C의 하이브리드화 분절 c가 캐리어 모듈 D의 하이브리드화 분절 c에 어닐링되는 하이브리드화 생성물을 형성한다. 이어서, 화학적 그룹 Cc와 화학적 그룹 CD 사이의 반응이 일어나 중간 생성물 CC-CD를 생성한다. 중간 생성물은 하이브리드화 조건 하에서 서로에게 어닝링됨으로써 별 구조물이 형성되다. 이어서, 또는 별 구조물의 형성과 동시에, 2개의 중간 반응 생성물 CA-CB과 CC-CD 사이의 반응으로 최종의 화학적 화합물 CA-CB-CC-CD를 생성한다. 단계적 또는 수렴식 합성이 수행되는 경우, 화학적 그룹의 반응 전에, 반응 중심을 형성하기 위해 보조 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이 유용할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 도 1d에 도시된 바와 같이 캐리어 모듈에 의해 제공되는 바와 같이 스템-루프 구조물에서의 루프의 형성에 관한 것이다. 달리, 루프는 도 1e에 도시되는 바와 같이 다른 올리고뉴클레오티드 또는 도 1d와 도 1e에 도시된 양태의 임의의 조합에 의해 제공되는 스템-루프의 결합에 의해 형성된다. 말단 캐리어 모듈은 PCR 증폭 부위를 포함하거나 증폭부위는 다른 올리고뉴클레오티드를 결합시킴으로써 제공될 수 있다.
도 1d에 기술된 양태는 5개 단계로 도시된다. 제1 단계에서, 4개의 캐리어 모듈 (각각 반응 그룹 R을 지님) 및 이-특이적 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화 조건 하에 접촉된다. 캐리어 모듈은 별 구조물과 평형 상태에 있다. 제2 단계에서, 하이브리드화 컴플렉스는 연속적인 핵산을 형성하도록 캐리어 모듈의 말단에서 결합된다. 별 구조물의 중심에 있는 화학적 그룹의 근접성은 반응을 촉진하며, 단계 3에서 화학적 화합물의 형성에 참여했던 화학적 그룹을 암호화하는 핵산에 연결 실체물에 의해 부착되는 반응물이 형성된다. 단계 4에서, 폴리머라제에 대한 증폭 부위가 핵산의 연장을 가능하게 하도록 별 구조물에 결합된다. 마지막 단계는 템플레이트로서 별 구조물의 핵산을 사용하여 이중 스트랜드의 DNA가 형성되었던 연장 생성물을 나타낸다.
도 1e에서는 도 1d의 양태의 변형이 도시되는데, 스템-루프가 별도로 첨가되어 별 구조물에 결합된다. 제1 단계에서, 4개의 캐리어 모듈이 혼합된다. 하이브리드화 분절의 존재 때문에, 별 구조물이 하이브리드화 조건 하에 형성된다. 하이브리드화 컴플렉스의 형성 후, 화학적 화합물을 형성하는 반응이 수행된다. 4개의 화학적 그룹의 반응에 의해 화합물을 형성한 후, 3개의 스템-루프 및 폴리머라제데 대한 증폭 부위가 첨가된다. 스템-루프 및 프라이밍 부위는 별 구조물의 돌출부에 상보적인 돌출부를 포함한다. 리가제가 첨가된 후, 연속적인 핵산을 형성하도록 스템-루프 및 증폭 부위가 별 구조물에 결합된다.
특정 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 T4 DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T RNA 리가제 또는 이. 콜라이 DNA 리가제와 같은 효소를 사용하거나 화학적 반응에 의하는 캐리어 모듈의 결합에 관한 것이다 (Shabarova et al., Nucleic Acids Res, 19, 4247-51, 1991).
캐리어 모듈-올리고뉴클레오티드 부분
본 발명에서 화학적 반응을 가이드하기 위해 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 이러한 맥락에서 올리고뉴클레오티드는, 2개 이상의 위치 특이적 하이브리드화 올리고뉴클레오티드 분절, 임의로 올리고뉴클레오티드 코돈 분절 및 반응성의 화학적 그룹을 포함하는 캐리어 모듈이라 불린다.
하나의 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 부분이 DNA, RNA 또는 이의 유사체 및 이의 임의의 조합물로 구성된 캐리어 모듈에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드 부분은, 적어도 증폭 후, 핵산 복제 및/또는 증폭을 위한 표준 프로토콜에 적합한 템플레이트일 수 있다.
캐리어 모듈은 당 기술 분야에서 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 자동화 합성기를 사용하는 고체상 합성법에 의해 제조될 수 있다. 합성 후의 올리고뉴클레오티드는 필요한 경우 당 기술 분야에 공지된 표준 커플링 화학을 이용하여 목적하는 CRG와 결합 (예를 들어, 공유적으로나 비-공유적으로 커플링)될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG의 올리고뉴클레오티드에의 결합이 하이브리드화 분절 사이의 중간부 또는 이에 인접한 캐리어 모듈에 관한 것이다. 중간부는 포스포르디에스테르 연결, 이의 유도체 또는 핵산 분절일 수 있다. 중간부의 인접부는 듀플렉스 핵산 스템 상의 위치, 바람직하게는 중간부에 가까운 위치와 관련된다. 바람직하게는, 중간부의 인접부는 20개 미만의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 10개 미만의 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 5개 미만의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 2개 미만의 뉴클레오티드와 관련된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG의 올리고뉴클레오티드에의 결합이 반응물이 반응에 근접하도록 하기에 충분히 길고 적응성이 있는 링커 또는 스페이서를 통해 일어나는 캐리어 모듈에 관한 것이다. 링커는 우선적으로는 올리고뉴클레오티드에 의해 쌍을 이루는 반응물 사이의 반응은 허용하나 쌍을 이루지 않은 실체물의 반응은 최소화하는 길이 및 조성을 갖는다. 또한, 올리고뉴클레오티드와 CRG 사이의 결합은 공유 결합을 통할 수 있다. 특정 양태에서, 공유 결합은 1 초과일 수 있다. 연결은, 예를 들어 광, 산화, 가수분해, 산에의 노출, 염기에의 노출 또는 환원에 의해 절단될 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 다양한 연결이 선행 기술 (Fruchtel and Jung, Angew Chem Int Ed Engl, 35, 17, 1996)에 기술되어 있다. 링커는 반응물의 접촉을 도우며, 특정 양태에서는 목적하는 반응에 따라 이탈 그룹으로서의 DNA의 위치를 정하고, 이때 링커는 자연적인 반응의 결과로서 절단된다. 특정 양태에서, 목적하는 상황에 따라, 반응 그룹 중의 하나의 그룹의 반응 후, 화학적 작용기를 제공할 수 있는 추가의 원자를 남기지 않는 생성물을 수득하도록 제2 반응 그룹에 부착된 링커가 절단된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG의 올리고뉴클레오티드에의 결합이 핵산의 골격을 통해 일어나는 캐리어 모듈에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG의 올리고뉴클레오티드에의 결합이 염기를 통해 일어나는 캐리어 모듈에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, CRG는 비-왓슨-크릭 (non-Watson-Crick) 수소 결합 부분에 결합된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG의 올리고뉴클레오티드에의 결합이 DNA 폴리머라제에 의해, 적어도 이의 제거 후, 판독되는 캐리어 모듈에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG의 올리고뉴클레오티드에의 결합이 비-공유결합인 캐리어 모듈에 관한 것이다. 예를 들어, 바이오틴이 올리고뉴클레오티드에 부착되고 스트렙트아비딘이 CRG에 부착되는 경우, 바이오틴과 스트렙트아비딘 사이의 상호작용은 올리고뉴클레오티드 및 CRG를 서로 비-공유적으로 결합시킨다.
캐리어 모듈-화학
넓은 범위의 화합물 및/또는 화합물의 라이브러리가 본원에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산 또는 이의 유사체가 아니거나 닮지 않은 화합물이 본 발명의 방법에 따라 합성된다. 특정한 다른 양태에서, 단백질 또는 이의 유사체가 아니거나 닮지 않은 화합물이 본 발명의 방법에 따라 합성된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 근접성으로 가이드되는 반응물의 화학적 반응에 관한 것이다. 예를 들어, 직교 화학의 이용에 의해, 또는 직교 보호/마스킹 그룹의 이용에 의해, 또는 연속적 조립 및 캐리어 분자의 반응에 의한다.
환 형성 없이 캐리어 모듈의 조립, 즉 연속적인 핵산의 형성은, 이중 나선의 직경이 약 2 nm이어서 반응 근접부 내에 수개의 연속적인 CRG를 위치시키는 것과 같이, 스스로 적합하게 위치된 CRG를 근접시킬 수 있다. 반응 조건, 링커, 반응물 및 반응 부위는 비-올리고뉴클레오티드 가이드된 반응을 피하고 올리고뉴클레오티드 가이드된 반응을 가속시키도록 선택된다. 캐리어 분자의 연속적 또는 동시적 접촉은 합성될 특정 화합물에 따라 이용될 수 있다. 특별히 주목되는 특정 양태에서, 컴플렉스 화학적 화합물의 다수-단계 합성을 촉진하도록 3개 이상의 캐리어 분자가 연속적으로 접촉되는 화학적 화합물의 다수-단계 합성이 고려된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 많은 종래의 유기 합성에 이용되는 농도 보다 낮은 농도의 캐리어 모듈의 사용을 가능하게 하는 캐리어 모듈의 어닐링에 관한 것이다. 따라서, 캐리어 모듈은 서브밀리몰 농도로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 캐리어 모듈의 농도는 100 마이크로몰 미만, 보다 바람직하게는 10 마이크로몰 미만, 보다 더 바람직하게는 1 마이크로몰 미만, 보다 더 바람직하게는 100 나노몰 미만, 가장 바람직하게는 10 나노몰 미만으로 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CRG 형성 소분자 또는 중합체에 관한 것이다. 중합체 또는 소분자를 합성하기 위한 공지된 화학 반응이 본 발명의 실시예 이용될 수 있다. 선택된 반응은 바람직하게는 핵산, 예를 들어 DNA 및 RNA 또는 이의 유사체와 양립할 수 있다. 유용한 반응은, 예를 들어 치환 반응, 탄소-탄소 결합 형성 반응, 제거 반응 및 부가 반응을 포함한다.
CRG 또는 반응물은 다양한 시약을 포함하고, 화학 기술 분야에서 공지된 어떠한 화학적 그룹 또는 반응적 잔기 (예: 친전자체, 친핵체)일 수 있다. 본 발명의 방법을 이용한 소분자의 합성 시, 캐리어 모듈은 연관되는 스캐폴드를 가질 수 있으며 스캐폴드 상에서 소분자가 조립될 수 있다. 스캐폴드는 작용화를 위한 2개 이상의 부위를 갖는 임의의 화학적 화합물일 수 있다. 상기 부위는 당 기술 분야에 공지된 방법 및 보호 그룹에 의해 보호될 수 있다. 보호 그룹은 이들이 개별적으로 제거될 수 있도록 서로에 대해 직교할 수 있다. 스캐폴드를 변형하기 위한 반응물은, 예를 들어 친전자체 (예: 아세틸, 아미드, 산 할라이드, 에스테르, 이민), 친핵체 (예: 아민, 히드록실 그룹, 티올) 또는 측쇄일 수 있다.
특정 양태에서, 중합체, 특히 비천연 중합체가 본 발명에 따라 합성될 수 있다. 본 발명의 방법 및 시스템을 이용하여 합성될 수 있는 비천연 중합체는 임의의 비천연 중합체를 포함한다. 예를 들어, 비천연 중합체는, 이로 제한됨이 없이, 펩티드 핵산 (PNA) 중합체, 폴리카바메이트, 폴리우레아, 폴리에스테르, 폴리아크릴레이트 (예: 폴리에틸렌, 폴리프로필렌), 폴리카보네이트, 비천연 입체화학을 갖는 폴리펩티드, 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 배합물을 포함한다. 특정 양태에서, 중합체는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25개 이상의 단량체 단위를 포함한다. 특정 양태에서, 단량체 단위는 이량체, 삼량체 또는 사량체 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 본 발명의 시스템을 이용하여 합성되는 중합체는, 예를 들어 촉매, 의약물 또는 진단적 친화성 리간드로서 사용될 수 있다. 특정한 비천연 중합체를 제조하는데 있어, 단량체 단위는 캐리어 모듈에 부착된다. 단량체 단위는, 예를 들어 카바메이트, D-아미노산, 비천연 아미노산, PNA, 우레아, 히드록시산, 에스테르, 카보네이트, 아크릴레이트, 또는 에테르일 수 있다. 특정 양태에서, 단량체 단위는 단량체 단위를 성장하는 중합체 쇄에 연결하는데 사용되는 2개의 반응성 그룹을 갖는다. 바람직하게는, 2개의 반응성 그룹은 단량체 단위가 방향적 패션 (directional fashion)으로 중합체에 삽입될 수 있도록 동일하지 않아야 한다. 예를 들어 하나의 말단은 친전자체일 수 있고, 다른 말단은 친핵체일 수 있다. 반응성 그룹은, 이로 제한됨이 없이, 에스테르, 아미드, 카복실산, 활성화된 카보닐 그룹, 산 할라이드, 아민, 히드록시 그룹 및 티올을 포함한다. 특정 양태에서, CRG가 탈보호되는 경우 목적하는 시간까지 중합화가 일어날 수 없도록 CRG는 마스킹되거나 보호된다 (Green et al (1999) Protective Groups in Organic Synthesis 3r Edition, Wiley). 일단 단량체가 캐리어 모듈 조립을 통해 모이게 되는 경우, 중합화의 개시로 중합화 및 탈보호 단계 (여기서, 중합화는 후속하는 중합화 단계에 사용될 반응성 그룹을 탈보호한다)의 케스케이드가 발생한다. 중합화될 단량체 단위는 2개 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 단량체 단위는 당 기술 분야에 공지된 어떠한 화학적 그룹도 포함할 수 있다. 반응적인 화학적 그룹은, 특히 중합화, 하이브리드화 등을 방해하는 그룹은 바람직하게는 공지된 보호 그룹을 사용하여 마스킹된다 (Green et al (1999) Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, Wiley). 일반적으로, 이들 반응성 그룹들을 마스킹하기 위해 사용되는 보호 그룹은 중합화 단계에 사용된 그룹들을 보호하는데 사용되는 그룹들에 대해 직교한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 반응적 부위가 모든 화학 반응에 대해 동일한 캐리어 모듈과 결합되는 캐리어 모듈에 관한 것이다. 예를 들어, 소분자 스캐폴드는 하나의 캐리어 모듈과 결합되고, 나머지 캐리어 모듈은 스캐폴드를 변형시키는 실체물을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 반응 부위가 화학 반응 동안 위치를 이동하는 캐리어 모듈에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 적어도 제거 후 DNA 폴리머라제에 의한 판독을 유지하는, 형성된 화학적 화합물의 올리고뉴클레오티드에의 결합에 관한 것이다.
조합식 라이브러리의 제조
종래의 라이브러리 합성과 핵산 가이드되는 라이브러리 합성의 중요한 차이는 각각의 조작의 규모이다. 스크리닝 및 화합물 확인에 필요한 물질의 양 때문에, 종래의 조합식 합성은 통상적으로 라이브러리 구성물 당 나노몰 내지 마이크로몰 규모로 진행한다. 이와는 달리, 핵산 가이드되는 라이브러리 합성은 단지 매우 소량으로 (예를 들어 약 10-20 mol) 각각의 핵산-연결된 합성 분자가 선별 및 PCR 증폭에 필요하기 때문에 펨토몰 내지 피코몰 크기로 일어날 수 있다. 핵산 가이드되는 라이브러리에서 단일 용액 포맷과 조합되는 규모의 큰 차이는 필요한 물질의 제조를 상당히 단순화시킨다.
하나의 양태에서, 본 발명은 조합식 디스플레이 라이브러리이 형성에 관한 것이다. 라이브러리는 일부 또는 모든 위치에서 캐리어 모듈의 레퍼토리들을 사용하여 생성될 수 있다 (도 2a). 제1 단계에서, 각각의 위치에 대해 일 레퍼토리의 캐리어 모듈이 제공된다. 캐리어 모듈이 하이브리드화 조건 하에 혼합되는 경우, 이들은 하이브리드화 분절의 서열에 의해 지시되는 별 구조물로 조립될 것이다. 캐리어 모듈의 조립 후, 결합 및 반응이 임의의 순서로 수행된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 결합은 별 구조물의 안정성을 증가시키기 위해 반응 전에 수행된다. 근접성 가이드되는 반응에 후속하여, 폴리머라제 증폭부위가 별 구조물에 결합되고 연장 반응이 수행되어 형성된 화학적 화합물을 외부 환경으로 디스플레이한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 소분자 및 중합체의 라이브러리가 본원에 기술된 원리를 이용하여 합성될 수 있다. 그 결과, 조합식 디스플레이 라이브러리는 선별되고 농축된 라이브러리 구성물이 이들을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 통해 확인될 수 있다.
상황에 따라, 2개 이상의 위치에 대한 캐리어 모듈이 레퍼토리들이 초기에 조합되어 부착된 CRG 사이의 핵산 가이드되는 화학적 반응이 수행된다. 상황에 따라, 라이브러리는 다수의 화학적 반응에 의해 형성될 수 있으며, 이때 각각의 중간체 생성물은 후속 라운드의 반응 전에 정제된다. 바람직하게는, 20개 미만의 화학적 단계가 라이브러리의 생성에 필요하다. 또 다른 양태에서, 10개 미만의 화학적 단계가 필요하며, 보다 바람직하게는 3 내지 9개의 단계가 라이브러리의 생성에 필요하다.
선별
목적하는 활성 (예를 들어, 촉매 활성, 결합 친화성, 결합 특이성 또는 활성 어세이에서이 특정 효과)을 갖는 반응 생성물의 선별 및/또는 스크리닝은 임의의 표준 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 친화성 선별 (도 3)은 파즈 디스플레이 (Smith, Science, 22S, 1315-7, 1985), 리보좀 디스플레이 (Hanes et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 14130-5, 1998), mRNA 디스플레이 (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 12297-302, 1997) 또는 DNA 암호화된 화학적 라이브러리 (WO 2004/016767, WO 2002/074929A2)와 같은 라이브러리-기초된 방법에서 원칙에 따라 수행될 수 있다. 촉매 활성에 대한 선별은 예를 들어 전이 상태의 유사체 친화성 컬럼에서 친화성 선별 (Baca et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 10063-8, 1997)에 의하거나 작용 기초된 선별 계획 (Pedersen et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 10523-8, 1998)에 의해 수행될 수 있다. 매우 소량의 DNA (약 100개 분자)가 PCR에 의해 증폭될 수 있기 때문에, 이들 선별은 이러한 크기의 규모에서 수행되어 목적하는 활성에 대한 실제로 광범위한 조사를 경제적이고 효과적으로 가능하게 할 수 있다.
디스플레이 라이브러리는 표적 분자의 결합에 대해 선별되거나 분할될 수 있다. 이러한 맥락에서, 선별 또는 분할은 표적 분자에 결합된 라이브러리 구성물이 표적 분자에 결합되지 않은 라이브러리 구성물로부터 분리되는 임의의 과정을 의미한다. 선별은 당 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 대부분의 적용에서, 표적 분자에 대한 결합은 선별적이어서, 표적 분자에 대한 결합은 다른 결합 사건 보다 선호된다. 궁극적으로, 본 발명을 이용하여 확인되는 결합 분자는 치료제 및/또는 진단제로서 유용할 수 있다.
선별 전략은 대부분의 임의의 표적물에 대한 선별이 가능하게 수행될 수 있다. 중요하게도, 선별 전략은 표적 분자 또는 디스플레이 라이브러리의 구성물에 대한 어떠한 상세한 구조적 정보를 필요로 하지 않는다. 전 과정은 지정된 표적 분자에 결합하는 라이브러리 구성물에 수반되는 결합 친화성 및 특이성에 의해 유도된다.
선별된 라이브러리 구성물은 표준 분자 생물학을 이용하여 이들의 암호화핵산을 통해 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명은 임의의 공지된 표적 분자에 대한 결합 분자를 광범위하게 확인할 수 있다. 또한, 선별된 라이브러리 구성물의 결합 분자를 분리함으로써 새로운 미지의 표적물을 발견하고 표적 분자의 확인 및 입증을 위해 이들을 사용할 수 있다.
디스플레이 라이브러리로부터 결합 분자를 선별하는 것은 결합 라이브러리 구성물을 확인하기 위한 임의의 포맷으로 수행될 수 있다. 결합 선별은 통상적으로 목적하는 표적 분자를 고정화시키고, 디스플레이 라이브러리를 가하며, 결합시키고, 세척에 의해 비결합물/약한 결합물을 제거하는 것을 수반한다. 표적물에 결합되어 있는 농축된 라이브러리는, 예를 들어 산, 카오트로픽 염, 열, 공지된 리간드를 사용한 경쟁적 용출, 고염, 염기, 표적물의 단백분해 방출, 핵산의 효소적 방출로 용출될 수 있다. 임의의 양태에서, 용출된 라이브러리 구성물은 동일하거나 보다 엄격한 조건을 이용하거나 상이한 결합 포맷을 이용하여 보다 많은 라운드의 결합 및 용출을 수행함으로써 농축이 증가될 것이다. 다른 양태에서, 결합 라이브러리 구성물은 표적물로부터 용출되지 않는다. 세포 표면에 발현되는 단백질, 예를 들어 이온 채널 또는 트랜스막 수용체에 결합하는 라이브러리 구성물을 선별하기 위해서, 세포 자체를 선별제로서 사용할 수 있다. 선별 절차는 또한 결합 분자와 함께 수용체가 세포질, 핵, 또는 기타 세포 구획물, 예를 들어 골지체 또는 리보좀을 통과하도록 내화되는 세포 표면 수용체에 대한 결합을 선별하는 것을 수반할 수 있다. 문제의 구획물의 분리는 내화되지 않은 라이브러리 구성물로부터 내화되는 라이브러리 구성물을 분할시킨다 (Hart et al., J Biol Chem, 269, 12468-74., 1994). 선별 절차는 또한 생체 내 선별을 수반할 수 있다. 예를 들어, 생체 내 기관 표적화에 의해, 라이브러리가 동물로 주사되고, 관심이 되는 기관을 분리한 후, 그러한 기관에 표적된 라이브러리 구성물의 농축 푸울을 수득한다 (Pasqualini and Ruoslahti, Nature, 380, 364-6, 1996). 농축된 라이브러리의 핵산 부분은, 예를 들어 PCR에 의해 증폭되어, 많은 차수의 증폭을 이끌고, 예를 들어 클로닝 및 DNA 서열분석에 의한 확인을 가능하게 한다.
도 3에 도시된 친화성 선별을 위한 특정 양태에 따라, 도 2a에 도시된 양태로부터 생기는 반응 생성물의 라이브러리를 결합 조건 하에 표적물에 접촉시킨다. 형성된 화학적 화합물 중 하나 이상이 표적물에 대해 친화성을 갖는 경우, 결합이 발생할 것이다. 후속 단계에서, 결합 라이브러리 구성물 또는 이로부터 유도되는 핵산이 분할된다. 이어서, 형성된 화학적 화합물에 부착된 핵산은, 예를 들어 목적하는 친화성을 디스플레이하는 화합물이 합성 내역을 암호화하는 다수 카피의 핵산을 생성하도록 PCR에 의해 증폭된다. 증폭된 핵산은 성공적인 화합물의 형성에 참여했던 화학적 그룹을 탈암호화하는 다수의 널리 공지된 기술에 의해 분석될 수 있다. 달리, 증폭된 핵산은 다음 세대의 라이브러리의 형성을 위해 사용될 수 있다.
기타 선별
다른 특성, 예를 들어 촉매적 또는 다른 작용 활성에 대한 선별도 수행될 수 있다. 일반적으로, 선별은 목적하는 활성을 갖는 라이브러리 구성물이 다른 라이브러리 구성물로부터 분리될 수 있도록 고안되어야 한다. 예를 들어, 결합 절단을 촉매하는 능력을 갖는 라이브러리 구성물에 대한 선별은 문제의 결합에 의해 각각의 라이브러리 구성물에 부착된 바이오틴을 가짐으로써 수행될 수 있다. 이때 스트렙트아비딘을 사용하는 분할은 다른 것들로부터 촉매 활성을 갖는 라이브러리 구성물을 분리시킬 수 있다. 또 다른 예는 결합 형성 능력을 갖는 라이브러리 구성물에 대한 선별이다. 이는 기질을 각각의 라이브러리 구성물에 부착시킨 후 바이오틴이 부착된 기질을 가하여 수행될 수 있다. 결합을 형성하는 2개의 기질 사이의 반응은 바이오틴을 촉매적 라이브러리 구성물에 부착시킬 것이다. 이어서, 스트렙트아비딘을 사용한 분할로 다른 것들로부터 촉매적 활성을 갖는 라이브러리 구성물을 분리시킬 수 있다. 다른 특성, 예를 들어 이량체화 및/또는 중합화에 대한 선별도 수행될 수 있다. 이러한 경우, 라이브러리 구성물은, 예를 들어 HPLC, 아크릴아미드 또는 아가로즈 겔 또는 크기 배제 컬럼을 사용하여 형성된 컴플렉스의 크기에 의해 분할될 수 있다.
핵산 증폭
농축된 라이브러리 구성물의 핵산 부분의 증폭은 핵산 증폭을 위한 표준 프로토콜에 의해 수행될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 폴리머라제 쇄 반응 (PCR) (Saiki et al., Science, 230, 1350-4, 1985), 핵산 서열에 기초한 증폭 (NASBA) (Compton, Nature, 350, 91-2, 1991), 스트랜드 대체 증폭 (Nycz et al., Anal Biochem, 259, 226-34, 1998), 자가-지지된 서열 복제 (Mueller et al., Histochem Cell Biol, 108, 431-7, 1997), 프라이머 연장, 및 플라스미드 증폭 (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory)을 포함한다.
모듈 치환에 의한 디스플레이 라이브러리의 조립
하나의 양태에서, 본 발명은 농축된 라이브러리 구성물 또는 디스플레이를 재생성하기 위한 농축된 라이브러리 구성물의 제1 세대 라이브러리의 재조립/증폭에 관한 것이다. 농축된 라이브러리의 경우, 농축된 디스플레이 라이브러리가 형성되어 수회 라운드의 선별 및 증폭 및 재조립을 가능하게 한다. 예를 들어, 도 4a에 도시된 바와 같이, 농축된 라이브러리 구성물의 상술된 PCR 증폭된 올리고뉴클레오티드가 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화되어 하나의 스템 및 다수의 스템-루프로 구성된 별 구조물이 재생성된다. 루프가 없는 스템은 다의의 (ambiguous) 염기(들)을 갖는 돌출부를 생성하는 제한 효소에 대한 인지 부위를 포함한다. 생성된 돌출부에 있는 서열의 다의의 염기(들)은 편리하게는 코돈을 포함하도록 이용된다. 따라서, 스템의 제한 효소 분해는 제1 위치에 대한 코돈 특이적 돌출부를 생성한다. 이어서, 제한 효소 분해된 별 구조물은 제1 위치에 대해 2개의 불변 분절 및 CRG와 안티-코돈의 동종 쌍을 포함하는 일 레퍼토리의 캐리어 모듈과 하이브리드화된다. 그 결과, 코돈/안티-코돈 하이브리드화는 캐리어 모듈과 별 구조물의 적합한 쌍을 결합시킨다. 또한, 이웃하는 스템-루프는 제2 위치에 대한 코돈 특이적 돌출부를 남길 수 있는 또 다른 제한 효소에 대한 인지 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 제2 제한 효소를 사용한 분해는 구조물의 나머지에 대한 PCR 증폭된 제1 모듈의 공유 연결을 제거한다. 별 구조물은 변성되며, 이어서 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화된다. 이로써 (CRG와 함께) 위치 1에 새로운 캐리어 모듈을 갖는 별 구조물이 재생성되고, 루프가 없는 스템이 위치 2에 위치된다. 수회 라운드의 이러한 과정을 수행하여 모든 위치를 치환하고, 적절한 조합의 CRG에 대한 근접성 가이드되는 화학 반응을 일으키며, 이로써 디스플레이 라이브러리를 증폭시키고 재조립한다. 마지막으로, PCR 프라이밍 부위를 별 구조물에 결합시킬 수 있다. 그 결과, 목적하는 농축이 달성될 때까지 수회 라운의 선별 및 증폭 및 재조립을 수행할 수 있다 (도 5 참조).
하나의 양태에서, 본 발명은 제한 효소에 의해 생성되는 코돈 특이적 돌출부의 형성에 관한 것이다. 적합한 제한 효소는 하나 초과의 특이적 서열을 갖는 돌출부를 형성할 수 있다. 이러한 효소는 i) 인지 서열에 다의의 염기를 갖는 제한 효소, ii) 인지 서열을 밖에서 절단하는 제한 효소 및 iii) 닉을 형성하는 제한 효소 (닉화 엔도뉴클레아제)를 포함한다. 이러한 제한 효소의 예는 AlwNI, ApaBI, Asul, Bbvl, BbvII, BccI, Bce83I, BcefI, BciVI, BglI, Binl, BseMII, BseRI, Bsgl, BsiYI, BsmAI, BspMI, BsrDI, BstEII, BstXI, BtgZI, DdeI, DraII, DraIII, DrdI, Eaml 105I, EciI, Eco31I, Eco57I, Eco57MI, EcoNI, EspI, Esp3I, Fnu4HI, Fokl, Gsul, HinfI, Hpyl78III, Hpyl88I, Ksp632I, Maelll, MboII, MmeI, Mwol, PflMI, PfoI, PIeI, SapI, SauI, ScrFI, SecI, SfaNI, SfiI, Sth132I, Tsp4CI, TspDTI, TspGWI, TspRI, Tth111I, Tth111II, Xcml, N.AlwI, N.BstNBI, N.BbvCIA 및 N.BbvCIB를 포함한다.
돌출부의 암호화 용량 (가능한 상이한 코돈의 수)는 제한 효소에 의해 생성되는 돌출부에 있는 다의의 염기의 수에 의해 지정된다. 따라서, 모든 N (N = A, T, G 또는 C)에 대해 4개의 상이한 잔기가 선택될 수 있으며, 모든 H (H = A, C 또는 T), V (V = A, C 또는 G), B (B = C, G 또는 T) 및 D (D = A, G 또는 T)에 대해 3개의 상이한 잔기가 선택될 수 있고, 모든 R (R = A 또는 G), K (K = G 또는 T), Y (Y = C 또는 T), S (S = C 또는 G) 및 M (M = A 또는 C) 및 W (W= A 또는 T)에 대해 2개의 상이한 잔기가 선택될 수 있다. 그 결과, 암호화 용량은 서로에 대해 각각의 위치에 있는 상이한 잔기들의 수를 곱함으로써 계산된다. 예를 들어, Sfi I;
5'-...GGCCNNNN/NGGCC...-3'
3'-...CCGGN/NNNNCCGG...-5'
는 돌출부 5' -NNN -3'를 생성하여, 3개의 N으로 이루어짐으로써 64 64 ( = 4 x 4 x 4)의 암호화 용량을 갖는다.
또 다른 예로서, Ava II;
5'-...G/GWCC...-3'
3'-...CCWG/G...-5'
는 돌출부 5' -GWC -3'를 생성하여 2의 암호화 용량을 갖는다.
또 다른 예로서, Bbs I;
5'-...GAAGACNN/NNNN...-3'
3'-...CTTCTGNNNNNN/...-5'
는 4개의 N으로 이루어진 돌출부를 생성함으로써 256 ( = 4 x 4 x 4 x 4)의 암호화 용량을 갖는다.
특정 그룹의 제한 효소는 단지 단일 스트랜드를 절단하는 제한 효소 (닉화 엔도뉴클레아제)이다. 이들 효소는 원칙적으로 무한한 암호화 용량을 갖는다; 예를 들어 i) 인지 서열이 스템-루프 구조의 스템에 위치되거나, ii) 말단 돌출부를 생성하는데 사용되거나, iii) 또 다른 제한 효소와 조합되는 경우이다. 이는 생성되는 돌출부의 길이가 윈칙적으로 무한한 길이일 수 있기 때문이다.
예를 들어 스템-루프 구조물의 스템에 위치되는 N. BbvC IA
5'-...CC/TCAGCNNN
⊃
3'-...GGAGTCGNNN
의 분해로
5'-...CC-3'
3'-...GGAGTCGNNNNNNCGACT-5'
가 생성된다. 이러한 예에서, 6개의 N이 형성된 돌출부에 존재하므로, 1024 (= 4 x 4 x 4 x 4 x 4 x 4)의 암호화 용량이 제공된다. 그러나, N의 수가 임의로 선택될 수 있기 때문에 무한한 암호화 용량이 제공되는 것이 분명하다. 이러한 예에서 가능한 서열의 전체수 중 소분획은 사용될 수 없다. 즉, 사용 중인 제한 효소의 인지 부위를 형성하는 서열.
또한, 닉화 엔도뉴클레아제는 임의 길이의 말단 돌출부를 생성할 수 있다. 예를 들어,
N.BbvC IA
5'-...CC/TCAGCNNNNNNNN-3'
3'-...GGAGTCGNNNNNNNN-5'
의 분해로
5'-...CC-3'
3'-...GGAGTCGNNNNNNNN-5'
및
5'-TCAGCNNNNNNNN-3'
이 생긴다. 이러한 예에서, 8개의 N이 형성된 돌출부에 존재하므로 65536 (= 48)의 암호화 용량을 제공한다. 그러나, N의 수가 임의로 선택될 수 있어 무한한 암호화 용량을 제공하는 것이 분명하다. 이러한 예에서 가능한 서열의 전체수 중 소분획은 사용될 수 없다. 즉, 사용 중인 제한 효소의 인지 부위를 형성하는 서열.
또한, 제한 효소와 조합하여 닉화 엔도뉴클레아제를 사용하여 스템-루프 구조물에 대한 어떠한 제한도 없이 임의 길이의 돌출부를 생성할 수 있다. 예를 들어, Eco RI과 조합된 N. BbvC IA
5'-...CC/TCAGCNNNNNNNNG/AATTC...3'
3'-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA/G...-5'
의 분해로
5'-...CC-3'
3'-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA-5'
및
5'-TCAGCNNNNNNNNG-3'
및
5'-AATTC-3'
3'-G-5'
이 생긴다. 이러한 예에서, 8개의 N이 형성된 돌출부에 존재하므로 65536 (= 48)의 암호화 용량을 제공한다. 그러나, N의 수가 임의로 선택될 수 있어 무한한 암호화 용량을 제공하는 것이 분명하다. 이러한 예에서 가능한 서열의 전체수 중 소분획은 사용될 수 없다. 즉, 사용 중인 제한 효소의 인지 부위를 형성하는 서열.
코돈 분절의 길이가 다양할 수 있지만, 코돈 분절은 1 내지 50개 뉴클레오티드, 1 내지 40개, 1 내지 30개, 1 내지 15개, 1 내지 10개 뉴클레오티드의 코돈 분절일 수 있으며, 우선적으로는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드 길이이다.
스템 형성 분절의 길이가 다양할 수 있지만, 스템 분절은 우선적으로는 5 내지 50개 뉴클레오티드, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 15개, 5 내지 10개 뉴클레오티드일 수 있다. 그러나, 스템 분절은 우선적으로는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드의 길이이다.
스템 형성 분절 사이의 중간부의 길이는 다양할 수 있다. 중간부는 우선적으로는 단일 포스포디에스테르 결합 (또는 유사체 결합) 내지 20개 뉴클레오티드의 스트레치일 수 있다. 그러나, 중간부는 우선적으로는 단일 포스포디에스테르 결합 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드 길이이다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 제한 효소 분해 후 별 구조물을 5' 포스페이트를 제거하는 포스파타제로 처리하여 별 구조물의 결합을 방지하는, 디스플레이 라이브러리의 재조립/증폭 방법에 관한 것이다. 몇몇의 적합한 포스파타제가 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 남극 (antarctic) 포스파타제 및 송아지 장 알칼리 포스파타제가 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 캐리어 모듈이 별 구조물에 대한 결합을 용이하게 하기 위해 5' 포스페이트를 포함하는, 디스플레이 라이브러리의 재조립/증폭 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 캐리어 모듈이 별 구조물에 결합 후 포스포릴화되는, 디스플레이 라이브러리의 재조립/증폭 방법에 관한 것이다. 이는 유리 캐리어 모듈 사이의 결합을 방지한다.
특정 양태에서, 본 발명은, PCR 증폭된 별 구조물의 5' 말단이 제한 효소, 예를 들어 RNase, 엔도뉴클레아제 III, 엔도뉴클레아제 VIII, APEl, Fpg, 화학적 절단 또는 광 절단 이외의 다른 수단에 의해 생성되는, 디스플레이 라이브러리의 재조립/증폭 방법에 관한 것이다. PCR 생성물은 5' 말단의 프라이머 및 DNA 폴리머라제에 의해 생성되는 나머지 서열로 구성된다. 프라이머는 DNA 폴리머라제에 의해 형성되는 분절에서는 발견되지 않는 잔기, 예를 들어 dUTP 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 규정된 말단을 생성할 적합한 수단에 의해 특이적으로 인지되고 생성될 수 있다 (Smith et al., PCR Methods Appl, 2, 328-32, 1993).
하나의 양태에서, 본 발명은 디스플레이 라이브러리의 재조립/증폭 방법에 관한 것이다. PCR 증폭된 농축 라이브러리 말단은 별 구조물의 형성 전에 상술된 방법에 의해 변형될 수 있다.
다양화
하나의 양태에서, 본 발명은 디스플레이되는 화합물 또는 디스플레이되는 화합물의 라이브러리를 다양화하여 분자 진화를 가능하게 하는 방법을 고려한다. 이는 본 발명의 범위를 넘지 않으면서 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어 (도 4b 참조), 일 라운드의 모듈 치환에 있는 분자의 일 분획을 2개의 연속적인 제한 효소로 분해하여 문제의 모듈과 나머지 구조물 사이의 공유 연결을 제거시킨다. 별 구조물이 변성되며 문제의 위치에 대한 일 레퍼토리의 캐리어 모듈과 하이브리드화된다. 따라서, 위치 특이적 불변 분절이 제1 라이브러리가 생성되었던 방식으로 하이브리드화를 가이드한다. 적합한 말단을 결합시키고, 형성된 생성물을 코돈 가이드되는 조립된 분획과 함께 푸울링하여 다양화를 이끈다. 이는 일, 수회 또는 모든 라운드의 모듈 치환에서 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 모듈 치환을 위한 일 라운드의 분자의 일 분획에 대해, 예를 들어 엑소뉴클레아제에 의해 문제의 위치에 대한 코돈 특이적 돌출부를 제거한다. 이어서, 문제의 위치에 대한 일 레퍼토리의 캐리어 모듈이 하이브리드화되고 결합된다. 이때 형성된 비-코돈 가이드되는 생성물을 코돈 가이드되는 조립된 분획과 함께 푸울링하여 다양화시킨다. 이는 일, 수회 또는 모든 라운드의 모듈 치환에서 수행될 수 있다.
또한, 모듈 치환 과정 전에 라이브러리 구성물 사이의 모듈의 셔플링 (shuffling)/재조합 (브리딩: breeding)에 의해 다양화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 농축된 라이브러리 구성물의 핵산 부분을 증폭하고, 불변 분절(들)에서의 제한 효소 절단으로 분해하여 2개 이상의 분절을 생성한다. 이 단편을 다른 라이브러리 구성물로부터 기원하는 단편과 결합시켜 전체 길이의 생성물을 형성함으로써, 이로써 셔플링/재조합이 발생된다. 셔플링/재조합 방법에 대한 또 다른 예는 별 구조물을 사용하는 것이다 (도 4b 참조). 별 구조물을 2개의 연속적인 제한 효소로 분해시키고, 변성시키며, 하이브리드화시켜 문제의 모듈을 교환한다. 그 결과, 수회 라운드의 선별, 증폭 및 다양화가 수행되어 분자 진화될 수 있다 (도 6 참조).
촉매적 활성 선별
기술된 원리는 또한 촉매적 활성을 선별하기 위해 적용될 수 있다. 이러한 경우, 캐리어 모듈은 반응적 부위 작용기를 포함하며, 별 구조물은 이들 작용기의 3차원 배열을 위한 프레임웍을 제공하여 단백질 효소를 모방한다.
다양한 촉매적 활성을 위한 선별 계획이 고려된다. 예를 들어, i) 전이 상태 유사체에 대한 결합을 선별, ii) 다른 기질은 예를 들어 비드에 고정화시키는 반면, 하나의 기질을 별 구조물에 결합시킴으로써 결합 형성을 선별 (그 결과, 비드에 결합된 라이브러리 구성물은 결합을 형성할 수 있다), 또는 iii) 별 구조물 및 비드 모두에 결합된 기질을 가짐으로써 결합 절단을 선별 (그 결과, 비드에 결합되지 않은 라이브러리 구성물은 결합 절단될 수 있다) (도 7 참조).
코돈 특이적 구획화
별 구조물은 예를 들어 적합한 제한 효소의 사용에 의해 임의의 코돈 위치가 말단화되거나 단일 스트랜드가 되게 함으로써, 하이브리드화 및 임의로 특정 코돈 위치에 대한 결합에 의해 고도로 특이적인 구획화를 가능하게 한다. 구획화를 위한 다양한 방법이 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 안티-코돈 서열의 마이크로어레이 (Lockhart et al., Nat Biotechnol, 14, 1675-80, 1996), 안티-코돈 서열의 컬럼 (Halpin and Harbury, PLoS Biol, 2, E 173, 2004) 또는 각각의 비드가 안티-코돈 서열 및 형광 택을 포함하여 형광 활성화된 세포에 의해 분류를 가능하게 하는 비드 사용 (Iannone et al., Cytometry, 39, 131-40, 2000)을 포함한다.
이러한 구획화는 본 발명의 실시, 예를 들어 i) 화학 반응 후 변형을 위한 라이브러리 합성 동안, ii) 단일 클론의 분석, iii) 선별 진행의 분석, 또는 iv) 다양화 분석에 유용할 수 있다. 그 결과, 경우 ii)-iv)에서의 구획화는 단일 서열 또는 일 라이브러리의 서열의 탈얽힘을 위한 DNA 서열분석에 대한 신속하고 경제적인 대체일 수 있다.
상기한 기술을 통해서, 조성물이 특정 성분들을 갖거나 포함하거나 함유하는 경우 또는 공정이 특정 공정 단계를 갖거나 포함하거나 함유하는 경우, 본 발명의 조성물은 또한 인용된 성분으로 필수적으로 이루어지거나 이루어지고, 본 발명의 방법은 인용된 공정 단계로 필수적으로 이루어지거나 이루어지는 것으로 간주된다. 또한, 단계들의 순서 또는 특정 작용을 수행하기 위한 순서는 본 발명이 가동할 수 있는 한 중요하지 않다. 또한, 2개 이상의 단계 또는 작용이 동시에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 목적하는 특성을 갖는 분자를 생성하는 새로운 방식을 제공한다. 이러한 접근은 매우 민감하고 강력한 분자 생물학을 유기 화학의 적응성과 조합한다. 분자 진화에 의한 비천연 중합체 및 소분자를 제조, 증폭 및 진화시키는 능력에 의해 새로운 부류의 촉매, 새로운 리간드, 또는 보다 느린 종래에 밝혀진 방법으로 분리되는 특성 보다 우수한 특성을 갖는 약물이 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트 및 조성물을 제공한다.
정의
본원에 기술된 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 언급한다. 중합체는, 이로 제한됨이 없이, 천연 뉴클레오시드 (즉, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신; 및 데옥시시티딘), 뉴클레오시드 유사체, (예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5-브로모우리딘,C5-플루오로우리딘, C5-우로우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예: 메틸화된 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예: 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 그룹 (예: 포스포로티오에이트 및 5', -N-포스포르아미다이트 연결)을 포함한다. 또한, 핵산 및 올리고뉴클레오티드는 변형된 골격을 갖는 다른 염기의 중합체, 예를 들어 로킹된 (locked) 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 트레오스 핵산 (TNA) 및 증폭 기술, 예를 들어 폴리머라제 쇄 반응 또는 리가제 쇄 반응을 이용하여 증폭 반응을 위한 템플레이트로서 사용될 수 있는 다른 중합체를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "분절 (segment)"은 올리고뉴클레오티드 서열의 연속 조각을 언급한다. 본원에 사용되는 용어 "코돈" 및 "안티-코돈"은 상기 코돈 또는 안티-코돈과 결합되는 특정 화학적 그룹을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 언급한다. 일련의 코돈이 암호화된 분자의 형성에 참여했던 특정 화학적 반응물의 조합을 암호화한다.
본원에 사용되는 용어 "스템-루프" 구조는, 대부분 이중 스트랜드인 "자체적으로 쌍을 이룬" 영역 및 스템의 일 말단에 위치되는 쌍을 이루지 않은 "루프" 영역을 구성하기 위해, 일 스트랜드의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자의 또 다른 부분과 분자간 수소 결합을 통해 하이브리드화된 적어도 하나의 뉴클레오티드 부분을 갖는 임의의 2차 구조를 언급한다. 루프의 길이가 0이면, "헤어핀" 또는 회문 (palindrome)라 불리는 스템-루프의 특별한 경우를 만든다.
본원에 사용되는 용어 "소분자"는, 분자량이 몰당 10,000 g 미만, 임의로 5,00 g 미만, 임으로 2,000 g 미만, 예를 들어 1000 미만인, 실험실에서 합성되거나 천연에서 발견되는 유기 화합물을 언급한다. 바람직한 소분자는 경구 투여에 적합하다.
본원에 사용되는 용어 "소분자 스캐폴드" 또는 "분자 스캐폴드"는, 작용화에 적합한 하나 이상의 부위 또는 화학적 잔기를 갖는 화학적 화합물을 언급한다. 소분자 스캐폴드 또는 분자 스캐폴드는 작용화에 적합한 2, 3, 4 또는 5개 이상의 부위 또는 화학적 잔기를 가질 수 있다. 이들 작용화 부위는 당업자에 의해 알 수 있는 바와 같이 보호되거나 마스킹될 수 있다. 또한, 이러한 부위는 기본 환 구조 또는 골결에서 발견될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "화학적 반응 그룹" 또는 "화학적 그룹" 또는 "반응 단위"는, 또 다른 화학적 잔기를 변형시키거나 이를 추가하거나 이로부터 제거될 수 있는 임의의 화학적 잔기를 언급한다. 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 빌딩 블럭, 단량체, 단량체 단위, 분자 스캐폴드, 또는 근접성 매개되는 화학적 합성에 유용한 다른 반응물을 포함한다. 일부 예에서, 화학적 그룹은 뉴클레오타이드 또는 이의 유도체가 아니다. 또 다른 양상에서, 형성된 화학적 화합물의 합성에 참여했던 화학적 그룹 중 하나 이상은 천연 발생 아미노산이 아니다.
본원에 사용되는 용어 "결합되는"은, 2개 이상의 그룹, 잔기, 화합물, 단량체 등의 이들 사이의 상호작용을 기술하기 위해 사용된다. 2개 이상의 실체물 (entity)이 본원에 기술되는 바와 같이 서로 "결합되는" 경우, 이들은 직접적 또는 간접적 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 연결된다. 바람직하게는, 결합은 공유적이다. 공유 결합은 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 아미드, 에스테르, 탄소-탄소, 디설파이드, 카바메이트, 에테르, 티오에테르, 우레아, 아민 또는 카보네이트 연결을 통해 결합될 수 있다. 또한, 공유 결합은 링커 잔기, 예를 들어 광절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 바람직한 비-공유 상호작용은 수소 결합, 반데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, pi 겹침 (pi stacking) 상호작용 등을 포함한다. 또한, 2개 이상의 실체물 또는 제제는 동일한 조성물에 함께 존재하는 다른 것과 "결합"될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "캐리어 모듈"은, 올리고뉴클레오티드에 결합된 화학적 그룹, 및 제1 올리고뉴클레오티드에 있는 5' 말단을 향한 분절에 하이브리드화할 수 있는 3' 말단을 향한 분절 및 제3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 향한 분절에 하이브리드화할 수 있는 5' 말단을 향한 분절을 언급한다. 캐리어 모듈은 임의로 코돈 또는 안티-코돈 분절을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "하이브리드화 분절"은 상기한 올리고뉴클레오티드 분절을 언급한다.
본원에 사용되는 용어 "별 구조물"은, 대부분 이중 스트랜드인 3개 이상의 스템을 수반하는 임의의 2차 구조를 언급한다. 0, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 개 이상의 뉴클레오티드 잔기가 스템을 분리시킬 수 있다. 0개의 뉴클레오티드 잔기가 4개의 스템을 분리시키고 있는 특정한 경우에, 그러한 연결을 헐리데이 연결 (Holliday junction)이라 부른다. 별 구조물은 하나의 핵산 분자로 구성되거나 다수의 핵산 분자로 구성될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "반응 근접성 (reaction proximity)"는 반응물들의 반응이 조절되는 효과적인 적시 방식으로 일어날 수 있는 반응물들 사이의 거리를 언급한다.
본원에 사용되는 용어 "근접성 가이드되는 화학적 반응 (proximity guided chemical reaction)"는, 반응물들이 결합된 핵산의 하이브리드화에 의해 반응 근접하게 되는 반응물들 사이의 화학적 반응을 언급한다.
실시예 1
서로 상보적인 이특이적 올리고뉴클레오티드에 의한 삼량체 및 사량체 DNA 별 구조물의 형성이 입증된다.
DNA 올리고뉴클레오티드 (제조: DNA Technology Arhus, Denmark)를 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에 각각 2 μM 농도로 도 8에 도시된 표에 나타난 바와 같이 혼합하였다. 이 혼합물을 2 분 동안 80 ℃에서 인큐베이션하고, 수조에서 서서히 실온으로 냉각시켰다. 생성물을 표준 프로토콜 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)을 이용해 PAGE 천연 (7.5 % 폴리아크릴아미드)하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다.
올리고6 및 올리고7 (각각 vipOO6 및 vip007에 상응), 올리고6 및 올리고8 (각각 vipOO6 및 vipOO8에 상응) 및 올리고7 및 올리고8 (각각 vip007 및 vipOO8에 상응)은 서로 상보적인 분절을 가지므로 어닐링된 이량체를 형성할 수 있다. 따라서, 이량체에 상응하는 밴드가 레인 1-3에서 관측되었다. vipOO6, vip007 및 vip008 각각은 2개의 이웃하는 올리고에 대해 서로 상보적인 분절을 지녀 폐쇄된 (closed) 어닐링된 삼량체 구조물을 형성할 수 있다(도 8 참조). 따라서, 삼량체에 상응하는 밴드가 레인 4에서 관측되었다. 올리고6, 올리고7, 및 올리고9 (각각 vipOO6, vip007 및 vip009에 상응) 각각은 이웃하는 올리고에 서로 상보적인 분절을 지녀, 어닐링된 삼량체 구조물을 형성할 수 있다. 그러나, 이 구조물은 vipOO8 및 vipOO6이 상보적인 분절을 갖지 않기 때문에 개방된다 (도 8 참조). 따라서, 삼량체에 상응하는 밴드가 레인 5에서 관측되었다. 개방 삼량체는 보다 조밀한 폐쇄된 형태보다 겔에서 약간 낮은 이동성을 갖는 것으로 예측된다. 레인 4를 레인 5와 비교할 때, 이동성 차이가 실제로 관측된다.
느리게 이동하는 삼량체 밴드에 대한 상응하는 관측을 vipOO6 및 vipOlO이 서로 직접적으로 어닐링하지 않는 (레인 4 및 레인 6을 비교) 올리고6, 올리고7, 및 올리고 10 (각각 vip006,vip007 및 vipOlO에 상응)을 사용하여 얻었다. 폐쇄된 삼량체 형태의 형성에 대한 효율을 평가하기 위해서, 올리고6, 올리고7, 및 올리고8 (각각 vipOO6, vip007, 및 vipOO8에 상응)을 2배 과량의 올리고9 또는 올리고 10 (각각 vip009 또는 vipOlO에 상응)의 존재 하에서 어닐링하였다. 흥미롭게도, 레인 7 및 8에 있는 주요 밴드는 vipOO6, vip007 및 vipOO8로 이루어진 폐쇄된 삼량체의 빠르게 이동하는 종에 상응한다. 폐쇄된 사량체의 성공적인 형성이 올리고6, 올리고7, 올리고9 및 올리고 10 (각각 vipOO6, vip007, vip009 및 vipOlO에 상응)을 어닐링시킴으로써 달성되었으며, 레인 9에서 하나의 주요 밴드가 관측되었다. 모든 체이스에서 의도된 결합가가 고효율로 얻어졌으며, 단일 주요 밴드로서 관측되었다.
실시예 2
T4 DNA 리가제에 의한 삼량체 DNA 별 구조물의 단일의 연속적인 스트랜드 DNA로의 전환
단일의 중단되지 않은 스트랜드의 DNA로 이루어진 3-스템의 DNA 별 구조물의 성공적인 제조가 본 실시예에서 입증되었다. 서로 상보적인 이특이적 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킨 후 결합시켜 연속적인 스트랜드의 DNA를 형성하였다.
DNA 올리고뉴클레오티드 (제조: DNA Technology Arhus, Denmark)를 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에 각각 2 μM 농도로 도 9에 도시된 표에 나타난 바와 같이 혼합하였다. 이 혼합물을 2 분 동안 80 ℃에서 인큐베이션하고, 수조에서 서서히 실온으로 냉각시켰다.
올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다. 1.67 μM 별 구조물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl 및 0.2 μ/μl T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolabs, cat# M0201)로 이루어진 혼합물을 제조하여 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
어닐링된 올리고뉴클레오티드의 나란히 놓인 말단 사이의 포스포디에스테르 결합을 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)로 형성하였다. 1/3배 용적의 리가제 혼합물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl, 및 100 μ/μl T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)를 상술된 키나제 처리된 혼합물에 가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 생성물을 표준 프로토콜 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)을 이용하여 비-천연 PAGE (7.5 % 폴리아크릴아미드, 8 M 우레아)를 수행하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다.
vipO76 (25nt) 및 vipO17 (42 nt) 각각은 어닐링 시 vipO76의 3' 말단을 vipO17의 5' 말단에 인접하게 위치시키는 서로 상보적인 분절을 지녀, T4 DNA 리가제에 대한 기질을 만든다. 따라서, vipO76-vipO17 (67 nt)에 상응하는 두드러진 밴드가 레인 1 (비-천연 PAGE)에서 관측되었다. 유사하게, vipO17-vipO78 (100 nt)에 상응하는 두드러진 밴드의 형성이 레인 3에서 관측되었다. 이와는 대조적으로, vipO76 및 vip078 (58 nt) 각각은 서로 상보적인 분절을 가지나 어닐링되는 인접 말단을 형성하지 않아 결합될 것으로 예측되지 않는다. 따라서, vipO76 및 vip078의 단량체에 상응하는 밴드만이 레인 2에서 관측되었다. vipO76에 상응하는 밴드가 보다 흐린 것이 주목되며, vip076이 보다 적고 올리고뉴클레오티드가 등몰량 농도인 것으로 예측된다. 또한, vipO78 (58 nt)은 겔에서 vipO76-vipO17 (67 nt) 보다 느리게 이동하며, vipO76-vipO17이 보다 조밀한 접힘가져 겔에서 보다 높은 이동성을 제공하는 스템-루프 구조물을 생성하는 서열을 포함하는 것으로는 예측되지 않는다.
vip076, vipO17 및 vipO78 각각은 어닐링 시 vipO76의 3' 말단을 vipO17의 5' 말단에 인접하게 위치시키고 vipO77의 3' 말단을 vipO18의 5' 말단에 인접하게 위치시키는 서로 상보적인 분절을 지녀, T4 DNA 리가제에 대한 2개의 기질을 만든다. 따라서, vipO76-vipO17-vipO78에 상응하는 두드러진 밴드가 레인 4에서 관측되었다.
따라서, 하나의 연속적인 스트랜드의 DNA로 이루어진 삼량체적 DNA 별 구조물의 생성이 입증되었다.
실시예 3
3-스템의 DNA 별 구조물의 증폭
하나의 연속적인 스트랜드의 DNA로 이루어진 삼량체적 DNA 별 구조물의 성공적인 증폭이 본 실시예에서 입증되었다. 서로 상보적인 이특이적 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 결합한 후 프라이머 연장 반응에서 템플레이트로 사용하였다.
DNA 올리고 (제조: DNA Technology Arhus, Denmark)를 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에 각각 2 μM 농도로 하기에 나타난 바와 같이 혼합하였다. 이 혼합물을 2 분 동안 80 ℃에서 인큐베이션하고, 수조에서 서서히 실온으로 냉각시켰다.
올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다. 1.67 μM 별 구조물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl 및 0.2 μ/μl T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolabs, cat# M0201)로 이루어진 혼합물을 제조하여 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였 다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 나란히 놓인 말단 사이의 포스포디에스테르 결합을 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)로 형성하였다. 1/3배 용적의 리가제 혼합물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl, 및 100 μ/μl T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)를 키나제 처리된 혼합물에 가하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
프라이머 연장 반응은 3 용적 연장 혼합물, 1.33x Vent 완충액 (New England Biolabs), 1,33 μM vipO38, 2.67 mM dNTP (1.33 μ/μl Vent(exo-) DNA 폴리머라제 (New England Biolabs, cat# M0257)의 존재 또는 부재)을 1 용적의 결합 반응물에 가하여 수행하였다. 이 용액을 1 분 동안 92 ℃, 1 분 동안 50 ℃ 및 10 분 동안 74 ℃에서 인큐베이션하고, 얼음 상에 두었다.
반응은 표준 프로토콜 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)을 이용하여 천연 PAGE (7.5 % 폴리아크릴아미드)를 수행하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다.
실험 결과가 도 10에 도시되어 있다. vipO38는 vip078의 20개의 대부분의 5' 말단 염기에 역으로 상보적이어서, 템플레이트로서 vipO78 또는 vipO78 융합물을 사용하는 연장 반응을 프라이밍할 수 있다. 따라서, 이중 스트랜드의 vip078에 상응하는 단일의 두드러진 밴드가 vip038, vipO76 및 vipO78 (레인 2)를 포함하는 연장 반응물에서 얻어졌다. 이러한 밴드가 DNA 폴리머라제가 포함되지 않는 것 이외에는 동등한 레인 6에는 존재하지 않는 것이 주목된다. 이와는 대조적으로, 레 인 6은 아마도 어닐링된 vipO76/vipO78/vipO38 및 어닐링된 vipO78/vipO38로 이루어진 2개의 밴드를 포함한다.
반응 특이성을 vip038, vipO76 및 vipO17으로 입증하였으며, 레인 1 및 레인 5를 비교하는 경우, DNA 폴리머라제의 존재 또는 부재 사이의 어떠한 가시적인 차이가 없었다.
또한, 성공적인 프라이머 연장이 레인 3에서의 두드러진 밴드에 의해 설명되는 바와 같이 결합 반응물 vipO17-vipO78을 사용하여 관측되었다. 이중 스트랜드의 vip078에 상응하는 흐린 밴드도 관측되는 것이 주목되며, 이는 모든 vip078이 vip017에 결합된 것은 아니라는 것을 설명한다. DNA 폴리머라제 없는 상응하는 레인 7에서, 이중 스트랜드의 vipO17-vipO78와 거의 동일한 이동성을 갖는 흐린 밴드가 관측된다. 이 밴드는 아마도 어닐링된 vipO3S/vipO17-vipO78로 구성된다.
또한, 성공적인 프라이머 연장이 템플레이트로서 vipO76-vipO17-vipO78 결합 반응을 이용하여 관측되었다. 이중 스트랜드의 vipO17-vipO78 보다 낮은 겔 이동성을 갖는 2개의 밴드가 관측되었다. DNA 폴리머라제가 없는 상당하는 레인 8과 비교할 때 보여지는 바와 같이, 하부 밴드는 어닐링된 vip038/vip076-vipO17-vipO78에 상응한다. 그러나, 레인 4에서의 상부는 독특하며, 이중 스트랜드의 vipO76-vipO17-vipO78로 이루어진다. 따라서, 본 실시예는 DNA 구조물이 이중 스트랜드의 DNA로 전환되어 증폭가능함을 입증한다.
실시예 4
별 구조물의 중심의 화학적 반응성
별 구조물의 중심에서의 화학적 반응성을 하기의 삼작용성 가교결합제 (TSAT, 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트, Pierce cat. No 33063)를 사용하여 수행하였다:
Figure 112007041838915-PCT00001
DNA 올리고: vipO16/vipO17 또는 vipO16/vipO17/vipO18 (제조: DNA Technology Arhus, Denmark) (모두 내부의 아미노 변형된 dT (GlenResearch, cat. No.: 10-1038-xx)을 갖는다)을 150 mM NaCl, 100 mM 인산나트륨, pH 7.2에서 혼합하여 20 μM의 총 올리고 농도를 수득하였다. 이 혼합물을 2 분 동안 80 ℃에서 인큐베이션하고, 수조에서 실온으로 서서히 냉각시켰다. TSAT를 DMF에 용해시켰다. DMF 중의 10배 연속 희석물을 제조하였다. 1 용적의 DMF 또는 TSAT 희석액을 9배 용적의 완충액과 혼합하여 150 mM NaCl, 100 mM 인산나트륨, pH 7.2의 최종 완충액 농도를 수득하였다. 1 용적의 완충된 DMF 또는 완충된 TSAT 희석액을 1 용적의 어닐링된 DNA 올리고 혼합물과 혼합하여 최종 올리고:TSAT 비율 (1:0, 1:10, 1:100, 1:1000, l;10000)로 하고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 표준 프로토콜 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)을 이용하여 PAGE: 천연 (7.5 % 폴리아크릴아미드) 및 비-천연 PAGE (7.5 % 폴리아크릴아미드, 8 M 우레아)를 수행하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다.
Figure 112007041838915-PCT00002
vipOl6 및 vipO17 각각은 서로 상보적 분절을 가지므로 어닐링된 이량체 구 조물을 형성할 수 있다. vipOl6, vipO17 및 vipO18 각각은 이웃하는 올리고에 대해 서로 상보적인 분절을 가지므로 폐쇄된 어닐링된 삼량체 구조물을 형성할 수 있다 (도 12 참조).
레인 1-5에서 예측되는 바와 같이, 주요 밴드는 이량체 구조물에 상응하고, 천연 겔의 레인 6-10에서의 주요 밴드는 삼량체 구조물에 상응한다. 비-천연 겔에서 어닐링은 파괴된다. 예측되는 바와 같이, 단량체에 상응하는 비-천연 겔의 레인 1 및 6에서의 밴드가 관측되었다. 그러나, TSAT가 포함되었으므로, 보다 높은 차수의 구조물이 관측되었으며 (레인 2-5, 7-10, 비-천연 겔), 이는 TSAT 가 올리고를 가교결합하였음을 나타낸다. 흥미롭게도, vipO16 및 vipO17만이 존재하는 경우, 가장 높은 차수의 가교결합된 구조물은 이량체 (비-천연 겔, 레인 2-5)였으며, vipO16, vipO17, vip018이 존재하는 경우, 추가의 삼량체 구조물이 관측되었으며 (비-천연 겔, 레인 7-10), 이는 가교결합이 DNA 올리고뉴클레오티드의 어닐링에 의존적임을 나타낸다. 또한, 예측되는 바와 같이, 벨 모양의 용량 반응이 관측되었으며, 낮은 TSAT 농도에서는 반응이 느려 낮은 수율을 이끌 것이며, TSAT 농도가 증가함에 따라 반응이 보다 빨라져 보다 가교결합된 생성물을 생성하나, 보다 높은 TSAT 농도에서 가교결합은 단지 하나의 DNA 올리고와 반응하는 TSAT 분자와 경쟁하여 보다 낮은 가교결합 생성물을 생성할 것이라는 것이 주목된다. 이로써, 가교결합 생성물의 최고의 수율은 1000 TSAT 당량 (레인 4 및 9, 비-천연 겔)을 사용하여 관측되었다. 또한, 가교결합을 위한 폐쇄된 어닐링 구조물의 이점은, 동일한 TSAT 농도를 갖는 레인 2-5에서의 상대물과 비교하여, 레인 7-10에서 수득되는 아주 높 은 총 수율에 의해 설명된다.
실시예 5
DNA 별 구조물에 의해 지시되는 화학 반응
25 ℃에서 10 분 동안 DMF 중의 10O mM BSOCOES ((비스[2-(숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸]술폰), Pierce cat# 21600) 용액 0.1 용적을 갖는 20O mM pH 7.4 인산나트륨 용액 (200 uL) 중의 올리고뉴클레오티드 (5 nmol)로 처리한 후, 25 ℃에서 2 시간 동안 30O mM NaOH 중의 30O mM 아미노산 (Leu 또는 Gly) 용액 0.3 용적으로 처리하여, 호모이작용성 링커 BSOCOES에 의해, 알파-아민을 통해 vip017의 내부 변형된 dT에 있는 1급 아민에 아미노산을 가교결합시킴으로써 올리고뉴클레오티드 vipO17을 작용화시켰다. 반응물의 총 용적은 200 uL였다. 미정제의 (crude) 연결된 아미노산 시약을 EtOH 침전으로 분리시켜 추가의 정제 없이 사용하였다. DNA를 문헌 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)에 따라 NaOAc/EtOH로 침전시켰다.
3.125 μM의 각각의 올리고뉴클레오티드, 125 mM MES pH 6.0, 187.5 mM NaCl을 제조하여 올리고뉴클레오티드를 어닐링하였다. 이 혼합물을 2 분 동안 80 ℃에서 인큐베이션한 후, 수조에서 실온으로 서서히 냉각시켰다. DNA 지시된 화학적 반응 (아미드 결합 형성)은 예비-어닐링된 올리고뉴클레오티드: 2.5 μM 예비형성된 별 구조물, 100 mM MES pH 6.0, 150 mM NaCl, 20 mM EDC 및 15 mM sNHS (최종 농도)에 EDC 및 NHS를 가하여 수행하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하고, 상술된 바와 같이 EtOH 침전시켰다.
반응물을 표준 프로토콜 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)을 이용하여 PAGE: 천연 (7.5 % 폴리아크릴아미드) 및 비-천연 PAGE (7.5 % 폴리아크릴아미드, 8 M 우레아)를 수행하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다.
호모이작용성 링커 BSOCOES에 의해 알파-아민을 통해 vip017의 내부 변형된 dT에 있는 1급 아민에 아미노산을 가교결합시킴으로써 올리고뉴클레오티드 vipO17을 작용화시켰다. 변형된 dT를 vipO17에 있는 2개의 하이브리드화 분절 사이에 위치시켰다. vip076은 1급 아민을 포함하는 변형된 dT에 이어 vip017에 있는 5' 하이브리드화 분절에 상보적인 3' 하이브리드화 분절을 갖는다. 그 결과, vipO17 및 vipO76을 어닐링함으로써 vip017에 접합된 아미노산과 vip076 상의 1급 아민 사이에 근접성이 생긴다. 따라서, 이량체에 상응하는 밴드가 천연 겔의 레인 4-6에서 관측되었다. vip008은 vipO76 및 vipO17 모두에 대해 상보적인 분절을 지녀, 폐쇄된 삼량체 별 구조물을 형성하고 별 구조물의 중심에 있는 반응 챔버에 vipO17 및 vipO76의 화학적 작용기를 배열할 수 있다. 따라서, 삼량체에 상응하는 밴드가 천연 겔의 레인 1-3에서 관측되었다.
EDC/sNHS에 의해 활성화 시, vip017에 접합된 아미노산과 vip076의 1급 아미노산 사이에 아미드 결합이 형성되어 vipO17 및 vipO76을 가교결합할 수 있다. 예 측되는 바와 같이, 별 구조물이 형성되는 경우 (vipOO8 존재), 가교결합된 vipO76/vipO17에 상응하는 독특한 밴드는 vipO17-Gly 및 vipO17-Leu (비-천연 PAGE, 각각 레인 2 및 3)를 갖는 것으로 나타났으며, 이들은 EDC/sNHS 활성화 (비-천연 PAGE, 레인 8 및 9)가 없거나 비-아세틸화된 vipO17 (비-천연 PAGE, 레인 1)로는 존재하지 않았다. 흥미롭게도, 독특한 밴드는 vip008이존재하지 않는 경우 (비-천연 PAGE, 레인 5 및 6) 검출되지 않았다. 이는 화학적 반응이 별 구조물에 의해 지시될 수 있으며, 별 구조물이 2개의 어닐링된 올리고보다 화학 반응을 가이드하는데 보다 효과적이라는 것을 예증한다.
실시예 6
별 구조물의 조립 및 결합
dsDNA로 이루어진 삼량체 DNA 별 구조물의 성공적인 증폭이 본 실시예에서 입증되었다. 서로 상보적인 이작용성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 결합시킨 후, PCR 반응에서 템플레이트로 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 vip029-vip031-vip0132-vip0133-vip030이 사용되었다. 도 13은 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화를 도식적으로 나타낸다.
DNA 올리고뉴클레오티드 (제조: DNA Technology Arhus, Denmark)를 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에 각각 2 μM 농도로 혼합하였다. 이 혼합물을 5 분 동안 94 ℃, 30 초 동안 80 ℃, 30 초 동안 65 ℃, 30 초 동안 5O ℃, 30 초 동안 35 ℃, 30 초 동안 2O ℃, 다음 단계까지 10 ℃에서 인큐베이션 하였다. 어닐링 절차를 Applied Biosystems AB2720 PCR 기계에서 수행하였다.
올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다. 1.5 μM 별 구조물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl 및 0.17 UJ/μl T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolabs, cat# M0201)로 이루어진 혼합물을 제조하고, 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
어닐링된 올리고뉴클레오티드의 나란히 놓인 말단 사이의 포스포디에스테르 결합을 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)로 10 μl 용적의 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs) 중, 50 mM NaCl, 및 200 U T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202) 중에서 형성하고, 16 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
하기 조건을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다:
0,2 mM dNTP (New England Biolabs O447S), 8 mM MgSO4, 0,2 μM 센스 프라이머 및 0,2 μM 안티센스 프라이머, 1 M 베타인 (Sigma B0300), 1 U/100 μl의 Vent (exo-) (New England Biolabs M0257L)을 사용하여 1x 테르모폴 완충액 (New England Biolabs B9004S) 중에서 반응을 수행하였다. 사용된 프라이머는 vipO27 및 vipO28였다. 이들 2개의 프라이머의 바이오티닐화된 버젼은 각각 vipO34 및 vip038이다. 하기 사이클 조건을 이용해 PCR 증폭을 수행하였다: 95 ℃에서 2분 및 20 사이클의 95 ℃/30 초, 60 ℃/30 초, 74 ℃/30 초. 하기 실시예 7에 보고되는 폴딩 및 ssDNA 정제를 위해 사용될 PCR 생성물은 vip034 및 vipO28 프라이머로 만들었다. PCR 생성물을 천연 PAGE로 분석하였다. 도 13에 도시된 겔에서 201 bp의 밴드를 분명히 볼 수 있다.
실시예 7
PCR 생성물의 재폴딩
PCR 생성물의 폴딩을 하기와 같이 수행하였다. PCR 정리 (cleanup)를 키트 교시에 따라 PerfectPrep (Eppendorf, cat# 0032 007.740)를 사용하여 수행하였다. 0,1 M NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 μM vipO27, 0,1 μM vipO28 (10 μl 용적) (5 μl/생성물, 5 μl 2x 완충액/프라이머 혼합물과 혼합됨)에서 폴딩을 수행하였다. PCR 생성물을 4개의 상이한 농도 (1:2 희석물부터 1:20 희석물)로 이용하였다. 제1 시리즈에서, 혼합물을 끓은 물 중에서 2 분 동안 인큐베이션한 후, 빙/수조에서 냉각시켰다. 제2 시리즈에서, 혼합물을 ABI2720 PCR 기계로 하기 프로그램을 이용하여 가열 및 냉각시켰다: 5분 동안 94 ℃, 30 초 동안 80 ℃, 30 초 동안 65 ℃, 30 초 동안 50 ℃, 30 초 동안 35 ℃, 30 초 동안 2O ℃, 다음 단계까지 10 ℃. 제2 시리즈에서, 가열 또는 냉각을 수행하지 않았다.
생성물을 20 % TBE 우레아 겔 (Invitrogen)에서 분석하였다. 겔을 SYBR 그린 (Molecular Probes S7563, 1:10.000 희석, 1x TBE 완충액 중, 지시에 따름)으로 염색하였다.
도 14에서 겔의 레인들은 하기를 내용을 포함한다:
레인 1 : 1:2 희석 PCR 생성물, 급속 냉각
레인 2: 1:4 희석 PCR 생성물, 급속 냉각
레인 3: 1:10 희석 PCR 생성물, 급속 냉각
레인 4: 1:20 희석 PCR 생성물, 급속 냉각
레인 5: 1:2 희석 PCR 생성물, 단계적 냉각
레인 6: 1:4 희석 PCR 생성물, 단계적 냉각
레인 7: 1:10 희석 PCR 생성물, 단계적 냉각
레인 8: 1:20 희석 PCR 생성물, 단계적 냉각
레인 9: 1:2 희석 PCR 생성물, 비처리
레인 10: 1:4 희석 PCR 생성물, 비처리
레인 11 : 1:10 희석 PCR 생성물, 비처리
레인 12: 1:20 희석 PCR 생성물, 비처리
레인 13: PCR 생성물 단독
상기 실험은 단일 스트랜드의 별 구조물 DNA가, 201 bp dsDNA 생성물과는 대조적으로, 약 100 bp로 이동한다는 것을 보인다. 별 구조물의 형성을 위한 최적 조건은 가열한 후 반응물을 급속 냉각하는 것으로 보인다.
실시예 8
재폴딩된 별 구조물의 정제
ssDNA 별 구조물을 스트렙트아비딘-코팅된 자석구슬 (Dynal, Cat# 650.02)을 사용하여 정제하였다. 10 μl 비드를 2x BWT (2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,2 % Triton X-100)로 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 비드를 1 용적의 2x BWT에 현탁시키고, 1 용적의 재폴딩된 PCR 생성물을 가하였다. 현탁액을 때때로 혼합하면서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 자석에 놓고, 비드를 수집한 후, 현탁액을 제거하였다. 비드를 50 ℃ 따뜻한 세척 완충액 (2 M 우레아, 0,1 % Triton X-100)에 현탁시키고, 50 ℃에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 자석에 놓고, 세척 절차를 총 3회 수행하였다. 하나의 최종 세척은 1x BWT (1 M NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100)에서 수행하였다. 최종 세척 완충액을 제거한 후, 비드를 1,5 ml NT (10 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100)에 현탁시키고, 5 분 동안 50 ℃에서 인큐베이션하였다. 튜브를 신속 냉각을 위해 빙/수조에 옮기고, 이러한 절차에 따라 스트렙트아비딘-코팅된 자석 비드에 고정화된 별 구조물을 형성하였다. 튜브를 신속 냉각 후 자석에 놓고, 상등액을 제거하였다. 비드를 이로부터 ssDNA를 방출시키기 위해 BsaI를 사용한 분해가 준비된 50 μl NT에 현탁시켰다.
17 μl 비드를 2 μl 10 x NEB3 완충액 및 1 μl BsaI (10 U/μl; NEB R0535L)에 가하였다. 반응물을 50 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 분해물을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (10 % TBE-우레아 겔, Invitrogen)을 수행하고, 샘플에 변성 로딩 완충액을 가한 후, 겔의 웰에 비드를 포함하는 전체 혼합물을 로딩시켜 분석하였다. 겔을 SYBR 그린 (Molecular Probes S7563, 1:10.000 희석, 1x TBE 완충액 중, 지시에 따름)으로 염색하였다.
도 15에서 레인 1 (+BsaI) 레인에서 하나의 밴드가 관측되었으며, 레인 2 '- BsaI' 레인에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않는다. 따라서, ssDNA가 스트렙트아비딘-코팅된 자석 비드 상에 폴딩되었으며, 이로써 단일 스트랜드의 생성물을 절단하는 효소의 능력에 의해 입증되는 바와 같이 BsaI에 대한 기질을 형성하였다.
실시예 9
루프 포맷 분해
별 구조물의 루프를 분해를 가능하게 하는 2개의 게놈을 고안하였다. 제한 효소는 일반적으로 ssDNA를 분해할 수 없다. 그러나, 루프에 10-mer 올리고뉴클레오티드가 어닐링함으로써 효소에 기질을 생성하며, 이로써 효소에 대한 인지 서열이 이중 스트랜드가 될 것이다. 실험의 고안이 도 16에 도식적으로 나타나 있다.
2개의 구조물 s129 및 s149을 조립하였다. s129는 올리고뉴클레오티드: vip029-vipl61-vipl62-vipl63-vip070로 구성되었다. s149는 올리고뉴클레오티드: vip029-vipl61-vipl92-vipl93-vip070로 구성되었다. vipl62, vipl63, vipl92 및 vipl93 모두 2개의 제한 효소 (vipl62: Apal and BamHI, vipl63: EcoRI and Kpnl, vipl92: PvuII and Sad, vipl93: Smal and Vspl)에 대한 인지 서열을 포함한다. DNA 올리고 (TAGC로 제조, Copenhagen, Denmark)를 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에 각각 2 μM 농도로 혼합하였다. 혼합물을 하기와 같이 인큐베이션하였다: 5분 동안 94 ℃, 30 초 동안 8O ℃, 30 초 동안 65 ℃, 30 초 동안 50 ℃, 30 초 동안 35 ℃, 30 초 동안 2O ℃, 다음 단계까지 0 ℃. 어닐링 절차를 Applied Biosystems AB2720 PCR 기계로 수행하였다.
올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다. 1.5 μM 별 구조물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl 및 0.17 U/μl T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolabs, cat# M0201)로 이루어진 혼합물을 제조하고, 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
어닐링된 올리고뉴클레오티드의 나란히 놓인 말단 사이의 포스포디에스테르 결합을 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)로 10 μl 용적의 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl, 및 200 U T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202) 중에서 형성하고, 16 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
PCR 증폭을 하기 조건을 이용하여 수행하였다:
반응을 1x ThermoPol 완충액 (NEB B9004S) 중에서 0,2 mM dNTP (NEB O447S), 8 mM MgSO4, 0,2 μM 센스 프라이머 및 0,2 μM 안티센스 프라이머, 1 M 베타인 (Sigma B0300), 1 U/100 μl의 Vent (exo-) (NEB M0257L)로 수행하였다. 사용된 프라이머는 vipO27 및 vipO28이었다. 프라이머의 바이오티닐화된 버젼은 각각 vipO34 및 vip038이다. 하기 사이클화 조건을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다: 95 ℃에서 2분, 및 20 사이클의 2 분/95 ℃, 및 20 사이클의 95 ℃/30 초, 60 ℃/30 초, 74 ℃/30 초.
실험의 결과가 도 17에 나타나 있다.
레인 1 및 3에서는 2개의 게놈이 성공적으로 증폭된 것으로 나타난다. 레인 2 및 4는 2개의 게놈에 대해 첨가된 리가제가 없는 음성 대조군이다.
s129 및 s149의 ssDNA 구조물의 정제
각각의 게놈의 80 μl PCR 생성물 (vipO34 및 vipO28 프라이머를 사용하여 제조)을 키트 지시에 따라 PerfectPrep (Eppendorf, cat# 0032 007.740) 를 사용하여 정제하였다. 40 μl 용출 완충액으로 용출을 수행하였다. PCR 생성물의 재폴딩을 위해, 하기를 수행하였다: 40 μl PCR 생성물에 750 μl 0,2 M NaCl, 0,2 % Triton X-100, 7,5 μl vipO27 및 7,5 μl vipO28 및 695 μl H2O를 가하고, 5분 동안 끓는 물에서 혼합물을 인큐베이션한 후, 빙수조에서 빨리 냉각시킴.
20 μl 스트렙트아비딘 비드 (Dynal, 650.02)을 2x BWT (2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,2 % Triton X-100)로 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 비드를 1 용적의 2x BWT에 현탁시키고, 1 용적의 재폴딩된 PCR 생성물을 가하였다. 현탁액을 때때로 혼합하면서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 자석에 놓고, 비드를 수거한 후, 상등액을 제거하였다. 비드를 50 ℃의 따뜻한 세척 완충액 (2 M 우레아, 0.1 % Triton X-100)에 현탁시키고, 5O ℃에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 자석에 놓고, 세척 절차를 총 3회 수행하였다. 하나의 최종 세척은 1x BWT (1 M NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100)에서 수행하였다. 자석 상에서 분리한 후, 비드를 50 μl 10 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100에 현탁하였다.
20 μl의 각각의 제조물의 비드를 자석 상에서 분리시키고, 10 μl 100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100에 현탁시켰다. 각각의 제조물을 각각 5 μl의 2개의 튜브로 나누고, 하기와 같이 분해 올리고를 가하였다:
1: sl29 -vipl64 -ApaI
2: sl29 -vipl65 -KpnI
3: sl49 -vipl94 -PvuII
4: sl49 -vipl95 -VspI
0.25 μl 올리고 (20 μM 스톡)를 가해 1 μM의 최종 농도를 만들었다. 하기 프로그램을 이용하여 AB2720 PCR 기계로 어닐링을 수행하였다: 5O ℃ - 2 분; 4O ℃ - 2 분; 35 ℃ - 2 분; 3O ℃ - 2 분; 3O ℃ - 2 분; 25 ℃ - 2 분; 2O ℃ - 2 분.
비드를 100 μl 100 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100에서 세척하였다. 이어서, 비드를 18 μl 1.1x 분해 완충액에 현탁시켰다. 반응물을 각각 9 μl의 2개의 튜브로 나누고, 1 μl 효소 (10 단위)를 각각의 튜브에 가하여 분해물에 대해 1x 분해 완충액을 만들었다. 한 세트의 분해물을 3O ℃에서 인큐베이션하고, 다른 세트의 분해물을 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 튜브 바닥으로부터 비드를 현탁시키기 위해 때때로 혼합하면서 5 시간 동안 인큐베이션하였다.
분해 후, 생성물을 10 % TBE-우레아 겔 (Invitrogen)에서 분석하였다. 로딩 완충액을 분해물에 가하고, 비드를 포함하는 전체 반응 혼합물을 겔에 로딩하였다. 겔을 SYBR 그린 (Molecular Probes S7563, 1:10.000 희석, 1x TBE 완충액 중, 지시 에 따름)으로 염색하였다.
실험의 결과가 도 18에 나타나 있다.
레인 1은 37 ℃에서 sl29의 ApaI 분해를 나타낸다.
레인 2는 37 ℃에서 sl29의 KpnI 분해를 나타낸다.
레인 3은 37 ℃에서 s149의 PvuII 분해를 나타낸다.
레인 4는 37 ℃에서 s149의 VspI 분해를 나타낸다.
레인 5는 3O ℃에서 s129의 ApaI 분해를 나타낸다.
레인 6은 3O ℃에서 s129의 KpnI 분해를 나타낸다.
레인 7은 3O ℃에서 s149의 PvuII 분해를 나타낸다.
레인 8은 37 ℃에서 s149의 VspI 분해를 나타낸다.
예측된 밴드 크기는 하기와 같다:
Apal: 163 nt, Kpnl: 80 nt, PvuII: 165 nt, Vspl: 83 nt.
겔 상에 4개의 효소 모두에 대해 예측된 크기의 밴드가 나타난다. 바이오틴을 포함하는 단편은 이들이 비드에 결합하므로 겔에 들어가지 않을 것이라는 것이 주목된다. 2개의 온도 모두 생성물을 제공하며, 절차의 견고함을 나타낸다.
실시예 10
다양한 위상의 아미드 결합의 DNA 지시된 형성
25 ℃에서 10 분 동안 DMF 중의 10O mM BSOCOES ((비스[2-(숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸]술폰), Pierce cat# 21600)용액 0.1 용적을 갖는 20OmM pH 7.4 인산 나트륨 용액 (200 uL) 중의 올리고뉴클레오티드 (5 nmol)로 처리한 후, 25 ℃에서 2 시간 동안 30O mM NaOH 중의 30OmM 아미노산 (Gly) 용액 0.3 용적으로 처리하여, 호모이작용성 링커 BSOCOES에 의해, 알파-아민을 통해 vip017의 내부 변형된 dT에 있는 1급 아민에 아미노산을 가교결합시킴으로써 올리고뉴클레오티드 vipO17을 작용화시켰다. 반응물의 총 용적은 200 uL였다. 미정제의 연결된 아미노산 시약을 EtOH 침전으로 분리시켜 추가의 정제 없이 사용하였다.
DNA를 문헌 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)에 따라 NaOAc/EtOH로 침전시켰다.
0,556 μM의 각각의 올리고뉴클레오티드, 111 mM MOPS pH 6.5 (Fluka 69947), 1,11 M NaCl (Fluka 71376)를 제조하여 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킨 후, 하기와 같이 인큐베이션하였다: 5 분 동안 94 ℃, 30 초 동안 80 ℃, 30 초 동안 65 ℃, 30 초 동안 50 ℃, 30 초 동안 35 ℃, 30 초 동안 2O ℃, 다음 단계까지 1O ℃. 어닐링을 Applied Biosystems AB2720 PCR 기계로 수행하였다.
예비-어닐링된 올리고뉴클레오티드에 100 mM DMTMM (Acros, cat # A017657001)을 가해 DNA 지시된 화학 반응 (아미드 결합 형성)을 수행하였다. DMTMM를 1 M의 농도로 물에 용해시켰다. DMTMM를 가하기 전에, 반응 혼합물을 50 ℃로 예비가열하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 0.5 μM이었다. 반응을 5O ℃에서 3 시간 동안 20 μl의 용적으로 100 mM MOPS pH 6.5, 1 M NaCl, 100 mM DMTMM (최종 농도) 중에서 수행하였다.
반응물을 천연 PAGE (20 % 폴리아크릴아미드, Invitrogen) 및 변성 PAGE (10 % 폴리아크릴아미드, 7 M 우레아, Invitrogen)하여 분석하고, SYBR 그린 (Molecular Probes S7563, 1:10.000 희석, 1x TBE 완충액 중, 지시에 따름)으로 염색하였다. 모든 결과가 도 19에 나타나 있다.
호모이작용성 링커 BSOCOES에 의해 알파-아민을 통해 vip017의 변형된 내부 dT에 있는 1급 아민에 아미노산 (Gly)을 가교결합시킴으로써 올리고뉴클레오티드 vipO17을 작용화시켰다. 변형된 dT를 vipO17에 있는 2개의 하이브리드화 분절 사이에 위치시켰다. vip008은 변형된 dT에 수용체 아민을 포함하지 않고, vip017에 하이브리드화할 하이브리드화 분절을 포함하여, DMTMM의 첨가시 vip017-Gly에 공유적으로 가교결합되지 않을 것이다. 따라서, 어떠한 가시적 밴드도 레인 1에서 관측되지 않았다.
vipO18-NH2는 1급 아민을 포함하는 변형된 dT에 이어 vip017에 있는 5' 하이브리드화 분절에 상보적인 3' 하이브리드화 분절을 갖는다. 그 결과, vipO17-Gly 및 vipO18-NH2를 어닐링함으로써 vip017에 접합된 아미노산과 vip018 상의 1급 아민 사이에 근접성이 생긴다. 따라서, 가교결합된 vipO17-Gly/vipO18-NH2로 구성된 이량체에 상응하는 밴드가 레인 2에서 관측되었다.
vip006은 vipO17-Gly 및 vipO18-NH2 모두에 대한 상보적 분절을 가지므로, 폐쇄된 삼량체 별 구조물을 형성하고, 별 구조물의 중심에 있는 반응 챔버에 vipO17-Gly 및 vip018-NH2의 화학적 작용기를 배열할 수 있다. 따라서, 기교결합된 vip017-Gly/vip018-NH2로 구성된 이량체에 상응하는 밴드가 레인 3에서 관측되었다. 레인 3은 레인 2 보다 많이 염색 되었으며, 이는 폐쇄된 삼량체 별 구조물이 개방된 이량체 구조물보다 우수한 반응 조건을 만든다는 것을 나타낸다.
vip020-NH2는 1급 아민을 포함하는 변형된 dT를 가지나 vip017-Gly에 대한 하이브리드화 분절을 포함하지 않는다. 그 결과, vip020-NH2 및 vipO17-Gly의 반응물이 염기쌍에 의해 근접하지 않으므로 레인 4에 어떠한 밴드도 보이지 않는다.
vipOO6은 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 vip020-NH2에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 가지며, 2개의 하이브리드화 분절 사이에 1급 아민을 포함하는 변형된 dT를 갖는다. 따라서, vipOO6는 작용 그룹들을 근접하게 하여, 레인 5에 밴드가 가시화되며, 가교결합된 vipO17-Gly 및 vip020-NH2를 구성한다.
vip009는 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 vip020-NH2에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 가지며, 2개의 하이브리드화 분절 사이에 1급 아민을 포함하는 변형된 dT를 갖는다. 따라서, vip009는 작용 그룹들을 근접하게 하여, 레인 6에 밴드가 가시화되며, 가교결합된 vipO17-Gly 및 vip020-NH2를 구성한다.
vipOO6은 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 vip020-NH2에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 가지며, 2개의 하이브리드화 분절 사이에 1급 아민을 포함하는 변형된 dT를 갖는다. vipOO9는 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 vip020-NH2에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 가지며, 2개의 하이브리드화 분절 사이에 1급 아민을 포함하는 변형된 dT를 갖는다. 이들 4개의 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화로 사량체 별 구조물이 형성된다. 레인 7에서 밴드가 관측되었으며, 이는 vip017-Gly 및 vip020 상의 작용 그룹이 4개의 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화에 의해 서로 근접하게 된다는 것을 나타낸다. 또한, 레인 7은 레인 5 및 6 보다 많이 염색되었으며, 이는 폐쇄된 사량체 별 구조물이 개방 삼량체 구조물보다 우수한 반응 조건을 만든다는 것을 나타낸다.
vipO48-NH2는 1급 아민을 포함하는 변형된 dT 및 vipO17-Gly에 결합할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절을 갖는다. 1급 아민을 포함하는 변형된 dT와 vipO17-Gly에 결합할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 사이에 하이브리드화에 수반되지 않은 6개의 뉴클레오티드 (워블 (wobble) 뉴클레오티드)가 삽입된다. 하나의 밴드가 레인 8에서 관측되었으며, 이는 2개의 올리고뉴클레오티드의 가교결합을 나타낸다. 그러나, 도입된 6개의 부가적 뉴클레오티드는 레인 8 및 레인 2를 비교할 때 나타나는 바와 같이 수득되는 가교결합 생성물의 양을 낮추지는 않았다.
vipOO6은 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 vip048에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 갖는다. vipO48-NH2는 1급 아민을 포함하는 변형된 dT 및 vipO17-Gly에 결합할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절을 갖는다. 1급 아민을 갖는 변형된 dT와 vipO17-Gly에 어닐링할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 사이에 하이브리드화에 수반되지 않은 6개의 뉴클레오티드 (워블 뉴클레오티드)가 삽입된다.
vip006의 존재는 2개의 반응성 그룹을 근접시키고, 레인 9에서 보여지는 바와 같이 생성물을 형성한다. 밴드 강도는 레인 8에서 보여지는 것보다 강하였으며, 이는 vip006이 구조 (삼량체 별 구조물)를 안정화시키고, 이량체 형성 반응에서 보여진 것보다 반응이 잘 진행한다는 것을 나타낸다.
vipO48-NH2는 1급 아민을 포함하는 변형된 dT 및 vipO17-Gly에 결합할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절을 갖는다. 1급 아민을 갖는 변형된 dT와 vipO17-Gly에 어닐링할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 사이에 하이브리드화에 수반되지 않은 6개의 뉴클레오티드 (워블 뉴클레오티드)가 삽입된다. vipO56은 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 6개의 워블 뉴클레오티드를 포함하는 vipO48-NH2의 분절에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 포함한다. 따라서, 이러한 3개의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 시, vipO48의 변형된 dT 상의 1급 아민은 반응 챔버로부터 6개의 뉴클레오티드를 떨어져 이중 스트랜드 암에 위치된다. 이중 스트랜드의 DNA는 단일 스트랜드의 DNA와는 대조적으로 매우 단단하여 접합된 잔기가 자유롭게 움직이는 것을 억제함으로써 이의 반응성을 감소시킨다. 따라서, 단지 매우 희미한 염색이 레인 10에서 관측되 었다.
vip018-NH2는 1급 아민을 포함하는 변형된 dT에 이어 vipO17-Gly의 5' 하이브리드화 분절에 상보적인 3' 하이브리드화 분절에 결합할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절을 갖는다.
vip056은 vipO17-Gly의 분절에 하이브리드화할 수 있는 하나의 하이브리드화 분절 및 vipO18-NH2의 분절에 하이브리드화할 수 있는 또 다른 하이브리드화 분절을 갖는다. vip056은 2개의 하이브리드화 분절 사이에 6개의 여분의 뉴클레오티드 (워블 뉴클레오티드)를 포함한다. 이량체 밴드가 레인 11에서 관측되며, 이는 반응성 그룹이 화학적 반응이 일어나도록 서로 근접하며, vip056에 있는 6개의 워블 뉴클레오티드가 이러한 실험에서 현재 구조로 근접성을 손상시키지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 11
다양한 올리고뉴클레오티드의 화학적 제조
실시예 11.1
내부 변형된 dT (아민-C6-dT) (위치 n = 1)을 갖는 올리고뉴클레오티드의 아세틸화
DMT-MM으로 촉진되는 Fmoc-AA-OH로의 아세틸화
인산나트륨 400 mM, pH 7.0, MOPS 400 mM, pH 7.5, HEPES 400 mM pH 8.0, 인 산나트륨 400 mM, pH 8.8의 완충액 중 하나와 함께 DMF와 300 mM NaCl의 1:1 혼합물에 용해된 올리고뉴클레오티드 (500 pmol)를 DMT-MM (4-(4,6-디메톡시-l,3,5-트리아진-2-yl)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드, Fluka #74104) 50 mM로 처리함으로써, 내부 아민-C6-dT를 갖는 올리고뉴클레오티드 vipO68을 DMT-MM로 촉진되는 Fmoc-Leu-OH로의 아실화를 수행하였다. 총 반응 용적은 20 μL였다. 반응물을 16 시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 50 μL로 희석시키고 제작자의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼 (Amersham Biosciences #27-5325-01)에서 정제한 후, HPLC 및 질량 분광 분석으로 정제하였다.
일반적 정제 방법:
작용화된 올리고뉴클레오티드를 용출제로 아세토니트릴/TEAA 100 mM pH 7.0 혼합물을 사용하면서 XTerra Cl 8 column (Waters #186000602) 상에서 자동 샘플러 및 분획 수집기를 갖는 Hewlett Packard Agilent HPLC 기구로 정제하였다. 적합한 분획을 동결건조시키고, 물로 20 mM로 희석시켰다.
일반적 질량 분광 분석:
작용화된 올리고뉴클레오티드를 네가티브 이온 반사 모드를 이용하여 HPA/암모늄 시트레이트 매트릭스에서 Bruker AutoFlex 기구로 MALDI-TOF 질량 분광학에 의해 분석하였다.
DNA 이론량 실측량
vip068-LeuFmoc 6843,340 6844,5
실시예 11.2
올리고뉴클레오티드 내부 변형된 dT (아민-C6-dT) (위치 n = 1)을 갖는 올리고뉴클레오티드의 아세틸화
Fmoc-AA-OSu로의 아세틸화
올리고뉴클레오티드 vipO46을 DMF와 인산나트륨 완충액 100 mM, pH 7.4의 1:1 혼합물 중에 용해된 올리고뉴클레오티드 (125 pmol)을 25 ℃에서 2 시간 동안 25 mM Fmoc-Gly-OSu (Chemlmpex #02420) 또는 Fmoc-Leu-OSu (Chemlmpex #02429)로 처리함으로써 Fmoc-AA-OSu (AA = Gly 또는 Leu)로 아실화시켰다. 작용화된 올리고뉴클레오티드를 문헌 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)에 따라 NH4OAc/EtOH로 침전시켰다. 펠렛을 물에 재현탁시키고, MALDI-TOF 질량 분광학으로 분석하였다.
DNA 이론량 실측량
vip046-LeuFmoc 6932,3642 6932,1
vip046-GlyFmoc 6876,3016 6876,1
실시예 11.3
내부 변형된 dT (아민-C6-dT) (위치 n = 1)을 갖는 올리고뉴클레오티드의 아세틸화
펩티드-올리고뉴클레오티드 접합물 (아미노산에 대해 단문자 약어 사용): YGGFL-vip068, GLFYG-vip068, YGGFL-PEG-vipO68, GLFYG-PEG-vip068, GFL-vipO16 및 GFL-PEG-vipO16의 합성: Fmoc-AA-OSu로의 아세틸화에 이어서 세파로즈 상에서 탈보호
펩티드를 내부 변형된 dT상의 1급 아민으로부터 DEAE 세파로즈 (Sigma #DFF100)에 흡착된 올리고뉴클레오티드에 합성하였다. 아미노산을 수 라운드의 아실화에 의해 Fmoc-AA-OSu (AA = Gly, Leu, Phe, Tyr, C6, PEG) (Fmoc-L-글리신 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #02420; Fmoc-L-루이신 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #02429; Fmoc-L-페닐알라닌 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #02446; Fmoc-L-티로신 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #11972; Fmoc-6-아미노헥사노산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #7296; Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시숙신이미드와의 EDC 커플링에 의해 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 (Chemlmpex #7310)로부터 합성됨)와 커플링한 후, 문헌 (Halpin and Harbury, Plos Biology 2004, 2, 1-8)의 절차에 따라 Fmoc를 탈보호하였다. 세포로즈로부터 DNA를 용출시킨 후, 혼합물을 제작자의 프포토콜에 따라 스핀 컬럼 (Amersham Biosciences #27-5325-01)에서 탈염시키고, HPLC로 정제하였다. 수율을 HPLC로 측정하였다.
DNA 분리 효율
YGGFL-vipO68 19 %
YGGFL-PEG-vipO68 32 %
GLFYG-vip068 11 %
GLFYG-PEG-vipO68 18 %
GFL-vipO16 30 %
GFL-PEG-vipO16 36 %
실시예 11.4
내부 변형된 dT (아민-C6-dT) (위치 n = 1)를 갖는 올리고뉴클레오티드의 아세틸화
C6-NH2, PEG-NH2 및 Gly-NH2 링커를 갖는 수용체 올리고뉴클레오티드의 합성
DEAE 세파로즈 (Sigma #DFF100)에 흡착된 올리고뉴클레오티드 vipOl6를 vipO16의 내부 변형된 dT 상의 1급 아민에서 FmocNH-C6-CO2Su (Fmoc-6-아미노헥사노산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #7296), FmocNH-PEG-OSu (Fmoc-S-아미노-3,6-디옥사옥타노산 히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시숙신이미드와의 EDC 커플링에 의해 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 (Chemlmpex #7310)으로부터 합성됨) 또는 Fmoc-Gly-OSu (Fmoc-L-글리신 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Chemlmpex #02420)로 아실화한 후, 문헌 (Halpin and Harbury, Plos Biology 2004, 2, 1-8)의 절차에 따라 Fmoc 보호 그룹을 절단하였다. 반응을 1 nmol DNA에서 수행하였다. 세파로즈로부터 DNA를 용출시킨 후, 혼합물을 제작자의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼 (Amersham Biosciences #27-5325-01)에서 탈염시킨 후, HPLC에 의해 정제하였다. 수율을 HPLC로 측정하였다.
분리된 DNA 수율
H2N-PEG-vip016 39 %
H2N-C6-vipO16 39 %
H-G-vipO16 45 %
실시예 11.5
위치 n ≠l에서 BSOCOES 또는 DSS에 의한 아미노산의 내부 변형된 dT (아민-C6-dT)을 갖는 올리고뉴클레오티드에의 접합
DMF와 40OmM pH 8.4 인산나트륨 완충액의 1:1 혼합물 중의 올리고뉴클레오티드 (0.5 nmol) 및 아미노산 (15 mM)을 링커 (10 mM)로 처리하여 호모이작용성 링커 BSOCOES ((비스[2-(숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸]술폰), Pierce cat# 21600) 및 DSS (디숙신이미딜 수버레이트, Pierce #21655)에 의해, 알파-아민을 통해 올리고뉴클레오티드의 내부 변형된 dT에 있는 1급 아민에 아미노산 (Gly, L-Leu, L-Phe, L-Tyr, Fluka, #50052, #61820, #78020, #93829)을 가교결합시킴으로써 올리고뉴클레오티드 vipO46, vipO17, vipO47 및 vipO48을 작용화시켰다. 반응물의 총 용적은 20 μL였다. 반응물을 25 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 50 μL로 희석시키고, 제작자의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼 (Amersham Biosciences #27-5325-01) 상에서 정제한 후, HPLC로 정제하였다. 수율을 HPLC로 측정하였다. MALDI-TOF 질량 분광학으로 정체를 측정하였다.
DNA 분리 효율 이론량 실측량
vip046-BSOCOES-Gly 32 % 6878,2325 6879,3
vip046-BSOCOES-Leu 48 % 6934,2951 6936,1
vip046-BSOCOES-Phe 49 % 6968,2795 6969,0
vip046-BSOCOES-Tyr 51 % 6984,2744 6985,5
실시예 12
상이한 온도에서 반응 중심에서의 아실화 반응의 안정성
본 실시예는 하나의 아미노산의 전달이 승온에서 삼량체 별 구조물에 어떻게 수행될 수 있는가를 측정한다. 그 결과가 도 20에 나타나 있다.
올리고 vipOO6, vipOl8, 및 vipO17-Leu (DNA Technology Arhus, Denmark, 실시예 11에 기술된 바와 같이 유도체화된 vip017)을 20 mM 스톡 용액으로 모르폴리 노프로판술폰산 (MOPS, 100 mM, pH 7.0) 및 NaCl (1 M)의 최종 조성을 포함하는 완충 용액에 혼합하였다. 용액을 어닐링 프로그램에 적용하였다 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 8O ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 5O ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 1O ℃). 각각의 반응물에 화학적 활성화제 (DMTMM, Fluka #74104, 10OmM 수용액, 최종 농도 5 mM)을 가하고, 25 ℃ 또는 70 ℃에서 지시된 시간 동안 인큐베이션하였다.
반응 혼합물을 변성 (10 %) PAGE에 의해 분석하고, 밴드를 SYBR 그린 염색 (5 분 동안 50 % EtOH에 겔의 고정화, 5 분 동안 수조에서 세척, 이어서 1xTBE 완충액 중의 SYBR 그린의 10,000배 희석된 DMSO 스톡에서 10 분 동안 인큐베이션)에 의해 가시화하였다.
25 ℃에서의 반응 수행을 위해, 검출가능하지 않은 양의 생성물을 처음 2 시간 후 관측하였다 (반응 1-5). 4 시간 반응 (반응 6)에서, 소량이 관측되었다. 밤새 인큐베이션한 후 보다 많은 활성화제가 첨가되는 경우 관측되는 가장 높은 세기로 유의한 양은 관측되었다.
7O ℃에서의 반응 수행을 위해, 제1 트레이스의 생성물이 5 분 후 관측되었다 (반응 2). 240 분 까지는 증가량이 관측되었으며, 밤새 반응 동안 감소량이 관측되었다.
vipO17-Leu 및 vip018의 목적하는 가교결합된 생성물은 25 ℃ 및 7O ℃ 모두에서 선명하게 형성되었으므로, 별 구조물이 승온에서 수행되는 반응을 매개할 수 있다는 것을 입증한다. 반응 속도는 본 실험에서 이용된 2개이 온도에서 명백히 상이하다. 그러나, DMTMM에 의한 아미노산 카복실산의 초기 활성화가 DNA에 의한 디리게이션 (dirigation)이 아니라 단지 분자내 충돌에 의해 조절되기 때문에 예상되는 것이다.
실시예 13
상이한 pH에서 반응 중심에서의 아실화 반응의 안정성
본 실시예는 하나의 아미노산이 5.2 내지 8.0의 pH 범위에서 삼량체 별 구조물에 어떻게 전달될 수 있는지를 입증한다. 낮은 pH에서 수용체 아미노산은 부분적으로 양성자화될 수 있으므로 강력한 친핵체로서 이를 불활성화시킬 수 있다. 보다 높은 pH에서 아미노산 카복실산의 활성화에 의해 생성되는 반응성 중간체가 가수분해되어 이를 불활성화시키고 화학적 활성화제를 파괴할 수 있다. 이들 모두 목적하는 아미드 결합의 형성을 방해할 수 있다. 그 결과가 도 21에 나타나 있다.
20 mM 스톡 용액으로서 올리고 vipOl6, vipOO8, 및 vipO17-Tyr (DNA Technology Arhus, Denmark, 실시예 11에 기술된 바와 같이 유도체화된 vipO17)을 2M NaCl에서 혼합하고 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 8O ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 50 ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 10 ℃)을 수행하였다. 이러한 어닐링 혼합물을 모르폴리노프로판술폰산 (MOPS, 100 mM, pH 5.2, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 또는 8.0), NaCl (1 M) 및 화학적 활성화제 (DMTMM, Fluka #74104, l,0 M 수용액, 최종 농도 75 mM)의 최종 조성으로 완충 용액에 희석하고, 5O ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 DNA 농도는 0.5 mM이었다. 반응 혼합물을 변성 PAGE (10 % 겔)로 분석하고, 10 분 동안 SYBR 그린 (DMSO 스톡으로부터 TBE-EtOH (96 %) 1:1에 10.000배 희석)과 인큐베이션하였다.
pH 5.2 내지 8.0을 커버하는 7개 레인 모두 가교결합된 올리고 vipO16-vipO17-Tyr에 대해 강력한 밴드를 나타내었으며, 이는 조작할 수 있는 넓은 pH 윈도우를 나타낸다. 따라서, 상기한 조건을 이용하는 수용체 아민의 양성자화 또는 반응성 중간체의 가수분해가 중요한 문제는 아니다.
실시예 14
상이한 수준의 유기 용매에서 반응 중심에서의 아실화 반응의 안정성
DNA 별 구조물의 안정성을 입증하기 위해서, 하나의 아미노산의 절단을 H2O와 유기 용매의 혼합물에서 수행하였으므로 유기 화학 합성에 이용된 조건과 유사하다. 염기 쌍 및 별 구조물이 이들 조건 하에서 파괴되면 어떠한 가교결합된 생성물도 형성되지 않는다. 용매 디옥산, 아세토니트릴 및 테트라히드로푸란은 물과의 혼화성 및 유기 합성 시 일반적인 적용성 관점에서 선택되었다.
20 μM 스톡 용액으로서 올리고 vipO16, vipOO8, 및 vipO17-Phe (DNA Technology Arhus, Denmark, 실시예 11에 기술된 바와 같이 유도체화된 vipO17)을 MOPS (200 mM, pH 6.5; Fluka #69947)와 NaCl (2M; Fluka #71376)의 혼합물에서 혼합하고 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 80 ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 50 ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 1O ℃)을 수행하였다. 이 러한 어닐링 혼합물을 모르폴리노프로판술폰산 (MOPS, 100 mM, pH 6.5), NaCl (1 M), 용매 (0, 10, 20, 30, 또는 35 vol%), 및 화학적 활성화제 (DMTMM, Fluka #74104, l,0 M 수용액, 최종 농도 75 mM)의 최종 조성으로 용매와 물의 혼합물에 희석하고, 5O ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 DNA 농도는 0.5 μM이었다. 반응 혼합물을 변성 PAGE (10 % 겔)로 분석하고, 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (Molecular Probes, #S7563)과 인큐베이션하였다. 그 결과가 도 22에 나타나 있다.
디옥산에 대해 가교결합된 생성물이 20 % 이하의 용매로 형성되었다. 다른 한편, 아세토니트릴 또는 테트라히드로푸란을 포함하는 모든 반응에 대해 유사한 양의 생성물이 형성되었으며, 이는 적어도 35 %까지의 유기 용매의 존재가 잘 허용되고 DNA 염기 쌍이 온전하였다는 것을 나타낸다.
실시예 15
상이한 수준의 DMF에서 반응 중심의 안정성
DNA 별 구조물의 안정성을 입증하기 위해서, 하나의 아미노산의 전달을 H2O-DMF 혼합물에서 수행하여 유기 화학 합성에 이용되는 조건과 유사하게 하였다. 염기 쌍 및 별 구조물이 이들 조건 하에 파괴되면 어떠한 가교결합도 형성될 수 없다.
20 μM 스톡 용액으로서 올리고 vipOl6, vip008, 및 vipO17-Phe (DNA Technology Arhus, Denmark, 실시예 11에 기술된 바와 같이 유도체화된 vipO17)을 MOPS (500 mM, pH 6.5; Fluka #69947) 및 NaCl (4M; Fluka #71376)의 완충액에서 혼합하고 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 80 ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 50 ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 10 ℃)을 수행하였다. 이러한 어닐링 혼합물을 모르폴리노프로판술폰산 (MOPS, 12.5 mM, pH 6.5), NaCl (10OmM), DMF (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 70 vol% DMF), 및 화학적 활성화제 (DMTMM, Fluka #74104, l,0 M 수용액, 최종 농도 75 mM)의 최종 조성으로 DMF와 물의 혼합물에 희석하고, 25 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 최종 DNA 농도는 0.5 μM이었다. 반응 혼합물을 변성 PAGE (10 % 겔)로 분석하고 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (Molecular Probes, #S7563)과 인큐베이션하였다. 그 결과가 도 23에 나타나 있다.
처음 5개의 레인에 생성된 생성물 밴드는 강도가 유사하며, 이는 적어도 40 %까지의 유기 용매 DMF의 존재가 잘 허용되며 DNA 염기 쌍이 온전하였음을 나타낸다. 50 % DMF에서는 여전히 약한 밴드가 관측되었으나, 60 % 이상에서는 가교결합된 생성물이 검출되지 않았다.
실시예 16
화학 반응을 매개하기 위한 상이한 활성화제
본 실시예는 다양한 화학적 활성화제 및 보조적 친핵체가 아미노산으로 수용체 아민의 아실화를 매개하는데 사용될 수 있는 가를 설명하기 위한 것이다. 보조 적 친핵체의 첨가가 아실화 속도를 크게 향상시키고/시키거나 반응물의 최종 결과를 변화시킬 수 있다는 것은 펩티드 화학으로부터 공지되어 있다. 본 실시예에서 반응은 보조적 친핵체를 사용하지 않고도 수행하였으며, N-히드록시숙신이미드 (NHS, 예: Fluka #56480), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염 (s-NHS, Fluka #56485), 또는 N-히드록시벤조트리아졸 수화물 (예: Fluka #54804)을 활성화제로서 DMTMM (Fluka #74104) 또는 EDC (예: Fluka #03449)와 함께 사용하였다.
20 mM 스톡 용액으로서 올리고 vipO16, vip008, 및 vipO17-Tyr (DNA Technology Arhus, Denmark, 실시예 11에 기술된 바와 같이 유도체화된 vipO17)을 MOPS (200 mM, pH 6.5) 및 NaCl (2M)의 완충액에서 혼합하고 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 80 ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 50 ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 10 ℃)을 수행하였다. 이러한 어닐링 혼합물을 모르폴리노프로판술폰산 (MOPS, 100 mM, pH 6.5), NaCl (1 M), 보조적 친핵체 (최종 농도 25 mM), 및 화학적 활성화제 (DMTMM 또는 EDC, 0.5M 수용액, 최종 농도 75 mM)의 최종 조성으로 물 및 첨가제의 용액으로 희석하였다. 최종 DNA 농도는 0.5 mM이었다. 반응물을 50 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
반응 혼합물을 변성 PAGE (10 % 겔)로 분석하고, 10 분 동안 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (DMSO 스톡으로부터 TBE-EtOH (96 %) 1:1 중에 10.000배 희석)과 인큐베이션하였다. 그 결과가 도 24에 나타나 있다.
활성화제로서 DMTMM을 사용하는 반응 1-4에서, 첨가제를 사용하거나 사용하지 않고도 차이가 관측되지 않았다. 단지 EDC에 대해서만 아주 선명하게 관측되었 으며, 이 경우 없거나 단지 희미하게 생성물이 관측되었다. 그러나, 보조적 친핵체의 첨가는 필적하는 양의 가교결합된 생성물을 제공하였다. 이는 활성화제로서 EDC를 사용하는 경우에 보조적 친핵체가 필요하며 반응 혼합물에서 잘 허용된다는 것을 입증한다.
실시예 17
아미노산의 다른 수용체로의 전달
본 실시예는 아미노산이 어떻게 다양한 방식으로 연결된 다수의 수용체 아민에 효과적으로 전달될 수 있는 가를 입증한다. C6-NH2를 수반하는 vipOl6가 이전과 같이 대조군으로 사용되었다. 기타 수용체는 트리펩티드 GFL-vipO16, PEG 연결된 트리펩티드 GFL-PEG-vipOl6, 아미노 작용화된 NH2-PEG-vip016, 아미노 작용화된 NH2-C6-vip016, 및 G-vipO16의 글리신 (모두 실시예 XX에 기술된 바와 같이 제조됨)이었다.
20 mM 스톡 용액으로서 올리고 vipO16-X-NH2, vipOO8, 및 vip017-Gly (DNA Technology Arhus, Denmark, 실시예 XX에 기술된 바와 같이 유도체화된 vipO17)을 MOPS (200 mM, pH 6.5) 및 NaCl (2 M)의 완충액에서 혼합하고 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 80 ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 5O ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 1O ℃)을 수행하였다. 이러한 어닐링 혼합물을 모르폴리노프로판술폰산 (MOPS, 100 mM, pH 6.5), NaCl (1 M), 및 화학적 활성화제 (DMTMM, Fluka #74104, 1.0 M 수용액, 최종 농도 75 mM)의 최종 조성으로 물 및 활성화제의 용액으로 희석하였다. 최종 DNA 농도는 0.5 mM이었다. 반응물을 50 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
반응 혼합물을 변성 PAGE (10 % 겔)로 분석하고, 10 분 동안 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (DMSO 스톡으로부터 TBE-EtOH (96 %) 1:1 중에 10.000배 희석)과 인큐베이션하였다. 그 결과가 도 25에 나타나 있다.
모든 6개의 반응물은 가교결합된 생성물로부터 강한 밴드를 나타낸다. 레인 4 및 5는 보다 큰 펩티드 (테트라펩티드)이기 때문에 다른 것과 비교하여 조금 느리게 진행하는 것으로 관측되었다. 따라서, 하나의 글리신의 트리펩티드 +/-PEG 링커, PEG 링커 자체, C6 링커를 통해 연결된 아미노 그룹으로, 또는 글리신으로 직접적으로의 전달은 일치하는 결과는 제공한다. 이는 별 구조물에 의해 형성되는 반응기의 견고함을 입증한다. 수용체 크기의 증가는 가교결합의 결과에 영향이 거의 없거나 전혀 없다.
실시예 18
2개의 구조적 DNA 디스플레이 생성물의 조립 및 후속 결합
2개의 구조적 DNA 디스플레이 생성물을 형성하였다: Leu-엔케팔린 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-DNA) 및 스크램블 (scramble) Leu-엔케팔린 (Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly-DNA). 후자는 Leu-엔케팔린 특이적 모노클로날 항체 3E을 사용하는 분할 검정을 위한 음성 대조군으로 포함시켰다. 과정의 주요 단계가 도 26에 도시되어 있다.
DNA 올리고뉴클레오티드는 DNA Technology (Aarhus, Denmark)로부터 구입하고, 실시예 11에 기술된 바와 같이 작용화시켰다.
각각 Leu-엔케팔린-DNA 및 스크램블 Leu-엔케팔린을 형성하기 위해 2개의 분리 반응으로 하기 올리고의 어닐링을 수반하는 과정의 제1 단계. 반응 1 (R1)에: Gly-Phe-Leu-PEG-vip231, Gly-BSOCOES-vip262 및 vip088 (각각 3-웨이 (3-way) DNA 별 구조물의 위치 1, 2 및 3) 및 반응 2 (R2)에서 : Gly-Tyr-Phe-PEG-vip23S, Leu-BSOCOES-vip269 및 vipOSS (각각 3-웨이 DNA 별 구조물의 위치 1, 2 및 3). 반응물 중의 3개의 올리고는 서로 하이브리드화하여 3-웨이 연결을 형성할 것이며, 이때 부착된 아미노산은 구조물의 중심에 위치된다. vipO88은 부착된 화학적 작용기를 갖지 않는다는 것을 주목한다. VipO88의 작용은 단순히 폐쇄된 3-웨이 연결을 형성하기 위해 2개의 다른 올리고에 하이브리드화하는 것이다.
200 pmole의 각각의 올리고를 100 mM 모르폴리노프로판술폰산 (MOPS, Fluka #69947) pH 6.5 및 1 M NaCl에 370 μl의 총 용적으로 혼합하였다. 올리고의 어닐링은 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션한 후 약 30 분에 걸쳐 실온으로 냉각시켜 수행하였다. 활성화제 DMT-MM (Fluka #74104)를 물에 용해시키고, 75 mM의 최종 농도로 가하였다. 최종 반응 용적은 400 μl였다. 화학 반응물은 5O ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 각각의 반응물에 2.5 용적의 에탄올 및 1 μl GenElute (Sigma 56575)을 가하고 4 ℃에서 30 분 동안 20000 xg에서 원심분리하여 반응물을 에탄올 침전시켰다. 펠렛을 공기 건조시키기 전에 70 % 에탄올로 세척하고, 물에 재현탁하였다.
이어서, 샘플을 제작자의 지시에 따라 비-천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE); 10 % TBE-우레아 겔 (Invitrogen)을 수행하였다. 가교결합된 생성물에 해당하는 밴드를 절단하고, 반응물을 "분쇄 및 담금 (crush and soak)" 방법 (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory)에 의해 추출하였다: 겔 조각을 분쇄하고 400 TBE 완충액에 밤새 담갔다. 샘플을 상술된 바와 같이 에탄올 침전하였다. 침전물을 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에 용해시켰다. 이어서, 5' 말단을 폴리머라제 키나제로 포스포릴화하였다; 50 단위의 폴리뉴클레오티드 키나제 (NEB M0201)를 총 200 μl 반응 용적에 포함시켰다. 반응물을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 2개의 가교결합된 올리고를 DNA 리가제에 의해 연속적인 DNA 스트랜드로 전환시켰으며, 이때 R1에 대해 나란히 놓인 vip231의 3' 말단과 vip262의 5' 말단 및 R2에 대해 나란히 놓인 vip238의 3' 말단과 vip269의 5' 말단 사이에 포스포르디에스테르 결합을 형성하였다. T4 DNA 리가제 (NEB M0202L)를 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl에 가하고, 5 unit/μl 효소를 가하여, 300 μl의 최종 반응 용적을 수득하였다. 결합물을 16 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
이어서, 절단가능한 BSOCOES 링커를 제거하였다. 3-(사이클로헥실아미노)-l-프로판술폰산 (CAPS, Fluka# 29338) (pH 11.8) 완충액 및 2-머캅토에탄올 (Fluka# 63689)을 가하여 600 μl의 최종 반응 용적으로 각각 100 및 60 mM의 최종 농도를 얻었다. 반응물을 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반 응물을 200 μl 1 M MOPS 완충액, pH 6.5을 가해 중화시켰다. 이어서, DNA를 표준 절차에 따라 에탄올 침전시켰다. 펠렛을 공기 건조시킨 후, 위치 3에 작용화된 올리고뉴클레오티드를 도입하는 다음 단계를 준비하였다. BSOCOES의 제거로 2개의 1급 아민이 형성된다는 것을 주목한다: 하나는 최초 위치 1 상의 성장하는 펩티드 쇄의 말단에 있고, 다른 하나는 최초 위치 2 올리고뉴클레오티드 상에 위치된다. 소위 "워블링 (wobbling)" 전략을 이용하여 성장하는 펩티드 쇄와 다음 단계에서 위치 3에 들어오는 아미노산 사이의 후속하는 반응을 유리하게 한다: 위치 2의 올리고는 변형된 염기의 상부에 일 스트레치의 염기 (워블링 염기) (이는 제1 화학적 전달 동안은 쌍을 이루지 않으나 제2 전달 과정에서는 위치 3 올리고와 염기 쌍을 이룬다)를 포함한다. 그 결과, 최초 위치 2 올리고뉴클레오티드 상의 1급 아민은, dsDNA가 유연하지 않기 때문에 별 구조물의 중심에 있는 잔기와의 반응성을 감소시킬 일 스트레치의 dsDNA에 의해 구조물의 중심으로부터 분리된다.
하기 조건 하에서 R1 생성물은 Tyr-BSOCOES-vip26에 어닐링되고, R2 생성물은 Gly-BSOCOES-vip270에 어닐링된다: 총 용적 240 μl로 100 mM MOPS, pH 6.5, 1 M NaCl 중 200 pmole 올리고. 이 혼합물을 약 30 분에 걸쳐 실온으로 냉각시킨 후, 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 활성화제 DMT-MM (Fluka #74104)를 아미노산 사이의 화학적 반응을 촉진하기 위해 75 mM의 최종 농도로 가하였다. 화학적 반응물을 5O ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 에탄올을 가하여 침전시킨 후, (상술된 바와 같이) 예비적 비-천연 PAGE를 수행하고 가교결합된 생성물에 상응하는 밴드를 겔로부터 잘라내었다. 이어서, 각각의 가교결 합된 생성물을 DNA 리가제에 의해 연속적인 DNA 스트랜드로 전환시키며, 이때 R1에 대해 나란히 놓인 최초 vip232의 3' 말단과 vip263의 5' 말단 및 R2에 대해 나란히 놓인 최초 vip269의 3' 말단과 vip270의 5' 말단 사이에 포스포르디에스테르 결합을 형성하였다.
또한, 말단 PCR 프라이밍 부위를 DNA 리가제에 의해 동일한 반응으로 도입하였다. 각각 R1 및 R2에 대해 PCR 프라이밍 부위 vip029/vip070 및 vipO29/vipO3O을 갖는 DNA 올리고를 하기 조건 하에서 예비-어닐링하였다: 40 μl의 최종 용적으로 1x 리가제 완충액 및 50 mM NaCl 중 각각의 올리고 200 pmole, PCR 기계로 95 ℃에서 5 분 및 하기 온도에서 30 초: 80 ℃, 65 ℃, 5O ℃, 45 ℃, 3O ℃, 2O ℃. vip070이 vipO29에 어닐링되는 경우, vip070의 4개의 대부분의 5' 말단 뉴클레오티드가 돌출한다. 이들 4개의 뉴클레오티드는, vip231이 vip263에 어닐링되는 경우 또한 돌출하는 vip231의 4개의 대부분의 5' 말단 뉴클레오티드에 역으로 상보적이다. 그 결과, 돌출 말단은 어닐링할 수 있고, DNA 리가제에 대한 기질을 형성한다. 마찬가지로, vip030을 vip029에 어닐링시키는 경우, vip070의 4개의 대부분의 5' 말단 뉴클레오티드가 돌출한다. 이들 4개의 뉴클레오티드는, vip238이 vip270에 어닐링되는 경우 돌출하는 vip238의 4개의 뉴클레오티드의 대부분의 5'에 역 상보적이다. 가교결합되고 겔-정제된 생성물을 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl에 재현탁시키고, R1 및 R2에 대해 각각 DNA 올리고; vip029/vip070 및 vip029/vip030를 포함하는 예비어닐링된 PCR 부위와 혼합하였다. 먼저 DNA 5' 말단을 200 μl의 최종 용적으로 50 단위의 폴리뉴클레오티드 키나제 (NEB 0201L)에 의해 포스포릴화하 였다. 반응물을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 R1 및 R2에서 각각 vip029-vip231-vip262-vip263-vip070 및 vip029-vip238-vip269-vip270-vip030로 이루어진 연속적인 DNA 스트랜드로 전환시켰다. 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl 중의 1500 단위의 T4 DNA 리가제 (NEB 0201L)를 반응물에 가해 300 μl의 최종 반응 용적을 만들었다. 결합 반응물을 밤새 16 ℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, BSOCOES 링커를 상술된 바와 같이 제거하였다. 샘플을 상술된 바와 같이 에탄올로 침전시킨 후, 예비적 비-천연 PAGE를 수행하고, 에탄올 침전시킨 후, 20 μl 물에 용해시켰다. 조립된 생성물을 프라이머 연장을 위해 준비하였다.
상술된 절차를 통해, 상술된 바와 같이 비-천연 PAGE에 의해 분석하기 위해 소량의 샘플을 제거하였다. 겔 사진이 도 27에 도시되어 있다. 레인 1 및 2는 R1 및 R2에 대해 각각 성공적으로 형성된 가교결합되고 작용화된 올리고 vip-231 (35 nt)/vip262 (68 nt) 및 가교결합된 vip-238 (35 nt)/vip-269 (68 nt)을 나타낸다. 가교결합된 생성물은 겉보기 크기 약 200 bp으로 이동한다. 실제 크기와 겉보기 크기의 차이는 역으로 상보적인 서열 때문에 비-천연 겔에서 조차 존재하는 형성된 생성물에서의 강력한 2차 구조 때문에 예측되는 것이다. 또한, 아마도 전체 길이의 종의 분해로부터 유래할 것 같은 보다 작은 크기의 밴드가 관측되었다.
레인 3 및 4는 R1 및 R2 각각에 대해 2개의 올리고의 결합 및 BSOCOES 링커의 제거 후의 생성물을 도시한다. 주요 생성물은 겉보기 크기 150 bp으로 이동한다. 또한, 아마도 전체 길이의 종의 분해로부터 생기는 보다 작은 크기의 밴드가 관측되었다. 레인 1 및 3 (및 레인 1 및 4) 모두에서의 종은 거의 같은 크기이나 겔에서 아주 상이하게 이동한다. 이는 레인 1 및 2의 종이 필수적으로 측쇄된 DNA 분자인 반면, 레인 3 및 레인 4의 종은 선형 DNA 분자이기 때문에 예측되는 것이다.
레인 5 및 6은 R1 및 R2 각각에 대해 위치 3 올리고의 가교결합 후의 생성물을 도시한다. 2가지 반응 모두에서, 위치 3 올리고는 74 nt이다. 따라서, 에측된 생성물은 177 nt이다. 그러나, 가교결합된 종의 겔의 겉보기 크기는 약 600 bp이다. 이는 DNA 별 구조물의 암에 있는 역으로 상보적인 서열 때문에 상기 종이 매우 강력한 2차 구조를 갖는 가교결합된 선형 DNA 분자로 이루어지므로 예측되는 것이다. 우레아 함유 PAGE 조차 구조를 변성시킬 수 없다.
레인 7 및 8은 위치 3 올리고와 PCR 부위 함유 올리고의 결합 및 BSOCOES 링ㅋ의 제거 후 R1 및 R2 각각에 대한 생성물을 포함한다. PCR 프라이밍 부위 포함 올리고를 가하고 총 64 nt이며, 따라서 목적하는 생성물은 241 nt이다. 겉보기 크기가 1000 bp를 초과하는 2개의 두드러진 밴드가 관측되었다. 상부 밴드는 아마도 전체 길이의 생성물을 포함하는 반면, 하부 밴드는 아마도 2개의 PCR 부위 포함 올리고 중 하나가 빠진 분자를 포함한다. 또한, 레인 8에서 겉보기 크기 600 bp로 이동하는 밴드가 나타났다. 이 밴드는 아마도 결합된 PCR 부위 포함 올리고가 없는 종을 나타낸다 (레인 8 및 6을 비교).
레인 9는 100 bp DNA 래더 (Fermentas, SM0248)를 포함한다.
프라이머 연장
조립된 생성물을 프라이머 연장시켜, 중심에 있는 화학적 생성물을 갖는 별 구조물에 폴딩된 DNA를 표면에 디스플레이되는 화학적 생성물을 갖는 선형의 이중 스트랜드의 분자로 전환시켰다. 반응물을 조립된 분자의 3'에 역으로 상보적인 vip038을 사용하여 프라이밍하였다. 반응을 1x Thermopol 완충액, 0.2 mM dNTP, 8 mM MgSO4, 1 M 베타인 (Sigma, B-0300), 0.4 μM vip038, 0.2 U/10 μl Vent (exo-) (NEB M0259L), 및 10 μl 프라이머 연장 반응 중 템플레이트로서 5 μl 조립 분자에서 수행하였다. 반응 혼합물을 2 분 동안 95 ℃, 30 초 동안 60 ℃ 및 5 분 동안 74 ℃에서 인큐베이션하였다.
결합 검정
합성된 펩티드를 디스플레이하는 DNA를 EMSA (electrophoresis mobility shift assay)로 분석하였다. 결합의 입증은 구조적 DNA에 의해 지시되는 캐리어 모듈로부터 화합물을 정확히 합성하는 능력을 확인할 것이다.
이러한 검정은 문헌 (Halpin and Harbury, PLoS Biol, 2, E174, 2004)을 따랐다. Rl (Leu-엔케팔린-DNA) 또는 R2 (스크럼블 Leu-엔케팔린-DNA)의 10 μL 프라이머 연장 생성물을 각각 4개의 튜브에 놓았다. 튜브 R1-1 및 R2-1에 1 μL 0.5 mg/ml 3E7 안티 Leu-엔케팔린 모노클로날 항체 (Chemicon, cat# MAB5276), 1 μL 1 M Tris-HCl pH 7.2 및 1 μL 0.1 % Triton-X/PBS를 가하였다. 튜브 Rl-2 및 R2-2 에 1 μL 0.5 mg/ml W6/32 모노클로날 항체 (Sigma, H1650), 1 μL 1 M Tris-HCl pH 7.2 및 1 μL 0.1 % Triton-X/PBS를 가하였다. 튜브 Rl-3 및 R2-3에 1 μL 0.5 mg/ml 3E7 안티 Leu-엔케팔린 모노클로날 항체, 1 μL 20 μM Leu-엔케팔린 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) (Schafer-N, Denmark) 및 1 μL 1 M Tris-HCl pH 7.2를 가하였다. 튜브 R1-4 및 R2-4에 1 μL 0.5 mg/ml 3E7 안티 Leu-엔케팔린 모노클로날 항체, 1 μL 20 μM 스크램블 Leu-엔케팔린 (Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly) (Schafer-N, Denmark) 및 1 μL 1 M Tris-HCl pH 7.2을 가하였다. 모든 샘플을 실온에서 1 시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 1.4 μL의 1OX 로딩 염료 (Invitrogen, Cat# 10816-015)를 각각의 샘플에 가하고, 전량을 겔에 로딩하였다. 또한, 1 μL의 lOO bp 및 1 kb 래더를 로딩하였다 (Fermentas #SM0248 and #SMO318). 10 % PAGE TBE 겔 (Invitrogen)을 45 분 동안 220 mV 및 15 mA에서 차갑게 진행하였다. 겔을 제작자의 지시에 따라 SYBR Green™ 핵산 염색 (Molecular Probes)을 20 분 동안 현상하였다. 겔의 사진이 도 28에 도시되어 있다. 그 결과, 모든 레인에서 겉보기 크기가 200-250 bp인 2개의 두드러진 밴드가 관측된다. 밴드는 아마도 이중 스트랜드의 DNA를 갖는 종을 포함한다 (추가의 입증을 예를 들어 실시예 21에서 찾을 수 있다). 상부 밴드는 의도된 241 bp의 전체 길이의 생성물을 갖는 웰에 상응하는 반면, 하부 밴드는 30 bp의 보다 작은 생성물을 제공할 vip029가 빠진 종을 포함한다. 겉보기 크기가 약 1000 bp인 2개의 두드러진 밴드가 모든 레인에서 관측된다. 이 밴드는 아마도 별 구조물로 폴딩된 DNA를 갖는 종을 포함한다: 상부 밴드는 아마도 전체 길이의 생성물을 포함하는 반면, 하부 밴드는 아마도 2개의 PCR 부위 포함 올리고 중 하나가 빠진 분자를 포함한다.
R1-1을 포함하는 레인 1에서, 겉보기 크기가 약 1500 bp인 밴드가 관측된다. 이 밴드는 전체 컴플렉스의 전기영동적 이동을 느리게 하는 3E7 항체에 결합하는 Leu-엔케팔린-DNA 생성물을 거의 포함한다. 이 밴드는 레인 2 (R1-2)에서 보여지는 바와 같이 IgG2A 이소타입 매치된 음성 대조군 항체와 인큐베이션하는 경우 부재한다. 상호작용의 특이성이 유리된 가용성 Leu-엔케팔린에 의한 결합 경쟁으로 추가로 실시된다; 레인 3에서, R1 생성물 3E7 및 유리 Leu-엔케팔린 펩티드가 공동-인큐베이션되는 경우, 겔-쉬프트된 밴드는 부재한다. 유리된 가용성의 스크램블 Leu-엔케팔린이 존재하는 경우, R1-4을 포함하는 레인 4에서는 경쟁이 나타나지 않는다. 각각 R2-1, R2-2, R2-3 및 R2-4를 포함하는 레인 5-8은, 예상되는 바와 같이 음성 대조군 R2 생성물 (스크램블 Leu-엔케팔린-DNA)이 3E7에 결합하지 않는다는 것을 보인다.
증폭
겔-쉬프트된 밴드 및 다른 밴드의 DNA가 온전함을 입증하기 위해, 겔 조각을 잘라내어, PCR을 위한 템플레이트로 사용하기 위해 DNA를 추출하였다. 도 29에 박스로 나타낸 겔 조각을 잘라내어 생성물을 "분쇄 및 담금" 방법 (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory)으로 추출하였다; 겔 조각을 분쇄하고 400 μl TE 완충액에 밤새 담갔다. 튜브를 20000 xg 에서 10 분 동안 회전시키고, 상등액을 새로운 튜브에 옮겼다. 이어서, 20 μl 반응물에서 폴딩된 200배 희석된 상등액 5 μl를 사용하여 PCR [1x 폴리머라제 완충액, 0.2 mM dNTP, 6 mM MgSO4, 0.2 μM vipO27, 0.2 μM vip028, 0.5 M 베타인 (Sigma, B-0300), 0.1 mg/ml BSA 0.08 unit/μl Vent(exo-)(NEB M0259L)]을 수행하였다. 써모사이클러에서 20 사이클의 95 ℃에서 30", 6O ℃에서 30" 및 74 ℃에서 30"를 수행하고, 2 μl의 샘플을 천연 10 % PAGE (Invitrogen)로 분석하며, 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (Molecular Probes)으로 염색하였다. 그 결과가 도 29에 나타나 있다. 레인 M은 100 bp DNA 래더 (Fermentas, SM0248)를 포함한다. 레인 1-5는 겔 정제된 템플레이트를 갖는 반응물을 포함한다: 모든 레인에서, 전체 길이의 생성물의 예상된 크기에 상응하는 약 250 bp의 두드러진 밴드가 관측된다. 이와는 대조적으로, 템플레이트가 가해지지 않은 음성 대조군을 포함하는 레인 6에서는 밴드가 관측되지 않는다. 그 결과, 구조적 DNA 디스플레이 생성물이 형성되고, 분할되며, 증폭될 수 있다는 것이 입증된다.
결론적으로, R1 생성물의 3E7 안티-Leu-엔케팔린 항체에의 특이적 결합은 Leu-엔케팔린 펩티드가 상기 과정으로 정확하게 조립되었다는 것을 확정적으로 입증한다. 또한, 리간드를 디스플레이하지 않는 생성물로부터 리간드를 디스플레이하는 생성물의 분할이 실제로 가능하다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 단순히 겔 쉬프트된 밴드를 분리하는 것에 의해 설명된다. 또한, 분할된 생성물은 예를 들어 DNA 서열분석에 의한 후속적 확인을 위해 증폭되거나 해독 과정에서 템플레이트로서 사용될 수 있어, 수회 사이클의 선별 및 증폭을 가능하게 한다.
실시예 19
환원적 아미노화의 DNA 별 구조물 지시
본 실시예는 구조적 DNA가 환원적 아미노화를 지시할 수 있다는 것을 설명하기 위한 것이다. 환원적 아미노화는 중요하고 넓게 적용가능한 화학선별 반응의 예로서 선택되었다.
올리고를 DNA Technology (Arhus, Denmark)로부터 입수하였다. 올리고뉴클레오티드 vipO46을 DST (디숙신이미딜 타르트레이트, Pierce #20589)로 올리고뉴클레오티드의 내부 변형된 dT에 있는 1급 아민에서 아세틸화시키고, NaIO4 (Aldrich #31,144-8)로 산화적 절단한 후 글리옥실레이트 작용화된 올리고를 수득하였다. 올리고뉴클레오티드 (2.5 nmol)를 40OmM pH 8.8 인산나트륨 완충액을 포함하는 40 % DMF/물 혼합물에서 DST (10 mM)로 처리하였다. 반응물의 총 용적은 100 μL였다. 반응물을 25 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, NaIO4 (50 μL의 150 mM 용액)을 가하고, 25 ℃에서 추가의 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 200 μL로 희석시키고, 제작자의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼 (Amersham Biosciences #27-5325-01)에서 정제한 후, 실시예 11에 따라 HPLC 및 질량 분광 분석으로 정제하였다. 수율: 36 %.
DNA 이론량 실측량
vip046-NHCOCHO 6653,202 6656,1
내부 변형된 dT (아민-C6-dT)를 갖는 벤즈알데히드-작용화된 올리고의 합성 (위치 n = 1) (vip046-NHCOCsH4CHO)
150 mM NaCl, 200 mM 인산나트륨 완충액 pH 8.8을 포함하는 40 % DMF/물 혼합물 중에 용해된 올리고뉴클레오티드 (2.5 nmol)를 DMT-MM 50 mM로 처리함으로써 DMT-MM (4-(4,6-디메톡시-l,3,5-트리아진-2-yl)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드, Fluka #74104)으로 촉진된 4-카복시벤즈알데히드 (Lancaster #8192)를 사용하여 올리고뉴클레오티드 vipO46을 아실화하였다. 반응물의 총 용적은 100 μL였다. 반응물을 25 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 제작자의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼 (Amersham Biosciences #27-5325-01)에서 정제한 후, 실시예 11에 따라 HPLC 및 질량 분광 분석으로 정제하였다. 수율: 53 %.
DNA 이론량 실측량
vip046-NHCOC6H4CHO 6729,233 6729,9
구조적 DNA 지시된 환원적 아미노화
반응 1 및 5에서, 각각 글리콜산 및 4-포르밀벤조산의 아미드를 수반하는 vip046의 2개의 유도체를 모르폴리노프로판술폰산 (Fluka #69947; MOPS, 100 mM, pH 5.2) 및 NaCl (Fluka #71376, 1 M)의 최종 조성을 포함하는 완충 용액에서 등몰량 (각각 10 pmole)의 vip017 및 vip008과 혼합하였다. 이 용액을 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 8O ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 50 ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 10 ℃)에 따라 수행하였다. 어닐링 혼합물에 환원물 (NaCNBH3; Sigma #156159, 1 M 수용액, 최종 농도 100 mM; 총 반응 용적 20 μL)을 가하고, 3O ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
대조군이 2가지 알데히드 모두에 대해 동시에 진행되었다:
ㆍvipO17를 아민을 수반하지 않는 vip007로 대체시켰다 (반응 2+6).
ㆍ삼량체와 비교되는 이량체의 효율을 시험하기 위해 vipOO8을 뺐다.
ㆍvip046-CHO을 vip019에 가교결합시켜 염기쌍을 이룰 수 없는 올리고 사이의 반응을 수행하였다 (반응 4+8).
모든 8개의 반응 혼합물을 50 μl로 희석시키고, 96 % EtOH (Biochemika 등급; 250 μl)로 EtOH 침전시켰다 (첨가된 GenElute 0.5 μL; Sigma 56575). 얼음 상에서 15 분 동안 인큐베이션한 후, 4 ℃에서 30 분 동안 14000 rpm으로 회전시켰다. 상등액을 버리고, 튜브를 간단히 회전시키며, 잔류 액체를 피펫으로 제거시킨 후, 펠렛을 공기 스트림으로 건조시켰다.
미정제의 DNA를 물에 용해시키고, 변성 10 % PAGE (Invitrogen)로 분석한 후, 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (Molecular Probes)으로 염색하였다. 겔의 사진이 도 30에 나타나 있다. 60-70 nt에 상응하는 이동성을 갖는 새로운 밴드의 형성은 vipO46 (21 nt) 및 vip017 (42 nt) (레인 5 및 9)의 예상된 가교결합을 확인시킨다. 내부 dT 상에 아민을 없다는 것을 제외하고는 vip017과 동일한 vip007을 갖는 대조 실험에서는 어떠한 가교결합도 관측되지 않았으며, 선별 반응을 나타낸다 (레인 6 및 10). 동일한 생성물이 이량체에서 형성되었으나 약간 덜 강한 밴 드가 관측되었다 (레인 7+11). 염기쌍을 형성할 수 없는 올리고에 대해서는 어떠한 생성물도 관측되지 않았으며, 이는 매치된 서열이 생성물 형성에 필요하다는 것을 나타낸다 (레인 8+12).
그 결과, 구조적 DNA는 고특이적 방식으로 환원적 아미노화를 지시할 수 있다.
실시예 20
우레아 형성의 구조적 DNA 지시
본 실시예는 구조적 DNA가 우레아 형성을 지시할 수 있다는 것을 설명하기 위한 것이다. 2개의 아민 사이의 우레아 형성은 중요하고 널리 적용가능한 반응의 예로서 선택되었다. 우레아는 의료 화학에서 공지된 이소스터 (isoster)이다.
올리고는 DNA Technology (Arhus, Denmark)로부터 구입하였다.
2개의 아미노 작용화된 올리고 및 하나의 보조적 올리고를 포함하는 3-웨이 연결로 구성된 DNA 별 구조물을 조립하였다. 올리고 vipO46, vip017, 및 vipOO8을 모르폴리노프로판술폰산 (Fluka #69947; MOPS, 100 mM, pH 8.0) 및 NaCl (Fluka #71376, 1 M)의 최종 조성을 포함하는 완충 용액에 등몰량 (각각 10 pmole)으로 혼합하였다. 이 용액을 어닐링 프로그램 (PCR 기계: 5 분 @ 94 ℃, 30 초 @ 8O ℃, 30 초 @ 65 ℃, 30 초 @ 5O ℃, 30 초 @ 35 ℃, 30 초 @ 2O ℃, 30 초 @ 10 ℃)에 적용하였다. 어닐링 혼합물을 최종 농도 10, 50, 또는 100 mM (total reaction volume 20 μL)로 우레아 형성 시약 (N,N'-디숙신이미딜 카보네이트, Aldrich #225827 (0.45M, DMF 중) 또는 비스(4-니트로페닐) 카보네이트, Aldrich #161691 (1,OM, DMF 중))에 가하고, 37 ℃에서 90 분 동안 인큐베이션하였다.
각각의 반응 혼합물의 분취량을 변성 10 % PAGE (Invitrogen)으로 분석하였다. 밴드를 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 염색 (Molecular Probes, #S7563)으로 가시화하였다.
PAGE의 사진이 도 31에 나타나 있다. 60-70 nt에 상응하는 이동성을 갖는 새로운 밴드의 형성은 레인 5-10에서 vipO46 (21 nt) 및 vipO17 (42 nt)의 예상된 가교결합을 확인시킨다. 흥미롭게도, 커플링제의 양의 증가로 감소량의 생성물이 형성되었다. 그러나, 이러한 관측은 2개의 아미노 그룹을 갖는 시약 분자의 반응에 의해 2개의 아민을 친핵체로 전환시키는 것으로 설명될 수 있다. 따라서, 보다 낮은 농도의 시약은 아민 중 단지 하나가 예상된 우레아를 형성하기 위해 다른 아민과 신속히 반응하는 중간체 카바메이트를를 형성하게 할 수 있으며, 이 예상된 우레아를 형성하기 위해 다른 아민과 신속히 반응할 수 있다.
그 결과, 구조적 별 DNA는 우레아 형성을 지시할 수 있다.
실시예 21
DNA 별 구조물 전기이동성
본 실시예는 천연 폴리아크릴아미드 겔에서의 구조적 DNA의 전기이동성을 입증한다.
구조적 DNA는 이중 스트랜드 DNA와는 명백히 상이한 구조를 갖는다. 후자는 선형의 긴 분자인 반면, 구조적 DNA는 보다 구형 구조를 갖는다. 그 결과, 겔에서 2개의 구조의 상이한 이동 패턴이 예상된다: 구조적 DNA는 이중 스트랜드의 선형 DNA 상대물의 겉보기 크기를 초과하는 겉보기 크기를 갖는다. 이러한 현상을 입증하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
말단 PCR 프라이밍 부위를 갖는 삼량체 DNA 별 구조물을 5개의 올리고 vipO29, vipl6l, vipl92, vipl93 및 vip207를 결합시켜 형성하였다. 구조에 대한 도식적 도면이 도 32에 나타나 있다.
DNA 올리고 (제조: DNA Technology Arhus, Denmark)를 1x 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl에서 각각 2 μM 농도로 혼합하였다. 이 혼합물을 하기와 같이 인큐베이션하였다; 5 분 동안 94μC, 30 초 동안 80μC, 30 초 동안 65μC, 30 초 동안 50μC, 30 초 동안 35μC, 30 초 동안 20μC, 다음 단계까지 1O ℃. 어닐링 절차를 Applied Biosystems AB2720 PCR 기계로 수행하였다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다. 1.5 μM 별 구조물, 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl 및 0.17 u/μl T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolabs, cat# M0201)로 이루어진 혼합물을 준비하고 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 나란히 놓인 말단 사이의 포스포르디에스테르 결합을 10 μl 용적으로 1x DNA 리가제 완충액 (New England Biolabs), 50 mM NaCl, 및 200 U T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)에서 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, cat# M0202)를 사용해 형성하였다.
PCR 증폭
0.04 μl의 결합 반응물을 400 μl PCR 반응 혼합물 [1x 테르모폴 완충액 (New England Biolabs B9004S), 0.2 mM dNTP (New England Biolabs O447S), 8 mM MgSO4, 0.2 μM vip202 및 vip224 μM, 0.5 M 베타인 (Sigma B0300), 1 U/100 μl의 Vent (exo-) (New England Biolabs M0257L)에서 템플레이트로 사용하였다. PCR 증폭을 하기 사이클 조건을 이용하여 50 μl 분취물로 수행하였다: 92 ℃에서 30 초 및 25회 사이클의 92 ℃/15 초, 50 ℃/15 초, 70 ℃/30 초.
샘플을 1 ml 에탄올 및 1/10 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2)를 가하여 에탄올 침전시키고, 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 20000 xg에서 30 분 동안 원심분리시키며, 상등액을 버리고, 펠렛을 1x 로딩 완충액 (Invitrogen)에 재현탁시킨 후, 예비적 천연 10 % PAGE (Invitrogen)하고, 제작자의 지시에 따라 SYBR 그린 (Molecular Probes, S7563)로 염색하였다. 겔의 사진이 도 32에 나타나 있다. 레인 M은 100 bp DNA 래더 (Fermentas, SM0248)를 포함한다. 2개의 밴드가 분리되었다: 약 250 bp의 밴드 (A) 및 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 밴드. 도 32에 박스로 나타낸 겔 조각을 잘라 생성물을 "분쇄 및 담금" 방법 (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory)으로 추출하였다; 겔 조각을 분쇄하고 400 μl TE 완충액에 밤새 담갔다. 튜브를 20000 xg에서 10 분 동안 회전시키고, 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 상술된 바와 같이 침전시킨 후, 100 μl 물에 재현탁시켰다.
프라이머 연장
템플레이트로 분리된 DNA를 사용하여 프라이머 연장을 수행하였다. 2 μl 템플레이트를 [1x 테르모폴 완충액 (New England Biolabs B9004S), 0.2 mM dNTP (New England Biolabs O447S), 8 mM MgSO4, 0.5 M 베타인 (Sigma B0300), 1 U/100 μl의 Vent (exo-) (New England Biolabs M0257L)]을 포함하는 20 μl 반응물에 사용하였다. 반응 1 및 5은 어떠한 프라이머도 포함하지 않고, 반응 2 및 6은 0.2 μM vip202를 포함하고, 반응 3 및 7은 0.2 μM vip224를 포함하며, 반응 4 및 8은 0.2 μM vip202 및 224을 포함하였다. 1 분 동안 95 ℃, 15 초동안 50 ℃ 및 30 초 동안 70 ℃에서 샘플을 인큐베이션하여 프라이머 연장을 수행하였다. 10 μl의 반응물을 상술된 바와 같이 10 % PAGE로 분석하였다.
토의 및 결론
먼저, 템플레이트로서 말단 PCR 프라이밍 부위를 갖는 삼량체 DNA 별 구조물을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 샘플을 예비적 PAGE를 수행하여 2개의 밴드를 분리하였다: 약 250 bp의 겉보기 크기를갖는 밴드 (A) (이중 스트랜드의 PCR 생성물의 예상된 크기는 241 bp이다) 및 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 밴드 (B). 마지막으로, 분리된 DNA를 프라이머 연장 반응에서 템플레이트로 사용하고 PAGE로 분석하였다. 도 32에서 보여지는 바와 같이, 2개의 템플레이트 모두 전방 프라이머 (레인 2 및 6) 및 후방 프라이머 (레인 3 및 7) 모두를 사용하여 약 250 bp의 크기를 갖는 이중 스트랜드의 생성물을 생성한다. 또한, 2개의 프라이머 모두가 존재하는 경우, 보다 많은 생성물이 형성된다 (레인 4 및 8). 이는 2개의 밴드 A 및 B 모두 의도된 241 bp 생성물을 포함하고 겔에서 이동의 차이가 폴딩때문이라는 것을 설명한다: A는 아마도 이중 스트랜드의 선형 생성물인 반면, B는 별 구조물 폴딩된 DNA이다.
흥미롭게도, 프라이머 연장 반응에 존재하는 임의의 프라이머 없이는, 레인 1에 나타난 바와 같이 출발물이 이중 스트랜드 DNA인 경우에서 조차도 약 250 bp의 단지 제한된 이중 스트랜드의 밴드가 관측된다. 이는 샘플이 겪는 열 변성 및 재생 사이클 때문이며, 이는 이중 스트랜드의 DNA와 별 구조물의 폴딩된 DNA의 혼합 생성물의 형성을 이끌 것이다. 동일한 현상이 출발 물질이 밴드 B인 레인 5에서 관측된다.
그 결과, 241 bp 길이의 DNA 분자가 구조물 (별 구조물)로 폴딩할 수 있으며, 이는 1000 bp를 초과하는 천연 겔에서의 겉보기 크기를 이끈다.
실시예 22
DNA 별 구조물의 해독
본 실시예는 DNA 별 구조물의 해독 과정의 원리를 입증한다. 이와 관련해서, 해독 과정은 다양한 위치의 개개의 모듈이 새로운 모듈로 치환되고 치환 과정이 코돈/안티코돈 인지로 지시되는 과정이다. 새로운 모듈은, 새로운 DNA 별 구조 물 (새로운 모듈이 이의 일부일 것이다)의 적합한 폴딩 시 중심에 또는 중심에 인접하게 위치되도록 부착된 화학적 반응물을 가질 수 있다. 그 결과, 해독에 따라 DNA 별 구조물에 의해 암호화된 화학적 화합물이 합성될 것이다.
해독 과정을 위한 출발 물질은, 예를 들어 실시예 18에 기술된 바와 같이 템플레이트로서 선별 과정으로부터의 산물을 사용하는 PCR 생성물일 것이다. 이는 선별 및 증폭의 반복적 사이믈을 가능하게 하고, 이는 다시 다양한 라이브러리가 적용된 선별압에 대한 용액을 향하도록 전환시킬 것이다.
해독 과정의 개요
출발 물질로서 PCR 생성물을 사용하는 해독 과정의 주요 단계에 대한 도식적 도면이 도 33에 나타나 있다.
먼저, DNA 별 구조물을 바이오티닐화된 후방 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시키고 2개의 스트랜드를 분리시켰다. 분리는 자석 스트렙트아비딘 비드를 사용하여 수행하였다. 목적하는 스트랜드 (상부 스트랜드)를 비드로부터 용출시키고, 2개의 스템-루프 및 스템을 갖는 DNA 별 구조물로 폴딩하였다. 이어서, 위치 1 스템 (루프 부재)을 이의 인지 서열의 밖에서 분해하여 5' 돌출부를 형성하는 제한 효소 BsaI으로 분해하였다. 이러한 돌출부는 위치 1에 대한 코돈이다.
이어서, 5' 안티코돈 서열을 갖는 위치 1에 대해 새로운 캐리어 모듈을 별 구조물에 결합하였다. 결합 및 다운스트림의 정제를 돕기 위해, 바이오티닐화된 헬퍼 올리고를 포함시켰다. 헬퍼 올리고는, 5' 돌출부를 생성하는 방식으로 새로 운 위치 1 캐리어 모듈에 하이브리드화하며, 이는 안티코돈이었다. 그 결과, 후속한 결합 (헬퍼 올리고/별 구조물/모듈 1)이 코돈/안티코돈에 의해 가이드되었다.
이어서, 새로운 캐리어 모듈이 별 구조물에 있는 최초 위치 1 모듈을 대체하는 변성 단계를 수행함으로써 위치 1상의 최초 모듈을 별 구조물로부터 방출시킨 후, 최초에는 제2 스템에서 떨어진 루프에 위치되었던 서열에 제한 효소 분해를 수행하였다. 이러한 실시로, 최초 위치 1 모듈 사이의 공유 결합 및 별 구조물에 대한 염기쌍이 제거되었다. 스트렙트아비딘 코팅된 자석 비드에 포착된 별 구조물에 대해 제한 효소 분해를 수행하였다. 그 결과, 비드로부터 방출된 별 구조물은 위치 1에 대해 성공적으로 해독되었다.
별 구조물로 폴딩 시, 새로운 위치 1 모듈의 3' 말단은 제2 스템을 형성하는데 참여하였으며, 스템은 위치 2 상의 코돈 바로 앞에서 끝난다는 것을 주목한다. 그 결과, 새로운 모듈 1의 3' 말단은 코돈/안티코돈 상호작용에 의해 지시되는 위치 2에 대한 새로운 캐리어 모듈을 위치 2에 수용하도록 정렬되었다. 그 결과, 구조물은 제2 코돈/안티코돈 지시되는 모듈 치환이 준비된다. 따라서, 별 구조물의 모든 위치에 대해 기술된 치환을 반복함으로써 완전한 해독이 달성된다.
별 구조물 형성
제1 단계는 5개 올리고: vip206, vipl6l, vipl92 및 vipl93 vip207의 어닐링을 수반하였다. 구조의 도식적 도면이 도 34A에 나타나 있다. 반응물 중의 5개의 올리고가 서로에게 하이브리드화하여 3-웨이 연결의 중심으로부터 떨어진 말단에 5' 및 3' 비하이브리드화 서열과 함께 2개의 스템-루프 및 하나의 스템으로 이루어진 3-웨이 연결을 형성할 것이다. 비하이브드화된 서열은 PCR 프라이밍 서열 (vip206의 5' 분절 및 vip207의 3' 분절)을 나타낸다. 올리고를 1x 리가제 완충액 (NEB B0202S), 50 mM NaCl 중에서 10 μl의 용적으로 20 pmole의 각각의 올리고뉴클레오티드와 혼합하였다. PCR 기계에서 95 ℃에서 5 분 및 다음 온도에서 30 초 동안 인큐베이션하여 어닐링을 수행하였다: 80 ℃, 65 ℃, 50 ℃, 45 ℃, 30 ℃, 2O ℃.
이어서, 5' 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다; 2.5 단위의 폴리뉴클레오티드 키나제 (NEB M0201)를 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl에 15 μl 반응 용적으로 포함시켰다. 반응물을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 어닐링된 올리고를 DNA 리가제에 의해 연속적인 DNA 스트랜드로 전환시키고, 각각 나란히 놓인 vip206의 3' 말단과 vip161의 5' 말단 사이, 나란히 놓인 vip161의 3' 말단과 vip192의 5' 말단 사이, 나란히 놓인 vip192와 vip193의 5' 말단 사이, vip193의 3' 말단과 vip207의 5' 말단 사이에 포스포르디에스테르 결합을 형성하였다. T4 DNA 리가제 (NEB M0202L)를 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl 중에서 가하고, 20 unit/μl 효소를 가하여 20 μl의 최종 반응 용적을 만들었다. 결합물을 16 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. DNA 별 구조물을 1x 테르모폴 완충액 (NEB M0257L), 8 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 M 베타인 (Sigma B0300), 1 μg/ml BSA (NEB B9001S), 0.1 μM 프라이머 (vip202 및 vip224) 및 32단위의 Vent(exo-) (NEB M257L) 중에서 400 μl의 총 반응 용적으로 증폭시켰다. vip224는 5' 말단에 바이오틴 잔기를 가져, 스트렙트아비딘 코팅된 자석 비드 상에 PCR 생성물의 포착을 가능하게 한다. 92 ℃에서의 초기 변성 단계에 이어, 30 초 동안 92 ℃, 15 초 동안 6O ℃ 및 30 초 동안 7O ℃에서 인큐베이션하는 사이클을 25회 수행하여 증폭시켰다. 1 분 동안 70 ℃에서 최종 연장을 수행하였다.
PCR 증폭 후, 지시에 따라 에펜도르프 키트 (0032 007.740)를 사용하여 PCR 생성물을 정리하였다. 2개의 컬럼을 사용하였다. 각각의 컬럼에 대해 150 μl TE로 용출을 수행하였다. 이어서, 정리된 PCR 생성물을 스트렙트아비딘 코팅된 자석 비드 (Dynal MyOne, 605.02)에 가하였다. 100 μl 비드를 2x BWT 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.1 % Triton X-100) 중에서 2회 세척하였다. 비드를 300 μl 2x BWT에 현탁시키고, 300 μl 정리된 PCR 생성물을 비드에 가하였다. 비드를 실온에서 15 분 동안 서서히 흔들면서 인큐베이션하였다. 비드를 자석에 포착시키고, 상등액을 제거하였다. 비드를 1x BWT (1/2 세기의 2x BWT)로 3회 세척하였다. 50 μl 10 mM NaOH를 가함으로써 자석 비드 상에 포착된 상보적인 바이오티닐화된 DNA 스트랜드로부터 DNA를 용출시키고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 비드를 자석에 포착시키고, 상부 DNA 스트랜드를 포함하는 상등액을 제거한 후, 20 μl 1 M Tris-HCl, pH 7.2에 즉시 중화시켰다.
용출된 DNA의 순도를 분리된 반응으로 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 프라이머 연장 반응에 의해 시험하였다. 프라이머 연장 반응을 1x 테르모폴 완충액, 8 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 1 M 베타인 및 0.2 단위 Vent(exo-) 및 0.2 μl 템플레 이트 및 0.4 μM vip202 또는 0.4 μM vip203/반응 중에서 10 μl의 반응물로 Vent(exo-) (NEB)를 사용하여 프라이머 연장 반응을 수행하였다. 프라이머 연장 반응은 다음 조건으로 수행하였다: 2 분 동안 95 ℃, 30 초 동안 6O ℃, 및 5 분 동안 74 ℃.
절차의 개요가 도 34A에 나타나 있다. 이 절차를 통해, PAGE 분석을 위해 샘플을 제거하였다. 겔의 사진이 도 34B에 나타나 있다. 겔은 또한 품질 대조 프라이머 연장 반응을 포함한다. 첨가된 템플레이트 없는 음성 대조군 (레인 1)에는 존재하지 않는 241 bp의 예상된 크기의 밴드가 레인 2에서 관측된다. 그 결과, DNA 별 구조물은 성공적으로 조립되고 증폭되었다. 또한, 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기을 갖는 2개의 밴드가, 폴딩된 DNA 별 구조물을 나타내는 레인 2에서 관측된다 (실시예 21 참조). 레인 3은 PCR 정리 후의 생성물을 나타낸다.
생성물을 PCR 생성물의 하부 스트랜드 상의 바이오틴 잔기를 통해 포착하였다. 그 유동이 레인 4에 나타나 있다. 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 2개의 밴드 중 아래의 밴드가 나타났으며, 바이오틴을 포함하지 않고 바이오티닐화된 스트랜드에 하이브리드화하지 않았던 것이다. 비드를 세척한 후, 바이오티닐화되지 않은 스트랜드를 염기 쌍을 파괴하는 높은 pH로 용출시켰다. 용출 생성물이 레인 5에 나타나 있다. 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 2개의 밴드 중 아래의 밴드에 상당하는 단일 밴드가 관측되었으며, 이는 PCR 생성물의 바이오티닐화되지 않은 상부 스트랜드의 성공적인 분리를 나타낸다. 흥미롭게도, 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 2개의 밴드 중 상부 밴드는 PCR의 양 스트랜드가 존재 하는 경우에만 관측되었다 (레인 1 및 2). 그 결과, 상부 밴드는 아마도 말단 PCR 프라이밍 부위를 통해 하이브리드화된 2개의 하이브리드화된 DNA 별 구조물 분자를 나타낸다.
정제된 DNA의 품질 대조로서 2개의 프라이머 연장 반응을 수행하였다. 하나의 반응에서는 전방 프라이머 (vip202)가 사용되고 제2 반응에서는 후방 프라이머 (vip203)이 사용되었으며, 각각 하부 및 상부 PCR 스트랜등서 프라이밍한다. 그 결과, 분리된 DNA가 순수하다면, 단지 제2 반응만이 프라이머 연장 생성물에 대해 일어난다. 따라서, 241 bp의 예상된 크기에 상응하는 밴드만이 레인 7에서 관측되는 반면, 레인 6에서는 어떠한 프라이머 연장 생성물도 관측되지 않았다. 그 겨로가, PCR 생성물의 목적하는 스트랜드의 성공적인 정제가 높은 순수 제제로 달성되었다.
위치 1의 코돈의 노출
DNA 별 구조물은 2개의 스템-루프 및 하나의 스템을 포함하였다. 루프가 없는 스템은 위치 1에 대한 코돈을 포함하였다. 이 코돈을 BsaI으로 제한 효소 분해에 노출시켜, 인지 서열의 밖으로 절단하여 4개의 뉴클레오티드의 5' 돌출부를 형성하였으며, 이 서열은 제한 없이 선택될 수 있어 암호화 목적에 이상적이다. 이러한 맥락에서, 돌출부는 위치 1에 대한 코돈이라 부른다.
별 구조물 DNA를 BsaI으로 분해시켰다. BsaI에 대한 이중 스트랜드의 기질이 vipl6l의 5' 분절 및 vipl93의 3' 분절의 하이브리드화에 의해 생성되는 제1 스 템 (루프가 없는 스템)에 있는 것으로 밝혀졌다. BsaI 분해 후 수득되는 생성물은 본 실시예의 개시부에서 기술된 vipl61-vipl92-vipl93의 서열에 상응한다는 것을 주목한다.
110 μl의 정제된 별 구조물 DNA를 200 μl의 총 용적으로 20 μl 10 x NEB3 완충액 및 200 단위의 BsaI (NEB R0535L)와 혼합하였다. 이 분해물을 2.5 시간 동안 50 ℃에서 인큐베이션하였다. 이 DNA를 표준 에탄올 침전시키고, 겔 정제를 위해 10 % TBE-우레아 겔에 적용하였다. SYBR 그린 염색후의 겔의 사진이 도 35에 나타나 있다. 참조로서, 절단되지 않은 DNA을 레인 1에 로딩하였다. 1000 bp를 초과하는 겉보기 크기로 이동하는 두드러진 밴드가 관측된다 (레인 M에 로딩된 마커로부터 "넘침 (spil over)"을 주목한다). BsaI 분해물을 로딩한 경우 다수의 밴드가 레인 2-7에서 관측되었으며, 이는 BsaI 분해물이 완전하지 않았다는 것을 나타낸다. 그러나, 상술된 바와 같이 목적하는 밴드를 겔 (도에 박스로 표시)로부터 절단하고, DNA를 "분쇄 및 담금" 방법에 의해 겔 조각으로부터 추출하고, 에탄올 침전시킨 후, 40 μl H2O에 재용해시켰다.
코돈/안티코돈 상호작용에 의해 지시되는 새로운 위치 1 모듈의 결합
새로운 위치 1 모듈 vip271을 BsaI 분해되고 정제된 DNA 별 구조물에 로딩하였다. vip066은 결합 보조물로서 결합 반응물에 포함시켰으며, 바이오틴 분자를 결합 반응물에 도입하여 다운스트림 정제를 용이하게 하였다. vip271 및 vipO66의 어닐링은 4개의 뉴클레오티드 5' 돌출부를 갖는 생성물을 생성할 것이며, 이러한 맥락에서 안티코돈이라 불린다. 따라서, 이 서열은 DNA 별 구조물의 위치 1에 있는 코돈에 역으로 상보적이도록 선택되었다. 그 결과, 코돈/안티코돈 하이브리드화가 2개의 도입 올리고의 DNA 별 구조물과의 결합을 가이드할 수 있다. vip271 및 vipO66을 1x 리가제 완충액 (NEB B0202S), 50 mM NaCl 중에서 10 μl의 용적으로 50 pmole의 각각의 올리고뉴클레오티드와 혼합하였다. 어닐링을 상술된 어닐링 프로그램을 이용해 PCR 기계로 수행하였다.
이어서, 어닐링된 vip27 l/vipO66을 BsaI 분해되고 정제된 DNA 별 구조물 (30 μl))와 혼합하고, 5' 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화하였다; 12.5 단위의 폴리뉴클레오티드 키나제 (NEB M0201)를 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl 중에 50 μl 반응 용적으로 포함시켰다. 반응물을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 분자의 동종 말단을 DNA 리가제로 연결하고 나란히 놓인 vipO66 의 3' 말단과 BsaI 분해된 DNA의 5' 말단 사이 및 나란히 놓인 BsaI 분해된 DNA의 3' 말단과 vip271의 5' 말단 사이에 포스포르디에스테르 결합을 형성하였다. T4 DNA 리가제 (NEB M0202L)를 1x 리가제 완충액, 50 mM NaCl 중에 가하고, 20 unit/μl 효소를 가하여, 60 μl의 최종 반응 용적을 만들었다. 결합물을 16 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
치환
다음 단계는 별 구조물로부터 최초 위치 1 모듈을 제거하는 것이다. 분자를 재폴딩하여 새로운 위치 1 모듈이 3-웨이 연결물의 일부이도록 하고, 최초 위치 1과 DNA 별 구조물 사이의 공유 결합을 제거하였다. 또한, 헬퍼 올리고 (vipl94)를 도입하고 최초 루프의 Pvu II 부위에 제2 스템의 윈위 말단을 어닐링시킴으로써 (도 36 참조), Pvu II에 대한 이중 스트랜드의 기질을 형성하였다. 그 결과, 최초 위치 1 모듈과 별 구조물 사이의 공유 결합 및 염기쌍의 형성 모두가 파괴되었다. 또한, 새로운 위치 1 모듈을 3-웨이 연결물의 일부로서 도입하였다.
43 μl의 결합 반응물을 60 μl의 총 용적으로 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100 중에서 200 pmole의 vipl94와 혼합하였다. 변성 및 어닐링을 PCR 기계로 95 ℃ 5 분 동안 및 하기 온도에서 30 초 동안 수행하였다: 80 ℃5 65 ℃5 50 ℃, 45 ℃, 3O ℃, 2O ℃.
이어서, DNA를 스트렙트아비딘-코팅된 자석 비드 (Dynal)에 포착시켰다. 30 μl 비드를 2x BWT (2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X-100) 중에서 2회 세척하였다. 비드를 최종 세척 후 60 μl 2x BWT에 현탁시키고, 60 μl vipl94/별 구조물 어닐링 반응물을 가하였다. 부드럽게 흔들면서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이에 부착된 DNA를 갖는 비드를 자석으로 포착한 후, Pvu II 분해 완충액: 22 μl 40 μl H2O에 현탁시키고, 3 μl 10 x Pvu II 분해 완충액을 비드에 가한 후, 5 μl Pvu II (10 unit/μl; Fermentas ER0637)를 가하였다. 분해물을 37 ℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 분해 후, 비드를 상등 액으로부터 분리시켰다.
절차를 통해서 제작자의 프로토콜에 따라 SYBR 그린 (Molecular Probes)으로 염색되는 10 % TBE-우레아 겔 (Invitrogen)에 의한 분석을 위해 분취물을 모아두었다. 겔의 사진이 도 36에 나타나 있다. 정제된 BsaI 분해된 별 구조물을 레인 1에 로딩하였다: 약 600 nt의 예상된 겉보기 크기의 두드러진 밴드가 관측되었다. BsaI 분해된 별 구조물과 위치 1/헬퍼 올리고 (vip066)에 대한 새로운 모듈의 결합 생성물을 레인 2에 로딩하였다. 1000 nt를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 두드러진 밴드가 관측되었으며, 이는 성공적인 결합을 나타낸다. Pvu II 분해 후 비드를 레인 4에 로딩하였다. 1000 nt를 초과하는 겉보기 크기를 갖는 밴드가 관측되었다. 이 밴드는 레인 2와의 비교로 알 수 있는 비분해된 DNA에 상응한다. 그러나, Pvu II 분해로부터의 상등액에서 약 600 nt의 겉보기 크기를 갖는 밴드가 관측되었다. 이 밴드는 성공적인 치환 생성물에 대한 약 600 nt의 예상된 겉보기 크기에 상응한다. 상등액에서 발견되었다는 사실은 위치 1 상의 새로운 모듈이 별 구조물의 위치 1에 있는 최초 모듈을 치환했다는 것을 나타낸다.
그 결과, 성공적인 해독, 즉 코돈/안티코돈 지시된 모듈 치환이 입증되었다.
실시예에 사용된 올리고뉴클레오티드의 목록
Figure 112007041838915-PCT00003
Figure 112007041838915-PCT00004
<110> Vipergen Aps <120> Structural Nucleic Acid Guided Chemical Synthesis <130> 130636 <150> 04105597.1 <151> 2004-11-08 <150> 60/687,849 <151> 2005-06-07 <150> 60,725,347 <151> 2005-10-11 <160> 49 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 1 ctcgttttcg agaccgactc tggaagtgtc accggatctg g 41 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 2 ttggaaaaac caaccagatc cggtgactgt caaggctgag gt 42 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 3 gagggagagc ctcacctcag ccttgactct tccagagtcg gt 42 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 4 gagggagagc ctcacctcag ccttgactgg agaacgcatt ct 42 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 5 acacaagaag tgtagaatgc gttctcctct tccagagtcg gt 42 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n=amine-C6-dT <400> 6 ctcgttttcg agaccgactc tggaagngtc accggatctg g 41 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> n=amine-C6-dT <400> 7 ttggaaaaac caaccagatc cggtgacngt caaggctgag gt 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> n=amine-C6-dT <400> 8 gagggagagc ctcacctcag ccttgacnct tccagagtcg gt 42 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> n=amine-C6-dT <400> 9 gagggagagc ctcacctcag ccttgacngg agaacgcatt ct 42 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> n=amine-C6-dT <400> 10 acacaagaag tgtagaatgc gttctccnct tccagagtcg gt 42 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 11 actatgaggg ctgtctgtgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 12 tagcaagccc aataggaacc 20 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 13 actatgaggg ctgtctgtgg cagtcacgag 30 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 14 aaaactcgtg actgggttcc tattgggctt gcta 34 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <400> 15 ttttcgagac cgactctgga agtgtcaccg gatctgg 37 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5' biotinylated <400> 16 actatgaggg ctgtctgtgg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5' biotinylated <400> 17 tagcaagccc aataggaacc 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n=amine-C6-dT <400> 18 actctggaag ngtcaccgga t 21 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'P <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> n=amine-C6-dT <400> 19 gagggagagc ctcacctcag ccttgacaca cacncttcca gagtcggt 48 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 20 ctcgttttcg agaccgactc tggaagagtg tgttgtcacc ggatctgg 48 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n=amine-C6-dT <400> 21 cagccttgac ncttccagag t 21 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 22 ctctctcgtg actgggttcc tattgggctt gcta 34 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n=amine-C6-dT <400> 23 actctggaag ngtcaccgga tctgg 25 <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 24 gagggagagc ctcacctcag ccttgactct tccagagtgg ttcctattgg gcttgcta 58 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Synthesis <400> 25 ttggaaaaac caaccagatc cggtgactgt gtgtgtcaag gctgaggt 48 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial synthesis <400> 26 gagggagagc ctcacctcag ccttgacaca cactcttcca gagtcggtct cg 52 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 27 agagcgagac cgactctgga agtgtcaccg gatct 35 <210> 28 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 28 ggttggcagg gcccactagc tcaggatcca cccaaccaga tccggtgact gtgtgtgtca 60 aggctgag 68 <210> 29 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 29 gtgaggctga attctctgta cctggtacct ccctcacctc agccttgaca cacactcttc 60 cagagtcggt ctcg 74 <210> 30 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 30 gtgggccctg 10 <210> 31 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 31 gtggatcctg 10 <210> 32 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 32 ggttggcaca gctgactagc tcagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgtgtca 60 aggctgag 68 <210> 33 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 33 gtgaggctcc cgggtctgta cctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacactcttc 60 cagagtcggt ctcg 74 <210> 34 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 34 gtcagctgtg 10 <210> 35 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial synthesis <400> 35 gtgagctctg 10 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> 5'clip <222> (1) <400> 36 ncttccagag tcggtctcg 19 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n= 5' biotin <400> 37 ncagccttga ctcttccaga gt 22 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <400> 38 caggtcgctg agaggttgac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <400> 39 acgtccgagt cagaagtgtg 20 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <400> 40 caggtcgctg agaggttgac cagtcacgag 30 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <400> 41 ctctctcgtg actgcacact tctgactcgg acgt 34 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n= 5' biotin <400> 42 nacgtccgag tcagaagtgt g 21 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized optionally derivatised oligonuclotides <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n=NH2-C6-dT <400> 43 agagcgagac cgactctgga agngtcaccg gatct 35 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized optionally derivatised oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n=NH2-C6-dT <400> 44 ttttcgagac cgactctgga agngtcaccg gatct 35 <210> 45 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized optionally derivatised oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n=NH2-C6-dT <400> 45 ggttggcaca gctgactagc tcagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgngtca 60 aggctgag 68 <210> 46 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized optionally derivatised oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n=NH2-C6-dT <400> 46 gtgaggctcc cgggtctgta cctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacacncttc 60 cagagtcggt ctcg 74 <210> 47 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized optionally derivatised oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n=NH2-C6-dT <400> 47 ggttggcaca gctgacaaaa acagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgngtca 60 aggctgag 68 <210> 48 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized optionally derivatised oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n=NH2-C6-dT <400> 48 gtgaggctcc cgggtcgaga gctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacacncttc 60 cagagtcggt ctcg 74 <210> 49 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized optionally derivatised oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n=NH2-C6-dT <400> 49 ctctcgagac cgactctgga agngtcaccg gatctggttg ggtgagctct g 51

Claims (56)

  1. 핵산 및 화학적 화합물을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 반응 중심으로부터 연장되는 3개 이상의 스템을 특징짓는 별 구조를 형성하며, 이때 상기 스템은 핵산 듀플렉스에 의해 형성되고, 상기 화학적 화합물은 3개 이상의 화학적 그룹의 반응 생성물로서 반응 중심에 형성되어 있는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3개 이상의 스템이 반응 중심으로부터 밖을 향해 방사상으로 연장되는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산은 형성된 화학적 화합물의 형성에 관여했던 하나 이상의 화학적 그룹을 확인하는 하나 이상의 코돈을 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 코돈이 스템의 말단에 위치되는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템의 끝에 루프가 형성되는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템-루프 구조물의 비-염기쌍 형성 부분에 코돈이 위치되는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템-루프 구조물에 효소적 제한 부위가 존재하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루프는 헬퍼 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있으며, 이에 따라 제한 효소에 대한 기질을 형성하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 스템을 제외하고 상기 스템의 모든 말단에 루프가 존재하여 연속적인 핵산 서열을 형성하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속적인 핵산 서열이 효소적으로 연장가능한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산이 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 대한 프라이밍 부위를 포함하는 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이밍 부위가 루프를 갖는 상기 스템에 존재하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 스템이 80 % 이상 상보적인 2개의 하이브리드화 분절을 포함하고, 각각의 하이브리드화 분절이 12개 이상의 뉴클레오티드로 이루어지는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 각각의 하이브리드화 분절이 18개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 핵산에 공유적으로 부착되는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학적 그룹이 반응 전에 상기 핵산에 공유적으로 부착되는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 공유 부착물 중 하나 이상이 반응과 동시에 또는 반응 후 절단되는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 공유 부착물을 제외하고는 모든 공유 부착물이 반응과 동시에 또는 반응 후 절단되는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 상기 핵산 및 임의로 하나 이상의 추가의 반응물에 부착되는 화학적 그룹의 반응에 의해 형성되는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 반응물이 핵산과 결합되지 않은 유리된 반응물인 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 다수의 상이한 조성물을 포함하는 조성물의 라이브러리.
  22. (i) (1) i) N 위치의 캐리어 모듈의 핵산 분절에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절 및 ii) 제2 위치의 캐리어 모듈의 분절에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절을 갖는 제1 위치의 캐리어,
    (2) n-1 캐리어 모듈의 상기 핵산 분절에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절 및 n+1 캐리어 모듈의 분절에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절을 갖는 n 위치의 캐리어 모듈(들) (n은 2 내지 N-1이다), 및
    (3) 상기 N-1 캐리어 모듈의 상기 핵산 분절에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절 및 상기 제1 캐리어 모듈의 분절에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절을 갖는 N 위치의 캐리어 모듈을 포함하고,
    상기 캐리어 모듈 중 3개 이상이 하이브리드화 분절 사이의 중간부나 이에 인접하게 위치되는 결합된 화학적 그룹 (CG) 및 임의로 하이브리드화 분절 중 하나에 대해 외부로 위치되는 코돈 분절을 포함하는,
    N (N = 3 내지 100)개의 캐리어 모듈을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 하이브리드화 분절을 하이브리드화시키는 조건 하에 상기 캐리어 모듈을 접촉시켜, 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 모듈 중 하나 이상과 결합되는 경우, 상기 화학적 그룹을 근접하게 하는 단계;를 포함하는, 하나 이상의 화학적 구조물의 생성 방법.
  23. 제22항에 있어서, 모듈 n-1의 말단을 모듈 n에 결합시키고 모듈 N-1을 모듈 N에 결합시키는 조건을 제공하여 스템-루프 구조물을 갖는 연속한 핵산 분자 및 결합된 화학적 화합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 분자 또는 연속한 핵산 분자 중 하나 이상과 공유적으로 결합되는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드화 분절을 하이브리드화시키는 조건 하에 캐리어 모듈을 접촉시켜 반응성 그룹을 반응적으로 근접시키고;
    반응성 그룹을 반응시키는 조건 (이때, 상기 형성된 화학적 화합물은 하나 이상의 캐리어 모듈과 결합된다); 및 모듈 n-1의 말단을 모듈 n에 결합시키고 모듈 N-1을 모듈 N에 결합시켜 스템-루프 구조물을 갖는 연속적인 핵산 분자 및 결합된 화학적 화합물을 형성하는 조건을 제공함을 포함하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 캐리어 모듈의 접촉을 연속적으로나 동시에 수행하는 방법.
  27. 제22항 및 제26항에 있어서, 상기 화학적 반응을 연속적으로나 동시에 수행하고/하거나 상기 결합을 효소적으로 또는 화학적으로; 그리고 연속적으로 또는 동시에 수행하는 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캐리어 모듈 및/또는 하나 이상의 N 캐리어 모듈에 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소 부위를 위한 프라이밍 부위를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형성된 화학적 화합물을 디스플레이하는 효소적 연장 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, N이 3, 4, 5, 6 또는 7이고, 특히 상기 각각의 캐리어 모듈이 하이브리드화 분절 사이의 중간부나 이에 인접하게 위치되는 결합된 화학적 그룹 (CG) 및 하이브리드화 분절 중 하나에 대해 외부로 위치되는 코돈 분절을 포함하는 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 화합물의 라이브러리가 하나 이상의 위치에서 레퍼토리의 캐리어 모듈을 가짐으로써 합성되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 하나 이상의 위치에 있는 상기 레퍼토리가 10개 이상의 상이한 캐리어 모듈을 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 2개 이상의 위치에 있는 상기 레퍼토리가 10개 이상의 상이한 캐리어 모듈을 포함하는 방법.
  34. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간부가 화학적 결합 또는 1 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학적 그룹이 중간부의 뉴클레오염기와 결합되는 방법.
  36. 제22항 내지 제34항 중 어느 한항에 있어서, 상기 화학적 그룹이 중간부의 포스포디에스테르 연결과 결합되는 방법.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학적 그룹이 하나 이상 의 공유 결합을 통해 중간부에 결합되는 방법.
  38. a) N개의 하이브리드화 분절과 상보적 하이브리드화 분절 및 하이브리드화 분절과 상보적 하이브리드화 분절 사이의 N-1개의 비-하이브리드화 분절을 포함하는 단일 스트랜드의 연속적인 핵산 서열을 제공하는 단계;
    b) 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 핵산을 하이브리드화하여 적어도 N-1개의 스템-루프 및 하나의 스템을 포함하는 연속적인 핵산을 형성하는 단계;
    c) 상기 스템 또는 루프에 브레이크를 도입하여 적어도 코돈 분절을 포함하는 돌출부를 생성하는 단계;
    d) 적어도 상기 스템에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절, 인접 스템-루프의 스템에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절, 임의의 결합된 반응성 그룹, 및 안티-코돈 분절을 갖는 제1 그룹의 캐리어 모듈을 제공하는 단계;
    d) 코돈 및 안티-코돈 분절을 하이브리드화시키는 조건을 제공하는 단계; 및
    e) 상기 하이브리드화된 캐리어 모듈을 상기 돌출부의 역행 말단에 효소적으로나 화학적으로 결합시키는 조건을 제공하고,
    i) 상기 코돈 서열에 인접한 스템-루프의 스템 또는 루프를 제한 효소로 분해하여 적어도 다음 코돈 분절을 포함하는 돌출부를 만드는 단계;
    ii) 상기 핵산을 변성시키는 단계;
    iii) 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화시켜 적어도 상기의 다음 코돈 분절을 포함하는 돌출부를 갖는 N-1개의 스템-루프 및 하나의 스템을 형성하는 단계;
    iv) 임의로 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 모듈 중 하나 이상과 결합되는 경우 상기 반응성 그룹을 반응시키는 조건을 제공하는 단계;
    v) 적어도 상기 스템에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절, 및 인접한 스템-루프의 스템에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분절을 갖고, 임의로 결합된 반응성 그룹을 갖고, 안티-코돈 분절을 갖는, 다음 그룹의 캐리어 모듈을 제공하는 단계; 및
    vi) 하이브리드화된 캐리어 모듈을 상기 돌출부의 역행 말단에 효소적으로나 화학적으로 결합시키는 조건을 제공하는 단계를 수행하고; 단계 i) 내지 vi)를 N-1회 반복하는 단계; 및
    f) 상기 제1 그룹의 캐리어 모듈로 부분적으로 이루어진 상기 스템-루프 구조물에 브레이크를 도입하여 적어도 상기 제1 캐리어 모듈에 연결된 상기 안티-코돈 분절은 남기는 단계; 및
    g) 상기 핵산을 변성시키는 단계; 및
    h) 분자내 하이브리드화에 유리한 조건 하에서 하이브리드화시켜 N-1개의 스템-루프 및 하나의 스템을 형성하는 단계; 및
    i) 임의로 형성된 화학적 화합물이 상기 캐리어 모듈 중 하나 이상과 결합되는 경우 상기 반응성 그룹을 반응시키는 조건을 제공하는 단계를 포함하는 모듈 치환의 수행방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 단계 a)의 연속적인 핵산 서열이, 화학적 그룹을 포함하지 않으면서 (모형 라이브러리), 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 단계 a)의 연속적인 핵산 서열이 제29항의 방법에 따라 수득되는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 제29항의 연장 생성물이 PCR에 의해 증폭되는 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a), b) 또는 c)에서의 연속적인 핵산 서열이 고체 지지체상에 PCR 생성물의 센스 스트랜드를 고정화시키고, 상기 고체 지지체를 분리시킨 후, 별 구조물을 형성하도록 상기 센스 스트랜드를 자가-하이브리드화시키며, 임의로 상기 자가-하이브리드화된 별 구조물을 부착하는 스템을 상기 고체 지지체와 분리시켜 상기 고체 지지체로부터 별 구조물을 방출시킴으로써 수득되는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 자가-하이브리드화가 순간 냉각에 의해 수행되는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 고체 지지체를 부착하는 스템 및 재-폴딩된 별 구조물의 분리가 제한 효소로 수행되는 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 루프에 제한 효소에 대한 이중 스트랜드 기질을 생성하기 위해, 분해 단계 전에, 루프의 서열에 상보적인 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 핵산 및 결합된 화학적 화합물의 구조물 또는 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득가능한 하나 초과의 이러한 구조물의 라이브러리를 포함하는 조성물.
  47. 목적하는 특성의 화학적 화합물을 갖는 라이브러리 구성물에 대해 라이브러리를 탐침하는 단계;
    목적하는 특성을 지니지 않는 라이브러리 구성물로부터 목적하는 특성을 갖는 라이브러리 구성물을 분할시키는 단계; 및
    이에 따라 목적하는 특성을 갖는 라이브러리 구성물의 농축 푸울을 수득하는 단계를 포함하는, 제29항에 기술된 바와 같이 제조되는 하나 이상의 화학적 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 방법이 농축된 푸울의 구성물의 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 핵산은 화학적 반응의 내역을 나타내는 방법.
  49. 제38항에 있어서, 제47항 또는 제48항에 따른 상기 농축된 라이브러리 구성물에 의해 암호화되는 화학적 화합물의 재조립물을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제38항에 있어서, 상기 스템 또는 루프에서의 브레이크가 제한 효소, RNase, 엔도뉴클레아제 III, 엔도뉴클레아제 VIII, APE1, Fpg, 화학적 절단 또는 광 절단에 의해 도입되는 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 화학적 반응이 연속적으로나 동시에 수행됨을 추가로 포함하는 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 캐리어 모듈 또는 N 캐리어 모듈에 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 위한 프라이밍 부위를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제38항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 연속적인 핵산 서열이,
    농축된 라이브러리로부터 유도된 분자간 하이브리드화 핵산 구조물을 2개의 연속적인 제한 효소로 분해하여 문제의 모듈과 나머지 구조물 사이의 공유 결합을 제거하는 단계,
    상기 분해된 구조물을 변성시키는 단계,
    상기 분해된 구조물로부터의 핵산 단편을 재하이브리드화시킴으로써 문제의 모듈을 구체화하는 핵산 분획을 교환시켜 브리딩을 수득하는 단계, 및
    적합한 말단을 결합시키는 단계에 의해 제조되는 핵산 서열을 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 재하이브리드화시키기 전에, 제1 세대 라이브러리의 형성에는 존재하지 않는, 캐리어 모듈을 나타내는 핵산 단편을 가하는 방법.
  55. 제53항에 있어서, 재하이브리드화시키기 전에, 제1 세대 라이브러리의 형성에는 사용되지 않은 캐리어 모듈의 레퍼터리를 가하는 방법.
  56. 제53항에 있어서, 농축된 라이브러리의 분획에 대해 제53항의 단계를 수행하고 브리딩된 결과물을 상기 농축된 라이브러리의 나머지 부분과 함께 푸울링하는 방법.
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