WO2009093667A1 - 核酸結合蛋白質アッセイ法およびキット - Google Patents

核酸結合蛋白質アッセイ法およびキット Download PDF

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WO2009093667A1
WO2009093667A1 PCT/JP2009/051006 JP2009051006W WO2009093667A1 WO 2009093667 A1 WO2009093667 A1 WO 2009093667A1 JP 2009051006 W JP2009051006 W JP 2009051006W WO 2009093667 A1 WO2009093667 A1 WO 2009093667A1
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nucleic acid
nucleotide sequence
sequence
complex
terminal
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PCT/JP2009/051006
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French (fr)
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Hidetoshi Tahara
Toru Miyagi
Original Assignee
Hiroshima University
Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting a nucleic acid binding protein.
  • the present invention further relates to a method for screening a binding inhibitor or promoter for a nucleic acid binding protein.
  • Nucleic acid binding proteins are molecules that have very important functions in cells, such as transcription factors, chromosome structural proteins, DNA repair enzymes, RNA processing enzymes, or polymerases, and analyze the behavior of nucleic acid binding proteins. This is considered to have an important meaning in understanding life activities. Nucleic acid-binding proteins have attracted attention as targets for development of pharmaceuticals, functional foods, etc. due to the importance of their functions.
  • a gel shift method or a footprint method is used to detect a nucleic acid binding protein, but these methods involve electrophoresis, and thus have a problem that time and operation are complicated.
  • Non-patent Document 2 Nucleic acid binding protein detection method using exonuclease III (Non-patent Document 2) is difficult to detect weak binding nucleic acid binding protein, and when used for drug screening of pharmaceuticals etc., exonuclease III activity of the drug In addition, there is a problem that it is not possible to screen for drugs that affect the activity of proteins related to exonuclease III.
  • Nucleic acid-binding protein detection method using fluorescence correlation spectroscopy is a combination of nucleic acid alone and nucleic acid binding protein bound to nucleic acid. This is to detect a difference in body size, and there is a problem that a sufficient signal / noise ratio cannot be obtained with a small nucleic acid binding protein. Furthermore, this method has a problem in versatility because special equipment is required.
  • nucleic acid duplexes composed of completely complementary double-stranded nucleic acids is very stable, and such nucleic acid duplexes interact with each other and the structure does not change.
  • nucleic acid duplexes having a single-stranded portion at each end bind to other nucleic acid duplexes via the single-stranded portion, resulting in a structural change.
  • the present inventors have found that such a structural change between nucleic acid duplexes is inhibited by binding of a nucleic acid binding protein. The present invention is based on this finding.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting the binding between a nucleic acid and a nucleic acid binding protein, and a screening method for a binding inhibitor or promoter of the nucleic acid binding protein.
  • a method for detecting the binding between a nucleic acid and a nucleic acid binding protein comprising measuring the degree of structural change of a nucleic acid complex having at least two nucleic acid duplex portions (
  • the “detection method according to the present invention” is provided.
  • screening method for a binding inhibitor or promoter of a nucleic acid binding protein (hereinafter referred to as “screening method according to the present invention”) in which the detection method of the present invention is performed in the presence and absence of a test substance. ) Is provided.
  • kit comprising a nucleic acid duplex A and a nucleic acid duplex B that can bind at a terminal sequence, or an integral nucleic acid complex E or an integral nucleic acid complex F.
  • kit (hereinafter referred to as “kit according to the present invention”) is provided.
  • the present invention does not require electrophoresis, can perform a homogeneous assay with a general-purpose instrument, does not require an enzyme such as exonuclease III, and does not require an unnatural structure such as fluorescence introduction or nick at the protein binding site. It is advantageous in some respects.
  • the present invention is also advantageous in that it can be widely applied to DNA binding proteins in general, including DNA binding proteins having DNA binding motifs such as loops, leucine zippers and Zn fingers.
  • the present invention is further advantageous in that it can also screen for inhibitors or promoters that target nucleic acid binding proteins that are difficult to evaluate by reporter assays (eg, structural proteins such as telomere binding proteins).
  • reporter assays eg, structural proteins such as telomere binding proteins
  • FIG. 1A is a diagram specifically showing one embodiment of the structures of nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2.
  • FIG. 1B is a diagram specifically showing one embodiment (integrated nucleic acid complex E) of the structures of nucleic acid G1, nucleic acid G2, nucleic acid H1, and nucleic acid H2.
  • FIG. 1C is a diagram specifically showing one embodiment (integrated nucleic acid complex F) of the structures of nucleic acid G1, nucleic acid G2, nucleic acid H1, and nucleic acid H2.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the concentration of recombinant human NF ⁇ Bp50 and the fluorescence value.
  • FIG. 3 is a diagram showing fluorescence values when the binding of recombinant human NF ⁇ Bp50 is inhibited using decoy oligos.
  • FIG. 4 is a graph showing fluorescence values when recombinant human AP1 (c-jun) protein is bound.
  • FIG. 5 is a diagram showing fluorescence values when recombinant human SP1 protein is bound.
  • FIG. 6 shows the results of detecting the binding of recombinant human TRF2 protein (N-terminal deletion) to nucleic acids.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the relationship between mismatch introduction and detection sensitivity. The numerical value on the bar indicates the relative fluorescence value when the fluorescence value when no protein is added is 100 in each nucleic acid set.
  • FIG. 4 is a graph showing fluorescence values when recombinant human AP1 (c-jun) protein is bound.
  • FIG. 5 is a diagram showing fluorescence values when recombinant human SP1 protein is bound.
  • FIG. 8 is a diagram showing the relationship between mismatch introduction and detection sensitivity. The numerical value on the bar indicates the relative fluorescence value when the fluorescence value when no protein is added is 100 in each nucleic acid set.
  • FIG. 9 is a graph showing the fluorescence intensity of NF- ⁇ B DNA and SP1 DNA as a relative fluorescence value with respect to the fluorescence value when no aurothioglucose is added.
  • FIG. 10 is a diagram showing NF- ⁇ B (p50) detection using an integrated complex. The fluorescence intensities of NF- ⁇ B DNA and SP1 DNA are shown as relative fluorescence values relative to the absence of protein.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of detecting the binding of NF- ⁇ B and SP1 in the multiplex system.
  • FIG. 12 is a diagram specifically showing one aspect of detection using an integrated nucleic acid complex. Stars indicate fluorescent labels, black circles indicate quenching labels, white circles and white squares indicate mutations, and gray solid lines indicate nucleic acid protein binding sequences.
  • FIG. 13 is a diagram specifically showing one mode of introducing a mutation for preventing a protein from binding to a protein binding sequence.
  • FIG. 14 is a diagram specifically showing one aspect of introducing a mutation for preventing a protein from binding to a protein binding sequence.
  • nucleic acid includes not only DNA and RNA, but also modified nucleic acid and nucleic acid analogs (for example, peptide nucleic acid (PNA) and LNA (Locked nucleic acid)). is there.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA Locked nucleic acid
  • nucleic acid double strand means that two nucleic acid molecules are bound as complementary strands of each other.
  • nucleic acid single strand means a nucleic acid molecule that is not bound as a complementary strand of another nucleic acid molecule. For example, a part of the nucleic acid molecule hybridizes within the nucleic acid molecule, and a double strand A nucleic acid molecule having a portion is also included in the “nucleic acid single strand”. Moreover, the nucleic acid single strand may be connected in series with another nucleic acid single strand directly or through another sequence (for example, linker sequence).
  • “complementary” means that a hydrogen bond is formed between bases constituting each sequence. Specifically, thymine is paired with adenine, and thymine is bonded with thymine. It means that adenine is paired, cytosine is paired with guanine, and guanine is paired with cytosine.
  • “complementarity” means the ratio of complementary base pairs between sequences to be compared. All the values of “complementarity” shown in the present specification are obtained by using a homology search program known to those skilled in the art as homology between one nucleotide sequence and the complementary strand of the other nucleotide sequence. Any numerical value may be used. For example, it can be easily calculated by using a default (initial setting) parameter in FASTA, BLAST, or the like.
  • hybridize means to hybridize to a target nucleic acid under stringent conditions and not to hybridize with other than the target nucleic acid.
  • the nucleic acid that can hybridize with the base sequence of the target nucleic acid under stringent conditions is complementary to the base sequence of the target nucleic acid by 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • a nucleic acid consisting of a base sequence having a property is complementary to the base sequence of the target nucleic acid by 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • Stringent conditions can be appropriately determined by those skilled in the art (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), for example, conditions of salt concentration of 0.1 mM to 3 M, temperature of 10 to 80 ° C., Preferably, the conditions are a salt concentration of 1 mM to 1 M and a temperature of 20 to 70 ° C.
  • the number of “consecutive” nucleotides is not particularly limited as long as each nucleotide sequence and the corresponding nucleotide sequence can be combined (preferably hybridized). Is preferably 15% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 25% or more, and particularly preferably 30% or more.
  • Tm value refers to two single-stranded nucleic acids to be compared under the reaction conditions in which the method of the present invention is carried out (for example, defined by nucleic acid concentration, salt concentration, pH, etc.) 50% means the temperature at which duplexes are formed.
  • the Tm value can be calculated using, for example, a change in the amount of UV absorption accompanying a change in temperature, a double-stranded DNA detection reagent such as SYBR Green I, a change in the fluorescence value of fluorescence energy transfer, etc. Can be calculated using a known algorithm (for example, Markham NR and Zuker M (2005) Nucleic Acids Research 33 W577-W581).
  • mismatch means a base pair other than an adenine / thymine base pair and a guanine / cytosine base pair, or a state without a corresponding base (bulge).
  • Nucleic acid complex According to the present invention, there is provided a method for detecting the binding between a nucleic acid and a nucleic acid binding protein, comprising measuring the degree of structural change of a nucleic acid complex having at least two nucleic acid duplex parts. A method is provided.
  • nucleotide exchange between nucleic acid duplexes means that the complementary strand of a nucleotide strand that forms a nucleic acid duplex is replaced with a nucleotide strand that forms another nucleic acid duplex.
  • Nucleotide strand exchange between nucleic acid duplexes may be irreversible or reversible and is based on the structure of the nucleic acid complex used.
  • the nucleic acid complex having at least two nucleic acid double-stranded parts includes a complex formed by binding two nucleic acid duplexes to each other at their terminal sequences (nucleic acid double-stranded complex; first embodiment) and two nucleic acid complexes. And a complex composed of two nucleic acid double-stranded parts reversibly exchanged (integrated nucleic acid complex; second embodiment).
  • the nucleic acid complex of the first aspect and the nucleic acid complex of the second aspect are described below.
  • Nucleic acid complex of the first aspect a complex formed by binding two nucleic acid duplexes (nucleic acid duplex A, nucleic acid duplex B) to each other at their terminal sequences
  • a method comprising measuring the degree of structural change of a body (nucleic acid double-stranded complex).
  • the nucleic acid double strand A is a nucleic acid double strand composed of a nucleic acid A1 which is a nucleic acid single strand and a nucleic acid A2 which is a nucleic acid single strand, and which can bind to a nucleic acid double strand B in a terminal sequence.
  • the nucleic acid double strand B is a nucleic acid double strand which is composed of a nucleic acid B1 which is a nucleic acid single strand and a nucleic acid B2 which is a nucleic acid single strand and which can bind to the nucleic acid double strand A in the terminal sequence.
  • nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 can be designed as follows.
  • Nucleic acid A1 A nucleic acid single strand having a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence (terminal sequence).
  • Nucleic acid A2 a nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the first nucleotide sequence and a third nucleotide sequence (terminal sequence).
  • Nucleic acid B1 A nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the second nucleotide sequence (terminal sequence) and a fourth nucleotide sequence.
  • Nucleic acid B2 A nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the third nucleotide sequence (terminal sequence) and a sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence.
  • the nucleic acid A2 after designing the nucleic acid A1 based on the target nucleic acid binding protein, the nucleic acid A2, the nucleic acid B1, and the nucleic acid B2 can be designed sequentially based on the nucleic acid A1.
  • nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 can be designed such that nucleotide chain exchange between nucleic acid duplexes in a nucleic acid duplex complex is performed irreversibly.
  • nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 is shown in FIG. 1A.
  • the first to fourth nucleotide sequences (polynucleotides) and their corresponding sequences (polynucleotides) are not particularly limited as long as they can form nucleic acid double strand A and nucleic acid double strand B, respectively. Can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in the nucleic acid A2 can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to a sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in the nucleic acid B2 can be selected.
  • the first nucleotide sequence is selected to have 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more complementarity with the sequence corresponding to the first nucleotide sequence. can do.
  • the fourth nucleotide sequence is selected to have 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, most preferably 95% or more complementarity with the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. can do.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence. As will be described later, mismatch may be introduced for the purpose of improving detection sensitivity.
  • the first nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20, in particular a contiguous sequence complementary to the sequence corresponding to the first nucleotide sequence, in particular Preferably, it can be selected to comprise at least 25 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20 consecutive complementary sequences of the first nucleotide sequence. Particularly preferably, it can be selected to comprise at least 25 nucleotides.
  • the fourth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20, in particular a contiguous sequence complementary to the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. Preferably, it can be selected to comprise at least 25 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably at least 20 consecutive complementary sequences of the fourth nucleotide sequence. Particularly preferably, it can be selected to comprise at least 25 nucleotides.
  • the Tm value between the first nucleotide sequence and the sequence corresponding to the first nucleotide sequence is 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably, from the reaction temperature. It can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the fourth nucleotide sequence has a Tm value with the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. from the reaction temperature. It can be selected to be higher.
  • the first to fourth nucleotide sequences and their corresponding sequences are not particularly limited as long as the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B can form a nucleic acid duplex complex, and any sequence is possible. Can be selected.
  • the second nucleotide sequence in nucleic acid duplex A binds (preferably hybridizes) to the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in nucleic acid duplex B, but the second nucleotide sequence in nucleic acid duplex A Select a sequence that does not bind (preferably hybridize) to the three nucleotide sequences, the sequence corresponding to the third nucleotide sequence in nucleic acid duplex B, or the second nucleotide sequence in other nucleic acid duplex A can do.
  • the third nucleotide sequence in the nucleic acid duplex A binds (preferably hybridizes) to the sequence corresponding to the third nucleotide sequence in the nucleic acid duplex B.
  • Select a sequence that does not bind (preferably hybridize) to the second nucleotide sequence, the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in nucleic acid duplex B, or the third nucleotide sequence in other nucleic acid duplex A can do.
  • the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence in the nucleic acid duplex A, and the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in the nucleic acid duplex B and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, respectively, Sequences that do not bind (preferably hybridize) within the nucleic acid molecule can be selected.
  • the second nucleotide sequence is selected to have 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more complementarity with the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. can do.
  • the second nucleotide sequence can be selected to have less than 50%, more preferably less than 30% complementarity with the third nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, respectively.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence is selected so as to have a complementarity of less than 50%, more preferably less than 30%, respectively with the third nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence. can do.
  • the third nucleotide sequence is selected to have 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, most preferably 95% or more complementarity with the sequence corresponding to the third nucleotide sequence. can do.
  • the third nucleotide sequence can be selected to have less than 50%, more preferably less than 30% complementarity with the second nucleotide sequence and the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, respectively.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence is selected so as to have a complementarity of less than 50%, more preferably less than 30%, respectively, with the second nucleotide sequence or the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. can do.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence. As will be described later, mismatch may be introduced for the purpose of improving detection sensitivity.
  • the second nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, even more preferably at least 20 nucleotides contiguous to the sequence complementary to the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. Can be selected.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20 contiguous sequences complementary to the second nucleotide sequence.
  • the second nucleotide sequence may comprise consecutive nucleotides of the third nucleotide sequence and / or the complementary sequence of the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, and also corresponds to the second nucleotide sequence.
  • the sequence may comprise a contiguous nucleotide of a third nucleotide sequence and / or a sequence complementary to the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, the number of nucleotides being at most 4, preferably 3 Or less.
  • the third nucleotide sequence may also comprise consecutive nucleotides of the second nucleotide sequence and / or the complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, and also corresponds to the third nucleotide sequence.
  • the sequence may comprise a contiguous nucleotide of the second nucleotide sequence and / or the complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, but the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 Or less.
  • the third nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, even more preferably at least 20 nucleotides contiguous to the sequence complementary to the sequence corresponding to the third nucleotide sequence. Can be selected.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20 contiguous sequences complementary to the third nucleotide sequence.
  • the third nucleotide sequence may comprise consecutive nucleotides of the second nucleotide sequence and / or the complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, and also corresponds to the third nucleotide sequence.
  • the sequence may comprise a contiguous nucleotide of the second nucleotide sequence and / or the complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, but the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 Or less.
  • the second nucleotide sequence may also include consecutive nucleotides of the third nucleotide sequence and / or the complementary sequence of the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, and also corresponds to the second nucleotide sequence.
  • the sequence may comprise a contiguous nucleotide of a third nucleotide sequence and / or a sequence complementary to the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, the number of nucleotides being at most 4, preferably 3 Or less.
  • the Tm value between the second nucleotide sequence and the sequence corresponding to the second nucleotide sequence is 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably, from the reaction temperature. It can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the Tm value between the third nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence is 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more from the reaction temperature, respectively. Preferably, it can be selected to be 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or lower.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence is such that the Tm value between the third nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence is 5 ° C. or more from the reaction temperature, preferably 10 It can be selected so as to be lower than or equal to ° C, more preferably lower than or equal to 15 ° C, and still more preferably lower than or equal to 20 ° C.
  • the third nucleotide sequence has a Tm value with the sequence corresponding to the third nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. from the reaction temperature. It can be selected to be higher.
  • the third nucleotide sequence has a Tm value of 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably from the reaction temperature, respectively, with the second nucleotide sequence or the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. , 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence has a Tm value of 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more from the reaction temperature, respectively, with the second nucleotide sequence or the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. More preferably, the temperature can be selected to be 15 ° C. or higher, and more preferably 20 ° C. or lower.
  • the first to fourth nucleotide sequences and their corresponding sequences are particularly limited as long as structural changes that form nucleic acid duplex C and nucleic acid duplex D occur from nucleic acid duplex A and nucleic acid duplex B. Instead, any sequence can be selected. For example, as the first nucleotide sequence in the nucleic acid A1, a sequence that binds (preferably hybridizes) to the fourth nucleotide sequence in the nucleic acid B1 can be selected. Further, as the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in the nucleic acid A2, a sequence that binds (preferably hybridizes) to the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in the nucleic acid B2 can be selected.
  • the first nucleotide sequence can be selected to have 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more complementarity with the fourth nucleotide sequence. .
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence has a complementarity of 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, most preferably 95% or more with the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. You can choose to have.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence. As will be described later, mismatch may be introduced for the purpose of improving detection sensitivity.
  • the first nucleotide sequence comprises at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20, even more preferably at least 25 nucleotides in a contiguous sequence of the fourth nucleotide sequence. Can be selected. Also, the fourth nucleotide sequence comprises at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20, even more preferably at least 25 nucleotides of the complementary sequence of the first nucleotide sequence. Can be selected.
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence is at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20, more preferably at least 20 contiguous sequences complementary to the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. It can be selected to comprise 25 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence is at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20, and more preferably, a sequence complementary to the sequence corresponding to the first nucleotide sequence. , Can be selected to comprise at least 25 nucleotides.
  • the first nucleotide sequence has a Tm value between the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher. You can choose to be.
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence has a Tm value of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably higher than the reaction temperature. Can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence may be both at one end of the nucleic acid double strand A or at both ends.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence may be both at one end of the nucleic acid duplex B, respectively, There may be.
  • the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence are both at one end of nucleic acid duplex A, and as the terminal sequence of nucleic acid duplex B, the second sequence This is the case where the sequence corresponding to the nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence are both present at one end of the nucleic acid duplex B.
  • the length of the base pair of the double-stranded part in nucleic acid double-stranded chain A is determined by nucleic acid double-stranded C and nucleic acid double-stranded It is not particularly limited as long as the structural change that forms D is not inhibited, and can be, for example, 5 base pairs to 1000 base pairs, preferably 10 base pairs to 100 base pairs, more preferably 15 base pairs. ⁇ 50 base pairs.
  • the lengths of the base pairs of the double-stranded part (pairing part of the fourth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence) in the nucleic acid double-stranded B are the nucleic acid double-stranded C and nucleic acid double-stranded. It is not particularly limited as long as the structural change that forms D is not inhibited, and can be, for example, 5 base pairs to 1000 base pairs, preferably 10 base pairs to 100 base pairs, more preferably 15 base pairs. ⁇ 50 base pairs.
  • the length of the base of the single-stranded part (second nucleotide sequence and third nucleotide sequence) in nucleic acid duplex A is not particularly limited as long as it can form the nucleic acid double-stranded complex of the present invention, For example, it can be 3 bases to 1000 bases, preferably 5 bases to 100 bases, more preferably 10 bases to 30 bases.
  • the length of the base of the single-stranded portion (the sequence corresponding to the second nucleotide sequence and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence) in the nucleic acid duplex B is such that the nucleic acid double-stranded complex of the present invention is used.
  • the base is not particularly limited, and can be, for example, 3 bases to 1000 bases, preferably 5 bases to 100 bases, more preferably 10 bases to 30 bases.
  • At least one of the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B has a binding site for a nucleic acid binding protein.
  • the binding site of the nucleic acid binding protein is at least one selected from the double-stranded part of the nucleic acid duplex A and / or the nucleic acid duplex B, the single-stranded part, and the branched part of the nucleic acid double-stranded complex.
  • the recognition sequence and its peripheral sequence are included.
  • the binding mode is particularly limited as long as the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B bind to each other at their respective terminal sequences and structural changes such as nucleotide chain exchange occur. Although it is not a thing, Preferably, it can couple
  • the 3 ′ end sequence (second nucleotide sequence) of the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex 5 'terminal sequence of the strand B (sequence corresponding to the second nucleotide sequence) binds and / or 5' terminal sequence of the nucleic acid duplex A (third nucleotide sequence) and the nucleic acid duplex B It is preferable to prepare the nucleic acid double strand A and the nucleic acid double strand B so that the 3 ′ terminal sequence (sequence corresponding to the third nucleotide sequence) is bound.
  • the 3 ′ end sequence of nucleic acid duplex A and the 5 ′ end sequence of nucleic acid duplex B are hybridized and / or the 5 ′ end sequence of nucleic acid duplex A and nucleic acid duplex
  • the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B are designed so as to hybridize with the 3 ′ terminal sequence of the strand B.
  • nucleic acid double strand A and the nucleic acid double strand 2 are prevented so that the nucleic acid double strand C and the nucleic acid double strand D do not bind to each other. It is preferable to prepare the main chain B.
  • the nucleic acid duplex is so formed that the single-stranded sequence formed by combining nucleic acid A1 and nucleic acid B1 and the single-stranded sequence formed by combining nucleic acid A2 and nucleic acid B2 do not hybridize.
  • a strand A and a nucleic acid duplex B are designed.
  • the complementarity between the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence is 70% or more, and / or the sequence corresponding to the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence And / or a complementarity between the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence, and a sequence corresponding to the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence.
  • the first nucleotide sequence also comprises at least 10 consecutive nucleotides of the complementary sequence of the fourth nucleotide sequence, or the fourth nucleotide sequence comprises Comprising at least 10 contiguous nucleotides of the complementary sequence of one nucleotide sequence and / or the sequence corresponding to the first nucleotide sequence is contiguous with the complementary sequence of the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence Comprising at least 10 nucleotides, or the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence comprises at least 10 consecutive nucleotides of the complementary sequence of the sequence corresponding to the first nucleotide sequence, and
  • the second nucleotide sequence is contiguous with the complementary sequence of the third nucleotide sequence If it contains a nucleotide, the number of nucleotides is a maximum of 4, and if the second nucleotide sequence contains consecutive nucleotides of the complementary sequence of the sequence of the sequence
  • the number of nucleotides is 4 at the maximum. If the nucleotide sequence contains consecutive nucleotides of the complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, the number of nucleotides is at most 4 and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence is the second nucleotide In the case of containing a contiguous nucleotide of a complementary sequence of the sequence, the number of nucleotides is a maximum of 4, and the sequence corresponding to the third nucleotide sequence is contiguous with the complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. When nucleotides are included, the detection method according to the present invention is provided in which the number of nucleotides is 4 at the maximum.
  • the Tm value between the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence and / or the sequence corresponding to the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence are further corresponded. And / or a Tm value between the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence, and / or a Tm value between the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence.
  • the Tm value between the sequence corresponding to the sequence, the Tm value between the sequence corresponding to the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence, the sequence corresponding to the second nucleotide sequence and the third nucleotide sequence A detection method according to the present invention is provided in which the Tm values between corresponding sequences are each 5 ° C. or more lower than the reaction temperature.
  • a complex (an integrated nucleic acid complex E, one comprising two nucleic acid double-stranded portions reversibly strand-exchanged).
  • a method comprising measuring the degree of structural change of the somatic nucleic acid complex F).
  • the integrated nucleic acid complex E includes a nucleic acid complex G having a nucleic acid double-stranded part and a nucleic acid complex H having a nucleic acid double-stranded part.
  • the nucleic acid complex G is a nucleic acid complex that includes the nucleic acid G1 that is a nucleic acid single-strand-containing body and the nucleic acid G2 that is a nucleic acid single-strand-containing body, and can bind to the nucleic acid complex H at the terminal sequence. is there.
  • the nucleic acid complex H is a nucleic acid complex that includes the nucleic acid H1 that is a nucleic acid single-strand-containing body and the nucleic acid H2 that is a nucleic acid single-strand-containing body, and can bind to the nucleic acid complex G in the terminal sequence. is there.
  • the integrated nucleic acid complex F comprises a nucleic acid complex I having a nucleic acid double-stranded part and a nucleic acid complex J having a nucleic acid double-stranded part.
  • the nucleic acid complex I is a nucleic acid complex that includes the nucleic acid G1 that is a nucleic acid single-strand-containing body and the nucleic acid H1 that is a nucleic acid single-strand-containing body, and can bind to the nucleic acid complex J at the terminal sequence is there.
  • the nucleic acid complex J is a nucleic acid complex that includes the nucleic acid G2 that is a nucleic acid single-strand-containing body and the nucleic acid H2 that is a nucleic acid single-strand-containing body, and can bind to the nucleic acid complex I in the terminal sequence. is there.
  • the integrated nucleic acid complex E is newly converted into an integrated nucleic acid complex F including the nucleic acid complex I and the nucleic acid complex J by a strand exchange reaction between the nucleic acid complex G and the nucleic acid complex H. Converted.
  • the integrated nucleic acid complex F is also newly added to the integrated nucleic acid complex including the nucleic acid complex G and the nucleic acid complex H by the strand exchange reaction between the nucleic acid complex I and the nucleic acid complex J. Converted to E.
  • Such a structural change between the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F is reversibly repeated.
  • nucleic acid G1 Consists of a terminal part 1, a fifth nucleotide sequence, and a terminal part 3, with terminal part 1 at the 3 ′ end of the fifth nucleotide sequence and terminal part at the 5 ′ end of the fifth nucleotide sequence
  • Nucleic acid single-stranded product comprising 3 linked together.
  • Nucleic acid G2 consisting of a terminal part 2, a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, and a part corresponding to the terminal part 3, the terminal part 2 being at the 5 ′ end of the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, A nucleic acid single-stranded product comprising a portion corresponding to a terminal portion 3 linked to the 3 ′ end of a sequence corresponding to a fifth nucleotide sequence.
  • Nucleic acid H1 It consists of a part corresponding to the terminal part 1, a sixth nucleotide sequence, and a terminal part 4, and the part corresponding to the terminal part 1 at the 5 ′ end of the sixth nucleotide sequence is the sixth nucleotide A nucleic acid single-stranded product comprising a terminal portion 4 linked to the 3 ′ end of a sequence.
  • Nucleic acid H2 consisting of a portion corresponding to the terminal portion 4, a sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence, and a portion corresponding to the terminal portion 2, and ends at the 5 ′ end of the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence
  • a nucleic acid single-stranded product comprising a portion corresponding to the portion 4 and a portion corresponding to the terminal portion 2 linked to the 3 ′ end of the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence.
  • the nucleic acid G2 after designing the nucleic acid G1 based on the target nucleic acid binding protein, the nucleic acid G2, the nucleic acid H2, and the nucleic acid H1 can be sequentially designed based on the nucleic acid G1.
  • nucleic acid G1, nucleic acid G2, nucleic acid H1, and nucleic acid H2 are designed so that the integrated nucleic acid complex composed of the nucleic acid G1, the nucleic acid G2, the nucleic acid H1, and the nucleic acid H2 repeats a reversible structural change by a strand exchange reaction. .
  • FIG. 1B one embodiment of the specific structure of the integrated nucleic acid complex E
  • FIG. 1C the integrated nucleic acid complex F
  • FIG. 1B one embodiment of the specific structure of the integrated nucleic acid complex E
  • FIG. 1C the integrated nucleic acid complex F
  • a sequence in which strand exchange is performed (the fifth nucleotide sequence, the fifth nucleotide sequence, It is possible to add terminal portions for stopping and reversing the progress of strand exchange at both ends of each of the sequence corresponding to the five nucleotide sequences, the sixth nucleotide sequence, and the sixth corresponding to the nucleotide sequence) .
  • the “terminal part” is not particularly limited as long as it can stop and reverse the progress of the strand exchange performed between the two double-stranded parts, and may be a polynucleotide or a chain. It may be a linker that joins the ends of two nucleotide chains to be exchanged (for example, an alkyl chain joined to the ends of two nucleotide chains to be exchanged by a phosphodiester bond). Further, it may be a polynucleotide having such a linker introduced at the extreme end.
  • the terminal portion is preferably a polynucleotide.
  • terminal portion is a polynucleotide
  • each of the nucleic acid G1, the nucleic acid G2, the nucleic acid H1, and the nucleic acid G2 can be provided as a single nucleic acid strand.
  • the reversible structural change between the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F occurs as follows. First, (1) strand exchange in which a nucleic acid duplex consisting of a fifth nucleotide sequence and a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence is formed, and the strand in the 5 ′ ⁇ ⁇ 3 ′ direction in the fifth nucleotide sequence Strand exchange in which the exchange is stopped at the 3 ′ end of the fifth nucleotide sequence and / or a nucleic acid duplex consisting of a sixth nucleotide sequence and a sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is formed.
  • a strand exchange in which a nucleic acid duplex consisting of a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence and a sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is formed, and in the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, 5 ′ ⁇ ⁇ ⁇ 3 'Strand exchange in the direction proceeds.
  • a highly stable base pair group is not formed between the nucleotide sequence of the 5 ′ end of the terminal portion 1 and the nucleotide sequence of the 3 ′ terminal of the terminal portion 2, and the 3 ′ terminal of the portion corresponding to the terminal portion 1
  • the highly stable base pair group formed between the sequence and the 5 ′ terminal nucleotide sequence of the part corresponding to the terminal part 2 is composed of the 5 ′ terminal nucleotide sequence of terminal part 1 and the 3 ′ terminal of terminal part 2 Group of base pairs with low stability between the nucleotide sequence of and the stability between the nucleotide sequence at the 3 ′ end of the portion corresponding to terminal portion 1 and the nucleotide sequence at the 5 ′ end of the portion corresponding to terminal portion 2 It can be designed to be thermodynamically more stable than a base pair group with low potency.
  • Strand exchange stopped at the 5 ′ end of the sequence and / or forming a nucleic acid duplex consisting of a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence and a sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence comprising: In order that the strand exchange in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction is stopped at the 3 ′ end of the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence and the direction of the strand exchange is changed in the sequence corresponding to the nucleotide sequence of A highly stable base pair group is not formed between the nucleotide sequence at the 3 ′ end of the terminal portion 3 and the nucleotide sequence at the 5 ′ end of the terminal portion 4, and the 5 ′ end of the portion corresponding to the terminal portion 3 A highly stable base pair group is not formed between the nucleotide sequence and the nucleotide sequence at the 3 ′ end of the portion corresponding to the terminal portion 4; and / or the nucleotide sequence at the 3 ′ end of the terminal portion 3 and the
  • a highly stable base pair group formed between the nucleotide sequence at the 3 ′ end of the portion corresponding to terminal portion 4 and the nucleotide sequence at the 3 ′ end of terminal portion 3 and the 5 ′ end of terminal portion 4 Low stability between the nucleotide sequence and the stability between the nucleotide sequence at the 5 ′ end of the portion corresponding to the terminal portion 3 and the nucleotide sequence at the 3 ′ end of the portion corresponding to the terminal portion 4 It can be designed to be thermodynamically more stable than a low base pair group.
  • Thermodynamic stability can be appropriately determined by those skilled in the art from the base pairs used.
  • Low-stability base pair groups include base pairs that cannot be paired because they are thermodynamically unstable at the locations to be paired. means.
  • base pair group H is not particularly limited as long as it is thermodynamically more stable than the “base pair group having low stability” (base pair group L).
  • the base pair group having a higher ratio of GC base pairs and AT base pairs (preferably, the ratio of GC base pairs) than the base pair group L can be obtained.
  • the base pair group L is not particularly limited as long as it is thermodynamically more unstable than the base pair group H.
  • a GG base pair, a GT base pair, a GA base pair, a TT base pair having low stability A base pair group in which the ratio of AA base pairs, TC base pairs, AC base pairs, CC base pairs, bulge bases (bases having no corresponding base), etc. is larger than the base pair group H can be obtained.
  • the base pair group L is not particularly limited as long as it can stop the progress of the strand exchange performed between the two double-stranded portions, and is at least 1, preferably 2 to 3, more preferably 4 A base pair group consisting of at least one base (for example, 4 to 10, 4 to the base length of the terminal portion) can be used. More preferably, the base pair group L is a base pair group comprising at least 2 to 4 consecutive low-stability base pairs.
  • the base pair group H is not particularly limited as long as the strand exchange performed between the two double-stranded portions can be stopped and the traveling direction thereof can be changed.
  • two or more, preferably three or more A base pair group consisting of (for example, 3 to 10, 3 to the terminal base length) can be used.
  • the base pair group H is a base pair group comprising at least 2 to 4 consecutive highly stable base pairs.
  • nucleotide sequences of the terminal portions 1 to 4 and the sequences corresponding thereto are particularly limited as long as reversible structural changes between the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F are possible. Any sequence can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 1 can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 2 can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 3 can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 4 can be selected.
  • the nucleotide sequence of terminal portion 1 is complementary to the nucleotide sequence of the portion corresponding to terminal portion 1 by 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more. Can be selected.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 2 has a complementarity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 2 Can be selected.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 3 has a complementarity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 3 Can be selected.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 4 has a complementarity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 4 Can be selected.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence. As will be described later, mismatch may be introduced for the purpose of improving detection sensitivity.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 1 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, more preferably at least 10 consecutive complementary sequences of the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 1. Of nucleotides can be selected. Further, the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 1 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, more preferably at least the contiguous sequence of the nucleotide sequence of the terminal portion 1. It can be selected to comprise 10 nucleotides.
  • the nucleotide sequence of terminal portion 2 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, more preferably at least 10 consecutive complementary sequences of the nucleotide sequence of the portion corresponding to terminal portion 2. Of nucleotides can be selected. In addition, the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 2 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, more preferably at least the contiguous sequence of the nucleotide sequence of the terminal portion 2. It can be selected to comprise 10 nucleotides.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 3 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, even more preferably at least 10 contiguous sequences of the nucleotide sequence corresponding to the terminal portion 3. Of nucleotides can be selected. In addition, the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 3 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, more preferably at least the contiguous sequence of the nucleotide sequence of the terminal portion 3. It can be selected to comprise 10 nucleotides.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 4 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, even more preferably at least 10 contiguous sequences complementary to the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 4. Of nucleotides can be selected. In addition, the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 4 is at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 7, more preferably at least the contiguous sequence of the nucleotide sequence of the terminal portion 4. It can be selected to comprise 10 nucleotides.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 1 has a Tm value between the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 1 of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably from the reaction temperature. Can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 2 has a Tm value between the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 2 of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably from the reaction temperature. Can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the Tm value between the nucleotide sequence of the terminal portion 3 and the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 3 is 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably from the reaction temperature. Can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the nucleotide sequence of the terminal portion 4 has a Tm value between the nucleotide sequence of the portion corresponding to the terminal portion 4 of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably from the reaction temperature. Can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the length of base pairs of the nucleotide sequence of the terminal portion (polynucleotide) 1 to 4 and the nucleotide sequence corresponding thereto prevents reversible structural changes.
  • it can be 3 to 50 bases, preferably 5 to 30 bases, more preferably 10 to 30 bases, and even more preferably 10 to 20 bases. It is.
  • nucleic acid G1 the nucleic acid G2
  • nucleic acid H1 the nucleic acid H2
  • nucleic acid H2 only one of the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F has a binding site for the nucleic acid binding protein. Designed to.
  • the present invention utilizes the fact that structural changes between nucleic acid duplexes are inhibited by the binding of nucleic acid binding proteins, but in an integrated nucleic acid complex, the protein binding sequence changes before and after strand exchange. Absent. For example, when the nucleic acid complex G (nucleic acid G1 / nucleic acid G2) has a protein binding sequence, the nucleic acid complex I (nucleic acid G1 / nucleic acid H1) and the nucleic acid complex J (nucleic acid G2 / nucleic acid H2) also have protein binding sequences. Will exist. In this case, the nucleic acid binding protein is bound to both the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F. In order to detect protein binding using the present invention, the nucleic acid binding protein is designed to bind to only one of the integrated nucleic acid complexes.
  • a nucleic acid binding protein that recognizes and binds to a base sequence is inhibited from binding if there is a mutation in the recognition site. Therefore, according to the present invention, only one of the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F has a nucleic acid protein binding sequence, and the other integrated nucleic acid complex has a nucleic acid protein binding sequence. To avoid this, for example, mutations can be introduced into the protein binding sequence. Such a mutation can be a mutation in which the nucleic acid protein does not bind other than the binding sequence of the target nucleic acid complex.
  • nucleic acid binding protein can bind to the nucleic acid complex G and, in some cases, to the nucleic acid complex H.
  • nucleic acid complex I is mutated to the nucleic acid H1
  • nucleic acid complex J is mutated to the nucleic acid H2. Therefore, the protein cannot bind to the integrated nucleic acid complex F.
  • the mutation corresponds to any nucleic acid single strand and its complementary strand (for example, the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence / the fifth nucleotide sequence, the sixth nucleotide sequence / the sixth nucleotide sequence).
  • Sequence, fifth nucleotide sequence / sixth nucleotide sequence, sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence / sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence for example, the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence / the fifth nucleotide sequence, the sixth nucleotide sequence / the sixth nucleotide sequence.
  • the mutation is preferably introduced into the protein binding sequence, and more preferably, to a base that is deeply involved in binding to the protein in the protein binding sequence.
  • bases that are deeply involved in binding to proteins are known for each nucleic acid protein. Bases that are deeply involved in protein binding can also be determined from the structure of the protein-nucleic acid complex determined by X-ray analysis or the like. Alternatively, it can be inferred from highly conserved bases that can be searched by a database such as TFSEARCH (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html).
  • the position of the mutation can be determined so that the strand exchange is not inhibited and the binding of the nucleic acid binding protein is inhibited. For example, it can be introduced by shifting between complementary strands (that is, a mutation can be introduced only at the base of one strand at each location) or can be introduced at the same location. In addition, when a mutation is introduced at the same position, a mutation that causes a mismatch can be introduced, or a mutation that becomes a match can be introduced. However, in order not to reduce the efficiency of strand exchange, it is preferable that the mutation is introduced in the complementary strand while shifting the mutation site.
  • the type of mutation is not particularly limited as long as it can inhibit the binding of the nucleic acid binding protein, and can be appropriately determined according to the target nucleic acid binding protein and its recognition sequence, but nucleotide substitution, deletion, insertion Etc., and substitution is preferable.
  • the number of mutations is not particularly limited as long as the binding of the nucleic acid binding protein can be inhibited, and can be appropriately determined according to the target nucleic acid binding protein and its recognition sequence. For example, 1 to 10 per strand. The number is preferably 1 to 5, more preferably 2 to 5.
  • Nucleic acids introduced with mutations can be synthesized according to known methods.
  • the fifth or sixth nucleotide sequence and the sequence corresponding thereto are not particularly limited as long as a reversible structural change between the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F is possible.
  • a sequence can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence in the nucleic acid G2 can be selected.
  • a sequence that binds (preferably, hybridizes) to the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence in the nucleic acid H2 can be selected.
  • the fifth nucleotide sequence is selected to have 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more complementarity with the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence. can do.
  • the sixth nucleotide sequence is selected to have 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, most preferably 95% or more complementarity with the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence. can do.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence. As will be described later, mismatch may be introduced for the purpose of improving detection sensitivity.
  • the fifth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, even more preferably at least 20 nucleotides contiguous to the sequence complementary to the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence. Can be selected.
  • the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20 contiguous sequences complementary to the fifth nucleotide sequence. Of nucleotides can be selected.
  • the sixth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, even more preferably at least 20 nucleotides contiguous to the sequence complementary to the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence. Can be selected.
  • the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 20 contiguous sequences complementary to the sixth nucleotide sequence. Of nucleotides can be selected.
  • the fifth nucleotide sequence has a Tm value between the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably from the reaction temperature. It can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the sixth nucleotide sequence has a Tm value with the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. from the reaction temperature. It can be selected to be higher.
  • a sequence that binds (preferably, hybridizes) with the sixth nucleotide sequence in the nucleic acid H1 can be selected.
  • a sequence that binds (preferably hybridizes) to the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence in the nucleic acid G2 can be selected.
  • the fifth nucleotide sequence can be selected to have 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more complementarity with the sixth nucleotide sequence. .
  • sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence is complementary to the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence by 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. You can choose to have.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence. As will be described later, mismatch may be introduced for the purpose of improving detection sensitivity.
  • the fifth nucleotide sequence comprises at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15 and even more preferably at least 20 nucleotides contiguous to the complementary sequence of the sixth nucleotide sequence. Can be selected. Also, the sixth nucleotide sequence comprises at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and even more preferably at least 20 nucleotides of the complementary sequence of the fifth nucleotide sequence. Can be selected.
  • the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 15 contiguous sequences complementary to the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence. It can be selected to comprise 20 nucleotides. Further, the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably, a sequence complementary to the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence. Can be selected to comprise at least 20 nucleotides.
  • the fifth nucleotide sequence has a Tm value between the sixth nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher. You can choose to be.
  • the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence has a Tm value of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably higher than the reaction temperature. Can be selected to be 20 ° C. or higher.
  • the base pairs of the fifth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence and the sixth nucleotide sequence are not particularly limited as long as reversible structural changes are not inhibited, and can be, for example, 5 to 100 base pairs, preferably 8 to 50 base pairs, more preferably 10 base pairs to 30 base pairs.
  • At least one type of protein binding site is present in the double-stranded part of the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex, or in the branched part of the integrated nucleic acid complex.
  • a double-stranded portion more preferably a double-stranded portion of a fifth nucleotide sequence and a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, and / or a sixth nucleotide sequence and a sixth nucleotide sequence.
  • the recognition sequence and its peripheral sequence are included.
  • the integrated nucleic acid complex is not particularly limited, but preferably Can be bound by hybridization.
  • the integrated nucleic acid complex may be an intramolecular higher-order structure of one nucleic acid, or a multimer composed of two or more nucleic acids.
  • the 5 ′ end of the nucleic acid G1 and the 3 ′ end of the nucleic acid G2 may be linked by a phosphodiester bond, and the nucleic acid G1 and the nucleic acid G2 may be single-stranded.
  • the 3 ′ end of the nucleic acid G1 and the 5 ′ end of the nucleic acid H1 may be linked by a phosphodiester bond, and the nucleic acid G1 and the nucleic acid H1 may be single-stranded.
  • the 3 ′ end of the nucleic acid H1 and the 5 ′ end of the nucleic acid H2 may be linked by a phosphodiester bond, and the nucleic acid H1 and the nucleic acid H2 may be single-stranded.
  • the 3 ′ end of the nucleic acid H2 and the 5 ′ end of the nucleic acid G2 may be linked by a phosphodiester bond, and the nucleic acid G2 and the nucleic acid H2 may be single-stranded.
  • the integrated nucleic acid complex can have the following structure.
  • an integrated nucleic acid complex comprising:
  • the nucleic acid G1 comprises a terminal part 1, a fifth nucleotide sequence, and a terminal part 3.
  • the terminal part 1 is at the 3 ′ end of the fifth nucleotide sequence and the terminal part is at the 5 ′ end of the fifth nucleotide sequence.
  • 3 is a nucleic acid single strand formed by linking,
  • the nucleic acid G2 consists of a terminal portion 2, a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, and a portion corresponding to the terminal portion 3, and the terminal portion 2 is at the 5 ′ end of the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence.
  • the nucleic acid H1 comprises a part corresponding to the terminal part 1, a sixth nucleotide sequence, and a terminal part 4, and the part corresponding to the terminal part 1 at the 5 ′ end of the sixth nucleotide sequence is the sixth nucleotide.
  • the nucleic acid H2 is composed of a portion corresponding to the terminal portion 4, a sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence, and a portion corresponding to the terminal portion 2, and ends at the 5 ′ end of the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence.
  • the portion corresponding to the portion 4 is a single-stranded nucleic acid in which the portion corresponding to the terminal portion 2 is linked to the 3 ′ end of the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence;
  • the terminal portions 1 to 4 and the corresponding portions are polynucleotides,
  • a low-stability base pair group (for example, 2 to 10 base pairs) is formed between the nucleotide sequence at the 5 ′ end of terminal portion 1 and the nucleotide sequence at the 3 ′ end of terminal portion 2, and
  • a less stable base pair group eg, 2-10 base pairs
  • a highly stable base pair group is formed between the nucleotide sequence at the 5 ′ end of the terminal portion 1 and the nucleotide sequence at the 3 ′ terminal of the portion corresponding to the terminal portion 1, and
  • a detection method according to the present invention comprising measuring the degree of structural change of an integrated nucleic acid complex.
  • the detection method according to the present invention wherein the degree of structural change is measured using fluorescence resonance energy transfer.
  • nucleic acid binding protein is not particularly limited as long as it is a protein that binds to a nucleic acid.
  • a transcription factor for example, a transcription factor, a structural protein, a repair enzyme, a branched binding protein, a recombinant enzyme, a polymerase, an RNA binding Examples include proteins, single-stranded DNA binding proteins, DNA or RNA cleaving enzymes, and the like.
  • transcription factors examples include TFIIID, NF ⁇ B, p53 and AP1.
  • telomere DNA binding proteins eg, human TRF1, TRF2, POT1, etc.
  • the repair enzyme is a mismatch binding protein, and examples thereof include Escherichia coli MutS, human MSH2, and MSH6.
  • branched binding proteins examples include E. coli RuvA.
  • Examples of enzymes involved in recombination include E. coli RecA, yeast Rad51, and the like.
  • Examples of the polymerase include RNA polymerase and DNA polymerase.
  • RNA binding protein examples include U1 snRNP, U2 snRNP, U6 snRNP contained in the spliceosome complex, poly A binding protein, RNA modifying enzyme, RISC complex, and the like.
  • the single-stranded DNA binding protein examples include E. coli SSB and human RPA.
  • the single-stranded DNA binding protein binds to, for example, a single-stranded portion of at least one of nucleic acid double-stranded A and nucleic acid double-stranded B, and inhibits formation of a nucleic acid double-stranded complex.
  • DNA or RNA cleaving enzyme examples include restriction enzymes (for example, EcoRI, HindIII and the like), nicking enzymes, Dicer and the like. Single-strand or double-strand breaks inhibit the formation of nucleic acid double-stranded complexes or subsequent structural changes.
  • nucleic acid binding protein As the nucleic acid binding protein, a purified protein or a cell extract may be used.
  • nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B having a single-stranded portion at the ends thereof are combined with each other to form a nucleic acid double-stranded complex, followed by structural changes.
  • new nucleic acid duplex C and nucleic acid duplex D are formed.
  • the newly formed nucleic acid double strand C and nucleic acid double strand D do not bind to each other at their terminal sequences to form a complex.
  • a nucleic acid binding protein binds to nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B, formation of such a nucleic acid duplex complex and subsequent formation of a new nucleic acid duplex is inhibited.
  • the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding protein is indicated by the degree of structural change of the nucleic acid double-stranded complex, and specifically, the amount of nucleic acid double-stranded and / or nucleic acid double-stranded complex is indicated as an indicator. Can be detected.
  • Binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding protein can be detected by performing the following steps: (I) contacting the nucleic acid binding protein, the nucleic acid duplex A, and the nucleic acid duplex B; and (ii) measuring the degree of structural change of the nucleic acid duplex complex.
  • nucleic acid duplex C composed of nucleic acid A1 and nucleic acid B1 and / or a nucleic acid duplex composed of nucleic acid A2 and nucleic acid B2 (nucleic acid duplex)
  • amount of D the degree of structural change of the nucleic acid double-stranded complex can be measured.
  • a step of comparing the measured amount with the amount of nucleic acid duplex C and / or nucleic acid duplex D in the absence of the nucleic acid binding protein may be further included.
  • the nucleic acid binding protein is Can be determined to be combined.
  • the degree of structural change of the nucleic acid duplex complex can also be measured by measuring the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B.
  • a step of comparing the measured amount with the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B in the absence of the nucleic acid binding protein may be further included.
  • the nucleic acid binding protein binds to the nucleic acid when the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B in the presence of the nucleic acid binding protein exceeds the amount in the absence of the nucleic acid binding protein. Then it can be determined.
  • the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B includes the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B in the nucleic acid duplex complex.
  • the “contacting step” may be performed by mixing the nucleic acid double strand A, the nucleic acid binding protein and the nucleic acid double strand B all together, or the nucleic acid double strand A.
  • the nucleic acid double strand B may be added after mixing the nucleic acid binding protein with the nucleic acid.
  • the structural change is caused by an excess amount of either one of the nucleic acid duplex A and the nucleic acid duplex B relative to the other nucleic acid duplex.
  • the efficiency can be increased. Also, by selecting an appropriate sequence that does not inhibit the occurrence of structural changes, structural changes with sufficient efficiency can be made even with equal amounts.
  • integrated nucleic acid complex E the nucleic acid complex G and the nucleic acid complex H are bonded to each other to form a nucleic acid complex.
  • the integrated nucleic acid complex F is a nucleic acid complex formed by binding a nucleic acid complex I and a nucleic acid complex J to each other.
  • the integrated nucleic acid complex E is newly converted into an integrated nucleic acid complex F composed of the nucleic acid complex I and the nucleic acid complex J by a strand exchange reaction between the nucleic acid complex G and the nucleic acid complex H.
  • the integrated nucleic acid complex F is newly converted into an integrated nucleic acid complex E composed of the nucleic acid complex G and the nucleic acid complex H by a strand exchange reaction between the nucleic acid complex I and the nucleic acid complex J. Converted. Such a structural change between the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F is reversibly repeated.
  • the nucleic acid binding protein binds to any one of the nucleic acid complex G, the nucleic acid complex H, the nucleic acid complex I, or the nucleic acid complex J, such a reversible structural change is inhibited, and the integrated nucleic acid complex It is stabilized with the structure of either E or the integrated nucleic acid complex F.
  • labels such that the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F have different values for example, nucleic acid G1 and nucleic acid G2, nucleic acid G1 and nucleic acid H1, nucleic acid G1 and nucleic acid H2, nucleic acid G2 and nucleic acid
  • H1, nucleic acid G2 and nucleic acid H2, or nucleic acid H1 and nucleic acid H2, respectively are labeled with a fluorescent label and a quenching label, for example, the label value becomes stable (ie, the label value Rise or fall).
  • the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding protein is performed using the degree of structural change of the integrated nucleic acid complex as an index, specifically, the amount of the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F as an index. Can be detected.
  • One mode of detection of the second mode is shown in FIG.
  • Binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding protein can be detected by performing the following steps: (Iii) contacting the nucleic acid binding protein with the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F; and (iv) measuring the degree of structural change of the integrated nucleic acid complex.
  • step (iv) the degree of structural change of the nucleic acid complex can be measured by measuring the amount of the target integrated nucleic acid complex.
  • the amount of the nucleic acid binding protein bound to the nucleic acid can be determined from the amount of the integrated nucleic acid complex E.
  • the nucleic acid binding protein is designed to bind to the nucleic acid complex I or the nucleic acid complex J
  • the amount of the nucleic acid binding protein bound to the nucleic acid can be determined from the amount of the integrated nucleic acid complex F.
  • the integrated nucleic acid complex F or the integrated nucleic acid complex G and the nucleic acid binding protein can be mixed at the same time.
  • the detection method of the second aspect of the present invention since it is only necessary to mix a nucleic acid complex prepared in advance and a protein, operations such as reduction in operation steps and operational errors due to complexity are reduced. This is advantageous in that improvement in performance can be expected.
  • the nucleic acid binding protein may be brought into contact with the effector molecule (protein).
  • the binding ability between a nucleic acid and a nucleic acid binding protein can be calculated from the amount of nucleic acid formed.
  • a nucleic acid binding protein whose binding sequence is not known is determined by determining whether or not it can bind to a specific sequence using the detection method of the present invention.
  • the binding sequence of the protein can be determined.
  • the detection method of the present invention by determining whether or not the test protein can bind to the target sequence using the detection method of the present invention for a sequence for which the protein to be bound is not known.
  • the nucleic acid binding protein that binds to the binding sequence of interest can be identified.
  • the structural change is not a reaction that requires a catalyst (for example, in the case of the first embodiment, two nucleic acids having a single-stranded portion capable of binding to each other at their ends).
  • the reaction can also be accelerated using a catalyst such as, for example, the E. coli RuvB protein.
  • the detection method according to the present invention may be performed in the presence of a substance that promotes hybridization (for example, polyethylene glycol, dextran sulfate, etc.). Further, the reaction may be performed in the presence of a substance (for example, bovine serum albumin, irrelevant DNA, etc.) having an anti-adsorption or protection effect on proteins and DNA.
  • a substance that promotes hybridization for example, polyethylene glycol, dextran sulfate, etc.
  • a substance for example, bovine serum albumin, irrelevant DNA, etc.
  • the detection method according to the present invention can be performed at a temperature suitable for the nucleic acid binding protein used. Detection of DNA-binding protein is generally performed at 20 ° C. to 30 ° C., but in the case of a thermophilic protein, it can be performed at a higher temperature.
  • any principle or method known to those skilled in the art can be used.
  • radioactive label, fluorescent label examples include methods utilizing electrophoresis, fluorescence resonance energy transfer, and the like.
  • a method using fluorescence labeling or fluorescence resonance energy transfer more preferably, a method using fluorescence resonance energy transfer that enables an assay that does not require a washing operation or electrophoresis to remove excess label.
  • the amount of nucleic acid duplex, nucleic acid duplex complex, nucleic acid complex can be measured.
  • the 5 'end of the nucleic acid A1 can be labeled with a fluorescent substance
  • the 3' end of the nucleic acid B1 can be labeled with a substance that quenches the fluorescent substance.
  • the nucleic acid A1 forms the nucleic acid double strand A
  • it fluoresces, but when the nucleic acid A1 hybridizes with the nucleic acid B1 and forms a new nucleic acid double strand C, it is quenched by the label of the nucleic acid B1. Therefore, the amount of nucleic acid duplex A can be easily measured by measuring the fluorescence value.
  • the 5 'end of the nucleic acid A1 can be labeled with a fluorescent substance
  • the 3' end of the nucleic acid A2 can be labeled with a substance that can quench the fluorescent substance.
  • the nucleic acid A1 is quenched when it forms the nucleic acid duplex A, but when the nucleic acid A1 hybridizes with the nucleic acid B1 and forms a new nucleic acid duplex C, it can emit fluorescence. From this, the amount of nucleic acid duplex C can be measured by measuring the fluorescence value.
  • nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 may be labeled, and the position of the label may be inside or at the end of the nucleic acid, but is preferably at the end. .
  • the 3 ′ end of the fifth nucleotide sequence is labeled with a fluorescent substance
  • the 5 ′ end of the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence is The fluorescent substance can be labeled with a quenching substance.
  • the nucleic acid G1 forms the nucleic acid complex G
  • it is quenched, but when the nucleic acid G1 forms the nucleic acid complex I, fluorescence is emitted by the label of the nucleic acid G1, and thus the fluorescence value is measured.
  • the amount of the single-stranded nucleic acid complex E or the single-stranded nucleic acid complex F can be easily measured.
  • the quencher and fluorescent material can be interchanged.
  • the 3 ′ end of the fifth nucleotide sequence is labeled with a fluorescent substance
  • the 3 ′ end of the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is a substance capable of quenching the fluorescent substance. Can be labeled.
  • the nucleic acid G1 forms the nucleic acid complex G
  • it is quenched, but when the nucleic acid G1 forms the nucleic acid complex I, fluorescence can be emitted.
  • the amount of the single-stranded nucleic acid complex E or the single-stranded nucleic acid complex F can be measured.
  • the quencher and fluorescent material can be interchanged.
  • the 5 ′ end of the fifth nucleotide sequence is labeled with a fluorescent substance
  • the 5 ′ end of the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is a substance capable of quenching the fluorescent substance. Can be labeled.
  • fluorescence can be emitted when the nucleic acid G1 forms the nucleic acid complex G.
  • the nucleic acid G1 forms the nucleic acid complex I, it is quenched, and thus it is easy to measure the fluorescence value.
  • the amount of the single-stranded nucleic acid complex E or the single-stranded nucleic acid complex F can be measured.
  • the quencher and fluorescent material can be interchanged.
  • Nucleic acid G1 (preferably a fifth nucleotide sequence), nucleic acid G2 (preferably a sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence), nucleic acid H1 (preferably a sixth nucleotide sequence), nucleic acid H2 (preferably a first nucleotide sequence) 6), any nucleic acid may be labeled, and the position of the label may be inside or at the end of the nucleic acid, but the distance of the label before and after the structural change It is preferable that the position be such that the difference between
  • fluorescent label examples include fluorescein, TAMRA, HEX, TET, JOE, Cy5, Cy3, Alexa series (Molecular Probes), fluorescent green protein (GFP), etc., preferably fluorescein, TAMRA, HEX, TET, JOE, Cy5, Cy3, Alexa series.
  • quenching substance examples include DABCYL, TAMRA, and BHQ (Molecular Probes), and can be appropriately selected depending on the fluorescent substance used.
  • Fluorescence resonance energy transfer is not quenching but can also be used as a shift in fluorescence wavelength.
  • This fluorescence energy transfer can be measured by a widely used apparatus such as a fluorescence spectrophotometer, a real-time PCR apparatus, or a fluorescence plate reader.
  • the effect of suppressing the strand exchange reaction by the introduction of mismatch and the improvement of the S / N ratio can reduce the cost because the detection method and the screening method according to the present invention enable an assay with a small amount of protein. This is advantageous. Particularly, in the detection of proteins in a living body, it is advantageous in that a valuable sample can be saved and a detailed analysis can be performed by expanding a measurement range.
  • the mismatch is introduced so that there is a mismatch between the nucleic acid strands that become complementary strands after exchange in the strand exchange reaction.
  • one or more mismatch bases in the nucleotide sequence of nucleic acid A1 with respect to the nucleotide sequence of nucleic acid B1;
  • the position at which the mismatch is introduced is not particularly limited as long as it is a sequence in which strand exchange is performed, but is preferably a sequence other than the nucleic acid protein binding sequence, as long as the strand exchange efficiency is not significantly impaired.
  • the number of mismatches is not particularly limited as long as it does not significantly impair strand exchange efficiency.
  • the first nucleotide sequence is the fourth nucleotide sequence
  • the fourth nucleotide sequence is the first nucleotide sequence
  • the sequence corresponding to one nucleotide sequence is a sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence
  • the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence is 90% or more, preferably 92%, respectively. %, More preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • a base that forms a mismatch can be introduced alone or in combination into any of the nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 in the nucleic acid double-stranded complex.
  • a base that forms a mismatch can be introduced alone or in combination into any of the nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 in the nucleic acid double-stranded complex.
  • the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence and / or between the sequence corresponding to the first nucleotide sequence and the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence more preferably the first nucleotide sequence.
  • a fourth nucleotide sequence and between the sequence corresponding to the first nucleotide sequence and the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence are introduced so that mismatches are formed.
  • the bases forming the mismatch can be introduced in a shifted manner between the complementary strands before strand exchange or can be introduced at the same location, but preferably, at the same location in the complementary strand before strand exchange. To be introduced.
  • preferred embodiments include a sequence between the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence, and a sequence corresponding to the first nucleotide sequence and a sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. 90% or more of the complementarity between the first nucleotide sequence and the fourth nucleotide sequence and the complementarity between the sequence corresponding to the first nucleotide sequence and the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. , Preferably 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more mismatches are introduced.
  • one or more mismatch bases in the nucleotide sequence of nucleic acid G1 with respect to the nucleotide sequence of nucleic acid H1 or the nucleotide sequence of nucleic acid G2;
  • the nucleic acid G1 in the nucleotide sequence of nucleic acid H1 preferably the sixth nucleotide sequence
  • the nucleotide sequence of nucleic acid G2 in the nucleotide sequence of nucleic acid H2 preferably the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence
  • it can be introduced in combination with mismatched base selected from one or more mismatched bases with respect to the first nucleotide
  • the position at which the mismatch is introduced is not particularly limited as long as it is a sequence in which strand exchange is performed, but is preferably a sequence other than the nucleic acid protein binding sequence, as long as the strand exchange efficiency is not significantly impaired.
  • the number of mismatches is not particularly limited as long as it does not significantly impair strand exchange efficiency.
  • the fifth nucleotide sequence is the sixth nucleotide sequence
  • the sixth nucleotide sequence is the fifth nucleotide sequence
  • the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence is the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence
  • the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence
  • the fifth nucleotide sequence is the fifth nucleotide sequence.
  • sequence corresponding to the nucleotide sequence corresponds to the fifth nucleotide sequence
  • the sixth nucleotide sequence corresponds to the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence
  • the sixth nucleotide sequence The sequence is 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 95%, respectively, with the sixth nucleotide sequence. Or more, even more preferably, 98% or more, and particularly preferably, may be introduced a number such that 99% or more complementarity.
  • the base that forms a mismatch can be introduced into any of the nucleic acids G1, N2, G1, and H2 alone or in combination in the nucleic acid complex.
  • the nucleotide sequence and the sixth nucleotide sequence, and / or between the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence, or between the fifth nucleotide sequence and the fifth nucleotide Between the sequence corresponding to the sequence and / or between the sixth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence, more preferably between the fifth nucleotide sequence and the sixth nucleotide sequence, And between the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence, or the fifth nucleotide sequence.
  • the base forming the mismatch is introduced so that the reversible structural change is close to the integrated nucleic acid complex having no protein binding sequence in the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F. It is preferred that Therefore, when the integrated nucleic acid complex E is designed to have a protein binding sequence, between the fifth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence, and / or the sixth nucleotide sequence. And a sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence is preferably introduced so that a mismatch is formed.
  • the complementarity between the fifth nucleotide sequence and the sixth nucleotide sequence and the complementarity between the sequence corresponding to the fifth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence are each 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more mismatches, and the fifth nucleotide sequence and the fifth Between the sequence corresponding to the nucleotide sequence and between the sixth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence.
  • the complementarity between the leotide sequence and the fifth nucleotide sequence and the complementarity between the sixth nucleotide sequence and the sequence corresponding to the sixth nucleotide sequence are each 90% or more, preferably 92% or more, more preferably A number of mismatches are introduced that have a complementarity of 95% or more, even more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • a plurality of nucleic acid complexes can be detected simultaneously using a plurality of nucleic acid complexes (multiplex detection).
  • Multiplex detection can increase the efficiency in screening for inhibitors of nucleic acid binding proteins. Since the influence on proteins other than the target causes side effects, it is necessary to confirm that the influence is small as early as possible. Multiplex detection makes it possible to examine the effect of a drug on a target protein, and at the same time, investigate the influence on other proteins.
  • multiplex detection can also measure the binding activity to a plurality of proteins present in the cell, it is possible to grasp in detail the life phenomenon occurring in the cell. According to multiplex detection, it is possible to obtain more detailed knowledge about nucleic acid binding proteins whose nucleic acid binding activity is known to change due to post-translational modifications and interactions with other proteins.
  • the nucleic acid sequence used in the multiplex detection method is not particularly limited as long as a plurality of nucleic acid complexes independently undergo structural changes, and the sequence of each nucleic acid in a reaction system related to one nucleic acid complex is as follows: It can be designed so as not to affect the binding between nucleic acids of other reaction systems or the structural change of the nucleic acid complex.
  • the first to fourth nucleotide sequences in each reaction system and their corresponding sequences, and the nucleotide sequences of nucleic acids in other reaction systems are as follows: Can be designed to
  • the first nucleotide sequence in each reaction system is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably the sequence corresponding to the first nucleotide sequence. Can be selected to have 98% or more complementarity.
  • the fourth nucleotide sequence in each reaction system is 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence.
  • it can be selected to have a complementarity of 98% or more.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence.
  • the first nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably, a sequence complementary to the sequence corresponding to the first nucleotide sequence. It can be selected to comprise at least 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides. Further, the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably a sequence complementary to the first nucleotide sequence. Can be selected to comprise at least 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides.
  • the fourth nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably, a sequence complementary to the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence. It can be selected to comprise at least 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably a sequence complementary to the fourth nucleotide sequence.
  • the Tm value between the first nucleotide sequence in each reaction system and the sequence corresponding to the first nucleotide sequence is 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably 15 ° C. or more from the reaction temperature. More preferably, it can be selected to be 20 ° C. or higher, particularly preferably 25 ° C. or higher.
  • the fourth nucleotide sequence in each reaction system has a Tm value with the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence of 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more than the reaction temperature. Preferably, it can be selected to be 20 ° C. or higher, particularly preferably 25 ° C. or higher.
  • the second nucleotide sequence in each reaction system is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably a sequence corresponding to the second nucleotide sequence. Can be selected to have 98% or more complementarity.
  • the second nucleotide sequence in each reaction system is complementary to the third nucleotide sequence in the same reaction system, the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, and the complement to the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the properties can be selected such that each is less than 50%, more preferably less than 30%, particularly preferably less than 20%.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in each reaction system is complementary to the third nucleotide sequence, the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, or the complement to the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the properties can be selected such that each is less than 50%, more preferably less than 30%, particularly preferably less than 20%.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably the sequence corresponding to the third nucleotide sequence. Can be selected to have 98% or more complementarity.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system is complementary to the second nucleotide sequence in the same reaction system, the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, and the complement to the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the properties can be selected such that each is less than 50%, more preferably less than 30%, particularly preferably less than 20%.
  • sequence corresponding to the third nucleotide sequence in each reaction system is the second nucleotide sequence in the same reaction system, the complementarity with the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, the nucleotide of the nucleic acid in the other reaction system
  • the complementarity with the sequence can be selected to be less than 50%, more preferably less than 30%, particularly preferably less than 20%.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence.
  • the second nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably, a sequence complementary to the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. It can be selected to comprise at least 20 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably a sequence complementary to the second nucleotide sequence. Can be selected to comprise at least 20 nucleotides.
  • the second nucleotide sequence in each reaction system is a sequence complementary to any of the third nucleotide sequence and the third nucleotide sequence in the same reaction system, and the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system. Although it may contain consecutive nucleotides, the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in each reaction system is any of the third nucleotide sequence in the same reaction system, the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, and the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the number of nucleotides may be 4 at the maximum, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system may include consecutive nucleotides of a second nucleotide sequence in the same reaction system or a complementary sequence of a sequence corresponding to the second nucleotide sequence.
  • the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence in each reaction system may include consecutive nucleotides of the second nucleotide sequence in the same reaction system or a complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence.
  • the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system may include a continuous nucleotide of the second nucleotide sequence in each reaction system or a complementary sequence of the sequence corresponding to the second nucleotide sequence. Is a maximum of 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably, a sequence complementary to the sequence corresponding to the third nucleotide sequence. It can be selected to comprise at least 20 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably a sequence complementary to the third nucleotide sequence. Can be selected to comprise at least 20 nucleotides.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system is a sequence complementary to any of the second nucleotide sequence and the second nucleotide sequence in the same reaction system, and the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system. Although it may contain consecutive nucleotides, the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence in each reaction system is any of the second nucleotide sequence in the same reaction system, the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, and the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the number of nucleotides may be 4 at the maximum, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the second nucleotide sequence in each reaction system may include consecutive nucleotides of a third nucleotide sequence in each reaction system or a complementary sequence of a sequence corresponding to the third nucleotide sequence.
  • the number of nucleotides is at most 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in each reaction system may include consecutive nucleotides of the third nucleotide sequence in each reaction system and the complementary sequence of the sequence corresponding to the third nucleotide sequence.
  • the maximum number of nucleotides is 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • nucleotide sequence of the nucleic acid in another reaction system may include consecutive nucleotides of a third nucleotide sequence in each reaction system or a complementary sequence of a sequence corresponding to the third nucleotide sequence. Is a maximum of 4, preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the Tm value between the second nucleotide sequence in each reaction system and the sequence corresponding to the second nucleotide sequence is 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably 15 ° C. or more from the reaction temperature. More preferably, it can be selected to be 20 ° C. or higher, particularly preferably 25 ° C. or higher.
  • the second nucleotide sequence in each reaction system includes the third nucleotide sequence in the same reaction system, the Tm value of the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, and the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system. Each Tm value is selected to be 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C.
  • the sequence corresponding to the second nucleotide sequence in each reaction system is the third nucleotide sequence in the same reaction system, the Tm value of the sequence corresponding to the third nucleotide sequence, or the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the Tm value between the reaction temperature and the reaction temperature is 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably 15 ° C. or more, further preferably 20 ° C. or more, and particularly preferably 25 ° C. or more.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system has a Tm value with the sequence corresponding to the third nucleotide sequence of 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably 15 ° C. or more from the reaction temperature. Preferably, it can be selected to be 20 ° C. or higher, particularly preferably 25 ° C. or higher.
  • the third nucleotide sequence in each reaction system is the Tm value of the second nucleotide sequence in the same reaction system, the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, or the Tm value of the nucleotide sequence of the nucleic acid in the other reaction system. Each value is selected to be 5 ° C. or more, preferably 10 ° C.
  • the sequence corresponding to the third nucleotide sequence in each reaction system is the second nucleotide sequence in the same reaction system, the Tm value with the sequence corresponding to the second nucleotide sequence, or the nucleotide of the nucleic acid in the other reaction system.
  • the Tm value with the sequence is 5 ° C. or higher, preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher, particularly preferably 25 ° C. or higher, than the reaction temperature. You can choose.
  • the first nucleotide sequence in each reaction system is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably the fourth nucleotide sequence in the same reaction system. , 98% or more can be selected.
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in each reaction system is 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, and further preferably, the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in the same reaction system. Can be selected to have a complementarity of 95% or more, particularly preferably 98% or more.
  • sequence having 70% or more complementarity with each nucleotide sequence in each reaction system is preferably a complementary sequence of each nucleotide sequence.
  • the first nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, more preferably at least 15 contiguous sequences of the fourth nucleotide sequence in the same reaction system. It can be selected to comprise 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides.
  • the fourth nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15, and more preferably, a sequence complementary to the first nucleotide sequence in the same reaction system. At least 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides.
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, and more preferably at least 10 consecutive sequences complementary to the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in the same reaction system. It can be selected to comprise 15, more preferably at least 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides. Further, the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in each reaction system is at least 5, preferably at least 10, and more preferably a sequence complementary to the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in the same reaction system. , At least 15, more preferably at least 20, particularly preferably at least 25, most preferably at least 30 nucleotides.
  • the Tm value between the first nucleotide sequence in each reaction system and the fourth nucleotide sequence in the same reaction system is 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably 15 ° C. or more from the reaction temperature, More preferably, it can be selected to be 20 ° C. or higher, particularly preferably 25 ° C. or higher.
  • the sequence corresponding to the first nucleotide sequence in each reaction system has a Tm value of 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably from the reaction temperature, with the sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence in the same reaction system.
  • nucleotide sequence used for example, the fifth nucleotide sequence, the sixth nucleotide sequence, The nucleotide sequences of the terminal portions 1 to 4 and the sequences corresponding thereto can be selected as appropriate.
  • the label used in the multiplex detection method is not particularly limited as long as it can be sufficiently distinguished from the structural change of other nucleic acid double-stranded complexes and can obtain sufficient fluorescence resonance energy transfer, but preferably fluorescein ( A combination of a fluorescent substance) and DABCYL (quenching substance), and a combination of Cy3 (fluorescent substance) and BHQ1 (quenching substance).
  • fluorescein A combination of a fluorescent substance
  • DABCYL quenching substance
  • Cy3 fluorescent substance
  • BHQ1 quenching substance
  • the binding sites of nucleic acid binding proteins used in a plurality of reactions may be binding sites of different proteins or different binding sites of the same protein.
  • nucleic acid binding protein binds to nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B
  • formation of a nucleic acid duplex complex and subsequent new nucleic acid duplex C and / or nucleic acid duplex D formation is inhibited. Therefore, whether or not the test substance inhibited the binding of the nucleic acid binding protein to the nucleic acid by carrying out the detection method of the present invention in the presence and absence of the test substance and comparing the degree of structural change, Alternatively, it can be determined whether or not it has been promoted.
  • the test substance When the amount of nucleic acid duplex C and / or nucleic acid duplex D formed in the presence of the test substance exceeds the amount formed in the absence of the test substance, the test substance is bound to the nucleic acid binding protein. It can be determined as an inhibitor. In addition, when the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B in the presence of the test substance is less than the amount in the absence of the test substance, the test substance is bound to the nucleic acid binding protein. It can be determined as an inhibitor.
  • the test substance when the amount of nucleic acid double strand C and / or nucleic acid double strand D formed in the presence of the test substance is less than the amount formed in the absence of the test substance, the test substance is added to the nucleic acid binding protein. It can be determined as a binding accelerator. In addition, when the amount of nucleic acid duplex A and / or nucleic acid duplex B in the presence of the test substance exceeds the amount in the absence of the test substance, the test substance is bound to the nucleic acid binding protein. It can be determined as an accelerator.
  • the nucleic acid binding protein binds to either the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F
  • the structural change between the integrated nucleic acid complex E and the integrated nucleic acid complex F is inhibited.
  • the nucleic acid-binding protein is stabilized in a state of being bound to any one of the integrated nucleic acid complexes. Therefore, by carrying out the detection method of the present invention in the presence and absence of the test substance and comparing the amount of the integrated nucleic acid complex designed to bind the nucleic acid binding protein, It can be determined whether the binding of the nucleic acid binding protein to the nucleic acid is inhibited or promoted.
  • the test substance When the amount of the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F in the presence of the test substance is less than the amount in the absence of the test substance, the test substance is treated as a nucleic acid binding protein binding inhibitor. Can be determined. In addition, when the amount of the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F in the presence of the test substance exceeds the amount in the absence of the test substance, the test substance is bound to the nucleic acid binding protein. It can be determined as an accelerator.
  • test substance means any candidate substance as an inhibitor or a promoter, and is preferably a low molecular compound.
  • the screening method according to the present invention is to confirm that the test substance acts on the binding of the target nucleic acid binding protein, and does not affect the strand exchange by a non-specific action on the nucleic acid. It was confirmed that a nucleic acid set that does not bind to the target nucleic acid binding protein can be used as a negative control (Example 5).
  • the screening method according to the present invention may further comprise measuring the degree of structural change of a nucleic acid complex composed of a nucleic acid that does not bind to a nucleic acid binding protein that is a target of a test substance.
  • the detection method of the negative control may be the detection method of the first aspect or the detection method of the second aspect.
  • the detection method of the first aspect the detection method of the second aspect, or when the target screening uses the detection method of the second aspect
  • the detection method of the first aspect it is preferable to use the same detection method as that for the intended screening.
  • the screening method according to the present invention is advantageous in that the inhibitory effect of a test substance can be measured easily and quickly without using a gel shift assay method or the like.
  • Kit According to the present invention, a detection kit for carrying out the detection method according to the present invention or the screening method according to the present invention is provided.
  • the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the detection method according to the present invention, specifically, a kit for detecting the binding between a nucleic acid and a nucleic acid binding protein. And a kit comprising at least a nucleic acid double strand A and a nucleic acid double strand B that can bind at a terminal sequence.
  • the nucleic acid duplex may be labeled.
  • This detection kit may further contain the target nucleic acid binding protein.
  • this detection kit detects the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding protein by measuring the degree of inhibition of the structural change of the nucleic acid double-stranded complex. Accordingly, if desired, it may further comprise various reagents for measuring the degree of inhibition of the structural change of the nucleic acid double-stranded complex, such as reaction buffers, positive standards, instructions, and / or instruments. Can do.
  • the detection kit according to the present invention also includes a detection kit for carrying out the screening method according to the present invention, specifically, a kit for screening an inhibitor or promoter of a nucleic acid binding protein, A kit comprising at least a nucleic acid double strand A and a nucleic acid double strand B that can be bound in a terminal sequence can be mentioned.
  • the nucleic acid duplex may be labeled.
  • This detection kit may further contain the target nucleic acid binding protein.
  • this detection kit screens for inhibitors or promoters of nucleic acid binding proteins by measuring the degree of inhibition of the structural change of the nucleic acid double-stranded complex.
  • it may further comprise various reagents for measuring the degree of inhibition of the structural change of the nucleic acid double-stranded complex, such as reaction buffers, positive standards, instructions, and / or instruments. Can do. Further, it can further contain a nucleic acid duplex or an integrated nucleic acid complex for use as a negative control.
  • the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the detection method according to the present invention, specifically, a kit for detecting the binding between a nucleic acid and a nucleic acid binding protein. And a kit comprising at least the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F. This integrated nucleic acid complex may be labeled.
  • This detection kit may further contain the target nucleic acid binding protein.
  • this detection kit detects the binding between the nucleic acid and the nucleic acid binding protein by measuring the degree of inhibition of the structural change of the integrated nucleic acid complex. Accordingly, if desired, it may further include various reagents for measuring the degree of inhibition of the structural change of the integrated nucleic acid complex, such as reaction buffers, positive standards, instructions, and / or instruments. it can.
  • the detection kit according to the present invention also includes a detection kit for carrying out the screening method according to the present invention, specifically, a kit for screening an inhibitor or promoter of a nucleic acid binding protein, Examples of the kit include at least the integrated nucleic acid complex E or the integrated nucleic acid complex F. This integrated nucleic acid complex may be labeled. This detection kit may further contain the target nucleic acid binding protein.
  • the detection kit also screens for inhibitors or promoters of nucleic acid binding proteins by measuring the degree of inhibition of structural changes in the integrated nucleic acid complex. Accordingly, if desired, it may further include various reagents for measuring the degree of inhibition of the structural change of the integrated nucleic acid complex, such as reaction buffers, positive standards, instructions, and / or instruments. it can. Further, it can further contain a nucleic acid duplex or an integrated nucleic acid complex for use as a negative control.
  • the kit of the second aspect is advantageous in that it can be expected to reduce costs by reducing reagent components in addition to improving operability.
  • NF ⁇ B p50 is a transcription factor having a DNA binding sequence belonging to the loop type (Rel family), and binds to an NF ⁇ B binding sequence (for example, 5′-GGGAACTTTCC-3 ′). It is known to do.
  • Heat denaturation and annealing were performed under the following temperature conditions. 95 °C 120 seconds-90 °C 30 seconds-85 °C 90 seconds-80 °C 90 seconds-77 °C 90 seconds-75 °C 90 seconds-72 °C 90 seconds-70 °C 90 seconds-67 °C 90 seconds-65 °C 90 seconds- 62 °C 90 seconds-60 °C 90 seconds-57 °C 90 seconds-55 °C 90 seconds-52 °C 90 seconds-50 °C 90 seconds-47 °C 90 seconds-45 °C 90 seconds-42 °C 90 seconds-40 °C 90 seconds- 37 °C 90 seconds-35 °C 90 seconds-32 °C 90 seconds-30 °C 90 seconds
  • the underlined part is an NF ⁇ B binding sequence, and the italicized one is a sequence that becomes a single strand in a double strand.
  • the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes and diluted with an NF ⁇ B binding solution (10 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 25 mM DTT, 10% glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630). After adding 8 ⁇ L (0.28 pmol) of double-stranded 02D / 13, the mixture was reacted at 30 ° C. for 11 minutes. The fluorescence value was measured using a real-time PCR apparatus, Rotor Gene 2000 (Corvette Life Sciences).
  • 01F / 14 emits fluorescence by 6-FAM introduced into NFkB-01-5F.
  • 01F / 14 was mixed with 02D / 13, resulting in a structural change, and newly completed double-stranded 01F / 02D (NFkB-01-5F and NFkB-02-3D) and 13/14 (NFkB-13 and When NFkB-14) is formed, 6-FAM is quenched by DABCYL of NFkB-02-3D.
  • NF ⁇ B p50 when NF ⁇ B p50 is bound, the above structural change is inhibited. Therefore, it is considered that the fluorescence value increases depending on the NF ⁇ B p50 concentration.
  • Example 2 Effect of decoy oligo on NF ⁇ B p50 binding amount (1) Preparation of double strand Synthetic oligonucleotide NFkB-01-5F labeled with 6-FAM at the 5 ′ end, synthetic oligonucleotide NFkB-14-03D labeled with DABCYL at the 3 ′ end, synthetic oligonucleotide NFkB-02 And synthetic oligonucleotide NFkB-13 were mixed, and double strands 01F / 14D and 02/13 having a single strand at the terminal were prepared under the same conditions as in Example 1.
  • NFcpt01 and NFcpt02 having an NF ⁇ B binding sequence were mixed to prepare decoy oligo double-stranded NFcpt and APcpt under the same conditions as in Example 1. . Since NFcpt contains NF ⁇ B binding sequences, it inhibits binding of NF ⁇ B protein to DNA containing other NF ⁇ B binding sequences, whereas APcpt does not contain NF ⁇ B binding sequences, so NF ⁇ B protein's binding to other NF ⁇ B binding sequences. Does not inhibit binding.
  • the underlined portion is the NF ⁇ B binding sequence, and the italicized sequence is a single strand in the double strands 01F / 14D and 02/13.
  • NFcpt decoy oligo duplex
  • APcpt decoy oligo duplex
  • 6-FAM introduced into NFkB-01-5F is quenched by DABCYL introduced into NFkB-14-3D.
  • DABCYL introduced into NFkB-14-3D.
  • structural changes occur when 01F / 14D is mixed with 02/13, and new double-stranded 01F / 02 (NFkB-01-5F and NFkB-02) and 13 / 14D (NFkB-13 and NFkB-
  • 6-FAM fluoresces because it is sufficiently away from DABCYL (FIG. 3: NF ⁇ B without p50).
  • NF ⁇ B p50 is added, the above structural change is inhibited, so the fluorescence value decreases (FIG. 3: NF ⁇ B p50 added).
  • Example 3-1 Human AP1 Protein Binding Test AP1 (c-jun) is a transcription factor having a leucine zipper-type DNA binding motif and binds to an AP1 binding sequence (eg, 5′-TGAGTCA-3 ′). It is known.
  • AP01C / 04B and AP02 / 03 have an AP1 binding sequence, while SP01A / 04B and SP02 / 03 do not have an AP1 binding sequence.
  • the AP1 binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • the sequence that becomes a single strand in the double strand is shown in italics. Underlined is the SP1 binding sequence.
  • Example 3 as in Example 2, the effect of inhibiting the structural change due to protein binding is detected by a decrease in fluorescence value.
  • Cy5 or Alexa647 was used instead of 6-FAM of Example 2 as the fluorescent material
  • BHQ3 was used instead of DABCYL as the quencher.
  • Example 3-2 Human SP1 Protein Binding Detection Test
  • SP1 is a transcription factor having a Zn finger type DNA binding motif and is known to bind to an SP1 binding sequence (eg, 5′-GGGGCGGGGC-3 ′). ing.
  • Double strands were prepared in the same manner as in Example 3.
  • TRF2 is a telomeric DNA binding protein having a DNA binding domain consisting of a Myb-type helix-turn-helix motif on the C-terminal side, and is a telomeric DNA (5'-TTAGGG-3). It is known as a protein that binds to (repeat) and forms a telomeric structure.
  • TRF2 ⁇ B is a recombinant human TRF2 protein (N-terminal deletion) in which the basic domain at the N-terminus of TRF2 is deleted.
  • a cDNA containing the full length of TRF2 was obtained from cDNA prepared based on mRNA extracted from a human cell line (IHW09084 (obtained from International HLA Worksshop)). Using this cDNA as a template, a DNA region corresponding to the 45th to 500th amino acid sequence was amplified by PCR. A histag sequence was added to the obtained DNA fragment and introduced into pFastBac1 (Invitrogen) to obtain Bacmid. Bacmid was transfected into insect cells (Sf9 (obtained from Invitrogen)) to produce a virus. The resulting virus was infected with Sf9 to express recombinant human TRF2 ⁇ B. TRF2 ⁇ B was purified by a Ni-NTA spin column (Qiagen). The protein concentration was calculated based on bovine serum albumin using a protein assay kit (Bio-Rad).
  • TLM-06 and synthetic oligonucleotide TLM-01-5C3 labeled with Cy3 at the 5 ′ end were mixed to obtain double strand T01C / 06 having a single strand at the end. It was prepared under the same conditions as in Example 1. T01C / 06 has a TRF2 binding sequence.
  • TLM-16 and a synthetic oligonucleotide TLM-13-5C3 labeled with Cy3 at the 5 ′ end were mixed, and double-stranded T13C / 16 having a single strand at the end was prepared under the same conditions as in Example 1.
  • T13C / 16 does not have a TRF2 binding sequence.
  • a synthetic oligonucleotide TLM-05 and a synthetic oligonucleotide TLM-02-3B1 labeled with BHQ1 at the 3 ′ end were mixed, and double-stranded T02B / 05 having a single strand at the end was prepared under the same conditions as in Example 1.
  • Prepared. T02B / 05 has a TRF2 binding sequence.
  • Synthetic oligonucleotide TLM-15 and synthetic oligonucleotide TLM-14-3B1 labeled with BHQ1 at the 3 ′ end were mixed, and double-stranded T14B / 15 having a single strand at the end was prepared under the same conditions as in Example 1. Prepared. T14B / 15 does not have a TRF2 binding sequence.
  • TRF2 binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • the underlined portion indicates the TRF2 binding sequence, but TRF2 cannot bind due to the mutation in the shaded portion. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • TRF2 binding Reaction solution (10 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 150 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 0.05 ) with 100 fmol of T01C / 06 or T13C / 16 and 1 ⁇ g of TRF2 ⁇ B % IGEPAL CA-630, 20 ⁇ L) and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 100 fmol of T02B / 05 and T14B / 15 were added to T01C / 06 and T13C / 16, respectively, to 50 ⁇ L, and then reacted at 25 ° C. for 60 minutes. The fluorescence value of Cy3 was measured using a fluorescence plate reader Ultra (Tecan).
  • the method of the present invention was able to detect binding inhibition of DNA binding proteins having loops, leucine zippers and Zn fingers, which are typical DNA binding motifs.
  • binding inhibition of telomeric DNA binding protein could be detected. Therefore, it has been shown that the present invention can be widely used in general for nucleic acid binding proteins.
  • the method according to the present invention has no limitation on the fluorescent substance used. According to the present invention, since various types of fluorescent substances can be used, for example, when a compound serving as a drug emits fluorescence, a fluorescent label that does not hinder the fluorescence of the compound is selected. It is possible.
  • Example 4 Confirmation test of detection sensitivity by mismatch introduction 4-1. Test using SP1 (1) Preparation of double strand Synthetic oligonucleotide SP1-05-5C3 labeled with Cy3 at the 5 ′ end and synthetic oligonucleotide SP1-08-3B1 labeled with BHQ1 at the 3 ′ end were mixed, Double-stranded SP05C / 08B having a chain was prepared under the same conditions as in Example 1. Further, the synthetic oligonucleotides SP1-06 and SP1-07, SP1-21 and SP1-22, SP1-23 and SP1-24 were mixed, respectively, and double-stranded SP06 / 07, SP22 / having a single strand at the terminal were mixed. 21 and SP24 / 23 were prepared under the same conditions as in Example 1. These double strands have the binding sequence of SP1.
  • SP1 binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics. Shading indicates the bases that are mismatched to SP1-08-3B1 for SP1-21 and SP1-23, and the bases that are mismatched to SP1-05-5C3 for SP1-22 and SP1-24, respectively. Indicated.
  • SP05C / 08B and SP1-07 form a trimer, undergoing complete chain exchange through branch transfer, and dimer 08B / 07 and monomer SP1-05-5C3 are formed.
  • the increase in fluorescence value due to was suppressed by the addition of SP1 (FIG. 7).
  • Similar results were obtained when SP1-21 and SP1-23 were used instead of SP1-07 (FIG. 7).
  • mismatch introduction enhances the strand exchange suppression effect by addition of SP1 protein and increases the ratio of fluorescence value when protein is not added to when protein is added.
  • Test example for NF- ⁇ B (1) Preparation of double strand Synthetic oligonucleotide NFkB-01-5F labeled with fluorescein at the 5 ′ end and synthetic oligonucleotide NFkB-14-3D labeled with DABCYL at the 3 ′ end were mixed, and one strand was added at the end. Double-stranded NF01F / 14D having a chain was prepared under the same conditions as in Example 1.
  • NFkB-02 and NFkB-13, NFkB-21 and NFkB-26, NFkB-49 and NFkB-50 were mixed, respectively, and double-stranded NF02 / 13, NF26 / 21 and NF50 / 49 were prepared under the same conditions as in Example 1. These duplexes have a binding sequence of NF- ⁇ B.
  • NF- ⁇ B binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics. Shading indicates that NFkB-21 and NFkB-49 are mismatched with NFkB-14-3D, and NFkB-26 and NFkB-50 are mismatched with NFkB-01-5F. Indicated.
  • NF01F / 14D and NF02 / 13 form a tetramer, undergoes complete chain exchange via branch migration, and the increase in fluorescence value due to conversion to NF01F / 02 is caused by the addition of p50. It was suppressed (FIG. 8). Similar results were obtained when NF26 / 21 and NF50 / 49 were used instead of NF02 / 13 (FIG. 8).
  • the fluorescence value due to the addition of the NF- ⁇ B (p50) protein was about 30% lower in the fluorescence value in the combination with NF02 / 13 in which there was no mismatch with NF01F / 14D.
  • the fluorescence value decreased by 50% or more (FIG. 8).
  • mismatch introduction enhances the NF- ⁇ B (p50) protein strand exchange inhibitory action and increases the ratio of the fluorescence value when no protein is added to when the protein is added.
  • Example 5 Examination of screening system using negative control When screening for an inhibitor of a nucleic acid binding protein, etc., the test substance acts on the binding of the target nucleic acid binding protein and is not specific to the nucleic acid. It is necessary to make sure that the chain exchange is not affected by the dynamic action. Therefore, a screening system using a nucleic acid set to which the target nucleic acid binding protein does not bind as a negative control was examined.
  • Aurothioglucose (Yanget et al. FEBSletters 1995-361-89-96), which is known to inhibit NF- ⁇ B, was used as a test substance.
  • NF- ⁇ B binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • SP1 binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • the final volume of the reaction solution (10 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630) is 50 ⁇ L.
  • the fluorescence values of fluorescein and Cy3 were measured using a fluorescence plate reader Ultra (Tecan). Fluorescein was excited at 485 nm and fluorescence at 535 nm was measured. Cy3 was excited at 535 nm and measured at 595 nm.
  • the relative fluorescence value of the NF- ⁇ B oligo decreased depending on the concentration of aurothioglucose that inhibits NF- ⁇ B.
  • the addition of aurothioglucose hardly affected the relative fluorescence value of the SP1 oligo (FIG. 9). From this, it was confirmed that aurothioglucose has an action of inhibiting the binding of NF- ⁇ B (p50) to a nucleic acid and at the same time, does not affect the strand exchange itself.
  • the inhibitory effect of a test substance can be measured easily and quickly without using a gel shift assay method or the like.
  • Example 6 Examination of binding amount using NF- ⁇ B p50 (Integrated nucleic acid complex) (1) Preparation of tetramer Synthetic oligonucleotides N-Cd-U2m4 (C4) and N-Bc-L2m5 (B5), and synthetic oligonucleotide N-Ab labeled with fluorescein at the 30th base thymine from the 5 'end -Synthetic tetramer Af / B5 / C4 / Dd by mixing U2-30F (Af) and thymine at the 20th base from the 5 'end with synthetic oligonucleotide N-Da-L2-20D (Dd) labeled with Dabcyl was prepared.
  • NF- ⁇ B p50 Integrated nucleic acid complex
  • N-Ab-U2-30F and N-Da-L2-20D were mixed to form a dimer Af / Da, which was used as a quenching reference product.
  • the test was performed under the same conditions as in Example 1 except that four types of DNA were mixed at the same time.
  • NFcpt01 and NFcpt02, NFcpt03 and NFcpt04 were mixed, and double-stranded NF01 / 02 and NF03 / 04 having a single strand at the terminal were prepared under the same conditions as in Example 1.
  • NF01 / 02 has an NF- ⁇ B binding sequence
  • NF03 / 04 has a mutation introduced into the NF- ⁇ B binding sequence.
  • the part for chain exchange is underlined.
  • the NF- ⁇ B binding sequence is shaded.
  • the sequence-specific binding of the nucleic acid binding protein can be detected by measuring the fluorescence value.
  • Example 7 Examination of multiplex detection system
  • NF- ⁇ B (p50) and SP1 were simultaneously detected, and an NF- ⁇ B (p50) inhibitor (decoy oligo) The specific inhibitory effect by was detected.
  • NFcpt01 and NFcpt02 were mixed, and double-stranded NF01 / 02 having a single strand at the terminal was prepared under the same conditions as in Example 1.
  • NF01 / 02 has an NF- ⁇ B binding sequence.
  • Synthetic oligonucleotides SPcpt01 and SPcpt02 were mixed, and double-stranded SP01 / 02 having a single strand at the terminal was prepared under the same conditions as in Example 1.
  • SP01 / 02 has an SP1 binding sequence.
  • NF- ⁇ B binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • SP1 binding sequence is underlined. Sequences that are single-stranded in double strands are shown in italics.
  • the NF- ⁇ B binding sequence is underlined.
  • 31F / 42 and 32D / 41 form a tetramer, undergoes complete chain exchange via branching migration, and is converted to 31F / 32D, resulting in a decrease in fluorescence value due to the protein mixture (NF It was increased by the addition of - ⁇ B (p50) + SP1) (Fig. 11; NF- ⁇ B).
  • 05C / 08 and 06B / 07 form a tetramer, undergoes complete chain exchange via branching movement, and is converted to 05C / 06B.
  • the decrease in fluorescence value due to conversion to 05C / 06B is caused by the protein mixture (NF- ⁇ B ( Increased by addition of p50) / SP1) (FIG. 11; SP1).
  • NF01 / 02 reduces only the relative fluorescence value of NF- ⁇ B DNA.
  • SP01 / 02 reduces only the relative fluorescence value of SP1 DNA (FIG. 11; SP1).
  • this detection system can not only detect each of the mixed proteins, but also can screen for drugs that inhibit only specific proteins.

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Abstract

　本発明は、核酸結合タンパク質の検出方法および核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。

Description

核酸結合蛋白質アッセイ法およびキット 発明の分野
　本発明は、核酸結合タンパク質の検出方法およびキットに関する。本発明は、更に、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法に関する。
　核酸結合タンパク質は、転写因子や染色体構造タンパク質、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮＡ加工に関わる酵素、あるいはポリメラーゼなど、細胞内において非常に重要な機能を担っている分子であり、核酸結合タンパク質の挙動を解析することは、生命活動を理解する上で重要な意味があると考えられている。また、核酸結合タンパク質はその機能の重要性から、医薬品や機能性食品等の開発の標的として注目されるようになってきている。
　近年の技術の進歩により、核酸結合タンパク質を検出する種々の方法がこれまでに開発されている。
　一般に、核酸結合タンパク質の検出には、ゲルシフト法やフットプリント法が用いられているが、これらの方法は電気泳動を伴うために、時間及び操作が煩雑であるという問題がある。
　タンパク質が結合した場合にのみ結合する二種類のＤＮＡプローブを利用したホモジニアスな核酸結合タンパク質の検出方法（米国特許６，５４４，７４６号公報、Heyduk, T., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20(2) 171-176）は、ＤＮＡプローブの設計が煩雑であり、さらに、離れた二箇所の配列に結合しうるＤＮＡ結合タンパク質にしか使用できないという問題がある（Wang, J., et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33(2) e23、Jantz, D., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20(2) 126-127）。
　エキソヌクレアーゼＩＩＩを利用した核酸結合タンパク質検出方法（非特許文献２）は、弱い結合の核酸結合タンパク質の検出が困難であり、また、医薬品等の薬物スクリーニングに利用した場合、薬剤のエキソヌクレアーゼＩＩＩ活性に対する影響を考慮することが必要であり、さらに、エキソヌクレアーゼＩＩＩ近縁のタンパク質の活性に影響する薬剤のスクリーニングはできないという問題がある。
　蛍光相関分光法を利用した核酸結合タンパク質検出法（Kobayashi, T., et al. (2004) Anal. Biochem. 332(1) 58-66）は、核酸単独と核酸に核酸結合タンパク質が結合した複合体の大きさの差を検出するものであり、小さな核酸結合タンパク質では十分なシグナル／ノイズ比が得られない問題がある。さらに、この方法には特殊な機器が必要であるため汎用性に問題がある。
　このように、種々の検出方法が開発されてきたにもかかわらず、多検体を迅速、かつ簡便に処理する方法は報告されておらず、核酸結合タンパク質を標的とする医薬品や機能性食品等のスクリーニングに応用可能な方法の開発が強く求められている。
発明の概要
　一般に、完全に相補的な二本鎖の核酸からなる核酸二本鎖は非常に安定であり、このような核酸二本鎖同士が相互作用し、構造変化することはない。しかし、それぞれの末端に一本鎖部分を有する核酸二本鎖同士は、その一本鎖部分を介して他の核酸二本鎖と結合し、構造変化が生じることが知られている。本発明者らは、このような核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　本発明は、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法、および核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法（以下、「本発明による検出方法」という）が提供される。
　本発明によれば、また、被験物質存在下および非存在下において、本発明の検出方法を行う、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法（以下、「本発明によるスクリーニング方法」という）が提供される。
　本発明によれば、さらに、末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを含んでなるキット、または一体型核酸複合体Ｅもしくは一体型核酸複合体Ｆを含んでなるキット（以下、「本発明によるキット」という）が提供される。
　本発明は、電気泳動が不要であり、汎用機器でホモジニアスアッセイが可能であり、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどの酵素が不要であり、またタンパク質結合部位に蛍光導入やニックなどの不自然な構造が不要である点で有利である。本発明はまた、例えば、ループ、ロイシンジッパー、Ｚｎフィンガー等のＤＮＡ結合モチーフを持つＤＮＡ結合タンパク質をはじめとする、ＤＮＡ結合タンパク質一般に広く適用可能である点で有利である。本発明はさらに、レポーターアッセイで評価することが困難な核酸結合タンパク質（例えば、テロメア結合タンパク質等の構造タンパク質）を標的とする阻害剤または促進剤についてもスクリーニングすることができる点で有利である。このように、本発明は、阻害剤等の新規医薬品や健康食品等の探索や同定に応用可能な点で有用である。
図１Ａは、核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、および核酸Ｂ２の構造の一態様を具体的に示した図である。 図１Ｂは、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２の構造の一態様（一体型核酸複合体Ｅ）を具体的に示した図である。 図１Ｃは、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２の構造の一態様（一体型核酸複合体Ｆ）を具体的に示した図である。 図２は、組み換えヒトＮＦκＢｐ５０の濃度と蛍光値の関係を示す図である。 図３は、デコイオリゴを用いて組み換えヒトＮＦκＢｐ５０の結合を阻害した時の蛍光値を示す図である。 図４は、組み換えヒトＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）　タンパク質が結合した時の蛍光値を示す図である。 図５は、組み換えヒトＳＰ１タンパク質が結合した時の蛍光値を示す図である。 図６は、組み換えヒトＴＲＦ２タンパク質（Ｎ末端欠損体）の核酸への結合を検出した結果を示す図である。 図７は、ミスマッチ導入と検出感度との関係を示す図である。棒の上の数値は、それぞれの核酸セットにおいてタンパク質未添加時の蛍光値を１００としたときの相対蛍光値を示している。 図８は、ミスマッチ導入と検出感度との関係を示す図である。棒の上の数値は、それぞれの核酸セットにおいてタンパク質未添加時の蛍光値を１００としたときの相対蛍光値を示している。 図９は、ＮＦ－κＢ　ＤＮＡとＳＰ１　ＤＮＡの蛍光強度を、オーロチオグルコース無添加時の蛍光値に対する相対蛍光値で示した図である。 図１０は、一体型複合体を利用したＮＦ－κＢ（ｐ５０）検出を示した図である。ＮＦ－κＢ　ＤＮＡとＳＰ１　ＤＮＡの蛍光強度を、タンパク質無添加に対する相対蛍光値で示した。 図１１は、マルチプレックス系におけるＮＦ－κＢとＳＰ１の結合を検出した結果を示した図である。ＮＦ－κＢ　ＤＮＡとＳＰ１　ＤＮＡの蛍光強度を、タンパク質無添加に対する相対蛍光値で示した。 図１２は、一体型核酸複合体を利用した検出の一態様を具体的に示した図である。星印は蛍光標識を、黒丸は消光標識を、白丸および白四角は変異を、灰色実線は核酸タンパク質結合配列をそれぞれ示した。 図１３は、タンパク質がタンパク質結合配列に結合できないようにするための変異の導入の一態様を具体的に示した図である。 図１４は、タンパク質がタンパク質結合配列に結合できないようにするための変異の導入の一態様を具体的に示した図である。
発明の具体的な説明
定義
　本願明細書において、「核酸」としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのみならず、修飾核酸や核酸類似体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やＬＮＡ（Locked nucleic acid））が挙げられるが、好ましくはＤＮＡである。
　本願明細書において、「核酸二本鎖」は、２つの核酸分子が互いの相補鎖として結合しているものを意味する。
　本願明細書において、「核酸一本鎖」は、他の核酸分子の相補鎖として結合していない核酸分子を意味し、例えば、核酸分子の一部が核酸分子内でハイブリダイズし、二本鎖部分を有するような核酸分子も「核酸一本鎖」に含まれる。また、核酸一本鎖は、他の核酸一本鎖と直接、あるいは他の配列（例えば、リンカー配列）等を介して、直列的に結合されていてもよい。
　本願明細書において「相補的」とは、各々の配列を構成する塩基間で水素結合が形成されることを意味し、具体的には、アデニンに対してチミンが対合し、チミンに対してアデニンが対合し、グアニンに対してシトシンが対合し、シトシンに対してグアニンが対合することを意味する。本願明細書において「相補性」とは、比較される配列間における相補的な塩基対の割合を意味する。本明細書において示した「相補性」の数値はいずれも、一方のヌクレオチド配列と、もう一方のヌクレオチド配列の相補鎖との間の相同性として、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
　本願明細書において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外とはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件下で標的核酸の塩基配列とハイブリダイズできる核酸としては、標的核酸の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する塩基配列からなる核酸が挙げられる。ストリンジェントな条件は、当業者であれば適宜決定することができ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））、例えば、塩濃度０．１ｍＭ～３Ｍ、温度１０～８０℃の条件、好ましくは、塩濃度１ｍＭ～１Ｍ、温度２０～７０℃の条件をいう。
　本願明細書において「連続する」ヌクレオチドの個数は、各ヌクレオチド配列とこれに対応するヌクレオチド配列とが結合（好ましくは、ハイブリダイズ）することができるかぎり特に限定されないが、連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列の各ヌクレオチド配列に対する割合が、好ましくは、１５％以上、より好ましくは、２０％以上、さらに好ましくは、２５％以上、特に好ましくは、３０％以上である。
　本願明細書において「Ｔｍ値」とは、本発明の方法が実施される反応条件下において（例えば、核酸濃度、塩濃度、ｐＨ等で規定）、比較される二つの一本鎖核酸のうち、５０％が二本鎖を形成する温度を意味する。Ｔｍ値は、例えば、温度変化に伴う紫外線吸収量の変化、ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ等の二本鎖ＤＮＡ検出試薬、蛍光エネルギー転移の蛍光値変化等を利用して算出することができるが、より簡便には、公知のアルゴリズムを用いて計算することができる（例えば、Markham NR and Zuker M(2005)Nucleic Acids Research 33 W577-W581）。
　本願明細書において「ミスマッチ」とは、アデニン／チミン塩基対およびグアニン／シトシン塩基対以外の塩基対、あるいは対応する塩基のない状態（バルジ）を意味する。
核酸複合体
　本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
　ここで、「構造変化」とは、好ましくは、核酸複合体における、核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換である。核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換とは、核酸二本鎖を形成するヌクレオチド鎖の相補鎖が、別の核酸二本鎖を形成するヌクレオチド鎖と入れ替わることを意味する。核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換は、不可逆的であっても、可逆的であってもよく、使用する核酸複合体の構造に基づく。
　少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体としては、二つの核酸二本鎖がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体；第一の態様）と二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体；第二の態様）とが挙げられる。第一の態様の核酸複合体と第二の態様の核酸複合体について、以下に説明する。
第一の態様の核酸複合体
　本発明の第一の態様によれば、二つの核酸二本鎖（核酸二本鎖Ａ、核酸二本鎖Ｂ）がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
　核酸二本鎖Ａは、核酸一本鎖である核酸Ａ１と核酸一本鎖である核酸Ａ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ｂと結合し得る核酸二本鎖である。
　核酸二本鎖Ｂは、核酸一本鎖である核酸Ｂ１と核酸一本鎖である核酸Ｂ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ａと結合し得る核酸二本鎖である。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ａ１：第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ａ２：第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ１：第二のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ２：第三のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖。
　例えば、まず、目的の核酸結合タンパク質に基づいて、核酸Ａ１を設計した後、核酸Ａ１に基づいて、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２を順次設計することができる。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２については、核酸二本鎖複合体における核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換が不可逆的に行われるように設計することができる。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、および核酸Ｂ２の具体的な構造の一態様を、図１Ａに示す。
　第一乃至第四のヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）およびそれらに対応する配列（ポリヌクレオチド）は、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂをそれぞれ形成することができれば特に限定されず、任意の配列を選択することができる。例えば、核酸Ａ１における第一のヌクレオチド配列は、核酸Ａ２における第一のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ｂ１における第四のヌクレオチド配列は、核酸Ｂ２における第四のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　第四のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
　第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第四のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　第四のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　第一乃至第四のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとが核酸二本鎖複合体を形成することができるかぎり特に限定されず、任意の配列を選択することができる。例えば、核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列は、核酸二本鎖Ｂにおける第二のヌクレオチド配列に対応する配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）するが、核酸二本鎖Ａにおける第三のヌクレオチド配列や、核酸二本鎖Ｂにおける第三のヌクレオチド配列に対応する配列や、他の核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）しない配列を選択することができる。また、核酸二本鎖Ａにおける第三のヌクレオチド配列は、核酸二本鎖Ｂにおける第三のヌクレオチド配列に対応する配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）するが、核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列や、核酸二本鎖Ｂにおける第二のヌクレオチド配列に対応する配列や、他の核酸二本鎖Ａにおける第三のヌクレオチド配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）しない配列を選択することができる。さらに、核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列、並びに核酸二本鎖Ｂにおける第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、それぞれ、核酸分子内では結合（好ましくは、ハイブリダイズ）しない配列を選択することができる。
　第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。
　第三のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
　第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。一方、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。また、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。
　第三のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。一方、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。また、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。
　第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。一方、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。
　第三のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。一方、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。
　第一乃至第四のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂから、核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄを形成する構造変化が生ずるかぎり特に限定されず、任意の配列を選択することができる。例えば、核酸Ａ１における第一のヌクレオチド配列は、核酸Ｂ１における第四のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ａ２における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、核酸Ｂ２における第四のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
　第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第四のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　核酸二本鎖Ａの末端配列として、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列は、核酸二本鎖Ａの片端に両方があってもよいし、両端にそれぞれあってもよい。核酸二本鎖Ｂの末端配列として、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、核酸二本鎖Ｂの片端に両方があってもよいし、両端にそれぞれあってもよい。好ましくは、核酸二本鎖Ａの末端配列として、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列が、核酸二本鎖Ａの片端に両方あり、核酸二本鎖Ｂの末端配列として、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列が、核酸二本鎖Ｂの片端に両方がある場合である。
　核酸二本鎖Ａにおける二本鎖部分（第一のヌクレオチド配列と第一のヌクレオチド配列に対応する配列との対合部分）の塩基対の長さは、核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄを形成する構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、５塩基対～１０００塩基対とすることができるが、好ましくは、１０塩基対～１００塩基対、より好ましくは、１５塩基対～５０塩基対である。
　核酸二本鎖Ｂにおける二本鎖部分（第四のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との対合部分）の塩基対の長さは、核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄを形成する構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、５塩基対～１０００塩基対とすることができるが、好ましくは、１０塩基対～１００塩基対、より好ましくは、１５塩基対～５０塩基対である。
　核酸二本鎖Ａにおける一本鎖部分（第二のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列）の塩基の長さは、本発明の核酸二本鎖複合体を形成することができれば特に限定されず、例えば、３塩基～１０００塩基とすることができるが、好ましくは、５塩基～１００塩基、より好ましくは、１０塩基～３０塩基である。
　核酸二本鎖Ｂにおける一本鎖部分（第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列）の塩基の長さは、本発明の核酸二本鎖複合体することができれば特に限定されず、例えば、３塩基～１０００塩基とすることができるが、好ましくは、５塩基～１００塩基、より好ましくは、１０塩基～３０塩基である。
　本願発明によれば、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一つが核酸結合タンパク質の結合部位を有する。
　核酸結合タンパク質の結合部位は、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの二本鎖部分、一本鎖部分、および核酸二本鎖複合体の分岐部分から選択される少なくとも一箇所に、少なくとも一種のタンパク質結合部位が存在するが、好ましくは、二本鎖部分である。転写因子のように特定の塩基配列を認識して結合するタンパク質の場合には、その認識配列とその周辺配列を含む。
　核酸二本鎖複合体は、核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとがそれぞれの末端配列において互いに結合し、かつヌクレオチド鎖交換などの構造変化が生ずる限り、結合の様式は特に限定されるものではないが、好ましくは、ハイブリダイゼーションにより結合させることができる。
　核酸二本鎖複合体において核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂ間のヌクレオチド鎖交換を生じさせるためには、核酸二本鎖Ａの３’末端配列（第二のヌクレオチド配列）と核酸二本鎖Ｂの５’末端配列（第二のヌクレオチド配列に対応する配列）とが結合し、および／または核酸二本鎖Ａの５’末端配列（第三のヌクレオチド配列）と核酸二本鎖Ｂの３’末端配列（第三のヌクレオチド配列に対応する配列）とが結合するように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを準備することが好ましい。
　本発明の好ましい態様では、核酸二本鎖Ａの３’末端配列と核酸二本鎖Ｂの５’末端配列とがハイブリダイズし、および／または核酸二本鎖Ａの５’末端配列と核酸二本鎖Ｂの３’末端配列とがハイブリダイズするように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを設計する。
　形成された核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄが安定して存在するためには、核酸二本鎖Ｃと核酸二本鎖Ｄとが結合しないように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを準備することが好ましい。
　本発明の好ましい態様では、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とが結合してできる一本鎖配列と、核酸Ａ２と核酸Ｂ２とが結合してできる一本鎖配列とが、ハイブリダイズしないように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを設計する。
　本発明の好ましい態様によれば、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との相補性が７０％以上であり、および／もしくは、第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が７０％以上であり、並びに／または、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列との相補性、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列との相補性、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、５０％未満である、本発明による検出方法が提供される。
　本発明の好ましい態様によれば、また、第一のヌクレオチド配列が、第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるか、もしくは、第四のヌクレオチド配列が、第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなり、および／または、第一のヌクレオチド配列に対応する配列が、第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるか、もしくは、第四のヌクレオチド配列に対応する配列が、第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなり、並びに／あるいは、第二のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第二のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第二のヌクレオチド配列に対応する配列が第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第二のヌクレオチド配列に対応する配列が第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列に対応する配列が第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列に対応する配列が第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４である、本発明による検出方法が提供される。
　本発明の好ましい態様によれば、さらに、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間のＴｍ値、および／もしくは、第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上高く、並びに／または、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列との間のＴｍ値、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列との間のＴｍ値、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上低い、本発明による検出方法が提供される。
第二の態様の核酸複合体
　本発明の第二の態様によれば、二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体Ｅ、一体型核酸複合体Ｆ）の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
　一体型核酸複合体Ｅは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｇと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｈとを含んでなる。
　核酸複合体Ｇは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ１と核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ２とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｈと結合し得る核酸複合体である。
　核酸複合体Ｈは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ１と核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ２とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｇと結合し得る核酸複合体である。
　一体型核酸複合体Ｆは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｉと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｊとを含んでなる。
　核酸複合体Ｉは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ１と核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ１とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｊと結合し得る核酸複合体である。
　核酸複合体Ｊは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ２と核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ２とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｉと結合し得る核酸複合体である。
　一体型核酸複合体Ｅは、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとを含んでなる一体型核酸複合体Ｆに変換される。また、一体型核酸複合体Ｆも、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとを含んでなる一体型核酸複合体Ｅに変換される。このような一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の構造変化は可逆的に繰り返される。
　核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ｇ１：末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
・核酸Ｇ２：末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
・核酸Ｈ１：末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
・核酸Ｈ２：末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
　例えば、まず、目的の核酸結合タンパク質に基づいて、核酸Ｇ１を設計した後、核酸Ｇ１に基づいて、核酸Ｇ２、核酸Ｈ２、核酸Ｈ１を順次設計することができる。
　核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２については、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２からなる一体型核酸複合体が鎖交換反応によって可逆的な構造変化を繰り返すように設計される。
　核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２の具体的な構造の一態様を、図１Ｂ（一体型核酸複合体Ｅの具体的な構造の一態様）および図１Ｃ（一体型核酸複合体Ｆの具体的な構造の一態様）に示す。
　核酸複合体が鎖交換反応によって可逆的な構造変化を繰り返すようにするために、例えば、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２において、鎖交換が行われる配列（第五のヌクレオチド配列、第五のヌクレオチド配列に対応する配列、第六のヌクレオチド配列、第六にヌクレオチド配列に対応する配列）のそれぞれの両端に鎖交換の進行を停止させ、逆転させるための末端部分を付加することができる。
　ここで「末端部分」とは、２つの二本鎖部分の間で行われている鎖交換の進行を停止させ、逆転させることができれば特に限定されず、ポリヌクレオチドであってもよいし、鎖交換が行われる２つのヌクレオチド鎖の末端同士を結合するようなリンカー（例えば、鎖交換が行われる２つのヌクレオチド鎖の末端とリン酸ジエステル結合によって結合されるアルキル鎖等）であってもよいし、最末端にこのようなリンカーが導入されたポリヌクレオチドであってもよい。末端部分は、好ましくは、ポリヌクレオチドである。
　末端部分がポリヌクレオチドである場合について、以下に説明する。
　末端部分がポリヌクレオチドである場合は、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｇ２をそれぞれ核酸一本鎖として提供することができる。
　一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の可逆的な構造変化は以下のように起こる。まず、（１）第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の３’末端で停止され、および／または、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第六のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第六のヌクレオチド配列の５’末端で停止されると（一体型核酸複合体Ｅの形成）、鎖交換の向きが変わる。次いで（２）第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換、および／または、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列に対応する配列において５’→ ３’方向の鎖交換が進行する。次いで（３）第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の５’末端で停止され、および／または、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列に対応する配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端で停止されると（一体型核酸複合体Ｆの形成）、鎖交換の向きが変わる。次いで（４）第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において５’→ ３’方向の鎖交換、および／または、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第六のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が進行し、再び（１）～（４）が繰り返される。
　第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の３’末端で停止され、および／または、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第六のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第六のヌクレオチド配列の５’末端で停止され、鎖交換の向きが変わるためには、
　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されるように設計することができる。
　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群、および末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群は、末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群、および末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群よりも、熱力学的に安定であるように設計することができる。
　また、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の５’末端で停止され、および／または、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列に対応する配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端で停止され、鎖交換の向きが変わるためには、
　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されるように設計することができる。
　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群および末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群は、末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群および末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群よりも、熱力学的に安定であるように設計することができる。
　熱力学的な安定性は、使用される塩基対から当業者であれば適宜決定することができる。
　「安定性が低い塩基対群」とは、対合すべき箇所において熱力学的に不安定であるため対合できない塩基対を含むことから、相補鎖が形成されない二本鎖の対応部分同士を意味する。
　「安定性が高い塩基対群」（塩基対群Ｈ）は、「安定性が低い塩基対群」（塩基対群Ｌ）よりも熱力学的に安定であれば特に制限されないが、例えば、安定性が高いＧＣ塩基対およびＡＴ塩基対の割合（好ましくは、ＧＣ塩基対の割合）が塩基対群Ｌよりも多い塩基対群にすることができる。また、塩基対群Ｌは、塩基対群Ｈよりも熱力学的に不安定であれば特に制限されないが、例えば、安定性が低いＧＧ塩基対、ＧＴ塩基対、ＧＡ塩基対、ＴＴ塩基対、ＡＡ塩基対、ＴＣ塩基対、ＡＣ塩基対、ＣＣ塩基対、バルジ塩基（対応する塩基がない塩基）等の割合が塩基対群Ｈよりも多い塩基対群とすることができる。
　塩基対群Ｌは、２つの二本鎖部分の間で行われている鎖交換の進行を止めることができれば特に限定されず、少なくとも１個、好ましくは、２～３個、より好ましくは、４個以上（例えば、４～１０個、４個～末端部分の塩基長）の塩基からなる塩基対群とすることができる。より好ましくは、塩基対群Ｌは、少なくとも連続した２～４個の安定性が低い塩基対を含んでなる塩基対群である。
　塩基対群Ｈは、２つの二本鎖部分の間で行われている鎖交換が停止され、その進行方向を変えることができれば特に限定されず、例えば、２個以上、好ましくは、３個以上（例えば、３～１０個、３個～末端部分の塩基長）の塩基からなる塩基対群とすることができる。より好ましくは、塩基対群Ｈは、少なくとも連続した２～４個の安定性が高い塩基対を含んでなる塩基対群である。
　末端部分１～４のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、上記のような一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の可逆的な構造変化が可能であれば特に限定されず、任意の配列を選択することができる。
　例えば、末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
　末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
　末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分１のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分２のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分３のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分４のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆにおいて、末端部分（ポリヌクレオチド）１～４のヌクレオチド配列とそれらに対応するヌクレオチド配列の塩基対の長さは、可逆的な構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、３塩基～５０塩基とすることができるが、好ましくは、５塩基～３０塩基、より好ましくは、１０塩基～３０塩基、さらにより好ましくは、１０塩基～２０塩基である。
　核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２については、また、一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つの一体型核酸複合体のみが核酸結合タンパク質の結合部位を有するように設計される。
　本発明は、核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを利用するものであるが、一体型核酸複合体においては、鎖交換の前後ではタンパク質結合配列は変わらない。例えば、核酸複合体Ｇ（核酸Ｇ１／核酸Ｇ２）がタンパク質結合配列を有する場合は、核酸複合体Ｉ（核酸Ｇ１／核酸Ｈ１）と核酸複合体Ｊ（核酸Ｇ２／核酸Ｈ２）にもタンパク質結合配列が存在することになる。この場合、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆのいずれにも核酸結合タンパク質が結合することとなる。本発明を利用してタンパク質の結合を検出するためには、核酸結合タンパク質がいずれか一方の一体型核酸複合体にのみ結合するように設計する。
　塩基配列を認識して結合するような核酸結合タンパク質は、その認識部位に変異があると結合が阻害される。従って、本発明によれば、一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸タンパク質結合配列を有し、他の一体型核酸複合体が核酸タンパク質結合配列を有さないようにするため、例えば、タンパク質結合配列に変異を導入することができる。このような変異としては、核酸タンパク質が、目的の核酸複合体の結合配列以外には結合しないような変異とすることができる。具体的な構造の一態様を、図１３に示す。
　例えば、一体型核酸複合体Ｅにおいて、核酸複合体Ｇのうち、核酸Ｇ１および核酸Ｇ２のいずれのタンパク質結合部位には変異を導入せず、核酸複合体Ｈのうち、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２のいずれにも変異を導入した場合、核酸結合タンパク質は、核酸複合体Ｇと、場合によっては、核酸複合体Ｈには結合することができる。しかし、一体型核酸複合体Ｅが構造変化して、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとが形成されると、核酸複合体Ｉは核酸Ｈ１に、核酸複合体Ｊは核酸Ｈ２にそれぞれ変異を有することになるので、一体型核酸複合体Ｆにはタンパク質が結合することができないこととなる。
　このように、変異は、いずれかの核酸一本鎖とその相補鎖（例えば、第五のヌクレオチド配列／第五のヌクレオチド配列に対応する配列、第六のヌクレオチド配列／第六のヌクレオチド配列に対応する配列、第五のヌクレオチド配列／第六のヌクレオチド配列、第五のヌクレオチド配列に対応する配列／第六のヌクレオチド配列に対応する配列）に少なくとも１個ずつ導入される。
　変異は、好ましくは、タンパク質結合配列に、より好ましくは、タンパク質結合配列のうちタンパク質との結合に深く関わる塩基に導入される。タンパク質結合配列のうちタンパク質との結合に深く関わる塩基については、核酸タンパク質ごとに知られている。タンパク質との結合に深く関わる塩基は、Ｘ線解析等によって決定されたタンパク質－核酸複合体の構造から決定することもできる。あるいは、ＴＦＳＥＡＲＣＨ（http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html）等のデータベースにより検索可能な高度に保存された塩基から推測することもできる。
　変異の位置は、鎖交換が阻害されず、かつ、核酸結合タンパク質の結合が阻害されるように決定することができる。例えば、相補鎖間でずらして導入する（すなわち、各箇所で一方の鎖の塩基にのみ変異を導入する）こともできるし、同じ箇所に導入することもできる。また、同じ箇所に変異が導入される場合は、ミスマッチとなるような変異を導入することも、マッチとなる変異を導入することができる。しかし、鎖交換の効率を低下させないためには、変異は、相補鎖において、変異箇所をずらして導入されることが好ましい。
　変異の種類としては、核酸結合タンパク質の結合を阻害することができれば特に限定されず、目的の核酸結合タンパク質とその認識配列に応じて適宜決定することができるが、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入等が挙げられ、好ましくは、置換である。
　変異の数は、核酸結合タンパク質の結合を阻害することができれば特に限定されず、目的の核酸結合タンパク質とその認識配列に応じて適宜決定することができるが、例えば、一本鎖に１～１０個であり、好ましくは１～５個、より好ましくは２～５個である。
　変異が導入された核酸は、公知の方法に従って合成することができる。
　変異の代わりに、タンパク質と結合しない人工塩基を導入することもできる。
　一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸タンパク質結合配列を有し、他の一体型核酸複合体が核酸タンパク質結合配列を有さないようにするためには、例えば、タンパク質が結合できないような構造となるような変異を導入することもできる。具体的な構造の一態様を、図１４に示す。
　この場合、鎖交換が途中で阻害されるような変異を導入することにより、完全なタンパク質結合部位は、鎖交換の前後においてどちらか一方にしか存在しないこととなる。　
　第五または第六のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の可逆的な構造変化が可能であれば特に限定されず、任意の配列を選択することができる。
　例えば、核酸Ｇ１における第五のヌクレオチド配列は、核酸Ｇ２における第五のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ｈ１における第六のヌクレオチド配列は、核酸Ｈ２における第六のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　第六のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
　第五のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第五のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第六のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　第六のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　また、核酸Ｇ１における第五のヌクレオチド配列は、核酸Ｈ１における第六のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ｇ２における第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、核酸Ｇ２における第六のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
　第五のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第六のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
　一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆにおいて、第五のヌクレオチド配列および第五のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに第六のヌクレオチド配列および第六のヌクレオチド配列に対応する配列の塩基対の長さは、可逆的な構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、５塩基対～１００塩基対とすることができるが、好ましくは、８塩基対～５０塩基対、より好ましくは、１０塩基対～３０塩基対である。
　核酸結合タンパク質の結合部位は、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体の二本鎖部分、あるいは一体型核酸複合体の分岐部分に、少なくとも一種のタンパク質結合部位が存在するが、好ましくは、二本鎖部分、より好ましくは、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との二本鎖部分、および／もしくは、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との二本鎖部分、または、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との二本鎖部分、および／もしくは、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との二本鎖部分である。転写因子のように特定の塩基配列を認識して結合するタンパク質の場合には、その認識配列とその周辺配列を含む。
　一体型核酸複合体は、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２が互いに結合し、かつ鎖交換による可逆的な構造変化が生ずる限り、結合の様式は特に限定されるものではないが、好ましくは、ハイブリダイゼーションにより結合させることができる。
　一体型核酸複合体は、一本の核酸の分子内高次構造でもよいし、二本以上の核酸からなる多量体であってもよい。例えば、核酸Ｇ１の５’末端と核酸Ｇ２の３’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｇ１と核酸Ｇ２とが一本鎖となっていてもよい。核酸Ｇ１の３’末端と核酸Ｈ１の５’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｇ１と核酸Ｈ１とが一本鎖となっていてもよい。核酸Ｈ１の３’末端と核酸Ｈ２の５’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｈ１と核酸Ｈ２とが一本鎖となっていてもよい。核酸Ｈ２の３’末端と核酸Ｇ２の５’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｇ２と核酸Ｈ２とが一本鎖となっていてもよい。例えば、一体型核酸複合体は以下のような構造をとることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明の好ましい態様によれば、一体型核酸複合体であって、
　核酸Ｇ１が、末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖であり、
　核酸Ｇ２が、末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖であり、
　核酸Ｈ１が、末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖であり、
　核酸Ｈ２が、末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖であり、
　末端部分１～４とそれらに対応する部分がポリヌクレオチドであって、
　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され；および
　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され；並びに
　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され；および
　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２～１０塩基対）が形成され、
　一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸タンパク質結合配列を有するように変異が導入された（ここで、変異は、タンパク質結合配列に、相補鎖間でずらして導入され、変異の数は、１～５個である。）
一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる、本発明による検出方法が提供される。より好ましい態様としては、構造変化の程度が、蛍光共鳴エネルギー転移を利用して測定される、本発明による検出方法が提供される。
核酸結合タンパク質
　本願明細書において、「核酸結合タンパク質」は、核酸に結合するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、転写因子、構造タンパク質、修復酵素、分岐結合タンパク質、組み換え酵素、ポリメラーゼ、ＲＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断酵素等が挙げられる。
　転写因子としては、例えば、ＴＦＩＩＩＤ、ＮＦκＢ、ｐ５３やＡＰ１等が挙げられる。
　構造タンパク質としては、例えば、テロメアＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒトＴＲＦ１、ＴＲＦ２、ＰＯＴ１等）等が挙げられる。
　修復酵素はミスマッチ結合タンパク質であり、例えば、大腸菌ＭｕｔＳ、ヒトＭＳＨ２、ＭＳＨ６等が挙げられる。
　分岐結合タンパク質としては、例えば、大腸菌ＲｕｖＡが挙げられる。
　組換えに関わる酵素としては、例えば、大腸菌ＲｅｃＡ、酵母Ｒａｄ５１等が挙げられる。
　ポリメラーゼとしては、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
　ＲＮＡ結合タンパク質としては、例えば、スプライソソーム複合体に含まれるＵ１ｓｎＲＮＰ、Ｕ２ｓｎＲＮＰ、Ｕ６ｓｎＲＮＰ、あるいはポリＡ結合タンパク質、ＲＮＡ修飾酵素、ＲＩＳＣ複合体等が挙げられる。
　一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、大腸菌ＳＳＢ、ヒトＲＰＡ等が挙げられる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一方の一本鎖部分に結合し、核酸二本鎖複合体の形成を阻害する。
　ＤＮＡまたはＲＮＡ切断酵素としては、例えば、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等）、ニッキング酵素、Ｄｉｃｅｒ等が挙げられる。一本鎖あるいは二本鎖の切断によって核酸二本鎖複合体の形成あるいはその後の構造変化が阻害される。
　核酸結合タンパク質は、精製されたものを使用してもよいし、細胞抽出液を使用してもよい。
検出方法
第一の態様
　末端に一本鎖部分を有する核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂは、それぞれの末端配列が互いに結合して核酸二本鎖複合体が形成され、続いて、構造変化が生じ、新たな核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄが形成される。新たに形成された核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄは、それらの末端配列において互いに結合して複合体を形成することはない。しかし、核酸結合タンパク質が核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂに結合すると、このような核酸二本鎖複合体の形成や、続く新たな核酸二本鎖の形成が阻害される。従って、核酸と核酸結合タンパク質との結合は、核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を指標にして、具体的には、核酸二本鎖および／または核酸二本鎖複合体の量を指標として、検出することができる。
　核酸と核酸結合タンパク質との結合は、下記工程を実施することにより検出することができる：
（ｉ）核酸結合タンパク質と、核酸二本鎖Ａと、核酸二本鎖Ｂとを接触させる工程；および
（ｉｉ）核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する工程。
　具体的には、工程（ｉｉ）において、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｃ）および／または核酸Ａ２と核酸Ｂ２とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｄ）の量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定することができる。
　測定した量を、核酸結合タンパク質の非存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの量と比較する工程を更に含んでいてもよい。この場合、核酸結合タンパク質の存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成量が、核酸結合タンパク質の非存在下での形成量を下回る場合に、核酸結合タンパク質が核酸に結合すると判定できる。
　また、工程（ii）において、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定することもできる。
　測定した量を、核酸結合タンパク質の非存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量と比較する工程を更に含んでいてもよい。この場合、核酸結合タンパク質の存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量が、核酸結合タンパク質の非存在下での量を上回る場合に、核酸結合タンパク質が核酸に結合すると判定できる。
　ここで、「核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量」は、核酸二本鎖複合体における核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量も含まれる。
　本発明による第一の態様の検出方法において「接触させる工程」は、核酸二本鎖Ａ、核酸結合タンパク質および核酸二本鎖Ｂは、全てを同時に混合してもよいし、核酸二本鎖Ａと核酸結合タンパク質を混合した後に核酸二本鎖Ｂを加えてもよい。
　本発明による第一の態様の検出方法において、構造変化は、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂのうち、いずれか一方の核酸二本鎖を他方の核酸二本鎖に対して過剰量とすることにより効率を上げることができる。また、構造変化が起こるのを阻害しない適切な配列を選択することにより、等量でも十分な効率の構造変化を起こすことができる。
第二の態様
　一体型核酸複合体Ｅは、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとが互いに結合して核酸複合体が形成されたものである。一体型核酸複合体Ｆは、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとが互いに結合して核酸複合体が形成されたものである。一体型核酸複合体Ｅは、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとからなる一体型核酸複合体Ｆに変換される。また、一体型核酸複合体Ｆも、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとからなる一体型核酸複合体Ｅに変換される。このような一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の構造変化は可逆的に繰り返される。しかし、核酸結合タンパク質が核酸複合体Ｇ、核酸複合体Ｈ、核酸複合体Ｉ、あるいは核酸複合体Ｊのいずれかに結合すると、このような可逆的な構造変化は阻害され、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆのいずれかの構造で安定化される。
　この時、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとが異なる値を示すような標識（例えば、核酸Ｇ１と核酸Ｇ２、核酸Ｇ１と核酸Ｈ１、核酸Ｇ１と核酸Ｈ２、核酸Ｇ２と核酸Ｈ１、核酸Ｇ２と核酸Ｈ２、あるいは核酸Ｈ１と核酸Ｈ２にそれぞれ、例えば、蛍光標識と消光標識をする）をすると、構造の安定化に伴い、標識の値も安定化（すなわち、標識の値の上昇または低下）される。
　従って、核酸と核酸結合タンパク質との結合は、一体型核酸複合体の構造変化の程度を指標にして、具体的には、一体型核酸複合体Ｅあるいは一体型核酸複合体Ｆの量を指標として、検出することができる。第２の態様の検出の一態様を図１２に示す。
　核酸と核酸結合タンパク質との結合は、下記工程を実施することにより検出することができる：
（ｉｉｉ）核酸結合タンパク質と、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆとを接触させる工程；および
（ｉｖ）一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する工程。
　具体的には、工程（ｉｖ）において、目的の一体型核酸複合体の量を測定することにより核酸複合体の構造変化の程度を測定することができる。
　例えば、核酸結合タンパク質が核酸複合体Ｇまたは核酸複合体Ｈに結合するように設計した場合、一体型核酸複合体Ｅの量から核酸に結合された核酸結合タンパク質の量を判定することができる。あるいは、核酸結合タンパク質が核酸複合体Ｉまたは核酸複合体Ｊに結合するように設計した場合、一体型核酸複合体Ｆの量から核酸に結合された核酸結合タンパク質の量を判定することができる。
　本発明による第二の態様の検出方法において「接触させる工程」は、一体型核酸複合体Ｆまたは一体型核酸複合体Ｇと核酸結合タンパク質とは、同時に混合することができる。
　本発明による第二の態様の検出方法によれば、予め調製しておいた核酸複合体とタンパク質を混合するだけでよいことから、操作ステップの減少や煩雑さによる操作ミスを低減するなどの操作性の向上が期待できる点で有利である。
　本発明による検出方法において、核酸結合タンパク質は、そのエフェクター分子（タンパク質）ととともに接触させてもよい。
　本発明による検出方法によれば、得られた核酸の形成量から、核酸と核酸結合タンパク質との結合能を算出することもできる。
　本発明による検出方法によれば、結合配列が知られていない核酸結合タンパク質について、本願発明の検出方法を利用して特定の配列に結合することができるか否かを判定することにより、核酸結合タンパク質の結合配列を決定することができる。
　本発明による検出方法によれば、結合されるタンパク質が知られていない配列について、本願発明の検出方法を利用して被験タンパク質が目的の配列に結合することができるか否かを判定することにより、目的の結合配列に結合する核酸結合タンパク質を同定することができる。
　本発明による検出方法において、構造変化は触媒を必要とする反応ではないが（例えば、第一の態様であれば、それぞれの末端に、互いに結合することができる一本鎖部分を有する核酸二本鎖を接触させれば起こる）、例えば、大腸菌のＲｕｖＢタンパク質などの触媒を用いて反応を促進することもできる。
　本発明による検出方法は、ハイブリダイゼーションを促進させる物質（例えば、ポリエチレングリコールやデキストラン硫酸等）の存在下で行ってもよい。また、タンパク質やＤＮＡの吸着防止や保護効果のある物質（例えば、ウシ血清アルブミン、無関係なＤＮＡ等）の存在下で行ってもよい。
　本願発明による検出方法は、使用される核酸結合タンパク質に適した温度で行うことができる。ＤＮＡ結合タンパク質の検出は、一般的には２０℃～３０℃で行われるが、好熱性のタンパク質の場合はより高温で行うことができる。
　核酸二本鎖、核酸二本鎖複合体、核酸複合体の量を測定する方法としては、当業者に知られている原理や方法であればいずれも使用でき、例えば、放射性標識、蛍光標識、電気泳動、蛍光共鳴エネルギー転移などを利用した方法が挙げられる。好ましくは、蛍光標識や蛍光共鳴エネルギー転移を利用した方法、より好ましくは、過剰な標識を除去するための洗浄操作や電気泳動を必要としないアッセイを可能とする蛍光共鳴エネルギー転移を利用した方法により、核酸二本鎖、核酸二本鎖複合体、核酸複合体の量を測定することができる。
　第一の態様によれば、例えば、核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１の３’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識することができる。この場合、核酸Ａ１が核酸二本鎖Ａを形成している時は蛍光を発するが、核酸Ａ１が核酸Ｂ１とハイブリダイズし、新たに核酸二本鎖Ｃを形成すると、核酸Ｂ１の標識によって消光されることから、蛍光値を測定することにより、容易に核酸二本鎖Ａの量を測定することができる。
　また、核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ａ２の３’末端を前記蛍光物質を消光できる物質で標識することができる。この場合、核酸Ａ１が核酸二本鎖Ａを形成している時は消光されるが、核酸Ａ１が核酸Ｂ１とハイブリダイズし、新たに核酸二本鎖Ｃを形成すると、蛍光を発することができることから、蛍光値を測定することにより、核酸二本鎖Ｃの量を測定することができる。
　核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２のうち、いずれの核酸が標識されてもよく、標識の位置は、核酸の内部であっても末端であってもよいが、好ましくは、末端である。
　第二の態様によれば、例えば、核酸Ｇ１のうち、第五のヌクレオチド配列の３’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｇ２のうち、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識することができる。この場合、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｇを形成している時は消光されるが、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｉを形成すると、核酸Ｇ１の標識によって蛍光を発することから、蛍光値を測定することにより、容易に一本鎖核酸複合体Ｅまたは一本鎖核酸複合体Ｆの量を測定することができる。消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
　また、核酸Ｇ１のうち、第五のヌクレオチド配列の３’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｈ２のうち、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端は前記蛍光物質を消光できる物質で標識することができる。この場合、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｇを形成している時は消光されるが、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｉを形成すると、蛍光を発することができることから、蛍光値を測定することにより、容易に一本鎖核酸複合体Ｅまたは一本鎖核酸複合体Ｆの量を測定することができる。消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
　さらに、核酸Ｇ１のうち、第五のヌクレオチド配列の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｈ２のうち、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端は前記蛍光物質を消光できる物質で標識することができる。この場合、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｇを形成している時は蛍光を発することができるが、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｉを形成すると、消光することから、蛍光値を測定することにより、容易に一本鎖核酸複合体Ｅまたは一本鎖核酸複合体Ｆの量を測定することができる。消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
　核酸Ｇ１（好ましくは、第五のヌクレオチド配列）、核酸Ｇ２（好ましくは、第五のヌクレオチド配列に対応する配列）、核酸Ｈ１（好ましくは、第六のヌクレオチド配列）、核酸Ｈ２（好ましくは、第六のヌクレオチド配列に対応する配列）のうち、いずれの核酸が標識されてもよく、標識の位置は、核酸の内部であっても末端であってもよいが、構造変化の前後で標識の距離の差異が大きくなるような位置であることが好ましい。
　蛍光標識としては、例えば、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａシリーズ（モレキュラープローブ社）、蛍光緑色タンパク質（ＧＦＰ）等が挙げられるが、好ましくは、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａシリーズである。
　消光物質としては、例えば、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（モレキュラープローブ社）等が挙げられ、使用される蛍光物質に応じて、適宜選択することができる。
　蛍光共鳴エネルギー転移は消光ではなく、蛍光波長のシフトとしても利用することができる。この蛍光エネルギー転移は、蛍光分光光度計、リアルタイムＰＣＲ装置あるいは蛍光プレートリーダーなどの汎用される装置で測定することができる。
ミスマッチの導入
　ヌクレオチド鎖交換反応において、ヌクレオチド配列にミスマッチが導入されると鎖交換効率が低下することが知られている（Panyutin IG et al. J. Mol. Biol. 1993 230 413-424）。しかし、本発明者らは、核酸複合体に用いられる核酸にミスマッチを導入することにより、鎖交換効率を大きく低下させることなく、核酸結合タンパク質による鎖交換反応の抑制効果を増強できることを見出した（実施例４）。また、ミスマッチの導入を利用して核酸結合タンパク質の検出を行うと、Ｓ／Ｎ比が向上することも見出された（実施例４）。
　ミスマッチ導入により鎖交換反応の抑制効果が増強され、また、Ｓ/Ｎ比が向上することは、本発明による検出方法やスクリーニング方法において、少量のタンパク質でアッセイが可能となるため、コストを削減できる点で有利である。特に、生体内のタンパク質の検出においては、貴重な試料を節約できるとともに、測定範囲が広がることで詳細な解析が可能となる点で有利である。
　ミスマッチは、鎖交換反応において交換後に相補鎖となる核酸鎖の間にミスマッチが存在するように導入される。
　例えば、核酸二本鎖複合体の場合、核酸Ａ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第一のヌクレオチド配列）における、核酸Ｂ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ｂ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第四のヌクレオチド配列）における、核酸Ａ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ａ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第一のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ｂ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および核酸Ｂ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第四のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ａ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて導入することができる。
　この場合、ミスマッチの導入位置は、鎖交換が行われる配列であれば、鎖交換効率を大きく損なわないかぎり特に制限されないが、好ましくは、核酸タンパク質結合配列以外の配列である。
　この場合、ミスマッチの数は、鎖交換効率を大きく損なわない限り特に制限されないが、例えば、第一のヌクレオチド配列は第四のヌクレオチド配列と、第四のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と、第一のヌクレオチド配列に対応する配列は第四のヌクレオチド配列に対応する配列と、第四のヌクレオチド配列に対応する配列は第一のヌクレオチド配列に対応する配列と、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数で導入することができる。
　この場合、ミスマッチを形成する塩基は、核酸二本鎖複合体において、核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２のいずれの核酸にも単独でまたは組み合わせて導入することができるが、好ましくは、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間、および／または第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間、より好ましくは、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間、および第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間にミスマッチが形成されるように導入される。
　この場合、ミスマッチを形成する塩基は、鎖交換前の相補鎖間でずらして導入することもできるし、同じ箇所に導入することもできるが、好ましくは、鎖交換前の相補鎖において、同じ箇所に導入される。
　核酸二本鎖複合体の場合の好ましい態様としては、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間、および第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間に、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との相補性および第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数のミスマッチが導入される。
　一体型複合体の場合、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第五のヌクレオチド配列）における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ｇ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第五のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ｈ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第六のヌクレオチド配列）における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および核酸Ｈ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第六のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて導入することができる。
　この場合、ミスマッチの導入位置は、鎖交換が行われる配列であれば、鎖交換効率を大きく損なわないかぎり特に制限されないが、好ましくは、核酸タンパク質結合配列以外の配列である。
　この場合、ミスマッチの数は、鎖交換効率を大きく損なわない限り特に制限されないが、例えば、第五のヌクレオチド配列は第六のヌクレオチド配列と、第六のヌクレオチド配列は第五のヌクレオチド配列と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列は第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、第五のヌクレオチド配列は第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列は第五のヌクレオチド配列と、第六のヌクレオチド配列は第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は第六のヌクレオチド配列と、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数を導入することができる。
　この場合、ミスマッチを形成する塩基は、核酸複合体において、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２のいずれの核酸にも単独でまたは組み合わせて導入することができるが、好ましくは、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との間、および／もしくは第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間、または、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および／もしくは第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間、より好ましくは、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との間、および第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間、または、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間にミスマッチが形成されるように導入されることが好ましい。ここで、ミスマッチを形成する塩基は、可逆的な構造変化が、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆのうち、タンパク質結合配列を有さない一体型核酸複合体に寄るように導入されることが好ましい。従って、一体型核酸複合体Ｅがタンパク質結合配列を有するように設計されている場合は、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および／もしくは第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間にミスマッチが形成されるように導入されることが好ましい。
　一体型複合体の場合の好ましい態様として、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との間、および第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間に、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との相補性および第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数のミスマッチ、並びに、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間に、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列との相補性および第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数のミスマッチが導入される。
マルチプレックス検出
　本願発明の検出方法によれば、複数の核酸複合体を用いて、核酸結合タンパク質の核酸への結合を複数同時に検出することができる（マルチプレックス検出）。
　マルチプレックス検出は、核酸結合タンパク質の阻害剤などのスクリーニングにおいてその効率を上げることができる。標的以外のタンパク質への影響は、副作用の原因となるため、できるだけ早い段階で影響が小さいことを確認する必要がある。マルチプレックス検出によれば、薬剤の標的タンパク質への効果を調べると同時に、他のタンパク質への影響も調べることが可能になる。
　マルチプレックス検出は、また、細胞内に存在する複数のタンパク質への結合活性を測定することできるため、細胞内で起きている生命現象をより詳細に把握することができる。マルチプレックス検出によれば、翻訳後修飾や他のタンパク質との相互作用で核酸結合活性が変化することが知られている核酸結合タンパク質について、より詳細な知見を得ることができる。
　マルチプレックスな検出方法において使用される核酸の配列は、複数の核酸複合体が独立して構造変化が生ずるかぎり特に限定されず、一つの核酸複合体に係る反応系の各核酸の配列については、他の反応系の核酸同士の結合や核酸複合体の構造変化に影響を与えないように設計することができる。
　核酸二本鎖複合体を使用するマルチプレックス検出について、例えば、各反応系における第一乃至第四のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列は、以下のように設計することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列は、該第一のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各反応系における第四のヌクレオチド配列は、該第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列は、該第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　各反応系における第四のヌクレオチド配列は、該第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列は、該第一のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
　各反応系における第四のヌクレオチド配列は、該第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
　各反応系における第二のヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。
　各反応系における第三のヌクレオチド配列は、該第三のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。
　各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。
　各反応系における第二のヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　一方、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。加えて、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。さらに、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列は、各反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。
　各反応系における第三のヌクレオチド配列は、該第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　一方、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。加えて、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、各反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、各反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。さらに、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列は、各反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。
　各反応系における第二のヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。一方、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列のＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列のＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。
　各反応系における第三のヌクレオチド配列は、該第三のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。一方、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
　各反応系における各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第四のヌクレオチド配列は、同一反応系における第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
　各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
　一体型核酸複合体を使用するマルチプレックス検出については、他の反応系の影響が少ないため、当業者であれば、使用されるヌクレオチド配列（例えば、第五のヌクレオチド配列、第六のヌクレオチド配列、末端部分１～４のヌクレオチド配列、およびこれらに対応する配列）を適宜選択することができる。
　マルチプレックスな検出方法において使用される標識は、他の核酸二本鎖複合体の構造変化と十分に区別でき、かつ十分な蛍光共鳴エネルギー転移を得られるかぎり特に限定されないが、好ましくは、フルオレセイン（蛍光物質）とＤＡＢＣＹＬ（消光物質）との組み合わせ、Ｃｙ３（蛍光物質）とＢＨＱ１（消光物質）との組み合わせである。
　複数の反応において使用される核酸結合タンパク質の結合部位は、異なるタンパク質の結合部位であってもよいし、同じタンパク質の異なる結合部位であってもよい。
　異なるタンパク質の場合、たとえば、タンパク質の阻害剤スクリーニングにおいて、このタンパク質と近縁であるが阻害効果を望まないタンパク質を同時にアッセイすることで、特異性の高い薬剤の取得が容易になる。
　また、同じタンパク質の異なる結合部位へのタンパク質結合を同時に測定することで、そのタンパク質の核酸への結合特性をより詳細に知ることができる。
スクリーニング方法
第一の態様
　核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂに核酸結合タンパク質が結合すると、核酸二本鎖複合体の形成や、続く新たな核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成が阻害される。従って、被験物質の存在下および非存在下において、本願発明の検出方法を実施し、構造変化の程度を比較することにより、被験物質が核酸結合タンパク質の核酸への結合を阻害したか否か、または促進したか否かを判定することができる。
　被験物質の存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成量が、被験物質の非存在下での形成量を上回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合阻害剤と判定できる。また、被験物質の存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量が、被験物質の非存在下での量を下回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合阻害剤と判定できる。
　一方、被験物質の存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成量が、被験物質の非存在下での形成量を下回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合促進剤と判定できる。また、被験物質の存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量が、被験物質の非存在下での量を上回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合促進剤と判定できる。
第二の態様
　一体型核酸複合体Ｅ、一体型核酸複合体Ｆのいずれかに核酸結合タンパク質が結合すると、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の構造変化が阻害され、いずれかの一体型核酸複合体に核酸結合タンパク質が結合された状態で安定化される。従って、被験物質の存在下および非存在下において、本願発明の検出方法を実施し、核酸結合タンパク質が結合されるように設計された一体型核酸複合体の量を比較することにより、被験物質が核酸結合タンパク質の核酸への結合を阻害したか否か、または促進したか否かを判定することができる。
　被験物質の存在下での一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆの量が、被験物質の非存在下での量を下回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合阻害剤と判定できる。また、被験物質の存在下での一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆの量が、被験物質の非存在下での量を上回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合促進剤と判定できる。
　本発明によるスクリーニング方法において、「被験物質」は、阻害剤または促進剤としてのあらゆる候補物質を意味するが、好ましくは、低分子化合物である。
　本発明によるスクリーニング方法は、被験物質が、標的の核酸結合タンパク質の結合に作用するのであって、核酸への非特異的な作用によって鎖交換に影響を与えたのではないことを確認するために、標的の核酸結合タンパク質とは結合しない核酸セットを、陰性コントロールとして使用できることが確認された（実施例５）。
　具体的には、本発明によるスクリーニング方法において、被験物質の標的となる核酸結合タンパク質とは結合しない核酸からなる核酸複合体の構造変化の程度を測定すること、をさらに含んでなることができる。
　陰性コントロールの検出方法としては、第一の態様の検出方法であっても、第二の態様の検出方法であってもよい。目的のスクリーニングが、第一の態様の検出方法を使用している場合に、第二の態様の検出方法を、あるいは、目的のスクリーニングが、第二の態様の検出方法を使用している場合に、第一の態様の検出方法を使用してもよいが、目的のスクリーニングと同じ検出方法を使用することが好ましい。
　本発明によるスクリーニング法は、ゲルシフトアッセイ法等を用いなくても、簡便かつ迅速に、被験物質の阻害効果を測定できる点で有利である。
キット
　本発明によれば、本発明による検出方法または本発明によるスクリーニング方法を実施するための検出キットが提供される。
第一の態様
　本発明による検出キットとしては、本発明による検出方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出するためのキットであって、末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この核酸二本鎖は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する。従って、所望により、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
　本発明による検出キットとしては、また、本発明によるスクリーニング方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングするためのキットであって、末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この核酸二本鎖は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングする。従って、所望により、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。また、陰性コントロールとして使用するための核酸二本鎖や一体型核酸複合体を更に含むことができる。
第二の態様
　本発明による検出キットとしては、本発明による検出方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出するためのキットであって、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この一体型核酸複合体は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する。従って、所望により、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
　本発明による検出キットとしては、また、本発明によるスクリーニング方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングするためのキットであって、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この一体型核酸複合体は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングする。従って、所望により、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。また、陰性コントロールとして使用するための核酸二本鎖や一体型核酸複合体を更に含むことができる。
　第二の態様のキットは、操作性の向上に加え、試薬コンポーネントの減少によるコスト削減が期待できる点で有利である。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１：ＮＦκＢ　ｐ５０を用いた結合量の検討
　ＮＦκＢ　ｐ５０はループ型（Ｒｅｌファミリー）に属するＤＮＡ結合配列を持つ転写因子であり、ＮＦκＢ結合配列（例えば、５’－ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ－３’）に結合することが知られている。
（１）二本鎖の調製
　５’末端を６－ＦＡＭで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－０１－５Ｆと合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－１４、３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－０２－３Ｄと合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－１３をそれぞれ２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５　％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０）中に混合して、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ二本鎖０１Ｆ／１４および０２Ｄ／１３を調製した。合成オリゴヌクレオチドは全て２０ｐｍｏｌ使用した。なお、以後すべての標識については、日本バイオサービス社に合成を依頼して作製されたものを使用した。
　加熱変性とアニーリングは以下の温度条件で行った。
95℃ 120秒 - 90℃ 30秒 - 85℃ 90秒 - 80℃ 90秒 - 77℃ 90秒 - 75℃ 90秒 - 72℃ 90秒 - 70℃ 90秒 - 67℃ 90秒 - 65℃ 90秒 - 62℃ 90秒 - 60℃ 90秒 - 57℃ 90秒 - 55℃ 90秒 - 52℃ 90秒 - 50℃ 90秒 - 47℃ 90秒 - 45℃ 90秒 - 42℃ 90秒 - 40℃ 90秒 - 37℃ 90秒 - 35℃ 90秒 - 32℃ 90秒 - 30℃ 90秒
　使用した各配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　下線部はＮＦκＢ結合配列であり、斜体は二本鎖において一本鎖になる配列である。
（２）ＮＦκＢ　ｐ５０結合の検出
　０．２８ｐｍｏｌの二本鎖０１Ｆ／１４と各濃度の組み換えヒトＮＦκＢ　ｐ５０（プロメガ社）を２０μＬの反応溶液（１２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９　、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、３０．５ｍＭ　ＤＴＴ、１１％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０６％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、５ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５　ｍＭ　ＰＭＳＦ、１μＭ　ＺｎＳＯ４）中に混合し、２５℃で３０分間反応させた。その後氷上で５分間静置し、ＮＦκＢ結合溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０）で希釈した２．８μＬ（０．２８ｐｍｏｌ）の二本鎖０２Ｄ／１３を加えた後、３０℃で１１分間反応させた。蛍光値の測定は、リアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。
　その結果、ＮＦκＢ　ｐ５０濃度に依存して蛍光値が上昇した（図２）。
　０１Ｆ／１４は、ＮＦｋＢ－０１－５Ｆに導入された６－ＦＡＭによって蛍光を発する。しかし、０１Ｆ／１４を０２Ｄ／１３と混合して構造変化が生じ、新たに完全な二本鎖０１Ｆ／０２Ｄ　（ＮＦｋＢ－０１－５ＦとＮＦｋＢ－０２－３Ｄ）と１３／１４（ＮＦｋＢ－１３とＮＦｋＢ－１４）が形成されると、６－ＦＡＭはＮＦｋＢ－０２－３ＤのＤＡＢＣＹＬによって消光される。一方、ＮＦκＢ　ｐ５０が結合すると上記の構造変化が阻害されることから、ＮＦκＢ　ｐ５０濃度に依存して蛍光値は上昇すると考えられる。
　以上のことから、上記の方法によれば、蛍光値を測定することにより、ＮＦκＢ　ｐ５０結合による構造変化を検出できることが確認された。
実施例２：デコイオリゴのＮＦκＢ　ｐ５０結合量への影響
（１）二本鎖の調製
　５’末端を６－ＦＡＭで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－０１－５Ｆと３‘末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－１４－０３Ｄ、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－０２と合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－１３をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖０１Ｆ／１４Ｄおよび０２／１３を実施例１と同様の条件で調製した。
　また、ＮＦκＢ結合配列を持つ合成オリゴヌクレオチドＮＦｃｐｔ０１とＮＦｃｐｔ０２、ＮＦκＢ結合配列を持たない合成オリゴヌクレオチドＡＰｃｐｔ０１とＡＰｃｐｔ０２をそれぞれ混合して、デコイオリゴ二本鎖ＮＦｃｐｔとＡＰｃｐｔを実施例１と同様の条件で調製した。ＮＦｃｐｔは、ＮＦκＢ結合配列を含むため、他のＮＦκＢ結合配列を含むＤＮＡへのＮＦκＢタンパク質の結合を阻害するが、ＡＰｃｐｔは、ＮＦκＢ結合配列を含まないため、他のＮＦκＢ結合配列へのＮＦκＢタンパク質の結合を阻害しない。
　使用した各配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　下線部はＮＦκＢ結合配列であり、斜体は二本鎖０１Ｆ／１４Ｄおよび０２／１３において一本鎖になる配列である。
（２）ＮＦκＢ　ｐ５０結合の検出
　１．６８ｐｍｏｌのデコイオリゴ二本鎖と０．４２ｐｍｏｌの二本鎖０１Ｆ／１４Ｄ、および１．５８ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦκＢ　ｐ５０（プロメガ社）、０．４２ｐｍｏｌの二本鎖０２／１３を３４．２μＬのＮＦκＢ反応溶液中（実施例１と同じ）に混合した後、３０℃で２１分間反応させた。蛍光値の測定はリアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。
　その結果、ＮＦκＢ結合阻害剤であるデコイオリゴ二本鎖（ＮＦｃｐｔ）の添加により、ＮＦκＢ　ｐ５０の添加により低下した蛍光値が上昇するが、ＮＦκＢ結合配列を持たないデコイオリゴ二本鎖（ＡＰｃｐｔ）の添加によっては、同様な蛍光値の上昇は認められなかった（図３）。
　０１Ｆ／１４Ｄは、ＮＦｋＢ－０１－５Ｆに導入された６－ＦＡＭがＮＦｋＢ－１４－３Ｄに導入されたＤＡＢＣＹＬによって消光される。しかし、０１Ｆ／１４Ｄを０２／１３と混合して構造変化が生じ、新たに完全な二本鎖０１Ｆ／０２（ＮＦｋＢ－０１－５ＦとＮＦｋＢ－０２）と１３／１４Ｄ（ＮＦｋＢ－１３とＮＦｋＢ－１４－３Ｄ）が形成されると、６－ＦＡＭはＤＡＢＣＹＬから十分に離れるため蛍光を発する（図３：ＮＦκＢ　ｐ５０なし）。ここで、ＮＦκＢ　ｐ５０を添加すると上記の構造変化が阻害されるため、蛍光値は低下する（図３：ＮＦκＢ　ｐ５０添加）。しかし、さらにＮＦｃｐｔが添加されると、ＮＦκＢ　ｐ５０の合成オリゴヌクレオチドへの結合が阻害され、構造変化も阻害されるため、蛍光値は高くなる（図３：ＮＦκＢ　ｐ５０＋ＮＦｃｐｔ添加）。一方、ＡＰｃｐｔが添加されても、ＮＦκＢ　ｐ５０の結合は阻害されず、構造変化も阻害されないため、蛍光値は低下する（図３：ＮＦκＢ　ｐ５０＋ＡＰｃｐｔ添加）。
　以上のことから、蛍光値を測定することにより、ＮＦκＢ結合配列をもつデコイオリゴ二本鎖（ＮＦｃｐｔ）による特異的なＮＦκＢ　ｐ５０の結合阻害を検出できることが確認された。従って、上記の方法は、核酸結合タンパク質の阻害剤のスクリーニングに使用できることが示された。
実施例３－１：ヒトＡＰ１タンパク質の結合試験
　ＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）はロイシンジッパー型のＤＮＡ結合モチーフを持つ転写因子であり、ＡＰ１結合配列（例えば、５’－ＴＧＡＧＴＣＡ－３’）に結合することが知られている。
（１）二本鎖の調製
　合成オリゴヌクレオチドＡＰ－０１－５Ｃ５とＡＰ－０４－３ＢＨ、ＡＰ－０２とＡＰ－０３、ＳＰ１－０１－５Ａ５とＳＰ１－０４－３ＢＨ３、ＳＰ１－０２とＳＰ１－０３をそれぞれハイブリダイズさせ、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＡＰ０１Ｃ／０４Ｂ、ＡＰ０２／０３、ＳＰ０１Ａ／０４ＢおよびＳＰ０２／０３を実施例１と同様の条件で調製した。
　ＡＰ０１Ｃ／０４ＢとＡＰ０２／０３はＡＰ１結合配列を持つが、ＳＰ０１Ａ／０４ＢとＳＰ０２／０３はＡＰ１結合配列を持たない。
　使用された各配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＡＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。下線はＳＰ１結合配列である。
（２）ＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）結合の検出
　６０ｆｍｏｌの二本鎖ＡＰ０１Ｃ／０４ＢあるいはＳＰ０１Ａ／０４Ｂと１．５　ｐｍｏｌの組み換えヒトＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）　（プロメガ社）を３０μＬの反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９　、５３ｍＭ　ＫＣｌ、０．１７ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．６ｍＭ　ＤＴＴ、１２％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５　％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、１．３ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、０．６７ｍＭ　ＭｇＣｌ２、３３ｍＭ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）中に混合し、２５℃で３０分間反応させた。その後氷上で５分間静置し、ＮＦκＢ結合溶液で希釈した３μＬ（６０ｆｍｏｌ）の二本鎖ＡＰ０２／０３あるいはＳＰ０２／０３をそれぞれ加えた後、３０℃で２時間反応させた。蛍光値の測定は、リアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。
　実施例３は、実施例２と同様に、タンパク質の結合による構造変化の阻害効果を蛍光値の低下によって検出するものである。ただし、蛍光物質として実施例２の６－ＦＡＭに代わりＣｙ５あるいはＡｌｅｘａ６４７を用い、消光物質としてＤＡＢＣＹＬの代わりにＢＨＱ３を用いた。
　その結果、ＡＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＡＰ０１Ｃ／０４ＢとＡＰ０２／０３）を使用した場合は、ＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）の添加による蛍光値の低下、すなわちＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）による構造変化の阻害が観察された（図４）。しかし、ＳＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＳＰ０１Ａ／０４ＢとＳＰ０２／０３）を使用した場合は、ＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）を添加しても蛍光値の低下、すなわちＡＰ１（ｃ－ｊｕｎ）による構造変化の阻害は認められなかった（図４）。
実施例３－２：ヒトＳＰ１タンパク質の結合検出試験
　ＳＰ１はＺｎフィンガー型のＤＮＡ結合モチーフを持つ転写因子であり、ＳＰ１結合配列（例えば、５’－ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ－３’）に結合することが知られている。
（１）二本鎖の調製
　二本鎖の調製は、実施例３と同様に行った。
（２）ＳＰ１結合の検出
　６０ｆｍｏｌの二本鎖ＡＰ０１Ｃ／０４ＢあるいはＳＰ０１Ａ／０４Ｂと１．６５ｐｍｏｌの組み換えヒトＳＰ１（プロメガ社）を３０μＬの反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９　、５３．０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．６ｍＭ　ＤＴＴ、１３．０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５６％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、０．３６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、３０３ｎＭ　ＺｎＳＯ４、０．７２　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５）中に混合し、２５℃で３０分間反応させた。その後氷上で５分間静置し、ＮＦκＢ結合溶液で希釈した３μＬ（６０　ｆｍｏｌ）の二本鎖ＡＰ０２／０３あるいはＳＰ０２／０３をそれぞれ加えた後、３０℃で４時間反応させた。蛍光値の測定は、リアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。
　その結果、ＳＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＳＰ０１Ａ／０４ＢとＳＰ０２／０３）を使用した場合は、ＳＰ１の添加による蛍光値の低下、すなわちＳＰ１による構造変化の阻害が観察された（図５）。しかし、ＡＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＡＰ０１Ｃ／０４ＢとＡＰ０２／０３）を使用した場合は、ＳＰ１を添加しても蛍光値の低下、すなわちＳＰ１による構造変化の阻害は認められなかった（図５）。
実施例３－３：ＴＲＦ２タンパク質の結合実験
　ＴＲＦ２は、Ｃ末端側にＭｙｂタイプのヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフからなるＤＮＡ結合ドメインを持つテロメアＤＮＡ結合タンパク質であり、テロメアＤＮＡ（５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’の繰り返し）に結合してテロメア構造を形成するタンパク質として知られている。
（１）組換えヒトＴＲＦ２ΔＢの作製
　ＴＲＦ２ΔＢは、ＴＲＦ２のＮ末端にある塩基性ドメインを欠損させた組換えヒトＴＲＦ２タンパク質（Ｎ末端欠損体）である。
　ヒト培養細胞株（ＩＨＷ０９０８４（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＨＬＡ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐより入手））から抽出したｍＲＮＡを基に調製したｃＤＮＡから、ＴＲＦ２の全長を含むｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡを鋳型として、アミノ酸配列の４５番目から５００番目に相当するＤＮＡ領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。得られたＤＮＡ断片にヒスタグ配列を付加し、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入して、Ｂａｃｍｉｄを得た。Ｂａｃｍｉｄを昆虫細胞（Ｓｆ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手））にトランスフェクションしてウィルスを作製した。得られたウイルスをＳｆ９に感染させ、組換えヒトＴＲＦ２ΔＢを発現させた。ＴＲＦ２ΔＢは、Ｎｉ－ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）でウシ血清アルブミンを基準に算出した。
（２）二本鎖の調製
　合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０６と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０１－５Ｃ３を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ０１Ｃ／０６を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ０１Ｃ／０６はＴＲＦ２結合配列を持つ。
　合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－１６と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－１３－５Ｃ３を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ１３Ｃ／１６を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ１３Ｃ／１６はＴＲＦ２結合配列を持たない。
　合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０５と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０２－３Ｂ１を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ０２Ｂ／０５を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ０２Ｂ／０５はＴＲＦ２結合配列を持つ。
　合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－１５と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－１４－３Ｂ１を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ１４Ｂ／１５を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ１４Ｂ／１５はＴＲＦ２結合配列を持たない。
　使用された配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＴＲＦ２結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　下線部はＴＲＦ２結合配列を示すが、網掛けの部分に変異があるため、ＴＲＦ２は結合することができない。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
（３）ＴＲＦ２結合の検出
　１００ｆｍｏｌのＴ０１Ｃ／０６あるいはＴ１３Ｃ／１６と１μｇのＴＲＦ２ΔＢを反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、２０μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。その後、Ｔ０１Ｃ／０６、Ｔ１３Ｃ／１６に、１００ｆｍｏｌのＴ０２Ｂ／０５、Ｔ１４Ｂ／１５をそれぞれ加えて５０μＬとした後、２５℃で６０分間反応させた。Ｃｙ３の蛍光値の測定は、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いた。
　その結果、ＴＲＦ２結合配列を持つＤＮＡセット（Ｔ０１Ｃ／０６とＴ０２Ｂ／０５）では、Ｔ０１Ｃ／０６とＴ０２Ｂ／０５とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、Ｔ０１Ｃ／０２Ｂに変換されることによる蛍光値の低下が、ＴＲＦ２ΔＢの添加により抑制された（図６）。一方、ＴＲＦ２結合配列に変異を導入したＤＮＡセット（Ｔ１３Ｃ／１６とＴ１４Ｂ／１５）では、Ｔ１３Ｃ／１６とＴ１４Ｂ／１５とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、Ｔ１３Ｃ／１４Ｂに変換されることによる蛍光値の低下が、ＴＲＦ２ΔＢの添加により抑制されなかった（図６）。
　このように、本発明の方法は、代表的なＤＮＡ結合モチーフであるループ、ロイシンジッパー、Ｚｎフィンガーを持つＤＮＡ結合タンパク質の結合阻害を検出することができた。また、テロメアＤＮＡ結合タンパク質の結合阻害を検出することができた。従って、本発明は、核酸結合タンパク質一般に広く使用可能であることが示された。
　また、本発明による方法は、使用する蛍光物質にも制限がないことを示された。本発明によれば、さまざまな種類の蛍光物質を使用することができるため、例えば、薬剤となる化合物が蛍光を発するものである場合に、化合物の蛍光が障害とならないような蛍光標識を選択することが可能である。
実施例４：ミスマッチ導入による検出感度の確認試験
４－１．ＳＰ１を用いた試験
（１）二本鎖の調製
　５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０５－５Ｃ３と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０８－３Ｂ１を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＳＰ０５Ｃ／０８Ｂを実施例１と同様の条件で調製した。また、合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０６とＳＰ１－０７、ＳＰ１－２１とＳＰ１－２２、ＳＰ１－２３とＳＰ１－２４をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＳＰ０６／０７、ＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３を実施例１と同様の条件で調製した。これらの二本鎖は、ＳＰ１の結合配列を持つ。
　使用された配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＳＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。網掛けは、ＳＰ１－２１とＳＰ１－２３についてはＳＰ１－０８－３Ｂ１に対してミスマッチとなる塩基を、ＳＰ１－２２とＳＰ１－２４についてはＳＰ１－０５－５Ｃ３に対してミスマッチとなる塩基をそれぞれ示した。
（２）鎖交換抑制効果の確認
　４０ｆｍｏｌのＳＰ０５Ｃ／０８Ｂと２．５ｐｍｏｌの組み換えヒトＳＰ１（プロメガ社）を反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、１５μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。８０ｆｍｏｌのＳＰ０６／０７、ＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３、ＳＰ１－０７、ＳＰ１－２１、ＳＰ１－２３のいずれかを加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させて、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、Ｃｙ３の蛍光値を測定した。
　その結果、ＳＰ０５Ｃ／０８ＢとＳＰ０６／０７とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、ＳＰ０５Ｃ／０６に変換されることによる蛍光値の上昇が、ＳＰ１の添加により抑制された（図７）。ＳＰ０６／０７の代わりにＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３を使用した場合も同様の結果が得られた（図７）。
　また、ＳＰ０５Ｃ／０８ＢとＳＰ１－０７とが三量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、二量体０８Ｂ／０７と単量体ＳＰ１－０５－５Ｃ３が形成されることによる蛍光値の上昇が、ＳＰ１の添加により抑制された（図７）。ＳＰ１－０７の代わりにＳＰ１－２１、ＳＰ１－２３を使用した場合も同様の結果が得られた（図７）。
　ここで、ＳＰ１タンパク質の添加による蛍光値の抑制は、ＳＰ０５Ｃ／０８Ｂに対してミスマッチが存在しないＳＰ０６／０７やＳＰ１－０７に比べて、ミスマッチが存在するＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３、ＳＰ－２１、ＳＰ－２３を加えた場合に非常に大きいことが確認された。
　以上のことから、ミスマッチ導入は、ＳＰ１タンパク質の添加による鎖交換抑制作用を増強し、タンパク質未添加時と添加時の蛍光値の比を大きくすることが確認された。
４－２．ＮＦ－κＢに関する試験例
（１）二本鎖の調製
　５’末端をフルオレセインで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－０１－５Ｆと３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－１４－３Ｄを混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０１Ｆ／１４Ｄを実施例１と同様の条件で調製した。また、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－０２とＮＦｋＢ－１３、ＮＦｋＢ－２１とＮＦｋＢ－２６、ＮＦｋＢ－４９とＮＦｋＢ－５０をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０２／１３、ＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９を実施例１と同様の条件で調製した。これらの二本鎖は、ＮＦ－κＢの結合配列を持つ。
　使用された配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ＮＦ－κＢ結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。網掛けは、ＮＦｋＢ－２１とＮＦｋＢ－４９についてはＮＦｋＢ－１４－３Ｄに対してミスマッチとなる塩基を、ＮＦｋＢ－２６とＮＦｋＢ－５０についてはＮＦｋＢ－０１－５Ｆに対してミスマッチとなる塩基をそれぞれ示した。
（２）鎖交換抑制効果の確認
　１００ｆｍｏｌのＮＦ０１Ｆ／１４Ｄと５００ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦ－κＢ（ｐ５０）（プロメガ社）を反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、１５μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。２００ｆｍｏｌのＮＦ０２／１３、ＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９のいずれかを加えて５０μＬとした後、３７℃で１２０分間反応させて、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、フルオレセインの蛍光値を測定した。
　その結果、ＮＦ０１Ｆ／１４ＤとＮＦ０２／１３とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、ＮＦ０１Ｆ／０２に変換されることによる蛍光値の上昇が、ｐ５０の添加により抑制された（図８）。ＮＦ０２／１３の代わりにＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９を使用した場合も同様の結果が得られた（図８）。
　ここで、ＮＦ－κＢ（ｐ５０）タンパク質の添加による蛍光値は、ＮＦ０１Ｆ／１４Ｄに対してミスマッチが存在しないＮＦ０２／１３との組み合わせでは蛍光値の低下が約３０％であったのに対し、ＮＦ０１Ｆ／１４Ｄに対してミスマッチが存在するＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９との組み合わせでは、蛍光値が５０％以上低下した（図８）。
　以上のことから、ミスマッチ導入は、ＮＦ－κＢ（ｐ５０）タンパク質の鎖交換抑制作用を増強し、タンパク質未添加時と添加時の蛍光値の比を大きくすることが確認された。
実施例５：陰性コントロールを使用したスクリーニング系の検討
　核酸結合タンパク質の阻害剤などのスクリーニングを行う際には、被験物質が標的の核酸結合タンパク質の結合に作用するのであって、核酸への非特異的な作用によって鎖交換に影響を与えるのではないことを確認する必要がある。そこで、標的とする核酸結合タンパク質が結合しない核酸セットを陰性コントロールとして使用したスクリーニング系について検討した。
　ＮＦ－κＢを阻害することが知られているオーロチオグルコース（Ａｕｒｏｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｅ）（Yang et al. FEBS letters 1995 361 89-96）を被験物質として使用した。また、ＮＦ－κＢが結合しない核酸セットを陰性コントロールとして使用した。
（１）二本鎖の調製
　合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－４２と５’末端をフルオレセインで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－３１－５Ｆ、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－４１と３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－３２－３Ｄをそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１を実施例１と同様の条件で調製した。３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１は、ＮＦ－κＢの結合配列を持つ。
　合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０８と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０５－５Ｃ３、合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０７と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０６－３Ｂ１をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７を実施例１と同様の条件で調製した。０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７は、ＳＰ１の結合配列を持つ。
　使用された配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ＮＦ－κＢ結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ＳＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
（２）オーロチオグルコースによるＮＦ－κＢ（ｐ５０）阻害効果の検出
　３１Ｆ／４２と０５Ｃ／０８の混合液（それぞれ５０ｆｍｏｌ）に、０～５ｎｍｏｌのオーロチオグルコースおよび０．５ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦκＢ　ｐ５０（プロメガ社）を加え、さらに３２Ｄ／４１と０６Ｂ／０７の混合液（それぞれ２００ｆｍｏｌ）を加えて混合し、２５℃で３０分間反応させた。反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０）の最終液量は５０μＬである。蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、フルオレセインとＣｙ３の蛍光値を測定した。フルオレセインは４８５ｎｍで励起して、５３５ｎｍの蛍光を測定した。Ｃｙ３は５３５ｎｍで励起して、５９５ｎｍで測定した。
　その結果、ＮＦ－κＢオリゴの相対蛍光値は、ＮＦ－κＢを阻害するオーロチオグルコースの濃度に依存して低下した。一方で、オーロチオグルコースの添加は、ＳＰ１オリゴの相対蛍光値はほとんど影響されなかった（図９）。このことから、オーロチオグルコースがＮＦ－κＢ（ｐ５０）の核酸への結合を阻害する作用があることを確認すると同時に、鎖交換自体には影響を与えないことを確認することができた。
　このように、本発明のスクリーニング法によれば、ゲルシフトアッセイ法等を用いなくても、簡便かつ迅速に、被験物質の阻害効果を測定できることが確認された。
実施例６：ＮＦ－κＢ　ｐ５０を用いた結合量の検討（一体型核酸複合体）
（１）四量体の調製
　合成オリゴオリゴヌクレオチドＮ－Ｃｄ－Ｕ２ｍ４（Ｃ４）とＮ－Ｂｃ－Ｌ２ｍ５（Ｂ５）、および５’末端から３０塩基目のチミンにフルオレセイン標識した合成オリゴヌクレオチドＮ－Ａｂ－Ｕ２－３０Ｆ（Ａｆ）と５’末端から２０塩基目のチミンにＤａｂｃｙｌ標識した合成オリゴヌクレオチドＮ－Ｄａ－Ｌ２－２０Ｄ（Ｄｄ）を混合して一体型四量体Ａｆ／Ｂ５／Ｃ４／Ｄｄを調製した。Ｎ－Ａｂ－Ｕ２－３０ＦとＮ－Ｄａ－Ｌ２－２０Ｄを混合して二量体Ａｆ／Ｄａを形成し、消光参照品とした。４種類のＤＮＡを同時に混合する以外は、実施例１と同じ条件で行った。
　デコイＤＮＡとして、合成オリゴヌクレオチドＮＦｃｐｔ０１とＮＦｃｐｔ０２、ＮＦｃｐｔ０３とＮＦｃｐｔ０４をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０１／０２、ＮＦ０３／０４を実施例１と同様の条件で調製した。ＮＦ０１／０２はＮＦ－κＢ結合配列を持つが、ＮＦ０３／０４はＮＦ－κＢ結合配列に変異が導入されている。
　使用された配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　鎖交換する部分を下線で示した。ＮＦ－κＢ結合配列を網掛けで示した。
（２）ＮＦ－κＢ（ｐ５０）結合の検出
　５０ｆｍｏｌのＡｆ／Ｂ５／Ｃ４／Ｄｄと４８４ｆｍｏｌの組み換えヒトＮＦ－κＢ（ｐ５０）（プロメガ社）を反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、５０μＬ）中に混合して２５℃で３０分間反応させた後、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いてフルオレセインの蛍光値を測定した（励起４８５ｎｍ、検出５３５ｎｍ）。デコイＤＮＡは１ｐｍｏｌ添加した。タンパク質による蛍光値の変化は、Ａｆ／Ｄｄの蛍光値を差し引いたバックグランド補正蛍光値で評価した。
　その結果、Ａｆ／Ｂ５／Ｃ４／Ｄｄの蛍光値はＮＦ－κＢ（ｐ５０）の添加により抑制された。さらに、ＮＦ－κＢ結合配列をもつデコイＤＮＡ（ＮＦ０１／０２）を添加すると、蛍光値が回復した。一方で、ＮＦ－κＢ結合配列に変異を導入したデコイＤＮＡ（ＮＦ０３／０４）を添加しても、蛍光値の回復は見られなかった（図１０）。
　以上のことから、上記の方法によれば、蛍光値を測定することにより、核酸結合タンパク質の配列特異的な結合を検出できることが確認された。
実施例７：マルチプレックス検出系の検討
　マルチプレックス検出系を検討するため、ＮＦ－κＢ（ｐ５０）、ＳＰ１のＤＮＡへの結合を同時に検出し、さらに、ＮＦ－κＢ（ｐ５０）阻害剤（デコイオリゴ）による特異的な阻害効果を検出した。
（１）二本鎖の調製
　合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－４２と５’末端をフルオレセインで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－３１－５Ｆ、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－４１と３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ－３２－３Ｄをそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１を実施例１と同様の条件で調製した。３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１は、ＮＦ－κＢの結合配列を持つ。
　合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０８と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０５－５Ｃ３、合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０７と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１－０６－３Ｂ１をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７を実施例１と同様の条件で調製した。０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７は、ＳＰ１の結合配列を持つ。
　合成オリゴヌクレオチドＮＦｃｐｔ０１とＮＦｃｐｔ０２を混合し、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０１／０２を実施例１と同様の条件で調製した。ＮＦ０１／０２は、ＮＦ－κＢ結合配列を持つ。
　合成オリゴヌクレオチドＳＰｃｐｔ０１とＳＰｃｐｔ０２を混合し、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＳＰ０１／０２を実施例１と同様の条件で調製した。ＳＰ０１／０２は、ＳＰ１結合配列を持つ。
　使用された配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　ＮＦ－κＢ結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　ＳＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　ＮＦ－κＢ結合配列を下線で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　ＳＰ１を下線で示した。
（２）タンパク質結合の検出
　３１Ｆ／４２と０５Ｃ／０８の混合液（それぞれ４０ｆｍｏｌ）、８００ｆｍｏｌのデコイ（ＮＦ０１／０２あるいはＳＰ０１／０２）、タンパク質混合液（２．５ｐｍｏｌの組み換えヒトＳＰ１と０．１２５　ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦκＢ　ｐ５０）を反応溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、１５μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。３２Ｄ／４１と０６Ｂ／０７の混合液（それぞれ８０　ｆｍｏｌ）を加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させて、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、フルオレセインとＣｙ３の蛍光値を測定した。フルオレセインは４８５ｎｍで励起して、５３５ｎｍの蛍光を測定した。Ｃｙ３は５３５ｎｍで励起して、５９５ｎｍで測定した。
　その結果、３１Ｆ／４２と３２Ｄ／４１とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、３１Ｆ／３２Ｄに変換されることによる蛍光値の低下が、タンパク質混合物（ＮＦ－κＢ（ｐ５０）＋ＳＰ１）の添加により上昇した（図１１；ＮＦ－κＢ）。
　０５Ｃ／０８と０６Ｂ／０７とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、０５Ｃ／０６Ｂに変換されることによる蛍光値の低下が、タンパク質混合物（ＮＦ－κＢ（ｐ５０）／ＳＰ１）の添加により上昇した（図１１；ＳＰ１）。
　ここで、ＮＦ０１／０２は、ＮＦ－κＢ　ＤＮＡの相対蛍光値のみを低下させることが確認された。また、ＳＰ０１／０２はＳＰ１　ＤＮＡの相対蛍光値のみを低下させることが確認された（図１１；ＳＰ１）。
　以上のことから、この検出系によれば、混合されたタンパク質をそれぞれ検出できるだけでなく、特定のタンパク質のみを阻害する薬剤のスクリーニングが可能であることが示された。

Claims (26)

  1. 　核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる、方法。
  2. 　構造変化が、二つの核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換である、請求項１に記載の方法。
  3. 　少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体が、二つの核酸二本鎖がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　下記工程を含んでなる、請求項３に記載の方法：
    （ｉ）核酸結合タンパク質と、核酸二本鎖Ａと、核酸二本鎖Ｂとを接触させる工程（ここで、核酸二本鎖Ａは二つの核酸一本鎖（以下、それぞれ「核酸Ａ１」および「核酸Ａ２」とする）からなり、核酸二本鎖Ｂは二つの核酸一本鎖（以下、それぞれ「核酸Ｂ１」および「核酸Ｂ２」とする）からなる）；および
    （ｉｉ）核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する工程。
  5. 　工程（ｉｉ）において、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｃ）および／または核酸Ａ２と核酸Ｂ２とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｄ）の量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する、請求項４に記載の方法。
  6. 　工程（ｉｉ）において、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する、請求項４に記載の方法。
  7. 　核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一つが核酸結合タンパク質の結合部位を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　核酸Ａ１が第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ａ２が前記第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ｂ１が前記第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ｂ２が前記第三のヌクレオチド配列に対応する配列および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖からなる、請求項４に記載の方法。
  9. 　核酸Ａ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｂ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
    　核酸Ｂ１のヌクレオチド配列における、核酸Ａ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
    　核酸Ａ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｂ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および
    　核酸Ｂ２のヌクレオチド配列における、核酸Ａ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
    から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体が、二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体）である、請求項１または２に記載の方法。
  11. 　下記工程を含んでなる、請求項１０に記載の方法：
    （ｉｉｉ）核酸結合タンパク質と、一体型核酸複合体Ｅとを接触させる工程（ここで、一体型核酸複合体Ｅは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｇと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｈとを含んでなり、核酸複合体Ｇは二つの核酸一本鎖含有体（以下、それぞれ「核酸Ｇ１」および「核酸Ｇ２」とする）を含んでなり、核酸複合体Ｈは二つの核酸一本鎖含有体（以下、それぞれ「核酸Ｈ１」および「核酸Ｈ２」とする）を含んでなる）；および
    （ｉｖ）一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する工程
    （ここで、
    　核酸Ｇ１が、末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
    　核酸Ｇ２が、末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
    　核酸Ｈ１が、末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
    　核酸Ｈ２が、末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体である）。
  12. 　末端部分がポリヌクレオチドであり、
    　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
    　末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され；並びに
    　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
    　末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成される、請求項１１に記載の方法。
  13. 　工程（ｉｖ）において、一体型核酸複合体Ｅの量を測定することにより一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 　工程（ｉｖ）において、核酸Ｇ１および核酸Ｈ１を含んでなり、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｉと、核酸Ｇ２および核酸Ｈ２を含んでなり、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｊとを含んでなる一体型核酸複合体Ｆの量を測定することにより一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する、請求項１１または１２に記載の方法。
  15. 　一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸結合タンパク質の結合部位を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　核酸Ｇ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
    　核酸Ｈ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
    　核酸Ｇ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および
    　核酸Ｈ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
    から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　核酸Ｇ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
    　核酸Ｇ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
    　核酸Ｈ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；または
    　核酸Ｈ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
    から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　構造変化の程度が、蛍光共鳴エネルギー転移を利用して測定される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　核酸が、ＤＮＡである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　核酸結合タンパク質が、転写因子である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 　核酸結合タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　マルチプレックスで行われる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 　被験物質存在下および非存在下において、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法を行う、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法。
  24. 　被験物質の標的となる核酸結合タンパク質とは結合しない核酸からなる核酸複合体の構造変化の程度を測定することをさらに含んでなる、請求項２３に記載のスクリーニング方法。
  25. 　末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを含んでなる、キット（ここで、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂは請求項４において定義された内容と同義である）。
  26. 　一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを含んでなる、キット（ここで、一体型核酸複合体Ｅは請求項１１に、一体型核酸複合体Ｆは請求項１４において定義された内容と同義である）。
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