CN101056980B - 结构型核酸指导的化学合成 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含核酸和化学化合物的组合物，所述组合物形成限定从反应中心延伸的3个或更多个干的星形结构。干由核酸双链体形成，并且化学化合物已作为3个或更多个化学基团的反应产物在反应中心形成。该组合物的优点是，在反应中心的化学基团之间提供了紧密的接近度，从而促进反应。本发明还涉及用于制备组合物的方法。该方法的优点是，它不需要预先合成大量的模板，并且它不依赖于密码子/反密码子识别来形成所编码的分子。

Description

结构型核酸指导的化学合成
发明领域
本发明提供了用于体外DNA展示技术的组合物和方法，所述技术允许展示各种分子，例如非天然的聚合物和小分子。此类方法的优点是可以构建组合文库并对其实施关于所需活性的选择、扩增和多样化的循环，从而允许分子进化。 
背景 
已开发了展示技术以组合核酸的信息储存和扩增能力与其他化合物的功能活性。展示技术依赖于功能实体和提供关于功能实体结构信息的核酸序列之间的关联。此类方法的优点是可以构建非常大型的文库，并就功能实体的所需活性进行探查。然后，具有所需活性的文库成员可以与不具有所需活性的文库成员分开，从而形成富集文库(enriched library)，其具有更大部分的具有所需活性的成员。这种方法被称为选择。随后，富集文库中的文库成员的结构可以通过其同族(cognate)核酸序列进行鉴定，从而甚至允许从微量的材料进行鉴定。 
一些展示技术进一步允许扩增富集文库而无需知道其成员的同一性；不仅是核酸序列而且还有功能实体。此类展示技术被称为“可扩增的展示技术”。当处理大型文库时这些技术特别有利，因为可以进行选择和扩增的重复循环，允许所需活性的富集增加。可扩增的展示技术的另一优点是可以进行选择、扩增和多样化的循环，从而利用与自然选择相同的原理进化具有所需功能的分子。这个过程被称为分子进化。 
已开发出了利用生物系统的展示技术，其中最著名的是噬菌体展示技术(Smith，Science，228，1315-7，1985)。然而，此类系统 局限于展示天然发生的产物例如蛋白质和肽。 
利用有机化学的灵活性(flexibility)的体外展示技术已得到描述。一个实例公开于US5723598中。该方法利用双官能团的分子；一个官能度能够接受化学基团和另一个官能度能够接受核酸序列。用于合成此类文库的方法通常称为“拆开(split)和混合”，由将双官能团分子混合和拆开为隔间(compartment)的循环组成。加入隔间特异性的化学基团和核酸序列对。从而使得核酸序列编码化学基团。随后将所有的双官能团分子混合并重复该过程以产生大型的组合文库。随后对文库实施选择并通过PCR扩增所选择的核酸序列，所述核酸序列可以用于通过常规分子生物学方法进行鉴定；克隆和DNA测序。 
另一实例公开于WO04/039825A2中，其中如此来制备组合文库，即循环进行在接近度(proximity)指导下向双官能团分子添加化学基团和核酸密码的同族对；所述双官能团分子具有1个能够接受化学基团的官能度和1个能够接受核酸序列的官能度。此外，使用所谓的转移单元的集合(repertoire)，其中化学基团与寡核苷酸联接(attach)，所述寡核苷酸包含编码区段(segment)和能够与双官能团分子退火的区段。转移单元的集合与双官能团分子退火，这允许密码被酶促转移给双官能团分子，以及指导化学基团与完全相同的双官能团分子反应。这个过程可以重复以形成大型组合文库。 
可以对上述文库实施选择以形成富集文库。随后通过编码性核酸可以推导出富集文库成员的合成史。然而，这些方法的局限性是不能扩增富集文库。 
已经描述了利用有机化学的灵活性以及选择、扩增和多样化的循环的体外展示技术。这些方法依赖模板的使用。 
一个利用“拆开和混合”原理的实例描述于WO00/23458中。使用ssDNA模板文库，每个模板包含化学反应位点和几个位置的密码子区段。通过与对于给定密码子位置的反密码子序列的集合杂交来分隔模板。随后，进行隔间特异性的化学反应以修饰模板上的反应位点。随后将模板混合，并通过使用其他密码子位置重复该过程以形成组合文 库。 
另一个利用“单罐(single-pot)”原理的实例描述于WO02/074929A2中。使用寡核苷酸模板文库，每个模板包含化学反应位点和几个位置的密码子区段。此外，利用转移单元的集合，该方法由寡核苷酸反密码子序列和化学反应性基团组成。模板文库与对于给定密码子位置的转移单元的集合杂交。这使在杂交的转移单元上的化学基团与在杂交的模板上的反应位点接近，因此这指导同族对的化学反应。随后，利用其他密码子位置来重复这个过程以形成组合文库。 
上述用接近度来指导密码和化学基团的同族对的局限性在于模板寡核苷酸的线性结构。作为线性的结果，密码子和化学反应位点之间的距离将会随着密码子位置不同而不同。对于离反应位点较远的密码子位置，接近度指导变弱，因为局部浓度作为距离的函数以三次方的方式下降。对于含有较多密码子位置和较复杂密码子的复杂文库，这个缺点变得更为明显。这个问题在WO04/016767A2中得到解决，其中转移单元除反密码子区段外还包含恒定区段，所述恒定区段与模板上靠近反应位点的恒定序列互补。因此，通过使转移单元与模板杂交导致所讨论的密码子位置和恒定区段之间的模板序列被凸出，以形成所谓的ω结构。构想是，密码子区段负责特异性和恒定区段负责接近度。WO04/016767A2还提出了所谓的模板的T-构造，其中模板上的反应位点位于模板中间，密码子位置散布在每一侧。因此，距离问题是所谓的“切成两半(cut in half)”。 
WO2004/056994A2公开了与WO02/074929A2或WO04/016767A2相似的方法，差别是将模板切成较小的序列，在申请中称为连接性多核苷酸。连接性多核苷酸连接转移单元以使这些达到反应接近度。在某些实施方案中，连接性多核苷酸可以包括反应化学基团。为了获得编码的分子，该方法依赖于反应前的密码子/反密码子识别。 
随后，对上述模板指导的文库实施选择以形成富集文库。然后，通过编码性核酸可以推导出富集文库成员的合成史。通过例如易错PCR还可以扩增富集文库并使其多样化，从而允许分子进化。 
这些方法的局限性是，必须产生大量模板，这是繁琐的，因为模板必须具有相当的长度以确保正确的密码子/反密码子杂交。在使用多个较小序列来进行最终经指导的合成的方法中，待合成的序列的数目比实际的文库大小高得多。 
利用模板的现有技术方法具有这样的缺点，即编码依赖于密码子和反密码子序列的杂交。有时，单链寡核苷酸之间的杂交将无需精确的互补性而进行。在文库构建的情况下，结果是编码和合成史之间的关联丧失。因此，在选择时，正密码可以是被取消选择的和负密码可以是被选择的。对于较复杂的文库，这个缺点变得更为明显，因为相对于数目、长度和序列，单链寡核苷酸的复杂性也增加。这使得该过程更难以控制。 
如上所述，允许展示各种化合物种类、选择、扩增和多样化的体外展示技术已得到开发。然而，仍需要不断改进，特别是关于文库构建和多样化的质量。本发明提供了用于产生所编码的分子的方法，其中该方法不需要预先合成大量模板。此外，本方法不依赖于密码子/反密码子识别来形成所编码的分子。 
发明概述 
本发明涉及体外展示技术，其利用有机化学的灵活性，并允许选择、扩增和多样化的循环。 
特别地，本发明涉及包含核酸和化学化合物的组合物，所述组合物形成限定从反应中心延伸的3个或更多个干的星形结构，其中所述干由核酸双链体形成，并且所述化学化合物已作为3个或更多个化学基团的反应产物在反应中心形成。 
核酸形成超级结构，其中不同的区段互相杂交从而形成类似星的的结构。星形结构包括反应中心和多个干。在反应中心内，化学化合物已作为3个或更多个化学基团的反应产物进行制备。干是核酸双链体，即干包括2个互相互补的杂交区段，它们的互补性足以在有利于 化学基团反应的条件下形成双链体以便形成化学化合物。 
至少一个干从中心放射状延伸。适当地，3个或更多个干从反应中心放射状向外延伸。认为干的双链体核酸将化学基团聚集在一起以便获得反应接近度。化学基团之间建立的接近度增加了局部浓度并提高了反应发生的机会。星形结构中3个或更多个干的存在创造了强的超级结构，它甚至在其中单个双链体将分开成为两个分离的单链核酸的条件下也是稳定的。因此，星形结构使得能够使用通用的反应条件以促进化学基团之间的反应。本文报道的实验显示，3个干的星形结构对于指导介质中的有机合成来说足够稳定，所述介质包含过量的35％乙腈和四氢呋喃和过量的40％DMF。在本发明的某些实施方案中，星形结构包括4、5、6、7个或更多个与共同的反应中心相连的干。当干的数目增加时，星形结构的稳定性也增加。 
核酸被划分为具有某功能的各个部分。在本发明的某一方面，核酸包括鉴定所述一种或多种化学基团的一种或多种密码子，所述化学基团已参与所形成的化学化合物的形成。密码子区段的存在使得不仅能够利用核酸来促进反应接近度，还能够利用核酸来编码已参与化学化合物形成的一种或多种化学基团。一种或多种密码子的存在对于解码目的特别有用。当所形成的化学化合物以少量存在或以与其他化合物的混合物形式存在时，通过分子生物学技术可以很容易地进行鉴定。 
鉴定化学基团的密码子可以存在于形成星形结构的核酸的任何地方，即密码子可以存在于反应中心或存在于反应中心附近，存在于杂交区段中或存在于星形结构的其他部分中。在本发明的某一方面，密码子位于干的末端。位于干的指向远离中心的末端的密码子允许更自由地设计核酸星形结构，因为末端的密码子无需参与双链体的形成或反应中心环境的形成。 
干可以具有平头末端、粘性末端，或可以存在环。当它计划连接干与另一核酸时，具有平头末端或粘性末端的干可能是优选的。在某一实施方案中，环在干的末端形成。环在两条链之间形成物理连接，从而在核酸超级结构的各个部分之间形成共价键。在某一实施方案中， 环存在于干的所有末端以便形成环状核酸。在另一实施方案中，环存在于除了一个以外的所述干的所有末端上，以便形成邻接的核酸序列。适当地，邻接的序列包括引发位点以利用聚合酶或另一种核酸活性酶来酶促延伸核酸。在适当的情况下，引发位点存在于没有环的干上。适当地，核酸包含用于DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的引发位点。因此，环使得能够制备展示所形成的化学化合物的双链延伸产物。 
重要地，延伸产物包括通常线性的双链体，即互补性链已通过延伸反应形成。延伸反应破坏反应中心，因此先前通过反应中心中的反应而形成的化学化合物展示于介质中。如本说明书稍后讨论的，化学化合物的展示使得能够利用关于延伸产物文库的各种选择策略。 
选择后，扩增核酸的可能性与鉴定目的特别相关，因为化学化合物可以被鉴定甚至在其中它只以微量浓度出现的情况下。邻接的核酸序列适当地包括所有反应物的密码子，所述反应物已参与所编码的化学化合物的形成。 
在本发明的一个特别优选的实施方案中，密码子位于干-环结构的非碱基配对部分。在环中密码子的存在允许在设计中利用核苷酸的任何组合，因为密码子的特异性序列对于杂交和反应能力没有实质影响。 
在本发明的一些方面，限制酶切位点存在于干-环结构中。取决于所使用的特异性核酸内切酶，可以打断干-环结构的一条或两条链。在某一实施方案中，只有靠近环的一条链是有缺口的，由此形成单链核酸区段。所述单链核酸区段合适地包含密码子。对于这个目的有用的酶是N.Bbvc IA。在另一实施方案中，打断两条链，并形成粘性末端，即单链核酸突出部分。适当地，密码子存在于单链突出部分中。在本发明的一个方面，优选加入至少与环的部分核酸序列互补的辅助寡核苷酸。在适当的条件下，辅助寡核苷酸与环序列杂交并形成适合于限制性内切酶的底物。 
星形结构的干可以具有任何合适的长度。一般地，干包括具有至少80％互补性的2个杂交区段，并且每个杂交区段由12个或更多个核苷酸组成。互补性一般为90％或以上，例如95％或以上。对于某些应用杂交区段可以包含少于12个核苷酸，在所述应用中星形结构的稳定性可以分给例如11、10、9、8、7或6个核苷酸。然而，一般而言，高稳定性是希望的。在大多数条件下的适当稳定性一般在每个杂交区段包含18个或更多个核苷酸时获得。当使用不利于杂交的条件时，即远高于环境的温度、高盐浓度、或存在有机溶剂，通常使用含20个或更多个核苷酸的杂交区段。 
单个的化学基团反应后，所形成的化学化合物优选与核酸共价联接。在某些应用中，可能希望利用杂交将所形成的化学化合物与星形结构的核酸联接；然而，共价联接确保化学化合物和核酸部分在后续选择过程中仍在一起。 
在反应中心反应的化学基团可以以任何适当的方式与核酸缔合(associate)。例如，反应前的化学基团与核酸共价联接。通常地，一个或多个共价联接在与反应同时或在反应后进行切割。共价键可以设计为可切割的或耐久的。此外，可切割的键可以设计为紧在反应后被切割或设计为在反应后的步骤中被切割。 
通常地，化学化合物通过联接在核酸上的化学基团和任选的一种或多种另外的反应物的反应而形成。所述反应物可以来源于任何来源，包括作为不与核酸缔合的游离反应物加入到介质中的化合物。所述另外的反应物可以是支架、交联剂、活化剂、脱保护剂等。 
根据本发明的星形结构可用于产生与遗传密码相关联的不同化学化合物的文库。因此，本发明还涉及星形结构文库。每个星形结构可以以几个拷贝的形式存在于介质中，并且介质一般包括包含不同化学化合物的星形结构。例如，本发明的文库可以包括至少1000种不同的化学化合物，优选106种不同的化学化合物，和更优选109种不同的化学化合物。 
在另一方面，本发明还可以描述为涉及例如用于合成大型文库的方法，所述文库通过由互相互补的寡核苷酸所形成的“星形结构”与编码性核酸相关联。这通过使包含2个区段的寡核苷酸杂交来获得，其中一个寡核苷酸的朝向3′末端的区段与下一个寡核苷酸中朝向5′末端的区段杂交，等等。最终，最后一个寡核苷酸的朝向3′末端的区段与第一个寡核苷酸的朝向5′末端的区段杂交。因此，每个寡核苷酸上的2个杂交区段之间的中间部分指向所形成的环的中心，而末端指向外面，得到星形结构。因此，当使用3种类型的寡核苷酸时，形成3个干，当使用4种类型的寡核苷酸时，形成4个干，等等。化学反应性基团与每个寡核苷酸上的中间部分缔合，从而允许由接近度指导在中心发生化学反应。此外，密码子方便地位于每个寡核苷酸上的杂交区段的外部，从而允许参与形成反应产物的化学基团的编码。具有缔合的化学基团的寡核苷酸在本文中被称为载体模块(carriermodule)。因此，载体模块含有化学基团、2个位置特异性区段和密码子。当使用对于每个位置的载体模块的集合时，允许形成编码的组合文库。根据某一实施方案，当每个干中除了一个末端以外的末端经环形成而进行连接以形成具有5′和3′末端的连续的寡核苷酸时，使经装配的寡核苷酸变得可延伸或可扩增。因此，由1个干和多个干-环组成的星形结构可以通过PCR进行扩增或用合适的酶进行延伸。因此，可以对组合的展示文库实施选择，并通过其编码性寡核苷酸来鉴定富集文库成员。 
相应地，本发明的一个方面涉及用于形成一种或多种化学结构的方法，其包括下列步骤： 
(i)提供N(N＝3至100)个载体模块，其包括： 
(1)第1个位置的载体模块，具有 
i)能够与第N个位置的载体模块的核酸区段杂交的核酸区段，和 
ii)能够与第2个位置的载体模块的区段杂交的核酸区段， 
(2)第n个位置的载体模块(n＝2至N-1)，具有能够与第n-1个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第n+1个载体模块的区段杂交的核酸区段，和 
(3)第N个位置的载体模块，具有能够与所述第N-1个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与所述第1个载体模 块的区段杂交的核酸区段， 
其中 
至少3个所述载体模块包含位于在所述杂交区段之间的中间部分或其附近的缔合的化学基团(CG)，和任选地包含位于所述杂交区段之一的外部的密码子区段； 
(ii)在允许所述杂交区段进行杂交的条件下使所述载体模块接触，从而使所述化学基团接近，其中所述形成的化学化合物与至少一个所述载体模块缔合。 
N指在化学结构的形成中使用的载体模块的总数目。因此，当在化学结构的形成中使用3个载体模块时，N为3，当在化学结构的形成中使用4个载体模块时，N为4，等等。n指载体模块的特定位置。 
因此，当N为3时，(1)使用的第1个位置的载体模块具有能够与第3个位置的载体模块的核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第2个位置的载体模块的区段杂交的核酸区段；(2)(n＝2)使用的第2个位置的载体模块具有能够与第1个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第3个载体模块的区段杂交的核酸区段；和(3)使用的第3个位置的载体模块具有能够与所述第2个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与所述第1个载体模块的区段杂交的核酸区段。 
当N为4时，(1)使用的第1个位置的载体模块具有能够与第4个位置的载体模块的核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第2个位置的载体模块的区段杂交的核酸区段；(2)(n＝2)使用的第2个位置的载体模块具有能够与第1个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第3个载体模块的区段杂交的核酸区段；和(n＝3)使用的第3个位置的载体模块具有能够与第2个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第4个载体模块的区段杂交的核酸区段；和(3)使用的第4个位置的载体模块具有能够与所述第3个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与所述第1个载体模块的区段杂交的核酸区段。 
当N为5时，(1)使用的第1个位置的载体模块具有能够与第5个位置的载体模块的核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第2个位置的载体模块的区段杂交的核酸区段；(2)(n＝2)使用的第2个位置的载体模块具有能够与第1个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第3个载体模块的区段杂交的核酸区段；和(n＝3)使用的第3个位置的载体模块具有能够与第2个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第4个载体模块的区段杂交的核酸区段；和(n＝4)使用的第4个位置的载体模块具有能够与第3个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与第5个载体模块的区段杂交的核酸区段；和(3)使用的第5个位置的载体模块具有能够与所述第4个载体模块的所述核酸区段杂交的核酸区段，和能够与所述第1个载体模块的区段杂交的核酸区段。 
上述方法随后可以是下列步骤：提供允许第n-1个模块与第n个模块以及第N-1个模块与第N个模块的末端进行连接的条件，从而形成具有干-环结构和缔合的化学化合物的邻接的核酸分子。因此，当N为3时，允许第1个模块的末端与第2个模块的末端连接，并且允许第2个模块的末端与第3个模块连接。当N为4时，(n＝2)允许第1个模块的末端与第2个模块的末端连接，(n＝3)允许第2个模块的末端与第3个模块连接，并且允许第3个模块的末端与第4个模块连接。当N为5时，(n＝2)允许第1个模块的末端与第2个模块的末端连接，(n＝3)允许第2个模块的末端与第3个模块连接，(n＝4)允许第3个模块的末端与第4个模块连接，并且允许第4个模块的末端与第5个模块的末端连接。 
根据本发明的进一步的方面，第N个位置的载体模块可以与第1个载体模块连接，以便形成环状核酸。 
根据上述方法制备的包含核酸结构和缔合的化学化合物的组合物是新型的，因为载体模块形成的新型“星形结构”不同于现有技术形成的结构。参见例如在上文的背景部分中所讨论的现有技术。 
在本发明的一个优选方面，提供了方法，它确保反应化学基团之 间的高度接近度和所形成的化学化合物的合成史的完整遗传密码的扩增。因此，在一个优选方面，本方法包括： 
在允许杂交区段进行杂交的条件下使载体模块接触，从而使反应性基团达到反应接近度；和 
提供允许反应性基团进行反应的条件，其中所形成的化学化合物与至少一个载体模块缔合；和允许第n-1个模块与第n个模块以及第N-1个模块与第N个模块的末端进行连接的条件，从而形成具有干-环结构和缔合的化学化合物的邻接的核酸分子。 
根据一个优选实施方案，N为3、4、5、6、7。还优选地，每个载体模块包含位于在杂交区段之间的中间部分或其附近的缔合的化学基团(CG)，和位于杂交区段之一的外部的密码子区段。 
载体模块的接触可以顺次进行，即载体模块可以以任何顺序在单个载体模块之间进行接触，或接触可以同时进行，即所有的载体模块或至少实质量的载体模块在杂交条件下混合在一起以便形成超分子复合物。当进行化学基团的顺次反应并且只使用装配整个星形结构所需的载体模块总量的一部分时，可以使用辅助性寡核苷酸来装配星形结构，由此形成反应中心。因此，当在化学化合物形成中的步骤涉及通过各自杂交区段的杂交来装配2个载体模块时，可以加入具有与未杂交的杂交区段逆向互补的区段的辅助性寡核苷酸以形成星形结构。 
在联接至载体模块的化学基团已在反应中心中紧密接近后，实施反应。可以设计化学基团从而使得当基团进入互相的反应距离时反应立即发生，或可以设计基团从而使得外部组分是反应发生所必需的。外部组分可以是实现反应的反应物、光子、电磁或任何其他刺激。在本发明的某一方面，使用正交化学(orthogonal chemistry)，即设计化学基团从而使得反应顺序是被指导的。 
反应中心由环绕所述中心的干限定。已提出，反应中心中2个反应物之间的距离少于10nm。假定反应中心是球形的；则可以计算出反应物的浓度为1mM。在生物学的情况下，这种大小的浓度被视为高浓度，并且可以假定反应在合理的时间内进行。此外，当载体模块已 按经调整的摩尔量进行给予时，介质中游离反应物的浓度非常低，因此反应中心中的反应比非指导的反应要有利得多。 
载体模块的中间部分可以包含任何适当的化学基团。为了允许通过例如聚合酶进行酶促延伸，载体模块的中间部分合适地包含化学键或1-20个核苷酸。可以修饰核苷酸以在反应中心中获得某些反应条件。例如，可以用亲脂性基团修饰中间部分的核苷酸以提供缔合的化学基团的高可动性和反应性。化学基团可以与各种不同位置处的载体模块相缔合。在一个方面，化学基团与中间部分的核碱基(nucleobase)缔合。在另一方面，化学基团与中间部分的磷酸二酯键缔合。 
当化学基团与主链联接时，联接点一般在核苷间键的磷上。当核碱基用于联接化学基团时，联接点通常在嘌呤或7-脱氮-嘌呤的第7位上或在嘧啶的第5位上。核苷酸可以通过间隔物部分而与化学基团的反应性基团隔开。可以设计间隔物从而使得由该反应性基团所取样的构象空间对于与在反应中心中的另一化学基团的反应性基团的反应来说是优化的。一般而言，化学基团通过一个或多个共价键与中间部分缔合。 
连接可以在反应前、反应同时或反应后进行，并且连接可以根据实验者的选择而酶促或化学地进行。为了减少介质中游离的未杂交的载体模块的量，一般希望在反应前连接载体模块。 
所形成的化学化合物可以通过各种化学相互作用与核酸缔合。根据一个优选方面，所形成的化学化合物与至少一个所述载体模块或连续的核酸分子共价缔合。在所形成的化学化合物和核酸之间的相对较强的缔合，例如共价连结，在筛选文库的过程中是有用的，因为我们可能需要严苛的条件，所述严苛的条件可以破坏较弱的键，例如氢键。 
在本发明的一个优选方面，提供具有用于DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的引发位点的一个或多个载体模块。引发位点的存在帮助扩增对于化学基团的遗传密码，所述化学基团已在化学化合物的形成中发生反应。当不存在连接时，即对于每个化学基团的遗传密码保留了通过杂交聚拢的分开的实体，优选地每个载体模块包含引发位点。 在已进行文库选择后，可以获得关于哪些化学基团已参与成功的化学化合物形成的信息，所述成功的化学化合物即具有所需特性的化学化合物。获得这种信息的一种方法是通过众所周知的方法例如QPCR或与微阵列相组合的标准PCR来定量扩增产物。该信息可以在多样性减少的第2代文库的形成中使用，因为只需要在文库中包括成功的载体模块。多样性减少的文库也是集中的(focused)文库，因为具有所需特性的化学化合物的丰度更高。 
当2个或更多个载体模块连接在一起时，可以获得反应物的信息，所述反应物已一起参与具有所需特性的化学化合物的形成。优选地，所有的载体模块连接在一起以便形成线性核酸或环状核酸。因此，当2个或更多个载体模块连接在一起时，需要单个引发位点以扩增包含2个密码子的邻接的核酸。根据一个优选实施方案，本发明方法包括至少在第1个载体模块和/或第N个载体模块中的用于DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的引发位点。当所有的载体模块连接在一起时，即第1个载体模块与第n(n＝2至N-1)个载体模块连接，所述第n个载体模块与第N个载体模块连接，当引发位点位于末端之一时，可以延伸核酸。为了减少所形成的化学化合物仍隐藏在反应中心中的风险，优选在选择过程前进行延伸。邻接核苷酸的延伸有效地将所形成的化学化合物展示给介质和可能存在于其中的任何靶。 
优选地，用于正向引物杂交的引发位点位于一个末端，和用于反向引物杂交的引发位点位于另一个末端，从而允许根据聚合酶链式反应(PCR)的规程进行扩增。合适地，在已进行选择后进行PCR扩增以产生具有所需特性的结构的遗传材料的更多拷贝。 
因此，本发明的第二个方面涉及组合物，其包含核酸和缔合的化学化合物的结构或超过一种此类结构的文库，所述结构可通过上述方法获得。 
通过使用一个或多个位置上的载体模块的集合可以形成与编码化学基团的核酸缔合的化学化合物的文库，所述化学基团已参与所述化学化合物的形成。 
如本文所述的文库可以用于筛选目的化合物。一般希望文库尽可能大以增加发现具有所需特性的化合物的可能性。在本发明的某一方面，目的化合物的特性是与靶结合的能力。一般地，假定发现对于靶具有高亲和力和特异性的化合物的可能性随着文库大小增加而增加。因此，根据本发明的文库合适地包括超过103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个与编码合成史的核酸缔合的不同化学化合物。 
为了获得文库，可以使用在许多位置上的载体模块的集合。在本发明的一个方面，至少一个位置上的集合包括至少10个不同的载体模块。在某一方面，至少2个位置上的集合包括至少10个不同的载体模块。为了在同一容器中获得含一百万种不同化学化合物的文库，利用在3个不同位置上的100个载体模块可以形成本发明的多重结构。换言之，正好300个载体模块的合成使得能够形成含一百万种化学化合物的文库。类似地，利用在4个不同位置上的100个载体模块可以形成含一亿种化学化合物的文库。 
本发明还涉及用于执行模块置换的方法。该方法包括下列步骤： 
a)提供单链的邻接核酸序列，其包含N个杂交区段和互补性杂交区段以及N-1个在所述杂交区段与所述互补性杂交区段之间的非杂交性区段， 
b)在有利于分子内杂交的条件下使核酸杂交，从而形成至少包含N-1个干-环和1个干的连续的核酸； 
c)在所述干或环中导入断口(break)，从而产生至少包含密码子区段的突出部分； 
d)提供第1组载体模块，其至少具有： 
能够与所述干杂交的核酸区段、能够与相邻的干-环的干杂交的核酸区段、任选的缔合的反应性基团、和反密码子区段； 
d)提供允许密码子和反密码子区段杂交的条件；和 
e)提供允许所述杂交的载体模块与所述突出部分的隐性(recessive)末端进行酶促或化学连接的条件；并施行下列步骤： 
i)用限制性内切酶消化与所述密码子序列相邻的干-环的干或环，从而制成至少包含下一个密码子区段的突出部分；和 
ii)使核酸变性；和 
iii)在有利于分子内杂交的条件下进行杂交，从而形成N-1个干-环和具有至少包含所述下一个密码子区段的突出部分的1个干；和 
iv)任选地提供允许所述反应性基团进行反应的条件，其中所形成的化学化合物与至少一个所述载体模块缔合；和 
v)提供下一组载体模块，其至少具有： 
能够与所述干杂交的核酸区段，和能够与所述相邻的干-环的干杂交的核酸区段，和任选地具有缔合的反应性基团，和具有反密码子区段；和 
vi)提供允许杂交的载体模块与所述突出部分的隐性末端进行酶促或化学连接的条件；和将步骤i)至vi)重复N-1次；和 
f)在部分由所述第1组载体模块组成的所述干-环结构中导入断口，至少让所述反密码子区段与所述第1个载体模块相连；和 
g)使核酸变性；和 
h)在有利于分子内杂交的条件下进行杂交，从而形成N-1个干-环和1个干；和 
i)任选地，提供允许所述反应性基团进行反应的条件，其中所形成的化学化合物与至少一个所述载体模块缔合。 
步骤a)中使用的邻接的核酸序列可以由许多来源提供。根据第一个方面，核酸通过上述方法提供，然而使用不携带化学基团的伪载体模块。当表示载体模块的这些核酸连接在一起时，形成线性或环状核酸。根据第二个方面，步骤a)的邻接的核酸序列可通过施行酶促延伸反应而获得以展示所形成的化学化合物。因此，在星形结构形成后，在步骤a)中可以使用单链延伸产物或与延伸产物互补的链。必要时，可以对延伸产物实施多核苷酸扩增，例如PCR，以扩增所述核酸的拷贝数。 
在某一方面，步骤a)、b)或c)中的邻接的核酸序列通过下列步骤获得：将所述PCR产物的有义链固定在固体支持物上，分离所述固体支持物，允许所述有义链自杂交以便形成所述星形结构，和任选地，打断联接所述自杂交的星形结构与所述固体支持物的干，从而从所述固体支持物释放出所述星形结构。 
固定有义链的一种合适的方法是将生物素联接在产生有义链的引物上。然后，可以将有义链联接在固体支持物上，例如用链霉抗生物素蛋白包被的珠。取决于固体支持物的特性，它可以通过多种方法从剩余介质中分离。目前，优选使用磁性珠，其可以容易地通过磁体进行分离。在将固体支持物洗涤过多次后，允许有义链自杂交以重新形成星形结构。在一个优选的方面，通过瞬间冷却来进行重折叠。星形结构可以在模块置换过程中自始至终保留在固体支持物上，或星形结构可以从固体支持物上切割下来。合适地，用限制性内切酶来切割联接固体支持物与重折叠的星形结构的干。限制性内切酶进行切割的能力实际上是确定分子内折叠的测试。 
在本发明的某些方面，在环中切割星形结构可能是合适的。因为大多数限制性内切酶只识别双链核酸作为底物，所以不可能利用限制性内切酶立即在环中切割。因此，本发明包括在消化步骤前加入与环序列互补的辅助寡核苷酸的另外步骤，以在环中形成适合于限制性内切酶的双链底物。 
本发明还涉及用于筛选含有超过一种化学化合物的文库的方法，其包括： 
在所述文库中探查有着具有所需特性的化学化合物的文库成员； 
将具有所需特性的文库成员与不具有所需特性的文库成员分开；和 
从而获得具有所需特性的文库成员的富集汇集物(enrichedpool)。 
必要时，可以分离并表征具有所需特性的文库成员的富集汇集物。然而，这种方法的优点之一是无需分离富集汇集物。在一个优选实施 方案中，对富集汇集物实施核酸扩增法以增加指示具有所需特性的化学化合物的合成史的遗传材料。经扩增的核酸汇集物(pool)代表了具有所需特性的化合物的富集文库，所述汇集物可以被解码以便鉴定参与合成具有所需特性的化学化合物的反应物。然而，如果富集汇集物大于能够容易解码的核酸总量时，则本发明提供了利用上述执行模件置换的方法来重新装配由富集文库成员或代表此类富集文库的核酸编码的化学化合物的可能性。 
在一个实施方案中，本发明提供了用于扩增具有所需特性的文库成员的富集汇集物的方法。该方法包括允许经PCR扩增的寡核苷酸在有利于分子内杂交的条件下进行杂交，由此重新形成由一个干和多个干-环组成的星形结构。没有环的干优选包含限制性内切酶的识别位点，所述酶在其识别序列外部切割并在消化后产生突出部分。可以方便地使用在所形成的突出部分中的序列冗余性以包含密码子。随后，干的限制性内切酶消化产生关于这个第1个位置的密码子特异性突出部分。经限制性内切酶消化的星形结构随后与载体模块的集合杂交，所述载体模块包含关于第1个位置的2个恒定区段以及化学基团和反密码子的同族对。因此，密码子/反密码子杂交允许通过DNA连接酶来连接合适的载体模块和星形结构的对。邻近的干-环同样包含另一种限制性内切酶的识别位点，所述另一种限制性内切酶能够留下关于这个第2个位置的密码子特异性突出部分。因此，利用这个第二种限制性内切酶的消化消除了经PCR扩增的第1个模块与所述结构的其余部分的共价键。使星形结构变性，随后允许其在有利于分子内杂交的条件下杂交。由此重新形成星形结构，但现在在位置1(具有缔合的化学基团)上具有新的载体模块，并且没有环的干现在位于位置2上。这个过程可以循环进行以置换所有的位置，以允许在接近度指导下进行化学基团的正确组合的化学反应。因此，可以进行选择和扩增循环直至完成所需的富集。 
干中的断口可以通过多种方法导入，例如通过限制性内切酶，例如RNA酶、核酸内切酶III、核酸内切酶VIII、APE1、Fpg，或通过化 学切割或光切割。 
在上述模块置换方法的步骤a)中使用的邻接的核酸序列可以通过“培育(breeding)”来提供。在某一实施方案中，培育方法包括下列步骤： 
用2种连续的限制性内切酶消化来源于富集文库的、分子间杂交的核酸结构，所述酶消除了在所讨论的模块和其余结构之间的共价键， 
使所述经消化的结构变性， 
允许来自所述经消化的结构的核酸片段再杂交，从而允许交换指定所讨论的模块的核酸部分以获得培育，和 
连接所述合适的末端。 
根据这种方法，载体模块或表示载体模块的核酸部分可以进行改组。所述改组允许基因汇集物的多样化，类似于在减数分裂生物系统中的培育。当在允许再杂交之前加入在第1代文库形成中不存在的、表示载体模块的核酸区段时，这种方法可以被修饰。可替代地，在允许再杂交之前可以就这样加入载体模块。当将新的遗传材料加至基因汇集物时，这类似于在生物系统中的突变。执行文库世代之间的培育和突变操作的可能性允许在寻找新的药物候选物中进行与自然进化过程非常类似的进化。 
因此，在某一实施方案中，本发明提供了用于富集文库多样化的方法，从而允许分子进化。在关于扩增展示文库的上述方法中，在每一轮模块置换循环中文库的一部分用2种连续的限制性内切酶消化，所述限制性内切酶消除了所讨论的模块和其余结构之间的共价键。使星形结构变性并与所讨论位置的载体模块的集合杂交。因此，位置特异性恒定区段指导杂交，相当于形成原始文库。连接合适的末端，并且将所形成的产物与密码子指导装配的文库的一部分合并，导致多样化。因此，可以进行选择、扩增和多样化的循环，从而允许分子进化。 
在另一实施方案中，本发明提供了用于培育富集文库，从而允许分子进化的方法。在用于扩增展示文库的上述方法中，在每一轮模块置换循环中文库的一部分用2种连续的限制性内切酶消化，所述限制 性内切酶消除了所讨论的模块和其余结构之间的共价键。使星形结构变性并杂交。因此，位置特异性恒定区段指导杂交，并允许所讨论的模块进行交换，即培育。连接合适的末端，并且将所形成的产物与密码子指导装配的文库的一部分合并，导致多样化。因此，可以进行选择、扩增、多样化和培育的循环，从而允许分子进化。 
在另一实施方案中，本发明提供了用于形成聚合物或小分子的组合展示文库的方法。通过利用例如正交化学、保护/掩蔽基团、顺次混合载体模块或不含CRG的载体模块，化学反应可以同时或顺次进行。 
在一个实施方案中，本发明提供了用于形成催化活性的组合展示文库的方法。在这一方面，载体模块与反应位点的官能团缔合，并且星形结构提供关于这些官能团三维排列的框架。 
上述方面和实施方案显示了超过现有技术的明显优点。为了列举一些，本发明的各种可能的实施方案显示出一个或多个下列优点：1)用于装配组合展示文库的独特方法，2)用于接近度指导化学反应的独特结构，3)化学反应高度独立于密码子序列，因为这些通过恒定区段而与反应位点隔开，4)在扩增展示文库方面的高度精确性，因为只有在相关位置上的密码子能够指导新的载体模块，因为只有这些包含促进连接的末端，和5)如果偶然发生了不正确的密码子/反密码子指导，则编码和展示之间的关联仍将存在，因为新的载体模块提供了CRG和密码。 
附图简述 
图1a公开了星形结构形成中的步骤，其中化学基团同时进行反应。 
图1b显示了星形结构形成中的步骤，其中化学基团顺次进行反应。 
图1c公开了采用化学化合物的会聚合成(convergent synthesis)的方法。 
图1d显示了用于形成文库的5步骤法，在所述文库中每个成员有 效展示所形成的化学化合物。 
图1e公开了其中在化学基团反应后添加环的方法。 
图2a公开了通过双特异性寡核苷酸的集合来自装配组合文库的方法。 
图3显示了亲和力选择中的5个步骤。 
图4a公开了文库形成中的步骤。 
图4b公开了富集文库的培育和突变的原理。 
图5公开了在导致形成富集文库的方法中的步骤。 
图6显示了分子进化的原理。 
图7显示了涉及固定的底物的一个本发明实施方案。 
图8公开了实施例1的实验结果。 
图9描述了在实施例2中报道的实验的结果。 
图10显示了根据实施例3的实验的结果。 
图11公开了在实施例4中报道的实验的结果。 
图12显示了在实施例5中描述的实验中获得的凝胶。 
图13描述了来自实施例6的非变性PAGE凝胶。 
图14显示了来自在实施例7中报道的实验的凝胶。 
图15公开了实施例8的重折叠实验的凝胶。 
图16是实施例9的设计示意图。 
图17显示了由在实施例9中报道的实验产生的凝胶。 
图18公开了由在实施例9中报道的实验产生的凝胶。 
图19显示了在实施例10中报道的反应设计的各种结构。 
图20显示了由在实施例12中公开的实验产生的2个凝胶。 
图21公开了来自在实施例13中报道的实验的凝胶。 
图22显示了来自在实施例14中报道的实验的凝胶。 
图23显示了来自在实施例15中报道的实验的凝胶。 
图24公开了来自在实施例16中公开的实验的凝胶。 
图25显示了在实施例17中显示的实验的结果。 
图26公开了在实施例18中所使用的实验策略的概括略图。 
图27显示了在实施例18中所使用的方法的单个步骤的变性PAGE凝胶。 
图28显示了在实施例18中报道的结合测定的变性PAGE凝胶。 
图29显示了在实施例18中报道的PCR扩增凝胶。 
图30显示证明还原性氨化发生的凝胶图像。 
图31公开了证明脲联接发生的凝胶图像。 
图32显示了关于星形结构的电迁移率的研究的凝胶。 
图33显示了转变过程的示意性图示。 
图34显示了在实施例22中报道的实验的结果。 
图35显示了在实施例22中报道的实验的结果。 
图36显示了在实施例22中报道的实验的结果。 
发明详述 
核酸
如本文所述的由核酸编码的化学合成允许生产组合展示文库和进行广泛多样的化学化合物例如小分子和非天然聚合物的选择、扩增和进化。核酸起多重功能的作用，例如，它使化学反应物聚在一起，指导化学反应物的三维排列，储存关于化学合成史的信息，指导所选择的化学反应物组合的正确匹配，和允许化学化合物的多样化和培育。 
该方法可以用于同时装配一个分子、万亿个分子或甚至更多的分子。 
该方法允许分离配体或药物，所述配体或药物的特性优于通过传统合理设计和组合的药物发现方法而分离的那些，因为可以在化学空间内系统搜索具有所需特性的配体。 
已显示，核酸指导的化学合成为广泛的现象，不仅限于核酸性质的化合物，还可应用于指导在广泛条件下的广泛化学反应(WO2004/016767，WO 2002/074929A2)。这特别重要，因为大多数目的分子不类似于核酸或核酸类似物。参与最终化学化合物形成的化学基 团可以在一个步骤中转移至支架上的接受性化学实体，或者化学基团可以在两个步骤中进行转移，其中第一个步骤包括化学基团和接受性实体之间的交联，和第二个步骤包括从载体模块上切割下化学基团以完成转移。前一反应类型的反应的例子是已联接有充当活化剂的经取代的5元N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)环的载体模块，即在与NHS环相连的氧原子和待转移的化学基团之间形成不稳定的键。化学基团可以转移给受体亲核基团，一般为胺基团，它可以存在于支架上。将其余片段转化为反应的离去基团。当化学基团通过羰基与活化剂相连并且受体基团是胺时，支架上形成的键将是酰胺键。 
两步反应的例子是所谓的烯丙基甘氨酸反应。在第1个步骤中，包括羧酸或其衍生物的化学基团与亲核基团例如胺反应。化学基团与烯丙基甘氨酸基团联接，所述烯丙基甘氨酸基团可以在第2个步骤中被碘切割开以释放化学基团。两步反应法更详细地公开于WO2004/039825中，其内容引入本文作为参考。两步反应策略的另一例子更详细地显示于实施例10中。 
在核酸指导下合成组合展示文库的关键重要性是反应物的接近度指导，这确保了反应有效性以及编码和展示的正确关联。通过用某种类型的连接体将反应物缔合在一起而获得反应物的接近。接近度也可以描述为局部浓度，这取决于连接体的长度和灵活性(flexibility)。如果假定了连接体的自由灵活性，则通过利用以连接体长度作为半径的球的体积可以计算出局部浓度。计算球体积的公式为：4/3*π*r3。因此，接近度或局部浓度作为连接体长度的函数以三次方的方式下降。例如约10nm的连接体长度将会相当于约1mM的浓度，而100nm的连接体将会相当于约1μM的浓度。有效的有机化学一般在mM至M的浓度范围内进行。因此，为了确保化学反应的有效性，连接体长度不应明显地大于10nm。 
优选地，反应性基团被带至小于100nm的反应接近度，更优选小于50nm，更加优选少于25nm，更加优选少于10nm，并最优选少于5nm。 
在允许扩增的单罐合成由DNA编码的展示文库的现有技术中，使用具有在整个模板长度上分布的密码子的单链DNA模板(WO2004/016767，WO 2002/074929A2)。模板负责从转移单元集合中募集具有正确的反密码子序列的转移单元，从而将模板和转移单元上的化学基团聚在一起。因此，单链模板还充当在模板上的化学基团和与模板杂交的转移单元上的化学基团之间的连接体。因此，连接体长度以及由此反应物的局部浓度将依赖于所使用的密码子位置。具有例如20个核苷的未折叠的(延展的)寡核苷酸将具有约10nm的长度，(6-键主链间距为约0.63nm)，并且具有200个核苷的寡核苷酸将具有约100nm的长度。因此，明显长于20个核苷的未折叠的寡核苷酸(10nm，相当于约1mM的浓度)一般而言将不适合于形成化学反应的接近度指导。 
在一个实施方案中，本发明避开了用于使反应物达到反应接近度的延长的核酸结构。这通过选择合适的寡核苷酸序列来完成，所述寡核苷酸序列能够折叠为稳定的三维结构，并从而允许通过被许多核苷分隔的序列位置来进行接近度指导。如图1a中所示，这通过使用双特异性寡核苷酸(互相互补的)来完成，其可以杂交为“星形结构”。双特异性寡核苷酸包含2个区段：一个寡核苷酸的朝向3′末端的区段与下一个寡核苷酸中朝向5′末端的区段杂交，等等。最终，最后一个寡核苷酸的朝向3′末端的区段与第一个寡核苷酸的朝向5′末端的区段杂交。因此，每个寡核苷酸上的2个区段之间的中间部分指向中心。该中间部分可以是键或区段。相反地，末端指向外部，从而产生星形结构。因此，当使用3种类型的寡核苷酸时，形成3个干，当使用4种类型的寡核苷酸时，形成4个干，等等。化学反应性基团(CRG)方便地缔合至每个寡核苷酸上的中间部分或其附近。化学反应性基团因此被带至反应接近度，因为DNA双螺旋的直径为约2nm，从而允许在中心或其附近发生接近度指导的化学反应。 
进行化学反应从而使得所形成的产物与至少一个寡核苷酸缔合。此外，密码子方便地位于在每个寡核苷酸上的1个或2个杂交的区段 的外部，从而允许编码化学基团。具有缔合的化学基团、2个位置特异性杂交区段和密码子的寡核苷酸被称为载体模块。 
为了制备可通过例如PCR进行扩增的寡核苷酸的所形成的组合，除了一个以外的每个干的末端经由环形成而进行连接以形成含有5′和3′末端的连续的寡核苷酸。在一个方面，该结构由1个干和多个干-环组成，其可以通过在末端具有PCR引发位点来扩增(图1d和1e)。可替代地，所有末端被连接从而形成闭合环，其可以通过使用不具有链置换活性的DNA聚合酶的引物延伸来扩增。 
图1b中显示了利用化学基团分步反应的方法。最初，2个载体模块在杂交条件下接触。载体模块A包含杂交区段a，其与载体模块B的杂交区段a′退火。该退火步骤后，允许载体模块A上的化学基团CA 和载体模块B上的CB之间发生化学反应。在第3个步骤中，在杂交条件下加入载体模块C。载体模块C包含杂交区段b′，其与载体模块B的杂交区段d互补。产物CA-CB与化学基团CC的反应接近度使得化学反应能够继续进行以便产生产物CA-CB-CC。在杂交条件下加入第4个载体模块D。允许载体模块D与正在生长的星形结构杂交，以便使反应物CD紧密接近前述反应的反应产物，由此促进反应以产生最终的化学化合物CA-CB-CC-CD。 
图1c公开了会聚合成法，其中起始反应步骤遵循2个分开的途径。在第1系列反应中，分开地，在第1个容器中载体模块A和B在杂交条件下接触。载体模块A的杂交区段a和载体模块B的杂交区段a′将互相退火，并且进行反应性基团CA和CB之间的反应。在第2个容器中，载体模块C和D在杂交条件下混合以便形成杂交产物，其中载体模块C的杂交区段c与载体模块D的杂交区段c′退火。随后，在化学基团CC和化学基团CD之间发生反应以产生中间产物CC-CD。允许中间产物在杂交条件下互相退火，由此形成星形结构。在星形结构形成后，或与此同时，允许2个中间反应产物CA-CB和CC-CD之间的反应以产生最终的化学化合物CA-CB-CC-CD。当执行分步或会聚合成时，在化学基团反应前提供辅助性寡核苷酸对于形成反应中心可能是有用的。 
在一个实施方案中，本发明涉及在由图1d中显示的载体模块提供的干-环结构中环的形成。可替代地，环通过连接由图1e中显示的其他寡核苷酸所提供的干-环，或通过图1d和1e中显示的实施方案的其任何组合而形成。末端的载体模块可以包含PCR引发位点，或引发位点可以通过连接其他寡核苷酸来提供。 
图1d中公开的实施方案显示了5个步骤。在第1个步骤中，各自携带反应性基团R和双特异性寡核苷酸的4个载体模块在杂交条件下接触。载体模块与星形结构相平衡。在第2个步骤中，杂交复合物连接在载体模块末端以便形成连续的核酸。位于星形结构中心的化学基团的接近度促进反应，并且在步骤3中形成产物，所述产物通过连接实体与编码化学基团的核酸联接，所述化学基团已参与化学化合物的形成。在步骤4中，用于聚合酶的引发位点与星形结构连接以使得能够延伸核酸。最后一个步骤显示了延伸产物，其中利用星形结构的核酸作为模板形成了双链DNA。 
在图1e中，显示了图1d的实施方案的变化方案，因为干-环被分开添加并与星形结构连接。在第1个步骤中，将4个载体模块混合。由于杂交区段的存在，星形结构在杂交条件下形成。在杂交复合物形成后，实施反应以形成化学化合物。在通过4个化学基团的反应来形成化合物后，加入3个干-环和用于聚合酶的引发位点。干-环和引发位点包含与星形结构的突出部分互补的突出部分。当加入连接酶时，干-环和引发位点与星形结构连接，以便形成连续的核酸。 
在某些实施方案中，本发明涉及例如利用酶或通过化学连接来连接载体模块，所述酶例如为T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T4 RNA连接酶或大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶(Shabarova等人，NucleicAcids Res，19，4247-51，1991)。 
载体模块-寡核苷酸部分
在本发明中，寡核苷酸用于指导化学反应。在这个上下文中，寡核苷酸被称为载体模块，它包含至少2个位置特异性的杂交寡核苷酸 区段、任选的寡核苷酸密码子区段和反应性化学基团。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中寡核苷酸部分由DNA、RNA或其类似物和以其任何组合组成。寡核苷酸部分至少在修饰后能够成为在关于核酸复制和/或扩增的标准规程中的合适模板。 
载体模块可以利用本领域已知的方法来合成。例如寡核苷酸可以通过本领域已知用于合成寡核苷酸的任何方法来制备，例如利用自动化合成仪的固相合成。必要时利用本领域已知的标准偶联化学可以将合成后的寡核苷酸与目的CRG缔合(例如共价或非共价偶联)。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中CRG与寡核苷酸缔合至在杂交区段之间的中间部分或其附近。中间部分可以是磷酸二酯键、其衍生物或核酸区段。中间部分的附近涉及在双链体核酸干上的区域，优选靠近中间部分的区域。优选地，中间部分的附近涉及少于20个核苷酸，更优选少于10个核苷酸，更加优选少于5个核苷酸，和最优选少于2个核苷酸。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中CRG与寡核苷酸的缔合经由连接体或间隔物而发生，所述连接体或间隔物足够长且灵活以允许反应物达到反应接近度。连接体优选具有允许在由寡核苷酸配对的反应物之间发生反应的长度和组成，但还使与未配对的实体的反应最小化。此外，寡核苷酸和CRG之间的缔合可以通过共价键。在某些实施方案中，共价键可以超过1个。所述键可以通过例如光、氧化作用、水解作用、暴露于酸、暴露于碱或还原作用进行切割。本发明实践中有用的各种键在现有技术中进行了描述(Fruchtel and Jung，Angew Chem Int Ed Engl，35，17，1996)。连接体帮助反应物接触，并且在某些实施方案中，取决于所需反应，决定作为离去基团的DNA的位置，其中连接体作为反应的自然结果而被切割。在某些实施方案中，取决于所需环境，在一个反应性基团的反应后接着为与第2个反应性基团联接的连接体的切割，以产生不留下能够提供化学官能度的另外原子的产物。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中CRG与寡核苷酸 的缔合通过核酸主链而发生。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中CRG与寡核苷酸的缔合通过碱基。在一个优选实施方案中，CRG与非Watson-Crick氢键键合部分缔合。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中CRG与寡核苷酸的缔合至少在其去除后允许由DNA聚合酶进行阅读。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中CRG与寡核苷酸的缔合是非共价的。例如，如果生物素与寡核苷酸联接，并且链霉抗生物素蛋白与CRG连接，则生物素和链霉抗生物素蛋白之间的相互作用使寡核苷酸和CRG互相非共价地缔合。 
载体模块-化学
利用本文所述方法可以制备广泛范围的化合物和/或化合物文库。在某些实施方案中，不是或不类似核酸或其类似物的化合物根据本发明的方法合成。在某些其他实施方案中，不是或不类似蛋白质或其类似物的化合物根据本发明的方法合成。 
在一个实施方案中，本发明涉及接近度指导的反应物的顺次化学反应，例如，利用正交化学或利用正交的保护/掩蔽基团，或者通过载体模块的顺次装配和反应。 
没有形成环即形成邻接核酸的载体模块的装配，本身可以使合适定位的CRG达到接近度，因为双螺旋的直径为约2nm，从而允许在反应接近度内确定几个连续CRG的位置。选择反应条件、连接体、反应物和反应位点以避免非寡核苷酸指导的反应并加速寡核苷酸指导的反应。取决于待合成的具体化合物可以采用载体模块的顺次或同时接触。在具有特定目的的某一实施方案中，考虑了化学化合物的多步骤合成，其中3个或更多个载体模块顺次接触以促进复杂化学化合物的多步骤合成。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块的退火，其允许以比许多常规有机合成中使用的浓度更低的浓度来使用载体模块。因此，可 以以亚毫摩尔浓度来使用载体模块。优选地，可以采用在少于100μM的亚毫摩尔浓度内的载体模块浓度，更优选少于10μM，更加优选少于1μM，更加优选少于100nM，和最优选少于10nM。 
在一个实施方案中，本发明涉及形成小分子或聚合物的CRG。用于合成聚合物或小分子的已知化学反应可以用于本发明的实践中。所选择的反应优选与核酸例如DNA和RNA或其类似物相容。有用的反应包括例如取代反应、碳-碳键形成反应、消除反应和加成反应。 
CRG或反应物包括各种反应物，并且可以是化学领域中已知的任何化学基团或反应性部分(例如，亲电子体、亲核体)。在利用本发明方法来合成小分子中，载体模块可以缔合的支架，小分子装配在所述支架上。该支架可以是具有2个或更多个官能化位点的任何化学化合物。所述位点可以通过本领域已知的方法和保护基团进行保护。保护基团可以是互相正交的从而使得它们可以单个地去除。修饰支架的反应物可以是例如亲电子体(例如乙酰基、酰胺、酰基氯、酯、亚胺)、亲核体(例如胺、羟基、硫醇)或侧链。 
在某些实施方案中，根据本发明的方法来合成聚合物，特别是非天然的聚合物。可以利用本发明方法和系统来合成的非天然的聚合物包括任何非天然的聚合物。例如，非天然的聚合物包括，但不限于，肽核酸(PNA)聚合物、聚氨基甲酸酯、聚脲类、聚酯类、聚丙烯酸酯(例如聚乙烯、聚丙烯)、聚碳酸酯、具有非天然立体化学的多肽、含有非天然氨基酸的多肽及其组合。在某些实施方案中，聚合物包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、25个单体单元或更多。在某些实施方案中，单体单元可以包括二聚体、三聚体或四聚体或者寡聚物。利用本发明系统合成的聚合物可以用作例如催化剂、药物或诊断亲和力配体。在制备某些非天然聚合物时，单体单元与载体模块联接。单体单元可以是例如氨基甲酸酯类、D-氨基酸、非天然的氨基酸、PNAs、脲类、羟酸、酯类、碳酸酯类、丙烯酸酯类或醚类。在某些实施方案中，单体单元含有2个反应性基团以用于将单体单元连接到正在生长的聚合物链中。优选地，2个反应性基团不是相同的，从而使得单体 单元可以以定性方式整合到聚合物中，例如在一端可以是亲电子体和在另一端是亲核体。反应性基团可以包括，但不限于，酯类、酰胺类、羧酸、活化的羰基、酰基氯、胺类、羟基和硫醇。在某些实施方案中，CRG是被掩蔽的或被保护的(Green等人，(1999)Protective Groupsin Organic Synthesis，第三版，Wiley)，从而使得聚合不发生直至当CRG脱保护时的所需时间。一旦单体经由载体模块装配而聚集在一起，开始聚合就会导致聚合和脱保护步骤的级联，其中聚合导致反应性基团脱保护以用于后续的聚合步骤。待聚合的单体单元可以包括2个或更多个单体。单体单元可以包含本领域已知的任何化学基团。反应性化学基团，特别是将会干扰聚合、杂交等的那些，优选地用已知的保护基团进行掩蔽(Green等人，(1999)Protective Groups inOrganic Synthesis，第三版，Wiley)。一般而言，用于掩蔽这些反应性基团的保护基团与用于保护在聚合步骤中使用的基团的那些正交。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中反应位点与用于所有化学反应的相同载体模块缔合。例如，小分子支架与一个载体模块缔合，和其余的载体模块提供修饰支架的实体。 
在一个实施方案中，本发明涉及载体模块，其中反应位点将会在化学反应过程中改变位置。 
在一个实施方案中，本发明涉及所形成的化学化合物与寡核苷酸的缔合，而同时保持至少在其去除后可例如由DNA聚合酶进行阅读。 
组合文库的制备
传统的和核酸指导的文库合成之间的重要的实际差异是每次操作的规模。由于筛选和化合物鉴定所需的材料量，传统的组合合成一般在纳摩尔至微摩尔/文库成员的规模上进行。相反地，核酸指导的文库合成可以发生在飞摩尔至皮摩尔的规模上，因为选择和PCR扩增只需要微量的(例如约10-20摩尔)每种与核酸连接的合成分子。规模上的极大差异，与核酸指导的文库合成中的单一解决形式相组合，明显简 化了所需材料的制备。 
在一个实施方案中，本发明涉及组合展示文库的形成。文库可以利用在一些或所有位置上的载体模块的集合来产生(图2a)。在第1个步骤中，提供了每个位置的载体模块的集合。当载体模块在杂交条件下混合时，它们将会在杂交区段的序列指导下装配成星形结构。在载体模块装配后，以任何顺序来进行连接和反应。在本发明的一个方面，在反应前进行连接以增加星形结构的稳定性。在接近度指导的反应后，聚合酶引发位点与星形结构连接，并施行延伸反应以将所形成的化学化合物展示给外部环境。 
如本领域技术人员将理解的，小分子和聚合物文库可以利用本文所公开的原理进行合成。因此，可以对组合展示文库实施选择，并通过其编码性寡核苷酸来鉴定富集文库成员。 
根据情况，最初组合2个或更多个位置的载体模块的集合，并对其实施在联接的CRG之间的由核酸指导的化学反应。根据情况，文库可以通过多重化学反应来形成，其中在后续的反应循环前纯化每种中间产物。优选地，需要少于20个化学反应步骤来形成文库。在其他实施方案中，需要少于10个化学反应步骤，并更优选地，需要3-9个步骤来形成文库。 
选择
可以根据任何标准规程来进行具有所需活性(例如催化活性、结合亲和力、结合特异性、或在活性测定中的特殊效应)的反应产物的选择和/或筛选。例如，可以根据基于文库的方法中的原理来进行亲和力选择(参见图3)，例如噬菌体展示(Smith，Science，228，1315-7，1985)、核糖体展示(Hanes等人，Proc Natl Acad Sci U S A，95，14130-5，1998)、mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc Natl AcadSci U S A，94，12297-302，1997)或DNA编码的化学文库(WO2004/016767，WO 2002/074929A2)。例如通过在过渡态类似物亲和柱上的亲和力选择(Baca等人，Proc Natl Acad Sci U S A，94，10063-8， 1997)或通过基于官能团的选择方案(Pedersen等人，Proc Natl AcadSci U S A，95，10523-8，1998)可以进行催化活性的选择。因为可以通过PCR扩增微量DNA(～100个分子)，因此这些选择可以在这个量级的规模上进行以允许经济且有效地真正广泛地搜寻所需活性。 
根据与靶分子的结合可以选择或划分(partition)展示文库。在这个上下文中，选择或划分指由此将与靶分子结合的文库成员与不与靶分子结合的文库成员分开的任何方法。选择可以通过本领域已知的各种方法来完成。在大多数应用中，与靶分子的结合优选是选择性的，从而使得相对于其他结合事件来说更有利于与靶结合。最后，利用本发明鉴定的结合分子可以用作治疗试剂和/或诊断试剂。 
可以执行所述选择策略以允许针对几乎任何靶进行选择。重要的是，所述选择策略不需要关于靶分子或关于展示文库成员的任何详细的结构信息。整个过程由在文库成员与给定的靶分子结合中所牵涉的结合亲和力和特异性驱动。 
利用标准分子生物学，通过其编码性核酸可以容易地鉴定经选择的文库成员。本发明广泛地允许鉴定对于任何已知靶分子的结合分子。此外，通过分离所选文库成员的结合分子并使用这些来鉴定和确认靶分子可以发现新型的未知靶。 
从展示文库中选择结合分子可以以任何形式进行以鉴定结合性文库成员。结合选择一般包括：固定所需靶分子，加入展示文库，允许结合，并通过洗涤去除非结合物/弱结合物。利用例如酸、离液序列高的盐、热、与已知配体的竞争洗脱、高盐、碱、靶的蛋白水解释放、核酸的酶促释放可以洗脱与靶保持结合的富集文库。在一些实施方案中，利用相同或更严谨的条件或利用不同的结合方式对洗脱的文库成员实施更多轮的结合和洗脱循环，这将增加富集。在其他实施方案中，不从靶上洗脱结合性文库成员。为了选择与在细胞表面上表达的蛋白质(例如离子通道或跨膜受体)结合的文库成员，可以使用细胞自身作为选择试剂。选择程序还可包括就与细胞表面受体结合进行选择，所述细胞表面受体被内在化从而使得受体与结合分子一起通过细胞 质、细胞核或其他细胞区室，例如高尔基体或溶酶体。所讨论的区室的分离导致将被内在化的文库成员与非内在化的文库成员分开(Hart等人，J Biol Chem，269，12468-74.，1994)。选择程序还可包括体内选择。例如通过体内器官靶向，其中将文库注射到动物中，随后分离目的器官，从而获得被靶向那个器官的文库成员的富集汇集物(Pasqualini和Ruoslahti，Nature，380，364-6，1996)。富集文库的核酸部分可以通过例如PCR进行扩增，导致许多级的扩增，允许通过例如克隆和DNA测序进行鉴定。 
根据图3中显示的亲和力选择的具体实施方案，将从图2a中显示的实施方案产生的反应产物文库在结合条件下与靶接触。如果一种或多种所形成的化学化合物具有对靶的亲和力，则将产生结合。在后续步骤中，分开结合性文库成员或来源于其中的核酸。与所形成的化学化合物联接的核酸随后通过例如PCR进行扩增以产生多个拷贝的核酸，所述核酸编码展示出所需亲和力的化合物的合成史。扩增出的核酸可以通过多种已知技术进行测序以译解哪些化学基团已参与成功的化合物的形成。可替代地，扩增出的核酸可以用于形成下一代文库。 
其他选择
还可进行其他特性的选择，例如催化或其他功能活性。一般地，应当设计选择，从而使得具有所需活性的文库成员可以与其他文库成员分开。例如，具有催化键切割的能力的文库成员的选择可以通过将生物素经所讨论的键与每个文库成员联接来进行。随后，利用链霉抗生物素蛋白的划分可以将具有催化活性的文库成员与其他文库成员分开。另一例子是选择具有键形成能力的文库成员。这可以通过下列步骤进行：将底物联接到每个文库成员上，并随后加入联接有生物素的底物。2种底物之间形成键的反应将使生物素联接在催化性文库成员上。随后，利用链霉抗生物素蛋白的划分可以将具有催化活性的文库成员与其他文库成员分开。还可进行其他特性的选择，例如二聚作用和/或聚合作用。在这种情况下，利用例如HPLC、丙烯酰胺或琼脂糖 凝胶或大小排阻柱，通过所形成的复合物的大小可以划分文库成员。 
核酸扩增
通过用于核酸扩增的标准规程可以进行富集文库成员的核酸部分的扩增。这些方法包括，例如聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等人，Science，230，1350-4，1985)、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton，Nature，350，91-2，1991)、链置换扩增(Nycz等人，Anal Biochem，259，226-34，1998)、自动维持序列复制(Mueller等人，HistochemCell Biol，108，431-7，1997)、引物延伸、和质粒扩增(参见例如Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory)。 
通过模块置换来装配展示文库
在一个实施方案中，本发明涉及富集文库成员或富集文库成员的第二代文库的重新装配/扩增以重新形成展示。在富集文库的情况下，形成富集展示文库，因此，允许进行选择和扩增和重新装配的循环。例如，如图4a中所示，允许富集文库成员的上述经PCR扩增的寡核苷酸在有利于分子内杂交的条件下杂交，由此重新形成由一个干和多个干-环组成的星形结构。没有环的干可以包含限制性内切酶的识别位点，所述限制性内切酶产生含有不确定碱基的突出部分。方便地，利用在所形成的突出部分中序列的不确定碱基以包含密码子。因此，干的限制性内切酶消化产生关于该第1个位置的密码子特异性突出部分。随后，经限制性内切酶消化的星形结构与载体模块的集合杂交，所述载体模块包含关于第1个位置的2个恒定区段以及CRG和反密码子的同族对。因此，密码子/反密码子杂交允许连接合适的载体模块与星形结构对。邻近的干-环还可包含用于另一种限制性内切酶的识别位点，所述另一种限制性内切酶能够留下关于这个第2个位置的密码子特异性突出部分。因此，利用这个第二种限制性内切酶的消化消除了经PCR扩增的第1个模块与所述结构的其余部分的共价键。使星形结 构变性，随后允许其在有利于分子内杂交的条件下杂交。由此重新形成星形结构，但现在在位置1(具有CRG)上具有新的载体模块，并且没有环的干现在位于位置2上。这个过程可以循环进行以置换所有的位置，以允许在接近度指导下进行CRGs的正确组合的化学反应；展示文库从而被扩增并重新装配。最后PCR引发位点可以与星形结构连接。因此，可以进行选择和扩增和重新装配循环直至完成所需的富集(参见图5)。 
在一个实施方案中，本发明涉及由限制性内切酶所造成的密码子特异性突出部分的形成。合适的限制性内切酶能够形成具有超过一个特异性序列的突出部分。此类酶包括i)在其识别序列中含有不确定碱基的限制性内切酶，ii)在其识别序列之外进行切割的限制性内切酶，和iii)形成切口的限制性内切酶(缺刻性核酸内切酶(nickingendonuclease))。此类限制性内切酶的例子有：AlwNI、ApaBI、AsuI、BbvI、BbvII、BccI、Bce83I、BcefI、BciVI、BglI、BinI、BseMII、BseRI、BsgI、BsiYI、BsmAI、BspMI、BsrDI、BstEII、BstXI、BtgZI、DdeI、DraII、DraIII、DrdI、Eam1105I、EciI、Eco31I、Eco57I、Eco57MI、EcoNI、EspI、Esp3I、Fnu4HI、FokI、GsuI、HinfI、Hpy178III、Hpy188I、Ksp632I、MaeIII、MboII、MmeI、MwoI、PflMI、PfoI、PleI、SapI、SauI、ScrFI、SecI、SfaNI、SfiI、Sth132I、Tsp4CI、TspDTI、TspGWI、TspRI、Tth111I、Tth111II、XcmI、N.AlwI、N.BstNBI、N.BbvCIA和N.BbvCIB。 
突出部分的编码能力(可能的不同密码子的数目)由通过限制性内切酶而形成的突出部分中的不确定碱基的数目给定。因此，对于每个N(N＝A、T、G或C)，可以选择4种不同的残基，对于每个H(H＝A、C或T)、V(V＝A、C或G)、B(B＝C、G或T)和D(D＝A、G或T)，可以选择3种不同的残基，以及对于每个R(R＝A或G)、K(K＝G或T)、Y(Y＝C或T)、S(S＝C或G)和M(M＝A或C)和W(W＝A或T)，可以选择2种不同的残基。因此，通过将每个位置上的不同残基的数目相乘可计算出编码能力。例如，SfiI； 
5’-...GGCCNNNN/NGGCC...-3’ 
3’-...CCGGN/NNNNCCGG...-5’， 
形成突出部分5′-NNN-3′，因此由3个N组成，因此编码能力为64(＝4×4×4)。 
另一例子，Ava II； 
5’-...G/GWCC...-3’ 
3’-...CCWG/G...-5’， 
形成突出部分5′-GWC-3′，因此编码能力为2。 
另一例子是Bbs I； 
5’-...GAAGACNN/NNNN...-3’ 
3’-...CTTCTGNNNNNN/...-5’， 
形成由4个N组成的突出部分，因此编码能力为256(＝4×4×4×4)。 
一组特殊的限制性内切酶是只切割一条链的那些限制性内切酶(缺刻性核酸内切酶)。这些酶在原则上可以具有无限的编码能力；例如，当i)识别序列位于干-环结构的干中，或ii)用于形成末端突出部分，或iii)与另一种限制性内切酶相组合。这是因为所形成的突出部分的长度在原则上可以具有无限的长度。 
例如，N.BbvC IA位于干-环结构的干中； 
5’-...CC/TCAGCNNN 
Figure G05838052720070511D000351
3’-...GGAGTCGNNN， 
3′-...GGAGTCGNNN 
消化产生； 
5’-...CC-3’ 
3’-...GGAGTCGNNNNNNCGACT-5’， 
在这个例子中，6个N存在于所形成的突出部分中，从而得到1024(＝4×4×4×4×4×4)的编码能力。然而，显然可以任意选择N的数目，从而得到无限的编码能力。在这个例子中，可能序列的总数目中的小 部分不能使用。即，形成所使用的限制性内切酶的识别序列的那些序列。 
此外，缺刻性核酸内切酶可以形成任意长度的末端突出部分，例如 
N.BbvC IA 
5’-...CC/TCAGCNNNNNNNN-3’ 
3’-...GGAGTCGNNNNNNNN-5’， 
消化产生； 
5’-...CC-3’ 
3’-...GGAGTCGNNNNNNNN-5’， 
和 
5’-TCAGCNNNNNNNN-3’， 
在这个例子中，8个N存在于所形成的突出部分中，从而得到65536(＝4的8次方)的编码能力。然而，显然可以任意选择N的数目，从而得到无限的编码能力。在这个例子中，可能序列的总数目中的小部分不能使用。即，形成所使用的限制性内切酶的识别序列的那些序列。 
此外，可以使用与限制性内切酶相组合的缺刻性核酸内切酶以形成对于干-环结构没有任何要求的任意长度的突出部分。例如N.BbvC IA与Eco RI组合； 
5’-...CC/TCAGCNNNNNNNNG/AATTC...-3’ 
3’-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA/G...-5’， 
消化产生； 
5’-...CC-3’ 
3’-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA-5’， 
和； 
5’-TCAGCNNNNNNNNG-3’， 
和 
5’-AATTC-3’ 
3’-G-5’， 
在这个例子中，8个N存在于所形成的突出部分中，从而得到65536(＝4的8次方)的编码能力。然而，显然可以任意选择N的数目，从而得到无限的编码能力。在这个例子中，可能序列的总数目中的小部分不能使用。即，形成所使用的限制性内切酶的识别序列的那些序列。 
尽管密码子区段的长度可以改变，但密码子区段可以是1-50、1-40、1-30、1-15、1-10个核苷酸。然而，优选地，密码子区段的长度是2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。 
尽管形成干的区段的长度可以改变，但干区段优选可以是5-50、5-40、5-30、5-15、5-10个核苷酸。然而，优选地，干区段的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。 
在形成干的区段之间的中间部分的长度可以改变。中间部分优选为单个磷酸二酯键(或类似键)至20个核苷酸的一段序列。然而，中间部分优选为单个磷酸二酯键或具有1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度。 
在一个实施方案中，本发明涉及用于重新装配/扩增展示文库的方法，其中星形结构在限制性内切酶消化后进一步用去除5′磷酸的磷酸酶进行处理，从而阻止2个星形结构的连接。几种合适的磷酸酶是本领域已知的，例如南极磷酸酶和牛小肠碱性磷酸酶。 
在一个实施方案中，本发明涉及用于重新装配/扩增展示文库的方法，其中载体模块包含5′磷酸以促进与星形结构的连接。 
在一个实施方案中，本发明涉及用于重新装配/扩增展示文库的方法，其中载体模块在与星形结构连接后进行磷酸化。这阻止了游离的载体模块之间的连接。 
在某些实施方案中，本发明涉及用于重新装配/扩增展示文库的方法，其中经PCR扩增的星形结构的5′末端可以通过除限制性内切酶以 外的其他方法来形成，例如RNA酶、核酸内切酶III、核酸内切酶VIII、APE1、Fpg、化学切割或光切割。PCR产物由5′末端的引物和由DNA聚合酶形成的其余序列组成。该引物可以包含在由DNA聚合酶形成的区段中没有发现的残基，例如dUTP或RNA。此类残基可以通过合适的手段特异性地识别和切割，这将产生限定的末端(Smith等人，PCRMethods  Appl，2，328-32，1993)。 
在一个实施方案中，本发明涉及用于重新装配/扩增展示文库的方法。经PCR扩增的富集文库的末端可以在星形结构形成前通过上述任何方法进行修饰。 
多样化
在一个实施方案中，本发明考虑了这样的方法，其用于使展示的化合物或展示的化合物的文库多样化，从而允许分子进化。这可以以不超过本发明范围的多种方式来完成。例如(参见图4b)，在模块置换循环中的部分分子用2种连续的限制性内切酶进行消化，所述限制性内切酶消除了所讨论的模块和其余结构之间的共价键。使星形结构变性并与所讨论位置的载体模块的集合杂交。因此，以与形成原始文库时相同的方式，位置特异性恒定区段指导杂交。使合适的末端连接，并将所形成的产物与密码子指导装配的部分合并，导致多样化。这可以在模块置换的一个、一些或所有循环中进行。在另一例子中，对于在模块置换循环中的部分分子实施去除所讨论位置的密码子特异性突出部分，例如通过核酸外切酶。随后，使所讨论位置的载体模块的集合进行杂交和连接。将随后形成的非密码子指导的产物与密码子指导装配的部分合并，导致多样化。这可以在模块置换的一个、一些或所有循环中进行。多样化还可通过在模块置换过程前改组/重组(培育)文库成员之间的模块来进行。例如，扩增富集文库成员的核酸部分，并用切割恒定区段的限制性内切酶消化，从而产生2个或更多个片段。所述片段可以与来源于其他文库成员的片段相连接以形成全长产物，由此发生改组/重组。用于改组/重组的方法的另一例子是通过使用星 形结构(参见图4b)。星形结构通过2种连续的限制性内切酶进行消化，使其变性，并允许其杂交，导致所讨论的模块交换。因此，可以进行选择、扩增和多样化的循环，从而允许分子进化(参见图6)。 
催化活性的选择
所述原理还可应用于选择催化活性。在这种情况下，载体模块包含反应位点官能团，并且星形结构提供这些官能团三维排列的框架，从而模拟蛋白质酶。 
考虑了各种催化活性的选择方案。例如i)选择与过渡态类似物结合，ii)选择键形成，通过使一种底物与星形结构缔合，而其他底物固定在例如珠上，(因此，与珠缔合的文库成员能够形成键)，或iii)选择键切割，通过具有与星形结构和珠缔合的底物，(因此，不与珠缔合的文库成员能够切割键)(参见图7)。 
密码子特异性分隔化(compartmentalization)
通过使用例如合适的限制性内切酶，星形结构允许任何密码子位置成为末端和单链，从而允许通过对于特定密码子位置的杂交和任选的连接来进行高度特异性的分隔化。用于分隔化的各种方法是本领域已知的，例如，反密码子序列的微阵列(Lockhart等人，NatBiotechnol，14，1675-80，1996)，反密码子序列的柱(Halpin和Harbury，PLoS Biol，2，E173，2004)，或使用珠，其中单个珠包含反密码子序列和荧光标签，所述荧光标签随后允许通过例如荧光活化细胞分类来进行分类(Iannone等人，Cytometry，39，131-40，2000)。此类分隔化在本发明的实践中可能是有用的，例如：i)在文库合成过程中用于化学反应后修饰，ii)单个克隆的分析，iii)选择进程的分析，或iv)多样性分析。因此，情况ii)-iv)中的分隔化可以是DNA测序的快速且经济的可替代方法，以用于单个序列或序列文库的去褶积(deconvolution)。 
在本说明书中，组合物被描述为具有、包含或含有特定组分，或 方法被描述为具有、包含或包括特定过程步骤，贯穿整个说明书，预期本发明的组合物同样也基本上由或由所述组分组成，并且本发明的方法同样也基本上由或由所述过程步骤组成。此外，应当理解，步骤的顺序或执行某些操作的顺序并不重要，只要本发明仍是可操作的。此外，可以同时进行2个或更多个步骤或操作。 
本发明的方法和组合物代表了产生具有所需特性的分子的新方法。这种方法将极其灵敏且有效的分子生物学技术与有机化学的灵活性相组合。通过分子进化来制备、扩增和进化非天然聚合物和小分子的能力可以导致产生新的催化剂种类、新型配体、或药物，它们具有的性质优于用较慢的传统发现方法分离的那些。 
本发明还提供了在本发明方法中使用的试剂盒和组合物。 
定义
如本文所使用的，术语“核酸”或“寡核苷酸”指核苷酸聚合物。所述聚合物可以包括，但不限于，天然的核苷(即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-urouridine、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物学修饰的碱基(例如甲基化的碱基)、插入的碱基、修饰的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)、或修饰的磷酸基团(例如硫代磷酸酯和5′，-N-亚磷酰胺键)。核酸和寡核苷酸还可包括碱基的其他聚合物，其具有修饰的主链，例如锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)和能够充当用于使用扩增技术的扩增反应的模板的任何其他聚合物，所述扩增技术例如为聚合酶链式反应或连接酶链式反应。 
如本文所使用的，术语“区段(segment)”指寡核苷酸序列的连续部分。 
如本文所使用的，术语“密码子”和“反密码子”指编码与所述密码子或反密码子缔合的某一化学基团的寡核苷酸序列。一系列密码子编码特定化学反应物的组合，所述化学反应物已参与了所编码的分子的形成。 
如本文所使用的，术语“干-环”指包括至少核苷酸部分的任何二级结构，在所述核苷酸部分中核酸序列的链经由分子内氢键与同一核酸分子的另一部分结合，以便构成具有大部分双链性质的被称为“干”的“自身配对”区域，和位于所述干的一个末端的未配对“环”区域。当环的长度为零时，它产生被称为“发夹”或回文结构的特殊情况的干-环。 
如本文所使用的，术语“小分子”指在实验室中合成的或在自然界中发现的有机化合物，其分子量小于10,000克/摩尔，任选小于5,000克/摩尔，和任选小于2,000克/摩尔，例如小于1,000克/摩尔。优选的小分子适合于口服施用。 
如本文所使用的，术语“小分子支架”或“分子支架”指具有至少一个适合于官能化的位点或化学部分的化学化合物。小分子支架或分子支架可以具有2、3、4、5个或更多个适合于官能化的位点或化学部分。如本领域技术人员所理解的，这些官能化位点可以被保护或掩蔽。所述位点还可以存在于隐含的环结构或主链中。 
如本文所使用的，术语“化学反应性基团”或“化学基团”或“反应单元”指能够修饰另一化学部分、添加至另一化学部分或从另一化学部分上取走的任何化学部分。包括，例如，但不限于，构建块(building block)、单体、单体单元、分子支架、或在由接近度介导的化学合成中有用的其他反应物。在某些情况下，化学基团不是核苷酸或其衍生物。在另一方面，已参与所形成的化学化合物的合成的化学基团中至少一个不是天然发生的氨基酸。 
如本文所使用的，术语“与……缔合”描述了2个或更多个基团、部分、化合物、单体等之间或之中的相互作用。当2个或更多个实体如本文所述互相“缔合”时，它们通过直接或间接的共价或非共价相 互作用连接。优选地，缔合是共价的。共价缔合可以是例如，但不限于，经由酰胺、酯、碳-碳、二硫键、氨基甲酸酯、醚、硫醚、脲、胺或碳酸酯键。共价缔合还可包括连接体部分，例如，光可切割的连接体。希望的非共价相互作用包括氢键、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、π堆叠相互作用(pi stacking interaction)、疏水相互作用、磁性相互作用、静电相互作用等。此外，2个或更多个实体或试剂可以通过一起存在于同一组合物中而互相“缔合”。 
如本文所使用的，术语“载体模块”指与寡核苷酸缔合的化学基团，和可以与第2个寡核苷酸中朝向5′末端的区段杂交的朝向3′末端的区段，和可以与第3个寡核苷酸的朝向3′末端的区段杂交的朝向5′末端的区段。载体模块任选包含密码子或反密码子区段。如本文所使用的，术语“杂交区段”指所述寡核苷酸区段。 
如本文所使用的，术语“星形结构”指包括至少3个具有大部分双链性质的干的任何二级结构。0、1、2、3、5、6、7、8、9或更多个核苷酸残基可以将干分隔开。在0个核苷酸残基分隔开4个干的特殊情况下，连结体(junction)被称为霍利迪连结体。星形结构可以由1个核酸分子组成，或它可以由多个核酸分子组成。 
如本文所使用的，术语“反应接近度”指反应物之间的距离，通过这一距离所述反应物的反应可以以受控的、有效的且及时的方式发生。 
如本文所使用的，术语“接近度指导的化学反应”指反应物之间的化学反应，所述反应物通过使与反应物缔合的核酸进行杂交而被带至反应接近度。 
实施例 
实施例1
证实了通过互相互补的双特异性寡核苷酸而形成三聚和四聚的DNA星形结构 
如在图8中显示的表中所表明的，DNA寡核苷酸(由DNATechnology  Denmark制备)各自在1×连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的浓度进行混合。混合物在80摄氏度下孵育2分钟并在水浴中缓慢冷却至室温。利用标准规程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″MolecularCloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)，通过非变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺)，随后用溴化乙锭染色来分析产物。 
oligo6和oligo7(分别对应于vip006和vip007)、oligo6和oligo8(对应于vip006和vip008)、以及oligo7和oligo8(分别对应于vip007和vip008)各自具有互相互补的区段，从而能够形成经退火的二聚物。因此，在泳道1-3中观察到对应于二聚物的条带。vip006、vip007和vip008各自具有与2个邻近的oligo互相互补的区段，从而能够形成闭合的经退火的三聚体结构(参见图8)。因此，在泳道4中观察到对应于三聚体的条带。oligo6、oligo7和oligo9(分别对应于vip006、vip007和vip009)各自具有与邻近的oligo互相互补的区段，从而能够形成经退火的三聚体结构。然而，该结构是开放的，因为vip008和vip006不具有互补区段(参见图8)。因此，在泳道5中观察到对应于三聚体的条带。预期开放的三聚体在凝胶中具有比更紧密闭合的三聚体形式更低的迁移率。事实上，当比较泳道4和5时，观察到迁移率的差异。 
通过使用oligo6、oligo7和oligo10(分别对应于vip006、vip007和vip010)同样观察到缓慢迁移的三聚体条带，其中vip006和vip010互相不直接退火(比较泳道4和6)。为了评估闭合的三聚形式的形成效率，oligo6、oligo7和oligo8(分别对应于vip006、vip007和vip008)在2倍过量的oligo9或oligo10(分别对应于vip009或vip010)存在下进行退火。有趣的是，泳道7和8中的主要条带对应于由vip006、vip007和vip008组成的闭合的三聚体快速迁 移种类。闭合的四聚体的成功形成通过使oligo6、oligo7、oligo9和oligo10(分别对应于vip006、vip007、vip009和vip010)退火来实现，并在泳道9中被观察为1个主要条带。注意，在所有寻觅(chases)中的预期的价(valency)以高效率获得；被观察为单个主要条带。 
实施例2
通过T4 DNA连接酶将三聚体DNA星形结构转化为DNA的单条邻接链 
在这个实施例中证实，成功形成了由DNA的单条不间断链组成的3干的DNA星形结构。使互相互补的双特异性寡核苷酸退火，并随后连接以形成DNA连续链。 
如图9中显示的，DNA oligo(由DNA Technology  
Figure G05838052720070511D000441
Denmark制备)各自在1×连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的浓度进行混合。混合物在80摄氏度下孵育2分钟并在水浴中缓慢冷却至室温。 
寡核苷酸的5′末端通过T4DNA多核苷酸激酶进行磷酸化。制备由1.67μM星形结构、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.2u/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)组成的混合物，并在37℃孵育30分钟。 
通过T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)在经退火的寡核苷酸的并列末端之间形成磷酸二酯键。向上述经激酶处理的混合物中加入1/3×体积的连接酶混合物、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和100u/μl T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，并在室温下孵育2小时。利用标准规程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)，通过变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺，8M尿素)，随后用溴化乙锭染色来 分析产物。 
vip076(25nt)和vip017(42nt)各自具有互相互补的区段，它们在退火后使vip076的3′末端与vip017的5′末端相邻，从而制成用于T4 DNA连接酶的底物。因此，在泳道1中观察到对应于vip076-vip017(67nt)的显著条带。类似地，在泳道3中观察到形成了对应于vip017-vip078(100nt)的显著条带。相反地，vip076和vip078(58nt)各自具有互相互补的区段但不形成经退火的相邻末端，并且被预期不进行连接。因此，在泳道2中只观察到对应于vip076和vip078单体的条带。注意到对应于vip076的条带较微弱，这是预料中的，因为vip076较小并且寡核苷酸为等摩尔浓度。此外，vip078(58nt)在凝胶中迁移得比vip076-vip017(67nt)更慢，这不是预料中的，因为vip076-vip017包含用于形成给出更紧密折叠的干-环结构，因此在凝胶中具有更高的迁移率。 
vip076、vip017和vip078各自具有互相互补的区段，它们在退火后使vip076的3′末端与vip017的5′末端相邻，并使vip017的3′末端与vip078的5′末端相邻，从而制成用于T4 DNA连接酶的2种底物。因此，在泳道4中观察到对应于vip076-vip017-vip078的显著条带。 
因此，据此证实，形成了由DNA的一条邻接链组成的三聚体DNA星形结构。 
实施例3：
3干的DNA星形结构的扩增 
在这个实施例中证实，成功扩增了由DNA的一条邻接链组成的三聚体DNA星形结构。使互相互补的双特异性寡核苷酸退火，连接，并随后在引物延伸反应中用作模板。 
如下文所述，DNA oligo(由DNA Technology 
Figure G05838052720070511D000451
Denmark制备)各自在1×连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl 中以2μM的浓度进行混合。混合物在80摄氏度下孵育2分钟并在水浴中缓慢冷却至室温。 
寡核苷酸的5′末端通过T4 DNA多核苷酸激酶进行磷酸化。制备由1.67μM星形结构、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.2u/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)组成的混合物，并在37℃孵育30分钟。 
通过T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)在经退火的寡核苷酸的并列末端之间形成磷酸二酯键。向上述经激酶处理的混合物中加入1/3×体积的连接酶混合物、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和100u/μl T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，并在室温下孵育过夜。 
通过向1体积的连接反应中加入3体积的延伸混合物、1.33×Vent缓冲液(New England Biolabs)、1.33μM vip038、2.67mM dNTP，并且连同或不连同1.33u/μl Vent(exo-)DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，cat#M0257)一起，来进行引物延伸反应。溶液在92℃孵育1分钟、在50℃孵育1分钟、在74℃孵育10分钟，并置于冰上。 
利用标准规程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，NewYork)，通过非变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺)，随后用溴化乙锭染色来分析反应。 
图10中显示了实验结果。vip038与vip078中20个最5′末端的碱基逆向互补，因此可以利用vip078或vip078融合物(fusions)作为模板来引发延伸反应。因此，在包含vip038、vip076和vip078的延伸反应中得到对应于双链的vip078的单个显著条带(泳道2)。注意到，这个条带不存在于泳道6中，所述泳道6是等价的但不包含DNA聚合酶。相反地，泳道6包含2个条带，推测它们由退火的vip076/vip078/vip038和退火的vip078/vip038组成。 
通过vip038、vip076和vip017证实了反应的特异性，其中比较 泳道1和5，在含或不含DNA聚合酶之间没有观察到明显差异。 
利用连接反应vip017-vip078也观察到成功的引物延伸，由泳道3中的显著条带说明。注意到，还观察到对应于双链的vip078的较微弱条带，说明并非所有的vip078都与vip017连接。在相应的不含DNA聚合酶的泳道7中，观察到具有与双链的vip017-vip076几乎相同的迁移率的较微弱条带。推测该条带由退火的vip038/vip017-vip078组成。 
利用vip076-vip017-vip078连接反应作为模板也观察到成功的引物延伸。在凝胶中观察到迁移率比双链的vip017-vip078更低的2个条带。当与不含DNA聚合酶的等价泳道8相比较时，如所看到的，较低的条带对应于退火的vip038/vip076-vip017-vip078。然而，泳道4中较高的条带是独特的，因此由双链的vip076-vip017-vip078组成。因此，这个实施例证实了，DNA结构可以转化为双链DNA，从而可进行扩增。 
实施例4
在星形结构中心处的化学反应性 
通过使用下列三官能交联剂(TSAT、Tris-氨基三乙酸琥珀酰亚胺酯(Tris-succinimidyl aminotriacetate)，Pierce cat.No 33063)来实现在星形结构中心处的化学反应性： 
Figure G05838052720070511D000481
DNA oligo：全都具有氨基经修饰的内部dT(GlenResearch，cat.No.：10-1038-××)的vip016/vip017或vip016/vip017/vip018(由DNA Technology 
Figure G05838052720070511D000482
Denmark制备)在150mM NaCl、100mM磷酸钠(pH 7.2)中混合，得到20μM的总oligo浓度。混合物在80摄氏度下孵育2分钟并在水浴中缓慢冷却至室温。将TSAT溶解于DMF中。制备在DMF中的10倍连续稀释液。将1体积的DMF或TSAT稀释液与9体积的缓冲液混合，得到的最终缓冲液浓度为150mM NaCl、100mM磷酸钠，pH 7.2。将1体积的缓冲的DMF或缓冲的TSAT稀释液与1体积的退火的DNA oligo混合物进行混合，得到最终的oligo∶TSAT比为1∶0、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000，并允许在室温下孵育2小时。利用标准规程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，NewYork)，通过非变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺)，以及变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺，8M尿素)，随后用溴化乙锭染色来分析反应。 
Figure G05838052720070511D000491
vip016和vip017各自具有互相互补的区段，因此能够形成退火的二聚体结构。vip016、vip017和vip018各自具有与邻近的oligo互相互补的区段，因此能够形成闭合的经退火的三聚体结构(参见图12)。 
如所预期的，在非变性凝胶中的泳道1-5中，主要条带对应于二聚体结构，而在非变性凝胶中的泳道6-10中，主要条带对应于三聚体结构。在变性凝胶中，退火被破坏。如所预期的，在变性凝胶中的泳道1和6中观察到对应于单体的条带。然而，当包括TSAT时，观察到更高级的结构(泳道2-5、7-10，变性凝胶)，表明TSAT的确使oligo交联。有趣的是，当只存在vip016和vip017时，最高级的交联结构是二聚的(变性凝胶，泳道2-5)，而当vip016、vip017和vip018存在时，观察另外的三聚体结构(变性凝胶，泳道7-10)，从而表明交联不依赖于DNA寡核苷酸的退火。还值得注意的是，如所预期的，观察到钟型的剂量应答：在低TSAT浓度时，反应将是缓慢的导致低得率，随着TSAT浓度增加反应将更快速地进行，导致产生更多的交联产物，然而在较高的TSAT浓度下，交联将与只与一个DNA oligo反应的TSAT分子进行竞争，导致产生较少的交联产物。因此，利用1000TSAT当量观察到交联产物的最高得率(泳道4和9，变性凝胶)。此外，当与具有相同TSAT浓度的泳道2-5中的其相似物(counterpart)相比较时，泳道7-10中获得的高得多的总得率举例说明了在闭合的经退火的结构中的交联优势。 
实施例5
由DNA星形结构指导的化学反应 
通过同双官能连接体BSOCOES((双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基]砜)，Pierce cat#21600)，通过将氨基酸(L-Leu或Gly，Fluka#61820和#50052)经α-胺与vip017中修饰的内部dT上的伯胺交联而对寡核苷酸vip017进行官能化，其步骤为：在200mM pH 7.4 磷酸钠溶液(200μl)中用0.1体积的在DMF中的100mM BSOCOES溶液于25℃处理所述寡核苷酸(5nmol)10分钟，随后用0.3体积的在300mM NaOH中的300mM氨基酸(Leu或Gly)溶液于25℃处理2小时。反应总体积为200μl。粗连接的氨基酸试剂通过EtOH沉淀来分离，并且无需进一步纯化即可使用。根据(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)通过NaOAc/EtOH来沉淀DNA。将粒状沉淀重悬浮于水中。 
寡核苷酸通过制备下列物质来进行退火：3.125μM每种寡核苷酸、125mM MES pH 6.0、187.5mM NaCl。混合物在80摄氏度下孵育2分钟并在水浴中缓慢冷却至室温。通过将EDC和sNHS加入至预退火的寡核苷酸中来进行DNA指导的化学反应(酰胺键形成)；2.5μM形成的星形结构、100mM MES pH 6.0、150mM NaCl、20mM EDC和15mM sNHS(终浓度)。混合物在室温下孵育过夜并如上所述进行EtOH沉淀。 
利用标准规程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，NewYork)，通过非变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺)，以及变性PAGE(7.5％聚丙烯酰胺，8M尿素)，随后用溴化乙锭染色来分析反应。 
通过同双官能连接体BSOCOES，通过将氨基酸Leu或Gly经α-胺与vip017中修饰的内部dT上的伯胺交联而对寡核苷酸vip017进行官能化。经修饰的dT位于vip017中的2个杂交区段之间。vip076具有包含伯胺的经修饰的dT，随后为与vip017中5′杂交区段互补的3′杂交区段。因此，通过使vip017和vip076退火，在与vip017缀合的氨基酸和vip076上的伯胺之间创造了接近度。因此，在非变性凝胶的泳道4-6中观察到对应于二聚体的条带。vip008具有与vip076和vip017互补的区段，因此能够形成闭合的三聚体星形结构，并在星形 结构中心的反应室内排列vip017和vip077的化学官能团。因此，在非变性凝胶的泳道1-3中观察到对应于三聚体的条带。 
在经EDC/sNHS进行活化后，在与vip017缀合的氨基酸和vip076中的伯胺之间可以形成酰胺键，并由此使vip017和vip076交联。如所预期的，当星形结构形成时(vip008存在)，对应于交联的vip076/vip017的独特条带的确与vip017-Gly和vip017-Leu一起出现(分别为变性PAGE的泳道2和3)，当没有EDC/sNHS活化(变性PAGE的泳道8和9)或具有未乙酰化的vip017(变性PAGE的泳道1)时所述条带不存在。有趣的是，当vip008不存在时，无法检测到所述独特条带(变性PAGE的泳道5和6)。这举例说明了，通过星形结构可以指导化学反应，并且在指导化学反应方面星形结构似乎比2个退火的oligo更有效。 
实施例6
星形结构的装配和连接 
在这个实施例中证实了，由dsDNA组成的三聚体DNA星形结构的成功扩增。使互相互补的双特异性寡核苷酸退火，连接，并随后在PCR反应中用作模板。使用下列寡核苷酸：vip029-vip031-vip0132-vip0133-vip030。图13图解显示了寡核苷酸的杂交。 
DNA寡核苷酸(由DNA Technology 
Figure G05838052720070511D000521
Denmark制备)各自在1×连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的浓度进行混合。混合物如下进行孵育：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步骤。退火操作过程在Applied Biosystems AB2720 PCR机器上进行。 
寡核苷酸的5′末端通过T4DNA多核苷酸激酶进行磷酸化。制备由1.5μM星形结构、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.17U/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs， cat#M0201)组成的混合物，并在37℃孵育30分钟。 
通过在10μl体积的1×DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)、50mM NaCl和200U T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)中的T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，并在16℃孵育过夜，而在经退火的寡核苷酸的并列末端之间形成磷酸二酯键。 
利用下列条件进行PCR扩增： 
反应在1×ThermoPol缓冲液(New England Biolabs B9004S)中用0.2mM dNTPs(New England Biolabs O447S)、8mM MgSO4、0.2μM有义引物和0.2μM反义引物、1M甜菜碱(Sigma B0300)、1U/100μl Vent(exo-)(New England Biolabs M0257L)来进行。使用的引物是vip027和vip028。这2种引物的生物素化的形式分别是vip034和vip038。利用下列循环条件进行PCR扩增：95℃2分钟，和95℃/30秒、60℃/30秒、74℃/30秒的20个循环。下文实施例7中报道的用于折叠和ssDNA纯化的PCR产物用vip034和vip028引物来制备。通过非变性PAGE来分析PCR产物。201bp的条带在图13中描绘的凝胶中清晰可见。 
实施例7
PCR产物的重折叠 
PCR产物的折叠如下进行。利用PerfectPrep(Eppendorf，cat#0032 007.740)根据试剂盒说明书进行PCR净化操作。在10μl体积(5μl/产物与5μl 2×缓冲液/引物混合物混合)的0.1M NaCl、0.1％Triton X-100、0.1μM vip027、0.1μM vip028中进行折叠。使用4种不同浓度的PCR产物(1∶2稀释度-1∶20稀释度)。在一个系列中，混合物在沸水中孵育2分钟，随后在冰/水浴中冷却。在第二个系列中，混合物利用下列程序在ABI2720 PCR机器上进行加热和冷却：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、 20℃30秒、10℃直至下一步骤。在第三个系列中，不进行加热或冷却。 
产物在20％TBE尿素凝胶(Invitrogen)上进行分析。凝胶用SYBRGreen(Molecular Probes S7563，根据说明书在1×TBE缓冲液中作1∶10000稀释)进行染色。 
在图14中，凝胶泳道包括下列内容物： 
泳道1：1∶2稀释的PCR产物，快速冷却 
泳道2：1∶4稀释的PCR产物，快速冷却 
泳道3：1∶10稀释的PCR产物，快速冷却 
泳道4：1∶20稀释的PCR产物，快速冷却 
泳道5：1∶2稀释的PCR产物，逐步冷却 
泳道6：1∶4稀释的PCR产物，逐步冷却 
泳道7：1∶10稀释的PCR产物，逐步冷却 
泳道8：1∶20稀释的PCR产物，逐步冷却 
泳道9：1∶2稀释的PCR产物，不处理 
泳道10：1∶4稀释的PCR产物，不处理 
泳道11：1∶10稀释的PCR产物，不处理 
泳道12：1∶20稀释的PCR产物，不处理 
泳道13：只有PCR产物。 
实验显示，单链星形结构DNA以大约1000bp迁移，与201bp dsDNA产物形成对比。看起来，星形结构形成的最佳条件是加热后将反应混合物快速冷却。 
实施例8
重折叠的星形结构的纯化 
利用经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynal，cat#650.02)纯化ssDNA星形结构。10μl珠用2×BWT(2M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，0.2％Triton X-100)洗涤2次。最后1 次洗涤后，将珠悬浮于1体积的2×BWT中，并加入1体积的重折叠的PCR产物。悬浮液在室温下孵育15分钟，不时地进行混合。将管置于磁体中，并在收集了珠后去除上清液。将珠悬浮于50℃温热的洗涤缓冲液(2M尿素，0.1％Triton X-100)中，并在50℃孵育2分钟。将管置于磁体上，并总共进行3次洗涤操作。最后1次洗涤在1×BWT(1M NaCl，5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5mM EDTA，0.1％TritonX-100)中进行。去除最后的洗涤缓冲液后，将珠悬浮于1.5ml NT(10mM NaCl、0.1％Triton X-100)中，并在50℃孵育5分钟。将管转移到冰/水浴中快速冷却，这个操作导致固定在经链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上的星形结构形成。将管在快速冷却后置于磁体中，并去除上清液。将珠悬浮于50μl NT中，准备用BsaI消化以从珠中释放出ssDNA。 
将17μl珠加入至2μl 10×NEB3缓冲液和1μl BsaI(10U/μl；NEB R0535L)中。反应混合物在50℃孵育1个半小时。消化产物通过下列方法进行分析：施行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％TBE-尿素凝胶，Invitrogen)，向样品中加入变性上样缓冲液，并在凝胶孔中加入包含珠的整个混合物。凝胶用SYBR Green(Molecular ProbesS7563，根据说明书在1×TBE缓冲液中作1∶10000稀释)进行染色。 
在图15中，在泳道1即(+BsaI)泳道中观察到1个条带，而在泳道2即‘-BsaI’泳道中没有看到条带。因此，通过酶切割下单链产物的能力证实，ssDNA在经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠上进行折叠从而形成用于BsaI的底物。 
实施例9
环形式的消化 
设计2个基因组，两者均使得能够在星形结构的环中进行消化。限制性内切酶通常不能消化ssDNA。然而，10-聚体的寡核苷酸对环的退火产生适合于酶的底物，由此酶的识别序列将成为双链。图16中图 解显示了本实验的设计。 
装配了2种结构，s129和s149。s129由下列寡核苷酸组成：vip029-vip161-vip162-vip163-vip070。s149由下列寡核苷酸组成：vip029-vip161-vip192-vip193-vip070。vip162、vip163、vip192和vip193全都包含用于2种限制性内切酶的识别序列(vip162：ApaI和BamHI；vip163：EcoRI和KpnI；vip192：PvuII和SacI；vip193：SmaI和VspI)。 
DNA oligo(由TAGC，Copenhagen，Denmark制备)各自在1×连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的浓度进行混合。混合物如下进行孵育：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步骤。退火操作在Applied Biosystems AB2720 PCR机器上进行。 
寡核苷酸的5′末端通过T4 DNA多核苷酸激酶进行磷酸化。制备由1.5μM星形结构、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.17U/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)组成的混合物，并在37℃孵育30分钟。 
通过在10μl体积的1×DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)、50mM NaCl和200U T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)中的T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，并在16℃孵育过夜，而在经退火的寡核苷酸的并列末端之间形成磷酸二酯键。 
利用下列条件进行PCR扩增： 
反应在1×ThermoPol缓冲液(NEB B9004S)中用0.2mM dNTPs(NEB O447S)、8mM MgSO4、0.2μM有义引物和0.2μM反义引物、1M甜菜碱(Sigma B0300)、1U/100μl Vent(exo-)(NEB M0257L)来进行。使用的引物是vip027和vip028。所述引物的生物素化的形式分别是vip034和vip038。利用下列循环条件进行PCR扩增：95℃2分钟，和95℃/30秒、60℃/30秒、74℃/30秒的20个循环。 
实验结果显示于图17中。 
在泳道1和3中，可以看出2个基因组均成功扩增。泳道2和4是没有添加用于所述2个基因组的连接酶的阴性对照。 
s129和s149的ssDNA结构的纯化。 
利用PerfectPrep(Eppendorf，cat#0032 007.740)根据试剂盒说明书纯化每个基因组的80μl PCR产物(利用vip034和vip028引物制得)。洗脱在40μl洗脱缓冲液中进行。为了重折叠PCR产物，进行下列操作：对于40μl PCR产物，加入750μl 0.2M NaCl、0.2％Triton X-100、7.5μl vip027和7.5μl vip028、和695μl H2O。将混合物在沸水中孵育5分钟，并在冰-水浴中快速冷却。 
将20μl链霉抗生物素蛋白珠(Dynal，650.02)用2×BWT(2MNaCl、10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、0.2％Triton X-100)洗涤2次。最后一次洗涤后，将珠悬浮于1体积的2×BWT中，并加入1体积的重折叠的PCR产物。悬浮液在室温下孵育15分钟，不时地进行混合。将管置于磁体中，并在收集了珠后去除上清液。将珠悬浮于50℃温热的洗涤缓冲液(2M尿素，0.1％Triton X-100)中，并在50℃孵育2分钟。将管置于磁体上，并总共进行3次洗涤操作。最后一次洗涤在1×BWT(1M NaCl，5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5mM EDTA，0.1％Triton X-100)中进行。在磁体上分开后，将珠悬浮于50μl 10mM NaCl、0.1％Triton X-100中。 
将每个制备物的20μl珠在磁体上分开，并悬浮于10μl 100mMNaCl、0.1％Triton X-100中。将每个制备物分成各为5μl的2管，并且如下添加消化oligo： 
1：s129-vip164-ApaI 
2：s129-vip165-KpnI 
3：s149-vip194-PvuII 
4：s149-vip195-VspI。 
加入0.25μl oligo(20μM储液)，得到的终浓度为1μM。退火在AB2720 PCR机器上利用下列程序进行：50℃-2分钟；40℃-2分钟；35℃-2分钟；30℃-2分钟；30℃-2分钟；25℃-2分钟； 20℃-2分钟。 
珠在100μl 100mM NaCl、0.1％Triton X-100中进行洗涤。随后，将珠悬浮在18μl 1.1×消化缓冲液中。将反应混合物分为2管，各为9μl，并向每个管中加入1μl酶(10单位)，得到用于消化的1×消化缓冲液。一组消化体系在30℃孵育，和另一组在37℃孵育。孵育进行5小时，不时地进行混合以使珠从管底部悬浮起来。 
消化后，产物在10％TBE-尿素凝胶(Invitrogen)上进行分析。向消化产物中加入上样缓冲液，并且在凝胶上加入包含珠的整个反应混合物。凝胶用SYBR Green(Molecular Probes S7563，根据说明书在1×TBE缓冲液中作1∶10000稀释)进行染色。 
实验结果显示于图18中。 
泳道1显示在37℃经ApaI消化的s129， 
泳道2显示在37℃经KpnI消化的s129， 
泳道3显示在37℃经PvuII消化的s149， 
泳道4显示在37℃经VspI消化的s149， 
泳道5显示在30℃经ApaI消化的s129， 
泳道6显示在30℃经KpnI消化的s129， 
泳道7显示在30℃经PvuII消化的s149， 
泳道8显示在37℃经VspI消化的s149。 
预期的条带大小如下： 
ApaI：163nt，KpnI：80nt，PvuII：165nt，VspI：83nt。 
在凝胶上的确出现了关于所有4种酶的预期大小的条带。注意到，包含生物素的片段没有进入凝胶，因为它们与珠结合。两种温度均得到产物，显示了该操作的坚固性。 
实施例10
以各种拓扑结构，DNA指导了酰胺键的形成 
通过同双官能连接体BSOCOES((双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基 氧基)乙基]砜)，Pierce cat#21600)，通过将氨基酸(甘氨酸，Flukacat#50052)经α-胺与vip017中修饰的内部dT上的伯胺交联而对寡核苷酸vip017进行官能化，其步骤为：在200mM pH 7.4磷酸钠溶液(200μl)中用0.1体积的在DMF中的100mM BSOCOES溶液于25℃处理所述寡核苷酸(5nmol)10分钟，随后用0.3体积的在300mM NaOH中的300mM氨基酸(甘氨酸)溶液于25℃处理2小时。反应总体积为200μl。粗连接的氨基酸试剂通过EtOH沉淀来分离，并且无需进一步纯化即可使用。 
根据(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)通过NaOAc/EtOH来沉淀DNA。将粒状沉淀重悬浮于水中。 
寡核苷酸通过制备下列物质来进行退火：0.556μM每种寡核苷酸、111mM MOPS pH 6.5(Fluka 69947)、1.11M NaCl(Fluka 71376)，并随后如下进行孵育：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步骤。退火操作在AppliedBiosystems AB2720PCR机器上进行。 
通过向预退火的寡核苷酸加入100mM DMTMM(Acros，cat#A017657001)来进行DNA指导的化学反应(酰胺键形成)。DMTMM以1M的浓度溶解于水中。在加入DMTMM前，将反应混合物预热至50℃。每种寡核苷酸的终浓度为0.5μM。反应在20μl体积的100mM MOPS pH6.5、1M NaCl、100mM DMTMM(终浓度)中于50℃进行3小时。 
通过非变性PAGE(20％聚丙烯酰胺，Invitrogen)和变性PAGE(10％聚丙烯酰胺，7M尿素，Invitrogen)，随后用SYBR Green(Molecular Probes S7563，根据说明书在1×TBE缓冲液中作1∶10000稀释)进行染色来分析反应。所有结果显示于图19中。 
通过同双官能连接体BSOCOES，通过将氨基酸(甘氨酸)经α-胺与vip017中修饰的内部dT上的伯胺交联而对寡核苷酸vip017进行官能化。经修饰的dT位于vip017中的2个杂交区段之间。vip008不包 含在经修饰的dT上的受体胺，它包含1个杂交区段，借助其它将与vip017杂交，并且因此在加入DMTMM后它将不与vip017-Gly共价交联。因此，在泳道1中没有观察到可见条带。 
vip018-NH2具有包含伯胺的经修饰的dT，随后为与vip017中5′杂交区段互补的3′杂交区段。因此，通过使vip017-Gly和vip018-NH2退火，在与vip017缀合的氨基酸和vip018上的伯胺之间创造了接近度。因此，在泳道2中观察到对应于由交联的vip017-Gly/vip018-NH2组成的二聚体的条带。 
vip006具有与vip017-Gly和vip018-NH2互补的区段，因此它能够形成闭合的三聚体星形结构，并在星形结构中心的反应室内排列vip017-Gly和vip018-NH2的化学官能团。因此，在泳道3中观察到对应于由交联的vip017-Gly/vip018-NH2组成的二聚体的条带。此外，泳道3包含比泳道2更多的着色，表明闭合的三聚体星形结构创造了比开放的二聚体结构更好的反应条件。 
vip020-NH2具有包含伯胺的经修饰的dT，但它不包含与vip017-Gly杂交的区段。因此，在泳道4中没有出现条带，因为vip020-NH2和vip017-Gly的反应物没有通过碱基配对而被带至接近度。 
vip006具有一个能够与vip017-Gly的区段杂交的杂交区段，和另一个能够与vip020-NH2杂交的杂交区段，它在其2个杂交区段之间具有包含伯胺的经修饰的dT。因此，vip006将官能团带至接近度，并且在泳道5中可以看见由交联的vip017-Gly和vip020-NH2构成的条带。 
vip009具有一个能够与vip017-Gly的区段杂交的杂交区段，和另一个能够与vip020-NH2杂交的杂交区段，它在其2个杂交区段之间具有包含伯胺的经修饰的dT。因此，vip009将官能团带至接近度。因此，在泳道6中观察到由交联的vip017-Gly和vip020-NH2构成的条带。 
vip006具有一个能够与vip017-Gly的区段杂交的杂交区段，和 另一个能够与vip020-NH2杂交的杂交区段，它在其2个杂交区段之间具有包含伯胺的经修饰的dT。vip009具有一个能够与vip017-Gly的区段杂交的杂交区段，和另一个能够与vip020-NH2杂交的杂交区段，它在其2个杂交区段之间具有包含伯胺的经修饰的dT。这4种寡核苷酸的杂交导致形成四聚体星形结构。在泳道7中观察到条带，显示vip017-Gly和vip020上的官能团通过这4种寡核苷酸的杂交而被带至互相接近。此外，泳道7包含比泳道5和6更多的着色，表明闭合的四聚体星形结构创造了比开放的三聚体结构更好的反应条件。 
vip048-NH2具有包含伯胺的经修饰的dT，和一个能够与vip017-Gly结合的杂交区段。在具有伯胺的经修饰的dT和能够对vip017-Gly退火的杂交区段之间插入了不参与杂交的6个核苷酸(摆动核苷酸(wobble nucleotide))。在泳道8中观察到条带，由此表明这2种寡核苷酸的交联。然而，通过比较泳道8和2可以看出，导入的6个额外的核苷酸降低了得到的交联产物的量。 
vip006具有一个能够与vip017-Gly的区段杂交的杂交区段，和另一个能够与vip048杂交的杂交区段。vip048-NH2具有包含伯胺的经修饰的dT，和一个能够与vip017-Gly结合的杂交区段。在具有伯胺的经修饰的dT和能够对vip017-Gly退火的杂交区段之间插入了不参与杂交的6个核苷酸(摆动核苷酸)。 
vip006的存在将2个反应性基团带至接近度，并且如泳道9中所见形成了产物。条带强度比在泳道8中见到的更强，表明vip006使结构(三聚体星形结构)稳定并且反应比在二聚体形式的反应中所发现的进行得更好。 
vip048-NH2具有包含伯胺的经修饰的dT，和一个能够与vip017-Gly结合的杂交区段。在具有伯胺的经修饰的dT和能够对vip017-Gly退火的杂交区段之间插入了不参与杂交的6个核苷酸(摆动核苷酸)。vip056包含一个能够与vip017-Gly杂交的杂交区段，和另一个能够与包含6个摆动核苷酸的vip048-NH2的区段杂交的杂交区段。因此，在这3种寡核苷酸退火后，vip048上经修饰的dT上的 伯胺离反应室6个核苷酸，并且现在位于双链臂上。与单链DNA相反，双链DNA非常坚固，从而阻止缀合的部分自由移动并由此降低其反应性。因此，在泳道10中只观察到非常微弱的染色。 
vip018-NH2具有包含伯胺的经修饰的dT，随后为与vip017-Gly中的5′杂交区段互补的3′杂交区段。 
vip056包含一个能够与vip017-Gly杂交的杂交区段，和另一个能够与vip018-NH2的区段杂交的杂交区段。在这2个杂交区段之间，vip056包含6个额外的核苷酸(摆动核苷酸)。在泳道11中可见二聚体条带，表明反应性基团被带至互相接近以使化学反应发生，并且vip056中的6个摆动核苷酸不损害这个实验中当前结构的接近度。 
实施例11
各种寡核苷酸的化学制备 
实施例11.1具有经修饰的内部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙酰化(位置n＝1) 
利用由DMT-MM促进的Fmoc-AA-OH进行并乙酰化 
利用由DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐酸盐，Fluka#74104)促进的Fmoc-Leu-OH来乙酰化具有内部胺-C6-dT的寡核苷酸vip068，方法为用一种下列缓冲液处理溶解于DMF和300mM NaCl的1∶1混合物中的寡核苷酸(500pmol)：磷酸钠400mM，pH 7.0，MOPS 400mM，pH 7.5，HEPES 400mM pH 8.0，磷酸钠400mM，pH 8.8，含DMT-MM 50mM。反应总体积为20μL。反应体系在25℃孵育16小时。将反应混合物稀释至50μL，并根据厂商规程在旋转柱(spin column)(Amersham Biosciences#27-5325-01)上纯化，随后为HPLC纯化和质谱分析。 
概括的纯化方法： 
通过具有自动采样器和级分收集器的Hewlett Packard AgilentHPLC装置在XTerra C18柱(Waters#186000602)上纯化官能化的寡核苷酸，使用乙腈/TEAA 100mM pH 7.0混合物作为洗脱剂。将合适的级分冻干，并用水稀释至20mM。 
概括的质谱分析： 
通过MALDI-TOF质谱法，在Bruker AutoFlex装置上，于HPA/柠檬酸铵基质中分析官能化的寡核苷酸，采用阴离子反射器模式(negative ion reflector mode)。 
DNA               计算出的质量    测得的质量 
vip068-LeuFmoc    6843.340        6844.5 
实施例11.2具有经修饰的内部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙酰化(位置n＝1) 
利用Fmoc-AA-OSu的乙酰化 
利用Fmoc-AA-OSu(AA＝Gly或Leu)来酰化寡核苷酸vip046，方法为用25mM Fmoc-Gly-OSu(ChemImpex#02420)或Fmoc-Leu-OSu(ChemImpex#02429)在25℃处理溶解于DMF和100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)的1∶1混合物中的寡核苷酸(125pmol)2小时。根据(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″MolecularCloning：a Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)通过NH4OAc/EtOH来沉淀官能化的寡核苷酸。将粒状沉淀重悬浮于水中，并通过MALDI-TOF质谱法进行分析。 
DNA               计算出的质量    测得的质量 
vip046-LeuFmoc    6932.3642       6932.1 
vip046-GlyFmoc    6876.301      66876.1 
实施例11.3具有经修饰的内部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙酰化(位置n＝1) 
肽-寡核苷酸缀合物的合成(使用氨基酸的单字母缩写)：YGGFL-Vip068、GLFYG-Vip068、YGGFL-PEG-Vip068、GLFYG-PEG-Vip068、GFL-Vip016和GFL-PEG-Vip016：利用Fmoc-AA-OSu乙酰化，随后在Sepharose上脱保护。 
从吸收在DEAE Sepharose(Sigma#DFF100)上的寡核苷酸的经修饰的内部dT上的伯胺合成肽。根据Halpin和Harbury的操作(PlosBiology 2004，2，1-8)，通过利用Fmoc-AA-OSu(AA＝Gly、Leu、Phe、Tyr、C6、PEG)(Fmoc-L-甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#02420；Fmoc-L-亮氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#02429；Fmoc-L-苯丙氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#02446；Fmoc-L-酪氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#11972；Fmoc-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#7296；Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸羟基琥珀酰亚胺酯，通过与N-羟基琥珀酰亚胺的EDC偶联而从Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ChemImpex#7310)合成)的酰化以及随后Fmoc脱保护的循环，使氨基酸偶联。从Sepharose上洗脱DNA后，混合物在旋转柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上根据厂商规程进行脱盐，随后通过HPLC纯化。通过HPLC测定得率。 
DNA                  分离的得率 
YGGFL-Vip068         19％ 
YGGFL-PEG-Vip068     32％ 
GLFYG-Vip068         11％ 
GLFYG-PEG-Vip068     18％ 
GFL-Vip016           30％ 
GFL-PEG-Vip016       36％ 
实施例11.4具有经修饰的内部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙酰化(位置n＝1) 
具有C6-NH2、PEG-NH2和Gly-NH2连接体的受体寡核苷酸的合成 
根据Halpin和Harbury的操作(Plos Biology 2004，2，1-8)，利用FmocNH-C6-CO2Su(Fmoc-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#7296)、FmocNH-PEG-OSu(Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸羟基琥珀酰亚胺酯，通过与N-羟基琥珀酰亚胺的EDC偶联而从Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ChemImpex#7310)合成)或Fmoc-Gly-OSu(Fmoc-L-甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，ChemImpex#02420)，在vip016的经修饰的内部dT上的伯胺处，对吸收在DEAESepharose(Sigma#DFF100)上的寡核苷酸vip016进行酰化，随后切割Fmoc保护基团。对1nmol DNA进行反应。从Sepharose上洗脱DNA后，混合物在旋转柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上根据厂商规程进行脱盐，随后通过HPLC纯化。通过HPLC测定得率。 
DNA               分离的得率 
H2N-PEG-vip016    39％ 
H 2N-C6-vip016    39％ 
H-G-vip016        45％ 
实施例11.5氨基酸与具有经修饰的内部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸经由BSOCOES或DSS在n≠1的位置上缀合 
通过同双官能连接体BSOCOES((双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基]砜)，Pierce cat#21600)和DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯(Disuccinimidyl suberate)，Pierce#21655)，通过将氨基酸(Gly、L-Leu、L-Phe、L-Tyr，Fluka，#50052、#61820、#78020、 #93829)经α-胺与寡核苷酸中修饰的内部dT上的伯胺交联而对寡核苷酸vip046、vip017、vip047和vip048进行官能化，其步骤为：在具有连接体(10mM)的DMF和400mM pH 8.4磷酸钠缓冲液的1∶1混合物中处理所述寡核苷酸(0.5nmol)和所述氨基酸(15mM)。反应总体积为20μL。反应体系在25℃孵育4小时。将反应混合物稀释至50μL，并根据厂商规程在旋转柱(Amersham Biosciences #27-5325-01)上进行纯化，随后通过HPLC进行纯化。通过HPLC测定得率。通过MALDI-TOF质谱法确定同一性。 
DNA                 分离的得率  计算出的质量  测得的质量 
vip046-BSOCOES-Gly  32％        6878.2325     6879.3 
vip046-BSOCOES-Leu  48％        6934.2951     6936.1 
vip046-BSOCOES-Phe  49％        6968.2795     6969.0 
vip046-BSOCOES-Tyr  51％        6984.2744     6985.5 
实施例12
在不同温度下，在反应中心中的酰化反应的稳定性 
在这个实施例中证实了，在三聚体星形结构中，1个氨基酸的转移如何能够在升高的温度下进行。结果显示于图20中。 
将oligo vip006、vip018和vip017-Leu(DNA Technology Arhus，Denmark，如实施例11中所述进行衍生的vip017)以20mM储液在缓冲液中混合，所述缓冲液包含吗啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 7.0)和NaCl(1M)的最终组成。对溶液实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。每个反应加入化学活化剂(DMTMM，Fluka#74104，100mM水溶液，终浓度为5mM)，并在25℃或70℃孵育指定的时间。 
通过变性(10％)PAGE分析反应混合物，并通过SYBR Green染色而显现出条带(凝胶在50％EtOH中固定5分钟，在水浴中洗涤5分钟，随后在SYBR Green的DMSO储液于1×TBE缓冲液中的10000 倍稀释液中孵育10分钟)。 
对于在25℃进行的反应，在第一个2小时后观察到不可检测量的产物(反应1-5)。在4小时反应(反应6)中，观察到少的量。在过夜孵育后观察到显著的量，当加入更多活化剂时观察到最高强度。 
对于在70℃进行的反应，在5分钟(反应2)后观察到第一种痕量产物。直至240分钟观察到量逐渐增加，随后对于过夜反应观察到量降低。 
在25℃和70℃都明显形成了所希望的vip017-Leu和vip018的交联产物，从而证实星形结构在升高的温度下能够介导反应进行。在这个实验中使用的两种温度下，反应速度明显不同。然而，这被预期为DMTMM对于氨基酸羧酸的最初激活仅受分子间碰撞控制，而不受DNA操纵。 
实施例13
在不同pH下，在反应中心中的酰化反应的稳定性 
在这个实施例中证实了，在三聚体星形结构中，1个氨基酸如何能够在5.2-8.0的pH范围内进行转移。在低pH下，受体氨基可以部分质子化，从而使其失活为潜在的亲核体。在较高pH下，由氨基酸羧酸活化而产生的反应中间体可以被水解，从而使其减活并破坏化学活化剂。两者均可阻碍所需酰胺键的形成。结果显示于图21中。 
将oligo vip016、vip008和vip017-Tyr(DNA Technology Arhus，Denmark，如实施例11中所述进行衍生的vip017)以20mM储液在2MNaCl中混合，并对其实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。这个退火混合物在缓冲液中进行稀释直至含有吗啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 5.2、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0)、NaCl(1M)和化学活化剂(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，终浓度为75mM)的最终组合物，并在50℃孵育1小时。DNA终浓度为0.5mM。通 过变性PAGE(10％凝胶)来分析反应混合物，所述变性PAGE凝胶用SYBR Green(由DMSO储液在TBE-EtOH(96％)1∶1中作10000倍稀释)孵育10分钟。 
涵盖了pH 5.2-8.0的所有7个泳道显示出关于交联的oligovip016-vip017-Tyr的强条带，表明具有在其中可进行操作的宽的pH窗。因此，使用上述条件，受体胺的质子化或反应中间体的水解不是严重问题。 
实施例14
在不同水平的有机溶剂下，在反应中心中的酰化反应的稳定性 
为了证实DNA星形结构的稳定性，在H2O和有机溶剂的混合物中进行1个氨基酸的转移，从而类似于在有机化学合成中使用的条件。如果碱基配对和星形结构在这些条件下被破坏，则交联产物不能形成。根据与水的可混性以及在有机合成中的一般适用性选择溶剂二噁烷、乙腈和四氢呋喃。 
将oligo vip016、vip008和vip017-Phe(DNA Technology Arhus，Denmark，如实施例11中所述进行衍生的vip017)以20μM储液在含MOPS(200mM，pH 6.5；Fluka#69947)和NaCl(2M；Fluka#71376)的缓冲液中混合，并对其实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。该退火混合物在溶剂和水的混合物中进行稀释直至含有吗啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 6.5)、NaCl(1M)、溶剂(0、10、20、30或35vol％)和化学活化剂(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，终浓度为75mM)的最终组合物，将其在50℃孵育1小时。DNA终浓度为0.5mM。通过变性PAGE(10％凝胶)来分析反应混合物，所述变性PAGE凝胶根据厂商说明书用SYBR Green(Molecular Probes，#S7563)进行染色。结果显示于图22中。 
对于二噁烷，用高达20％的溶剂形成交联产物。另一方面，对于 包含乙腈或四氢呋喃的所有反应，形成的产物量相似，从而表明至少高达35％的有机溶剂的存在是被良好耐受的，并且DNA碱基配对是完好无损的。 
实施例15
在不同水平的DMF下，反应中心的稳定性 
为了证实DNA星形结构的稳定性，在H2O-DMF混合物中进行1个氨基酸的转移，从而类似于在有机化学合成中使用的条件。如果碱基配对和星形结构在这些条件下被破坏，则交联产物不能形成。 
将oligo vip016、vip008和vip017-Phe(DNA Technology Arhus，Denmark，如实施例11中所述进行衍生的vip017)以20μM储液在含MOPS(500mM，pH 6.5；Fluka#69947)和NaCl(4M；Fluka#71376)的缓冲液中混合，并对其实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。该退火混合物在DMF和水的混合物中进行稀释直至含有吗啉代丙磺酸(MOPS，12.5mM，pH 6.5)、NaCl(100mM)、DMF(0、10、20、30、40、50、60或70vol％的DMF)和化学活化剂(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，终浓度为75mM)的最终组合物，其在25℃孵育过夜。DNA终浓度为0.5μM。通过变性PAGE(10％凝胶)来分析反应混合物，所述变性PAGE凝胶根据厂商说明书用SYBR Green(Molecular Probes，#S7563)进行染色。结果显示于图23中。 
在前5个泳道中产生的产物条带具有类似的强度，从而表明至少高达40％的有机溶剂DMF的存在是被良好耐受的，并且DNA碱基配对是完好无损的。在50％的DMF时，仍可观察到微弱条带，但从60％开始及以上，没有检测到交联产物。 
实施例16
介导化学反应的不同活化剂 
这个实施例用于举例说明各种化学活化剂和辅助性亲核体如何能够用于介导受体胺与氨基酸的酰化。由肽化学已知，添加辅助性亲核体可以极大地提高酰化的速度和/或改变反应的最终结果。在这个实施例中，反应不使用辅助性亲核体来进行，使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，例如Fluka#56480)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(s-NHS，Fluka#56485)或N-羟基苯并三唑水合物(例如Fluka#54804)，使用DMTMM(Fluka#74104)或EDC(例如Fluka#03449)作为活化剂。 
将oligo vip016、vip008和vip017-Tyr(DNA Technology Arhus，Denmark，如实施例11中所述进行衍生的vip017)以20mM储液在含MOPS(200mM，pH 6.5)和NaCl(2M)的缓冲液中混合，并对其实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。该退火混合物用水和添加剂溶液进行稀释直至含有吗啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 6.5)、NaCl(1M)、辅助性亲核体(终浓度25mM)和化学活化剂(DMTMM或EDC，0.5M水溶液，终浓度为75mM)的最终组合物。DNA终浓度为0.5mM。反应在50℃孵育1小时。 
通过变性PAGE(10％凝胶)分析反应混合物，所述变性PAGE凝胶用SYBR Green(由DMSO储液在TBE-EtOH(96％)1∶1中作10000倍稀释)孵育10分钟。结果显示于图24中。 
反应1-4利用DMTMM作为活化剂，使用添加剂或不使用添加剂没有观察到差异。只有对于EDC的观察是最明显的，在这种情况下，没有观察到产物或只微弱地观察到产物。然而，任何一种辅助性亲核体的添加再次得到相当量的交联产物。这证实，当使用EDC作为活化剂时辅助性亲核体是必需的，否则它在反应混合物中是被良好耐受的。 
实施例17
氨基酸向其他受体的转移 
这个实施例证实了，氨基酸如何能够有效地转移至以各种方式连接的众多受体胺上。如前使用携带C6-NH2的vip016作为对照。其他受体是三肽GFL-vip016、连接有PEG的三肽GFL-PEG-vip016、氨基官能化的NH2-PEG-vip016、氨基官能化的NH2-C6-vip016和在G-vip016中的甘氨酸(所有均如在实施例XX中所述进行制备)。 
将oligo vip016-X-NH2、vip008和vip017-Gly(DNA TechnologyArhus，Denmark，如实施例XX中所述进行衍生的vip017)以20mM储液在含MOPS(200mM，pH 6.5)和NaCl(2M)的缓冲液中混合，并对其实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。该退火混合物用水和活化剂溶液进行稀释直至含有吗啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH6.5)、NaCl(1M)和化学活化剂(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，终浓度为75mM)的最终组合物。DNA终浓度为0.5mM。反应体系在50℃孵育1小时。 
通过变性PAGE(10％凝胶)来分析反应混合物，所述变性PAGE凝胶用SYBR Green(由DMSO储液在TBE-EtOH(96％)1∶1中作10000倍稀释)孵育10分钟。结果显示于图25中。 
所有6个反应均显示出来自交联产物的强条带。观察到，由于具有更大的肽(四肽)，泳道4和5与其他泳道相比在边上走得更慢。因此，将1个甘氨酸转移给经由三肽+/-PEG连接体、PEG连接体本身、C 6连接体或直接甘氨酸进行连接的氨基给出了一致的结果。这证实了由星形结构形成的反应器的坚固性。受体大小的增加对交联结果有很小的影响或没有影响。 
实施例18
2种结构型DNA展示产物的装配和后续结合 
形成2种结构型DNA展示产物：亮啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-DNA)和乱序的(scrambled)亮啡肽 (Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly-DNA)。后者被包括作为阴性对照，以用于利用亮啡肽特异性单克隆抗体3E7的划分性测定。图26中举例说明了该方法的关键步骤。 
DNA寡核苷酸从DNA Technology(Aarhus，Denmark)购买并如实施例11中所述进行官能化。 
该方法的第1个步骤涉及在2个分开的反应中进行下列oligo的退火，以分别形成亮啡肽-DNA和乱序的亮啡肽。在反应1(R1)中：Gly-Phe-Leu-PEG-vip231、Gly-BSOCOES-vip262和vip088(分别在3-向的DNA星形结构的位置1、2和3上)，和在反应2(R2)中：Gly-Tyr-Phe-PEG-vip238、Leu-BSOCOES-vip269和vip088(分别在3-向的DNA星形结构的位置1、2和3上)。反应中的3种oligo将互相杂交，从而形成3-向连结体，其中所联接的氨基酸位于结构的中心。注意到，vip088没有联接化学官能团。vip088的功能仅仅是与来自闭合的3-向连结体的其他两种oligo杂交。 
将200pmol的每种oligo在总体积为370μl的100mM吗啉代丙磺酸(MOPS，Fluka#69947)(pH 6.5)和1M NaCl中混合。通过在95℃孵育5分钟来进行oligo的退火，然后冷却至室温大约30分钟。将活化剂DMT-MM(Fluka#74104)溶解于水中，并添加直至终浓度为75mM。最终的反应体积为400μl。该化学反应体系在50℃孵育1小时。然后，通过向每个反应体系中加入2.5体积的乙醇和1μlGenElute(Sigma 56575)，并于4℃以20000×g将管离心30分钟，而对产物进行乙醇沉淀。粒状沉淀用70％乙醇洗涤，随后进行空气干燥，并重悬浮于水中。 
然后，根据厂商说明书对样品实施制备型变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：10％TBE-尿素凝胶(Invitrogen)。切下对应于交联产物的条带，并通过“压碎和浸泡(crush and soak)”法(Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory)来提取产物：将凝胶块压碎并在400TBE缓冲液中浸泡过夜。样品如上所述进 行乙醇沉淀。将沉淀物溶解于1×连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs)，50mM NaCl中。然后，5′端通过多核苷酸激酶进行磷酸化：将50单位的多核苷酸激酶(NEB M0201)包含在200μl的总反应体积中。反应体系在37℃孵育30分钟。 
然后，将两种交联的oligo通过DNA连接酶转化为连续的DNA链，所述DNA连接酶对于R1在并列的vip231的3′端和vip262的5′端之间形成磷酸二酯键，和对于R2在并列的vip238的3′端和vip269的5′端之间形成磷酸二酯键。在1×连接酶缓冲液，50mM NaCl中加入T4DNA连接酶(NEB M0202L)，并加入5单位/μl的酶，得到的最终反应体积为300μl。连接体系在16℃孵育过夜。 
然后，消除可切割的BSOCOES连接体。在600μl的最终反应体积中加入3-(环己氨基)-1-丙磺酸(CAPS，Fluka#29338)(pH 11.8)缓冲液和2-巯基乙醇(Fluka#63689)，分别得到100mM和60mM的终浓度。反应体系在37℃孵育2小时。然后通过添加200μl 1M MOPS缓冲液(pH 6.5)来中和反应体系。然后，DNA根据标准操作来进行乙醇沉淀。在将粒状沉淀空气干燥后，DNA准备用于下一步骤，这是在位置3上导入官能化的寡核苷酸。注意到，通过消除BSOCOES连接体，形成了两种伯胺：一种位于在原始位置1寡核苷酸上的正在生长的肽链的末端，和另一种位于原始位置2寡核苷酸上。所谓的“摆动(wobbling)”策略用于促进在正在生长的肽链和下一步骤中位置3上引进的氨基酸之间的后续反应：位置2上的oligo在经修饰的碱基上游包含一段碱基(摆动碱基)，它们在第一次化学转移过程中是未配对的，然而在第二次转移过程中它们与位置3的oligo进行碱基配对。因此，现在，原始位置2寡核苷酸上的伯胺通过一段dsDNA与结构中心分隔开，这将降低其与星形结构中心部分的反应性，因为dsDNA是刚性的。 
在下列条件下，R1产物与Tyr-BSOCOES-vip263退火，而R2产物与Gly-BSOCOES-vip270退火：200pmol oligo，在总体积为240μl的100mM MOPS(pH 6.5)，1M NaCl中。混合物在95℃孵育5分 钟，然后冷却至室温大约30分钟。然后，加入活化剂DMT-MM(Fluka#74104)至终浓度为75mM，用于促进氨基酸之间的化学反应。化学反应体系在50℃孵育1小时。样品通过乙醇进行沉淀，并随后对其实施制备型变性PAGE(如上所述)，其中从凝胶上切下对应于交联产物的条带。然后，每种交联产物通过DNA连接酶转化为连续的DNA链，分别地，所述DNA连接酶对于R1在并列的原始vip232的3′端和vip263的5′端之间形成磷酸二酯键，和对于R2在并列的原始vip269的3′端和vip270的5′端之间形成磷酸二酯键。 
此外，在相同反应中通过DNA连接酶导入末端PCR引发位点。将具有PCR引发位点的DNA oligo(对于R1和R2分别为vip029/vip070和vip029/vip030)在下列条件下进行预退火：在总体积为40μl的1×连接酶缓冲液和50mM NaCl中的200pmol每种oligo，并在PCR机器中在95℃孵育5分钟和在下列温度下孵育30秒：80℃、65℃、50℃、45℃、30℃、20℃。 
当vip070与vip029退火时，vip070的4个最5′末端的核苷酸是突出的。这4个与vip231中4个最5′末端的核苷酸逆向互补，当vip231与vip263退火时所述核苷酸同样也是突出的。因此，突出末端可以退火并形成用于DNA连接酶的底物。同样地，当vip030与vip029退火时，vip070的4个最5′末端的核苷酸是突出的。这4个与vip238中4个最5′末端的核苷酸逆向互补，当vip238与vip270退火时所述核苷酸同样也是突出的。将交联的、经凝胶纯化的产物重悬浮于1×连接酶缓冲液、50mM NaCl中，并与预退火的包含PCR位点的DNA oligo(对于R1和R2分别为vip029/vip070和vip029/vip030)混合。DNA5′末端首先通过在200μl的最终体积中的50单位多核苷酸激酶(NEB0201L)进行磷酸化。允许反应体系在37℃孵育30分钟。 
然后，将DNA通过T4DNA连接酶转化为连续的DNA链，其在R1和R2中分别由vip029-vip231-vip262-vip263-vip070和vip029-vip238-vip269-vip270-vip030组成。向反应体系中加入在1×连接酶缓冲液、50mM NaCl中的1500单位T4DNA连接酶(NEB 0201L)，得到的最终反应体积为300μl。连接反应体系在16℃孵育过夜。然后，如上所述消除BSOCOES连接体。样品通过乙醇进行沉淀，并随后对其实施制备型变性PAGE，再次乙醇沉淀，并如上所述溶解于20μl水中。经装配的产物现在准备用于引物延伸。 
在上述操作过程中，如上所述通过变性PAGE取出小样品以用于分析。凝胶图像显示于图27中。泳道1和2显示了，分别对于R1和R2，成功形成的、交联的、官能化的oligo vip-231(35nt)/vip262(68nt)和交联的vip-238(35nt)/vip-269(68nt)。交联产物以约200bp的表观大小迁移。观察到的由于所形成的产物中的强二级结构而造成的实际大小和表观大小之间的差异是意料中的，所述强二级结构由于逆向互补序列甚至在变性凝胶中也存在。此外，观察到尺寸较小的条带，它最可能来源于全长种类的降解。 
泳道3和4分别对于R1和R2显示了在连接2种oligo和消除BSOCOES连接体后的产物。主要产物以150bp的表观大小迁移。此外，还观察到最可能由于全长种类降解而产生的尺寸较小的条带。注意到，泳道1和3(以及泳道2和4)中的种类的大小几乎相等，但在凝胶中的迁移明显不同。这是意料中的因为泳道1和2中的种类基本上是支化的DNA分子，而泳道3和泳道4中的种类是线性DNA分子。 
泳道5和6分别对于R1和R2显示了位置3的oligo交联后的产物。在这两个反应中，位置3的oligo为74nt。因此，预期产物为177nt。然而，交联种类在凝胶中的表观大小为约600bp。这是意料中的，因为该种类由具有非常强的二级结构的、交联的线性DNA分子组成，所述二级结构由于DNA星形结构的臂中的逆向互补序列而引起。甚至包含尿素的PAGE都不能使该结构变性。 
泳道7和8，分别对于R1和R2，包含在连接位置3的oligo与包含PCR位点的oligo以及消除BSOCOES连接体后的产物。包含PCR引发位点的oligo总共添加了64nt，因此所需产物为241nt。观察到表观大小超过1000bp的两条显著的条带。较高的条带最可能包含全长产物，而较低的条带最可能包含缺少所述两个包含PCR位点的oligo 之一的分子。此外，在泳道8中，可见600bp的表观大小迁移的条带。该条带最可能表示连接有不包含PCR位点的oligo的种类(比较泳道8和6)。 
泳道9包含100bp DNA梯(Fermentas，SM0248)。 
引物延伸 
对经装配的产物实施引物延伸，这使在中心有化学产物的星形结构中折叠的DNA转化为在表面上展示有化学产物的线性双链分子。反应由vip038引发，所述vip038与经装配的分子的3′逆向互补。反应在1×Thermopol缓冲液、0.2mM dNTPs、8mM MgSO4、1M甜菜碱(Sigma、B-0300)、0.4μM vip038、0.2U/10μl Vent(exo-)(NEB M0259L)、和5μl作为模板的装配分子中进行，在10μl引物延伸反应体系中。反应混合物在95℃孵育2分钟、在60℃孵育30秒和在74℃孵育5分钟。 
结合测定 
展示合成肽的DNA在电泳迁移率变动分析法(EMSA)中进行分析。结合的证实将确定由结构型DNA指导从载体模块正确合成化合物的能力。 
这个测定法改编自文献(Halpin和Harbury，PLoS Biol，2，E174，2004)。将10μL R1(亮啡肽-DNA)或R2(乱序的亮啡肽-DNA)的引物延伸产物各自置于4个管中。向管R1-1和R2-1中加入1μL 0.5mg/ml 3E7抗亮啡肽单克隆抗体(Chemicon，cat#MAB5276)、1μL 1MTris-HCl pH 7.2和1μL 0.1％Triton-X/PBS。向管R1-2和R2-2中加入1μL 0.5mg/ml W6/32单克隆抗体(Sigma，H1650)、1μL 1MTris-HCl pH 7.2和1μL 0.1％Triton-X/PBS。向管R1-3和R2-3中加入1μL 0.5mg/ml 3E7抗亮啡肽单克隆抗体、1μL 20μM亮啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)(Schafer-N，Denmark)和1μL 1MTris-HCl pH 7.2。向管R1-4和R2-4中加入1μL 0.5mg/ml 3E7抗 亮啡肽单克隆抗体、1μL 20μM乱序的亮啡肽(Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly)(Schafer-N，Denmark)和1μL 1M Tris-HCl pH 7.2。所有样品在室温下搅拌孵育1小时。向每个样品中加入1.4μL 10×上样染料(Invitrogen，cat#10816-015)，并将整个量上样到凝胶上。还上样了1μL的100bp和1kb梯(Fermentas#SM0248和#SMO318)。10％PAGE TBE凝胶(Invitrogen)在220mV和15mA下冷运行45分钟。根据厂商说明书，将凝胶在SYBR GreenTM核酸染料(MolecularProbes)中显色20分钟。凝胶图像显示于图28中。结果是：在所有泳道中均观察到表观大小为200-250bp的2个显著条带。该条带最可能包含具有双链DNA的种类(进一步的证据可以在例如实施例21中找到)。较高的条带很好地对应于所预期的241bp的全长产物，而较低的条带最可能包含缺少vip029的种类，它将给出30bp的较小产物。在所有泳道中均观察到表观大小为约1000bp的2个显著条带。该条带最可能包含具有折叠为星形结构的DNA的种类：较高的条带最可能包含全长产物，而较低的条带最可能包含缺少所述两个包含PCR位点的oligo之一的分子。 
在包含R1-1的泳道1中，观察到表观大小为约1500bp的条带。这个条带最可能包含与3E 7抗体结合的亮啡肽-DNA产物，这减缓了整个复合物的电泳迁移。如泳道2(R1-2)中所显示的，当将R1产物用IgG2A同种型匹配的阴性对照抗体进行孵育时，这个条带不存在。通过游离的可溶性亮啡肽的竞争结合而进一步增强了相互作用的特异性：在泳道3中，当R1产物、3E7和游离的亮啡肽共孵育时，所述凝胶-变动条带不存在。当游离的可溶性乱序亮啡肽存在时，在包含R1-4的泳道4中没有看到竞争。包含R2-1、R2-2、R2-3和R2-4的泳道5-8分别显示，如所预期的，阴性对照R2产物(乱序的亮啡肽-DNA)不与3E7结合。 
扩增 
为了证实凝胶-变动条带和其他条带的DNA是完整，切下凝胶块并 提取DNA用作PCR的模板。切下图29中在框中的凝胶块，并通过“压碎和浸泡”法(Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs HarborLaboratory)来提取产物：压碎凝胶块并在400μl TE缓冲液中浸泡过夜。将管在20000×g下旋转10分钟，并将上清液转移到新管中。然后利用5μl在20μl反应体系中稀释200倍的上清液进行PCR[1×聚合酶缓冲液、0.2mM dNTP、6mM MgSO4、0.2μM vip027、0.2μM vip028、0.5M甜菜碱(Sigma，B-0300)、0.1mg/ml BSA、0.08单位/μl Vent(exo-)(NEB M0259L)]。在热循环仪中进行95℃30秒、60℃30秒、74℃30秒的20个循环，和将2μl样品在10％的非变性PAGE(Invitrogen)上进行分析，并且根据厂商说明书用SYBRGreen(Molecular Probes)染色并摄像。结果显示于图29中。泳道M包含100bp DNA梯(Fermentas，SM0248)。泳道1-5包含具有经凝胶纯化的模板的反应体系；在所有泳道中，观察到对应于预期大小的全长产物的约250bp的显著条带。相反地，在包含无模板的阴性对照的泳道6中，没有观察到条带。因此，据此证实可以形成、划分和扩增结构型DNA展示产物。 
总之，R1产物与3E 7抗-亮啡肽抗体的特异性结合最终证实了，亮啡肽通过该方法被正确装配。此外，已显示，将展示配体的产物与不展示配体的产物划分开确实是可行的。例如，如本文通过分离凝胶变动条带而简单举例说明的。此外，划分出的产物可以进行扩增以用于随后通过例如DNA测序进行鉴定，或在转变(translation)过程中用作模板，从而允许进行选择和扩增的循环。 
实施例19
DNA星形结构指导的还原性氨化 
本实施例用于举例说明结构型DNA可以指导还原性氨化。选择还原性氨化作为重要且广泛应用的化学选择反应的例子。 
oligo从DNA Technology(Arhus，Denmark)获得。寡核苷酸vip046用DST(二琥珀酰亚胺酒石酸盐，Pierce#20589)在寡核苷酸中经修饰的内部dT上的伯胺处进行乙酰化，随后用NaIO4(Aldrich#31，144-8)进行氧化切割，以产生乙醛酸官能化的oligo。寡核苷酸(2.5nmol)在包含400mM pH8.8磷酸钠缓冲液的40％DMF/水混合物中用DST(10mM)进行处理。反应总体积为100μL。反应体系在25℃孵育2小时。随后加入NaIO4(50μL的150mM溶液)并在25℃再孵育2小时。将反应混合物稀释至200μL，并根据厂商规程在旋转柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上进行纯化，随后根据实施例11通过HPLC进行纯化和进行质谱分析。得率：36％。 
DNA               计算出的质量  测得的质量 
vip046-NHCOCHO    6653.2026     656.1 
具有经修饰的内部dT(胺-C6-dT)的苯甲醛-官能化的oligo的合成(位置n＝1)(vip046-NHCOC6H4CHO) 
利用由DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐酸盐，Fluka#74104)促进的4-羧基苯甲醛(Lancaster#8192)对寡核苷酸vip046进行酰化，方法为：用50mM DMT-MM处理溶解于包含150mM NaCl、200mM pH 8.8磷酸钠缓冲液的40％DMF/水混合物中的寡核苷酸(2.5nmol)。总反应体积为100μL。反应体系在25℃孵育4小时。反应混合物根据厂商规程在旋转柱(AmershamBiosciences#27-5325-01)上进行纯化，随后根据实施例11通过HPLC进行纯化和进行质谱分析。得率：53％。 
DNA                   计算出的质量  测得的质量 
vip046-NHCOC6H4CHO    6729.233      6729.9 
结构型DNA指导的还原性氨化 
在反应1和5中，将分别携带乙醛酸和4-甲酰基苯甲酸的酰胺的两种vip046衍生物与等摩尔量(各为10pmol)的vip017和vip008 在缓冲液中混合，所述缓冲液包含吗啉代丙磺酸(Fluka#69947；MOPS，100mM，pH 5.2)和NaCl(Fluka#71376，1M)的最终组成。对溶液实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。将反应物(NaCNBH3；Sigma#156159，1M水溶液，终浓度为100mM；反应总体积为20μL)加入退火混合物，并在30℃孵育2小时。 
对于两种醛的平行运行的对照： 
●将vip017调换为不携带胺的vip007(反应2+6)； 
●省去vip008以便测试与三聚体相比的二聚体的有效性(反应3+7)； 
●vip046-CHO尝试与vip019交联，从而执行不能碱基配对的oligo之间的反应(反应4+8)。 
将所有8种反应混合物稀释至50μl并进行EtOH沉淀(加入GenElute(0.5μL；Sigma 56575)和96％EtOH(生物化学级；250μl))。在冰上孵育15分钟，随后在14000rpm下于4℃旋转4分钟。倾析出上清液，使管短暂旋转，通过移液管去除剩余的液体，并允许粒状沉淀在空气流中干燥。 
将粗制的DNA溶解于水中，并通过10％变性PAGE(Invitrogen)进行分析，并随后根据厂商说明书用SYBR Green(Molecular Probes)进行染色。凝胶图像显示于图30中。迁移率相应于60-70nt的新条带的形成证实了预期的vip046(21nt)和vip017(42nt)的交联(泳道5和9)。在使用vip007(所述vip007等同于vip017，除了前者在内部dT上没有胺之外)的对照实验中没有观察到交联，表明选择性反应(泳道6和10)。在二聚体中形成相同产物，但观察到强度略低的条带(泳道7+11)。对于不能碱基配对的oligo没有观察到产物，表明匹配的序列是产物形成所必需的(泳道8+12)。 
因此，结构型DNA能够以高度特异性的方式指导还原性氨化。 
实施例20
结构型DNA指导的脲形成 
本实施例用于举例说明结构型DNA可以指导脲形成。选择2个胺之间的脲形成作为重要且广泛应用的反应的例子。脲类是医学化学中已知的电子等排体(isoster)。 
oligo从DNA Technology Arhus，Denmark获得。 
由3-向DNA连结体组成的DNA星形结构被装配成包含2个氨基官能化的oligo和1个辅助性oilgo。oligo vip046、vip017和vip008以等摩尔量(各为10pmol)在缓冲液中混合，所述缓冲液包含吗啉代丙磺酸(Fluka#69947；MOPS，100mM，pH 8.0)和NaCl(Fluka#71376；1M)的最终组成。对溶液实施退火程序(PCR机器：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。退火混合物是终浓度为10、50或100mM(反应总体积为20μL)的脲形成试剂(碳酸N，N′-二琥珀酰亚胺酯(N，N′-Disuccinimidyl carbonate)，Aldrich#225827(在DMF中为0.45M)；或双(4-硝基苯基)碳酸酯，Aldrich#161691(在DMF中为1.0M))，并在37℃孵育90分钟。 
通过10％变性PAGE(Invitrogen)来分析每种反应混合物的等分试样。根据厂商说明书通过SYBR Green染料(Molecular Probes，#S7563)来显现条带。 
PAGE图像显示于图31中。迁移率相应于60-70nt的新条带的形成证实了预期的vip046(21nt)和vip017(42nt)的交联(泳道5-10)。有趣的是，随着偶联试剂的量增加，形成的产物量减少。然而，这种观察结果可以如此来解释：试剂分子与2个氨基反应，从而将2个胺转化为亲核体。因此，较低浓度的试剂可以允许正好一个胺形成中间体氨基甲酸酯，它与另一个胺快速反应从而形成预期的脲。 
因此，结构型星形DNA能够指导脲形成。 
实施例21
DNA星形结构的电迁移率 
这个实施例证实了结构型DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电迁移率。 
结构型DNA具有与双链DNA明显不同的构象。后者是线性延长的分子，而结构型DNA具有更为球形的结构。因此，预期到这两种构象在凝胶中的不同迁移样式：结构型DNA具有远远超过双链线性DNA相似物的表观大小。为了证实这种现象进行下列实验： 
通过5种oligo vip029、vip161、vip192、vip193和vip207的连接而形成具有末端PCR引发位点的三聚体DNA星形结构。这种组织构造的示意图显示于图32中。 
DNA oligo(由DNA Technology 
Figure G05838052720070511D000821
Denmark制备)各自以2μM的浓度在1×连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl中混合。混合物如下进行孵育：94℃5分钟、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步骤。退火操作在Applied Biosystems AB2720 PCR机器上进行。寡核苷酸的5′末端通过T4DNA多核苷酸激酶进行磷酸化。制备由1.5μM星形结构、1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.17u/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)组成的混合物，并在37℃孵育30分钟。通过在10μl体积的1×DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)、50mM NaCl和200U T4 DNA连接酶(New England Biolabs，cat#M0202)中的T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs，cat#M0202)并在16℃孵育过夜，而在经退火的寡核苷酸的并列末端之间形成磷酸二酯键。 
PCR扩增 
0.04μl连接反应产物在400μl PCR反应混合物[1×ThermoPol缓冲液(New England Biolabs B9004S)、0.2mM dNTPs(New EnglandBiolabs O447S)、8mM MgSO4、0.2μM vip202和vip224μM、0.5M甜菜碱(Sigma B0300)、1U/100μl Vent(exo-)(New England Biolabs M0257L)]中用作模板。采用下列循环条件在50μl等分试样中进行PCR扩增：92℃30秒，和92℃/15秒、50℃/15秒、70℃/30秒的25个循环。 
样品通过加入1ml乙醇和1/10的3M乙酸钠(pH 5.2)进行乙醇沉淀，在冰上孵育30分钟，并以20000×g离心30分钟，弃去上清液并将粒状沉淀重悬浮于1×上样缓冲液(Invitrogen)中，和对其实施制备型10％非变性PAGE(Invitrogen)，并根据厂商说明书用SYBRGreen(Molecular Probes，S7563)进行染色。凝胶图像显示于图32中。泳道M包含100bp DNA梯(Fermentas，SM0248)。分离出2个条带：约250bp的条带(A)和表观大小超过1000bp的条带(B)。切下图32中在框中的凝胶块，并通过“压碎和浸泡”法(Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory)来提取产物：压碎凝胶块，并在400μl TE缓冲液中浸泡过夜。将管在20000×g下旋转10分钟并将上清液转移到新管中，如上所述进行乙醇沉淀并重悬浮于100μl水中。 
引物延伸 
随后执行利用分离出的DNA作为模板的引物延伸。在包含[1×ThermoPol缓冲液(New England Biolabs B9004S)、0.2mM dNTPs(New England Biolabs O447S)、8mM MgSO4、0.5M甜菜碱(SigmaB0300)、1U/100μl Vent(exo-)(New England Biolabs M0257L)]的20μl反应体系中使用2μl模板。对于反应1和5不包括引物，在反应2和6中包括0.2μM vip202，在反应3和7中包括0.2μM vip224，和在反应4和8中包括0.2μM vip202和224。引物延伸如下进行：将样品在95℃孵育1分钟，在50℃孵育15秒和在70℃孵育30秒。如上所述，10μl反应产物通过10％PAGE进行分析。 
讨论和结论 
首先，利用含末端PCR引发位点的三聚体DNA星形结构作为模板来进行PCR。其次，对样品实施制备型PAGE，其中分离出2个条带：表观大小为约250bp(双链PCR产物的预期大小为241bp)的条带(A)和表观大小超过1000bp的条带(B)。最后，分离出的DNA在引物延伸反应中用作模板并通过PAGE进行分析。如图32中所示，使用正向引物(泳道2和6)和反向引物(泳道3和7)，两种模板均产生大小为约250bp的双链产物。此外，当存在两种引物时，形成更多的产物(泳道4和8)。这举例说明了，条带A和B均包含预期的241bp产物，因此凝胶中迁移率的差异是由于折叠：推测A为双链线性产物，而B为折叠为星形结构的DNA。 
有趣的是，如泳道1中所示，在引物延伸反应中不存在任何引物时，只观察到有限的约250bp的双链条带，甚至当起始物为双链DNA时。这完全是由于样品经历了热变性和复性循环，这将导致形成双链DNA和折叠为星形结构的DNA的混合产物。在起始材料是条带B的泳道5中观察到相同现象。 
因此，据此证实，长度为241个核苷酸的DNA分子可以折叠为构象(星形结构)，这导致在非变性凝胶中出现超过1000bp的表观大小。 
实施例22
DNA星形结构的转变 
这个实施例证实了DNA星形结构的转变过程的原理。在这个上下文中，转变过程是其中各个位置上的单个模块由新模块置换的过程，并且置换过程由密码子/反密码子识别指导。新模块可以具有以这样的方式联接的化学反应物，即使得在新模块将是其一部分的新DNA星形结构进行正确折叠后，它将位于中心或中心附近。因此，转变允许合成由DNA星形结构编码的化学化合物。 
用于转变过程的起始材料可以是使用选择过程的输出物作为模板 的PCR产物，例如如实施例18中所示。这将允许选择和扩增的反复循环，这反过来又会允许不同的文库转变为用于所应用的选择压力的解决方案。 
转变过程的概要 
图33中显示了使用PCR产物作为起始材料的转变过程的主要步骤的示意图。 
首先，通过利用生物素化的反向引物的PCR来扩增DNA星形结构，这允许分开两条链。通过使用链霉抗生物素蛋白磁性珠来进行分离。将目的链(上链)从珠上洗脱并折叠为具有2个干-环和干的DNA星形结构。随后位置1的干(不含环)通过限制性内切酶Bsa I消化，所述酶在其识别序列外进行消化并形成5′突出部分。这个突出部分是对于位置1的密码子。 
然后，将具有合适的5′反密码子序列的对于位置1的新载体模块与星形结构连接。为了帮助连接和下游纯化，包括了生物素化的辅助oligo。辅助oligo与新位置1载体模块以这样的方式杂交，即使得它产生5′突出部分，其是反密码子。因此，随后的连接(辅助oligo/星形结构/模块1)由密码子/反密码子杂交指导。 
然后，将位置1上的原始模块从星形结构中释放出来，方法为：首先执行变性步骤，其中新载体模块替代星形结构中的原始位置1模块，随后在起初位于第2个干的远端环中的序列中进行限制性内切酶消化。通过这个过程，去除了原始位置1模块和与星形结构配对的碱基之间的共价键。在被捕获于经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠上的星形结构上进行限制性内切酶消化。因此，从珠上释放出的星形结构成功地进行了关于位置1的转变。 
注意到，在折叠为星形结构后，新位置1模块的3′末端参与形成第二个干和紧在处于位置2上的密码子前的干末端。因此，使新模块1的3′末端排直以用于接受位置2的新载体模块，由位置2的密码子/反密码子相互作用指导。因此，该结构准备用于第二个密码子/反密码 子指导的模块置换。因此，通过重复关于星形结构中所有位置的所述置换过程，实现了完全转变。 
星形结构的形成 
第1个步骤包括5种oligo的退火：vip206、vip161、vip192、vip193和vip207。图34A显示了该组织构造的示意图。反应中的5种oligo将互相杂交，从而形成3-向连结体，它由在远离3-向连结体中间的末端处具有5′和3′未杂交序列的2个干-环和1个干组成。未杂交序列表示PCR引发序列(vip206的5′区段和vip207的3′区段)。在体积为10μl的1×连接酶缓冲液(NEB B0202S)、50mM NaCl中将oligo与20pmol的每种寡核苷酸进行混合。通过在PCR机器中进行孵育来实施退火：在95℃孵育5分钟，和在下列温度下孵育30秒：80℃、65℃、50℃、45℃、30℃、20℃。 
然后，5′末端通过多核苷酸激酶进行磷酸化：将2.5单位的多核苷酸激酶(NEB M0201)包括在1×连接酶缓冲液、50mM NaCl中，反应体积为15μl。反应体系在37℃孵育30分钟。 
经退火的oligo通过DNA连接酶转化为连续的DNA链，所述DNA连接酶分别在并列的vip206的3′末端和vip161的5′末端之间，和在并列的vip161的3′末端和vip192的5′末端之间，和在并列的vip192的3′末端和vip193的5′末端之间，和在并列的vip193的3′末端和vip207的5′末端之间形成磷酸二酯键。在1×连接酶缓冲液、50mMNaCl中加入T4DNA连接酶(NEB M0202L)，并加入20单位/μl的酶，得到的最终反应体积为20μl。连接体系在16℃孵育过夜。DNA星形结构以400μl的反应总体积在1×Thermopol缓冲液(NEBM0257L)、8mM MgCl2、0.2mM dNTPs、0.5M甜菜碱(Sigma B0300)、1μg/ml BSA(NEB B9001S)、0.1μM引物(vip202和vip224)和32单位的Vent(exo-)(NEB M257L)中进行PCR扩增。vip224在5′末端含有生物素部分，使得能够在经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠上捕获PCR产物。进行扩增，条件为：92℃30秒的初始变性，随 后为在92℃孵育30秒、在60℃孵育15秒和在70℃孵育30秒的25个循环。最后在70℃延伸1分钟。 
在PCR扩增后，根据说明书用Eppendorf试剂盒(0032 007.740)对PCR产物进行净化。使用两种柱。对于每种柱用150μl TE进行洗脱。然后，将经净化的PCR产物加到经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynal MyOne，605.02)上。100μl珠在2×BWT缓冲液(10mMTris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，2M NaCl，0.1％Triton X-100)中洗涤两次。将珠悬浮于300μl 2×BWT中，并将300μl经净化的PCR产物加到珠中。将珠在室温下于缓慢振荡的同时孵育15分钟。在磁体上捕获珠，并去除上清液。珠用1×BWT(2×BWT的一半强度)洗涤三次。通过加入50μl 10mM NaOH而从在磁性珠上捕获的互补性生物素化的DNA链洗脱出DNA，并在室温下孵育5分钟。在磁体上捕获珠，并去除包含上部的DNA链的上清液，并立即用20μl 1M Tris-HCl(pH 7.2)中和。 
通过在分开的反应中使用正向和反向引物的引物延伸反应来测试洗脱出的DNA的纯度。在10μl反应体系中，在1×Thermopol缓冲液、8mM MgCl2、0.2mM dNTPs、1M甜菜碱和0.2单位的Vent(exo-)以及0.2μl模板和0.4μM vip202或0.4μM vip203/反应中，利用Vent(exo-)(NEB)进行引物延伸反应。引物延伸反应如下：95℃2分钟、60℃30秒和74℃5分钟。 
图34A中显示了该操作过程的概要。在整个该操作过程中，取出样品以用于通过PAGE进行分析。凝胶图像显示于图34B中。该凝胶还包含质量控制引物延伸反应。在泳道2中观察到预期大小为241bp的条带，它不存在于没有添加模板的阴性对照中(泳道1)。因此，DNA星形结构已被成功装配和扩增。此外，在泳道2中观察到表观大小超过1000bp的2个条带，其表示折叠的DNA星形结构(参见实施例21)。泳道3显示了PCR净化后的产物。 
产物经由在PCR产物的下链上的生物素部分而被捕获。流出物(flow through)显示于泳道4中。在此发现了表观大小超过1000bp 的2个条带中的较低条带，因此其既不含生物素也不与生物素化的链杂交。在洗涤珠后，通过破坏碱基配对的高pH来洗脱非生物素化的链。洗脱产物显示于泳道5中。观察到相当于表观大小超过1000bp的2个条带中的较低条带的单个条带，表明PCR产物的非生物素化的上链的成功分离。有趣的是，当PCR的两条链都存在时，只观察到表观大小超过1000bp的2个条带中的较高条带(泳道1和2)。因此，较高的条带最可能表示2个杂交的DNA星形结构分子，其经由末端PCR引发位点杂交。 
作为纯化的DNA的质量对照，执行2次引物延伸。在一个反应中使用正向引物(vip202)，和在第二个反应中使用反向引物(vip203)，它们分别在下部和上部的PCR链上进行引发。因此，如果分离的DNA是纯的，那么只有第二个反应应当产生引物延伸产物。因此，只在泳道7中观察到对应于预期大小为241bp的条带，而在泳道6中没有观察到引物延伸产物。因此，非常纯的制备物形式，实现了PCR产物的所需链的成功纯化。 
位置1上的密码子的暴露 
DNA星形结构包含2个干-环和1个干。不含环的干包含对于位置1的密码子。所述密码子通过Bsa I限制性内切酶消化而暴露，所述限制性内切酶在其识别序列外进行切割并形成4个核苷酸的5′突出部分，这个序列可以没有限制地进行选择，因此对于编码目的很理想。在这个上下文中，突出部分被称为对于位置1的密码子。 
对星形结构DNA实施Bsa I消化。在由vip161的5′末端和vip193的3′末端杂交而产生的第1个干(不含环的干)中发现了用于Bsa I的双链底物。注意到，Bsa I消化后获得的产物对应于在这个实施例开始时描述的vip161-vip192-vip193的序列。 
将110μl纯化的星形结构DNA与20μl 10×NEB3缓冲液和200单位的Bsa I(NEB R0535L)混合，总体积为200μl。将消化体系在50℃孵育2.5小时。对DNA实施标准的乙醇沉淀，然后将其施加至10 ％TBE-尿素凝胶(Invitrogen)以用于凝胶纯化。在图35中显示了SYBR Green染色后的凝胶图像。将未切割的DNA上样到泳道1中作为参照。观察到以超过1000bp的表观大小迁移的显著条带(注意，在泳道M中加入的标记的“溢出(spil over)”)。在加入了Bsa I消化物的泳道2-7中观察到多个条带，从而表明Bsa I消化不完全。但是，从凝胶上切下目的条带(在图中被框中的)，并且如前所述，通过“压碎和浸泡”法从凝胶块中提取出DNA，进行乙醇沉淀，并再溶解于40μl H2O中。 
由密码子/反密码子相互作用指导的新位置1模块的连接 
将新位置1模块vip271连接在经Bsa I消化并纯化的DNA星形结构上。将vip066包括在连接反应中作为连接助剂，并将生物素分子导入连接产物中，从而促进下游的纯化。vip271和vip066的退火将产生具有4个核苷酸的5′突出部分(vip271)的产物，其在这个上下文中被称为反密码子。因此，该序列以这样的方式选择，即使得它与DNA星形结构中位置1上的密码子逆向互补。因此，密码子/反密码子杂交能够指导2个新引进的oligo与DNA星形结构的连接。将vip271和vip066在10μl体积的1×连接酶缓冲液(NEB B0202S)、50mM NaCl中与50pmol的每种寡核苷酸混合。退火在PCR机器上利用上述退火程序进行。 
然后，将经退火的vip271/vip066与经Bsa I消化并纯化的DNA星形结构(30μl)混合，并且5′末端通过多核苷酸激酶进行磷酸化：将12.5单位的多核苷酸激酶(NEB M0201)包括在1×连接酶缓冲液、50mM NaCl中，反应体积为15μl。反应体系在37℃孵育30分钟。 
然后，所述分子的同族末端通过DNA连接酶进行连接，所述DNA连接酶在并列的vip066的3′末端和经Bsa I消化的DNA的5′末端之间、和在并列的经Bsa I消化的DNA的3′末端和vip271的5′末端之间形成磷酸二酯键。将T4 DNA连接酶(NEB M0202L)加入1×连接酶缓冲液、50mM NaCl中，并加入20单位/μl的酶，得到60μl的最 终反应体积。连接体系在16℃孵育过夜。 
置换 
下一个步骤是从星形结构中消除起始位置1模块。是所述分子进行重折叠，以允许新位置1模块成为3-向连结体的一部分，并消除起始位置1和DNA星形结构之间的共价键。此外，导入辅助oligo(vip194)，它与第2个干远端的起始环中的Pvu II位点退火(参见图36)，从而形成用于Pvu II的双链底物。因此，原始位置1模块和星形结构之间的共价键和碱基配对均被破坏。此外，导入新位置1模块作为3-向连结体的一部分。 
将43μl的连接反应产物在10mM Tris-HCl pH 8、1mM EDTA、100mM NaCl、0.1％Triton X-100中与200pmol vip194进行混合，总体积为60μl。变性和退火在PCR机器上进行，条件为：在95℃孵育5分钟，和在下列温度下孵育30秒：80℃、65℃、50℃、45℃、30℃、20℃。 
然后，在经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynal)上捕获DNA。将30μl珠在2×BWT(2M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8，1mM EDTA，0.1％Triton X-100)中洗涤两次。最后一次洗涤后，将珠悬浮于60μl 2×BWT中，并加入60μl vip194/星形结构退火反应产物。孵育在室温下于轻轻振荡的同时进行15分钟。在磁体上捕获现在具有与其联接的DNA的珠，随后悬浮于Pvu II消化缓冲液中：将22μl H2O和3μl 10×Pvu II消化缓冲液加入至珠中，并加入5μl Pvu II(10单位/μl；Fermentas ER0637)。消化体系在37℃孵育6小时。消化后，在磁体上将珠与上清液分离。 
在整个该操作过程中，保存等分试样以用于通过10％TBE-尿素凝胶(Invitrogen)进行分析，所述凝胶根据厂商规程用SYBR Green(Molecular Probes)进行染色。凝胶图像显示于图36中。 
在泳道1中上样纯化的经Bsa I消化的星形结构；观察到预期的表观大小为600nt的显著条带。在泳道2中上样经Bsa I消化的星形 结构与对于位置1的新模块/辅助gligo(vip066)的连接产物。观察到表观大小超过1000nt的显著条带，从而表明成功连接。在泳道4中上样在Pvu II消化后的珠。观察到表观大小超过1000nt的条带。通过与泳道2的比较看出，这个条带对应于未消化的DNA。然而，在来自Pvu II消化的上清液中(泳道5)，观察到表观大小为约600nt的条带。这个条带对应于预期表观大小为约600nt的成功置换产物。它在上清液中存在这一事实显示，位置1上的新模块已置换了星形结构中位置1上的原始模块。 
因此，证实了成功的转变，即密码子/反密码子指导的模块置换。 
实施例中使用的寡核苷酸的列表 
Figure G05838052720070511D000921
Figure G05838052720070511D000931
序列表
<110>Vipergen Pharmaceuticals Aps
<120>结构型核酸指导的化学合成
<130>130636
<160>49
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>1
ctcgttttcg agaccgactc tggaagtgtc accggatctg g                        41
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>2
ttggaaaaac caaccagatc cggtgactgt caaggctgag gt                       42
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>3
gagggagagc ctcacctcag ccttgactct tccagagtcg gt                       42
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>4
gagggagagc ctcacctcag ccttgactgg agaacgcatt ct                       42
<210>5
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>5
acacaagaag tgtagaatgc gttctcctct tccagagtcg gt                       42
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(27)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>6
ctcgttttcg agaccgactc tggaagngtc accggatctg g                        41
<210>7
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>7
ttggaaaaac caaccagatc cggtgacngt caaggctgag gt                       42
<210>8
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>8
gagggagagc ctcacctcag ccttgacnct tccagagtcg gt                       42
<210>9
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>9
gagggagagc ctcacctcag ccttgacngg agaacgcatt ct                       42
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>10
acacaagaag tgtagaatgc gttctccnct tccagagtcg gt                       42
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>11
actatgaggg ctgtctgtgg                                                20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>12
tagcaagccc aataggaacc                                                20
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>13
actatgaggg ctgtctgtgg cagtcacgag                                     30
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>14
aaaactcgtg actgggttcc tattgggctt gcta                                34
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<400>15
ttttcgagac cgactctgga agtgtcaccg gatctgg                             37
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’生物素化的
<400>16
actatgaggg ctgtctgtgg                                                20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’生物素化的
<400>17
tagcaagccc aataggaacc                                                20
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>18
actctggaag ngtcaccgga t                                              21
<210>19
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>5’P
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>19
gagggagagc ctcacctcag ccttgacaca cacncttcca gagtcggt                 48
<210>20
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>20
ctcgttttcg agaccgactc tggaagagtg tgttgtcacc ggatctgg                 48
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>21
cagccttgac ncttccagag t                                              21
<210>22
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>22
ctctctcgtg actgggttcc tattgggctt gcta                                34
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n＝胺-C6-dT
<400>23
actctggaag ngtcaccgga tctgg                                          25
<210>24
<211>58
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>24
gagggagagc ctcacctcag ccttgactct tccagagtgg ttcctattgg gcttgcta      58
<210>25
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>25
ttggaaaaac caaccagatc cggtgactgt gtgtgtcaag gctgaggt                 48
<210>26
<211>52
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>26
gagggagagc ctcacctcag ccttgacaca cactcttcca gagtcggtct cg            52
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>27
agagcgagac cgactctgga agtgtcaccg gatct                               35
<210>28
<211>68
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>28
ggttggcagg gcccactagc tcaggatcca cccaaccaga tccggtgact gtgtgtgtca    60
aggctgag                                                             68
<210>29
<211>74
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>29
gtgaggctga attctctgta cctggtacct ccctcacctc agccttgaca cacactcttc    60
cagagtcggt ctcg                                                      74
<210>30
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>30
gtgggccctg                                                           10
<210>31
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>31
gtggatcctg                                                           10
<210>32
<211>68
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>32
ggttggcaca gctgactagc tcagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgtgtca    60
aggctgag                                                             68
<210>33
<211>74
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>33
gtgaggctcc cgggtctgta cctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacactcttc    60
cagagtcggt ctcg                                                      74
<210>34
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>34
gtcagctgtg                                                           10
<210>35
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成
<400>35
gtgagctctg                                                           10
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>5’生物素
<222>(1)..(1)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n is a，c，g，or t
<400>36
ncttccagag tcggtctcg                                                 19
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n＝5’生物素
<400>37
ncagccttga ctcttccaga gt                                             22
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<400>38
caggtcgctg agaggttgac                                                20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<400>39
acgtccgagt cagaagtgtg                                                20
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<400>40
caggtcgctg agaggttgac cagtcacgag                                     30
<210>41
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<400>41
ctctctcgtg actgcacact tctgactcgg acgt                                34
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n＝5’生物素
<400>42
nacgtccgag tcagaagtgt g                                              21
<210>43
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>43
agagcgagac cgactctgga agngtcaccg gatct                               35
<210>44
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>44
ttttcgagac cgactctgga agngtcaccg gatct                               35
<210>45
<211>68
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>45
ggttggcaca gctgactagc tcagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgngtca    60
aggctgag                                                             68
<210>46
<211>74
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>46
gtgaggctcc cgggtctgta cctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacacncttc    60
cagagtcggt ctcg                                                      74
<210>47
<211>68
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>47
ggttggcaca gctgacaaaa acagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgngtca    60
aggctgag                                                             68
<210>48
<211>74
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>48
gtgaggctcc cgggtcgaga gctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacacncttc    60
cagagtcggt ctcg                                                      74
<210>49
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成的、任选衍生的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n＝NH2-C6-dT
<400>49
ctctcgagac cgactctgga agngtcaccg gatctggttg ggtgagctct g             51

Claims (21)

1.包含核酸和化学化合物的组合物，所述组合物形成限定从反应中心延伸的3个或更多个干的星形结构，其中所述干由核酸双链体形成，并且所述化学化合物已作为3个或更多个化学基团的反应产物在反应中心形成。
2.权利要求1的组合物，其中所述3个或更多个干从反应中心放射状向外延伸。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述核酸包含鉴定一种或多种化学基团的一种或多种密码子，所述化学基团已参与所形成的化学化合物的形成。
4.根据权利要求3的组合物，其中密码子位于干的末端。
5.根据权利要求4的组合物，其中在所述干的末端形成环。
6.根据权利要求5的组合物，其中密码子位于所述干-环结构的非碱基配对部分。
7.根据权利要求6的组合物，其中在所述干-环结构中存在限制酶切位点。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述环能够与至少与环的部分核酸序列互补的辅助寡核苷酸杂交，从而形成用于限制性内切酶的底物。
9.根据权利要求8的组合物，其中环存在于除了一个以外的所述干的所有末端上，以便形成邻接的核酸序列。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述邻接的核酸序列是酶促可延伸的。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述核酸包含用于DNA聚合酶、RNA聚合物或逆转录酶的引发位点。
12.根据权利要求11的组合物，其中所述引发位点存在于不具有环的干上。
13.根据权利要求12的组合物，其中干包含具有至少80％互补性的2个杂交区段，并且每个杂交区段由12个或更多个核苷酸组成。
14.根据权利要求13的组合物，其中每个杂交区段包含18个或更多个核苷酸。
15.根据权利要求1的组合物，其中所述化学化合物与所述核酸共价联接。
16.根据权利要求15的组合物，其中所述化学基团在反应前与所述核酸共价联接。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述共价联接中的一个或多个在与反应同时或在反应后进行切割。
18.根据权利要求17的组合物，其中除一个共价联接以外的所有共价联接在与反应同时或在反应后进行切割。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述化学化合物通过联接在所述核酸上的所述化学基团的反应而形成。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述化学化合物通过联接在所述核酸上的所述化学基团和一种或多种其他反应物的反应而形成，所述一种或多种反应物是不与核酸缔合的游离反应物。
21.组合物文库，其包括许多不同的根据权利要求1-20中任一项的组合物。
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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1401850A1 (en) 2001-06-20 2004-03-31 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
ATE414769T1 (de) 2002-03-15 2008-12-15 Nuevolution As Eine verbesserte methode zur synthese von matritzenabhängigen molekülen
WO2004013070A2 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Nuevolution A/S Multi-step synthesis of templated molecules
CN106337046B (zh) 2002-10-30 2021-03-23 纽韦卢森公司 合成双功能复合物的方法
EP1756277B1 (en) 2002-12-19 2009-12-02 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
EP1597395A2 (en) 2003-02-21 2005-11-23 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
EP1608748B1 (en) 2003-03-20 2009-03-04 Nuevolution A/S Ligational encoding of small molecules
DK1670939T3 (da) 2003-09-18 2010-03-01 Nuevolution As Fremgangsmåde til opnåelse af strukturel information om et kodet molekyle og fremgangsmåde til udvælgelse af forbindelser
DE602005017370D1 (de) 2004-03-22 2009-12-10 Nuevolution As Ligationscodierung unter verwendung von oligonukleotidbausteinen
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
EP1931806B1 (en) 2005-10-07 2011-10-05 California Institute Of Technology Pkr activation via hybridization chain reaction
ES2897529T3 (es) 2005-12-01 2022-03-01 Nuevolution As Métodos de codificación enzimática para la síntesis eficiente de bibliotecas grandes
WO2007124758A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-08 Vipergen Aps A method for preparing compounds by nucleic acid directed synthesis
WO2008106658A2 (en) 2007-03-01 2008-09-04 California Institute Of Technology TRIGGERED RNAi
US9217151B2 (en) 2007-05-16 2015-12-22 California Institute Of Technology Versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways
EP2241640B1 (en) * 2008-01-22 2016-06-22 Hiroshima University Nucleic acid-binding protein assay method and kit
US8497364B2 (en) 2008-02-27 2013-07-30 California Institute Of Technology Triggered RNAi
US8241854B2 (en) 2008-05-22 2012-08-14 California Institute Of Technology Triggered RNAi
US9359601B2 (en) 2009-02-13 2016-06-07 X-Chem, Inc. Methods of creating and screening DNA-encoded libraries
EP2452294A2 (en) * 2009-07-07 2012-05-16 The Procter & Gamble Company Property-space similarity modeling
EP3540059A1 (en) 2010-04-16 2019-09-18 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
US8658780B2 (en) 2010-05-18 2014-02-25 California Institute Of Technology Triggered covalent probes for imaging and silencing genetic expression
US8962241B2 (en) 2010-07-20 2015-02-24 California Institute Of Technology Triggered molecular geometry based bioimaging probes
US8877438B2 (en) 2010-07-20 2014-11-04 California Institute Of Technology Self-assembled polynucleotide structure
US9834439B2 (en) 2010-07-20 2017-12-05 California Institute Of Technology Biomolecular self-assembly
EP2622073B1 (en) 2010-09-27 2018-04-18 Vipergen A method for making an enriched library
WO2013036810A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 X-Chem, Inc. Methods for tagging dna-encoded libraries
US9078078B1 (en) * 2011-09-15 2015-07-07 Google Inc. Call forwarding methods and systems
DK2872680T3 (en) 2012-07-13 2018-07-09 X Chem Inc DNA-encoded libraries with coding oligonucleotide compounds that cannot be read with polymerases
US9856472B2 (en) 2013-07-01 2018-01-02 California Institute Of Technology Small conditional RNAs
GB201322692D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Philochem Ag Production of encoded chemical libraries
EP3218479A1 (en) 2014-11-11 2017-09-20 Nanocore ApS Method for identification of molecules with desired characteristics
NL2013857B1 (en) * 2014-11-21 2016-10-11 Piculet Biosciences Tech B V Self-assembled bivalent ligand complex (SABLC) libraries and methods for screening such libraries.
CA3024875A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Richard Edward Watts Oligonucleotide directed and recorded combinatorial synthesis of encoded probe molecules
ES2908919T3 (es) 2016-07-05 2022-05-04 California Inst Of Techn Reacción en cadena de hibridación de iniciador fraccionario
WO2018044939A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 California Institute Of Technology Immunohistochemistry via hybridization chain reaction
US11795580B2 (en) 2017-05-02 2023-10-24 Haystack Sciences Corporation Molecules for verifying oligonucleotide directed combinatorial synthesis and methods of making and using the same
IL297543A (en) 2017-11-30 2022-12-01 Arrakis Therapeutics Inc Nucleic acid-binding photoprobes and their uses
GB201817321D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Nanna Therapeutics Ltd Microbeads for tagless encoded chemical library screening
GB201821109D0 (en) * 2018-12-21 2019-02-06 Philochem Ag Nucleic acid encoded chemical libraries
ES2954675T3 (es) 2019-01-22 2023-11-23 Vipergen Aps Un método de cribado de una biblioteca de presentación in vitro dentro de una célula
US11873485B2 (en) 2021-01-26 2024-01-16 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide RNAs for cell-selective regulation of CRISPR/Cas

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024929A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Nuevolution A/S Proximity-aided synthesis of templated molecules
WO2004056994A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985000813A1 (en) * 1983-08-03 1985-02-28 The Research Foundation Of State University Of New Nucleic acid branched junctions with precisely defined migrational mobility
US5386020A (en) * 1991-01-10 1995-01-31 New York University Multiply connected, three-dimensional nucleic acid structures
US5278051A (en) * 1991-12-12 1994-01-11 New York University Construction of geometrical objects from polynucleotides
US6072044A (en) * 1996-04-26 2000-06-06 New York University Nanoconstructions of geometrical objects and lattices from antiparallel nucleic acid double crossover molecules
US7479472B1 (en) 1998-10-19 2009-01-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DNA-templated combinatorial library chemistry
CA2403209A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-19 Pavel V. Sergeev Synthesis of biologically active compounds in cells
US6951939B2 (en) * 2000-06-08 2005-10-04 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
EP1423400B2 (en) 2001-03-19 2013-05-22 President and Fellows of Harvard College Evolving new molecular function
WO2004016767A2 (en) 2002-08-19 2004-02-26 The President And Fellows Of Harvard College Evolving new molecular function
CN106337046B (zh) * 2002-10-30 2021-03-23 纽韦卢森公司 合成双功能复合物的方法
EP1562959A2 (en) 2002-11-01 2005-08-17 Pharmacia & Upjohn Company LLC Compounds having both alpha7 nachr agonist and 5ht antagonist activity for treatment of cns diseases
AU2002953366A0 (en) 2002-12-17 2003-01-09 Hearts And Minds Crm Pty Ltd A method of analysing a business network

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024929A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Nuevolution A/S Proximity-aided synthesis of templated molecules
WO2004056994A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods

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