JP4931825B2 - 構造核酸指向化学合成 - Google Patents
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- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
Description
本発明は、非天然ポリマーや小分子のような、種々の分子の表示を可能にする、インビトロDNAディスプレイテクノロジーのための組成物および方法を提供する。そのような方法の利点は、コンビナトリアルライブラリーが構築され、及び分子の進化を可能にする、所望の活性のための選択、増幅及び多様化のラウンド(rounds)に供され得ることである。
ディスプレイテクノロジーは情報ストレージと核酸の増幅能力を他の化合物の機能活性と組み合わせるために開発されてきた。ディスプレイテクノロジーは機能実体(functional entity)と機能実体の構造について情報を与える核酸配列の間の関連に依存する。そのような方法の利点は非常に大きなライブラリーが構築されて機能実体の所望の活性について証明され得ることである。それから所望の活性を有するライブラリーメンバーは所望の活性を有さないライブラリーメンバーから分けることができ、従って所望の活性を有するメンバーのより多くの分画を有する濃縮ライブラリーを作成する。この方法は選択と呼ばれる。それから濃縮ライブラリー中のライブラリーメンバーの構造はそれらの同族の核酸配列によって同定されることができ、従って物質の微小量からでさえ同定を可能にする。いくつかのディスプレイテクノロジーはさらにそのメンバーのアイデンティティ; 単なる核酸配列だけでなく機能実体も知ること無しで濃縮ライブラリーが増幅されることを可能にする。そのようなディスプレイテクノロジーは“増幅可能ディスプレイテクノロジー”と呼ばれる。選択と増幅の反復ラウンドが所望の活性の高められた濃縮を可能にして行われることができるので、これらのテクノロジーは特に大きなライブラリーを処理するときに利点がある。増幅可能ディスプレイテクノロジーのもう一つの利点は、選択、増幅及び多様化のラウンドが行われることができ、所望の機能を有する分子を進化させるために、従って自然選択におけるのと同じ原理を使用する。この方法は分子進化と呼ばれる。
本発明は有機化学の柔軟性を利用し、選択、増幅及び多様化のラウンドを可能にするインビトロディスプレイテクノロジーに関する。
(i)以下を含むN(N = 3-100)個のキャリアーモジュールを提供する工程:
(1)以下を有する1番目の位置のキャリアーモジュール
i)N位置のキャリアーモジュールの核酸セグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグメ ント、及び
ii)2番目の位置のキャリアーモジュールのセグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグ メント、
(2)n-1キャリアーモジュールの前記核酸セグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグメ ント、及びn+1キャリアーモジュールのセグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグメ ントを有するn位置のキャリアーモジュール(n = 2からN-1)、及び
(3)前記N-1キャリアーモジュールの前記核酸セグメントにハイブリダイズ可能な核酸セ グメント、及び前記1番目のキャリアーモジュールのセグメントにハイブリダイズ可能 な核酸セグメントを有するN位置のキャリアーモジュール、
ここで
前記キャリアーモジュールの少なくとも3個がハイブリダイゼーションセグメント間の 中間セクションに又はこの近くに位置する結合した化学基(CG)及び必要に応じてハイブ リダイゼーションセグメントの一方の外に位置するコドンセグメントを含む;
(ii)形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも1個と結合する、前記化学基を近傍に持ってくる、前記ハイブリダイゼーションセグメントのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記キャリアーモジュールを接触させる工程。
Nは化学構造の形成に使用されたキャリアーモジュールの総数を示す。従って、3個のキャリアーモジュールが化学構造の形成に使用されるとき、Nは3であり、4個のキャリアーモジュールが化学構造の形成に使用されるとき、そのときNは4であるなどである。nはキャリアーモジュールの特異的な位置を示す。
本発明の更なる局面によれば、N位置のキャリアーモジュールは、環状核酸を形成するように、1番目のキャリアーモジュールにライゲートされてもよい。
形成された化合物が少なくとも1個のキャリアーモジュールと結合している、反応基の反応を可能にする条件を提供すること; 及び
モジュールnへのモジュールn-1及びモジュールNへのモジュールN-1の末端のライゲーションを可能にする条件及びそれによってステムループ構造及び結合した化合物を有する連続した核酸分子を形成することを含む。
a)N個のハイブリダイゼーションセグメント及び相補するハイブリダイゼーションセグメントに加えてハイブリダイゼーションセグメントと相補するハイブリダイゼーションセグメントの間にN-1個のハイブリダイズしないセグメントを含む一本鎖の連続した核酸配列を提供する工程、
b)それによって少なくともN-1個のステムループと1個のステムを含む連続した核酸を形成する、分子内ハイブリダイゼーションに有利である条件下で核酸をハイブリダイズする工程;
c)それによって少なくともコドンセグメントを含むオーバーハングを生成する、前記ステム又はループに切断を導入する工程;
d)少なくとも以下を有するキャリアーモジュールの1番目のグループを提供する工程:
前記ステムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、隣接したステムループのステムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、必要に応じて結合した反応基、及びアンチコドンセグメント;
d)コドン及びアンチコドンセグメントのハイブリダイゼーションを可能にする条件を提供する工程; 及び
e)前記オーバーハングの退行 (recessive)末端に前記ハイブリダイズされたキャリアーモジュールの酵素的または化学的なライゲーションを可能にする条件を提供する工程; そして次の工程を行う;
i)それによって少なくとも隣接したコドンセグメントを含むオーバーハングを生成す る、前記コドン配列に隣接したステムループのループ又はステムを制限酵素で消化する 工程; 及び
ii)核酸を変性させる工程; 及び
iii)それによってN-1個のステムループと少なくとも前記隣接したコドンセグメントを 含むオーバーハングを有する1個のステムを形成する、分子内ハイブリダイゼーション セグメントに有利である条件下でハイブリダイズさせる工程; 及び
iv)形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも1個に結合する、前記 反応基の反応を可能にする条件を必要に応じて提供する工程; 及び
v)少なくとも以下を有するキャリアーモジュールの隣接したグループを提供する工程;
前記ステムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、及び隣接したステムループのス テムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、及び必要に応じて反応基を結合させ、及 びアンチコドンセグメントを有する工程;及び
vi)前記オーバーハングの退行 (recessive)末端にハイブリダイズされたキャリアーモ ジュールの酵素的な又は化学的にライゲーションを可能にする条件を提供する工程; 及 び
工程i)からvi)をN-1回繰り返す; 及び
f)前記1番目のキャリアーモジュールに結合した少なくとも前記アンチコドンセグメントを残しておいてキャリアーモジュールの前記1番目のグループの一部からなる前記ステムループ構造中に切断を導入する工程; 及び
g)核酸を変性させる工程; 及び
h)それによってN-1個のステムループと1個のステムを形成する分子内ハイブリダイゼーションに有利である条件下でハイブリダイズさせる工程; 及び
i)必要に応じて、形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも1個と結合する、前記反応基の反応を可能にする条件を提供する工程。
工程a)で使用された連続した核酸配列は幾つかの供給源から提供され得る。第一の局面によれば、核酸は上の方法によって提供され、しかしながら化学基を有さないダミーキャリアーモジュールを使用する。キャリアーモジュールを表すこれらの核酸は共にライゲートされるとき、直鎖又は環状の核酸が形成される。第二の局面によれば、工程a)の連続した核酸配列は形成された化合物を表示するための酵素伸長反応を行うことによって得られ得る。従って、星形構造の形成の後、一本鎖伸長産物又は伸長産物に相補しているストランドが工程a)で使用されるかもしれない。もし所望であれば、伸長産物は、核酸のコピー数を増幅するために、PCRのようなポリヌクレオチド増幅に供されてもよい。
所望の特性の化合物を有するライブラリーメンバーを得るためにライブラリーを探索(probing)すること;
所望の特性を有さないライブラリーメンバーから所望の特性を有するライブラリーメンバーを分けること; 及び
それによって所望の特性を有するライブラリーメンバーの濃縮プールを得ること。
問題の該モジュールと残りの構造の間の共有結合を取り除く、2種の連続した制限酵素で濃縮ライブラリーに由来する分子間ハイブリダイズした核酸構造を消化する工程、
消化された構造を変性する工程、
交配を得るために該モジュールを特定する核酸分画の交換を行い、消化された構造からの核酸フラグメントの再ハイブリダイゼーションを可能にすること、及び
適切な末端のライゲーション。
核酸
ここに記載されているように核酸にコード化される化学合成はコンビナトリアルディスプレイライブラリーの生成及び小分子や非天然ポリマーのような化合物の幅広い種類の選択、増幅及び進化の実行を可能にする。核酸は例えば、化学反応物を集め、化学反応物の3次元配置を指向し、化学合成履歴に関する情報を蓄積し、化学反応物の選択された組み合わせを適切に結びつけるために指向し及び化合物の多様化と交配を可能にするような多数の機能を提供する。
キャリアーモジュール-オリゴヌクレオチド部分
オリゴヌクレオチドは本発明で化学反応を指向するために使用される。この文脈でオリゴヌクレオチドはキャリアーモジュールと呼ばれ、それは少なくとも2個の位置特異的ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドセグメント、必要に応じてオリゴヌクレオチドコドンセグメント、及び反応性化学基を含む。
キャリアーモジュール-化学
広範囲の化合物及び/又は化合物ライブラリーはここに記載された方法を使用して調製され得る。ある実施態様で、核酸又はそれのアナログでない、又は類似しない化合物は本発明の方法に従って合成される。ある他の実施態様で、タンパク質又はそれのアナログでない、又は類似しない化合物は本発明の方法に従って合成される。
コンビナトリアルライブラリーの調製
伝統的なものと核酸指向ライブラリー合成の間の重要な実施上の相違は各操作のスケールである。スクリーニングと化合物同定のために必要となる物質の量のために、伝統的なコンビナトリアル合成は典型的にライブラリーメンバー当たりナノモル-マイクロモルスケールで進行する。対照的に、各核酸結合合成分子の微少量だけ(例えば約10-20 mol)が選択やPCR増幅のために必要となるので、核酸指向ライブラリー合成はフェムトモル-ピコモルスケールで生じる。核酸指向ライブラリー合成で一溶液方式(single-solution format)と併用された、スケールにおける大変大きな違いが必要とされる物質の調製を大きく単純化する。
選択
所望の活性(例えば、触媒活性、結合親和性、結合特異性、又は活性アッセイでの特定の効果)を有する反応生成物のための選択及び/又はスクリーニングは任意の標準的なプロトコルに従って行われてもよい。例えば、親和性選択(図3参照)はファージディスプレイ(Smith, Science, 228, 1315-7, 1998)、リボソームディスプレイ(Hanes et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 14130-5, 1998)、mRNAディスプレイ(Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 12297-302, 1997)又はDNAコード化学ライブラリー(WO 2004/016767, WO 2002/074929A2)のようなライブラリーに基づく方法での原理に従って行われもよい。触媒活性の選択は例えば、遷移状態アナログ親和性カラムでの親和性選択によって(Baca et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 10063-8, 1997)又は官能基(function)に基づいた選択スキームによって (Pedersen et al., Proc Natl Acad Sci U S A,95, 10523-8, 1998)行われてもよい。DNAの微少量(〜100分子)がPCRによって増幅され得るので、従ってこれらの選択は経済的であり効率的でもあり、所望の活性のための本当に幅広い探索を可能してこの大きさのスケールで行われ得る。
他の選択
触媒又は他の官能基活性のような、他の特性のための選択が行われ得る。一般に、選択は所望の活性を有するライブラリーメンバーが他のライブラリーメンバーと分離され得るようにデザインされるべきである。例えば、結合切断を触媒する能力を有するライブラリーメンバーのための選択は、問題の該結合によってビオチンを各ライブラリーメンバーに結合することによって行われ得る。それからストレプトアビジンを使用する分別(partitioning)は触媒活性を有するライブラリーメンバーを他から分離し得る。もう一つの例は結合形成能力を有するライブラリーメンバーについての選択である。これは、基質を各ライブラリーメンバーに結合させその後にビオチンが結合する基質を加えることによって、行われ得る。結合を形成する2種の基質間の反応はビオチンを触媒ライブラリーメンバーに結合させるであろう。それからストレプトアビジンを使用する分別は触媒活性を有するライブラリーメンバーを他から分離し得る。二量体化及び/又は重合のような、他の特性についての選択はまた行われてもよい。この場合にライブラリーメンバーは例えば、HPLC、アクリルアミド又はアガロースゲル又はサイズ排除カラムを使用して、形成された複合体のサイズによって分割され得る。
核酸増幅
濃縮ライブラリーメンバーの核酸部分の増幅は、核酸増幅のための標準的なプロトコルによって行われてもよい。これらの方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saiki et al., Science, 230, 1350-4, 1985)、核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence-based amplification)(NASBA)(Compton, Nature, 350, 91-2, 1991)、鎖置換増幅(strand displacement amplification)(Nycz et al., Anal Biochem, 259, 226-34, 1998)、自己維持配列複製(self-sustained sequence replication)(Mueller et al., Histochem Cell Biol, 108, 431-7, 1997)、プライマー伸長、及びプラスミド増幅(例えばSambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratoryを参照)を含む。
モジュール置換によるディスプレイライブラリーの構築
一つの実施態様で、本発明は濃縮ライブラリーメンバーの再構成/増幅又は表示を再生成するための濃縮ライブラリーメンバーの第二世代ライブラリーに関する。濃縮ライブラリーの場合では濃縮ディスプレイライブラリーは形成され、したがって選択と増幅と再アッセンブリのラウンドを可能にする。例えば、図4aで示されているように、濃縮ライブラリーメンバーの上記のPCR増幅オリゴヌクレオチドは分子内ハイブリダイゼーションに有利である条件下でハイブリダイズすることが可能になり、それによってステムと幾つかのステムループからなる星形構造は再生成される。ループのないステムは制限酵素のための認識部位を含んでもよく、それはアンビギュアス塩基(ambiguous base(s))を有するオーバーハングを生じる。生成されたオーバーハングでの配列のアンビギュアス塩基はコドンを含むために都合良く利用される。従ってステムの制限酵素消化はこの1番目の位置のためのコドン特異的オーバーハングを生ずる。制限酵素消化された星形構造はそれから1番目の位置のための2個の一定のセグメント及びCRGとアンチコドンの同族体ペアを含むキャリアーモジュールのレパートリーとハイブリダイズされる。その結果、コドン/アンチコドンハイブリダイゼーションはライゲートされるためのキャリアーモジュールと星形構造の適切なペアを可能にする。隣接するステムループはまたこの2番目の位置のためのコドン特異的オーバーハングを残すことができるもう一つの制限酵素のための認識部位を含んでいても良い。従ってこの2番目の制限酵素での消化は構造の残りにPCR増幅された1番目のモジュールの共有結合を取り除く。星形構造は変性し、その後分子内ハイブリダイゼーションに有利な条件下でハイブリダイズすることを可能にする。それによって星形構造が再生成されるが、今や(CRGを有する)位置1に新しいキャリアーモジュールを有し、位置2にループのないステムが位置する。この方法のラウンドは、CRGsの適切な組合せの近接誘導化学反応を許容して、すべての位置を置換するために行われる; それによってディスプレイライブラリーは増幅され、再構成される。最終的にPCRプライミング部位は星形構造にライゲートされてもよい。その結果、選択と増幅と再構成のラウンドは所望の濃縮が達成されるまで行われ得る(図5参照)。
オーバーハングのコード化容量(可能な異なるコドンの数)は制限酵素によって生成されるオーバーハングでのアンビギュアス塩基の数によって与えられる。すべてのN(N = A、T、G又はC)にとって4種の異なる残基が選択されることができ、すべてのH(H = A、C又はT)、V(V = A、C又はG)、B( = C、G又はT)及びD(D = A、G又はT)にとって3種の異なる残基が選択されることができ、そしてすべてのR(R = A又はG)、K(K = G又はT)、Y(Y = C又はT)、S(S = C又はG)及びM(M = A又はC)及びW(W = A又はT)にとって2種の異なる残基が選択され得る。その結果、コード化容量は各位置での異なる残基の数を互いに掛けることによって計算される。例えばSfi I;
5’-...GGCCNNNN/NGGCC...-3’
3’-...CCGGN/NNNNCCGG...-5’
はオーバーハング5’-NNN-3’を生成し、従って3個のNを含み、従って64( = 4 x 4 x 4)のコード化容量を有する。
もう一つの例、Ava II;
5’−...G/GWCC...−3’
3’−...CCWG/G...−5’
はオーバーハング5’-GWC-3’を生成し、従って2のコード化容量を有する。
もう一つの例はBbs I;
5’-...GAAGACNN/NNNN...-3’
3’-...CTTCTGNNNNNN/...-5’
は4個のNからなるオーバーハングを生成し、従って256( = 4 x 4 x 4 x 4)のコード化容量を有する。
例えば、ステムループ構造のステムに位置するN. BbvC IA;
5’-...CC/TCAGCNNN
⊃
3’-...GGAGTCGNNN
消化は以下の結果になる;
5’-...CC−3’
3’-...GGAGTCGNNNNNNCGACT-5’
この例で6個のNが形成されたオーバーハングに存在し、従って1024( = 4 x 4 x 4 x 4 x 4 x 4)のコード化容量を与える。しかしながら、Nの数は任意に選択されることができ、従って不定のコード化容量を与えることは明らかである。この例で可能な配列の総数の小さいフラクションは使用されることができない。すなわち使用中の制限酵素の認識配列を形成するそれらの配列。
N.BbvC IA
5’-...CC/TCAGCNNNNNNNN-3’
3’-...GGAGTCGNNNNNNNN-5’
消化は以下の結果になる;
5’-...CC-3’
3’-...GGAGTCGNNNNNNNN-5’
及び
5’-TCAGCNNNNNNNN-3’
この例で8個のNは形成されたオーバーハング中に存在し、したがって65536(=4の8乗)のコード化容量を与える。しかしながら、Nの数は任意に選択されることができ、したがって不定のコード化容量を与えることは明らかである。この例での可能な配列の総数の小さいフラクションは使用され得ない。すなわち使用中の制限酵素の認識配列を形成するそれらの配列。
Eco RIと併用されたN.BbvC IA;
5’-...CC/TCAGCNNNNNNNNG/AATTC...-3’
3’-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA/G...-5’
消化は以下の結果となる;
5’-...CC-3’
3’-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA-5’
及び;
5’-TCAGCNNNNNNNNG-3’
及び
5’-AATTC-3’
3’-G-5’
この例で8個のNは形成されたオーバーハング中に存在し、したがって65536(=4の8乗)のコード化容量を与える。しかしながら、Nの数は任意に選択されることができ、したがって不定のコード化容量を与えることは明らかである。この例での可能な配列の総数の小さいフラクションは使用され得ない。すなわち使用中の制限酵素の認識配列を形成するそれらの配列。
多様化
一つの実施態様で、本発明は分子進化を可能にする、表示された化合物または表示された化合物のライブラリーの多様化のための方法を意図する。これは本発明の範囲を超えることなく幾つかの方法で達成され得る。例えば(図4b参照)、モジュール置換のためのラウンドで分子のフラクションは2種の連続した制限酵素で消化され、それは問題の該モジュールと残りの構造の間の共有結合を除去する。星形構造は変性されて問題の該位置のためのキャリアーモジュールのレパートリーとハイブリダイズされる。したがって位置特異的な一定のセグメントは、第一次のライブラリーが生成されたのと同じ方法でハイブリダイゼーションを指向する。適切な末端はライゲートされて形成された生成物はコドン誘導で構築された分画と共にプールされ、多様化に導く。これはモジュール置換の1つ、幾つか又はすべてのラウンドでなされてもよい。もう一つの例で、モジュール置換のためのラウンドで分子のフラクションは、例えばエキソヌクレアーゼによる、問題の該位置のためのコドン特異的オーバーハングの除去に供される。その後、問題の該位置のためのキャリアーモジュールのレパートリーはハイブリダイズされライゲートされる。それから形成された非コドン誘導生成物はコドン誘導で構成された分画と共にプールされ、多様化に導く。これはモジュール置換の一つ、幾つか又はすべてのラウンドでなされてもよい。
触媒活性のための選択
記載される原理はまた触媒活性のための選択に適用され得る。この場合にキャリアーモジュールは反応部位官能性を含み星形構造はこれらの官能性の3次元配列のためのフレームワークを提供し、従ってタンパク質の酵素を模倣する。
コドン特異的コンパートメント化
星形構造は例えば適切な制限酵素の使用によっていずれかのコドン位置が末端で1本鎖になることを可能にし、従って特定のコドン位置のためのハイブリダイゼーションと必要に応じたライゲーションによって高特異的なコンパートメント化を可能にする。コンパートメント化のための種々の方法が当該技術分野で知られている、例えば、アンチコドン配列のマイクロアレイ(Lockhart et al., Nat Biotechnol, 14, 1675-80, 1996)、アンチコドン配列のカラム(Halpin and Harbury, PLoS Biol, 2, E173, 2004)又は個々のビーズがアンチコドン配列及び、その後の例えば蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorted)による選別を可能にする、蛍光タグを含むビーズを使用すること(Iannone et al., Cytometry, 39, 131-40, 2000)。
定義
ここで使用される“核酸”又は“オリゴヌクレオチド”という用語はヌクレオチドのポリマーを意味する。ポリマーは、制限無しで、天然ヌクレオシド(すなわちアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン; 及びデオキシシチジン)、ヌクレオシドアナログ、(例えば、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ウロウリジン(C5-urouridine)、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアノシン、O(6)-メチルグアニン、及び2-チオシチジン)、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基(例えばメチル化された塩基)、挿入された塩基、修飾された糖(例えば、2’-フルオロリボース、リボース、2’-デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース)、又は修飾されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエート及び5’,-N-ホスホルアミダイト結合)を含んでもよい。核酸及びオリゴヌクレオチドはまた、固定化(locked)核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、トレオース核酸(TNA)及び増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応又はリガーゼ連鎖反応を用いて、増幅反応のためのテンプレートとして機能できるいずれかの他のポリマーのような、修飾されたバックボーンを有する塩基の他のポリマーを含んでもよい。
実施例1
相互に相補的な二重特異性オリゴヌクレオチドによるトリマー及びテトラマーのDNA星形構造の形成が証明された。
トリマーDNA星形構造のT4 DNAリガーゼによるDNAの1本の連続した鎖への変換.
DNAの1本の中断されていない鎖からなる3ステムのDNA星形構造の首尾よい生成はこの実施例で証明された。相互に相補的な二重特異性オリゴヌクレオチドはアニールされ、そしてその後DNAの連続した鎖を形成するためにライゲートされた。
3ステムのDNA星形構造の増幅
DNAの1本の連続した鎖からなるトリマーのDNA星形構造の首尾よい増幅はこの実施例で証明された。相互に相補的な二重特異性オリゴヌクレオチドはアニールされ、ライゲートされその後プライマー伸長反応におけるテンプレートとして使用された。
アニールされたオリゴヌクレオチドの並列された末端間のホスホジエステル結合はT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, cat# M0202)によって形成された。リガーゼミックスの1/3 x容量, 1x DNAリガーゼバッファー(New England Biolabs), 50 mM NaCl, 及び100 u/μl T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, cat# M0202)がキナーゼ処理された混合物に加えられ室温でオーバーナイトでインキュベートされた。
星形反応中心での化学反応性
星形構造の中心での化学反応性は次の三官能性クロスリンカー(TSAT, トリス-スクシンイミジル アミノトリアセタート, Pierce cat. No 33063)を使用することによって達成された;
DNA星形構造によって指向される化学反応.
200mM pH 7.4リン酸ナトリウム溶液(200 μL)中のオリゴヌクレオチド(5 nmol)を25℃で10分間DMF中の100mM BSOCOES溶液の0,1 容量で、その後に25℃で2時間300mM NaOH中の300mMアミノ酸(Leu又はGly)溶液の0,3容量で処理することによるホモ二官能性リンカーBSOCOES((ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン), Pierce cat# 21600)によって、オリゴヌクレオチド、vip017はvip017で内部修飾されたdTでの第一級アミンにアミノ酸(L-Leu又はGly Fluka, #61820及び#50052)をα-アミンによって架橋することにより官能性を持たせた。反応の総容量は200μLであった。粗製の結合されたアミノ酸試薬はEtOH沈澱によって分離され更なる精製なしで使用された。DNAは(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989) in “Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)に従ってNaOAc/EtOHによって沈澱された。ペレットは水で再懸濁された。
星形構造の構築及びライゲーション.
dsDNAからなるトリマーのDNA星形構造の首尾よい増幅はこの実施例で例証された。相互に相補的な二重特異性オリゴヌクレオチドはアニールされ、ライゲートされそしてその後PCR反応でテンプレートとして使用された。次のオリゴヌクレオチドは使用された: vip029-vip031-vip0132-vip0133-vip030。図13はオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを概略的に示す。
反応は0,2 mM dNTPs(New England Biolabs O447S), 8 mM MgSO4, 0,2 μMセンスプライマー及び0,2 μMアンチセンスプライマー, 1 Mベタイン(Sigma B0300), ベント(エキソ-)(New England Biolabs M0257L)の1 U/100 μlを有する、1 x ThermoPolバッファー(New England Biolabs B9004S)中で行われた。使用されたプライマーはvip027及びvip028であった。これらの2種のプライマーのビオチン化されたバージョンは、それぞれvip034とvip038である。PCR増幅は次のサイクル条件を使用して行われた: 95℃で2分、そして95℃/30秒、60℃/30秒、74℃/30秒の20サイクル。下の実施例7で報告される折り畳みとssDNA精製のために使用されるPCR産物は、vip034及びvip028プライマーで生成された。PCR産物はnative PAGEによって分析された。201 bpのバンドは図13で示されるゲルにはっきり見られる。
PCR産物の再折り畳み.
PCR産物の折り畳みは次のとおり行われた。PCR精製手順はキットの使用説明書に従ってPerfectPrep(Eppendorf, cat# 0032 007.740)を使用して行われた。折り畳みは10 μlの容量で(5 μl 2x バッファー/プライマーミックスと混合された生成物あたり5 μl)、0,1 M NaCl, 0,1 % トリトン X-100, 0,1 μM vip027, 0,1 μM vip028中で行われた。PCR産物は4種の異なる濃度で使用された(1:2希釈から1:20希釈の範囲である)。一系列で、混合物は沸騰水中で2分間インキュベートされ、そしてその後アイス/水浴中で冷却された。第2の系列で、混合物はABI2720 PCRマシンで次のプログラムを使用して加熱と冷却が行われた: 5分間94℃、30秒間80℃、30秒間65℃、30秒間50℃、30秒間35℃、30秒間20℃、次の工程まで10℃。第3の系列で、加熱又は冷却は行われなかった。
図14でゲルのレーンは次の内容からなる:
レーン1: 1:2希釈された PCR産物、急速冷却
レーン2: 1:4希釈された PCR産物、急速冷却
レーン3: 1:10希釈された PCR産物、急速冷却
レーン4: 1:20希釈された PCR産物、急速冷却
レーン5: 1:2希釈された PCR産物、段階冷却
レーン6: 1:4希釈された PCR産物、段階冷却
レーン7: 1:10希釈された PCR産物、段階冷却
レーン8: 1:20希釈された PCR産物、段階冷却
レーン9: 1:2希釈された PCR産物、未処理
レーン10: 1:4希釈された PCR産物、未処理
レーン11: 1:10希釈された PCR産物、未処理
レーン12: 1:20希釈された PCR産物、未処理
レーン13: PCR産物のみ
実験は201 bp dsDNA産物とは対照的に、一本鎖星形構造DNAは約1000 bpに移動することを示す。星形構造形成のための最適な条件は加熱に続いての反応の急速冷却であるらしい。
再び折り畳まれた星形構造の精製.
ssDNA星形構造はストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズを使用して精製された(Dynal, Cat# 650.02)。10 μlビーズは2x BWT(2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,2 % トリトン X-100)で二回洗浄された。最終洗浄の後、ビーズは1容量の2x BWTで懸濁され1容量の再び折り畳まれたPCR産物を加えられた。懸濁液は時々撹拌しながら、室温で15分間インキュベートされた。チューブは磁石に置かれ、そしてビーズが集められた後に上清が取り除かれた。ビーズは50℃の暖かさの洗浄バッファー(2 M尿素, 0,1 % トリトン X-100)に懸濁され、そして50℃で2分間インキュベートされた。チューブは磁石上に置かれ、そして洗浄手順がトータルで3回行われた。1回の最終洗浄が1x BWT(1 M NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,1 % トリトン X-100)で行われた。最終洗浄バッファーの除去に続いて、ビーズは1,5 ml NT(10 mM NaCl, 0,1 % トリトン X-100)中に懸濁され、そして50℃で5分間インキュベートされた。チューブは急速冷却のために氷/水浴に移され、そしてこの手順はストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに固定された星形構造の形成という結果になった。チューブは急速冷却後に磁石上に置かれ、そして上清が取り除かれた。ビーズは、ビーズからのssDNAの放出のためにBsaIでの消化の準備のために、50 μl NTに懸濁された。
消化ループフォーマット
両方が星型構造のループでの消化を可能にする、2本のゲノムがデザインされた。制限酵素は一般にssDNAを消化することができない。しかしながら、ループへの10量体オリゴヌクレオチドのアニーリングは酵素のための基質を生じ、そしてそれによって酵素のための認識配列が二本鎖になるだろう。実験のデザインは図16に概略的に示されている。
反応は0,2 mM dNTPs(NEB O447S), 8 mM MgSO4, 0,2 μMセンスプライマー及び0,2 μMアンチセンスプライマー, 1 Mベタイン(Sigma B0300), ベント(エキソ-)(NEB M0257L)の1 U/100 μlを有する、1 x ThermoPolバッファー(NEB B9004S)中で行われた。使用されたプライマーはvip027及びvip028であった。プライマーのビオチン化されたバージョンは、それぞれvip034とvip038である。PCR増幅は次のサイクル条件を使用して行われた: 95℃で2分、そして95℃/30秒、60℃/30秒、74℃/30秒の20サイクル。
各ゲノムの(vip034及びvip028プライマーを使用して作成された)80 μl PCR産物はキットの使用説明書に従ってPerfectPrep(Eppendorf, cat# 0032 007.740)を使用して精製された。溶出は40 μl溶出バッファーで行われた。PCR産物の再折り畳みのために、次のことが行われた: 40 μl PCR産物に、750 μl 0,2 M NaCl, 0,2 % トリトン X-100, 7.5 μl vip027及び7,5 μl vip028及び695 μl H2Oを加える。沸騰水中で5分間混合物をインキュベートし、そしてアイス-水浴中で急速に冷却する。
1: s129−vip164-ApaI
2: s129−vip165-KpnI
3: s149−vip194-PvuII
4: s149−vip195−VspI
1 μMの最終濃度という結果になるように、0.25 μlオリゴ(20 μMストック)が加えられた。アニーリングはプログラム: 50℃−2分; 40℃−2分; 35℃−2分; 30℃−2分; 30℃−2分; 25℃−2分; 20℃−2分を使用してAB2720 PCRマシンで行われた。
実験の結果は図18に示されている。
レーン1は37℃でのs129のApaI消化を示す
レーン2は37℃でのs129のKpnI消化を示す。
レーン3は37℃でのs149のPvuII消化を示す。
レーン4は37℃でのs149のVspI消化を示す。
レーン5は30℃でのs129のApaI消化を示す。
レーン6は30℃でのs129のKpnI消化を示す。
レーン7は30℃でのs149のPvuII消化を示す。
レーン8は37℃でのs149のVspI消化を示す。
予想されるバンドサイズは次のとおりである:
ApaI:163 nt, KpnI: 80 nt, PvuII: 165 nt, VspI: 83 nt。
種々のトポロジーでのアミド結合のDNA指向形成.
200mM pH 7.4リン酸ナトリウム溶液(200 μL)中のオリゴヌクレオチド(5 nmol)を25℃で10分間DMF中の100mM BSOCOES溶液の0,1 容量で、その後に25℃で2時間300mM NaOH中の300mMアミノ酸(グリシン)溶液の0,3容量で処理することによるホモ二官能性リンカーBSOCOES((ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン), Pierce cat# 21600)によって、オリゴヌクレオチド、vip017はvip017で内部修飾されたdTでの第一級アミンにアミノ酸(Glycine, Fluka, cat #50052)をα-アミンによって架橋することにより官能性を持たせた。反応の総容量は200μLであった。粗製の結合されたアミノ酸試薬はEtOH沈澱によって分離され更なる精製なしで使用された。
種々のオリゴヌクレオチドの化学的調製
実施例 11.1 内部修飾されたdT(アミン-C6-dT)(位置 n = 1)を有するオリゴヌクレオチドのアセチル化
DMT-MMによって促進されるFmoc-AA-OHでのアセチル化。
官能化オリゴヌクレオチドは溶離液としてアセトニトリル/TEAA 100 mM pH 7.0混合液を使用してXTerra C18カラム(Waters #186000602)でオートサンプラーとフラクションコレクターを有するヒューレットパッカード アジレント HPLC機器によって精製された。適切な分画は凍結乾燥されて水で20 mMまで希釈された。
官能化オリゴヌクレオチドは陰イオンリフレクターモードを使用してHPA/クエン酸アンモニウム マトリックス中でBruker AutoFlex機器でMALDI-TOF質量分析法によって分析された。
DNA 計算質量 検出質量
vip068-LeuFmoc 6843,340 6844,5
実施例 11.2 内部修飾されたdTを有するオリゴヌクレオチドのアセチル化(アミン-C6-dT)(位置 n = 1)
Fmoc-AA-Osuでのアセチル化
オリゴヌクレオチドVip046は25℃で2時間 DMF及びリン酸ナトリウムバッファー 100 mM, pH 7.4の1:1混合液中で溶解されたオリゴヌクレオチド(125 pmol)を25 mM Fmoc-Gly-OSu(ChemImpex #02420)又はFmoc-Leu-OSu(ChemImpex #02429)で処理することによってFmoc-AA-Osu(AA = Gly又はLeu)でアシル化された。官能化オリゴヌクレオチドは(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989) in “Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York)に従ってNH4OAc/EtOHによって沈澱された。ペレットは水で再懸濁されMALDI-TOF質量分析法によって分析された。
DNA 計算質量 検出質量
vip046-LeuFmoc 6932,3642 6932,1
vip046-GlyFmoc 6876,3016 6876,1
実施例 11.3 内部修飾されたdTを有するオリゴヌクレオチドのアセチル化(アミン-C6-dT)(位置 n = 1)
ペプチド-オリゴヌクレオチド複合体の合成(アミノ酸に使用される一文字略号): YGGFL-Vip068、GLFYG-Vip068、YGGFL-PEG-Vip068、GLFYG-PEG-Vip068、GFL-Vip016及びGFL-PEG-Vip016: Sepharoseでの後の脱保護を有するFmoc-AA-Osuでのアセチル化。
DNA 分離された収量
YGGFL-Vip068 19%
YGGFL-PEG-Vip068 32%
GLFYG-Vip068 11%
GLFYG-PEG-Vip068 18%
GFL-Vip016 30%
GFL-PEG-Vip016 36%
実施例 11.4 内部修飾されたdTを有するオリゴヌクレオチドのアセチル化(アミン-C6-dT)(位置 n = 1)
C6-NH2、PEG-NH2及びGly-NH2リンカーを用いたアクセプターオリゴヌクレオチドの合成.
DEAE Sepharose(Sigma #DFF100)に吸収されたオリゴヌクレオチド、vip016は、FmocNH-C6-CO2Su(Fmoc-6-アミノヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル, ChemImpex #7296)、FmocNH-PEG-OSu(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸 ヒドロキシスクシンイミドエステル, N-ヒドロキシスクシンイミドとのEDC結合によってFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(ChemImpex #7310)から合成された)又はFmoc-Gly-OSu (Fmoc-L-グリシン N-ヒドロキシスクシンイミド エステル, ChemImpex #02420)を用いてvip016で内部修飾されたdT上の第一級アミンでアシル化され続いてHalpinとHarburyの手順(Plos Biology 2004, 2, 1-8)に従ってFmoc保護基が切断された。反応は1nmol DNAで行われた。sepharoseからDNAの溶出後に混合物は製造元のプロトコルに従ってスピンカラム(Amerasham Biosciences #27-5325-01)で脱塩され続いてHPLCによる精製された。収量はHPLCによって測定された。
DNA 分離された収量
H2N-PEG-vip016 39%
H2N-C6-vip016 39%
H-G-vip016 45%
実施例 11.5 位置 n ≠ 1でBSOCOES又はDSSを介した内部修飾されたdT(アミン-C6-dT)を有するオリゴヌクレオチドへのアミノ酸の結合。
DNA 単離された収率 計算質量 検出質量
vip046-BSOCOES-Gly 32% 6878,2325 6879,3
vip046-BSOCOES-Leu 48% 6934,2951 6936,1
vip046-BSOCOES-Phe 49% 6968,2795 6969,0
vip046-BSOCOES-Tyr 51% 6984,2744 6985,5
実施例12
異なる温度で反応中心でのアシル化反応の安定性
この実施例ではトリマーの星形構造での上昇した温度で1個のアミノ酸転移がどのように影響し得るかが証明される。結果は図20に示されている。
異なるpHのものでの反応中心でのアシル化反応の安定性
この実施例でどのように1個のアミノ酸が5.2から8.0のpHの範囲でトリマーの星形構造で転移され得るかが証明される。低pHで、アクセプターアミノ基は部分的にプロトン化されているかもしれない、従って強力な求核基としてそれを不活性化する。より高いpHで、アミノ酸のカルボン酸の活性化によって生成された反応中間体は加水分解されることができ、従ってそれを不活性化し化学活性化剤を破壊する。両方は所望のアミド結合の形成を妨げるかもしれない。結果は図21に示されている。
異なる有機溶媒のレベルで反応中心でのアシル化反応の安定性
DNA星形構造の安定性を証明するために、1個のアミノ酸の転移は従って有機化学合成で使用される条件に似ている、H2Oと有機溶媒の混合液中で行われた。もし塩基対と星形構造がこれらの条件下で破壊されたなら、架橋産物は形成され得ない。溶媒ジオキサン、アセトニトリル、及びテトラヒドロフランは水との混和性及び有機合成での一般的な適用性に関して選択された。
異なるDMFのレベルでの反応中心の安定性
DNA星形構造の安定性を証明するために、1個のアミノ酸の転移が、有機化学合成で使用される条件に似ている、H2O−DMF混合液中で行われた。もしこれらの条件下で塩基対形成及び星形構造が破壊されたなら、架橋産物は形成され得ない。
最初の5個のレーンで生成された生成物のバンドはよく似た強度を有しており、従って有機溶媒、DMFの少なくとも40%までの存在は十分許容されDNA塩基対が損なわれていないことを示している。50%DMFで、弱いバンドがまだ観察され、しかし60%から及びより上では架橋産物は検出されなかった。
化学反応を媒介するための異なる活性化剤.
この実施例は種々の化学活性化剤及び補助求核剤がアミノ酸でのアクセプターアミンのアシル化を媒介するためにどのように使用され得るのかを例証するために役に立つ。補助の求核剤の付加がアシル化速度を大きく高め得ること及び/又は反応の最終結果を変更し得ることがペプチド化学から知られている。この実施例では反応は補助求核剤無しで、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS, 例えばFluka #56480)、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド ナトリウム塩(s-NHS, Fluka #56485)、又はN-ヒドロキシベンゾトリアゾール 水和物(例えば Fluka #54804)を使用して行われ活性化剤としてDMTMM(Fluka #74104)又はEDC(例えば Fluka #03449)と共に使用された。
他のアクセプターへのアミノ酸の転移
この実施例はどのようにアミノ酸が種々の方法で結合された幾つかのアクセプターアミンに効果的に転移されるのかを証明する。C6-NH2を有するvip016は以前のようにコントロールとして役に立つ。他のアクセプターはトリペプチド GFL-vip016、PEG結合トリペプチド GFL-PEG-vip016、アミノ官能化NH2-PEG-vip016、アミノ官能化NH2-C6-vip016、及びG-vip016でのグリシン(すべて実施例XXで記載されるように調製された)であった
20 mMストック溶液のオリゴvip016-X-NH2、vip008、及びvip017-Gly (DNA Technology Arhus, Denmark, 実施例XXで記載されるように誘導体化されたvip017)はMOPS(200 mM, pH6.5)及びNaCl(2M)のバッファー中で混合され、アニーリングプログラム(PCRマシン: 5分 @ 94℃, 30秒 @ 80℃, 30秒 @ 65℃, 30秒 @ 50℃, 30秒 @ 35℃, 30秒 @20℃, 30秒 @ 10℃)に供された。このアニーリング混合物はモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS, 100 mM, pH 6.5), NaCl(1M), 及び化学活性化剤(DMTMM, Fluka #74104, 1.0M aq. sol, 75 mMの最終濃度)の最終組成まで水と活性化剤の溶液で希釈された。最終DNA濃度は0.5 mMであった。反応は50℃で1時間インキュベートされた。
2種の構造DNAディスプレイ産物の構成とその後の結合
2種の構造DNAディスプレイ産物は形成された: Leu-エンケファリン(Try-Gly-Gly-Phe-Leu-DNA)及びスクランブルLeu-エンケファリン(Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly-DNA)。後者はLeu-エンケファリン特異的なモノクローナル抗体3E7を使用する分別アッセイのためのネガティブコントロールとして含められた。方法のキーの工程は図26に図解されている。
集合した生成物はプライマー伸長に供され、それは中心に化学的生成物を有する星形構造に折り畳まれたDNAを、表面に提示された化学的生成物を有する直鎖状二本鎖分子に変換する。反応は集合した分子の3’末端に逆相補的であるvip038によってプライムされた。反応は10 μlプライマー伸長反応で1 x Thermopolバッファー, 0.2 mM dNTPs, 8 mM MgSO4, 1 M ベタイン(Sigma, B-0300), 0.4 μM vip038, 0.2 U/10 μl ベント(エキソ-)(NEB M0259L), 及びテンプレートとして5 μlの集合した分子中で行われた。反応混合物は95□Cで2分間、60℃30秒間及び74℃5分間インキュベートされた。
合成されたペプチドを提示するDNAは電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)で分析された。結合の証明は構造DNAによって向けられたキャリアーモジュールから化合物を正確に合成する能力を立証するだろう。
ゲルシフトされたバンド及び他のバンドのDNAが完全な状態であることを証明するためにゲル断片が切り取られDNAはPCRのためのテンプレートとしての使用のために抽出された。図29でボックスに囲まれたゲル断片は切り取られ生成物は“クラッシュ アンド ソーク”法(Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory)によって抽出された; ゲル断片は潰されて400 μl TEバッファー中にオーバーナイトで浸された。チューブは20 000 x gで10分間回転され上清は新しいチューブに移された。それからPCR[1 x ポリメラーゼ バッファー, 0.2 mM dNTP, 6 mM MgSO4, 0.2 μM vip027, 0.2 μM vip028, 0.5 Mベタイン(betain)(Sigma, B0300), 0.1 mg/ml BSA 0.08 units/μl ベント(エキソ-)(NEB M0259L)]は20 μlの反応で200倍希釈された上清の5 μlを使用して行われた。サーモサイクラーで95℃で30“、60℃で30“及び74℃で30“の20サイクルが行われてサンプルの2 μlがnative 10% PAGE(Invitrogen)で分析され製品使用説明書に従ってSYBR グリーン(Molecular Probes)で染色され写真撮影された。結果は図29で示されている。レーンMは100 bp DNAラダー(Fermentas, SM0248)を含む。レーン1-5はゲル精製されたテンプレートを有する反応を含む: すべてのレーンで約250 bpの顕著なバンドが全長の生成物の予想されたサイズに対応して観察された。対照的に加えられたテンプレートの無いネガティブコントロールを含むレーン6でバンドは観察されなかった。その結果、構造DNAディスプレイ産物が形成、分割及び増幅され得ることがこれによって証明された。
DNA星形構造の還元的アミノ化の指向(direction)
本実施例は構造DNAが還元的アミノ化を指向し得ることを例証するのに役立つ。還元的アミノ化は重要な及び幅広く応用できる化学選択的反応の例として選択された。
DNA 計算質量 検出質量
vip046-NHCOCHO 6653,202 6656,1
内部修飾されたdTを有するベンズアルデヒド官能化オリゴの合成(アミン-C6-dT)(位置 n = 1)(Vip046-NHCOC6H4CHO)
オリゴヌクレオチドvip046は150 mM NaCl, 200 mM リン酸ナトリウムバッファー pH 8.8を含む40% DMF/水の混合液中に溶解されたオリゴヌクレオチド(2.5 nmol)のDMT-MM 50 mMとの処理によるDMT-MM(4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウム クロライド, Fluka #74104)によって促進されて4-カルボキシベンズアルデヒド(Lancaster #8192)でアシル化された。総反応容量は100 μlであった。反応は25℃で4時間インキュベートされた。反応混合物は製造元のプロトコルに従ってスピンカラム(Amersham Bioscience #27-5325-01)で精製され続いて実施例11に従ってHPLC及び質量分析法分析による精製を行なった。収率: 53%
DNA 計算質量 検出質量
vip046-NHCOC6H4CHO 6729,233 6729,9
構造DNA指向還元的アミノ化
反応1及び5でそれぞれ、グリオキシル酸と4-ホルミル安息香酸のアミドを有するvip046の2種の誘導体はモルホリノプロパンスルホン酸(Fluka #69947; MOPS, 100 mM, pH 5.2)及びNaCl(Fluka #71376, 1M)の最終組成を含むバッファー溶液中でvip017及びvip008の等モル量(各10 pmole)と混合された。溶液はアニーリングプログラム(PCRマシン: 5分 @ 94℃, 30秒 @ 80℃, 30秒 @ 65℃, 30秒 @ 50℃, 30秒 @ 35℃, 30秒 @20℃, 30秒 @ 10℃)に供された。アニーリング混合物は還元剤(NaCNBH3; Sigma #156159, 1M aq. sol, 100 mMの最終濃度; 総反応容量 20 μl)を加えられ30℃で2時間インキュベートされた。
・ vip017はアミンを有していないvip007と交換された (反応2+6)。
・ vip008はトリマーに比較したダイマーの効率をテストするために省略された(反応3+7)。
・ vip046-CHOはvip019への架橋を試みられ、従って塩基対を形成できないオリゴ間での反応を行った (反応 4+8)。
構造DNAの尿素形成の指向
本実施例は構造DNAが尿素形成を指向し得ることを例証するのに役立つ。2個のアミン間の尿素形成は重要な、幅広く応用できる反応の例として選択された。尿素はメディシャルケミストリー(medicial chemistry)において有名なアイソスターである。
DNA星形構造の電気泳動移動度
この実施例はネイティブ ポリアクリルアミドゲルでの構造DNAの電気泳動移動度を証明する。
末端PCRプライミング部位を有するトリマーDNA星形構造は5種のオリゴ vip029、vip161、vip192、vip193及びvip207のライゲーションによって形成された。構成の略図は図32に示されている。
ライゲーション反応の0.04 μlが400 μl PCR反応ミックス [1 x Thermopolバッファー(New England Biolabs B9004S), 0.2 mM dNTPs(New England Biolabs O447S), 8 mM MgSO4, 0.2 μM vip202及びvip224μM, 0.5 M ベタイン(Sigma, B0300), ベント(エキソ-)の1 U/100 μl(New England Biolabs M0257L)中でテンプレートとして使用された。PCR増幅は次のサイクル条件を使用して50 μlのアリコートで行われた: 92℃で30秒、及び92℃/15秒、50℃/15秒、70℃/30秒の25サイクル。
テンプレートとして分離したDNAを使用してプライマー伸長はそれから行われた。2 μlのテンプレートが[1 x Thermopolバッファー(New England Biolabs B9004S), 0.2 mM dNTPs(New England Biolabs O447S), 8 mM MgSO4, 0.5 M ベタイン(Sigma, B0300), ベント(エキソ-)の1 U/100 μl(New England Biolabs M0257L)]を含む20 μlの反応液で使用された。反応1及び5にプライマーは含まれず、反応2及び6で0.2 μM vip202が含まれ、反応3及び7で0.2 μM vip224が含まれ反応4及び8で0.2 μM vip202及びvip204が含まれた。プライマー伸長は95□Cで1分間、50□Cで15秒間及び70□Cで30秒間サンプルをインキュベートすることによって行われた。反応の10 μlは上に記載されているように10% PAGEによって分析された。
最初に、PCRはテンプレートとして末端PCRプライミング部位を有するトリマーのDNA星形構造を使用して行われた。第二に、サンプルは2種のバンドが分離された調製用のPAGEに供された: 約250 bp(二本鎖PCR産物の予想されるサイズは241 bpである)の見かけのサイズを有するバンド(A)及び1000 bpを超過する見かけのサイズを有するバンド(B)。最後に、単離されたDNAがプライマー伸長反応でテンプレートとして使用されPAGEによって分析された。図32で示されているように、両方のテンプレートがフォワード(レーン2及び6)及びバックワードプライマー(レーン3及び7)の両方で、約250 bpのサイズを有して二本鎖生成物を生じる。そのうえ、両方のプライマーが存在するときに、より多くの生成物が形成される(レーン4及び8)。これはバンドA及びBの両方が意図された241 bpの生成物を含むこと及びゲル中での移動度における相違はそれゆえフォールディングのためであることを例証している: Aはたぶん二本鎖の直鎖生成物であるのに対し、Bは星形構造に折り畳まれたDNAである。
DNA星形構造の翻訳
この実施例はDNA星形構造の翻訳方法の原理を証明する。この文脈で翻訳方法は種々の位置で個々のモジュールが新しいモジュールによって置換されそして置換方法がコドン/アンチコドン認識によって向けられる方法である。新しいモジュールが一部となるだろう新しいDNA星形構造の適切な折り畳みの際に中心にまたは中心の近くに位置するように結合した化学反応物を新しいモジュールは有するかもしれない。結果的に、翻訳はDNA星形構造によってコード化された化合物が合成されることを可能にする。
開始物質としてPCR産物を使用する翻訳方法の主要な工程の略図が図33に示されている。
最初の工程は5種のオリゴ: vip206, vip161, vip192及びvip193 vip207のアニーリングを含む。構成の略図は図34に示されている。反応で5種のオリゴは互いにハイブリダイズするであろう、従って3本の道の接合点の中心への末端では2個のステムループ及び5’も3’もハイブリダイズしない配列を有する1個のステムからなる、3本の道の接合点を形成する。ハイブリダイズしない配列はPCRプライミング配列(vip206の5’セグメント及びvip207の3’セグメント)に相当する。オリゴは10 μlの容量で各オリゴヌクレオチドの20 pmolを有する、1 x リガーゼ バッファー(NEB B0202S), 50 mM NaCl中で混合された。アニーリングは95℃で5分間と次の温度で30秒工程の間PCRマシンでのインキュベートによって行われた: 80℃, 65℃, 50℃, 45℃, 30℃, 20℃。
DNA星形構造は2個のステムループと1個のステムを含んでいた。ループのないステムは位置1のためのコドンを含んでいた。コドンはBsa Iによる制限酵素消化によって露出され、それはその認識配列の外で切断して4ヌクレオチドの5’オーバーハングを形成し、その配列は制限無しで選択されることができ、従ってコード化目的のために理想的である。この文脈でオーバーハングは位置1のためのコドンを呼ぶ。
新しい位置1のモジュール、vip271はBsa I消化及び精製されたDNA星形構造にライゲートされた。vip066はライゲーションの補助として、及び下流の精製を容易にするためにライゲーション産物にビオチン分子を導入するためにライゲーション反応に含められた。vip271及びvip066のアニーリングはこの文脈でアンチコドンと呼ばれる4ヌクレオチド5’オーバーハング(vip271)を有する生成物を生じるだろう。それゆえ配列はDNA星形構造での位置1のコドンに逆相補的なように選択された。結果的にコドン/アンチコドン ハイブリダイゼーションはDNA星形構造と2種の入ってくるオリゴのライゲーションを指向することができる。vip271及びvip066は10 μlの容量で各オリゴヌクレオチドの50 pmoleと1 x リガーゼ バッファー(NEB B0202S), 50 mM NaCl中で混合された。アニーリングは上に記載されているアニーリングプログラムを使用してPCRマシンで行われた。
次の工程は星形構造からの元の位置1のモジュールを除去することであった。分子は新しい位置1のモジュールを3本の道の接合点の一部になることを可能にして再び折り畳まれ元の位置1とDNA星形構造の間の共有結合は除去された。そのうえ、ヘルパーオリゴ(vip194)が導入され、それはPvu IIのための二本鎖基質を形成して2番目のステムの末端の元のループでPvu II部位にアニールした(図36参照)。その結果、共有結合と塩基対形成の両方が元の位置1のモジュールと星形構造の間で破壊された。そのうえ、新しい位置1のモジュールは3本の道の接合点の一部として導入された。
Claims (55)
- 核酸及び化合物を含む組成物であって、前記組成物が反応中心から伸びる3又はより多いステムによって定められる星形構造を形成し、そこで少なくとも1つのステムが該中心から放射状に伸びており、各ステムは核酸デュプレックスを含み、該化合物は反応中心に位置し、少なくとも1つの核酸と結合している、組成物。
- 3又はより多いステムが反応中心から外側に放射状に伸びている、請求項1の組成物。
- 形成された化合物の形成に関与した、1個以上の化学基を同定する1個以上のコドンを核酸が含む、請求項1又は2の組成物
- コドンがステムの末端に位置している、請求項3に記載の組成物。
- ループがステムの末端に形成される、請求項1から4のいずれか一つに記載の組成物。
- コドンがステムループ構造の非塩基対形成部分に位置している、請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
- 酵素制限部位がステムループ構造中に存在する、請求項1から6のいずれか一つに記載の組成物。
- ループがヘルパーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズでき、それによって制限酵素のための基質を形成する、請求項1から7のいずれかに記載の組成物。
- 連続した核酸配列を形成するように、ループが1個を除いたステムのすべての末端に存在する、請求項1から8のいずれか一つに記載の組成物。
- 連続した核酸配列が酵素的に伸長可能である、請求項1から9のいずれかに記載の組成物。
- 核酸がDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ又は逆転写酵素のためのプライミング部位を含む、請求項10に記載の組成物。
- プライミング部位がループを有さないステムに存在する、請求項9から11のいずれか一つに記載の組成物。
- ステムが少なくとも80%の相補性を有する2個のハイブリダイゼーションセグメントを含み、各ハイブリダイゼーションセグメントが12又はより多いヌクレオチドを含む、請求項1から12のいずれか一つに記載の組成物。
- 各ハイブリダイゼーションセグメントが18又はより多いヌクレオチドを含む請求項13に記載の組成物。
- 化合物が共有結合的に核酸に結合している、請求項1に記載の組成物。
- 反応前に化学基が共有結合的に核酸に結合している、請求項1から15のいずれか一つに記載の組成物。
- 1個又はより多くの共有結合が反応と同時に又は反応の後に切断される、請求項16に記載の組成物。
- 共有結合の1個以外のすべてが反応と同時に又は反応の後に切断される、請求項1から17のいずれか一つに記載の組成物
- 化合物が核酸に結合した化学基及び任意に1個の又はより多い更なる反応物の反応によって形成される、請求項1から18のいずれか一つに記載の組成物。
- 1個の又はより多い反応物が核酸と結合していない遊離の反応物である、請求項1から19のいずれか一つに記載の組成物。
- 請求項1から20のいずれかに記載の多数の異なる組成物を含む組成物のライブラリー。
- 以下の工程を含む1個又はより多い化学構造を生成する方法:
(i)以下を含むN(N = 3-100)個のキャリアーモジュールを提供する工程:
(1)以下を有する1番目の位置のキャリアーモジュール
i)N位置のキャリアーモジュールの核酸セグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグメ ント、及び
ii)2番目の位置のキャリアーモジュールのセグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグ メント、
(2)n-1キャリアーモジュールの前記核酸セグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグメ ント、及びn+1キャリアーモジュールのセグメントにハイブリダイズ可能な核酸セグメ ントを有するn位置のキャリアーモジュール(n = 2からN-1)、及び
(3)前記N-1キャリアーモジュールの前記核酸セグメントにハイブリダイズ可能な核酸セ グメント、及び前記1番目のキャリアーモジュールのセグメントにハイブリダイズ可能 な核酸セグメントを有するN位置のキャリアーモジュール、
ここで
前記キャリアーモジュールの少なくとも3個がハイブリダイゼーションセグメント間の 中間セクション又はこの近くに位置する結合した化学基(CG)及び必要に応じてハイブリ ダイゼーションセグメントの1個の外に位置するコドンセグメントを含む;
(ii)前記ハイブリダイゼーションセグメントのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記キャリアーモジュールを接触させ、前記化学基を近傍に持ってきて、形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも一つと結合する、工程:
(iii)モジュールn-1からモジュールn並びにモジュールN-1からモジュールNの末端のライゲーションを可能にする条件を提供し、それによってステムループ構造及び結合した化合物を有する連続した核酸分子を形成する、工程。 - 形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも1個又は連続した核酸分子と共有結合的に結合している、請求項22の方法。
- 反応基を反応近接に持ってくる、ハイブリダイゼーションセグメントのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でキャリアーモジュールを接触させること; 及び
形成された化合物が少なくとも1個のキャリアーモジュールと結合している、反応基の反応を可能にする条件を提供すること; 及び
モジュールnへのモジュールn-1並びにモジュールNへのモジュールN-1の末端のライゲーションを可能にする条件及びそれによってステムループ構造及び結合した化合物を有する連続した核酸分子を形成することを含む、請求項22又は23に記載の方法。 - キャリアーモジュールの接触が逐次的に又は同時に行われる、請求項22に記載の方法。
- 化学反応が逐次的に又は同時に行われ及び/又は前記ライゲーションが酵素的に又は化学的に; そして逐次的に、又は同時に行われる、請求項22〜25のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1番目のキャリアーモジュールに及び/又は少なくともNキャリアーモジュールにDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ又は逆転写酵素部位のためのプライミング部位を更に含む、請求項22〜26のいずれかに記載の方法。
- 形成された化合物を表示するために酵素的伸長反応を行う更なる工程を含む、請求項22〜27のいずれか一つに記載の方法。
- Nが3、4、5、6又は7であり特にキャリアーモジュールの各々がハイブリダイゼーションセグメント間の中間セクションに又はこの近くに位置する結合した化学基(CG)及びハイブリダイゼーションセグメントの一方の外に位置するコドンセグメントを含む、請求項22〜28のいずれかに記載の方法。
- 1個より多くの化合物のライブラリーが一つの又はより多い位置でキャリアーモジュールのレパートリーを有することによって合成される、請求項22〜29のいずれか一つに記載の方法。
- 少なくとも1個の位置で該レパートリーが少なくとも10個の異なるキャリアーモジュールを含む、請求項30に記載の方法。
- 少なくとも2個の位置で該レパートリーが少なくとも10個の異なるキャリアーモジュールを含む、請求項30又は31のいずれか一つに記載の方法。
- 中間セクションが化学結合又は1から20ヌクレオチドを含む、請求項22又は23に記載の方法。
- 化学基が中間セクションの核酸塩基と結合している、請求項22〜33のいずれかに記載の方法。
- 化学基が中間セクションのホスホジエステル結合と結合している、請求項22〜33のいずれかに記載の方法。
- 化学基が1個の又はより多い共有結合によって中間セクションに結合している、請求項22〜35のいずれかに記載の方法。
- 次の工程を含む、モジュール置換を行うための方法:
a)N個のハイブリダイゼーションセグメントおよび相補するハイブリダイゼーションセグメントに加えてハイブリダイゼーションセグメントと相補するハイブリダイゼーションセグメント間のN-1個のハイブリダイズしないセグメントを含む一本鎖の連続した核酸配列を提供する工程、
b)それによって少なくともN-1個のステムループと1個のステムを含む連続した核酸を形成する、分子内ハイブリダイゼーションに有利である条件下で核酸をハイブリダイズする工程;
c)それによって少なくともコドンセグメントを含むオーバーハングを生成する、前記ステム又はループに切断を導入する工程;
d)少なくとも以下を有するキャリアーモジュールの1番目のグループを提供する工程:
前記ステムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、隣接したステムループのステムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、必要に応じて結合した反応基、及びアンチコドンセグメント;
d)コドン及びアンチコドンセグメントのハイブリダイゼーションを可能にする条件を提供する工程; 及び
e)前記オーバーハングの退行 (recessive)末端に前記ハイブリダイズされたキャリアーモジュールの酵素的または化学的なライゲーションを可能にする条件を提供する工程; そして次の工程を行う;
i)それによって少なくとも隣接したコドンセグメントを含むオーバーハングを生成す る、前記コドン配列に隣接したステムループのループ又はステムを制限酵素で消化する 工程; 及び
ii)核酸を変性させる工程; 及び
iii)それによってN-1個のステムループと少なくとも前記隣接したコドンセグメントを 含むオーバーハングを有する1個のステムを形成する、分子内ハイブリダイゼーション セグメントに有利である条件下でハイブリダイズさせる工程; 及び
iv)形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも1個に結合する、前記 反応基の反応を可能にする条件を必要に応じて提供する工程; 及び
v)少なくとも以下を有するキャリアーモジュールの隣接したグループを提供する工程;
前記ステムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、及び隣接したステムループのス テムにハイブリダイズ可能な核酸セグメント、及び必要に応じて反応基を結合させ、及 びアンチコドンセグメントを有する工程;及び
vi)前記オーバーハングの退行 (recessive)末端にハイブリダイズされたキャリアーモ ジュールの酵素的な又は化学的にライゲーションを可能にする条件を提供する工程; 及 び
工程i)からvi)をN-1回繰り返す; 及び
f)前記1番目のキャリアーモジュールに結合した少なくとも前記アンチコドンセグメントを残しておいてキャリアーモジュールの前記1番目のグループの一部からなる前記ステムループ構造中に切断を導入する工程; 及び
g)核酸を変性させる工程; 及び
h)それによってN-1個のステムループと1個のステムを形成する分子内ハイブリダイゼーションに有利である条件下でハイブリダイズさせる工程; 及び
i) 必要に応じて、形成された化合物が前記キャリアーモジュールの少なくとも1個と結合する、前記反応基の反応を可能にする条件を提供する工程。 - 工程a)の連続した核酸配列が請求項22〜36の方法によって得ることができ、しかし化学基を含んでいない(ダミーライブラリー)、請求項37に記載の方法。
- 工程a)の連続した核酸配列が請求項28の方法によって得ることができる、請求項37に記載の方法。
- 請求項28の伸長産物がPCRによって増幅される、請求項39に記載の方法。
- 工程a)、b)、又はc)での連続した核酸配列が固体支持体にPCR産物のセンス鎖を固定化すること、固体支持体を単離すること、星形構造を形成するようにセンス鎖が自己ハイブリダイズするのを可能にすること、及び、必要に応じて、自己ハイブリダイズされた星形構造を固体支持体と結合するステムを切断すること、それによって固体支持体から星形構造を遊離させることによって得られる、請求項37〜40のいずれかに記載の方法。
- 自己ハイブリダイゼーションが瞬間冷却(instant cooling)によって行われる、請求項41に記載の方法。
- 固体支持体と再び折り畳まれた星形構造を結合するステムの切断が制限酵素で行われる、請求項41又は42に記載の方法。
- ループ中に制限酵素のための二本鎖基質を生成するために、消化する工程の前に、ループの配列に相補的なヘルパーオリゴヌクレオチドを加える工程を更に含む、請求項37〜43のいずれかに記載の方法。
- 請求項22〜36のいずれかの方法によって得ることができる核酸及び結合した化合物の構造又はそのような構造の1を超えるライブラリーを含む組成物。
- 次の工程を含む、請求項28で開示されているように調製された1を超える化合物のライブラリーをスクリーニングするための方法:
所望の特性の化合物を有するライブラリーメンバーを得るためにライブラリーを探索する工程;
所望の特性を有さないライブラリーメンバーから所望の特性を有するライブラリーメンバーを分ける工程; 及び
それによって所望の特性を有するライブラリーメンバーの濃縮プールを得る工程。 - 該方法が更に、前記核酸が化学反応の履歴を示す、濃縮プールのメンバーの核酸を増幅することを含む、請求項46に記載の方法。
- 請求項46又は47に記載の濃縮ライブラリーメンバーによってコードされた化合物の再構成を更に含む、請求項37に記載の方法。
- ステム又はループ中での切断が制限酵素、RNase、エンドヌクレアーゼ III、エンドヌクレアーゼ VIII、APE1、Fpg、化学的切断又は光切断によって導入される、請求項37に記載の方法。
- 化学反応が逐次的に又は同時に行われることを更に含む、請求項48又は49に記載の方法。
- 少なくとも1番目のキャリアーモジュール又はNキャリアーモジュール中にDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素のためのプライミング部位を更に含む、請求項48〜50のいずれかに記載の方法。
- 工程a)の連続した核酸配列は次の工程によって調製される核酸配列を含む、請求項37〜51のいずれかに記載の方法:
問題の該モジュールと残りの構造の間の共有結合を取り除く、2種の連続した制限酵素で濃縮ライブラリーに由来する分子間ハイブリダイズした核酸構造を消化する工程、
消化された構造を変性する工程、
交配を得るために問題の該モジュールを特定する核酸分画を交換させる、消化された構造からの核酸フラグメントの再ハイブリダイゼーションを可能にする工程、及び
適切な末端のライゲーション。 - 第一世代のライブラリーの形成に存在しなかった、キャリアーモジュールを表す核酸フラグメントが再ハイブリダイゼーションを可能にする前に加えられる、請求項52の方法。
- 第一世代のライブラリーの形成に使用されなかったキャリアーモジュールのレパートリーが再ハイブリダイゼーションを可能にする前に加えられる、請求項52の方法。
- 濃縮ライブラリーの分画が請求項52の工程に供されて交配された結果が濃縮ライブラリーの残りの部分と共にプールされる、請求項52に記載の方法。
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