JP2005538725A - 遺伝子長ポリヌクレオチドのマイクロアレイ合成及びそのアセンブリ - Google Patents

Abstract

マイクロアレイ基板上でその場で合成された複数の短鎖オリゴヌクレオチドのアセンブリに基づく長い遺伝子長のポリヌクレオチドの試験管内合成方法及びアセンブリ方法を開示する。具体的には、固相マイクロアレイ基板上でのオリゴヌクレオチドフラグメントの in situ 合成方法及びその後の複数の短鎖オリゴヌクレオチドからなる長鎖ポリヌクレオチドの「装置上」アセンブリを開示する。

Description

発明の技術分野
本発明は、マイクロアレイ基板上でその場で合成された多数の短鎖オリゴヌクレオチドのアセンブリに基づく長い遺伝子長ポリヌクレオチドの試験管内合成のための方法及びそのアセンブリを提供する。具体的には、本発明は、固相マイクロアレイ基板上でのオリゴヌクレオチド配列フラグメントの in situ 合成のための方法及び、その後の複数の短鎖オリゴヌクレオチド配列フラグメントからなる長鎖ポリヌクレオチドの「チップ上」アセンブリを提供する。

発明の背景
マイクロアレイの世界では、生体分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドなど）は、ヌクレオチド又は受容体の標的試料との見込まれる結合のために所定位置の表面上に設置される。マイクロアレイは、様々な基板上で利用できる又はその上で生じる生体分子の小型のアレイである。これらのマイクロアレイについての初期の焦点の多くは、一塩基多型（ＳＮＰｓ）とゲノムＤＮＡの検出／評価とに重点を置いたゲノミクス、機能ゲノミクス及びプロテオミクスにあてられてきた（Ｗｉｌｇｅｎｂｕｓ及びＬｉｃｈｔｅｒ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：７６１，１９９９；Ａｓｈｆａｒｉ他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４７５９，１９９９；Ｋｕｒｉａｎ他，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８７：２６７，１９９９；Ｈａｃｉａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１ ｓｕｐｐｌ．：４２，１９９９；Ｈａｃｉａ他，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３，１９９８；並びにＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２６：Ｒ１７１，１９９８）。

一般に、オリゴヌクレオチド内容物を有する３つのマイクロアレイ（「バイオチップ」及び「ＤＮＡアレイ」及び「遺伝子チップ」とも呼ばれるが、この記述的名称は商標登録しようとされている。）のカテゴリーが存在する。多くの場合、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、通常珪素をベースとする固体表面を有する（ガラス製の顕微鏡用スライドであることが多い）。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、多くの場合、（１）物理的手段によってin situ 合成用の単鎖ヌクレオチド又は完全オリゴヌクレオチドを付着させることによる「スポッティング」（インクジェット印刷など）、（２）in situ オリゴヌクレオチド合成のためのフォトリソグラフィー技術（例えば、Ｆｏｄｏｒの米国特許’９３４号及びこの優先権書類に基づく優先権を主張している追加の特許を参照されたい。）、（３）保護化学官能基のｐＨに基づく除去を主体とする電気化学的 in situ 合成（例えば、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙの米国特許第６０９２３０２号及びＳｏｕｔｈｅｒｎの米国特許第５６６７６６７号を参照されたい。）及び（４）完全に形成されたオリゴヌクレオチドの電場引力／反発力（例えば、Ｈｏｌｌｉｓ他の米国特許第５６５３９３９号及びその発明者の一人であるＨｅｌｌｅｒの米国特許第５９２９２０８号を参照されたい。）を含め、異なる技術によって作られ得る。この最初の３つの基本的な技術のみがその場でオリゴヌクレオチドを形成できる（即ち、完全に形成されたオリゴヌクレオチドを配置することなく又は引き寄せることなくマイクロアレイ表面上でそれぞれのオリゴヌクレオチドをヌクレオチドごとに構築することができる。）。

完全に形成されたオリゴヌクレオチドを特定の位置に配置することに関して、コンピューター制御されたプロッター又はさらにインクジェットプリンターを使用する様々なマイクロスポッティング技術がオリゴヌクレオチドを所定の位置にスポットするために開発されてきた。一つの技術は、穴のあいた複数の毛細管を有するガラス繊維を装填し、次いで異なるオリゴヌクレオチドをそれぞれの毛細管に装填する。次いで、マイクロアレイチップ（単にガラス製の顕微鏡用スライドであることが多い）をガラススライドの紙の各シート上にゴム印のようにスタンプする。また、「スポッティング」技術を使用してオリゴヌクレオチドをその場で構築することも可能である。本質的には、これは、適切な短鎖ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの特定の配列が構築されるべきスライド（好ましくはガラススライド）上の正確な位置又は領域に「スポット」することを伴う。従って、完全に形成されたオリゴヌクレオチド又は短鎖ヌクレオチドが in situ 合成のために添加されるかどうかに関わらず、スポッティング技術は、自動化された技術を使用して物質を特定の部位又は領域に正確に配置することを伴う。

別の技術は、光開裂性保護基を有する単鎖オリゴヌクレオチドと調和した一連の正確なフォトマスクを与えることによってオリゴヌクレオチドをその場で塩基ごとに構築するためのフォトマスクを伴うフォトリソグラフィーを包含する。この技術は、Ｆｏｄｏｒ他の米国特許第５４４５９３４号及びその様々な孫特許に記載されている。本質的には、この技術は、「光指向空間アドレス可能平行化学合成を達成するための固相化学、光不安定性保護基及びフォトリソグラフィー」を提供する。

電気化学基板（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙの米国特許第６０９２３０２号、所望ならば参照されたい。）は、複数の微小電極を有する半導体チップ基板を基材とするマイクロアレイを与える。このチップのデザインは、アレイ内の個々の微小電極を選択し及び制御するための並列アドレッシングによって高密度の微小電極アレイを創り出すために相補性金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）技術を使用する。電流でオンになった電極は、該電極に隣接する小さな「仮想フラスコ」領域又はボリューム内のｐＨを変化させるための電気化学的試薬（具体的には酸性プロトン）を生成させる。このマイクロアレイは、反応層の材料に対して多孔性マトリックスで被覆されている。この材料の厚さ及び多孔度が注意深く制御され、そして生体分子が、多孔性マトリックスであってそのｐＨが電気化学的に生成されたプロトンの制御された拡散によって改変され及びその拡散が拡散係数と溶液の緩衝容量とによって制限されるもののボリューム内で合成される。しかしながら、適切に機能するためには、in situ 合成のために電気化学的手段を使用するマイクロアレイバイオチップは、必要なプロトン（酸）をアノードで生じさせるために（その結果として、これらのプロトン及びその他の酸性の電気化学的に生成された酸性試薬は、酸性ｐＨのシフトを生じさせ、そして成長しつつあるオリゴマーから保護基を除去するであろう）該アレイ内のアノードとカソードを交替させなければならない。

遺伝子アセンブリ
任意のポリヌクレオチド配列の調製は、「ポストゲノム」段階には有用である。というのは、これは、任意の所望の遺伝子オリゴヌクレオチド若しくはそのフラグメント又はさらにプラスミド、ファージ及びウイルスの全ゲノム物質を与えるからである。このようなポリヌクレオチドは長い（例えば長さが１０００塩基を超える）。オリゴヌクレオチドの試験管内合成（ホスホラミダイト化学の最良の収量条件を与えた）は実現可能ではないであろう。というのは、それぞれの塩基付加反応が１００％未満の収率だからである。従って、遺伝子長又はそれ以上の長さの長鎖ポリヌクレオチドを得ることを望む研究者は、このような長さのポリヌクレオチドを得るためには自然又は遺伝子単離技術に頼らなければならなかった。この特許出願の目的上、用語「ポリヌクレオチド」は、試験管内で一塩基付加によって作るのが実際的に実現可能でないように十分に長い核酸（単鎖又は二重鎖のいずれか）をいうために使用する。ホスホラミダイト化学のような核酸合成化学からの収率の指数関数的な減少を考慮すれば、このようなポリヌクレオチドは、一般に、１００塩基以上、多くの場合２００塩基以上の長さを有する。多くの市販の有用なゲノムｃＤＮＡは、多くの場合、１０００塩基を超える長さを有していることに留意すべきである。

さらに、用語「オリゴヌクレオチド」又は略語「オリゴ」は、試験管内で合成でき且つ一般に１５０塩基よりも短い長さの、さらに短い長さの単鎖又は二重鎖核酸をいうために使用する。ポリヌクレオチドを一塩基付加によって合成することは理論的には可能であるが、その収率の損失は、１５０塩基を超えると（確実には２５０塩基以上の長さ）、それを実際的に不可能にする。

しかしながら、ゲノム物質の正確な構造の知識は、多くの場合、天然源からこの物質を得るのには十分ではない。ｍＲＮＡ分子のコピーである成熟ｃＤＮＡは、出発物質がこの所望のｍＲＮＡを含有する場合に得られ得る。しかしながら、この特定のｍＲＮＡが試料中に存在しているかどうかは通常分からず、又はこのｍＲＮＡの量は、相当するｃＤＮＡを難なく得るのには低すぎるかもしれない。また、異なるレベルの相同又はスプライス変異体が一つの特定の種類のｍＲＮＡを得るのを妨害し得る。一方、多くのゲノム物質は、多くの異なるゲノム内の遺伝子のエクソン−イントロン構造のため、成熟遺伝子（ｃＤＮＡ）を調製するのには適切でないかもしれない。
米国特許第６０９２３０２号明細書 米国特許第５６６７６６７号明細書 米国特許第５９２９２０８号明細書 米国特許第５４４５９３４号明細書

さらに、斯界には、天然には存在しないポリヌクレオチドに対して、ゲノム検索性能を改善させる要望が存在している。一般に、一次構造が分かったばかりの任意の所望の配列のポリヌクレオチドを短期間に適性価格で得ることができることは、生物医学的研究及び臨床業務のいくつかの分野を有意に前進させるであろう。

有機合成によって合成され且つ個々に精製されたオリゴヌクレオチドからの任意の長鎖ポリヌクレオチドのアセンブリは、他の問題を有する。このアセンブリは、ＰＣＲ又は連結方法を使用して実行できる。慣用方法による多くの異なるオリゴヌクレオチドの合成及び精製（マルチチャンネル合成装置を使用しても）は、労力を要し、しかも費用のかかる手順である。アセンブルしたポリヌクレオチドの現在の市場価格は、１塩基対当たり約１２〜２５ドルであり、これはより長いポリヌクレオチドをアセンブルするためには相当なものである。慣用法で合成されたオリゴヌクレオチドの量は過剰であることが多い。これも最終製品のコストの一因となる。

従って、斯界には、現在の方法ほど扱いにくくなく且つ労働集約型でない、ポリヌクレオチドを１塩基当たり１ドル以下又は現在の方法の１〜２０倍以下のコストで提供することができる手順によって費用効果のあるポリヌクレオチドを提供する要望が存在する。本発明は、この要望に応えるためになされた。

発明の概要
本発明は、マイクロアレイ上でポリヌクレオチド配列に合成されるオリゴヌクレオチドのアセンブリ方法を提供する。所望の標的ポリヌクレオチド配列は、重複するオリゴヌクレオチドの断片に切断される。第１の具体例では、これらのオリゴヌクレオチドは、開裂できない形でマイクロアレイチップ上に平行な状態でその場で合成される。プライマー伸長法により標的ポリヌクレオチドをアセンブルする。このプライマー伸長法は、適切な配列に対して特異的な開始プライマーを使用する。最後の工程は、最終ポリヌクレオチド産物のＰＣＲ増幅である。好ましくは、このポリヌクレオチド産物は、転写の目的のために好適で且つ転写のためのプロモーターをさらに含むｃＤＮＡである。

本発明は、次の工程：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面を有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、第１のオリゴヌクレオチド配列が第２のオリゴヌクレオチド配列の領域と同一又は実質的に同一である約１０〜約５０塩基の重複配列を有し、そして該第２のオリゴヌクレオチド配列が第３のオリゴヌクレオチド配列との重複領域を有する（以下同様）ものとし（以下、第１オリゴヌクレオチドをオリゴ１、第２オリゴヌクレオチドをオリゴ２・・・とする。）、
（ｂ）オリゴ１に相補的なプライマー１を伸長させることによって相補オリゴ１を形成させ、
（ｃ）オリゴ１から相補オリゴ１を解離させ、そして相補オリゴ１をオリゴ１とオリゴ２の該重複配列との両方にアニーリングさせ、ここで、該相補オリゴ１のオリゴ２へのアニーリングが相補オリゴ１＋２を形成させるための伸長用プライマーとしての役割を果たすものとし、
（ｄ）工程（ｃ）のプライマー伸長サイクルを全長ポリヌクレオチドが生成するまで繰り返し、及び
（ｅ）アセンブルした相補全長ポリヌクレオチドを増幅させて所望量の全長ポリヌクレオチドを生成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。

好ましくは、固体又は多孔性の表面は、マイクロアレイ装置の形である。最も好ましくは、このマイクロアレイ装置は、ヌクレオチドの塩基をカップリングさせ及びデカップリングさせるための電気化学的手段を使用してオリゴヌクレオチドをその場で合成させるための複数の電極を有する半導体装置である。好ましくは、プライマー伸長反応は、融解、アニーリング及び次に伸長の連続方法によって実施される。最も好ましくは、プライマー伸長反応は、複数のオリゴヌクレオチドを結合してなるマイクロアレイを使用してＰＣＲ増幅装置で実施される。

さらに、本発明は、次の工程：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該配列内に次のオリゴヌクレオチド配列に相当する重複領域を有し、且つ、２個のフランキング配列であって一方がそれぞれのオリゴヌクレオチドの３'末端にあり他方が５'末端にあるものをさらに含むものとし、そしてこの際に、それぞれのフランキング配列は、約７〜約５０塩基であり、且つ、プライマー領域と制限酵素開裂部位を有する配列セグメントとを含むものとし、
（ｂ）該フランキング配列のプライマー領域を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させて二重鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドを形成させ、
（ｃ）該オリゴヌクレオチド配列を該制限酵素開裂部位で開裂させ、及び
（ｄ）該開裂オリゴヌクレオチド配列を該重複領域を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチド配列を形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。

好ましくは、フランキング配列は、約１０〜約２０塩基の長さである。好ましくは、制限酵素開裂部位は、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位である。最も好ましくは、II型エンドヌクレアーゼ制限部位は、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する。好ましくは、このフランキング配列は、フランキング配列からの開裂オリゴヌクレオチドを精製するために使用される結合部分をさらに含む。好ましくは、この方法は、増幅工程（ｂ）中に、結合部分で標識されたプライマー配列を使用してフランキング配列を標識する工程をさらに含む。最も好ましくは、結合部分は、アビジン若しくはストレプタビジンによって捕獲されるビオチン又は抗フルオレセイン抗体によって捕獲され得るフルオレセインのような、捕獲され得る小分子である。

さらに、本発明は、次の工程：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該配列内に次のオリゴヌクレオチド配列に相当する重複領域を有し、且つ、開裂性のリンカー部分を有する配列セグメントをさらに含むものとし、
（ｂ）該マイクロアレイ又はビードの固体表面からそれぞれのオリゴヌクレオチド複合体を開裂させるように該オリゴヌクレオチド配列を該開裂性リンカー部位で開裂させてそれぞれ重複配列を有するオリゴヌクレオチドの可溶性混合物を形成させ、及び
（ｃ）該オリゴヌクレオチド配列を該重複配列を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。

好ましくは、この開裂性リンカーは、開裂が３'ヒドロキシヌクレオチドを生じさせるようにスクシネート部分をヌクレオチド部分に結合させてなる化学組成物である。最も好ましくは、開裂性リンカーは、５'−ジメトキシトリチルチミジン−３'−スクシネート、４−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−３'−スクシネート、１−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−３'−スクシネート、２−Ｎ−イソブチリル−５'−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−３'−スクシネート及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択される。

さらに、本発明は、次の工程：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、末端に該固体又は多孔性表面に結合したフランキング領域と、ポリヌクレオチド配列を複数の重複オリゴヌクレオチド配列に切断することによってデザインされる特定の領域とを有し、そしてこの際に、第１のオリゴヌクレオチド上の第１の重複配列が第２のオリゴヌクレオチドの第２の重複配列に相当し、しかも該フランキング配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）酵素によって開裂し得るＲＥ認識配列を有する配列セグメントを含むものとし、
（ｂ）該フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて対応するＲＥ酵素と相互作用し得る二重鎖配列を形成させ、
（ｃ）該複数のオリゴヌクレオチドを消化させてこれらのものを該マイクロアレイ又はビードから溶液にまで開裂させ、及び
（ｄ）該オリゴヌクレオチド混合物を該重複領域を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法を提供する。

好ましくは、フランキング配列は、約１０〜約２０塩基の長さである。好ましくは、この制限酵素開裂部位は、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である。最も好ましくは、このII型エンドヌクレアーゼ制限部位は、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する。好ましくは、この方法は、ポリヌクレオチドの両末端に位置したプライマーを使用して該ポリヌクレオチド配列を増幅させる最終工程をさらに含む。

さらに、本発明は、次の工程：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、２個のフランキング配列であってその一方がそれぞれのオリゴヌクレオチドの３'末端にあり他方が５'末端にあるものをさらに含み、そしてこの際に、それぞれのフランキング配列は、約７〜約５０塩基であり、且つ、プライマー領域と制限酵素開裂部位を有する配列セグメントとを含むものとし、
（ｂ）該フランキング配列のプライマー領域を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させて二重鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドを形成させ、及び
（ｃ）該二重鎖オリゴヌクレオチド配列を該制限酵素開裂部位で開裂させること
を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法を提供する。

好ましくは、このフランキング配列は、約１０〜約２０塩基の長さである。好ましくは、この制限酵素開裂部位は、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である。最も好ましくは、このII型エンドヌクレアーゼ制限部位は、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせより群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する。好ましくは、このフランキング配列は、フランキング配列からの開裂オリゴヌクレオチドを精製するために使用される結合部位をさらに含む。好ましくは、この方法は、増幅工程（ｂ）中に、結合部分で標識されたプライマー配列を使用して該フランキング配列を標識する工程をさらに含む。最も好ましくは、結合部分は、アビジン若しくはストレプタビジンによって捕獲され得るビオチン又は抗フルオレセイン抗体によって捕獲され得るフルオレセインのような、捕獲され得る小分子である。

さらに、本発明は、次の工程：
（ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかもそれぞれのオリゴヌクレオチド配列は開裂性リンカー部分を有する配列セグメントを有するものとし、
（ｂ）該マイクロアレイ又はビードの固体表面からそれぞれのオリゴヌクレオチド配列を開裂させるように該オリゴヌクレオチド配列を該架橋性リンカー部位で開裂させて可溶性のオリゴヌクレオチド混合物を形成させること
を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法を提供する。

好ましくは、この開裂性リンカーは、開裂が３'ヒドロキシヌクレオチドを生じさせるようにスクシネート部分をヌクレオチド部分に結合してなる化学組成物である。最も好ましくは、この開裂性リンカーは、５'−ジメトキシトリチルチミジン−３'−スクシネート、４−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−３'−スクシネート、１−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−３'−スクシネート、２−Ｎ−イソブチリル−５'−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−３'−スクシネート及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択される。

さらに、本発明は、次の工程：
（ａ）固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該固体又は多孔性表面に結合する末端にあるフランキング領域と、特定領域とを有し、この際に、該フランキング配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）酵素によって開裂し得るＲＥ認識配列を有する配列セグメントを含むものとし、
（ｂ）該フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて該対応するＲＥ酵素と相互作用し得る二重鎖配列を形成させ、
（ｃ）該複数のオリゴヌクレオチドを消化させてこれらのものを該マイクロアレイ装置又はビードから溶液にまで開裂させること
を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法を提供する。

好ましくは、このフランキング配列は、約１０〜約２０塩基の長さである。好ましくは、この制限酵素開裂部位は、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である。最も好ましくは、このII型エンドヌクレアーゼ制限部位は、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせより群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する。

図面の簡単な説明
図１は、マイクロアレイ装置の表面又は多孔性マトリックス上での遺伝子アセンブリの概要を示している。図１Ａでは、標的遺伝子配列は、多数の重複オリゴヌクレオチドに切断されている。３'及び５'は、示される鎖の末端である。また、図１Ａは、標的配列を基準にして、プライマーＰｒｌ、プライマーＰｒ１の伸長産物（相補オリゴヌクレオチド１）及び相補オリゴヌクレオチド１の伸長産物（相補オリゴヌクレオチド１＋２）も示している。図１Ｂは、アセンブリ方法の初期工程の一具体例を例示している。アセンブリの工程１では、プライマーＰｒ１をオリゴヌクレオチド１にアニーリングさせ、そして適切なポリメラーゼ酵素によってオリゴヌクレオチド１に相補的な産物に伸長させる。第２工程は、大量のＰｒ１伸長産物（相補オリゴヌクレオチド１）の生成、該相補オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド１との再会合及び該相補オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２とのアニーリングをもたらし、その後オリゴヌクレオチド１＋２に相補的な産物へのその伸長をもたらすための融解、再アニーリング及び伸長（即ち増幅）である。図１Ｃは、図１Ｂからのアセンブリ方法の続きを示している。具体的には、該方法の工程３（即ち、融解、再アニーリング及び伸長）は、工程２と同一の産物に加えて、オリゴヌクレオチド１＋２＋３に相補的な産物をもたらす。サイクル（工程）は、全長相補ポリヌクレオチドが形成されるまで繰り返される。最終工程は、最終標的ポリヌクレオチド分子の末端に相補的な２個のプライマー（ＰｒＸ及びＰｒＹ）を使用した増幅（即ちＰＣＲ）による所望量の該最終標的分子の調製である。

図２は、マイクロアレイ上でその場で合成されるオリゴヌクレオチドであってそれぞれが制限酵素開裂部位を含むフランキング配列領域を有するものを使用し、その後ＰＣＲ増幅工程及びＲＥII制限酵素開裂工程に続く本発明の遺伝子アセンブリ方法の第２の具体例を示している。

図３は、合成され、次いでマイクロアレイ装置から開裂されるオリゴを使用する遺伝子アセンブリについての概略を示している。具体的には、Ａと表示された上のパネルにおいて、オリゴヌクレオチド配列は、開裂性リンカー（ＣＬ）部分を介してマイクロアレイ装置に結合している。開裂性リンカー部分の例を図３Ａに与えている。この開裂性リンカーは、オリゴヌクレオチド合成のプロセスに持ちこたえることができ（即ち、ホスホラミダイト化学）、そして次いで開裂してオリゴヌクレオチドフラグメントを放出することができる分子である。開裂性リンカーＣＬでの化学的な開裂は、通常特定のオリゴ１〜Ｎの３'末端を再度生じさせる。これらのオリゴヌクレオチドは混合物に放出される。このオリゴヌクレオチド混合物は、その後、全長ポリヌクレオチド分子にアセンブルされる。「Ｂ」と表示された図３の下のパネルでは、オリゴヌクレオチド配列は、制限酵素（ＲＥ）配列部位を含む追加のフランキング配列を介してマイクロアレイ装置に結合している。該フランキング配列の領域に相補的な別のオリゴヌクレオチド配列がこのマイクロアレイ装置上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。これは、「ｄｓ」又は二重鎖オリゴヌクレオチド構造であってそれぞれがフランキング配列領域内にＲＥの配列認識領域を有するものを再度生じさせる。このｄｓオリゴヌクレオチドを対応するＲＥ酵素によって該フランキング配列領域内にあるＲＥ認識部位で消化することにより、特定のオリゴヌクレオチド１〜Ｎが放出される。アセンブルされると、オリゴヌクレオチド配列１〜Ｎは、全長ポリヌクレオチド分子を形成する。

図４は、３種のオリゴヌクレオチドフラグメントであってそのそれぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントがマイクロアレイ装置上でその場で合成されたものからのポリヌクレオチドのアセンブリを示している。この完全にアセンブルされたポリヌクレオチドは、in situ 合成では事実上達成され得ない長さである１７２ｍｅｒの長さであった。この本発明の第１の具体例の方法をこの実施例で使用した。

図５は、図４の１７２ｍｅｒポリヌクレオチドをアセンブルするために使用したオリゴヌクレオチド配列を示している。プライマーＸ及びＺの配列は下線で示されている。ＨｐａII制限部位は下線を引いたイタリック体で示されている。

図６は、ＲＥII型酵素であるＭｌｙＩを使用したアセンブリ用の特定オリゴヌクレオチドの調製のために使用したフランキング領域及びプライマーの配列を調製するためのスキームを示している。プライマー１は、マイクロアレイ装置上のオリゴヌクレオチド鎖に相補的であり、且つ、ビオチン−ＴＥＧ（トリエチレングリコール）部分を含有する。プライマー２は、マイクロアレイ装置上の該オリゴヌクレオチド鎖と同一の鎖であり、且つ、ビオチン−ＴＥＧ部分を含有する。これらのプライマー間の任意の配列が使用でき、そしてこれを単に一連のＮで示す。

図７は、図６に記載されるようなオリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ及びＭｌｙＩ消化の結果を示している。このクリーンなバンドは、適切な制限酵素を使用してオリゴヌクレオチド配列を開裂させるための本発明の方法の第２の具体例を使用して純粋なオリゴヌクレオチドを得ることができることを示している。

図８は、２９０ｂｐのポリヌクレオチドをアセンブルさせるために使用した９種のオリゴヌクレオチドフラグメント（通し番号１〜９がふってある）からの配列を示している。フランキング領域は、太字及び下線で示されている。このポリヌクレオチドアセンブリのために使用した方法は、第２の具体例である。重複領域は、ＭｌｙＩであるII型制限エンドヌクレアーゼに対するＭｌｙＩ認識部位としての開裂部位をさらに含んでいた。

図９は、上のパネルにおいては、９種のオリゴヌクレオチドからポリヌクレオチドをアセンブリするための概略を示している。図８に示した９種のオリゴヌクレオチド配列を、プライマー１及び２（図６に記載されるような）を使用したＰＣＲによって同一のフランキング領域と特定の重複配列とを含有するｄｓＤＮＡフラグメントに増幅させ、ＭｌｙＩ酵素で消化してフランキング配列を除去し、そしてこれを２９０ｂｐのＤＮＡフラグメントのアセンブリのために使用した。示されているゲルのカラムは、Ｍ：マーカー、１：プライマーＦＰ１及びＦＰ２なしのアセンブリである負の対照、２：特定オリゴなしのアセンブリである負の対照、３：特定オリゴ＋ＦＰ１及びＦＰ２プライマーによる増幅からの２９０ｂｐフラグメントのアセンブリである。カラム３のバンドは、本発明のポリヌクレオチドアセンブリ方法の高い効率を示している。

図１０は、構成成分であるオリゴヌクレオチドにまで分解された例４のアセンブルポリヌクレオチドの配列を示している。

発明の詳細な説明
本発明は、マイクロアレイ装置若しくは固体表面ビード装置上で合成され又はその上にスポットされた重複短鎖オリゴヌクレオチドのアセンブリを使用したポリヌクレオチド配列（遺伝子とも呼ばれる。）の調製を説明する。この短鎖オリゴヌクレオチドとしては、所望のポリヌクレオチドの配列へのアセンブリを助成するための重複領域を有する配列領域が挙げられる。重複領域とは、第１のオリゴヌクレオチド配列であって、第２のオリゴヌクレオチドの一部分と同一であり、同一の方向を有し（３'から５'又は５'から３'の方向に対して）、及び第２オリゴヌクレオチド配列又はその相補配列（第２の具体例）の５'末端又は３'末端にハイブリダイズするであろうもの（この第２オリゴヌクレオチド配列は第３のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする：以下同様）の３'末端又は５'末端のいずれかにある配列領域をいう。マイクロアレイ装置又はビード装置をポリヌクレオチドアセンブリのために使用するようにデザインし又は開発するためには、ポリヌクレオチド配列は、多数の重複オリゴヌクレオチドセグメントであってそれぞれ２０〜１０００塩基、最も好ましくは２０〜２００塩基の長さを有するものに分割（又は切断）される（図１Ａ）。オリゴヌクレオチドセグメント間での重複は、第１から第２、第２から第３、第３から第４（以下同様）の適切なハイブリダイゼーションが生じるように５以上の塩基、好ましくは１５〜２５塩基である。これらのオリゴヌクレオチド（又はオリゴ）は、好ましくは、任意の利用可能な方法（即ち、電気化学的 in situ 合成法、フォトリソグラフィー in situ 合成法、インクジェット印刷法、スポッティング法など）を使用してマイクロアレイ装置上で合成される。マイクロアレイ装置の表面又はマイクロアレイ装置を覆う多孔性マトリックスに対する合成の方向は、３'から５'又は５'から３'であることができる。好ましくは、in situ 合成は、３'から５'の方向で行われる。

第１の具体例では、本発明の遺伝子／ポリヌクレオチドアセンブリ方法は、マイクロアレイ装置上に固定されたオリゴヌクレオチドを使用する。このマイクロアレイ装置自体又は固定されたオリゴヌクレオチドを有する多孔性反応層は、本発明の遺伝子／ポリヌクレオチドアセンブリ方法のために使用できる。

図１Ｂに関して、この方法は、任意の熱サイクラー器具で実行できる融解、アニーリング及び伸長のいくつかの反復工程（図１Ｂ）を含む。サイクルプログラムは、ＰＣＲのために使用されるプログラムと同様である。遺伝子／ポリヌクレオチドアセンブリの第１工程で、プライマーＰｒ１を添加し、そしてマイクロアレイ装置上のオリゴヌクレオチド１にアニーリングさせ、次いで適切なポリメラーゼ酵素によってオリゴヌクレオチド１に相補的な産物（相補オリゴヌクレオチド１と呼ぶ。）に伸長させる。この方法の第２工程で、オリゴヌクレオチド１に相補的な産物がオリゴヌクレオチド１から融解し、プライマー１が再度オリゴヌクレオチド１にアニーリングし、並びに、オリゴヌクレオチド１に相補的な産物がオリゴヌクレオチド１に部分的に再アニーリングし及びオリゴヌクレオチド２に部分的にアニーリングする（オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２の間の重複配列領域のため）。Ｐｒ１の伸長は、追加量のＰｒ１伸長産物（相補オリゴヌクレオチド１）の生成をもたらす。相補オリゴヌクレオチド１のオリゴヌクレオチド２へのアニーリング後のその伸長は、オリゴヌクレオチド１＋２に相補的な産物（相補オリゴヌクレオチド１＋２と呼ぶ。）をもたらす。同様に、この方法の工程３で、融解、再アニーリング及び伸長は、工程２と同一の産物に加えて、オリゴヌクレオチド１＋２＋３に相補的な産物をもたらす。これらの融解、アニーリング及び伸長サイクルは、全長ポリヌクレオチドが形成されるまで繰り返される。サイクルの回数は、マイクロアレイ装置上のオリゴの数以上であるべきである。形成後に、この最終標的ポリヌクレオチド分子をこの分子の末端に相補的な２個のプライマーによるＰＣＲ方法によって所望量にまで増幅させる。

第２の具体例では、互いに（重複領域と共に）標的ポリヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ装置上で合成させる（又は固体基材としてのビーズ上で合成させることができる）が、ここで、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、短いフランキング配列領域をさらに含み、しかもそれぞれのフランキング配列領域は、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはII型エンドヌクレアーゼ（ＥＲII）酵素に対する１個の又は複数の配列部位を含むものとする。それぞれのオリゴヌクレオチドを、フランキング配列領域に対する好適なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって増幅させて複数のオリゴヌクレオチドの調製物を形成させる。次いで、このオリゴヌクレオチド調製物を好適なＲＥII型酵素（該フランキング配列領域内の制限配列に特異的な）で処理して、互いに所望のポリヌクレオチド配列を含むフランキングフラグメントと重複オリゴヌクレオチドを生成させる。所望ならば、フランキングフラグメントとＰＣＲプライマーとを寸法又は該ＰＣＲプライマーの特異的な標識化に基づく異なる方法によって該混合物から除去する。次いで、所望の標的ポリヌクレオチドに類似するオリゴヌクレオチドを、プライマー伸長法の反復及び最終標的ポリヌクレオチド分子のＰＣＲ増幅を使用して該最終分子にアセンブルさせる。

特に、第２の具体例では、アセンブリ方法は、最初に、スポッティング若しくはインクジェット印刷のような固定化技術によって又はフォトリソグラフィー若しくは電気化学的合成法のような様々な技術を使用するマイクロアレイ装置の直接 in situ 合成によってマイクロアレイ装置若しくはビーズに固定されたオリゴヌクレオチドを使用する。重複オリゴヌクレオチド配列は、重複領域とII型制限認識部位（図２Ａ）を含む１個又は２個のフランキング配列領域とを有するようにデザインされる。アセンブルしたオリゴヌクレオチドは、共に標的ポリヌクレオチド配列を含む。

フランキング配列の長さは、少なくともＲＥII認識部位の長さである。フランキング配列は、マイクロアレイ装置上の特定オリゴヌクレオチド配列領域に対して最小の相同性を有するようにデザインされる。フランキング配列は、それぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントについて同一であることができ、又は２種以上の異なる配列であることができる。例えば、Ｐｒ１及びＰｒ２と呼ばれる一対の好適なプライマーは、それぞれのオリゴヌクレオチドをＰＣＲによってマイクロアレイ装置上で増幅（図２）させるようにデザインされた。それぞれのプライマーは、プライマーとしての役割を果たし得ることに影響を及ぼさないビオチンのような結合部分を含有し得る。ＰＣＲ増幅後に、それぞれのオリゴヌクレオチドの増幅ｄｓコピーは、反応混合物中に存在していた。この反応混合物は、好適なＲＥII型酵素又はフランキング配列領域内にある制限部位に対して特異的な酵素で処理された。ＲＥIIに対する消化部位は、開裂後に、アセンブルしたときには標的ポリヌクレオチド配列を形成するであろう所望の特定オリゴヌクレオチド配列フラグメントを生成させるようにデザインされた。消化の結果として、所望の標的ポリヌクレオチドの構造に類似する特定の二重鎖（ｄｓ）重複オリゴヌクレオチド配列フラグメントとｄｓフランキング配列との混合物が形成された。所望ならば、これらのフランキング配列及び残余のプライマーは、プライマーに導入された特異的部分を介した特異的吸収を使用して（例えば、ビオチン標識プライマーに対するアビジンビーズ上での吸収によって）、又は特定オリゴとフランキング配列とプライマーとの寸法の差に基づき混合物から除去される。標的遺伝子配列に類似する特定オリゴヌクレオチド配列の混合物は、融解、自己アニーリング及びポリメラーゼ伸長の反復サイクルを使用して最終標的ポリヌクレオチド分子をアセンブルさせるために使用され、その後、この最終標的ポリヌクレオチド分子は、増幅するようにデザインされた好適なＰＣＲプライマーでＰＣＲ増幅される。この最後のＰＣＲ増幅工程は、斯界において日常的に行われており、例えば、Ｍｕｌｌｉｓ外，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１ Ｐｔ １：２６３−７３，１９８６；及びＳａｉｋｉ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１，１９８８に記載されている。ＰＣＲ増幅工程は、一般に、製造業者の説明書に従う。簡単にいえば、核酸又はその混合物中に含まれる任意の標的核酸配列を増幅させるための方法は、該核酸の別個の相補鎖を過剰モル濃度の２個のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、そして該プライマーを熱安定性のある酵素で伸長させて所望の核酸配列を合成させるための鋳型として作用する相補プライマー伸長産物を形成させることを含む。増幅した配列は容易に検出できる。この反応の工程は、所望の回数繰り返すことができ、且つ、ハイブリダイゼーション、酵素活性の促進及び形成された雑種の変性をもたらすための温度サイクリングを伴う。

アセンブリ工程についての別の具体例では、共に標的ポリヌクレオチド分子を含むオリゴヌクレオチド配列を、Ａｕ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４８：２００−３，１９９８に記載されるようなリガーゼ連鎖反応を使用してアセンブルする。簡単に言えば、短いオリゴヌクレオチドを高ストリンジェント条件でリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって連結させて「単位フラグメント」を作る（２．２ｍＭの各オリゴ、８単位のＰｆｕＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社，カリフォルニア州ラ・ホーヤ）及び該酵素と共に与えられる反応用緩衝液を含有する５０μＬの反応混合物）。ＬＣＲは次のように実施した：９５℃１分；１５回のサイクルにわたって５５℃１．５分、７０℃１．５分、９５℃３０秒；５５℃２分；７０℃２分、次いでこれらのものを融合させてポリメラーゼ連鎖反応により全長遺伝子配列を形成させる。

さらに別の具体例では、ｄｓオリゴヌクレオチド配列を、Ｐａｃｈｕｋ外，Ｇｅｎｅ ２４３：１９−２５，２０００及び米国特許第６１４３５２７号（所望ならば参照されたい）に記載されるような鎖連結クローニング法によって調製した後にアセンブルする。簡単に言えば、連鎖反応クローニングは、ＤＮＡリガーゼ及び架橋オリゴヌクレオチドによって二重鎖ＤＮＡ分子の連結を可能にする。二重鎖核酸分子は、単鎖分子に変性される。これらの分子の末端は、鋳型へのハイブリダイゼーションによって一致する。この鋳型は、この２個の単鎖核酸分子が正確に整列するのを保証する。ＤＮＡリガーゼがこの２個の核酸分子を単一の大きな複合核酸分子へと結合させる。その後に、この核酸分子を変性させ、その結果として、連結した核酸分子と鋳型とによって形成された複合分子は、それぞれにハイブリダイズしなくなる。このときに、それぞれの複合分子は、連結していない単鎖核酸分子を配向させるための鋳型としての役割を果たす。数回のサイクル後に、複合核酸分子が、さらに小さな核酸分子から生成される。制限酵素消化、ＤＮアーゼ消化、化学的開裂、酵素又は化学合成及びＰＣＲ増幅によって生成されたＤＮＡフラグメントの部位特異的連結反応を含む連鎖反応クローニングについての多数の応用が開示されている。

本発明の方法の第２の具体例（図２に例示される）に関して、標的ポリヌクレオチド遺伝子配列（いずれかの鎖）は、図１に示すように、手作業で又はソフトウェアプログラムで多数の重複オリゴヌクレオチド配列に分割される。これらのオリゴヌクレオチド配列は、フランキング配列Ａ及びＢ（フランキング領域配列内に１個又は複数の制限酵素部位を有する）と共に、マイクロアレイ装置上で若しくは in situ 合成技術を使用してビード固体表面上で（その場で）合成され、又は標準的なスポッティング（例えば、コンピューターを使用した又はインクジェット印刷）技術による標準的なオリゴヌクレオチド合成手順を使用してマイクロアレイ装置上にスポット（予備合成）される。これらのオリゴヌクレオチド配列は、好ましくは一対のプライマー（Ｐｒ１及びＰｒ２）によるＰＣＲ方法を使用して増幅される。これらのプライマーは、随意としてビオチンのような特異的な結合部分で標識される。得られる異なる増幅オリゴヌクレオチド配列の増幅混合物は二重鎖（ｄｓ）である。このｄｓオリゴヌクレオチド配列の混合物をＲＥII制限酵素（例えば、ＭｌｙＩ酵素）のような好適な制限酵素で処理して所望のポリヌクレオチド（遺伝子）及びｄｓフランキング配列の構造にアセンブルされ得る異なる二重鎖（ｄｓ）重複オリゴヌクレオチド配列の混合物を生成させる。随意として、このフランキング配列と残余のプライマーとは、好ましくは、プライマーに導入された特異的結合部分（例えばビオチン）を使用した特異的吸収方法によって又は特定オリゴヌクレオチド配列とフランキング配列との寸法の差に基づく寸法分別方法によって、このｄｓオリゴヌクレオチド配列混合物から除去される。特定オリゴヌクレオチド配列の混合物は、例えば、融解、自己アニーリング及びポリメラーゼ伸長の反復サイクルの方法によってアセンブルされ、その後、その最終分子は、この完成分子を増幅させるようにデザインされた好適なＰＣＲプライマーによりＰＣＲ増幅される（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ外，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｕｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１ Ｐｔ １：２６３−７３，１９８６；及びＳａｉｋｉ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１，１９８８に記載されるように）。

本発明の方法のさらに別の具体例（図３で例示される）では、標的ポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド配列は、マイクロアレイ装置又はビード固体支持材上で合成されるが、ここで、それぞれのオリゴヌクレオチドは、合成後にオリゴヌクレオチドがマイクロアレイ装置から溶液へと開裂し得るように、配列内に合成された開裂性リンカー部分を有している。好適な開裂の例を図３Ａに示している。この開裂方法のほかに、ＲＥ酵素部位を含有する配列をマイクロアレイ装置に結合したオリゴヌクレオチドの末端で合成させることができる。次いで、これらのマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドをこの追加のフランキング配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そしてＲＥ酵素部位に対して特異的なＲＥ酵素で処理する。この方法は、標的ポリヌクレオチドの構造に類似するオリゴヌクレオチドフラグメントを放出させる。次いで、このオリゴヌクレオチドのセットを、連結、プライマー伸長及びＰＣＲ法のうちのいずれか一つ又はそれらの方法の組み合わせを使用して最終ポリヌクレオチド分子にアセンブルさせることができる。

本発明の方法の第３の具体例では、全長ポリヌクレオチドにアセンブルされ得る複数のオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ装置（又は固体表面を有するビーズ）上で合成させるが、このオリゴヌクレオチドは、特異的開裂性リンカー部分（図３Ａ）を有し又はマイクロアレイ装置若しくはビーズの固体支持材から化学的処理によって開裂し得る。この正味の効果は、それぞれの特定オリゴヌクレオチド配列の機能性３'末端及び５'末端を再度生じさせることである。これらのものを開裂させるための処理後に、オリゴヌクレオチド（それぞれが重複領域を有する）は混合物に放出され、そしてここで説明した遺伝子アセンブリ方法のうち任意のものを使用する全長ポリヌクレオチド遺伝子アセンブリのために使用される。

特に、図３に例示されるような第３の具体例では、標的ポリヌクレオチド配列は、多数の重複オリゴヌクレオチド配列にソフトウェアプログラムによって又は理論上切断される（必ずしも研究室で物理的に行う必要はない）。これらのオリゴヌクレオチド配列は、マイクロアレイ装置上で物理的に合成される。別法Ａでは、これらのオリゴヌクレオチド配列を開裂性リンカー部分を介してマイクロアレイ装置に連結させる。塩基性条件下（例えば、アンモニアの添加による）における開裂性リンカーＣＬでの化学的な開裂は、特定オリゴヌクレオチド配列１〜Ｎの通常の３'末端を再度生じさせる。オリゴヌクレオチド１〜Ｎは、混合物に放出される。このオリゴヌクレオチド配列の混合物は、ポリヌクレオチドアセンブリのために使用される。

別法Ｂの別の例では、オリゴヌクレオチド配列を制限酵素（ＲＥ）配列部位を含有する追加のフランキング配列領域を介してマイクロアレイ装置に連結させる。このフランキング配列に相補的な第２オリゴヌクレオチドフラグメントをこのマイクロアレイ装置上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。これは、ＲＥ認識部位を含むフランキング配列領域でｄｓ構造を再度生じさせる。このフランキング配列領域内のＲＥ認識部位に特異的なＲＥ酵素によるこのｄｓＤＮＡ構造の消化は、特定オリゴヌクレオチド１〜Ｎを混合物溶液に放出させるであろう。このオリゴヌクレオチド１〜Ｎは、溶液の状態でポリヌクレオチド分子にアセンブルできる。

別法Ｂでは、共にポリヌクレオチドにアセンブルするオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ装置上で合成させるが、ここで、それぞれはマイクロアレイ側にフランキング配列を有している。このフランキング配列は、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）認識部位をさらに含む（図３Ｂ参照）。このフランキング配列領域に相補的なオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ装置上のオリゴヌクレオチドに添加し、そしてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後に、ＲＥ（フランキング領域内のＲＥ配列に特異的な制限酵素）をマイクロアレイ装置に添加する。特定オリゴヌクレオチド配列がＲＥ消化の結果としてマイクロアレイ装置から混合物に放出される。この特定オリゴヌクレオチド配列の混合物が全長ポリヌクレオチド配列にアセンブルされる。

例１
この例は、本発明の方法の第１の具体例（図４及び５）に従う、マイクロアレイ装置上で合成された非開裂性オリゴヌクレオチド配列からの１７２ｍｅｒポリヌクレオチド配列のアセンブリを例示する。３種のオリゴヌクレオチド（図５に示す配列）を電気化学的方法に従ってマイクロアレイ装置上でその場で合成した（例えば、米国特許第６０９３３０２号を参照されたい。ここに引用して説明に代える。）。合成されたオリゴヌクレオチド配列をプライマーＸ（オリゴ＃１の鎖に相補的）及びＺ（オリゴ＃３と同一の鎖）（図５）を使用したＲＣＲ反応によって増幅させた。ＡｍｐｌｙＧｏｌｄ（商標）酵素を有するＰＣＲキット（アプライドバイオシステムズ社）を使用した４５サイクルのＰＣＲの後に、１７２ｂｐの正確なＤＮＡフラグメントが合成された（図４）。その後の消化により、この酵素の特異性を確認した（ＨｐａIIにより１０６ｂｐと６８ｂｐの二つのフラグメントが生じた）。

例２
この例は、全長ポリヌクレオチドへのアセンブリ用のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ及びＲＥII（制限酵素）消化により調製するための本発明の方法の第２の具体例を例示する。単鎖オリゴヌクレオチド配列を例１の手順に従ってマイクロアレイ装置上で合成した（図２及び６参照）。このオリゴヌクレオチド配列は、２個のフランキング配列をさらに含んでおり、そしてそのそれぞれはＭｌｙＩ制限酵素に対する認識部位を有していた。このマイクロアレイ装置を２つのプライマー（図７に示した）を使用したＰＣＲ（２５サイクル）反応に付して増幅ＰＣＲフラグメントの混合物を生成させた。この得られた増幅ＰＣＲフラグメントをＭｌｙＩ制限酵素で消化し、そしてＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製してアセンブリの準備が整った特定オリゴヌクレオチドを生成させた（図７）。同様に、この特定オリゴヌクレオチドをストレプタビジン−アガロース（シグマ社）による消化混合物の吸収によってフランキング配列から精製した。

例３
この例は、それぞれＭｌｙＩ制限部位を含むフランキング配列を有する９種のオリゴヌクレオチドからの２９０ｂｐのポリヌクレオチド配列のアセンブリを例示する。この９種の異なるオリゴヌクレオチド配列のぞれぞれを例１で説明したような in situ 電気化学法によってマイクロアレイ装置上で合成した。
９種の特定のオリゴヌクレオチド配列（図８に示されるようなフランキング配列を有する）を含むマイクロアレイ装置を、図６に記載される２つのプライマーであるプライマー１及び２を使用したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のために使用してｄｓオリゴヌクレオチド配列の混合物を形成させた。これらのプライマーは、フランキング配列に相補的であった。増幅されたｄｓオリゴヌクレオチド配列の混合物をＭｌｙＩ酵素で消化させた。特定のｄｓオリゴヌクレオチド配列を精製し、次いで、図２に記載され且つ図９に図式的に示されるような２つの工程で最終２９０ｂｐポリヌクレオチド配列にアセンブルさせた。第１のアセンブリ工程では、２０サイクルの融解−アニーリング−伸長を使用した。最終産物を、２つのプライマーＦＰ１及びＦＰ２（図９）を使用して２５サイクルのＰＣＲで２９０ｂｐのポリヌクレオチドＤＮＡに増幅させた。

例４
この例は、３８種の重複オリゴヌクレオチド配列（図１０）を使用した、融合蛋白質ＭＩＰ−ＧＦＰ−ＦＬＡＧ（マクロファージ炎症蛋白質−緑色蛍光蛋白質−ＦＬＡＧペプチド）についての発現を暗号化できるｃＤＮＡポリヌクレオチド配列の作製を例示する。この３８種のオリゴヌクレオチドを、例１に記載したように、電気化学的 in situ 合成方法を使用してマイクロアレイ装置上で合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、それらの３'末端に開裂性リンカー部分（図３Ａ参照）を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチド配列を濃アンモニアで同時に脱保護及び開裂させた後に、このオリゴヌクレオチド配列の混合物をスピンカラムによるゲル濾過によって精製した。この精製されたオリゴヌクレオチド配列を図３に図式的に示した方法によってポリヌクレオチドにアセンブルした。得られたＤＮＡポリヌクレオチドは９６５ｂｐであり、またＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとＭＩＰ−ＧＦＰ−ＦＬＡＧ融合蛋白質についてのコード配列との両方を含んでいた。この例でアセンブルされたポリヌクレオチドを標準的な転写／翻訳反応で使用し、そしてこのものは適切なＭＩＰ−ＧＦＰ−ＦＬＡＧ融合蛋白質を生成した。翻訳蛋白質を、抗ＦＬＡＧ樹脂（シグマ社）を使用して反応混合物から精製した。この機能性蛋白質は、好適な青色光下で緑色蛍光シグナルを有していた。従って、この例から、本発明の遺伝子アセンブリ方法は、機能性蛋白質をコードする正確なＤＮＡ配列を与えることが立証された。

マイクロアレイ装置の表面又は多孔性マトリックス上の遺伝子アセンブリの概要図である。 マイクロアレイ装置の表面又は多孔性マトリックス上の遺伝子アセンブリの概要図である。 マイクロアレイ装置の表面又は多孔性マトリックス上の遺伝子アセンブリの概要図である。 マイクロアレイ上でその場で合成されるオリゴヌクレオチドであってそれぞれが制限酵素開裂部位を含むフランキング配列領域を有するものを使用し、その後ＰＣＲ増幅工程及びＲＥII制限酵素開裂工程に続く本発明の遺伝子アセンブリ方法の第２の具体例を示す図である。 合成され、次いでマイクロアレイ装置から開裂されるオリゴを使用する遺伝子アセンブリについての概略図である。 合成され、次いでマイクロアレイ装置から開裂されるオリゴを使用する遺伝子アセンブリについての概略図である。 ３種のオリゴヌクレオチドフラグメントであってそのそれぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントがマイクロアレイ装置上でその場で合成されたものからのポリヌクレオチドのアセンブリを示す図である。 図４の１７２ｍｅｒポリヌクレオチドをアセンブルするために使用したオリゴヌクレオチド配列を示す図である。 ＲＥII型酵素であるＭｌｙＩを使用したアセンブリ用の特定オリゴヌクレオチドの調製のために使用したフランキング領域及びプライマーの配列を調製するためのスキームを示す図である。 図６に記載されるようなオリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ及びＭｌｙＩ消化の結果を示す図である。 ２９０ｂｐのポリヌクレオチドをアセンブルさせるために使用した９種のオリゴヌクレオチドフラグメント（通し番号１〜９がふってある）からの配列を示す図である。 ９種のオリゴヌクレオチドからポリヌクレオチドをアセンブリするための概略図である。 構成成分であるオリゴヌクレオチドにまで分解された例４のアセンブルポリヌクレオチドの配列を示す図である。

【配列表】

Claims (34)

1. 次の工程：
   （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面を有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、第１のオリゴヌクレオチド配列が第２のオリゴヌクレオチド配列のある領域と同一又は実質的に同一の約１０〜約５０塩基の重複配列領域を有し、そして該第２のオリゴヌクレオチド配列が第３オリゴヌクレオチド配列との重複領域を有する（以下同様）ものとし（以下、第１オリゴヌクレオチドをオリゴ１、第２オリゴヌクレオチドをオリゴ２（以下同様）とする）、
   （ｂ）該オリゴ１に相補的なプライマー１を伸長させることによって相補オリゴ１を形成させ、
   （ｃ）相補オリゴ１をオリゴ１から解離させ、そして相補オリゴ１をオリゴ１とオリゴ２の該重複領域との両方にアニーリングさせ、ここで、該相補オリゴ１のオリゴ２へのアニーリングが相補オリゴ１＋２を形成させるための伸長用プライマーとしての役割を果たすものとし、
   （ｄ）該工程（ｃ）のプライマー伸長サイクルを全長ポリヌクレオチドが生成されるまで繰り返し、及び
   （ｅ）このアセンブルされた相補全長ポリヌクレオチドを増幅させて所望量の全長ポリヌクレオチドを生成させること
   を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
2. 固体又は多孔性の表面がマイクロアレイ装置の形である、請求項１に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
3. マイクロアレイ装置が、ヌクレオチドの塩基をカップリング及びデカップリングさせるための電気化学的手段を使用してオリゴヌクレオチドをその場で合成させるための複数の電極を有する半導体装置である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
4. プライマー伸長反応を、融解、アニーリング及びその後の伸長の連続方法で実施する、請求項１に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
5. プライマー伸長反応を、複数のオリゴヌクレオチドを結合してなるマイクロアレイを使用して熱循環型ＰＣＲ増幅装置で実施する、請求項４に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
6. 次の工程：
   （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、その配列内に次のオリゴヌクレオチドに相当する重複領域を有し、且つ、２個のフランキング配列であって一方がそれぞれのオリゴヌクレオチドの３'末端にあり他方が５'末端にあるものをさらに含み、この際に、それぞれのフランキング配列は、約７〜約５０塩基であり、且つ、プライマー領域と制限酵素開裂部位を有する配列セグメントとを含むものとし、
   （ｂ）該フランキング配列の該プライマー領域を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させて二重鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドを形成させ、
   （ｃ）該オリゴヌクレオチド配列を該制限酵素開裂部位で開裂させ、及び
   （ｄ）該開裂オリゴヌクレオチド配列を該重複配列を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
   を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
7. フランキング配列が約１０〜約２０塩基の長さである、請求項６に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
8. 制限酵素開裂部位が、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である、請求項６に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
9. II型エンドヌクレアーゼ制限部位が、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する、請求項８に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
10. フランキング配列が、フランキング配列からの開裂オリゴヌクレオチドを精製するために使用される結合部分をさらに含む、請求項６に記載の複数のオリゴヌクレオチド配列からのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
11. 前記方法が、増幅工程（ｂ）中に、結合部分で標識されたプライマー配列を使用してフランキング配列を標識する工程をさらに含む、請求項６に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
12. 結合部分が、アビジン若しくはストレプタビジンによって捕獲されるビオチン又は抗フルオレセイン抗体によって捕獲され得るフルオレセインのような、捕獲され得る小分子である、請求項１１に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
13. 次の工程：
    （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、その配列内に次のオリゴヌクレオチド配列に相当する重複配列を有し、且つ、開裂性リンカー部分を有する配列セグメントをさらに含むものとし、
    （ｂ）該マイクロアレイ又はビードの固体表面からそれぞれのオリゴヌクレオチド複合体を開裂させるように該オリゴヌクレオチド配列を該開裂性リンカー部位で開裂させてそれぞれ重複配列を有するオリゴヌクレオチドの可溶性混合物を形成させ、及び
    （ｃ）該オリゴヌクレオチド配列を該重複領域を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
    を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
14. 開裂性リンカーが、開裂が３'ヒドロキシヌクレオチドを生じさせるようにスクシネート部分をヌクレオチド部分に結合してなる化学組成物である、請求項１３に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
15. 開裂性リンカーが、５'−ジメトキシトリチルチミジン−３'−スクシネート、４−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−３'−スクシネート、１−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−３'−スクシネート、２−Ｎ−イソブチリル−５'−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−３'−スクシネート及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項１４に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
16. 次の工程：
    （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、固体又は多孔性表面に結合した末端にあるフランキング領域と、該ポリヌクレオチド配列を複数の重複オリゴヌクレオチドに切断することによってデザインされる特定領域とを有し、この際に第１のオリゴヌクレオチド上の第１の重複配列が第２のオリゴヌクレオチドの第２の重複配列に相当し、そして該フランキング配列は、対応するＲＥ酵素によって開裂し得る制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）認識配列を有する配列セグメントを含むものとし、
    （ｂ）該フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて対応するＲＥ酵素と相互作用し得る二重鎖配列を形成させ、
    （ｃ）該複数のオリゴヌクレオチドを消化させてこれらのものをマイクロアレイ装置又はビードから溶液に開裂させ、
    （ｄ）該オリゴヌクレオチド混合物を該重複領域を介してアセンブルさせて全長ポリヌクレオチドを形成させること
    を含む、複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
17. フランキング配列が約１０〜約２０塩基の長さである、請求項１６に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
18. 制限酵素開裂部位が、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である、請求項１６に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
19. II型エンドヌクレアーゼ制限部位が、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する、請求項１８に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
20. 前記方法がポリヌクレオチド配列を該ポリヌクレオチドの両末端に位置するプライマーを使用して増幅させる最終工程をさらに含む、請求項１６に記載の複数のオリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチドのアセンブル方法。
21. 次の工程：
    （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は２個のフランキング配列であって一方がそれぞれのオリゴヌクレオチドの３'末端にあり他方が５'末端にあるものをさらに含み、そしてそれぞれのフランキング配列は、約７〜約５０塩基であり、且つ、プライマー領域と制限酵素開裂部位を有する配列セグメントとを含むものとし、
    （ｂ）該フランキング配列の該プライマー領域を使用してそれぞれのオリゴヌクレオチドを増幅させて二重鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドを形成させ、及び
    （ｃ）該二重鎖オリゴヌクレオチド配列を該制限酵素開裂部位で開裂させること
    を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
22. フランキング配列が約１０〜約２０塩基の長さである、請求項２１に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
23. 制限酵素開裂部位が、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である、請求項２１に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
24. II型エンドヌクレアーゼ制限部位が、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する、請求項２３に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列の混合物の作製方法。
25. フランキング配列がフランキング配列からの開裂オリゴヌクレオチドを精製するために使用される結合部分をさらに含む、請求項２１に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
26. 前記方法が、前記増幅工程（ｂ）中に、結合部分で標識されたプライマー配列を使用してフランキング配列を標識する工程をさらに含む、請求項２１に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
27. 結合部分が、アビジン若しくはストレプタビジンによって捕獲され得るビオチン又は抗フルオレセイン抗体によって捕獲され得るフルオレセインのような、捕獲され得る小分子である、請求項２６に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
28. 次の工程：
    （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかもそれぞれのオリゴヌクレオチド配列は開裂性リンカー部分を有する配列セグメントを有するものとし、
    （ｂ）該マイクロアレイ又はビードの固体表面からそれぞれのオリゴヌクレオチド配列を開裂させるように該オリゴヌクレオチド配列を該開裂性リンカー部位で開裂させて可溶性のオリゴヌクレオチド混合物を形成させること
    を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
29. 開裂性リンカーが、開裂が３'ヒドロキシヌクレオチドを生じさせるようにスクシネート部分をヌクレオチド部分に結合してなる化学組成物である、請求項２８に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
30. 開裂性リンカーが、５'−ジメトキシトリチルチミジン−３'−スクシネート、４−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−３'−スクシネート、１−Ｎ−ベンゾイル−５'−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−３'−スクシネート、２−Ｎ−イソブチリル−５'−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−３'−スクシネート及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項２９に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
31. 次の工程：
    （ａ）複数のオリゴヌクレオチド配列を、固体若しくは多孔性の表面をそれぞれ有するマイクロアレイ装置若しくはビード装置上でその場で合成し又はその上にスポットし、ここで、該複数のオリゴヌクレオチド配列は該固体又は多孔性の表面に結合しており、しかも、それぞれのオリゴヌクレオチド配列は、該固体又は多孔性の表面に結合した末端にあるフランキング領域と、特定領域とを有し、そして該フランキング領域は対応する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）酵素によって開裂し得るＲＥ認識配列を有する配列セグメントを含むものとし、
    （ｂ）該フランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせて該対応ＲＥ酵素と相互作用し得る二重鎖配列を形成させ、
    （ｃ）該複数のオリゴヌクレオチドを消化させてこのものをマイクロアレイ装置又はビードから溶液に開裂させること
    を含む、溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
32. フランキング配列が約１０〜約２０塩基の長さである、請求項３１に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
33. 制限酵素開裂部位が、対応するII型エンドヌクレアーゼ制限酵素によって開裂し得るII型エンドヌクレアーゼ制限部位配列である、請求項３１に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。
34. II型エンドヌクレアーゼ制限部位が、ＭｌｙＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ及びそれらの２種以上の組み合わせよりなる群から選択されるII型エンドヌクレアーゼ制限酵素に対する制限部位に相当する、請求項３３に記載の溶液状のオリゴヌクレオチド配列混合物の作製方法。

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