JP2005521419A - ポリヌクレオチド作製のための固相方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの直鎖であって、ここでヌクレオチドは糖、塩基及びリン酸塩から成る。鎖を形成するために、1のヌクレオチドの糖は隣接するヌクレオチドのリン酸塩に結合する。ヒト遺伝子はポリヌクレオチドから形成され、ここで糖はデオキシリボース、そして鎖の各位置の塩基はアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)及びチミン(T)から選ばれる。したがって、ポリヌクレオチド鎖中の連結間の化学的相違は、連結中に存在する塩基のみである。大部分において、遺伝子はそれらの異なる鎖の長さによって、そして鎖に沿った4の塩基の異なる配列によってお互いに異なる。
本発明は、固相ポリヌクレオチド合成において使用されることのできる方法、装置及び組成物を提供する。本発明の技術は以下の:1)支持体上に成長する鎖を固定することは、反応を単純化し(1の末端のみが露出されるので、より少ない副反応が可能となる);2)モル過剰の溶液相成分が反応を推進することができ;そして3)溶液中の副反応が各サイクルにおいて洗い流される;を含む、いくつかの理由によって有利である。固相技術は、遺伝子合成をより信頼性があり、且つより費用効果の高いものとし、したがって、それがより広い範囲の慣用のクローニング研究に取って代わることを可能とする。
本発明は、ポリヌクレオチド合成、より特別には、固相プロセスによるポリヌクレオチド合成を目的とする。本発明を詳細に記載する前に、本発明の概説及び本発明を記載するために使用されるいくつかの用語の説明が提供される。
本明細書において使用されるとおり、「ポリヌクレオチド」及び「遺伝子」、並びにそれらに対応する複数形は、相互に交換可能に使用される。したがって、「遺伝子」という用語は、天然にも見出されるヌクレオチド配列を必ずしも意味せず、この意味を有することができるにもかかわらず、より一般的にはいずれかの塩基配列のポリヌクレオチドを指す。以下においてもっと詳細に検討されるように、本発明は、オリゴを一緒にして結合させるために固相化学を使用し、それによって遺伝子を構築する。最終的な所望の遺伝子が、例えば、2000塩基対を有する場合、本発明の1の側面において、この2000塩基対の遺伝子の二本鎖断片は、オリゴを固相支持体上で構築することによって作製され、そしてこれらの遺伝子断片は最終的な(2000塩基対の)遺伝子を形成するために構築される。後に検討される理由によって、300〜500のオーダーの塩基対を有する遺伝子断片にオリゴを構築し、複数のそれらの遺伝子断片を最終的な遺伝子に構築することが好ましい。明確性のために、直接的なオリゴの固相構築による産物は、本明細書において「遺伝子断片」又は「第1ポリヌクレオチド」と呼ばれるであろう。2以上の「遺伝子断片」又は第1及び第2ポリヌクレオチド等の構築によって作製される産物は、「遺伝子」と呼ばれるであろう。
1.方法の概説
本発明は、以下の3の主要なステップによって、オリゴを構築して遺伝子を形成する。ステップ1は、遺伝子断片を形成するためのオリゴの構築である。繰り返すと、もし、遺伝子断片が所望の長さを有していれば,遺伝子及び遺伝子断片は全く同じである。しかしながら、所望の遺伝子が遺伝子断片よりも多くの塩基対を有していれば、該遺伝子断片を高度に純粋な形態で得るために、第2のステップにおいて該遺伝子断片はクローン化され、配列決定される。第3のステップにおいて、精製された遺伝子断片が最終的な大きなポリヌクレオチドに構築される。
(a)固相支持体に結合した普遍的オリゴを提供すること;
(b)粘着末端を有する開始二本鎖を形成するために、該普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること;
(c)第1中間二本鎖を形成するために、第1オリゴまたは第1二本鎖を粘着末端にアニーリングすること;
(d)第2中間二本鎖を形成するために、第2オリゴ又は第2二本鎖を第1中間二本鎖にアニーリングすること;
(e)最終的な二本鎖を形成するために、必要に応じてステップ(d)を繰り返すこと;及び
(f)普遍的オリゴと架橋オリゴがお互いに或いは他のオリゴ又は二本鎖にライゲーションしない条件下で、最終的な二本鎖のオリゴ及び二本鎖を一緒にライゲーションすること;
を含む、遺伝子構築方法を提供する。
本明細書中で使用されるとおり、「固相支持体」という用語は固相支持体について行われる有機合成の分野の当業者によって理解されるような普通の意味を有する。本発明において有用であるためには、固相支持体は固体、すなわち液体又は気体でない、であって、室温及びpH7において水に不溶である。本発明の固相支持体は水の存在下で安定であり、すなわち、本発明の固相支持体は長期間、例えば24時間、水に露出している間に、その化学的組成及び形態を保持する。本発明において有用な固相支持体は、最初の水への露出によって、膨潤するなどの何らかの変化をおこすが、この最初の変化の後は、固相支持体は水中で安定、すなわち化学的構造に関して不変、である。固相支持体が水中へ置かれる場合、固相支持体の表面は水に溶解された溶質と接触できるようになる。
本発明の構築プロセスは、固体表面に連結されたオリゴヌクレオチドで開始し、ここで、この特別なオリゴヌクレオチドは、本明細書中で普遍的オリゴヌクレオチド又は普遍的オリゴと呼ばれる。普遍的オリゴは、二本鎖ポリヌクレオチド(ds−ポリヌクレオチド)を提供するために、任意に二本鎖形態である追加の(第2、第3など)オリゴとの以下に記載の方法による接触によって伸長される。ds−ポリヌクレオチドの部分はその後、固相支持体から離れて、所望のds−ポリヌクレオチド及び固体表面にまだ結合している普遍的オリゴの両方を提供する。本発明の多くの利点の一つは、出発材料、すなわち固相表面に結合した普遍的オリゴヌクレオチド、がポリヌクレオチド合成の最後において再生成されること、及び追加のポリヌクレオチドを生成するために使用されることができることである。固相支持体に連結したオリゴヌクレオチドは、普遍的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が第1ポリヌクレオチドから独立している、すなわち、普遍的オリゴがいずれの配列の第1ポリヌクレオチドについても「普遍的に」使用されることができるので、本明細書において普遍的オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
普遍的オリゴが直接的に固相支持体に連結することができる一方、本発明の1の実施態様において、連結基が普遍的オリゴと固相支持体の間に位置する。部分的には、連結基は便宜性のために存在する。すなわち、いくつかの固相支持体は、普遍的オリゴ中に容易にそして経済的に存在する反応基と反応しない反応基を有する。この場合、連結基は二機能性であり、固相支持体と普遍的オリゴの両方と反応性である官能基を有する。しかしながら、連結基は、普遍的オリゴがさらに溶液中へ伸長し、そして架橋オリゴと反応することをより可能とさせるという目的も果たす。したがって、本発明の1の側面において、連結基が固相支持体と普遍的オリゴの間に配置される。
図2に図解したように、架橋オリゴは、固相支持体上の普遍的リンカーオリゴと標的遺伝子の1の末端の両方にアニーリングされる。この架橋オリゴはライゲーションには参加せず、したがって弱い変性条件で除去され得る。この方法にはいくつかの利点がある。普遍的オリゴを有する単一の固相支持体は、製造、品質管理及び棚卸しを単純化する。連結の選択的逆行性は、正しい緩衝剤及び温度条件下で、産物である遺伝子又は遺伝子断片の固相支持体からの容易な放出を可能とし、したがって、標的への制限部位配列の付加を避ける。逆行可能な連結の主要な利点は、固相支持体が再使用可能である、つまり、新しい遺伝子の作製が新しい固相支持体を手動で加えるプロセスを含まない、ということである。
第1のステップに先立って、同時に、又はそれに続いて行われる第2のステップにおいて、第1ODNが架橋ODNに接触することが可能となる。これまで検討してきたODNのうちで最初に第1のポリヌクレオチドの部分となるため、第1ODNは、「第1」ODNと呼ばれる。普遍的ODNに対して相補的でなく、したがってハイブリダイズしない架橋ODNの部分に対して、第1ODNは少なくとも部分的に相補的であるため、架橋ODNの一部分にハイブリダイズする。第1ODNが架橋ODNにハイブリダイズする場合、これによって第2ハイブリッドが形成され、ここで、第2ハイブリッドは架橋ODNの第1ヌクレオチド領域にハイブリダイズする普遍的オリゴ、及び架橋ODNの第2ヌクレオチド領域にハイブリダイズする第1ODNを含み、ここで、第1ODNはさらに、普遍的ODN又は架橋ODNのいずれにもハイブリダイズしないヌクレオチド領域を含む。
プロセス中の各ステップの間、所望の産物は精製された形態、すなわち望ましくないODNを含まない形態、であるべきである。例えば、普遍的ODNが固相支持体に連結された後、いずれの非連結(溶液相)普遍的ODNも洗浄除去されることが望ましい。同様に、第1中間ハイブリッドを形成することが望ましい場合、架橋ODNは、好ましくはオリゴヌクレオチド伸長反応を続ける前に、第1ハイブリッドから洗浄除去される。同様に、第2中間ハイブリッドが形成された後は、第2ハイブリッドの部分でない普遍的ODN、架橋ODN又は第1ODNは、好ましくはそれがさらに第2ハイブリッドと接触できないように洗浄除去される。この場合、表面に結合した普遍的ODNに基づいた所望のポリヌクレオチドの収率は、増加の傾向にある。
第1ODNは、第1ODNが架橋ODNにハイブリダイズする時に第2ODNにハイブリダイズされることができるか又はできない。しかしながら、第1ODNに必要な特徴は、それが架橋ODNにハイブリダイズした後でさえ、第2の、部分的に相補的なODNにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列が存在することである。第1ポリヌクレオチド又はその所望の部分を作製するための必要に応じた、第3ODN、及び第4ODNなどについても同様である。すなわち、第1、第2、第3、第4、第5などのODNを含む各ODNは、本発明によって作製された二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖中に存在する2のODNにハイブリダイズする。言い換えれば、第1、第2などの各ODNは、2のODNに部分的にハイブリダイズする。ODN、例えば第2ODN、が2の相補的ODN、例えば第1及び第3ODN、にハイブリダイズされる場合、好ましくは2の相補的ODN、例えば第1及び第3ODN、が両方とも第2ODNにハイブリダイズされる時、これらの相補的ODNの間にヌクレオチドギャップは存在しない。この場合、リガーゼが第1及び第3ODNを一緒にして結合させることができるだろう。言い換えれば、結局、第1、第2、第3などのODNは、第1ポリヌクレオチドに存在する各ヌクレオチド又はその所望の部分を含む。
各ODNが所望の順序でお互いにハイブリダイズされた後は、完全にハイブリダイズされた構築物は、第1、第3、第5などのODNとお互いに共有結合で順番に結合し、第2、第4、第6などのODNとお互いに共有結合で順番に結合するために、ライゲーション条件に露出される。このライゲーション反応後、他のODNとライゲーションされていない唯一のODNが普遍的及び架橋ODNである。
ライゲーション反応が完了後、ライゲーションされた断片が架橋ODNから変性され、架橋ODNが普遍的ODNから変性されるような条件下で、産物が変性条件に露出される。この一連の反応による最終産物は、普遍的ODNに連結された固相支持体、架橋ODN及び第1、第2、第3、第4などのODNからの産物である第1ポリヌクレオチドである。今や、普遍的オリゴは、他の遺伝子又は遺伝子断片を作製するために使用されることができる。
1.遺伝子断片の構築
本発明の1の側面において、オリゴを一緒にしてライゲーションすることによって作製されたポリヌクレオチドは、最終的な所望のポリヌクレオチド(遺伝子)の断片である。一緒にしてライゲーションされるオリゴの数が増加するにしたがって、特別なポリヌクレオチドが所望の配列を有する可能性は低下する。これは、オリゴが100%純粋でないということに大きく依存する。したがって、約800を超える塩基対を有する所望のポリヌクレオチドを作製するための本発明の好ましい側面において、2以上の遺伝子断片が本明細書に記載の固相合成法を使用して作製され、そしてこれらの2の遺伝子断片は、最終的な所望のポリヌクレオチドを作り出すために、好ましくはライゲーション条件下で一緒に結合される。
(a)少なくとも50塩基対を有する第1遺伝子断片を、固相支持体上で構築すること;
(b)第1断片を溶液中に提供するために、上記第1断片を固相支持体から分離すること;
(c)少なくとも50塩基対を有し、上記第1断片と同一でない、第2遺伝子断片を固相支持体上で構築すること;
(d)最終的な遺伝子を提供するために、上記第1断片を、表面結合第2遺伝子断片と結合させること;そして
(e)上記(d)の遺伝子を固相支持体から分離すること;
を含む、固相支持体上での遺伝子又はその部分の構築方法を提供する。
(a)少なくとも50塩基対を有する、第1遺伝子断片を、固相支持体上で構築すること;
(b)第1断片を溶液中に提供するために、上記第1断片を固相支持体から分離すること;
(c)少なくとも50塩基対を有し、上記第1断片と同一でない、第2遺伝子断片を固相支持体上で構築すること;
(d)第2遺伝子断片を溶液中に提供するために、上記第2断片を固相支持体から分離すること。
(e)第3遺伝子断片を固相支持体上で構築すること;
(f)より長い遺伝子断片を提供するために、上記固相結合第3遺伝子断片に上記第1断片を結合させ、そして最終的な遺伝子を提供するために、上記より長い遺伝子断片に上記第2遺伝子断片を結合させること;そして
(g)上記最終的な遺伝子を上記固相支持体から分離すること;
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも50塩基対を有する、第1遺伝子断片を、固相支持体上で構築すること;
(b)第1断片を溶液中に提供するために、上記第1断片を固相支持体から分離すること;
(c)少なくとも50塩基対を有し、上記第1断片と同一でない、第2遺伝子断片を固相支持体上で構築すること;
(d)第2遺伝子断片を溶液中に提供するために、上記第2断片を固相支持体から分離すること。
(e)上記第1断片及び上記第2断片を単一の溶液中で併合すること;そして
(f)最終的な遺伝子を溶液中で提供するために、ステップ(e)の上記第1及び第2断片を共有結合で結合させること;
を含む、最終的な遺伝子を溶液中で構築するための方法を提供する。
1.固相支持体+連結基+普遍的オリゴ
本発明の別の側面においては、固相支持体、ポリヌクレオチド(例えば、先に記載の普遍的オリゴ)、及び支持体とポリヌクレオチドの間に配置される連結基を含む物品が提供される。連結基は、固相支持体及びポリヌクレオチドの両方に共有結合で結合し、したがって、本発明のこの側面は、式SS)−L−PN、ここで、「SS)」は固相支持体、「L」は連結基、そして「PN」はポリヌクレオチドを表す、によって表されることのできる物品を提供する。PNの5’末端は、直接的にLに結合することができ、この場合、上記物品は式SS)−L−PN(5’)によって表されることができ、又はPNの3’末端は直接的にLに結合されることができ、この場合には上記物品は式SS)−L−PN(3’)によって表されることができ、これらは本発明の2の別々の側面である。
他の側面において、本発明は上記の物品(すなわち、式SS)−L−PNの物品)を提供し、これは架橋オリゴにアニーリングされる。架橋オリゴは、「P」基中に存在するいくつかの又はすべてのヌクレオチドにアニーリングされる、リンカーポリヌクレオチド領域を含む。好ましくは、リンカーポリヌクレオチド領域は、5〜50の近接するヌクレオチドから成る。架橋オリゴはさらに、5〜50の近接するヌクレオチドから成る、架橋ポリヌクレオチド領域を含み、ここで、架橋ポリヌクレオチド領域は、PNのポリヌクレオチド基にアニーリングしない。PNとアニーリングされた形態の架橋オリゴは、本明細書中で最初の、又は開始二本鎖と呼ばれ、この開始二本鎖は本発明の1の側面である。1の側面において、上記物品は式SS)−L−PN(3’)によって表され、PNにアニーリングする架橋オリゴは架橋オリゴの3’末端のリン酸基を欠く。
他の側面において、架橋ODNの架橋ポリヌクレオチド領域は、第1オリゴ(A)又は第1二本鎖(A+B)にアニーリングされ、便宜のためにこの論議は第1二本鎖に関する。この状況は図3に例解され、ここで、太線は固相支持体、そして、細線及び破線は、それぞれポリヌクレオチドを表す。
他の側面において、本発明は、上記の物品を利用するポリヌクレオチド構築方法を提供する。すなわち、本発明は、以下のステップ:
(a)上記固相支持体、上記連結基、上記普遍的オリゴ及び上記架橋オリゴを含む,上記の物品を提供すること;
(b)(a)の物品にオリゴ又は二本鎖をアニーリングすること;そして
(c)2以上のオリゴを一緒にして結合させ、第1標的オリゴヌクレオチドを形成するために、リガーゼを使用すること;
を含む、ポリヌクレオチド合成法を提供する。
(d)上記普遍的オリゴから上記架橋オリゴを分離すること;
を含む。
1の側面において、本発明は、溶液中のポリヌクレオチドを固相支持体に結合したポリヌクレオチドにアニーリングするために、(そのどちらかは部分的に二本鎖形態である)支持体に結合したポリヌクレオチドと溶液中のポリヌクレオチドとを接触させる方法を提供する。支持体に結合したポリヌクレオチドが、好ましくは先に記載した本発明の側面により普遍的オリゴと架橋オリゴを組み込んでいる一方、本発明のこの側面においては、支持体に結合したポリヌクレオチドはこの特別な構成を有する必要はない。言い換えれば、溶液中のポリヌクレオチドを固相支持体に結合したポリヌクレオチドにアニーリングするために、固相支持体に結合したポリヌクレオチドと溶液中のポリヌクレオチドを接触させるこの方法は、一般的には、いずれの支持体に結合したポリヌクレオチドにも適用可能である。
(a)固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸(ds‐NA)を提供すること;
(b)上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸(ss-NA)の溶液を提供すること;
(c)(i)ss-NAがds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、そして(ii)ステップ(b)の溶液の少なくともいくらかがds-NAを少なくとも2回通過するように、その方向が少なくとも1回逆にされる、ような方向に現される力の影響下において、該溶液の少なくともいくらかがds-NAを通過するという条件下で、ステップ(a)のds-NAとステップ(b)の溶液を接触させること;
を含む、遺伝子構築法を提供する。
(a)固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸(ds‐NA)を提供すること;
(b)上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸(ss-NA)の溶液を提供すること;
(c)(i)ss-NAがds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、そして(ii)その他は一定の条件下で、力の減少が、ds-NAの一本鎖部分にアニーリングするss-NAの量を減少させる、ような力の影響下において、ステップ(b)の溶液の少なくともいくらかがds-NAを通過するという条件下で、ステップ(a)のds-NAとステップ(b)の溶液を接触させること;
を含む、遺伝子構築法を提供する。
固相遺伝子合成プロセスにおける以下の2の重要なステップ:
(1) 固相支持体結合能;および
(2) 固相のライゲーション効率の推定;
を定量化するために、2のアッセイ法が使用されることができる。これらのアッセイは以下に記載される。
この遺伝子構築において使用される固相支持体は、好ましくは約17のヌクレオチドを有する普遍的リンカーオリゴヌクレオチドに共有結合で結合されている。固相支持体表面の結合能は、以下の蛍光に基づくアッセイによって決定される。リンカーオリゴを伴う固相支持体は、最初に蛍光標識された相補的オリゴとハイブリダイズされる。ハイブリダイズしない標識オリゴは、過剰の洗浄によって除去され、洗浄液は蛍光によってモニターされる。ハイブリダイズした標識オリゴは、その後、高温での変性によって放出され、その量を蛍光光度計によって測定される。固相支持体は、典型的には、表面上で約1〜3ピコモル/cm2の結合能を有する。
他の固相を基礎とする反応のように、固相上での酵素的ライゲーションは、液体を基礎とする反応よりも効率が低く、且つ遅い(V. Chan, D. Graves, P. Fortina and S. Mckenzie, Langmuir, (1997) vol. 13, 320-329; M. Shchepinov, S. Case-Green and E. Southern, Nucleic Acid Research, (1997) vol. 25, 1155-1161; H. Hakala, E. Maki and H. Lonnberg, Bioconjugation Chem. Research, (1999) vol. 27, 1719-1727)。試薬の1つの拡散による損失及び増加した立体障害は、反応位置近傍における試薬濃度を大いに減少させる。さらに、固相ライゲーション効率はまた、DNA鎖全体の長さにも依存する。したがって、DNAが短い場合、構築の初期段階におけるライゲーション効率は、DNAが長くなった時の構築のより後の段階におけるライゲーション効率に相当しないかも知れない。
・ リガーゼ濃度
・ ライゲーション時間及び温度
・ 溶液中の標的濃度
・ オリゴ二本鎖のオーバーハング長
・ 固相支持体材料
・ 伸長する末端と固相表面の間の距離
・ 緩衝液中のイオン強度
・ インキュベーション中の混合
1.概説
多様な側面において本発明は、自動化された遺伝子合成を提供する装置を含む、遺伝子合成のための装置並びにこれらの装置の遺伝子合成における使用方法を提供する。1の側面において、本発明は以下の:
i)複数の反応チャンバーであって、上記複数のそれぞれが以下の:
(a)多孔質の領域を含む、チャンバー内に位置し且つチャンバー内に広がる固相支
持体;
(b)第1及び第2オリフィスであって、第1オリフィスから第2オリフィスへの直
線が固相支持体の横を通るか又は貫通するように位置する、第1及び第2オリフィス;
(c)上記第1オリフィスと上記第2オリフィスとの間に位置するチャンバーの第1
容積;及び
(d)上記第2オリフィスと固相支持体との間に位置するチャンバーの第2容積;
を含む、固相遺伝子構築のための装置を提供する。
i)以下の:
(a)第1オリゴヌクレオチドに結合され、チャンバー内に位置する固相支持体;及
び
(b)第1オリフィスから第2オリフィスへの直線が固相支持体の横を通るか又は貫通するように位置する、第1オリフィス及び第2オリフィス;
を含む、反応チャンバーを提供すること;
ii)第1オリフィスを通って第2オリゴヌクレオチドの溶液を送達し、第2オリフィスの方向にある固相支持体の横を通って又はこれを貫通して第2オリゴヌクレオチドの溶液を輸送すること;
iii)第2オリゴヌクレオチドの溶液を繰り返し又は連続的に、固相支持体の横を通らせるか又はこれを貫通させること;
を含む、上記固相遺伝子構築法を提供する。
1の側面において、本発明の遺伝子合成は、複数の反応チャンバー内で実施される。この複数のそれぞれは、そこへオリゴヌクレオチドが結合する内部固相表面を有する。図5A、5B、5C,5D及び5Eは、5つの固相表面の構成を例示する。図5Aにおいては、固相表面は、チャンバーの内壁から伸びる繊維である。図5Bにおいては、固相表面は、チャンバーの内壁に隣接する縁である。図5Cにおいては、固相表面は、チャンバーを効果的に第1及び第2副チャンバーに分割する、チャンバーの幅にわたる多孔質の栓である。図5Dにおいては、チャンバーの幅にわたる2の堅い多孔質の障壁が、障壁間に位置する、ビーズで満たされた空間を定義する。ビーズは、オリゴヌクレオチドが結合する固相支持体である。図5Eにおいては、固相支持体は、反応器中に吊り下げられたブラシであり、該ブラシはモーターの操作によって、溶液中を回転することができる。他の表面構成は代替的に利用されることができる。
各反応チャンバーは、ポンプと流体連絡している。同じポンプが、複数の反応チャンバーのすべて又は一部分と流体連絡している。1の側面において、単一のポンプが複数の反応チャンバーのすべてと流体連絡している。この側面は、複数のポンプを購入し、保持するのにかかる出費を減少させるという利点を有する。他の側面においては、各反応チャンバーが、別々の特有のポンプと流体連絡している。この側面は、操作の最大のフレキシビリティー、すなわち各反応チャンバーが個別に制御されることができ、そしてすべての反応チャンバーが同じ操作条件におかれる必要がない、という理由によって有利である。各反応チャンバーを特有のポンプと流体連絡の関係におくことも、1の反応チャンバーにおける機能不全が他の反応チャンバーの操作にわずか影響しか与えないか、又は影響しないという理由で、有利である。各反応チャンバーに存在する2の孔のひとつはポンプと流体連絡している。
1の側面において、遺伝子構築システムは、以下の:1)各カラムに対する個別の温度制御を伴なう、マルチ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、など)カラムシステムを含む。他の側面においては、遺伝子構築システムは、ブロック全体にわたる均一の温度制御を伴なう、マルチカラムシステムを含む。固相構築ステーションの中心要素は、カラムに基づく固相反応器カートリッジ(図10B)である。この型の構築ステーションは、この目的のために商業的製作者によって製造されることができる。カラムは、不活性で、滅菌可能であり、且つ適切な熱伝導特性を有し、DNA吸着性の低い、成形可能なプラスチックから作られることができる。成形された部分は好ましくは、カラムが反応ブロック中へ摩擦による適合で正しい位置に保持され、今度は固相フリットがカラム中へ摩擦による適合で正しい位置に保持されるように、寸法的に安定である。各カラムの一番上には好ましくは、容易に試薬の送達及び混合ユニットの管に連結しそして外れる結合連結部を有する。各反応器は好ましくは、小容量の試薬を採取するために、標準的な96ウエルプレートの底に届くことのできる先細りのチップを有する。反応カラムの容量は好ましくは、固相支持体のバルク容量の約3倍である。複数の反応容器を保持する反応ブロックは、上流及び下流の自動化を容易にするために、好ましくは96ウエルプレートのフォーマットに適合するやり方で反応容器を配置する。反応ブロックは好ましくは、温度制御(例えば、+/−1℃又は+/−2℃、毎分10℃の昇降温速度)を含む。反応の模式的ダイアグラム、及び反応のブロックが図10Bに示される。
反応ブロックは、+/−1℃の精度の室温〜100℃の加熱能を有する。温度制御ユニットは、好ましくはコンピュータプロセス制御へのインターフェースによってプログラム可能である。反応ブロック及び温度制御ユニットは、J-KEM Scientific (St. Louis, MO)のような、多数の製作者のうちのいずれによっても製造されることができる。
本発明の1の側面において、マルチプレート貯蔵システム及び自動的プレート輸送システムが設計全体の中へ取り入れられる。装置のこの部品は、オリゴ供給物を貯蔵し、そして固相アニーリング反応の各サイクルへ送達する役割を果たす。48の400塩基対遺伝子断片の構築は、約10のアニーリングサイクルを含む。これらのサイクルのためのオリゴは、10のマイクロタイタープレート中において供給されることができる。バッチサイクル全体が一回で約2日間で終了するため、オリゴは顕著な蒸発及び変性をすることなく、待機モードに保たれなくてはならない。一つの解決法は、プレート輸送のための自動化アームに連結された、温度及び湿度の制御された貯蔵ユニットである。そのような装置は、最近、多様な販売者を通じて入手可能である。
プロセスの質管理プロトコールは、望ましくは各重要ステップに含まれる。固相結合能及びライゲーション効率のアッセイは、本明細書中ですでに記載された。最終的な溶出された遺伝子断片は、ゲル電気泳動によって立証されることができる。
1の側面において、本発明は、固相遺伝子プロセスを用いた自動的遺伝子構築を目的とする。この構築は図11に例解されたようないくつかの重要なモジュールを含む。固相遺伝子構築ステーションは、反応ブロック、温度制御システム、液体操作及び混合ユニット並びにマイクロタイタープレートの貯蔵及び管理システムを含む。反応ブロックモジュールは、個別の反応カラムを保持し、各反応サイクルの温度を維持する。マルチプレート管理システムは、400塩基対の遺伝子断片の構築に含まれるすべてのサイクルのためのオリゴ供給物を保管し、管理する。試薬送達及び混合ユニットは、オリゴ及び緩衝液の、添加及び除去並びに反応周期の間の混合を制御する。
微粒子固相支持体上での310塩基対遺伝子の構築
樹脂の酸処理
アミノメチル化ポリスチレン樹脂(3グラム、直径100ミクロン以下、Aldrich)を、ガラスシンチレーションバイアル中で4mlの濃塩酸(HCl)及び12mlの水と混合した。樹脂を室温で酸性の溶液に1.5時間攪拌した。酸処理した樹脂を、濾液のpHが5〜6に達するまで水で洗浄した。この手順を、酸処理条件として、濃HClの代わりに酢酸、水の代わりにジメチルホルムアミド(DMF)を用いて、アミノメチル化ポリスチレン樹脂の第2のバッチについて繰り返した。酸処理したアミノメチル化ポリスチレン樹脂のバッチを湿った固体として、4℃で貯蔵した。
(上記のパートAで調製したように)濃HClで処理し、水で洗浄したアミノポリスチレン樹脂を以下の記載のように、リンカーオリゴに共有結合させた。以下の構造式:
mは1〜50の範囲内の整数から選ばれ;
nは1〜20の範囲内の整数から選ばれ;そして、
pは0及び1〜10の範囲内の整数から選ばれる。}
により例示されるように、リンカーオリゴは、17ヌクレオチド塩基、スペーサー群、及びその5’末端に一級アミン基を含むオリゴヌクレオチド部分を含有する。
固相支持体を100マイクロリッターの0.5Mホウ酸塩、500マイクロリッターの1−メチル−2−ピロリジノン(NMP、Aldrich Chemicals)及び500マイクロリッターの無水酢酸(Fisher Scientific)と、室温で1.5時間混合することによって、アミノメチル化ポリスチレン樹脂上の未処理−NH2基を無水酢酸でキャッピングした。液体を固体から濾過によって除去し、その後、固相支持体を2mlの1−メチル−2−ピロリジノン/水(50/50 v/v)で3回、2mlの1mMEDTAで3回、2mlの10mMトリス/1mMEDTA/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム溶液で3回、そして最後に2mlの10mMトリス/2mMEDTAで3回洗浄した。各洗浄ステップは、洗浄溶液を固相支持体と接触させること、そして混合物の攪拌後、液体を固体から濾過によって除去することから成るものであった。樹脂を4℃で貯蔵した。
分子ビーコン技術は、溶液相オリゴヌクレオチド(すなわち、溶液中に溶解されたオリゴヌクレオチド)中の特異的なヌクレオチド配列を検出する感度の高い方法として周知である。本発明によれば、我々は固相支持体上に固定されたリンカーオリゴヌクレオチド量の直接的アッセイに、分子ビーコン技術をうまく適用した。この方法は、他の溶液に基づいた決定法に一般的に使用されるアッセイ技術を採用した場合に起こる、固相支持体のリンカーオリゴ含量の過大評価を防ぐ。
図12Aに例解するように、両方の3’末端にCTTTC配列を有する310塩基対の標的ポリヌクレオチド(遺伝子)のヌクレオチド配列を得た。この遺伝子は、概念的には、AからUの文字が特別なオリゴの名前を提供し、(例えば、30、33、35などの)数字が特別なオリゴ中に存在するヌクレオチド数を表す、図12Bにおいて定義された、短いオリゴヌクレオチド配列(オリゴ)のファミリーに分類される。図12Bに示すように、遺伝子内部のオリゴはそれぞれ33〜35の塩基から成る一方、遺伝子末端付近のオリゴ(オリゴK及びU)は、いくらか短かった。オリゴ間の中断は、各内部オリゴが、相補鎖中の15〜17ヌクレオチドの長さにわたる、2の部分的に相補的なオリゴと重複するように設計された。遺伝子末端を形成するオリゴは、それらの相補的オリゴと、15〜16ヌクレオチドの長さにわたって重複するように設計された。これらのオリゴの設計後、それらを標準的な固相技術によって合成した。
組に対する要素が2又は3のいずれかである、相補的オリゴの組を併合し、アニーリングさせて、二本鎖のハイブリッドを形成した。図12E及び12Fにおいて、特別な組を示し、「0A」、「1A」などの用語によって同定した。オリゴを相互にアニーリングさせるアニーリングプロセスは、相当するオリゴを1×SSPE緩衝液中、65℃、15分間併合することを必要とした。2の架橋オリゴ「L」及び「R」は、一本鎖オリゴとして固相支持体にアニーリングすることができるか、又はそれらの隣接するオリゴ二本鎖「3A」及び「4A」にそれぞれアニーリングして、固相支持体に結合する前に三量体を形成することができる。遺伝子末端のそれらの短いオリゴのために、二本鎖の三量体を作製した。同定の容易のために、図12E及び12Fに示すように、組のそれぞれに連続する名前を与えた。
トリス‐HCl、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、25μg/mlBSA,pH7.5)で二回洗浄し100マイクロリッターの1×ライゲーション緩衝液(50mM トリス‐HCl、10mM MgCl2、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mMATP、25μg/mlBSA、pH7.5)で1回洗浄した。50マイクロリッターの1×ライゲーション緩衝液及び800粘着末端ユニットT4DNAリガーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA, USA; @neb.com)をカートリッジに添加し、カートリッジを室温で3時間、穏やかに振とうすることによって、ライゲーション反応を実施した。そして、固相支持体を0.4mlの冷蔵した2×SSPEで3回洗浄した。
多孔質ポリエチレン支持体上での240塩基対遺伝子の構築
カルボジイミドによる、ポリエチレンフリットへのリンカーオリゴの結合
直径9mm及び厚さ1.5mmで、7及び20ミクロンの孔サイズを有する、ポリエチレンフリットをOrchem Technologies (Westmont, IL, USA; @orochem.com)から購入した。一級アミン基を、4thState Inc(Belmont, CA, USA; @4thstate com)によって実施したプラズマプロセスによってPEフリットの表面上に導入した。フリットを含む、続くすべての反応及びプロセスを、図12Gに示したように、ポリプロピレンカートリッジ(これもOrchem Technologiesから購入した)中で実施した。容器の壁との摩擦によって、フリットを正しい位置に保持した。
オリゴヌクレオチドにアニーリングするフリットの能力を決定するために、以下のアッセイを行った。リンカーオリゴヌクレオチドに結合したポリエチレンフリットを、リンカーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドの溶液と併合する。その後、過剰の(ハイブリダイズしない)相補的オリゴを除去するために、フリットを洗浄した。そして、ハイブリダイズした相補的オリゴを溶出した条件にフリットを露出し、溶出された溶液からの蛍光シグナルを測定した。
図13Aに例解されるように、標的遺伝子は、1の末端上の5塩基オーバーハング及び他の末端上の17塩基オーバーハングを含む240塩基対を有する。
PEGスペーサーを伴なうか又は伴なわない固相支持体上での固相遺伝子構築の比較
アミノメチル化ポリスチレン樹脂の別のバッチを2の異なるリンカーオリゴに結合させた。1のリンカーオリゴはPEGスペーサー(n=24)を末端アミン基とオリゴヌクレオチドの間に含む。(17塩基のオリゴヌクレオチド−PEG(n=24)−NH2)他のリンカーオリゴは、いずれのスペーサーも含まず、カルボン酸末端を有する(17塩基のオリゴヌクレオチド−COOH)。両方のオリゴをTrilinkから得た。実施例1に記載の方法を使用して、PEGスペーサーを有するオリゴをポリスチレン支持体に結合させた。スペーサーを有さないリンカーオリゴを同じポリスチレン支持体の別のバッチに結合させ、次に記載するカルボジイミド法を用いてポリエチレンフリットにも結合させた。
実施例1に記載のアプローチに類似して、標的遺伝子を、それぞれ30〜33ヌクレオチド塩基を有する一連のオリゴに「切断」した。より短い22塩基の配列を、一番下の鎖の末端においた。各内部オリゴは、2の相補的オリゴと15〜18ヌクレオチド塩基にわたって重複した。図14Aに示すように、一番上の鎖の中の第1オリゴは、その5’末端において蛍光団FAM(三重丸)で標識されている。アスタリスクでマークした架橋オリゴを遺伝子の左端に付加した。架橋オリゴは、5’末端にリン酸を有さないので、遺伝子のライゲーションには加わらない。また、架橋オリゴも3’末端において蛍光標識する。
オーバーハングの異なる大きさの比較
PEG(n=6)スペーサーを含むリンカーオリゴと結合したポリスチレン球固相支持体をこの実施例に使用した。結合方法は、実施例1に記載されたものと同じであった。固相支持体は、1ピコモル/μl充填樹脂のハイブリダイゼーション能を有した。
2の異なる組のオリゴヌクレオチドから構築するために、134塩基対の標的遺伝子を設計した。1の組は、15〜18塩基の範囲の長いオーバーハングを有した(図15Aを参照のこと)。他の組は、4塩基のみの短いオーバーハングを有した(図15Bを参照のこと)。各組において、第1の一番上の鎖は、5’末端に蛍光団(FAM、三重丸)を有し、架橋オリゴは3’末端にFAM団を有した。
一番上の鎖のオリゴヌクレオチドすべてを、離れた相補的な一番下の鎖のオリゴヌクレオチドに、1×SSPE緩衝液中で65℃、15分間アニーリングして二量体を形成した。架橋オリゴを第1二量体にアニーリングして三量体を形成した。得られた断片を、図15Cにおいて同定した。
一番上の鎖のオリゴヌクレオチドすべてを、1の相補的な一番下の鎖のオリゴヌクレオチドに、1×SSPE緩衝液中で65℃、15分間アニーリングして二量体を形成した。架橋オリゴを第1三量体にアニーリングして四量体を形成した。得られた断片を、図15Dにおいて同定した。
DNA断片の大きさを立証するために、ゲル分析を行った。8%のネイティブアクリルアミドゲルを1×TBE泳動緩衝液(89mM トリス、89mMホウ酸及び2mMEDTA、pH7.6)とともに使用した。6〜7マイクロリッターの各断片を、3マイクロリッターの泳動用色素(Gesura Type II 6X)及び40%ショ糖の混合物(1/1 v/v)と混合した。ゲルを一定の150ボルトで泳動し、SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, OR, USA; @probes.com)で後染色した。結果を図15Eに示す。図15Eにおいて、レーン1及び2は、17塩基オーバーハングの構築産物を示す。レーン3及び7は、20塩基対マーカーである。レーン4〜6は、2Aのライゲーション後(レーン4を参照)、3Aのライゲーション後(レーン5を参照)、及び4Aのライゲーション後(レーン6を参照)の4塩基対オーバーハングの構築産物を示す。
一般的なリンカーオリゴと結合した固相支持体の再使用
本発明中に記載された一般的なリンカーオリゴヌクレオチドは、一般的に再使用可能である。1の遺伝子を構築し、固相支持体から溶出した後、支持体はミリポア水及びそして2×SSPEで洗浄することができ、精製水中、4℃で貯蔵することができる。支持体は、他の遺伝子を構築するために、再度使用することができる。そのようなプロセスは複数回繰り返すことができる。
多孔質ポリエチレン支持体上での425塩基対遺伝子の構築
カルボジイミドによる、ポリエチレンフリットへのリンカーオリゴの結合
直径9mm及び厚さ1.5mmで、7及び20ミクロンの孔サイズを有する、ポリエチレンフリットをOrchem Technologies (Westmont, IL)から購入した。一級アミン基を、4thState IncによるプラズマプロセスによってPEフリットの表面上に導入した。フリットを含む、続くすべての反応及びプロセスを、図12Gに示したように、ポリプロピレンカートリッジ(これもOrchem Technologiesから購入した)中で実施した。試薬及び緩衝液をカートリッジの一番上からフリットに送達し、液体をシリンジによるポンプ作用で上下させることによってフリットの孔を通して混合し、空のシリンジによってフリットから除去した。反応の間、カートリッジの底の開口に栓をする。
実施例1に記載のプロセスに類似して、リンカーオリゴヌクレオチドと結合したポリエチレンフリットを、蛍光標識した相補的なヌクレオチドとアニーリングし、過剰の相補的オリゴを除去するために、フリットを洗浄し、ハイブリダイズした相補的オリゴを溶出し、そして溶出された溶液からの蛍光を測定した。アニーリング反応を2×SSPE中で室温において2時間行った。洗浄を2×SSPEで行い、洗浄が完了したことを蛍光によってモニターした。1mlの50℃Millipore水で、ハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドをフリットから3回溶出した。95%を超える蛍光シグナルを最初の溶出から得た。既知量の標識相補的オリゴ溶液の検量線との比較は、7μm孔のフリットのハイブリダイゼーション能が170ピコモル/フリットであり、20μm孔のフリットのハイブリダイゼーション能が175ピコモル/フリットであると決定した。
一般的に図17Aに例解されるように、標的遺伝子は、両方の5’末端上の17塩基オーバーハングを含む425塩基対を有する。
新しいプロトコールを使用した、1KB遺伝子断片の合成
我々が構築したモデル遺伝子は、1199塩基対の大腸菌(E. coli)Lacリプレッサー遺伝子(Lacl)である。このモデル遺伝子の構築を図18のフローチャートに示す。それぞれが約400塩基対である、3の中間遺伝子断片を固相支持体上で作製した。最終的な1.2kbの遺伝子を、溶液に基づく技術を使用して構築した。オリゴは、商業的なオリゴ合成装置上で独自に合成した。
Claims (57)
- 遺伝子構築方法であって、以下のステップ:
(a)固相支持体に結合した普遍的オリゴを提供すること;
(b)粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、上記普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること;
(c)第1中間二本鎖を形成するために、第1オリゴ又は第1二本鎖を、上記架橋オリゴにアニーリングすること;
(d)第2中間二本鎖を形成するために、第2オリゴ又は第2二本鎖を、上記第1中間二本鎖にアニーリングすること;
(e)最終的な二本鎖を形成するために、必要に応じてステップ(d)を繰り返すこと;及び
(f)上記普遍的オリゴがライゲーション反応を行わず、且つ上記架橋オリゴが上記第1オリゴ又は第1二本鎖のいずれともライゲーションされない条件下で、最終的な二本鎖のオリゴと二本鎖を一緒にしてライゲーションすること;
を含む、前記方法。 - ステップ(a)による上記固相支持体に結合した上記普遍的オリゴを提供し、そしてステップ(b)〜(f)を繰り返すために、上記普遍的オリゴが上記架橋オリゴから分離される、請求項1に記載の方法。
- 上記普遍的オリゴが連結基を介して上記固相支持体に結合される、請求項1に記載の方法。
- 上記連結基が、ポリ(オキシアルキレン)部分を含む、請求項3に記載の方法。
- 上記連結基がリン酸基を含む、請求項3に記載の方法。
- 上記普遍的オリゴが5〜50ヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
- 上記普遍的オリゴが3‘末端 及び5’末端を有し、上記普遍的オリゴの上記5‘末端が連結基に結合され、ここで、上記連結基が上記固相支持体に結合されている、請求項1に記載の方法。
- 上記架橋オリゴが、リンカー配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記リンカー配列が上記開始二本鎖中の上記普遍的オリゴのいくつか又は全部にアニーリングする、請求項1に記載の方法。
- 上記リンカー配列が5〜50ヌクレオチドを有する、請求項8に記載の方法。
- 上記架橋オリゴが、標的配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記標的配列が上記第1オリゴ又は上記第1二本鎖の粘着末端にアニーリングする、請求項1に記載の方法。
- 上記架橋オリゴが5‘末端及び3’末端を有し、且つ上記5‘末端がリン酸基を欠いている、請求項1に記載の方法。
- 上記第1中間二本鎖が、上記普遍的オリゴと上記第1オリゴ又は第1二本鎖の間に位置するヌクレオチドギャップを含む、請求項1に記載の方法。
- 上記ヌクレオチドギャップが、1〜5ヌクレオチドの長さである、請求項12に記載の方法。
- 以下の:
(a)固相支持体に結合した普遍的オリゴ;及び
(b)粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、上記普遍的オリゴにアニーリングされた、架橋オリゴ
を含む、組成物。 - さらに、以下の:
(c)第1中間二本鎖を形成するために、上記架橋オリゴにアニーリングされた、第1オリゴ又は第1二本鎖;
を含む、請求項14に記載の組成物。 - さらに、以下の:
(d)第2中間二本鎖を形成するために、上記第1中間二本鎖にアニーリングされた、第2オリゴ又は第2二本鎖;
を含む、請求項15に記載の組成物。 - さらに、以下の:
(e)第3中間二本鎖を形成するために、上記第2中間二本鎖にアニーリングされた、第3オリゴ又は第3二本鎖;
を含む、請求項16に記載の組成物。 - さらに、リガーゼを含む、請求項17に記載の組成物。
- 中間二本鎖のライゲーション条件への露出が、上記普遍的オリゴ又は上記架橋オリゴにライゲーション反応を行なわせることを引き起こさない、請求項15〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記普遍的オリゴが、連結基を介して上記固相支持体に結合される、請求項14〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記連結基がポリ(オキシアルキレン)部分をふくむ 、請求項20に記載の組成物。
- 上記普遍的オリゴが5〜50ヌクレオチドを有する、請求項14〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記普遍的オリゴが3‘末端及び5’末端を有し、且つ上記普遍的オリゴの上記5‘末端が連結基に結合されており、ここで、上記連結基が上記固相支持体に結合される、請求項14〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記架橋オリゴが、リンカー配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記リンカー配列が上記開始二本鎖中の普遍的オリゴにアニーリングされる、請求項14〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記リンカー配列が5〜50ヌクレオチドを有する、請求項24に記載の組成物。
- 上記架橋オリゴが、標的配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記標的配列が上記第1オリゴ又は第1二本鎖にアニーリングする、請求項15〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記第1中間二本鎖中の、上記普遍的オリゴと上記第1オリゴ又は第1二本鎖の間に、ヌクレオチドギャップが存在する、請求項15〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記ヌクレオチドギャップが1〜5ヌクレオチドの長さである、請求項27に記載の組成物。
- 普遍的オリゴに結合された固相支持体を含む物品であって、1以上のリン酸基及びポリオキシアルキレン基が、上記固相支持体と上記普遍的オリゴの末端ヌクレオチドの間に位置する、上記物品。
- 上記固相支持体が多孔質のモノリスである、請求項29に記載の物品。
- 上記固相支持体がビーズ及び繊維から選ばれる、請求項29に記載の物品。
- 上記固相支持体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート及びポリメタクリレートから選ばれる有機ポリマーを含む、請求項29に記載の物品。
- 上記固相支持体が金属酸化物を含む、請求項29に記載の物品。
- 上記ポリオキシアルキレン基がポリオキシエチレン基である、請求項29に記載の物品。
- リン酸基によって分離された2のポリオキシアルキレン基を含む、請求項29に記載の物品。
- 上記普遍的オリゴが、5〜50ヌクレオチドから成る、請求項29に記載の物品。
- さらに、架橋オリゴを含み、ここで、上記架橋オリゴが、上記普遍的オリゴの5以上のヌクレオチドにアニーリングされているリンカーポリヌクレオチド領域を含む、請求項29に記載の物品。
- 遺伝子構築方法であって、以下のステップ;
(a)請求項29〜36のいずれか1項に記載の物品を提供すること;
(b)上記普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること;及び
(c)2以上のオリゴヌクレオチドを一緒にして結合し、そして標的ポリヌクレオチド又はその断片を形成するために、リガーゼを使用すること;
を含む、前記方法。 - さらに、以下のステップ:
(d)上記架橋オリゴから上記普遍的オリゴを分離すること;
を含む、請求項38に記載の方法。 - 他の標的ポリヌクレオチド又はその断片を作製するために、上記物品を再使用することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 水性の環境における固相支持体上でのポリヌクレオチド構築方法における進歩であって、以下の:
(a)直接的に又は連結基を介して、普遍的オリゴを固相支持体に共有結合させること;
(b)開始二本鎖を形成するために、架橋オリゴを上記普遍的オリゴにアニーリングすること、ここで上記開始二本鎖は粘着末端を提供するために、一本鎖形態の上記架橋オリゴの部分を有する;及び
(c)第1オリゴ又は第1二本鎖を、上記開始二本鎖の上記粘着末端にハイブリダイズすること、ここで、上記第1オリゴ又は第1二本鎖が次にライゲーション条件におかれ、そして標的ポリヌクレオチド又はその断片中に取り込まれる;
を含む、前記進歩。 - 固相支持体上での遺伝子の部分の構築方法であって、以下のステップ:
(a)固相支持体上で第1遺伝子断片を構築すること、ここで、上記第1断片が少なくとも50塩基対を有する;
(b)第1断片を溶液中に提供するために、上記第1断片を上記固相支持体から分離すること;
(c)固相支持体上で第2遺伝子断片を構築すること、ここで、上記第2断片が少なくとも50塩基対を有し、且つ上記第1断片と同一でない;
(d)第2断片を溶液中に提供するために、上記第2断片を上記固相支持体から分離すること;
(e)固相支持体上で第3断片を構築すること;
(f)より長い遺伝子断片を提供するために、上記第3断片を上記第1断片に結合させること;
(g)最終的な遺伝子を提供するために、上記第2断片を普遍的オリゴをステップ(e)のより長い遺伝子断片に結合させること;及び
(h)上記最終的な遺伝子を上記固相支持体から分離すること;
を含む、前記方法。 - 溶液中で遺伝子の部分を構築する方法であって、以下のステップ:
(a)第1遺伝子断片を固相支持体上で構築すること、ここで上記第1断片が少なくとも50塩基対を有する;
(b)第1断片を溶液中に提供するために、上記第1断片を上記固相支持体から分離すること;
(c)第2遺伝子断片を固相支持体上で構築すること、ここで、上記第2断片が少なくとも50塩基対を有し、且つ上記第1断片と同一でない;
(d)第2断片を溶液中に提供するために、上記第2断片を上記固相支持体から分離すること;
(e)上記第1断片と上記第2断片を単一の溶液中で併合すること;そして
(f)最終的な遺伝子を溶液中に提供するために、ステップ(e)の上記第1及び第2断片を共有結合させること;
を含む、前記方法。 - 上記第1及び第2断片が、細菌又は酵母中で同種性組換えによって一緒にして結合される、請求項43に記載の方法。
- 遺伝子構築方法であって、以下のステップ:
(a)固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸(ds-NA)を提供すること;
(b)上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸(ss-NA)の溶液を提供すること;及び
(c)以下のような方向:(i)上記ss-NAがステップ(a)の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ(ii)少なくともステップ(b)の上記溶液のいくらかが上記ds-AAを少なくとも2回通過するように、その方向が少なくとも1回逆行する、のような上記方向に働く力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-AAを通過するという条件下で、ステップ(a)の上記ds-NAとステップ(b)の上記溶液を接触させること;
を含む、前記方法。 - 遺伝子構築方法であって、以下のステップ:
(a)固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸(ds-NA)を提供すること;
(b)上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸(ss-NA)を提供すること;及び
(c)以下の:(i)上記ss-NAがステップ(a)の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ(ii)力の減少が上記ds-NAの一本鎖部分へアニーリングするss-NAの量を減少させる力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-NAを通過するという以外は一定である条件下で、ステップ(a)の上記ds-NAとステップ(b)の上記溶液を接触させること;
を含む、前記方法。 - 上記固相支持体が多孔質である、請求項45又は46に記載の方法。
- ステップ(b)の上記溶液が、上記孔を多数回通り抜けることを必要とする、請求項47に記載の方法。
- 自動遺伝子構築のための装置であって、以下の:
(a)複数の反応容器、ここで、各反応容器が第1オリフィス、第2オリフィス、及び内幅を有し、そして各容器が上記内幅にわたる多孔質固相支持体を含む;そして
(b)上記複数の反応容器と流体連絡している1以上のポンプ;
を含む、前記装置。 - さらに、流体モニタリング手段を含む、請求項49に記載の装置であって、ここで、上記流体モニタリング手段が反応容器中の流体レベルをモニターする、前記装置。
- さらに、温度制御手段を含み、ここで、上記温度制御手段が反応容器内部の温度を制御する、請求項49に記載の装置。
- さらに、上記第1オリフィスと上記ポンプの間に位置する弁を含み、ここで、上記弁が液体貯蔵容器と流体連絡しており、液体が上記容器から反応容器中へポンプの作用によって押し出されることのできる、請求項49に記載の装置。
- さらに、コンピュータ制御された上記装置の操作を提供する、コンピュータを含む、請求項49に記載の装置。
- さらに、マイクロプレート貯蔵ステージを含む、請求項49に記載の装置。
- 上記マイクロプレート貯蔵ステージが、上記マイクロプレート貯蔵ステージ上に位置される、マイクロプレートと接触している溶液の温度をモニターし且つ制御するために、温度モニタリング及び制御手段を含む、請求項54に記載の装置。
- さらに、マルチプレート貯蔵システムを含む、請求項49に記載の装置。
- 上記マルチプレート貯蔵システムが温度制御されている、請求項56に記載の装置。
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