Spaltung von chemisch synthetisierten Oligo-/Polynucleotiden an einer vorbestimmten Stelle
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligo-/Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]n gekennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Vielfaches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen, wobei im Falle von n>1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur chemischen Synthese eines vorgenannten Oligo-/Polynucleotids, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben beschriebenen Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangehenden Schritt erzeugten Moleküls darstellt, und (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (c) und (d). In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei wie oben definierten Nucleinsäuremolekülen A und B, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangehenden Schritt erzeugten Moleküls darstellt, (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (c) und (d), und (e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B.
Für die chemische DNA-Synthese wird heutzutage im wesentlichen die Amiditchemie angewendet (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552). Bei neueren Verfahren zur Synthese von DNA auf planaren Oberflächen, wie z.B. zur Herstellung
von sogenannten "Arrays", werden zunehmend auch photoreaktivierbare Gruppen verwendet (Ahmad Hasan, et al., Tetrahedron Letters 53 (1997), 4247-4264). Für verschiedene Anwendungen werden Amidite von Nucleotidanaloga angeboten oder auch einfachere Verbindungen mit synthesetauglichen Amiditgruppen, welche dazu verwendet werden, Oligonucleotide mit kopplungsfähigen Gruppen, Haptenen oder beispielsweise mit Fluorochromen zu markieren.
Synthetische Oligonucleotide werden für eine Vielzahl von molekularbiologischen Verfahren verwendet, die zum größten Teil Varianten der Polymerasekettenreaktion (PCR-Technik) darstellen. Auch für die Hybridisierung auf soliden Oberflächen finden immobilisierte Oligonucleotide Verwendung. Beide Verfahren beruhen grundlegend auf der spezifischen Hybridisierung. Die PCR-Reaktion beruht auf der spezifischen Hybridisierung von mindestens zwei antipolar orientierten Primeroligonucleotiden an Matrizen-DNA in Lösung. Zur Anwendung der PCR-Reaktion wird mindestens ein Primerpaar benötigt. Andere Varianten der Methode, z.B. die "nested-primer"-PCR, oder die Multiplex-PCR benötigen drei oder mehr Primeroligonucleotide. In der Regel werden Oligonucleotide an einer Festphase synthetisiert. Der meist verwendete Standard ist heutzutage CPG-Glas ("controlled pore size glass"), auf das über eine Succinsäureesterbindung jeweils eine der vier Basen als Start-Base angedockt ist. Neuerdings werden auch universelle Startermoleküle angeboten. Zu einer Oligonucleotidsynthese benötigt man in einer Syntheseeinheit eine Säule mit CPG, die einen Platz in der Synthesemaschine belegt.
Wie vorstehend erwähnt, ist der Bedarf an chemisch hergestellten Nucleinsäuremolekülen bereits enorm groß, und ein Ende dieses weiter zunehmenden Bedarfs ist aufgrund der Entwicklung immer neuerer molekularbiologischer Verfahren, die auf der Verwendung von chemisch hergestellten Oligonucleotiden beruhen, nicht abzusehen. Aufgrund dieser großen Nachfrage besteht ein dringender Bedarf, sowohl die Kapazität der Synthesemaschinen als auch die Produktionskosten für Unternehmen, die solche Leistungen anbieten, zu senken. Neben der PCR-Technik existieren eine Reihe weiterer molekularbiologischer Techniken, die ebenfalls auf der Verwendung von zwei Oligonucleotiden beruhen, und, ähnlich wie im Fall der PCR-Technik, ist es auch bei diesen Verfahren von großer Wichtigkeit, daß die beiden Oligonucleotide in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander eingesetzt werden. Im Falle der PCR-Technik und in Fällen, in
denen z.B. doppelsträngige Oligonucleotide eingesetzt werden, ist das gewünschte molare Verhältnis in der Regel 1 :1. Ist der Einsatz von zwei Oligonucleotiden erforderlich, wird herkömmlicherweise nach der Synthese der beiden Oligonucleotide, gegebenenfalls nach verschiedenen Behandlungsschritten, die Konzentration der Oligonucleotide bestimmt, um diese danach im Experiment in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander einzusetzen. Da der Einsatz von Oligonucleotiden in molaren Verhältnissen, die vom gewünschten Wert mehr oder weniger stark abweichen, zu unerwünschten Nebenreaktionen führen kann, die einen erheblichen negativen Einfluß auf die Quantität und Qualität eines Versuchsergebnisses haben können, ist der Fachmann in der Regel sehr bemüht, die Konzentrationen der Nucleinsäuren so exakt wie möglich zu bestimmen. Üblicherweise wird die Bestimmung der Konzentration einer Nucleinsäure photometrisch durchgeführt. Obwohl diese Methode prinzipiell Ergebnisse von ausreichender Genauigkeit liefern kann, existieren eine Reihe von Faktoren, die diese Genauigkeit beeinträchtigen können. So können z.B. Verunreinigungen in der nucleinsäurehaltigen Lösung, aber auch zu hohe Nucleinsäurekonzentrationen zu falschen Meßergebnissen führen, die wiederum zu falschen Konzentrationsberechnungen und schließlich zum Einsatz der Oligonucleotide in falschen molaren Verhältnissen führen. Somit besteht neben dem obengenannten Bedarf von wirtschaftlicher Seite ein weiterer Bedarf von wissenschaftlicher Seite, nämlich der Bedarf für eine Möglichkeit, Oligonucleotide in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander in einem Experiment einsetzen zu können, bei dem (ein) bestimmte(s) molares/molare Verhältnis(se) von zwei oder mehreren Nucleinsäuremolekülen wichtiger ist als die exakten absoluten Molaritäten.
Das dieser Erfindung zugrunde liegende technische Problem war dementsprechend, Möglichkeiten bereitzustellen, die die oben erwähnten Bedürfnisse befriedigen.
Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligo-/Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]n gekennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Vielfaches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen, wobei im Falle von n>1 B gleiche oder verschiedene
Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können.
Der Begriff "Oligo-/Polynucleotid" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl Nucleinsäuremoleküle mit einer Länge von ungefähr 50 bis zu 100 oder mehr Nucleotiden als auch Oligonucleotide, die eine Länge zwischen 10 oder weniger Nucleotiden und ungefähr 50 Nucleotiden aufweisen. Des weiteren umfaßt der Begriff "Oligo-/Polynucleotid" insbesondere Ribo-, Desoxyribo- und
Peptidnucleinsäuremoleküle, sowie Mischpolymere aus den vorgenannten Nucleinsäuremolekülen wie z.B. ein Oligo-/Polynucleotid, das aus einem Ribonucleinsäuremolekül A und einem Desoxyribonucleinsäuremoleukül B besteht. Der Begriff "Verbindung X" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl einzelne Atome als auch Moleküle und Makromoleküle, die aus mehreren, kovalent verknüpften Atomen bestehen.
Der Begriff "sequenzunabhängig" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß das Agens zur Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit den Nucleinsäuremolekülen A und B nicht zuvor ein bestimmtes Sequenzmotiv, d.h. eine bestimmte Abfolge von Nucleotidbausteinen, erkennen muß, das sich innerhalb des Oligo-/Polynucleotids z.B. in unmittelbarem Anschluß vor und nach der Verbindung X oder auch in einem bestimmten Abstand von der Verbindung X entfernt befindet. Ist beispielsweise für die Spaltung die Erkennung ausschließlich der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B notwendig, so ist diese Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung sequenzunabhängig. Wäre jedoch die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B Teil eines Sequenzmotivs, das notwendigerweise zur Spaltung erkannt werden muß, so würde eine solche Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als sequenzunabhängig gelten. Restriktionsendonucleasen sowohl des Typs II (Spaltung des Nucleinsäuremoleküls erfolgt innerhalb der Erkennungssequenz) als auch des Typs I oder III (Spaltung des Nucleinsäuremoleküls erfolgt außerhalb der Erkennungssequenz) erfüllen deshalb z.B. nicht die erfindungsgemäßen Kriterien der Sequenzunabhängigkeit.
Der Begriff "spezifisch" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß mittels des Agens nur die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit den Nucleinsäuremolekülen A und B gespalten wird, ohne daß es zu einer Spaltung einer
oder mehrerer der Bindung(en) kommt, die die Nucleoside der Nucleinsäuremoleküle A und B verknüpft/verknüpfen und/oder Bestandteil der Nucleoside selbst ist/sind. Handelt es sich beispielsweise bei der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B um die einzige(n) Phosphodiesterbindung(en), die durch eine Endonuclease gespalten wird/werden, so würde eine solche Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung als spezifisch bezeichnet werden. Bindungen, die nicht durch Nucleasen gespalten werden können, sind z.B. Phosphorothioat-, Methylphosphonat- oder Peptidbindungen. Handelt es sich hingegen bei der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B um eine oder mehrere Phos- phodiesterbindungen, und wird das Oligo-/Polynucleotid mit einer unspezifisch spaltenden Endonuclease behandelt, so wird diese Behandlung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als spezifische Spaltung betrachtet, sofern zwei oder mehrere der Nucleoside des Nucleinsäuremoleküls A und/oder B ebenfalls über (eine) Phosphodiesterbindung(en) miteinander verknüpft sind und diese auch durch die verwendete Endonuclease gespalten wird/werden. Eine chemische Modifikation des Oligo-/Polynucleotids und eine anschließende chemische Spaltung, wie sie z.B. bei der Sequenzierungsmethode nach Maxam & Gilbert eingesetzt wird, würde, um ein weiteres Beispiel zu geben, unter den Begriff "spezifische Spaltung" fallen, wenn durch eine solche Behandlung nur die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B gespalten werden würde. Würde eine solche Behandlung nicht nur zur Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B, sondern auch zur Spaltung von einer oder mehreren weiteren Bindungen in den Nucleinsäuremolekülen A und/oder B führen, so wäre dies keine spezifische Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung.
Die Oligo-/Polynucleotide der vorliegenden Erfindung erlauben es vorteilhafterweise, Gemische herzustellen, die zwei oder mehrere Oligo- und/oder Polynucleotide in (einem) bestimmten Verhältnis(sen) enthalten. Enthält das erfindungsgemäße Poly- nucleotid beispielsweise 1 Nucleinsäuremolekül A und 1 Nucleinsäuremolekül B, so erhält man nach Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B ein Gemisch, das das Nucleinsäuremolekül A und B exakt oder im wesentlichen im Verhältnis 1 :1 enthält. Enthält das erfindungsgemäße Polynucleotid z.B. 2, 3 oder 4 Kopien des Nucleinsäuremoleküls B, so lassen sich Gemische herstellen, die die Nucleinsäuremoleküle A und B exakt oder im wesentlichen im Verhältnis 1 :2, 1 :3 oder 1 :4 enthalten. Es ist zu erwarten, daß je nach Wahl der Oligo-
/Polynucleotidsequenz und/oder der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B und des entsprechenden Agens, möglicherweise nicht jedes Oligo-/Polynucleotid oder gegebenenfalls nicht jede Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen innerhalb eines Oligo-/Polynucleotids mittels des Agens gespalten wird, so daß das erzielte Verhältnis vom theoretisch erwarteten Wert geringfügig abweichen kann. Solche möglicherweise auftretenden geringfügigen Abweichungen von dem theoretisch erwarteten Verhältnis verleihen den entsprechenden Nucleinsäuregemischen nichtsdestotrotz die erfindungsgemäßen vorteilhaften Eigenschaften, wodurch solche Gemische ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Oligo- /Polynucleotid durch die allgemeine Formel 3'-A[-X-B]n-5' oder 5'-A[-X-B]n-3' gekennzeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Oligo- /Polynucleotid ist 1 < n < 100. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist 1 < n < 50, und am meisten bevorzugt ist 1 < n < 10.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligo-/Polynucleotids wie oben beschrieben, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangegangenen Schritt erzeugten Moleküls darstellt, und (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (b) und (c), wobei die Nucleinsäuresynthese nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt wird (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei wie oben definierten Nucleinsäuremolekülen A und B, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des
Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangegangenen Schritt erzeugten Moleküls darstellt, (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (b) und (c), und (e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B, wobei darunter selbstverständlich auch Ausführungsformen fallen, in denen nach Wiederholung der Schritte (b) und (c) die Bindung(en) in B-X-B gespalten werden können, und wobei die Nucleinsäuresynthese nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt wird (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B gekoppelt an einer Festphase synthetisiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, die Synthesekosten dadurch zu reduzieren, daß die Kosten für das Festphasenmaterial halbiert bzw. noch weiter reduziert werden, da zwei oder mehr Oligo- und/oder Polynucleotide gekoppelt an einer Festphase synthetisiert werden, und nicht für jedes Oligo- und/oder Polynucleotid separat Festphasenmaterial bereitgestellt werden muß. Die Kopplung an die Festphase erfolgt vorteilhafterweise nach konventionellen Verfahren. Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu, Zusammensetzungen herzustellen, die nur Nucleinsäuremoleküle enthalten, die aus der vollständigen gewünschten Sequenz bestehen und nicht mit Molekülen verunreinigt sind, die aufgrund eines frühzeitigen Abbruchs der Synthese nicht die vollständige gewünschte Sequenz aufweisen. Wird beispielsweise für ein Nucleinsäuremolekül A eine Sequenz gewählt, die komplementär zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls B ist, und ist das zu synthetisierende Oligo- /Polynucleotid so an die Synthesematrix gekoppelt, daß es bei Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B nicht von der Synthesematrix abgespalten wird, so erhält man nach der Synthese des Oligo- /Polynucleotids und Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B ein an die Synthesematrix gekoppeltes Nucleinsäuremolekül
A und ein in Lösung vorhandenes Nucleinsäuremolekül B, das aufgrund der Komplementarität der Sequenzen an das Nucleinsäuremolekül A hybridisieren kann. Über einen Temperaturgradient lassen sich nun "affinitätschromatographisch" alle Nucleinsäuremoleküle B abtrennen, die nicht die vollständige gewünschte Sequenz aufweisen, da diese abhängig von der Anzahl der hybridisierenden Nucleotide, die im Vergleich zu der vollständigen Sequenz fehlen, ab einer entsprechend hohen Temperatur nicht mehr in der Lage sind, mit dem Nucleinsäuremolekül A zu hybridisieren, und bei entsprechend hoher Temperatur nur noch in ihrer Sequenz vollständige Nucleinsäuremoleküle B hybridisieren. Auf diese Weise aufgereinigte in ihrer Sequenz vollständige Nucleinsäuremoleküle B lassen sich schließlich z.B. durch kurzes Erhitzen auf 100°C isolieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren nach dem letzten Schritt eine Abspaltung des Oligo-/Polynucleotids oder des Nucleinsäuremoleküls A von der Festphase (Synthesematrix). Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben es dem Fachmann also vorteilhafterweise, mittels einer Synthese zwei oder mehrere Oligo- und/oder Polynucleotide herzustellen. Neben den oben diskutierten Vorteilen, weisen die erfindungsgemäßen Verfahren eine Reihe weiterer vorteilhafter Eigenschaften auf. Zu diesen Eigenschaften zählt u.a., daß die Synthesekapazität von Nucleinsäure- Synthesemaschinen deutlich erhöht werden kann. Ist das Ziel der Synthese beispielsweise ein Gemisch von zwei Oligonucleotiden, so können bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die zwei Oligonucleotide wie im Falle der Synthese eines einzelnen Oligonucleotids auf einer Synthesematrix synthetisiert werden. Außerdem findet nur eine Programmierung des Geräts statt. Wird eine Nucieinsäure-Synthesemaschine nun mit einer maximal möglichen Anzahl von Syntheseeinheiten bestückt, so wird durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der Reduktion der notwendigen Arbeitsschritte die Synthesekapazität der Synthesemaschine deutlich erhöht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Festphase eine planare Oberfläche oder "controlled pore size glass" (CPG).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Oligo-/Polynucleotid bzw. ein oder mehrere der mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B mit einer kopplungsfähigen Gruppe, einem Hapten, einem Chromophor, einem oder mehreren Fluorophoren, einem oder mehreren Chelatoren, einer enzymatisch modifizierbaren Gruppe oder einem Paar von modifizierenden Gruppen markiert.
Ein Paar von modifizierenden Gruppen kann z.B. ein Fluorophor und ein Quenchermolekül umfassen, oder ein Paar von Fluorophoren, die in der Lage sind, Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) durchzuführen. Chelatoren können verwendet werden, um verschiedene Metalle und Übergangsmetalle wie z.B. fluoreszierendes Europium oder Ruthenium zu binden und damit das Emissionsspektrum einer Fluoreszenzanregung zugunsten einer vorteilhafteren Filterkombination zu verschieben.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des Oligo-/Polynucleotids oder des Verfahrens der vorliegenden Erfindung weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 2 und 40 Nucleotiden auf. Stellt es sich heraus, daß z.B. bestimmte Di-, Tri- oder Tetramere eine besondere z.B. therapeutische oder prophylaktische Wirkung besitzen, so lassen sich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens solche Nucleinsäuremoleküle enthaltende Lösungen einfach und kostengünstig herstellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 10 und 30 Nucleotiden auf.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 13 und 25 Nucleotiden auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B einzelsträngig.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B Primer für eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR).
Die vorliegende Erfindung erlaubt es natürlich auch, Oligonucleotide für Techniken herzustellen, die Varianten der PCR darstellen. Solche Techniken wie beispielsweise die sogenannte "Ligase Chain Reaction" (LCR) sind dem Fachmann bekannt (Lee, Biologicals 3 (1996), 197-199; Barany, PCR Methods Appl. 1 (1991), 5-16). Die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B können im Sinne der vorliegenden Erfindung jedoch auch zwei in ihrer Sequenz komplementäre Nucleinsäuremoleküle sein. Nach Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B kann eine Hybridisierung der komplementären Nucleinsäuremoleküle z.B. durch kurzes Erhitzen und langsames Abkühlen der die Nucleinsäuremoleküle enthaltenden Lösung erzielt werden. Da die Nucleinsäuremoleküle z.B. im Verhältnis 1 :1 vorliegen, erlaubt es die vorliegende Erfindung, doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle herzustellen, die im wesentlichen nicht durch einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle verunreinigt sind. Auf diese Weise hergestellte doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle können vorteilhafterweise z.B. als Linker eingesetzt werden, die an die Enden von DNA- oder RNA-Fragmenten ligiert werden können und somit diese Fragmente mit Restriktionsendonuclease- Schnittstellen z.B. zu Clonierungszwecken versehen. Die erfindungsgemäß hergestellten doppelsträngigen Nucleinsäuremoleküle können auch in sogenannten "Electrophoretic Mobility Shift Assays" (EMSAs) eingesetzt werden. Durch entsprechende Wahl der Sequenzen und entsprechender Anzahl von Nucleinsäuremolekülen B ist es mittels der erfindungsgemäßen Verfahren natürlich auch möglich, Gemische von verschiedenen doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen herzustellen. Die erfindungsgemäß hergestellten doppelsträngigen Nucleinsäuremoleküle bzw. die Gemische von verschiedenen doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen eignen sich auch für die einfache und kostengünstige Herstellung von Arrays von beispielsweise dsDNA zur Analyse von proteinbindenden Sequenzen, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren und deren Komplexe. Wie in Martha L. Bulyk, et al., Nature Biotechnology 17 (1999), 573-577, Robert Carlson & Roger Brent, Nature Biotechnology 17 (1999), 536-537, sowie Eckhard Nordhoff, et al., Nature Biotechnology 17 (1999), 884-888, beschrieben, ist es möglich, dsDNA-Moleküle mit spezifischen Sequenzen an geeignete Oberflächen zu binden und so die
Bindungseigenschaften von DNA-bindenden Proteinen und deren Komplexe zu analysieren. Analog dazu können erfindungsgemäß hergestellte dsRNA-Moleküle oder Mischpolymere aus DNA und RNA sowie einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung von Nucleinsäure-Arrays verwendet werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Nucleinsäuremolekülen, umfassend die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens und weiterhin den Schritt: (f) Immobilisierung der Nucleinsäuremoleküle an definierten Positionen auf einem Träger. Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuremolekülen auf Trägermaterialien sowie geeignete Matrizen sind dem Fachmann bekannt (z.B. R. Schwerdtle et al., Labchips und Microarrays für biotechnologische Anwendungen, medizinische Genetik Nr. 1 , 11. Jahrgang (1999)). Unabhängig davon, ob die Nucleinsäure-Trägermoleküle als funktioneile Rezeptoren für die in einem Analytengemisch nachzuweisenden bzw. zu quantifizierenden spezifischen Liganden auf der Trägermatrix des Chips oder Kügelchens in situ z.B. mittels photolithographischer Techniken unter Verwendung von physikalischen Masken synthetisiert oder mittels verschiedener Kontakt- oder Nichtkontaktverfahren aufgedruckt (gespottet) werden, erfolgt die Chipherstellung stets auf Basis einer festen Matrix, zu deren Herstellung beispielsweise Silikone, Quarz und Glas sowie zunehmend Polymermaterialien eingesetzt werden. Diese feste Trägermatrix wird üblicherweise anschließend aktiviert und/oder mit einer als Kopplungsmatrix bezeichneten Schicht beaufschlagt, um die gewünschten Nucleinsäure-Rezeptoren synthetisieren oder aufdrucken zu können. Grundsätzlich erfolgt die Aktivierung zur Bereitstellung kopplungsfähiger reaktiver Gruppen auf der Oberfläche der Trägermatrix. Gewöhnlich werden für diesen Zweck Säuren eingesetzt wie z.B. Caro'sche Säure (20% H2O2/80% H2S04) und HCI. Weitere Aktivierungsmittel sind dem Fachmann bekannt.
Wird als Trägermatrix Glas eingesetzt, muß die Glasoberfläche vor der Synthese bzw. vor dem Aufdrucken der Rezeptoren in geeigneter Weise beschichtet werden, um die Hydrophobizität der Oberfläche zu erhöhen. Im Gegensatz dazu werden beim Aufdrucken vorgefertigte Nucleinsäure-Moleküle kovalent oder nicht-kovalent auf der festen Trägermatrix immobilisiert. Die nicht-kovalente Immobilisierung kann z.B. über Biotin-Streptavidin-vermittelte Sondenkopplung oder über das Bedrucken von mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasoberflächen erfolgen.
Bei der in s/ it-Synthese wird die Oberfläche üblicherweise mit einem Silan beschichtet, an das ein eine Hydroxylgruppe tragendes Verbindungsmolekül gekoppelt wird, von dem ausgehend die Oligonukleotidsynthese nach dem etablierten CPG-Phosphoramidit-Verfahren erfolgt. Bei modifizierten Verfahren wird die Hydroxylgruppe des Verbindungsmoleküls mit einer photolabilen Schutzgruppe versehen, welche nach UV-Bestrahlung wieder entfernt werden kann und dadurch die Ankopplung eines gewünschten Phosphoramiditmonomers ermöglicht. Eine Möglichkeit liegt in der Anwendung standardisierter photolithografischer Verfahren, die entweder nach erfolgter Polymerisierung (Photoablation der Polymere mittels (virtueller) Masken), vor der Polymerisierung (Photoabbau oder Photoablation der monomolekularen Initiatorschicht mittels (virtueller) Masken), oder während der Reaktion durch Masken-vermittelte Photopolymerisation angewendet werden können. Andere mögliche Techniken zur Schaffung einer rasterartig angelegten monomolekularen Initiator- bzw. Polymerschicht umfassen verschiedene Druckverfahren wie z.B. Kontaktverfahren mit Hilfe von Kapillarnadeln („Pin-Technik") oder Nichtkontaktverfahren auf Basis von piezoelektronischen Tintenstrahldüsen und dergleichen, welche während der Bildung der Initiatorschicht oder während der Polymerisation angewendet werden können. Unter Anwendung einer oder mehrerer dieser Techniken können Oberflächenstrukturen mit Abmessungen im Mikrometerbereich geschaffen werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung X ein 5'-0-(o-Nitrophenyl)alk-oxycarbonylnucleosid, ein Dicarbonsäure- di-cis-diolester oder eine thermisch spaltbare Verbindung.
Thermisch spaltbare Verbindungen, die vorteilhafterweise im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind beispielsweise solche, die durch eine thermisch induzierte Cycloreversion des Typs (4+2) nach Diels-Alder gespalten werden können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Oligo- /Polynucleotids oder des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verbindung X 5'- oder 3'-0-[2,2'-Di-(2-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl]-thymidin, Succinyl-2,3- dihydroxytetrafuran oder Di-1 ,2-Hydroxycyclopentansuccinsäurediester.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Agens ein chemisches und/oder physikalisches Agens.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das chemische Agens eine Säure oder Base.
Idealerweise wird/werden für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Verbindung(en) X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B so gewählt, daß die Behandlung des Polynucleotids zur Abtrennung von der Festphase nach der Synthese oder zur Abspaltung der zum Schutz der Basen vorhandenen chemischen Gruppen auch zu einer Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B führt. Somit kann A auch über X an die Matrix gebunden sein. Eine übliche Behandlung zur Abspaltung der Schutzgruppen von chemisch synthetisierten Nucleinsäuremolekülen ist die mehrstündige Inkubation bei ca. 55°C in einer konzentrierten Ammoniaklösung. Wird/werden nun während der Synthese des Polynucleotids eine oder mehrere Verbindung(en) X inkorporiert, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch Alkalibehandlung gespalten wird/werden, so erhält man in einem Arbeitsschritt ein Gemisch von einsatzbereiten Nucleinsäuremolekülen.
In einer zusätzlichen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B thermisch und/oder photoinduziert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B eine Eliminierungsreaktion, eine intramolekulare Umlagerungsreaktion, eine hydrolytische Reaktion, die Umkehrung einer Additionsreaktion oder eine Cycloreversion.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B eine ß-Eliminierungsreaktion, eine Umkehrung einer Michaelis-Addition, eine Woodward-Hoffmann-Reaktion oder eine Diels-Alder-Reaktion.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Oligo- /Polynucleotids oder Verfahrens erzeugt die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B eine 5'- und 3'-OH-Gruppe oder eine 5'-Phosphatgruppe und eine 3'-OH-Gruppe in den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B.
Die in dieser Anmeldung zitierten Publikationen sind hiermit per Referenz in die Anmeldung inkorporiert.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Schematische Darstellung der internen Spaltungsreaktion in einem Oligonucleotid an einer vorbestimmten Stelle durch Einbau einer labilen Amiditverbindung während der Synthese, und nachfolgende Spaltungsreaktion: M = Synthesematrix, O = labile Gruppe, - = Sequenz.
Figur 2: Plasmidclonierung und Linkeradaptor.
A: Plasmidende links (Hindlll, schwarzer Balken),
B: Adaptor (Hindlll, hellgrauer Balken, EcoRI),
C: zu ligierendes Fragment (EcoRI, dunkelgrauer Balken, Aatll),
D: Plasmidende rechts (Aatll, schwarzer Balken).
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Für eine Clonierungsreaktion wird ein doppelsträngiges Adaptormolekül benötigt, das in einer eigentlich inkompatiblen Ligationsreaktion eine geeignete Verbindung schafft zwischen einem Plasmid und einem zu ligierenden Fragment. Dies wird durch Inkorporation einer neuen Restriktionsschnittstelle mit geeignetem Überhang bewerkstelligt.
Üblicherweise würden nun zwei Oligonucleotide bei dem Synthesedienstleister bestellt, die
1. teilweise komplementär zueinander sind, des weiteren
2. teilweise komplementär sind mit passenden einzel-strängigen Überhängen, zum einen an dem einen Plasmidende (A:B),
3. zum anderen am linken Ende des zu ligierenden Fragmentes (B:C)
Das Syntheselabor würde für je einen Strang der Einzelstrang-DNA zwei Synthesen durchführen, und der Forscher müßte dann zur Herstellung des Adaptors die beiden einzelsträngigen DNAs in exakt dem gleichen Verhältnis mischen und diese dann für die Clonierung vorbereiten.
Im vorliegenden Falle wurden die beiden einzelsträngigen DNAs jedoch in einer Synthese hintereinandergeschaltet und zeitgleich in der gleichen Synthesesäule synthetisiert, indem die beiden Sequenzen bei der Synthese durch den Einbau eines Di-Diol-Succinsäureesteramidits miteinander verbunden wurden. Bei der Ammoniumabspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese spalten sich die beiden einzelsträngigen Oligos voneinander ab und können sich dann aneinanderlagem. Das richtige stöchiometrische Verhältnis (1 :1) wurde durch das Syntheseverfahren bereits eingestellt. Das Adaptormolekül konnte so fertig zur Ligation direkt ausgeliefert werden.
Liqationspuffer:
1 μ\ Ligationspuffer (T4-DNA-ügase, BioLabs) 1 μ\ Ligase (1 U) 1 //I PIasmid pNEB193 (50 ng) 1 μ\ Fragment pA01 -15 (150 ng) 1 μ\ Adaptoroligonucleotid (10 ng) 5 υ\ H2Q
10 μ\ Gesamtansatz
Die Ligationsreaktion erfolgte 5 h bei 16°C. Der Ligationsansatz wurde mit Ethanol gefällt und mit 70% Ethanol anschließend gewaschen, getrocknet und nach
Standardprotokoll in kompetente DH10α-E. coli Zellen transformiert und auf Ampicil- linplatten (50 μg/ml, Amp) plattiert. Zwanzig Transformanten wurden ausgewählt und in LB-Medium (50 /vg/ml Ampicillin) angezogen.
Die Analyse der Transformanten erfolgte nach der Plasmidpräparation-Alkali-
Methode: A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA,
Birnboim, HC, Methods Enzymol. 1983; 100: 243-55 mittels Restriktionsanalyse
(EcoRI-Aatll).
Beispiel 2
Für eine generelle PCR-Strategie zum Nachweis und zur Differenzierung verschiedener Lactobacillenspezies wie z.B. Lactobacillus fermentum, L. fructivorans, L. brevis und/oder L. cremoris in Sauerteig wurden im stöchiometrischen Verhältnis (1 :1) ein Primer-Paar zum Nachweis der 16S RNA auf einem DNA-Array eingesetzt.
41f-Primer: GCTCAGATTGAACGCTGGCG 1066R-Primer: ACATTTCACAACACGAGCTG
Mit diesem Primerpaar aus hochkonservierten Sequenzen ist es möglich, die divergierenden Sequenzen aus vielen verschiedenen Bakterienspezies, die zwischen den Primersequenzen liegen, zu amplifizieren und in einem Hybridisierungsexperiment voneinander zu trennen, wobei die entstehenden Signale einer bestimmten Bakterienspezies zugeordnet werden können.
Die entsprechenden Primersequenzen wurden in einer Oligonucleotid-Synthese in einer Sequenzfoige am Stück synthetisiert. Die einzelnen Sequenzabschnitte wurden durch den Einbau von Trityl-di-cis-diol-dicarbonsäureamidite miteinander verbunden. Bei der Ammoniumabspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese spalteten sich die zwei verschiedenen einzelsträngigen Oligos voneinander ab und können direkt in der PCR-Reaktion Verwendung finden. Das Primerpaar konnte in einer Synthese hergestellt und direkt im PCR-Experiment eingesetzt werden. Die entstehenden Fragmente wurden zum Hybridisierungsexperiment mit FITC-dUTP intern markiert.