DE10041542A1 - Neue Strategie zur Synthese von Polymeren auf Oberflächen - Google Patents

Neue Strategie zur Synthese von Polymeren auf Oberflächen

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese von Polymeren, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäuren, Peptiden und Sacchariden, auf der Oberfläche von festen Trägern. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Polymeren mit verbesserter Qualität sowie eine Kostenverringerung. Weiterhin werden neue Strukturen von trägergebundenen Polymeren bereitgestellt.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese von Polymeren, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäuren, Peptiden und Sacchariden, auf der Oberfläche von festen Trägern. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Polymeren mit verbesserter Qualität sowie eine Kostenverringerung. Weiterhin werden neue Strukturen von trägergebundenen Polymeren bereitgestellt.
Die Synthese von Biopolymeren wie z. B. DNA oder Peptiden auf einem festen Träger erfolgt in der Regel durch eine gerichtete Kondensation bifunktioneller Monomereinheiten. Ausgangspunkt der Synthese ist die. Abspaltung einer Schutzgruppe an einer trägergebundenen funktionellen Gruppe. Anschließend wird das erste bifunktionelle Monomer in aktivierter Form an die funktionelle Gruppe gekoppelt. Nach Abspaltung von dessen Schutzgruppe wird erneut ein aktivierter Synthesebaustein an die freigewordene funktionelle Gruppe gekoppelt.
Bei der Synthese von Peptiden bzw. Peptidnukleinsäuren (PNA) erfolgt der Aufbau entweder vom N- zum C-Terminus oder vom C- zum N-Terminus, während bei der Synthese von Nukleinsäuren wie RNA, LNA oder DNA die Synthese vom 3'-Ende zum 5'-Ende oder in umgekehrter Richtung erfolgt. Die Polymere werden dementsprechend senkrecht zur Oberfläche aufgebaut, wie in Abb. 1 schematisch dargestellt ist. Die Gesamtausbeute entspricht dem Produkt der Ausbeute der einzelnen Kopplungsschritte. Die Kopplungsausbeute jedes einzelnen Kondensationsschrittes ist maßgeblich für die Qualität des Polymers. Diese Qualität beeinflußt wiederum dessen Eignung für die folgenden Applikationen. Dabei spielen neben einer Optimierung der Kopplungsparameter, der Qualität der Entschützungsprozedur und der Aktivatoren auch die Natur möglicher verwendeter Spacer und deren physikochemische Eigenschaften eine entscheidende Rolle.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand darin, neue Strategien für die Synthese von Polymeren auf festen Trägern zu entwickeln, die Vorteile gegenüber der zuvor genannten Methode vorteilhaft sind. Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines festen Trägers mit einer reaktiven Gruppe,
  • b) Koppeln eines trifunktionellen Synthesebausteins an die reaktive Gruppe des Trägers, wobei der trifunktionelle Synthesebaustein eine Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) ist:
    wobei X und Y zueinander orthogonale Schutzgruppen sind,
    L ein Baustein für die Synthese eines Polymers ist, und
    R eine Gruppe ist, die gegebenenfalls nach Aktivierung an die reaktive Gruppe des Trägers gekoppelt werden kann,
  • c) gerichtetes Aufbauen eines Polymerteilstranges, ausgehend von der Schutzgruppe X und
  • d) gerichtetes Aufbauen eines Polymerteilstranges, ausgehend von der Schutzgruppe Y.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst eine Kombination von zwei entgegengesetzten Syntheserichtungen und verschiebt den Ausgangspunkt der Polymersynthese von einem der Enden in das Innere, beispielsweise die Mitte der zu synthetisierenden Polymere, ohne die Gesamtmolekülorientierung zu beeinflussen. Hierzu wird als Ausgangspunkt der Synthese anstelle eines bifunktionellen Synthesebausteins ein trifunktioneller Synthesebaustein verwendet, der mit orthogonalen Schutzgruppen versehen ist. Eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Abb. 2 dargestellt.
Bei der in Abb. 2 gezeigten Ausführungsform, die auf der Oligonukleotidchemie beruht, erfordert die Strategie die Verwendung von 5'-geschützten Synthesebausteinen M, z. B. Phosphoramiditen, sowie der inversen 3'-geschützten Synthesebausteine M', z. B. Phosphoramiditen, um zu einem Molekül mit einer einheitlichen Orientierung zu gelangen (Kopf- Schwanz- bzw. Schwanz-Kopf-Polymer). In Abwandlung dazu ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren selbstverständlich auch die gezielte Synthese von Kopf-Kopf-(5'-5') oder Schwanz-Schwanz-(3'-3')Polymeren.
Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Bereitstellen eines festen Trägers mit einer reaktiven Gruppe. Als feste Träger kommen anorganische oder organische Materialien in Betracht, z. B. funktionalisiertes Controlled-Pore-Glas (CPG), andere Gläser wie Foturan, Pyrex oder gewöhnliche Kalk-Natron-Gläser, metallische Träger wie etwa Silicium, oder organische Harze wie etwa Tentagel. Besonders bevorzugt ist der Träger ein Chip, der zur Synthese von Polymer-Arrays eingesetzt wird.
Die Kopplung des trifunktionellen Synthesebausteins (I) an den Träger erfolgt vorzugsweise über einen Spacer. Die Verwendung eines Spacers hat den Vorteil, dass das Polymer weiter von der Oberfläche des festen Trägers entfernt ist, so dass dessen Einflüsse zurückgedrängt werden, so dass das immobilisierte Polymer quasi homogene Reaktionen eingehen kann. Für den Aufbau des Spacers können Aminosäuremonomere oder Cyanoethyl- oder anderweitig geschützte Phosphoramidite bzw. H-Phosphonate verwendet werden. Beispiele für geeignete Spacerbausteine sind im Stand der Technik bekannt.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Koppeln des trifunktionellen Synthesebausteins (I) an die reaktive Gruppe des gegebenenfalls durch einen Spacer derivatisierten Trägers. Beispiele für geeignete reaktive Gruppen sind Hydroxy, Thiol, Carboxyl, Aldehyd, Epoxy, Amino etc. Die Kopplung des Synthesebausteins (I) an die reaktive Gruppe des Trägers erfolgt auf übliche Art und Weise über die Gruppe R, bei der es sich um eine Gruppe handelt, die gegebenenfalls nach Aktivierung an die reaktive Gruppe des Trägers gekoppelt werden kann. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Beispiele für die Gruppe R bekannt, wie etwa Carboxyl oder Amidit.
Ein wesentliches Merkmal des trifunktionellen Synthesebausteins (I) ist das Vorhandensein von zwei orthogonalen Schutzgruppen X und Y. Diese Schutzgruppen werden aus für die Festphasensynthese von Polymeren, beispielsweise Nukleinsäuren bzw. Peptiden, bekannten Schutzgruppen ausgewählt, mit der Maßgabe, dass ein auf der Verwendung einer ersten der beiden Schutzgruppen basierender Aufbau eines Polymers ohne Beeinflussung der zweiten Schutzgruppe stattfinden kann, d. h. die beiden Schutzgruppen sind zueinander orthogonal. Vorzugsweise sind X und Y Schutzgruppen, die durch chemische, photochemische oder enzymatische Reaktionen abgespalten werden können, wobei durch die Abspaltung eine reaktive Gruppe, z. B. eine Hydroxyl- oder Aminogruppe freigesetzt wird. Beispiele für geeignete Schutzgruppen sind säurelabile Schutzgruppen wie etwa Dimethoxytrityl (DMT), MMT, Pixyl, Fpmp etc., basenlabile Schutzgruppen wie etwa Benzyl, Benzoyl, Isobutyryl, Phenoxyacetyl, Laevulinyl etc., oxidations- oder/und reduktionslabile Schutzgruppen, photolabile Schutzgruppen wie etwa NVOC, NPPOC, katalytisch, z. B. durch Pd-abspaltbare Schutzgruppen, wie etwa Allyl, AOC, durch Fluorid abspaltbare Schutzgruppen, wie etwa TMS oder Derivate davon, z. B. TBDMS. Darüber hinaus können auch Kombinationen von mehreren der genannten Prinzipien über mehrstufige Schutzgruppenkonzepte eingesetzt werden. Bevorzugte Beispiele für Kombinationen orthogonaler Schutzgruppen sind eine katalytisch abspaltbare Schutzgruppe wie AOC und eine Tritylgruppe.
Die Gruppe L der Verbindung (I) ist ein Baustein für die Synthese von Polymeren, vorzugsweise ein monomerer Baustein, wobei jedoch auch oligomere Bausteine, z. B. dimere oder trimere Bausteine eingesetzt werden können. Vorzugsweise wird L aus Bausteinen für die Synthese von Nukleinsäuren wie DNA, RNA oder LNA Nukleinsäureanaloga, wie etwa PNA, Peptiden und Sacchariden ausgewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist L ein monomerer Baustein für die RNA-Synthese. Derartige trifunktionelle RNA-Monomere (allerdings ohne Schutzgruppen) treten auch in der Natur beim Splicen von mRNA Molekülen auf und sind in der Lage, so genannte Lariat-Strukturen auszubilden. Ein Beispiel für einen derartigen Verzweigungsbaustein ist in Abb. 3 gezeigt, wobei B' eine Nukleobase darstellt, X eine säurelabile Schutzgruppe, wie DMT, MMT oder Pixyl, Y eine dazu orthogonale Schutzgruppe, z. B. eine photolabile Schutzgruppe wie NVOC oder NPPOC darstellt und R eine Phosphoramiditgruppe bedeutet.
Die Schritte (c) und (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen das gerichtete Ausbauen von zwei Polymerteilsträngen, jeweils ausgehend von der Schutzgruppe X und der Schutzgruppe Y, wobei unter Anwendung der geeigneten Schutzgruppenchemie zwei separate Polymerteilstränge aufgebaut werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zunächst das erste Teilpolymer synthetisiert. Für die folgenden Schritte eröffnen sich mehrere Anwendungsmöglichkeiten: Einerseits kann man zum Beginn der zweiten Teilsynthese an die Verbindung (I) als Ausgangsmolekül zurückkehren.
Andererseits kann eine Nukleinsäure mit geeigneter Sequenz auf die erste Teilsequenz mit einer 3'-5'-Orientierung hybridisiert werden, so dass diese im Zusammenspiel mit den trifunktionellen Molekül als 3'-Primer fungiert und enzymatisch z. B. mit Hilfe von Polymerasen oder Ligasen verlängert werden kann (Primer-Extension). Im Falle eines Oligomers, das aus 31 Monomeren aufgebaut ist, werden durch das erfindungsgemäße Verfahren nunmehr zwei 15 Monomereinheiten lange Polymerteilstränge aufgebaut. Dies führt zu einer einheitlichen Polymerstruktur mit verbesserter Qualität.
Diese verbesserte Qualität hat zur Folge, dass kleinere Ansätze durchgeführt werden können bzw. bei der Synthese von Arrays oder Chips kleinere Stellplätze für eine bestimmte Polymerspezies ausreichen. Dies führt zu einem günstigeren Signal-Rauschverhältnis und zu einer erheblichen Kostenverringerung.
Die Qualität kann zu dem noch weiter gesteigert werden, da alle Halbsequenzen, die eine freie 3'-Hydroxyfunktion am trifunktionellen Molekül enthalten, unter basischem Milieu auf einem hydrolyselabilen Sockel aufgebaut sind, so dass sie im Rahmen der Entschützungsprozedur vom festen Träger abgespalten werden. Diese Diskriminierung von Abbruchsequenzen führt zu einem noch weiter verbesserten Signal-Rausch- Verhältnis.
Die zur Oberfläche des Trägers waagrechte Anordnung der Polymeren erhöht darüber hinaus die Beweglichkeit der Moleküle und drängt Oberflächeneinflüsse zurück. Dies führt im Falle von Nukleinsäuren zu einer verbesserten Hybridisierung, da die zusätzlichen Freiheitsgrade die räumliche Präorganisation begünstigen, die dem molekularen Erkennungsprozess bei der Strangpaarung vorausgehen. Auch dieser Vorteil ist insbesondere bei der Herstellung von Arrays oder Biochips von Bedeutung. Wichtige Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher die molekulare Diagnostik in den Bereichen Human- und Veterinärmedizin, die Entwicklung neuer pharmazeutisch wirksamer Substanzen, die biologische, biochemische und bioorganische Grundlagenforschung, die in vitro Selektion, die Lebensmittelanalytik, die Biotechnologie sowie Hochdurchsatzverfahren zum Wirkstoffscreening in kombinatorisch chemischen Untersuchungen.
Eine besonders bevorzugte Anwendung ist die in vitro Selektion, z. B. von Ribozymen, d. h. RNA Molekülen oder RNA Analoga, welche die Fähigkeit zur sequenzspezifischen Spaltung anderer Nukleinsäuremoleküle aufweisen. Solche Selektionsexperimente können mit einem an einem festen Träger immobilisierten Zielmolekül durchgeführt werden. In neueren Ansätzen wird . dabei ein verkleinerter, wenig diverser Pool von Zielmolekülen in einem entsprechend ortsaufgelöst adressierbaren Array immobilisiert. Diese Methode ist jedoch problematisch, da derzeit keine Arrays mit einer hinreichend großen Sondenzahl zur Verfügung stehen und diese sich nicht flexibel an die jeweiligen Erfordernisse anpassen lassen. Die erfindungsgemäßen T-förmigen Strukturen bewirken hier auf Grund ihrer zusätzlichen Freiheitsgrade insbesondere bei der Selektion nach katalytischer Aktivität einen erheblichen Vorteil.
Darüber hinaus können als trifunktionelle Moleküle neben den genannten Synthesebausteinen auch andere Substanzen, z. B. beliebige lineare oder verzweigte aliphatische, olefinische bzw. aromatische trifunktionelle Kohlenwasserstoffe eingesetzt werden, die gegebenenfalls durch Heteroatome substituiert sind. Ebenso können Ethylen- bzw. Propylenglykolderivate verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Träger zur Festphasensynthese von Polymeren der allgemeinen Formel (II)
worin T ein fester Träger wie zuvor angegeben ist, L, X und Y wie zuvor definiert sind und (S) einen gegebenenfalls vorhandenen Spacer bedeutet.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Träger mit immobilisiertem Polymer der allgemeinen Formel (III)
worin T ein fester Träger wie zuvor angegeben ist, L und (S) wie zuvor angegeben sind und M1. . .Mn und M1'. . .Mm' monomere Einheiten eines Polymers sind, wobei n + m vorzugsweise 5 bis 100, besonders bevorzugt 5 bis 50 ist.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen (I) erfolgt durch z. B. ausgehend von einem der Ribonucleoside (A, G, C, U) durch Schützen der exocyclischen Aminofunktionen mittels "Transient Protection" nach Jones mit z. B. Phenoxyacetyl. Anschließend wird die primäre 5'-Hydroxygruppe z. B. mit DMT umgesetzt.
Bei der Einführung der zur ersten Schutzgruppe orthogonalen Funktionalität z. B. NPPOC wird ein Isomerengemisch erhalten. Nach Trennung der Isomeren wird die 2'-Position phosphityliert.

Claims (8)

1. Verfahren zur Synthese von Polymeren auf einem festen Träger umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines festen Trägers mit einer reaktiven Gruppe,
  • b) Koppeln eines trifunktionellen Synthesebausteins an die reaktive Gruppe des Trägers, wobei der trifunktionelle Synthesebaustein eine Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) ist:
    wobei X und Y zueinander orthogonale Schutzgruppen sind,
    L ein Baustein für die Synthese eines Polymers ist, und
    R eine Gruppe ist, die gegebenenfalls nach Aktivierung an die reaktive Gruppe des Trägers gekoppelt werden kann,
  • c) gerichtetes Aufbauen eines Polymerteilstranges, ausgehend von der Schutzgruppe X und
  • d) gerichtetes Aufbauen eines Polymerteilstranges, ausgehend von der Schutzgruppe Y.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung des trifunktionellen Synthesebausteins an den Träger über einen Spacer erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y Schutzgruppen sind, die durch chemische, photochemische oder enzymatische Reaktionen abgespalten werden können.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination der Schutzgruppen X und Y eine katalytisch abspaltbare Schutzgruppe und eine Trityl-Schutzgruppe umfasst.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass L aus Bausteinen für die Synthese von Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, Peptiden und Sacchariden ausgewählt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (d) als chemische Synthese oder als enzymatische Synthese durchgeführt wird.
7. Träger zur Festphasensynthese von Polymeren der allgemeinen Formel (II)
worin T ein fester Träger ist, L, X und Y wie in Anspruch 1 definiert ist und (S) einen gegebenenfalls vorhandenen Spacer bedeutet.
8. Träger mit immobilisiertem Polymer der allgemeinen Formel (III):
worin T ein fester Träger ist, L wie in Anspruch 1 definiert ist, (S) einem gegebenenfalls vorhandenen Spacer bedeutet und M1. . .Mn und M1'. . .Mm' monomere Einheiten eines Polymers sind.
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