DE3789812T2

DE3789812T2 - Poröser wafer zur segmentierten herstellung von bipolymeren.

Info

Publication number: DE3789812T2
Application number: DE3789812T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Beattie; James Frost
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1987-01-06
Filing date: 1987-12-30
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2007-12-31
Also published as: AU602753B2; NO882506L; DE3789812D1; EP0344177A4; EP0344177B1; NO882506D0; CN1039250A; AU1226088A; CA1322745C; IL84939A; EP0344177A1; BR8803544A; IL84939A0; WO1988005074A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemische Synthese von Biopolymeren und insbesondere eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Synthese von einer großen Zahl von Biopolymeren, beispielsweise Polynucleotiden, Polypeptiden und Polysacchariden.
Die Entwicklung von Verfahren zur chemischen Synthese von Biopolymeren einer beliebigen gewünschten Sequenz führte zu großen Fortschritten auf vielen Gebieten der Biologie und Medizin im Verlaufe der letzten Jahre. Beispielsweise führten physikalische und biochemische Untersuchungen der Struktur und der Wechselwirkungen synthetischer DNA-Fragmente zu wichtigen neuen Erkenntnissen hinsichtlich der molekularen Mechanismen genetischer Prozesse, einschließlich des DNA-Metabolismus und der Regulierung der Genexpression. Synthetische Polynucleotide spielten bei Untersuchungen einer genetischen Organisation durch ihre Verwendung als Primer für eine DNA-Sequenzierung und als Hybridisierungssonden, Linker und Adaptoren bei der Klonierung von Genen eine Schlüsselrolle. Eine zusätzliche Verwendung synthetischer Polynucleotide besteht in der DNA-Sondentechnologie in der Diagnose von Erkrankungen. Schließlich können synthetische Polynucleotide im Rahmen einer Genersetzungstherapie zur Heilung genetischer Störungen und in weiteren Genomkonstruktionsmaßnahmen zur Lieferung einer Krankheitsresistenz und Starvationsresistenz verwendet werden. Synthische Polynucleotide werden routinemäßig für eine stellengerichtete in vitro- Mutagenese, zur Untersuchung der Struktur/Funktionsbeziehungen in genetischen Regulationselementen und zur Bestimmung der Auswirkungen spezifischer Aminosäuresubstitutionen auf die Funktionen der Proteine verwendet. Die letztere Verwendung, als Protein Engineering bezeichnet, erleichtert nicht nur ein Verständnis des Mechanismus der Wirkung von Enzymen und weiteren Proteinen, sondern erlaubt auch die Schaffung funktionell überlegener Proteine und Arzneimittel, was zu bedeutenden Fortschritten in der Medizin, der Landwirtschaft und der Industrie führt. In ähnlicher Weise erfährt die Verfügbarkeit synthetischer Polypeptide mit definierter Sequenz gleichermaßen dramatische Fortschritte in der Proteinchemie, Immunologie, der Pharmakologie und der Biotechnologie.
In vielen genetischen Engineering-Projekten ist es notwendig, eine Große Zahl von eine unterschiedliche definierte Sequenz aufweisenden Polynucleotiden, manchmal Hunderte von unterschiedlichen Sequenzen in einem einzelnen Experiment, zu verwenden. In ähnlicher Weise erfordern einige Proteinchemieexperimente Hunderte von unterschiedlichen Peptidsequenzen. Zur Bestimmung der Nucleotidsequenz des menschlichen Genoms (ein in Kürze beginnendes Projekt unter Einbeziehung vieler Laboratorien) sind in der Größenordnung von 50 Millionen unterschiedliche Polynucleotidprimer erforderlich. Das letztere Bestreben ist zusammen mit zahlreichen weiteren wertvollen, durch einzelne Laboratorien durchführbaren Projekten aus ökonomischen Gesichtspunkten bei den gegenwärtigen Kosten synthetischer Polynucleotide für den Erfinder (5-20 $ pro Nucleotidrest) unpraktisch.
Die Fähigkeit zur chemischen Synthese von Polynucleotiden einer definierten Sequenz stammte von der Pionierleistung von Michelson und Todd in den fünfziger Jahren (A.M. Michelson und Sir A.R. Todd, "Nucleotides Part XXXII. Synthesis of a Dithymidine Dinucleotide Containing a 3':5' Internucleotide Linkage", J. Chem. Soc. 1955, Seiten 2632-2638).
Darin war ein Verfahren zur spezifischen chemischen Synthese von 5'-3' Internucleotidphosphordiester-Verknüpfungen entwickelt worden. Dieses Verfahren wurde im Verlauf der nächsten 20 Jahre weiterentwickelt und kulminierte in der Gesamtsynthese eines Gens für Transfer RNA durch Khorana und Mitarbeiter (H.G. Khorana, "Total Synthesis of a Gene", Science, Band 203, Seiten 614-625 (1979)). In jüngster Zeit wurde das Phosphatdiesterverfahren durch das Phosphattriesterverfahren (R.L. Letsinger und K.K. Ogilvie, "A Convenient Method for Stepwise Synthesis of Oligothymidylate Derivatives in Large-Scale Quantities", J. Am. Chem. Soc., Band 89, Seiten 4801-4803 (1967); S.A. Narong, R. Brousseau, H.M. Hsiung und J.J. Michniewicz, "Chemical Synthesis of Deoxyoligonucleotides by the Modified Triester Method", Meth. Enzymol., Band 65, Seiten 610-620 (1980)) und das Phosphittriesterverfahren (R.L. Letsinger, J.L. Finnan, G.A. Heavener und W.B. Lunsford, "Phosphite Coupling Procedure for Generating Internucleotide Links", J. Am. Chem. Soc., Band 97, Seiten 3278-3279 (1975); S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, "Deoxynucleotide Phosphoramidites - A New Class of Key Intermediates For Deoxypolynucleotide Synthesis", Tet. Lett., Band 22, Seiten 1859-1862 (1981)), die hinsichtlich einer schnelleren Synthese und weniger Nebenreaktionen von Vorteil sind, ersetzt. Diese beiden Verfahren können, wie ursprünglich geraten, in Lösung durchgeführt werden, sie wurden jedoch jüngst für eine Festphasensynthese von Polynucleotiden (M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, "Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support", J. Am. Chem. Soc., Band 103, Seiten 3185-3191 (1981); B.S. Sproat und W. Bannwarth, "Improved Synthesis of Oligodeoxynucleotides on Controlled Pore Glass Using Phosphotriester Chemistry and a Flow System", Tet. Lett., Band 24, Seiten 5771-5774 (1983)) angepaßt. Eine Festphasensynthese liefert den Vorteil einer größeren Synthesegeschwindigkeit, da die wachsende Kette kovalent an einen unlöslichen Träger gebunden ist. Dies gestattet ein Wegwaschen bzw. Wegspülen der Reagenzien zwischen den chemischen Schritten und einen Verzicht auf die Notwendigkeit zur Reinigung des Polynucleotidprodukts nach der jeweiligen Monomerenzugabe. Des weiteren gestattet eine Festphasensynthese eine Automation des Verfahrens, so daß jede Basenzugabe (über einen mehrere Schritte umfassenden Reaktionszyklus) in etwa 10 min bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden kann. Die hohe Kondensationswirksamkeit unter diesen Bedingungen (gegenwärtig > 99%) erlaubt die automatisierte Synthese von Polydesoxynucleotiden einer Kettenlänge von mehr als 100.
Zur Festphasenpolypeptidsynthese verwendete chemische Maßnahmen basieren häufig auf dem ursprünglichen Protokoll von Merrifield, das in erfolgreicher Weise zur Synthese der enzymatisch aktiven, 124 Reste umfassenden Ribonuclease A (B. Gutte und R.B. Merrifield, "The Synthesis of Ribonuclease A", J. Biol. Chem., Band 246, Seiten 1922-1941 (1971)) verwendet wurde. Dieses Vorgehen bedient sich standardisierter Polystyrol-Divinylbenzolträger, eines tert.-Butyloxycarbonyl (Boc)-Aminogruppenschutzes und einer DCC-aktivierten Kondensation mit symmetrischen Anhydridzwischenprodukten. Das Vorgehen kann in erfolgreicher Weise in automatischen Peptidsynthesevorrichtungen sowie in den im folgenden dargestellten multiplen gleichzeitigen Syntheseverfahren von Houghton oder Kubodera et al. verwendet werden.
Mehrere alternative Vorgehensweisen zur Peptidsynthese wurden vorgeschlagen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren (S.D. Auffret und L.G. Meade, "Alternative Strategies in Peptide Synthesis", Synthetic Peptides in Biology and Medicine, K. Alitalo, P. Partanen und A. Vaheri (Herausgeber), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985) bedient sich eines zusammengesetzten Polyamid-Kieselgurträgers (dieser erwies sich bei einer kontinuierlichen Strömungssynthese als ausgezeichnet), eines Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Aminogruppenschutzes und einer 1-Hydroxybenztriazolaktivierten Kondensation mit Pentafluorphenylester (PFPE)-Zwischenprodukten. Die hohe Stabilität der Zwischenprodukte des aktiven Esters bedingen eine zweckmäßigere Verwendung derselben für eine Peptidsynthese als die relativ instabilen Anhydridzwischenprodukte.
Jüngste Entwicklungen in der Polynucleotidsynthese, einschließlich Beschreibungen der chemischen Reaktionen, sind in den Übersichtsartikeln von John Smith ("Automated Solid Phase Oligodeoxyribonucleotide Synthesis", American Biotechnology Laboratory, Seiten 15-24 (Dezember 1983)) und Marvin Caruthers ("Gene Synthesis Machines: DNA Chemistry and Its Uses", Science, Band 230, Seiten 281-85 (1985)) zusammengefaßt. Ein besonders vielversprechender Fortschritt in der jüngsten Vergangenheit ist die Entwicklung kostenwirksamer Verfahren zur in situ-Erzeugung von Phosphoramidit-Zwischenprodukten aus billigen geschützten Nucleosiden (A.D. Barone, J.-Y. Tang und M.H. Caruthers, "In Situ Activation of Bis-Dialkylaminophosphines - A New Method for Synthesizing Deoxyoligonucleotides on Polymer Supports", Nucl. Acids Res., Band 12, Seiten 4051-4061 (1984); J. Nielsen, M. Taagaard, J.E. Marigg, J.H. van Boom und O. Dahl, "Application of 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite for In Situ Preparation of Deoxyribonucleoside Phosphoramidites and Their Use in Polymer - Supported Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides", Nucl. Acids Res., Band 14, Seiten 7391-7403 (1986)).
Eine weitere günstige Entwicklung in der jüngsten Zeit besteht in der Verwendung von Amidingruppen zum Schützen von exocyclischen Aminogruppen (z. B. M.H. Caruthers, L.J. McBride, L.P. Bracco und J.W. Dubendorff, "Studies on Nucleotide Chemistry 15. Synthesis of Oligodeoxynucleotides Using Amidine Protected Nucleosides", Nucleosides and Nucleotides, Band 4, Seiten 95-105 (1985)). Amidinschutzgruppen stabilisieren Desoxyadenosinreste gegen eine säurekatalysierte Guanidinabspaltung, die während der Enttritylierungsstufe des Synthesezyklus auftritt. Dadurch wird eine Synthese längerer Polynucleotide gestattet.
Schließlich wurde jüngst von einem Vorgehen zur Synthese von RNA-Polymeren auf Silikaträgern, einschließlich eines modifizierten Phosphoramiditansatzes, berichtet (R. Kierzek, M.H. Caruthers, C.E. Longfellow, D. Swinton, D.H. Turner und S.M. Freier, "Polymer-Supported RNA Synthesis and its Application to Test the Nearest - Neighbor Model for Duplex Stability", Biochemistry, Band 25, Seiten 7840-7846 (1986)).
Obwohl die obigen Verfahren die gleichzeitige Synthese einer oder einiger Polynucleotidsequenzen zu mäßigen Kosten gestatten, besteht ein großer Bedarf einer technologischen Entwicklung auf diesem Gebiet, um die Synthesekosten zu verringern und die gleichzeitige Synthese einer großen Zahl von Polynucleotidsequenzen zu gewährleisten. Ein Fortschritt in Richtung auf dieses Ziel gelang jüngst in Form von Verfahren und Vorrichtungen, die eine multiple gleichzeitige Synthese von Polynucleotiden oder Polypeptiden gewährleisten.
Frank et al. ("A New General Approach for the Simultaneous Chemical Synthesis of Large Numbers of Oligonucleotides: Segmented Solid Supports", Nucleic Acid Research, Band 11, Nr. 13, Seiten 4365-77 (1983)) verwendeten jüngst Cellulosefilter als einen Festphasenträger zur Polynucleotidsynthese. Ein geschütztes Nucleosid wurde durch eine 3'-o-Succinatverknüpfung kovalent an die Hydroxylgruppen des Filterpapiers gebunden und anschließend im Rahmen des vormals verwendeten Phosphattriestervorgehens mit freien zu Perlen geformten Festphasenträgermaterialien verlängert. In diesem Artikel berichteten die Autoren von einer Synthese zweier Octamere und schlugen vor, daß durch Stapeln der Papierfilter in vier unterschiedlichen Reaktionssäulen, die zur Zugabe von A-, G-, C- und T-Resten zu der wachsenden Kette und zum Sortieren der Scheiben zwischen den Reaktionszyklen vorgesehen waren, eine große Zahl unterschiedlicher Polynucleotidsequenzen gleichzeitig synthetisiert werden könnte. Die Autoren zeigten, daß die beiden nach diesem Vorgehen synthetisierten Octamere (vorhanden in derselben Reaktionssäule während der meisten Zyklen) in merklicher Ausbeute erhalten wurden, wobei eine DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß die Produkte aus den erwarteten Nucleosidsequenzen bestanden und nicht miteinander kontaminiert waren.
Die vorgeschlagene Verwendung des Filterpapierverfahrens zur simultanen Synthese zahlreicher Sequenzen wurde später von Matthes et al. eingeführt ("Simultaneous Rapid Chemical Synthesis of Over One Hundred Polynucleotides on a Microscale", The EMBO Journal, Band 3, Nr. 4, Seiten 801-05 (1984)). Diese Autoren bedienten sich eines dem von Frank et al. berichteten Verfahren ähnlichen Phosphattriesterverfahrens zur gleichzeitigen Synthese von mehr als einhundert Polynucleotidsequenzen in einer Zeitdauer von 2 Wochen. Einige Beschränkungen für das Verfahren von Matthes et al. bestehen jedoch. Infolge einer niedrigen Beladungskapazität der Filterpapierscheiben und ihrer ungünstigen Masseübertragungseigenschaften (dies führt zu einem unter dem optimalen Reagenzzugang liegenden Zugang der Reagenzien zu der wachsenden Kette) ist die Kupplungswirksamkeit in jeder Stufe, verglichen mit der, die bei den Standardfestphasensyntheseverfahren erreicht wird, gering, und es wird nur eine sehr geringe Menge des gewünschten Polynucleotids einer begrenzten Kettenlänge (bis zu etwa 20 Struktureinheiten) gebildet. Das Produkt ist stark durch kürzere Fehlsequenzen kontaminiert und muß vor Verwendung durch zeitraubende Verfahren gereinigt werden. Nichtsdestotrotz besitzt dieses Vorgehen das Potential zur Herstellung großer Zahlen von Sequenzen zu niedrigen Kosten. Dieses Verfahren wurde offenbar von vielen Laboratorien versuchsweise durchgeführt, nur sehr wenige Laboratorien waren jedoch offenbar in der Lage, unter Verwendung der Technik geeignete Produkte zu erhalten.
Ein sehr neuer Bericht (W. Bannwarth und P. Laiza, "A System for the Simultaneous Chemical Synthesis of Different DNA Fragments on Solid Support", DNA, Band 5, Seiten 413-419 (1986)) beschreibt eine mechanische Vorrichtung, die mehrere unterschiedliche Polynucleotide gleichzeitig zu synthetisieren vermag. Die Vorrichtung besteht aus einer Reihe von stapelbaren drehbaren Metallscheiben mit jeweils - in radial symmetrischer Anordnung - einer einzelnen Reaktionskammer plus einer Zahl von engen "Bypass"-Löchern. Die gestapelten Metallscheiben können zur Herstellung einer vertikalen Anordnung aller zum Zusatz eines gegebenen Nucleotidrests zu den darin enthaltenen Trägern gebundenen DNA-Ketten vorgesehenen Reaktionskammern, die durch Bypass-Löcher verbunden sind, umlaufen gelassen werden. Somit wird durch eine geeignete Rotation der Metallscheiben im Anschluß an jeden Reaktionszyklus (erzeugt durch sequentielles Strömenlassen der Reagenzien und Lösungsmittel durch das System) eine unterschiedliche DNA-Sequenz für jede der gestapelten Metallscheiben synthetisiert. Der Hauptvorteil dieser Vorrichtung gegenüber dem Segmentfilterpapierverfahren besteht in einer höheren Kupplungswirksamkeit, die durch die Anordnung von gesteuerte Poren aufweisenden Glasträgern in den Reaktionskammern ermöglicht wird. Unter Verwendung der Phosphoramiditchemie wurden DNA-Ketten einer Länge bis zu 36 Resten hergestellt. Ein weiterer Vorteil der Ausgestaltung ist ihr Potential für eine Automatisierung. Der Hauptnachteil besteht in der relativ niedrigen Zahl einer gleichzeitigen Synthese (maximal 12 DNA-Fragmente wurden gleichzeitig hergestellt).
Ein ähnliches System, das auch auf der Technik eines zur Rotation fähigen Elements basiert, umfaßt gestapelte Platten mit jeweils einer Reaktionskammer und Bypass-Kanälen (Cole, EP-A-164 206; Hamill, US-A-4 728 502). Dieses System weist dem obigen System (Bannwarth und Laiza) ähnliche Merkmale auf. Beide Systeme sind nicht ohne Schwierigkeiten für eine Peptidsynthese einsetzbar, wobei beide Systeme infolge der innewohnenden Totvolumina der Bypass-Kanäle eine verringerte Reagenzökonomie aufweisen.
Kubodera et al. (US-A-3 647 390) beschreiben eine sich der oben beschriebenen chemischen Maßnahmen bedienende Vorrichtung zur Festphasensynthese von Polypeptiden. Diese Vorrichtung kann automatisiert werden. Sie ist jedoch nur zu einer einzelnen Synthese pro Zeiteinheit in der Lage und nicht ohne Schwierigkeiten, wenn überhaupt, für eine in hohem Maße multiple gleichzeitige Synthese einsetzbar.
In einem weiteren Ansatz zur gleichzeitigen Synthese unterschiedlicher Polypeptide (Houghton, "General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides: Specificity of Antigen-Antibody Interaction of the Level of Individual Amino Acids", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 82, Seiten 5131-35 (August 1985)) bediente sich Houghton Polypropylenmaschenbeutel, die für eine Standardfestphasensynthese von Peptiden verwendete Festphasenträgerharze enthalten. Durch Einbringen mehrerer dieser Harz enthaltenden Beutel in eine einzelne gerührte Reaktionskammer vermochten alle Peptidsequenzen, denen eine bestimmte Aminosäure zuzusetzen war, gleichzeitig die Kupplungsreaktion einzugehen. Die Autoren bedienten sich dieses Vorgehens zur gleichzeitigen Synthese von 248 unterschiedlichen, 13 Struktureinheiten umfassenden Peptiden, die in einer der Ausbeute, die im Rahmen von Standardeinzelpeptidfestphasenverfahren erreicht wird, vergleichbaren Ausbeute erhalten wurden. In dieser Arbeit bestand jedes der 13 Struktureinheiten aufweisenden Peptide in der Tat aus einer mit der "Kontrollsequenz" (mit Ausnahme des Ersatzes einer einzelnen Aminosäure) identischen Sequenz. Somit wurde bei jeder Aminosäurezugabe der größte Teil der Harz enthaltenden Beutel in dasselbe gerührte Reaktionsgefäß eingebracht, während nur diejenigen Harze mit Peptiden, an denen eine einzelne Aminosäure in der Stellung in der Sequenz hinzugefügt werden sollte, getrennt von der Masse des Materials umgesetzt wurden. Obwohl die in Houghtens ursprünglicher Arbeit hergestellten "unterschiedlichen" Peptidsequenzen jeweils aus derselben Sequenz (wobei eine einzelne Aminosäure gegenüber der "Kontrollsequenz" verändert war), bestanden, wurde vorgeschlagen, daß durch Verwendung mehrerer gerührter Reaktionsgefäße mit jeweils vielen Harz enthaltenden Beuteln das Vorgehen für eine gleichzeitige Synthese einer großen Zahl von vollständig einzigartigen Peptidsequenzen verwendet werden könnte. Houghtens "Teebeutel"-Verfahren, einschließlich einer Beschreibung seiner Verwendung zur gleichzeitigen Synthese von 120 vollständig unterschiedlichen, 15 Reste umfassenden Peptiden, wird des weiteren in einem neuen Artikel beschrieben (Houghten et al., "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis: The Rapid Preparation of Large Numbers of Discrete Peptides for Biological Immunological, and Methodological Studies", Biotechniques, Band 4, Nr. 6, Seiten 525-28 (1986)).
Zwei Schwierigkeiten können eine Verwendung des "Teebeutel"-Verfahrens nach Houghten zur gleichzeitigen Synthese einer großen Zahl von Polynucleotidsequenzen verhindern. Die verschließbaren Polypropylenmaschenbeutel sind nicht ausreichend inert, um im Rahmen der gegenwärtig für eine Polynucleotidsynthese verwendeten Phosphattriester- und Phosphittriesterverfahren verwendet zu werden. Aus inerten Materialien, beispielsweise TEFLON®, konstruierte trägerhaltige poröse Beutel sind schwierig, wenn überhaupt, zu verschließen bzw. zu versiegeln. Dies macht es schwierig, einen Verlust an Festphasenträger aus den Beuteln während einer Synthese zu verhindern. Ein ernsteres Problem besteht darin, daß bei dem Festphasenvorgehen zur Polynucleotidsynthese in der Säule oberhalb des Trägerbettes ausreichend Raum vorhanden sein muß, so daß bei Einpumpen der Lösungsmittel und Reagenzien von unten der Träger durch den nach oben gerichteten Strom angehoben wird. Dies führt zu dem für nahezu quantitative chemische Reaktionen geforderten notwendigen Massentransfer innerhalb der Perlen. Die physikalischen Eigenschaften der nicht starren "Teebeutel" würden das notwendige Anheben der Trägermaterialien während einer Passage der Lösungsmittel und Reagenzien durch die Säule nicht gestatten.
Aus der US-A-4 301 139 sind ein mehrschichtiges säulenchromatographisches, ein spezifisches Binden untersuchendes Verfahren, eine Testvorrichtung und ein Testbesteck zur Verwendung derselben bekannt. Die Testvorrichtung umfaßt ein vollständig mit unterschiedlichen, übereinander angeordneten Betten aus festem Material gefülltes Rohr.
Aus der US-A-4 155 846 ist eine Vorrichtung mit einer Säule mit mehreren in einer Abfolge angeordneten Segmentkammern, die mit einem zur Adsorption fähigen Gel oder Ionenaustauschharz zur chromatographischen Verwendung gefüllt sind, bekannt.
Aus der US-A-3 763 879 sind aus einzelnen Verbindungsteilen bestehende Kombinationssäulen, die Systeme zur Durchführung chemischer Verfahren, beispielsweise einer Chromatographie, die trägergebundene Reagenzien umfassen, liefern, bekannt.
Aus der US-A-3 692 669 ist eine Vorrichtung zur Mikrotrockensäulenchromatographie mit einem mit einer gepackten porenfreien Säule von Teilchen eines trockenen chromatographischen Adsorptionsmittels gefüllten Röhrenelement und einer porösen Vorrichtung an mindestens einem Ende hiervon bekannt.
Folglich besteht infolge der Nachteile der gegenwärtigen Vorrichtungen und Maßnahmen ein Bedarf nach einer Vorrichtung und einem Vorgehen zur schnellen gleichzeitigen Synthese großer Zahlen eines beliebigen Biopolymers unterschiedlicher Sequenzen in hohen Ausbeuten und zu niedrigen Kosten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es folglich, eine verbesserte Vorrichtung zur chemischen Synthese von Biopolymeren anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung zur gleichzeitigen Synthese einer großen Zahl von Biopolymeren anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, für eine gleichzeitige Herstellung großer Zahlen von eine definierte Sequenz aufweisenden Biopolymeren zu sehr niedrigen Kosten zu sorgen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine zur gleichzeitigen Festphasensynthese beliebiger Biopolymere anwendbare Vorrichtung anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, für eine gleichzeitige Herstellung großer Zahlen von eine definierte Sequenz aufweisenden Biopolymeren in hohen Ausbeuten zu sorgen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte, Segmente aufweisende Vorrichtung zur gleichzeitigen Herstellung von Biopolymeren anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung zur gleichzeitigen Herstellung großer Zahlen von Biopolymeren, die geringere Mengen an Reagenzien und Lösungsmitteln erfordert, anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung zur gleichzeitigen Herstellung großer Zahlen von Biopolymeren, die weniger Synthesezeit erfordert, anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung zur gleichzeitigen Herstellung großer Zahlen von Biopolymeren, in der die zahlreichen Segmente, im folgenden als "Scheiben" bezeichnet, nach jedem Reaktionszyklus einfach voneinander getrennt werden können, anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Festphasenträgersegment ("Scheibe") zur chemischen Synthese von Biopolymeren bereitzustellen.
Die obigen Aufgaben lassen sich gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung durch eine Segmente aufweisende Scheibensynthesevorrichtung zur Herstellung mehrerer Biopolymerer definierter Sequenz, die ein Lösungsmittelabgabesystem, mindestens eine mit dem Lösungsmittelabgabesystem verbundene Säule zur Gewährleistung eines Lösungsmittel- und Reagenzflusses durch die Säule und mindestens eine in der Säule, in der eine Polymersynthese stattfindet, angeordnete Scheibe umfaßt, lösen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Synthesevorrichtung mindestens vier Säulen zur Aufnahme von vier Reagenzien und eine Mehrzahl von Scheiben in jeder Säule, wobei jede Scheibe für die Synthese eines Polymeren definierter Sequenz sorgt. Die Vorrichtung kann in Abhängigkeit von den Benutzerbedürfnissen entweder automatisch, halbautomatisch oder manuell betrieben werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung mehrere gestapelte Scheiben, die miteinander unter Bildung einer Säule verbunden sind, wobei das Lösungsmittelabgabesystem mit der Säule zur Gewährleistung eines Flusses durch die Säule verbunden ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Scheibe zur Synthese von Biopolymeren, beispielsweise Polynucleotiden, Polypeptiden und Polysacchariden, mit einem Festphasenträgermaterial, einem Festhaltering zum Festhalten des Trägermaterials in einer durch die Innenwände des Festhalterings gebildeten Kammer und Mitteln, beispielsweise einer Membran oder Fritte, zur Gewährleistung eines Stromes durch den Festhaltering zum Trägermaterial und zur Unterbindung einer Wanderung des Trägermaterials aus dem Festhaltering heraus bereitgestellt. Vorzugsweise umfaßt der Festhaltering eine innenliegende eingeschlossene Reaktionskammer zur Aufnahme und zum Festhalten des Trägermaterials, wobei der Festhaltering an beiden Enden offen ist. Die poröse Strömungsvorrichtung besteht aus einem im wesentlichen inerten porösen Material. Sie ist vorzugsweise an beiden Enden des Festhalterings vorgesehen und erstreckt sich über die Innenkammer, um die Kammer zu verschließen. Darüber hinaus umfaßt die Scheibe vorzugsweise eine inerte Befestigungsvorrichtung zum Befestigen der Trägermaterialien an der Festhaltevorrichtung.
Das Festphasenträgermaterial wird in vorteilhafter Weise aus der Gruppe Siliziumdioxid, einem gesteuerte Poren aufweisenden Glas (CPG), Polystyroldivinylbenzol, Polyamidharzen, Polyamidkieselgurverbundharzen, eine Makronetzstruktur aufweisenden Harzen, Benzyhydrylaminharzen und makroporösen Kunststoffharzen, wie MONOBEADS-Harz (ein von Pharmacia hergestelltes Harz), ausgewählt. Das poröse Trägermaterial umfaßt ein derivatisiertes Material, das einen kovalent gebundenen Rest, beispielsweise ein Nucleosid im Falle einer Polynucleotidsynthese umfaßt.
Die poröse Membran oder Fritte umfaßt vorzugsweise eine flexible Membran aus TEFLON® oder anderen inerten Fluorkohlenstoffen oder starre Fritten aus Glas, nichtrostendem Stahl oder Titan. Die Porosität der Membran oder Fritte ist ausreichend groß, um einen Strom durch die Scheibe zu gewährleisten, und ausreichend gering, um das poröse Trägermaterial in der Scheibe festzuhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Scheibe ein Festphasenträgermaterial, einen inneren Gehäusering mit einer Innenreaktionskammer, die durch die Innenwände des Rings gebildet ist, zur Aufnahme und zum Festhalten des Trägermaterials, wobei der Gehäusering an beiden Enden offen ist, eine an den beiden offenen Enden des Gehäuserings angeordnete und sich über die offenen Enden des Gehäuserings erstreckende inerte poröse Membran eines über dem des Innenrings liegenden Durchmessers und zwei Außenringe mit einem etwas über dem des Innenrings liegenden Innendurchmesser, wobei die Innenringe den Innenring umgeben und die Kanten der Membran zwischen dem Innenring und den äußeren Ringen sichern. Besonders bevorzugt ist eine äußere Befestigungsvorrichtung, die einen um die Außenfläche des jeweiligen Endes des Gehäuserings angeordneten Festhaltering umfaßt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Scheibe ein Festphasenträgermaterial, einen inerten zylindrischen Gehäusering, der an beiden Enden offen ist, und eine in die Einkerbungen nahe der offenen Enden des Gehäuserings eingeschnappte inerte kreisförmige Fritte.
Die erfindungsgemäße Scheibenausgestaltung sorgt für eine gleichzeitige Herstellung von zahlreichen Biopolymeren. Die Geometrie des Trägermaterials führt zu einer hohen Kupplungswirksamkeit, wobei die starren Scheiben nach jedem Reaktionszyklus einfach zu sortieren sind. Diese Anordnung gewährleistet die gleichzeitige Synthese von zahlreichen unterschiedlichen Sequenzen. Durch Verwendung eines Trägermaterials wechselnder Kapazität (Derivatisierungsdichte) und durch Verändern der Höhe jeder Scheibe kann der Synthesemaßstab von weniger als 0,1 uMol auf mehr als 10 uMol pro Segment verändert werden. Des weiteren können in jeder Säule Segmente unterschiedlicher Höhen gestapelt werden, wodurch die gleichzeitige Synthese von Produkten in stark unterschiedlichem Maßstab gewährleistet wird. Die Flexibilität und Wirksamkeit dieses Ansatzes sollte die Synthese großer Zahlen von Biopolymeren bei deutlich verringerten Kosten gestatten. Beispielsweise betragen die gegenwärtigen Kosten einer Polynucleotidsynthese unter idealen Bedingungen (beispielsweise bei Vorhandensein eines Syntheseservices im Haus) typischerweise 10-15 $ pro Rest. Mit der segmentierten Scheibenvorrichtung sind die Kosten deutlich niedriger und liegen möglicherweise bei nur 0,50-2 $ pro Rest. Da die Kosten gegenwärtig der begrenzende Faktor bei der Verwendung von synthetischen Biopolymeren bleiben, stellt die Entwicklung der Segmente aufweisenden Scheibenvorrichtung einen weiteren "Quantensprung" bei der Verwendung von Biopolymeren in der wissenschaftlichen Forschung dar und sollte somit zukünftige Entwicklungen auf dem Gebiet der Biomedizin beschleunigen.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen im Zusammenhang mit den im folgenden kurz beschriebenen Zeichnungen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In den Zeichnungen bedeuten:
Fig. 1 eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Scheibe;
Fig. 2 eine Querschnittsansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Scheibe in ihrem zusammengebauten Zustand;
Fig. 3 eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Scheibe in ihrem zusammengebauten Zustand;
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Säulenanordnung der erfindungsgemäßen Segmente aufweisenden Scheibensynthesevorrichtung;
Fig. 5 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Segmente aufweisenden Scheibensynthesevorrichtung und
Fig. 6, 7 und 8 Photographien einer UV-Schattensichtbarmachung von im Rahmen der vorliegenden Erfindung gebildeter DNA.
Alle Bezugszahlen in den Figuren sind dahingehend konsistent, daß dasselbe Teil in unterschiedlichen Figuren immer dieselbe Nummer aufweist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung wird zuerst anhand der Zeichnungen beschrieben. An verschiedenen Punkten in der folgenden Offenbarung wird die vorliegende Erfindung anhand einer Polynucleotidsynthese diskutiert. Die Erfindung, wie festgestellt, ist in gleicher Weise auf die Herstellung eines beliebigen auf Festphasenträger synthetisierbaren Biopolymeren anwendbar und dafür geeignet. Darüber hinaus beschreiben und veranschaulichen die folgende Diskussion und die Zeichnungen hauptsächlich eine spezifische Scheibenausgestaltung. Es ist selbstverständlich, daß diese Beschreibung lediglich zur Veranschaulichung dient und weitere Scheibenausgestaltungen möglich sind und unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
Fig. 1 veranschaulicht die erfindungsgemäße Scheibe 10 vor einem Zusammenbau, d. h. in einer auseinandergezogenen schematischen Darstellung. Die Scheibe umfaßt eine äußere Befestigungsvorrichtung mit einem oberen und unteren Festhaltering 12 bzw. 14. Zwischen den gegenüberliegenden Festhalteringen 12 und 14 ist ein Innengehäusering 16, der zusammen mit Membranen 18 und 20 als Reaktionskammer dient, angeordnet. Die Scheibe umfaßt des weiteren poröse Materialien oder Membranen 18 und 20, die an jedem Ende des Gehäuserings 16 angeordnet sind und sich darüber erstrecken. Diese porösen Materialien oder Membranen 18 sind zwischen dem Gehäusering 16 und den Festhalteringen 12 bzw. 14 befestigt.
Der Gehäusering 16 besitzt einen Außendurchmesser, der etwas unter dem Innendurchmesser der Festhalteringe 12 und 14 liegt. Die porösen Membranen 18 und 20 weisen Außendurchmesser auf, die über den Außendurchmessern der Festhalteringe liegen.
Es ist selbstverständlich, daß ein hier zur Bezeichnung sowohl des Innengehäuserings als auch der Festhalteringe verwendeter Ring sowohl kreisförmige, rechteckige, quadratische als auch andere unterschiedliche geometrische Ringausgestaltungen umfaßt. Das wichtige Ausgestaltungskriterium besteht darin, daß die Ringe-einen hohlen Innenraum zum Festhalten der Reaktantenkomponenten, wie im folgenden beschrieben, aufweisen.
Die Scheibe 10 ist in ihrem zusammengebauten Zustand in Fig. 2 und 3 dargestellt. Zum Zusammenbau der Scheibe wird die poröse Membran 20 derart auf den unteren Festhaltering 14 aufgebracht, daß sich die Kanten der Membran über den Ring hinaus über seinen gesamten Außenumfang erstrecken. Der Gehäusering 16 wird anschließend auf die untere Membran 20 aufgebracht und in den unteren Festhaltering 14 geschoben. Die Durchmesser der Ringe 12, 14 und 16 sind so gewählt, daß sie mit der Membran zwischen den Ringen eine flüssigkeitsdichte Versiegelung bilden. Nach Einbringen des Festphasenträgermaterials in den Gehäusering werden die obere Membran 18, der Festhaltering 12 und der Gehäusering 16 in ähnlicher Weise durch Anordnen der Membran 18 über dem Ring 16 und Schieben des Rings 12 an seine Stelle abgedichtet. Neben der Erzeugung einer flüssigkeitsdichten Versiegelung erleichtert die Ausgestaltung ein festes Halten der Membranen an ihrer Stelle während der chemischen Reaktion. Dieses Ergebnis läßt sich durch Überlappen der Kanten der Membranen über den Gehäusering 16 und Verankern der Membranen zwischen den Festhalteringen 12 und 14 und dem Gehäusering 16 erreichen.
Wie die Fig. 2 und 3 veranschaulichen, erstrecken sich in der zusammengebauten Scheibe 10 die Membranen 18 und 20 über die Enden des inneren Gehäuserings 16, wobei die Enden der Membranen zwischen den äußeren Festhalteringen 12 und 14 und dem inneren Gehäusering 16 gehalten werden.
Die zusammengebaute Scheibe enthält die Reaktantenkomponenten 22. Die Reaktantenkomponenten 22 sind Festphasenträger, die durch kovalentes Binden eines Restes, beispielsweise eines Nucleosids, an dem festen Träger über einen organischen Abstandsarm derivatisiert sind. Der Rest oder die erste Base, von der aus ein Polymerwachstum beginnt, wird somit von der Oberfläche des Trägermaterials abgetrennt. Die Reaktantenkomponenten 22 werden vor dem Versiegeln der Scheibe mit der Membran 18 und dem Festhaltering 12 in den inneren Gehäusering 16 eingebracht. Somit bilden der Gehäusering 16 und die Membranen 18 und 20 zusammen eine Reaktionskammer für die Reaktantenkomponenten 22.
Wie oben ausgeführt, ist die obige Offenbarung auf eine bestimmte Scheibenausgestaltung gerichtet. Es sei darauf hingewiesen, daß zahlreiche Scheibenausgestaltungen möglich sind und unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Beispielsweise könnte die Scheibe eine Ausgestaltung mit Schnappverschlüssen oder Schraubverschlüssen umfassen. Insbesondere könnte eine alternative Ausführungsform der Scheibe 10 starre poröse Fritten, die in Einkerbungen in der Innenfläche des Gehäuserings nahe seiner oberen und unteren Kante eingeschnappt sind, aufweisen.
Die Scheibe ist eine starre, chemisch inerte Kammer, so daß sie die bei der Synthese der Biopolymeren verwendeten Chemikalien nicht stört oder mit ihnen reagiert. Die äußeren Festhalteringe und der innere Gehäusering lassen sich aus einer Vielzahl von inerten Materialien, beispielsweise TEFLON® und weiteren Fluorkohlenstoffen, wie KEVLAR® und KALREZ® herstellen.
Die Größe der Scheiben kann über einen breiten Bereich schwanken. Zur Synthese von Milligrammengen der Polynucleotide liegen der Innendurchmesser des inneren Festhalterings vorzugsweise im Bereich von etwa 2 - 10 mm und die Höhe im Bereich von etwa 2 - 10 mm. Zur Herstellung von Grammengen des Produkts betragen der Innendurchmesser vorzugsweise etwa 20 - 100 mm und die Höhe etwa 20 - 100 mm. Des weiteren kann die Höhe der Säule der gestapelten Scheiben zur Gewährleistung einer gleichzeitigen Synthese von großen Zahlen unterschiedlicher Polynucleotidketten erhöht werden. Der Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet erkennt selbstverständlich, daß die Größe der Scheiben in Abhängigkeit von den spezifischen Merkmalen der speziellen Synthese über oder unter den obigen Abmessungen liegen kann. Des weiteren erkennt der Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet, daß die Säulenabmessungen in Abhängigkeit von dem zu Synthetisierenden Biopolymer und dem verwendeten Festphasenträger schwanken. Bei der Herstellung von Peptiden liegen die Scheibenabmessungen im allgemeinen nahe der Obergrenze dieser Bereiche.
Die den Strom der Reagenzien durch die Scheiben gewährleistenden porösen Materialien werden auch aus einem chemisch inerten Material gebildet. Beispiele für sicher inerte Materialien sind TEFLON® und weitere Fluorkohlenstoffmaterialien, wie KEVLAR®, Frittglas oder gesintertes Glas und Fritten aus Titan und nichtrostendem Stahl. Die Porengröße kann schwanken, sie wird jedoch so gewählt, daß sie einen ausreichenden Strom der Reagenzien und Waschlösungen durch die Scheibe gewährleistet, während das Trägermaterial und die wachsenden Biopolymerketten in den Scheiben festgehalten werden. Bei Verwendung von CPG-Trägern, die typischerweise einen Durchmesser von 120 - 180 um aufweisen, sollte die Porengröße 50 - 100 um betragen. Das poröse Material kann eine Vielzahl von Ausgestaltungen annehmen, solange der notwendige Fluß und die Einschließung gewährleistet sind. Wie hier veranschaulicht und beschrieben, kann das poröse Material in Form einer flexiblen Membran, einer starren Frittenstruktur usw. vorliegen.
Der Festphasenträger, auf dem die Biopolymerkette gebildet wird, kann aus den verschiedensten bekannten Trägern ausgewählt werden. Beispiele für Polynucleotidsyntheseträger sind Polystyroldivinylbenzol (DVB), Polyamid-Kieselgur, Siliziumdioxid, gesteuerte Poren aufweisendes Glas (CPG) und Kunststoffharze, wie MONOBEADS (ein von Pharmacia hergestelltes Harz). CPG, Siliziumdioxid und MONOBEADS sind als Festphasenträger besonders bevorzugt, da sie starr sind, d. h. nicht quellen oder sich zusammenziehen. Beispiele für Polypeptidsyntheseträger sind Polystyrol- und Vinylbenzolharze, Polyamidharze, Polyamid/Kieselgur-Harze, Benzhydrylaminharze und eine Makronetzstruktur aufweisende Harze.
Trägermaterialien großer Porengröße, beispielsweise 20 - 200 nm, gewährleisten, daß die Reagenzien gut zu der wachsenden Kette gelangen und die Reaktanten in wirksamer Weise ausgewaschen werden können. Ferner gewährleisten diese Träger einen Zusammenbau relativ langer Ketten, beispielsweise von 50 - 200 Resten, ohne eine sterische Hinderung zwischen den Polymeren.
Die in die Scheibe eingebrachte Menge des Trägermaterials 22 kann schwanken. Bei der Bestimmung der Trägermaterialzusatzmenge zu berücksichtigende Faktoren sind die Menge der notwendigen DNA, RNA, des notwendigen Polypeptids, Polysaccharids oder weiteren Biopolymers, die Strömungsgeschwindigkeit und das Derivatisierungsausmaß des Festphasenträgers, beispielsweise die Mikromole Monomerrest pro Gramm Träger. Vorteilhafte Ergebnisse lassen sich erhalten, wenn die Scheiben zu zwei Drittel bis drei Viertel gefüllt sind und somit ein Mischen und ein mögliches Quellen gestatten. Die Verwendung starrer Festphasenträger sehr großer Porengröße, beispielsweise von Siliziumdioxid einer Porengröße von 3000 - 4000 Å, gewährleistet einen ausgezeichneten Massentransfer in den Trägern, derart, daß die Scheiben vollständig mit derivatisierten Trägern gefüllt werden können.
Bezugnehmend auf Fig. 4 wird die einmal zusammengebaute Scheibe in eine Säule 24 eingebaut, durch die zur Erzeugung eines Reaktionszyklus Reagenzien und Waschlösungen geleitet werden. Die Säule 24 ist so ausgestaltet, daß sie eine Zahl von Scheiben 10 aufzunehmen vermag. Wie in den Fig. 4 und 5 dargestellt, sorgt eine Zuführeinrichtung 26 unter Verwendung von beispielsweise Argondruck für ein Durchleiten der Reagenzien und der Waschlösung durch die Säule 24 und die Scheiben 10. Vorzugsweise erfolgt das Durchströmen durch die Säule von unten nach oben zur Erleichterung der Reaktion, indem dadurch ein Vermischen und Verteilen des porösen Trägermaterials in einer gegebenen Scheibe bewirkt wird. Typischerweise ist die Zuführeinrichtung mit mindestens vier den vier Basen Cytosin (C), Thymin (T), Guanin (G) und Adenin (A) entsprechenden parallelen Säulen verbunden. Weitere Säulen können vorgesehen sein, wenn modifizierte Basen oder Basengemische bei der Synthese verwendet werden sollen. Eine beliebige Scheibenzahl kann in jeder Säule in Abhängigkeit von der Zahl der herzustellenden Biopolymersequenzen angeordnet werden. Beispielsweise ist es möglich, nur eine Scheibe in einer Säule anzuordnen. Dies ist jedoch in typischer Weise kostspielig und ineffizient und, wie oben ausgeführt, ein Problem bei einigen der gegenwärtig verfügbaren Ausgestaltungsformen. Typischerweise kann die Scheibenzahl in der Größenordnung von 15 - 25 pro Säule liegen. Weniger Scheiben oder mehr Scheiben können jedoch verwendet werden.
Die ausgewählte Scheibenzahl muß selbstverständlich einen ausreichenden Strom durch die Säule gewährleisten. In dieser Hinsicht sollten die Außendurchmesser der Scheiben so gewählt sein, daß sie einen Paßsitz mit der Innensäulenfläche gewährleisten, so daß ein Strom durch die Scheiben selbst und nicht entlang der Seiten der Säule erzwungen wird. Wenn zusätzliche Strömungsgeschwindigkeit erforderlich ist, kann man sich eines unterschiedlichen Lösungsmittelzuführsystems bedienen. Ferner schwankt die Zahl der Scheiben selbstverständlich in Abhängigkeit von der wechselnden Säulenhöhe.
Die Säule 24 kann aus einem beliebigen inerten Material hergestellt sein. Beispielsweise sind Glas und nichtrostender Stahl zwei bevorzugte Materialien. Die Säule umfaßt typischerweise einen Stempel 28, der für wechselnde Zahlen und Höhen der Scheiben in der Säule sorgt.
In einer weiteren Ausführungsform schnappen die Scheiben unter Bildung einer Segmente aufweisenden Scheibensäule von selbst miteinander zusammen, wodurch die Notwendigkeit einer getrennten Trägersäule hinfällig wird. In dieser Ausführungsform wäre das Abgabesystem 26 direkt mit der Segmente aufweisenden Scheibensäule verbunden.
Bei der Synthese sind, wie oben ausgeführt, eine Reihe von die Scheiben enthaltenden Säulen aufgebaut. Jede Säule ist mit einem Reagenz zur Restezugabe ausgestattet. Beispielsweise sind bei der DNA-Synthese eine Säule zur Zugabe von Cytosin (C), eine weitere für Thymin (T), eine weitere für Guanin (G) und eine weitere für Adenin (A) vorhanden. In ähnlicher Weise kann für eine RNA-Synthese das Thymin durch das zur Zugabe von Uracil (U) notwendige Reagenz ersetzt sein. Wie oben dargestellt, ist die Zahl der verwendeten Säulen jedoch nicht wesentlich für die vorliegende Erfindung. Eine einzelne Säule reicht aus, dies verlängert jedoch die zur Vollendung der Biopolymersynthese erforderliche Zeit. Die Reagenzien müssen für jede Synthese verschoben werden und weniger Proben können in einer Säule als in vier Säulen synthetisiert werden. Somit erleichtert die Verwendung mehrerer Säulen die Zahl der durchzuführenden Reaktionen und erhöht die Wirksamkeit des Vorgehens. Ein weiteres Verfahren umfaßt die Zugabe von Dimeren, Trimeren usw. Bei dieser Synthese werden weitere Säulen angefügt. Beispielsweise würden bei einem Dimer 20 Säulen verwendet werden, d. h. eine Säule für jedes Dimer, das zugesetzt werden kann, und eine Säule für jede einzelne zuzusetzende Nucleosidbase.
Um auf das DNA-Verfahren zurückzukehren, hier werden die Scheiben selektiv in Abhängigkeit von der ersten zuzusetzenden Base in die T-, G-, C- oder A-Säule eingebaut. Nach dem geeigneten Durchleiten der Reagenzien und Chemikalien zur Zugabe dieser Base zu der Polynucleotidkette (dies stellt einen Reaktionszyklus dar) werden die Scheiben aus der Säule entfernt, für die nächste Synthesestufe sortiert, in die geeignete Säule eingebaut und der Syntheseschritt wiederholt. Dieses Vorgehen wird wiederholt, bis die gewünschten Polynucleotidsequenzen synthetisiert sind. Somit durchläuft bei Verwendung unterschiedlicher Säulen zur Basenzugabe jede Scheibe ihr eigenes Synthesemuster. Dieses Vorgehen gewährleistet die gleichzeitige Synthese vieler unterschiedlicher Polynucleotide.
Die vorliegende Erfindung kann zur Herstellung eines beliebigen Biopolymeren im Rahmen einer Festphasensynthese verwendet werden. Besonders bevorzugte Synthesen sind die Synthese von Polynucleotiden, Polypeptiden und Polysacchariden durch Festphasenverfahren, vorausgesetzt, daß diese Verfahren, wie erfindungsgemäß realisiert, sich einer Durchströmausgestaltung bedienen. Eine besonders bevorzugte Festphasenroute zur Peptidsynthese unter Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in dem oben erwähnten Fmoc-Pentafluorphenylesterverfahren unter Einsatz von Polyamid-Kieselgurträgern.
Das Vorgehen ist auf die gleichzeitige Synthese einer Vielzahl von sequenzdefinierten Biopolymeren im Rahmen von manuellen, halbautomatischen oder vollautomatischen Verfahren anwendbar. Beispielsweise kann eine durch einen Mikrocomputer gesteuerte halbautomatische Vorrichtung eingesetzt werden. Ein Programmeditor erlaubt dem Operator die Steuerung der Abgabe aller Reagenzien an die Festphasenträger. Der Computer kann ferner den Operator in jeder Stufe mit Instruktionen zum Sortieren der Scheiben und Anordnen derselben in der richtigen Säule versorgen. In dem halbautomatischen System führt der Operator diese letzteren Funktionen durch. Selbstverständlich erkennt der Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet, daß das vollautomatische System bevorzugt ist. In diesem System erfolgen das Sortieren der Scheiben und ihre nachfolgende Anordnung in der nächsten Säule maschinell.
Die Segmente aufweisende Scheibenvorrichtung ist speziell zur Biopolymersynthese im Rahmen von Festphasendurchströmverfahren ausgestaltet. Der Vorteil einer Festphasenchemie bei der Synthese von Biopolymeren besteht darin, daß die stufenweise Zugabe zur Bildung eines Biopolymeren stark vereinfacht wird, da das Produkt nicht nach jeder Kondensationsstufe gereinigt werden muß. Die Reaktanten und Reagenzien können in einfacher Weise weggewaschen werden. Dieser Festphasensyntheseansatz wurde für eine Reihe von bei der Biopolymersynthese verwendeten unterschiedlichen Chemien entwickelt. Die Segmente aufweisende Scheibe kann in allen diesen Verfahren verwendet werden.
Bei der Synthese von Polynucleotiden wurde die Wirksamkeit der Reaktion in jeder Stufe der Festphasensynthese mit zwischen etwa 95 und mehr als 99% bestimmt, wobei die Zykluszeit pro zugesetztes Nucleosid etwa 5 - 30 min betrug. Dieser Ansatz ist bevorzugt, wenn die Menge des gewünschten Produkts im Milligrammbereich, was für die meisten Anwendungen reichlich ist, liegt. Darüber hinaus ist die Festphasensynthese zur Synthese von gemischten Sonden-Polynucleotiden, bei denen in bestimmten Stellungen in der Sequenz ein Restegemisch vorliegt, in hohem Maße bevorzugt.
Das Phosphoramiditverfahren einer Festphasensynthese (s. das folgende Diagramm) wird vorzugsweise erfindungsgemäß verwendet. Detritylierung Kondensation (gemessen bei 498 nm) Freisetzung vom Träger nach N Zyklen Entfernung der Phosphatmethylschutzgruppen Entfernung des OLIGO aus dem festen Träger Entfernung der Aminschutzgruppen Entfernung der terminalen DMTr-Gruppe Umkehrphasen-HPLC Ionenaustausch Gelelektrophorese
Das aktivierte Zwischenprodukt in diesem Verfahren ist 5'-DMT-2'-Desoxynucleosid-3'-phosphoramidit. Das Verfahren beginnt mit einer kovalenten Verknüpfung der 3'-Hydroxylgruppe des ersten Nucleosids mit dem festen Träger über einen langkettigen Alkylabstandsarm.
Die säurelabile Dimethoxytritylgruppe (DMTr) wird durch Behandlung mit verdünnter Aichloressigsäure vom 5'-OH des trägergebundenen Nucleosids abgespalten. Nucleosidphosphoramidite (in 10- bis 20fachem molaren Überschuß gegenüber dem trägergebundenen Nucleosid 5'-OH) werden durch Protonierung ihres Stickstoffatoms unter Verwendung von Tetrazol unter wasserfreien Bedingungen aktiviert, worauf - wie in Stufe 2 dargestellt - eine Kondensation erfolgt. Nach Beendigung der jeweiligen nachfolgenden Kupplung wird das reaktive Phosphit unter Verwendung einer Jodlösung in Tetrahydrofuran und Wasser in ein stabileres Phosphat umgewandelt (Stufe 4). Gewünschtenfalls kann anschließend zur Acetylierung der 5'-Hydroxylgruppen, die bei der vorangehenden Kupplung mit dem aktivierten Phosphoramidit nicht reagiert haben, eine "Capping"-Reaktion durchgeführt (mit Essigsäureanhydriddimethylaminopyridin/Lutidin, Stufe 5), um eine Verlängerung der abgestumpften und unsinnigen (durcheinandergeworfenen) Sequenzen zu verhindern.
Am Ende eines jeden Synthesezyklus bleiben die exozyklischen Aminogruppen von A, C und G amidgeschützt, die Internucleotidphosphatgruppen werden methylverestert, und das 3'-OH- Ende der wachsenden Kette bleibt mit dem Träger succinatverknüpft. Vor der Zugabe des nächsten Rests wird die Detritylierungsstufe wiederholt. Das brillantorange DMTr-Kation kann spektroskopisch zur Berechnung der Kupplungswirksamkeit quantitativ bestimmt werden. Unter Verwendung des Segmentscheibenverfahrens lassen sich Kupplungseffizienzen im Bereich von etwa 95 - 99% erreichen.
Am Ende der Synthese werden die Phosphatmethylschutzgruppen durch Thiophenoxidionen, die sich in Gegenwart von Triethylamin aus Thiophenol bilden, abgespalten (Stufe 6). Diese Stufe ist nicht erforderlich, wenn bei der Synthese zwei Cyanoethylphosphoramidite verwendet werden. Anschließend werden die alkalilabilen Acylgruppen (sie schützen die exozyklischen Aminogruppen von A, G und C) und die kovalente Verknüpfung mit dem festen Träger durch Behandlung mit wäßrigem Ammonium gespalten (Stufen 7 und 8). Wenn die DMTr- Gruppe verbleibt, wird sie durch konzentrierte Essigsäure abgespalten (Stufe 9).
Wie oben ausgeführt, wird zur Polynucleotidsynthese im allgemeinen ein weiteres Verfahren (das Phosphotriesterverfahren) verwendet. Obwohl das Phosphotriesterverfahren zu einer Verwendung in der vorliegenden Erfindung angepaßt werden könnte, ist es aufgrund der längeren Zykluszeiten und der höheren Anforderungen an wasserfreie Bedingungen, die während eines Sortierens der Scheiben schwierig einzuhalten sind, weniger bevorzugt.
Die oben erwähnten jüngsten Entwicklungen in der Festphasenpolynucleotidsynthese, einschließlich der in situ-Phosphoramiditherstellung der Amidinschutzgruppen und der Ribopolymersynthese, könnten erfindungsgemäß eingesetzt werden. Des weiteren wäre es für den Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet naheliegend, sich der vorliegenden Erfindung bei zukünftigen Entwicklungen in der Biopolymersynthesechemie, einschließlich Verbesserungen der Kondensations-, Schutz- und Entschützungsreaktionen oder der Festphasenträger, zu bedienen.
Die Verwendung der obigen Syntheseverfahren bei der Segmentscheibensynthese von Biopolymeren kann mit Hilfe im Handel erhältlicher Systeme automatisiert werden. Beispielsweise kann eine automatische Vorrichtung mit vier Säulen, die Synthesevorrichtung Cruachem Modell PS200, durch einen IBM PC- kompatiblen Mikrocomputer gesteuert werden. Der Programmeditor gestattet dem Operator die Abgabe aller Reagenzien an den Festphasenträger zu steuern. Dies ist für die Entwicklung des bei dem Segmentscheibenverfahren zu verwendenden Reaktionszyklus erforderlich. Des weiteren kann der Computer durch Verfolgen (Überwachen) der Reihenfolge der Scheibeneinsätze in die Säulen den Sortierprozeß erleichtern. Zur Steuerung der Anordnung jeder Scheibe in der geeigneten Säule während der Synthese bedient man sich eines Computerprogramms. Somit zeigt ein Ausdruck an, welche Scheiben (identifiziert durch Nummern) in einer gegebenen Säule nach jedem Reaktionszyklus anzuordnen sind, so daß die Scheiben leicht sortiert und die abgetrennten Scheiben in Säulen für die geeignete Synthesereaktionssequenz eingebracht werden können. Die Verwendung eines Computerprogramms vermindert die Fehlermenge und erhöht die Verläßlichkeit der Synthese. Darüber hinaus ist auch die Entwicklung einer automatischen Sortiervorrichtung, die auch durch den Computer gesteuert und mit der vorhandenen Synthesevorrichtung schnittstellenverbunden wird, möglich, um für eine vollständig automatische Synthese von Biopolymeren unter Verwendung der Segmente aufweisenden Scheibenvorrichtung zu sorgen.
Die vorliegende Erfindung wird des weiteren anhand der folgenden Beispiele beschrieben.

BEISPIEL I

Dieses Beispiel beschreibt das zur segmentierten Synthese von Polynucleotiden in chemisch inerten porösen Scheiben verwendete Standardvorgehen. Details spezifischer Anwendungen dieses Vorgehens sind in den folgenden Beispielen angegeben.

A. Bedienung eines interaktiven Synthese-Ansatz/Aufbau- Programms

Zu synthetisierende DNA-Sequenzen werden unter Verwendung eines Textverarbeitungsprogramms in einen IBM-kompatiblen Computer eingegeben (in 5' → 3' Richtung). Die Sequenzdateien werden in einem Nicht-Dokumentdatei gespeichert und im Format benamt. Nach Eingabe der Sequenzen wird das Wafer- DNA-Setup-Programm (geschrieben in Basic) mit den Sequenzdateien in dem Diskettenlaufwerk abgearbeitet. Das Wafer-DNA- Programm bzw. das Scheiben-DNA-Programm prüft die Sequenzdateien und erzeugt eine Hard-Copy der folgenden Information:
(i) Eine Auflistung aller eingegebenen Sequenzen zusammen mit den jeweils zugeordneten Identifikationszahlen und -namen,
(ii) eine Auflistung der mit dem jeweiligen Typ des derivatisierten CPG-Trägers (der die 3'-terminale Base in jeder Sequenz festlegt) zu ladenden numerierten Scheiben und
(iii) ein Schema zur Steuerung des Sortierens der Scheiben nach jedem Reaktionszyklus.

B. Reagenzherstellung, Scheibenzusammenbau und Aufbau der Cruachem Modell PS200 DNA-Synthesevorrichtung

Unter Verwendung der mit der Cruachem-DNA-Synthesevorrichtung mitgelieferten Software wurde ein mit "Wafer-CE20" bezeichnetes Verfahren geschaffen. Das Verfahren ist das folgende:
Verfahren: Wafer-Ce20
Reservoir 1: Acetonitril
Reservoir 2: DMAP/THF
Reservoir 3: Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin
Reservoir 4: Jod/THF/Lutidin/Wasser
Reservoir 5: Acetonitril
Reservoir 6: DCA/DCE
Verfahren: Wafer-Ce20

Ester Zyklus

Stufe 1: Waschen mit Acetonitril, feststehende Dauer 2 : 15 min
Stufe 2: Entblocken mit DCA/DCE-Base, variable Dauer
A Dauer 1 : 30 min
G Dauer 1 : 30 min
C Dauer 2 : 30 min
T Dauer 2 : 30 min
Purin (A/G) Dauer 2 : 30 min
Pyrimidin (T/C) Dauer 2 : 30 min
N (A/C/G/T) Dauer 2 : 30 min
Stufe 3: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer 1 : 30 min.

Normalzyklus

Stufe 1: Reaktion, festgelegte Dauer = 4 Minuten
Stufe 2: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 1 : 30 min
Stufe 3: Waschen mit Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 4: Waschen mit DMAP/THF, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 5: Waschen mit Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 6: Waschen mit DMAP/THF, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 7: Waschen mit Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 8: Waschen mit DMAP/THF, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 9: Waschen mit Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 10: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 0,12 Minuten
Stufe 11: Capping/Funktionalisieren, festgelegte Dauer = 1 : 30 min
Stufe 12: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 1 : 30 min
Stufe 13: Waschen mit Jod/THF/Lutidin/Wasser, festgelegte Dauer = 2 Minuten
Stufe 14: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 1 : 30 min
Stufe 15: Capping/Funktionalisieren, festgelegte Dauer = 60 Minuten
Stufe 16: Entblocken mit DCA/DCE-Base, variable Dauer
A Dauer 1 : 30 min
G Dauer 1 : 30 min
C Dauer 2 : 30 min
T Dauer 2 : 30 min
Purin (A/G) Dauer 1 : 30 min
Pyrimidin (T/C) Dauer 2 : 30 min
N (A/C/G/T) Dauer 2 : 30 min
Stufe 17: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 1 : 30 min.

Schlußzyklus

Stufe 1: Reaktion, festgelegte Dauer = 4 Minuten
Stufe 2: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 1 : 30
Stufe 3: Waschen mit Jod/THF/Lutidin/Wasser, festgelegte Dauer = 2 Minuten
Stufe 4: Waschen mit Acetonitril, festgelegte Dauer = 4 Minuten.
Vor Beginn der Synthese ist es notwendig, die Scheiben zusammenzubauen. Bei jeder Scheibe wird der Bodenteil der Scheibe zuerst derart zusammengebaut, daß das derivatisierte, gesteuerte Poren aufweisende Glas (CPG)-Trägermaterial durch die Oberseite eingeführt werden kann. Etwa 18 mg des geeigneten CPGs werden entsprechend der Anweisung durch den Ausdruck des Wafer-DNA-Setup-Programms, eingetragen. Schließlich wird die Scheibe durch Aufbringen eines weiteren Stücks des porösen TEFLON®-Tuchs über die Reaktionskammer und sicheres Befestigen desselben mit dem äußeren TEFLON®-Festhaltering verschlossen. Die Scheiben werden entsprechend der Anweisung in Stufe 2 des Ausdrucks des Wafer-DNA-Setup- Programms in die geeigneten Säulen eingebaut.
Um die Synthesevorrichtung betriebsbereit zu machen, werden die Reservoirs mit ihren jeweiligen Reagenzien gefüllt und die Lösungsmittelleitungen gemäß dem mit der Cruachem-Synthesevorrichtung mitgelieferten Bedienungsprogramm gespült. Die letzten herzustellenden Reagenzien sind die Phosphoramidite und das sublimierte Tetrazol. Tabelle I beschreibt die zur Polynucleotidsynthese im Rahmen des Segmentscheibenverfahrens verwendeten Reagenzien.
Normalzyklus: Wafer-CE20-Verfahren bzw. Scheiben-CE20- Verfahren.
Lösungsmittel/Reagenzien für eine Säule von 10 Scheiben
1. Acetonitril - 12,5 ml (mit Lösungsmittelordnerständer mit einem 1 l Reservoir)
2. 6,5% Dimethylaminopyridin in THF (g/v) - 1,2 ml
3. Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin - 1,6 ml
4. Jod (0,1M in Wasser/Lutidin/THF (1/10/4)) - 4 ml
5. 3% Dichloressigsäure/Dichlorethan (g/v) - 4 ml
Lösungsmittelströmungsgeschwindigkeit: 2 ml/min
Durchschnittliche Zykluszeit: 18 min
Synthesemaßstab: 0,5 - 1 uMol pro Scheibe
Träger: Nucleosid-CPG, typischerweise 15 - 20 mg pro Scheibe
Monomerlösung: 0,1 M CE Phosphoramidit
6,67 ml Acetonitril/0,5 g T-Phosphoramidit
6,00 ml Acetonitril/0,5 g G-Phosphoramidit
5,80 ml Acetonitril/0,5 g A-Phosphoramidit
6,00 ml Acetonitril/0,5 g C-Phosphoramidit
Katalysator: 0,5M Tetrazol (20 ml Acetonitril/0,7 g Tetrazol)
Gemisch aus 0,5 ml Monomer und 0,5 ml Katalysator wird in die Säule injiziert.

C. Synthese der Polynucleotide

Unter Verwendung der PS200 Cruachem-DNA-Synthesevorrichtung und der vorliegenden Bedienungssoftware, des Wafer-CE20-Verfahrens und der in Fig. 5 dargestellten Segmentscheibensynthesevorrichtung wird Polynucleotidsegmentsynthese unter Verwendung der oben beschriebenen 2-Cyanoethylphosphoramiditchemie durchgeführt. Nach Verbinden der Scheiben enthaltenden Säulen mit der Synthesevorrichtung wird entsprechend dem Verfahren ("Erster Zyklus", Stufen 1 bis 3) der erste Zyklus, der lediglich aus einer Detritylierung und einem Waschen besteht, durchgeführt. Ein Beginn jedes nachfolgenden Zyklus erfolgt nach Injektion der Phosphoramidite unmittelbar vor Stufe 1 ("Normalzyklus"). Stufe 15 ("Normalzyklus") ist keine Wiederholung der Capping-Stufe 11, sondern eher eine variable "Pausen"-Zeit, während der die Scheiben entsprechend der Anordnung des Ausdrucks des Wafer-DNA-Setup- Programms sortiert werden. In jedem normalen Zyklus werden nach Beendigung des Sortierens der Scheiben und abermaligem Verbinden der Säulen mit der Synthesevorrichtung der Synthesezyklus wieder aufgenommen und eine Detritylierung und ein Waschen durchgeführt. Der abschließende Zyklus entspricht dem Normalzyklus, mit der Ausnahme, daß auf ein Capping und eine Detritylierung verzichtet wird. Gewünschtenfalls können die Scheiben nach Beendigung der Synthese in allen Scheiben wieder in Säulen eingebaut und zur Entfernung der restlichen 5'-DMT-Schutzgruppen einer Detritylierung unterworfen werden.
Nach beendeter Synthese werden der Scheibeninhalt in Ampullen mit Schraubverschluß geleert und die DNA vom Träger abgespalten. Anschließend wird im Rahmen von allgemein bekannten Verfahren entsprechend den Instruktionen im Bedienungshandbuch Cruachem PS200 die Blockierung entfernt und gereinigt.
Das obige Vorgehen erfolgte zahlreiche Male, wobei an einem einzigen Tag in einer gleichzeitigen Synthese (in einem Maßstab von 0,5 - 1,0 uMol) zwischen 3 und 79 unterschiedliche DNA-Sequenzen einer Länge im Bereich von 15 bis 25 Resten erhalten wurden. Die Kupplungseffizienz in jeder Stufe betrug typischerweise etwa 95%, wobei die DNA-Sequenzen durch das Maxam-Gilbert-Sequenzierverfahren bestätigt wurden.

BEISPIEL II

Simultane Herstellung von drei Testpolynucleotiden

Zur Bestimmung der Einsetzbarkeit der Segmente aufweisenden Scheibensynthesevorrichtung zur Biopolymersynthese erfolgte eine gleichzeitige Synthese von drei Pentadecameren unter Verwendung der in den Fig. 1 bis 5 dargestellten Vorrichtung und des in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Vorgehens, wie im folgenden detailliert beschrieben. Die Nucleotidsequenzen der Test-DNA-Moleküle waren die folgenden:
1. 5'-GAGCCATCAAGCCAG-3'
2. 5'-GCTGCAGAGAGGCCA-3'
3. 5'-GAGGTGTTGGAGCTG-3'
Die Details der Synthese waren die folgenden:
Reagenzbezugsquelle: Cruachem.
Synthesemaßstab und Scheibenabmessungen: Jede Scheibe (10 mm Außendurchmesser · 4 mm Höhe) enthielt 18 mg Nucleosid-CPG (etwa 0,6 uMol) und war aus Komponenten der folgenden Abmessungen (vgl. Fig. 1 bis 3) zusammengebaut: Poröses Teflon®-Tuch, 12 mm Durchmesser; Innengehäusering, 5 mm Innendurchmesser · 4 mm Höhe; Außenfesthalteringe, 10 mm Außendurchmesser · 2 mm Höhe; Innenvolumen 0,050 ml.
Reaktionszyklus und Reagenz/Lösungsmittel-Verwendung: In diesem Experiment wurden das Standard-"CE Phosphoramidit"- Protokoll und der Reaktionszyklus gemäß dem Instruktionshandbuch der Cruachem PS200 Synthesevorrichtung zu einer allgemein bekannten Bedienung verwendet. Die "stehenden" Stufen des Reaktionszyklus (Kondensationsstufe 1 und Capping-Stufe 11) erfolgten die in Beispiel 1 für das "Wafer-CE20"-Verfahren angegebene Zeit lang (4,0 bzw. 1,5 min). Stufe 1 wurde durch Vermischen von 0,1 ml 0,1M CE-Phosphoramidit und 0,1 ml 0,5M Tetrazol (beide in wasserfreiem Acetonitril) in einer Spritze und Injizieren des Gemisches in jede Säule gestartet. Die verbleibenden "Strömungs"-Stufen im Reaktionszyklus erfolgten (bei 2 ml/min) die Hälfte der in Beispiel I für den "Normylzyklus" des "Wafer-CE20"-Verfahrens spezifizierten Zeit lang. Die Säulen wurden direkt vor der Sortierstufe 15 kurz mit Argon gespült. Die durchschnittliche Zykluszeit betrugt 11 min. Die Menge der pro Zyklus verbrauchten Reagenzien pro Scheibe zusammen mit den ungefähren Kosten für eine Basenzugabe (bezogen auf den Katalogpreis von Nucleosid-CPG, die Reagenzien
und Lösungsmittel) waren die folgenden:
3,7 ml Acetonitril
0,4 ml 6,5% Dimethylaminopyridin in THF
0,5 ml Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin
1,2 ml Jod (0,1M in Wasser/Lutidin/THF (1/10/4))
1,2 ml 6,3% Dichloressigsäure/Dichlorethan
0,06 ml 0,5M Tetrazol in Acetonitril
0,06 ml 0.M 2-Cyanoethylphosphoramitit in Acetonitril.
Kosten pro Basenzugabe: 1,98 $, verglichen mit 5,42 $/Base bei Durchführung der Synthese mit Hilfe der Cruachem PS200- Synthesevorrichtung bei Betrieb im Standardmodus (nach Stand der Technik).
Postsynthese in Form einer Entschützung, DNA-Reinigung und Analyse: Der abschließende Detritylierungsschritt erfolgte auf der Säule (wie in Stufe 16 des "Normalzyklus"). Nach Entleeren des Scheibeninhalts in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wurden 1 ml frisches konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben und die Röhrchen mit einem Deckel verschlossen und gemischt. Nach 20 min bei Raumtemperatur (während dieser Zeit erfolgte eine Spaltung der Polynucleotide vom CPG) wurde die Flüssigkeit zusammen mit 1 ml zusätzlichem konzentriertem Ammoniumhydroxid in eine Glasampulle mit Schraubverschluß (15 mm Außendurchmesser · 45 mm Höhe) überführt, mit einer Teflon®-ausgekleideten Kappe verschlossen und 6 - 15 h lang bei 55ºC inkubiert (zur Entschützung exozyklischer Aminogruppen von C, A und G). Der Ammoniak wurde im Vakuum mit Hilfe einer Savant SpeedVac-Aufkonzentriervorrichtung (1 h Wasserstrahlvakuum, anschließend über Nacht Hochvakuum) entfernt. Die trockene DNA wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst, anschließend durch Elektrophorese (20% Polyacrylamid, 7M Harnstoff) und durch UV-Schatten sichtbar gemacht. Aus 20 A&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten der rohen Reaktionsprodukte gebildete Gele sind in Fig. 6 dargestellt.
Die oberste Bande in jedem Gel zeigt das gewünschte, die volle Länge aufweisende Produkt. Die schwachen unteren Banden zeigen "Fehl"-Sequenzen und die schwarze Bande am unteren Ende den Bromphenolblaumarkerfarbstoff. Diese Gele waren mit denen, die mit auf einer automatischen Synthesevorrichtung Applied Biosystems Modell 380A (unter Verwendung eines allgemein bekannten Phosphoramiditvorgehens) hergestellten ähnlichen DNA-Produkten, wobei die Kupplungseffizienzen nach der Standardtritylfreisetzungsuntersuchung mit 98 - 99% bestimmt wurden, erhalten wurden, vergleichbar. Somit beträgt die durchschnittliche Kupplungseffizienz bei der Synthese der drei Pentadecamere mit Hilfe der Segmente aufweisenden Scheibensynthesevorrichtung schätzungsweise etwa 98 - 99%.
Anmerkungen: Diese DNA-Produkte wurden in erfolgreicher Weise 5'-phosphoryliert (unter Verwendung einer T4-Polynucleotidkinase) und als Hybridisierungssonden im Rahmen von allgemein bekannten Vorgehensweisen verwendet. Die hohe Ausbeute und Qualität sowie die geringeren Kosten des Produkts demonstrieren die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung zur gleichzeitigen Polynucleotidsynthese. Des weiteren besteht eine wichtige Erkenntnis darin, daß das von Hand nach jedem Reaktionszyklus durchgeführte Sortierverfahren die Synthese nicht in negativer Weise beeinflußt.

BEISPIEL III

Gleichzeitige Synthese von 62 Bipolymeren

Zur Bestimmung der Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung für eine gleichzeitige Synthese von großen Zahlen von Biopolymeren wurden 62 unterschiedliche DNA-Nonadecamere unter Verwendung der in den Fig. 1 bis 5 dargestellten Vorrichtung und der allgemeinen, in Beispiel 1 angegebenen Vorgehensweise, wie im folgenden detailliert beschrieben, synthetisiert. Die Nucleotidsequenzen der Test-DNA-Moleküle waren die folgenden:
Die Details der Synthese sind die folgenden:
Reagenzquelle: Cruachem.
Synthesemaßstab und Scheibenabmessungen: Gemäß Beispiel II wurden 18 mg derivatisiertes CPG (etwa 0,6 uMol) in jede Scheibe einer Größe von 10 mm Außendurchmesser · 4 mm Höhe eingebracht.
Reaktionszyklus: Die Synthese erfolgte nach dem "Wafer-ce20"-Verfahren (Reaktionszyklus gemäß Beispiel 1). Ein Gemisch von 0,5 ml 0,5M Tetrazol und 0,5 ml 0,1M 2-Cyanoethylphosphoramidit wurde nach oben durch die Säule der Scheiben zur Einleitung der Stufe 1 injiziert. Die Dauer eines durchschnittlichen Reaktionszyklus betrug 18 min. Die für ein Sortieren (Stufe 15) erforderliche Durchschnittszeit betrug 12 min.
Pro Reaktionszyklus verwendete Reagenzien und Lösungsmittel: Die pro Basenzugabe erforderlichen Reagenz- und Lösungsmittelmengen pro Scheibe und die Synthesekosten pro Basenzugabe waren die folgenden:
0,80 ml Acetonitril
0,08 ml 6,5% Dimethylaminopyridin in THF
0,10 ml Essigsäureanhydrid/THF/Lutidin
0,26 ml Jod (0,1M in Wasser/Lutidin/THF (1/10/4))
0,26 ml 6,3% Dichloressigsäure/Dichlorethan
0,03 ml 0,5M Tetrazol in Acetonitril
0,03 ml 0,1M 2-Cyanoethylphosphoramidit in Acetonitril.
Die Kosten pro Basenzugabe betrugen 0,65 $. Dieser Wert ist etwa 1/8 der Synthesekosten, die für die Synthese derselben Polynucleotide mit Hilfe der Cruachem PS200-Synthesevorrichtung oder mit Hilfe der vollständig automatischen Vorrichtung Applied Biosystems Modell 380A bei Betrieb im Standardmodus (nach Stand der Technik) anfallen würden.
Die für eine Synthese von 62 Polynucleotiden erforderliche Gesamtzeit: Die Synthese wurde in einem einzigen Tag im Verlauf von 12 h beendet. Diese Zeit steht etwa 10 Tagen gegenüber, die für die Herstellung dieser Zahl von Polynucleotiden unter Verwendung einer vollautomatischen 3-Säulensynthesevorrichtung Applied Biosystems Modell 380A bei Durchführung von zwei Synthesen pro Säule und Tag erforderlich sind.
Entschützung, DNA-Reinigung und Analyse nach der Synthese: Die Vorgehen entsprachen den in Beispiel II angegebenen Vorgehensweisen. Die in den Fig. 7 und 8 angegebenen "UV-Schatten"-Gele sind Beispiele derjenigen, die mit 20 A&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten der in diesem Experiment gebildeten Rohreaktionsprodukte erhalten wurden.
Basierend auf den Ergebnissen der UV-Schattengelanalysen und der Quantifizierung der gereinigten DNA-Produkte wurde die durchschnittliche Kupplungseffizienz während dieser gleichzeitigen Mehrfachsynthese mit 92 - 98% bestimmt.
Anmerkungen: Die gereinigten Polynucleotide wurden in allgemein bekannten Vorgehensweisen für eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese verwendet. Während dieser Arbeit wurden die DNA-Produkte erfolgreich 5'-phosphoryliert (unter Verwendung einer T4-Polynucleotidkinase), an die DNA-Matrizen hybridisiert und durch DNA-Polymerase verlängert. Somit wurden DNA-Produkte hoher Qualität in hohen Ausbeuten und zu deutlich verringerten Kosten und bei deutlich verringerter Zeit, verglichen mit den Vorgehen des Standes der Technik, hergestellt.
Somit sorgen die erfindungsgemäßen Scheiben für die Synthese von großen Zahlen sequenzdefinierter Biopolymere. Die Geometrie des Trägermaterials führt zu hohen Kupplungseffizienzen. Die starren Scheiben erleichtern ein Sortieren nach jedem Reaktionszyklus. Besonders vorteilhaft sind die geringeren Synthesekosten, die durch die vorliegende Erfindung realisiert werden, und die für die Synthese einer großen Zahl von Biopolymeren erforderliche kürzere Zeit. Die durch das Segmentscheibenverfahren geschaffenen ökonomischen und Zeiteinsparungsvorteile sollten die Nachfrage nach dem Handelsprodukt und zukünftigen Brennstoffentwicklungen auf dem Gebiet der Biomedizin erhöhen.
Die vorliegende Erfindung ist folglich gut dafür geeignet, die Aufgaben zu erfüllen und die erwähnten sowie die in dieser Beschreibung inhärent vorhandenen Ziele und Vorteile zu erreichen. Während gegenwärtig bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen hier zum Zwecke der Offenbarung angegeben wurden, lassen sich zahlreiche, dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet ohne weiteres naheliegende Veränderungen, die vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfaßt werden, bezüglich der Konstruktionsdetails und Anordnung der Teile durchführen.

Claims

1. Modulare, chemisch inerte, zum aneinander anliegenden Stapeln in Mehrfachanordnung ausgestattete Scheibe zur Synthese von Biopolymeren, wobei in gestapelten Anordnung unabhängige obere und untere poröse Mittel aufweist, umfassend

ein Festphasenträgermaterial mit der Fähigkeit zum kovalenten Binden eines Biopolymerrests,

einen Gehäusering mit innerer und äußerer Wand zum Festhalten des Trägermaterials in einer von den Innenwänden gebildeten und sich koaxial durch den Gehäusering hindurch erstreckenden Kammer und an jedem Ende des Gehäuserings angeordnete obere und untere poröse Mittel, die einen Fluß durch den Gehäusering zu dem Trägermaterial gewährleisten und eine Wanderung des Trägermaterials aus dem Gehäusering verhindern.

2. Scheibe nach Anspruch 1, wobei der an beiden Enden offene Gehäusering eine innere, umschlossene Reaktionskammer zur Aufnahme und zum Festhalten des Trägermaterials umfaßt.

3. Scheibe nach Anspruch 2, wobei die poröse Fließvorrichtung an jedem Ende des Gehäuserings vorgesehene und sich durch die offenen Enden erstreckende getrennte Einrichtungen zum Umschließen der Kammer umfaßt.

4. Scheibe nach Anspruch 1, des weiteren umfassend eine Befestigungsvorrichtung zum Befestigen der porösen Fließvorrichtung an dem Gehäusering.

5. Scheibe nach Anspruch 4, wobei die Befestigungsvorrichtung chemisch inert ist.

6. Scheibe nach Anspruch 1, wobei der Gehäusering chemisch inert ist.

7. Scheibe nach Anspruch 1, wobei das Festphasenträgermaterial aus Siliziumdioxid, einem gesteuerte Poren aufweisenden Glas, Polystyroldivinylbenzol, Polyamidkieselgur, benzylverknüpften Polystyrolharzen, durch eine Abstandsgruppe verknüpften Styrolharzen, Polyamidharzen oder eine Makronetzstruktur aufweisenden Harzen besteht.

8. Scheibe nach Anspruch 7, wobei das Festphasenträgermaterial gesteuerte Poren aufweisendes Glas umfaßt.

9. Scheibe nach Anspruch 1, wobei das Festphasenträgermaterial ein einen kovalent gebundenen Rest umfassendes abgeleitetes Material umfaßt.

10. Scheibe nach Anspruch 1, wobei die poröse Fließvorrichtung ein Fluorkohlenstoffmaterial, Fritte- oder Sinterglas, Titan- oder nichtrostende Stahlfritten umfaßt.

11. Scheibe nach Anspruch 1, wobei die Porosität der Fließvorrichtung zur Gewährleistung eines Fließens durch die Scheibe ausreichend groß und zum Festhalten des Festphasenträgermaterials in der Scheibe ausreichend klein ist.

12. Scheibe nach Anspruch 3, wobei die poröse Fließvorrichtung in den Gehäusering durch Druck eingepaßt ist.

13. Modulare, chemisch inerte, zum aneinanderliegenden Stapeln in Mehrfachanordnung ausgestaltete Scheibe zur Synthese von Biopolymeren, wobei jede Scheibe bei Vorliegen in einer gestapelten Anordnung unabhängige obere und untere poröse Mittel aufweist, umfassend

einen inneren Gehäusering mit Innen- und Außenwänden mit einer durch die Innenwände des Rings gebildeten und sich koaxial durch diesen hindurch erstreckenden inneren Reaktionskammer zur Aufnahme und zum Festhalten des Trägermaterials, wobei der Gehäusering an beiden Enden offen ist,

eine an jedem der offenen Enden des inneren Gehäuserings angeordnete und sich durch diesen hindurch erstreckende inerte poröse Membran eines über dem Außendurchmesser des Gehäuserings liegenden Durchmessers, so daß sich die Membran über die Außenwand hinaus erstreckt, und

zwei äußere hülsenartige Ringe mit einem Innendurchmesser, der etwas über dem des Gehäuserings und der Dicke der Membran liegt, zum Befestigen der Kanten der Membran zwischen dem Gehäusering und den äußeren hülsenartigen Ringen.

14. Unterteilte Scheibensynthesevorrichtung zur Synthese von mehreren sequenzdefinierten Biopolymeren, umfassend

ein Lösungsmittelabgabesystem,

mindestens eine mit dem Lösungsmittelabgabesystem verbundene Säule zur Gewährleistung eines Lösungsmittel- und Reagenzflusses durch die Säule und

mindestens eine Scheibe nach Anspruch 1, die in der Säule, in der die Polymersynthese abläuft, angeordnet ist.

15. Synthesevorrichtung nach Anspruch 14, des weiteren umfassend mindestens vier Säulen zur Aufnahme von vier Reagenzien und eine Mehrzahl von Scheiben in jeder Säule, wobei jede der Scheiben eine Synthese eines eine definierte Sequenz aufweisenden Biopolymeren gewährleistet.

16. Unterteilte Scheibensynthesevorrichtung zur Synthese von mehreren sequenzdefinierten Biopolymeren, umfassend

ein Lösungsmittelabgabesystem und

eine Mehrzahl von gestapelten Scheiben nach Anspruch 1, wobei jede Scheibe ein Biopolymersynthesematerial umfaßt und mit der benachbarten Scheibe unter Bildung einer Säule verbunden ist, wobei jede Scheibe direkt auf der benachbarten Scheibe aufliegt und wobei das Lösungsmittelabgabesystem mit der Säule zur Gewährleistung eines Flusses durch die Säule verbunden ist.