DE10152147A1 - Verfahren zum Aufbringen von Nukleosiden und/oder Nukleotiden auf funktionalisierten Oberflächen sowie Verfahren zur Bestimmung von Kopplungsausbeuten bei der Synthese von Nukleotiden - Google Patents

Verfahren zum Aufbringen von Nukleosiden und/oder Nukleotiden auf funktionalisierten Oberflächen sowie Verfahren zur Bestimmung von Kopplungsausbeuten bei der Synthese von Nukleotiden

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DE10152147A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufbringen von Nukleosiden und/oder Nukleotiden auf funktionalisierten Oberflächen, die mit reaktiven funktionellen Gruppen versehen sind, wobei die reaktiven funktionellen Gruppen in einem ersten Schritt mit geeigneten derivatisierten Nukleosiden und/oder Nukleotiden zur Reaktion gebracht werden und in einem zweiten Schritt mit einem Schutzgruppenreagens umgesetzt werden, so dass ein Reaktionsprodukt der Folgereaktion mit elektromagnetischer Strahlung derart wechselwirkt, dass es quantitativ bestimmbar ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von Kopplungsausbeuten bei der Synthese von Nukleotiden, wobei die freie 3'- oder 5'-Hydroxygruppe eines ausgewählten Nukleosids und/oder Nukleotids mit einer Verbindung der Formel (I) umgesetzt wird DOLLAR F1 wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein H-Phosphonat, ein Phosphonsäureester oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV): DOLLAR F2

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufbringen von Nukleosiden und/oder Nukleotiden auf funktionalisierten Oberflächen, die mit reaktiven funktionellen Gruppen versehen sind, sowie ein Verfahren zur Bestimmung von Kopplungsausbeuten bei der Synthese von Nukleotiden.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren oder Kits zur Herstellung von Nukleotiden und/oder Nukleinsäurechips.
  • Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Nukleosidderivate und deren Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Synthetische Nukleotide finden weite Anwendung in allen Bereichen der Bio- bzw. Gentechnik, wie beispielsweise bei der Gentransfektion oder bei der Genanalyse. Nukleotide, worunter im Nachstehenden sowohl Oligo- wie Polynukleotide verstanden werden sollen, werden durch Kettenverlängerung einer Ausgangsverbindung mit vielen einzelnen Nukleosidbausteinen hergestellt. Zur Synthese werden die miteinander reagierenden Hydroxygruppen so derivatisiert, dass eine Phosphodi- oder Phosphotriestergruppe oder eine H-Phosphonatgruppe bei der Umsetzung ausgebildet wird. Weitere, diese Umsetzung störende funktionelle Gruppen der Ausgangsverbindungen werden mit dafür üblichen Schutzgruppen versehen.
  • Beispielsweise können so DNA-Chips unter Verwendung von 3'-O-Phosphitamiden, die temporäre photolabile Schutzgruppen an der 5'-O-Position aufweisen, hergestellt werden (WO-A-96/18634). Weiter beschreibt die DE 199 15 867 A1 photolabile Schutzgruppen für Hydroxygruppen, wobei die photolabile Schutzgruppe im Gegensatz zum vorstehend genannten Schritt an der 3'-O-Position eingeführt wird, so dass die über eine lichtgesteuerte Synthese aufgebauten Oligomere nicht über das 3'-Ende, sondern über das 5'-Ende an eine feste Phase gekoppelt sind und somit Enzymreaktionen am 3'- bzw. 5'-Ende möglich machen.
  • Zur besseren Verfahrenseffizienz werden Nukleotide, insbesondere Polynukleotide, heutzutage meist in Festphasen-Syntheseverfahren hergestellt. Die Ausgangsverbindungen werden dabei direkt oder über sogenannte Linkergruppen an funktionalisierte Feststoffoberflächen von Polymerkügelchen oder Glas-, Metall- oder Kunststoffoberflächen gebunden und mit den zur Polynukleotidkettenverlängerung notwendigen Reagenzien umgesetzt. Überschüssige Reagenzien sowie lösliche Reaktionsnebenprodukte und Lösungsmittel sind leicht von den festphasengebundenen Polynukleotidverbindungen zu entfernen.
  • Nachteilig erweist sich bei den bisher verwendeten Verfahren, dass die Vielzahl der einzelnen Reaktionsschritte selbst bei hohen Einzelausbeuten zu einer geringen Gesamtausbeute führt. Der Fachmann muss daher je nach gewünschter Nukleotidkettenlänge und Anzahl der Reaktionseinzelschritte eine erhebliche Überschussmenge an Ausgangsverbindungen und Reagenzien einsetzen, welche nach erfolgter Umsetzung, wenn überhaupt, nur sehr aufwändig zum erneuten bestimmungsgemäßen Einsatz wieder gewonnen werden können. Zudem müssen die vielen, der Endverbindung oft sehr ähnlichen, unerwünschten Nebenprodukte vom Endprodukt abgetrennt werden. Der Fachmann muss daher eine große Menge Ausgangsverbindungen einsetzen und die Produkte aufwändig reinigen. Das letztere Problem wurde in der bislang unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen Nr. 101 32 536.3 durch die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens gelöst.
  • Allen vorstehend genannten Verfahren gemein ist jedoch, dass bislang die Kopplungsausbeuten nicht oder nur unter besonders großen Schwierigkeiten bestimmt werden konnten und insbesondere erst nach vollständiger Kettenverlängerung. Dies war besonders nachteilig, wenn die Synthese direkt auf der Oberfläche von Festphasensubstraten erfolgte, da im Falle von Fehlkopplungen nicht zeitnah eingegriffen werden konnte und somit teure Reagenzien und Instrumentenzeit vergeudet wurden. Auch war bisher nur indirekt ein Nachweis möglich, um genau feststellen zu können, an welcher Stelle eine Fehlkopplung eintrat.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das diesen Nachteil des Standes der Technik nicht aufweist. Insbesondere soll ein solches Verfahren zur automatisierten Festphasensynthese von Polynukleotiden geeignet sein, bei dem auch die Kopplungsausbeuten und damit die Syntheseeffizienz in einfacher Weise - für jeden Kopplungszyklus einzeln - bestimmt werden können.
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Aufbringen von Nukleosiden und/oder Nukleotiden auf funktionalisierten Oberflächen gelöst, die mit reaktiven funktionellen Gruppen versehen sind, wobei die reaktiven funktionellen Gruppen in einem ersten Schritt mit geeigneten derivatisierten Nukleosiden und/oder Nukleotiden zur Reaktion gebracht werden, und wobei in einem zweiten Schritt diese mit einem Schutzgruppenreagens umgesetzt werden, so dass ein Reaktionsprodukt dieser Folgereaktion mit elektromagnetischer Strahlung derart wechselwirkt, dass es quantitativ bestimmbar ist. Weiter wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein neues Nukleotidderivat, insbesondere zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Verfügung gestellt wird.
  • Die Wechselwirkung eines Reaktionsproduktes der vorgenannten Folgereaktion mit elektromagnetischer Strahlung führt dazu, dass durch die Vielzahl an derzeit bekannten modernen Analysetechniken, beispielsweise kernmagnetische Resonanz, UV/VIS, Fluoreszenzspektroskopie, Infrarotspektroskopie etc., welche ebenso leicht automatisiert und parallelisierbar eingesetzt werden können, eine einfache, schnelle und effiziente schrittweise Bestimmung der Kopplungsausbeute in einem derartigen Verfahren möglich ist.
  • Bevorzugt sind die reaktiven funktionellen Gruppen im wesentlichen Hydroxygruppen, da diese besonders reaktiv sind und besonders einfach mit den aufzubringenden Nukleosiden und Nukleotiden reagieren können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die freien Hydroxygruppen mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I umgesetzt:


    wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, wie elektronendefizitäre substituierte und unsubstituierte Phenol- bzw. Thiophenolderivate, substituierte und unsubstituierte mehrkernige Aromaten mit mindestens einer Hydroxy- bzw. Thiolgruppe, Heteroaromaten usw., insbesondere Cyano- und Nitroderivate der vorgenannten Verbindungen wie Nitronaphthole, 4-Nitrophenyloxyderivate usw.
    PX ein Phosphitamid-, ein H-Phosphonat, einen Phosphonsäureester oder einen Phosphortriester darstellt,
    Y = O oder S bedeutet,
    N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, das ausgewählt ist aus:
    einem Nukleosid der Formel (II),


    oder einem Nukleosid der Formel (III)


    einem Nukleosid der Formel (IV)


    wobei gilt: wenn in dem entsprechenden terminalen Nukleosid sich PX in 3'-Stellung in den Formeln (II) bis (IV) befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'-Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 3'-Stellung,
    und wobei B1, B2 und Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5- Amino-4-imidazolcarbonsäure-1-yl oder 5-Amino-4-imidazolcarbonsäureamid-3-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
    R = H, ein Alkyl, Aryl, Aralkyl, Haloalkyl, Cyanoalkyl, und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, und sofern R = H ist, liegt die vorliegende Verbindung bevorzugt als lösliches Phosphordiestersalz vor, beispielsweise in Form eines quartären Ammoniumsalzes,
    und wobei R1 ein H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA = locked nucleic acid).
  • Bevorzugt wird in dem zweiten Reaktionsschritt die Abgangsgruppe L abgespalten, die anschließend quantitativ bestimmt werden kann, so dass die Kopplungsausbeute und Effizienz des vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahrens genau beurteilt werden kann.
  • Der Einsatz ausgewählter, fertig funktionalisierter Oligonukleotide mit Ausgangsverbindungen, die freie und/oder derivatisierte reaktive Hydroxygruppen aufweisen, vermeidet Zwischenschritte, wie sie bei der Polynukleotidkettenverlängerung mit Einzelnukleosiden notwendig sind. So sind zum Beispiel bei ausgewählten Dinukleotiden nur 1/2 der notwendigen Kopplungen nötig, bei Trinukleotiden nur noch 1/3 der notwendigen Kopplungen usw.
  • Unter den ausgewählten Nukleotiden werden erfindungsgemäß Oligonukleotide bzw. Polynukleotide mit 2 bis zu 10 Nukleosiden verstanden, die untereinander bevorzugt über 3'- 5'- bzw. 5'-3'-Phosphorsäureesterbindungen verbunden sind. Polynukleotide umfassen außerdem weiter Oligonukleotide aus mehr als 10 Nukleotidbausteinen.
  • Bevorzugt finden in dem erfindungsgemäßen Verfahren als ausgewählte Oligonukleotide Pentanukleotide, insbesondere Dinukleotide, Trinukleotide und Tetranukleotide Verwendung.
  • Ganz besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte:
    • 1. Umsetzung einer eine freie Hydroxygruppe aufweisenden Oberfläche mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I):


      wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein Phosphonsäureester, H-Phosphonat oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV):




      wobei gilt: wenn sich in den Formeln (II) bis (IV) in den terminalen Nukleosiden PX in 3'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'-Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 3'- Stellung,
      sowie B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
      R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann,
      R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA = locked nucleic acid)
      und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
      • a) ,
      • b) weitere Umsetzung des in Schritt a) erhaltenen Reaktionsproduktes mit einem Schutzgruppenreagens unter Abspaltung der Abgangsgruppe L,
      • c) Abspaltung der in Schritt b) eingeführten Schutzgruppe,
      • d) ggf. Wiederholung der Schritte a) bis c) unter Verwendung des Reaktionsproduktes der Schritte a) bis c) als Oberfläche und wobei die quantitative Bestimmung der Menge des in Schritt b) abgespaltenen Reaktionsproduktes L durch dessen Wechselwirkung mit elektromagnetischer Strahlung entweder nach den Schritten b) und/oder c) oder parallel dazu erfolgt.
  • Bevorzugt sind die freien Hydroxygruppen der Oberfläche in Schritt a) Bestandteile eines Nukleosids und/oder Nukleotids und umfassen beispielsweise einen oder mehrere Nukleosidbausteine der Formel (V), die über 3'-5'-Phosphorsäureester verbunden sind:


    wobei B ein H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4- carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von ggf. vorhandenen primären Aminofunktionen diese gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
    R2 = H, ein Phosphorsäureesterrest, ein Phosphitamidoester, ein Phosphonsäureesterrest, ein H-Phosphonat oder eine sonstige geeignete Hydroxyschutzgruppe sein kann,
    R3 ein H, OH, Halogen, Acylamino-, Alkoxy- oder substituierter Alkoxyrest mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann,
    R4 = H, ein Phosphorsäureesterrest, ein Phosphitamidoesterrest, ein Phosphonsäureesterrest, ein H-Phosphonatrest oder eine sonstige geeignete Hydroxyschutzgruppe sein kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt mit Verbindungen der Formel (I) durchgeführt, bei denen die Abgangsgruppe L eine geeignete chromophore Gruppe ist, die die C=Y Funktion durch Erniedrigung der Elektronendichte gegen nukleophilen Austausch aktiviert. Chromophore Gruppen erlauben die besonders einfache quantitative Bestimmung durch verschiedenste Arten optischer Spektroskopie.
  • Als intermediäre Schutzgruppe der 3'- bzw. 5'-Hydroxyfunktion eignen sich bevorzugt alle dem Fachmann geläufigen Schutzgruppen, welche orthogonal zu den permanenten Basenschutzgruppen abspaltbar sind, insbesondere jedoch photolabile Schutzgruppen. Bevorzugte photolabile Schutzgruppen sind beispielsweise NPPOC, MeNPOC, MeNNPOC, NPES, NPPS, PyMOC, NVOC, NBOC. Sinngemäß werden dementsprechende Reagenzien in Form der jeweiligen Alkohole, also beispielsweise NPPOH, MeNPOH, MeNNPOH, PyMOH, NVOH, NBOH, zur Einführung dieser Schutzgruppen verwendet.
  • Bevorzugt wird diese Einführung durch dem Fachmann bekannte übliche Katalysatoren beschleunigt, wie z. B. Pyridin, Dimethylaminopyrrolidon, N-Methylimidazol usw.
  • Neben den ausgewählten Oligonukleotiden können auch entsprechende Mononukleoside ergänzend oder auch überwiegend eingesetzt werden, um die erwünschte Nukleotidkette zu realisieren, wenn beispielsweise das eine oder andere notwendige Nukleotid nicht verfügbar ist.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiter durch ein Verfahren zur Bestimmung von Kopplungsausbeuten bei der Synthese von Nukleotiden gelöst, wobei das erfindungsgemäße Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst:
    • a) Umsetzung der freien 3'- oder 5'-Hydroxygruppe eines ausgewählten Nukleosids und/oder Nukleotids mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)


      wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein H- Phosphonat, ein Phosphonsäureester oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV):





      wobei gilt: wenn sich in den entsprechenden terminalen Nukleosiden PX in 3'-Stellung in den Formeln (II) bis (IV) befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'- Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)- Einheit in 3'-Stellung,
      sowie B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann,
      wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
      R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann,
      R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA)
      und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
    • b) weitere Umsetzung des in Schritt a) erhaltenen Reaktionsproduktes mit einem Schutzgruppenreagens unter Abspaltung der Abgangsgruppe L, gegebenenfalls unter Katalyse.
    • c) Abspaltung der in Schritt b) eingeführten Schutzgruppe,
    wobei die quantitative Bestimmung der Menge der in Schritt b) abgespaltenen Abgangsgruppe L ganz besonders bevorzugt in Form ihres Anions L- nach den Schritten b) und/oder c) oder parallel dazu erfolgt. Bevorzugt tritt dabei das Anion L- mit elektromagnetischer Strahlung in Wechselwirkung, so dass eine besonders einfache Bestimmung der Menge des abgespaltenen Anions 12 beispielsweise mittels UV/VIS und/oder Fluoreszenzspektroskopie möglicht ist.
  • Besonders bevorzugt ist, wenn dieses erfindungsgemäße Verfahren automatisiert durchgeführt wird.
  • Vorzugsweise ist ein solches automatisiertes Verfahren als Parallelsynthese zur Herstellung einer Nukleotidbibliothek ausgestaltet, bei der die ausgewählten Oligonukleotide und gegebenenfalls weitere Mononukleotide gezielt oder zufällig ausgewählt werden können.
  • Es ist dabei zeitsparend und nützlich, dass der Fachmann sich ein Reservoir an Oligonukleotiden verschiedener Nukleinsäuresequenzen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren anlegt. Vorzugsweise sind diese Nukleinsäuresequenzen bereits entsprechend derivatisiert, so dass sie ohne weitere Umsetzungen gleich eingesetzt werden können.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung einen Kit, der einen Teil oder alle Reagenzien und/oder Hilfsstoffe und/oder Lösungsmittel und/oder eine Arbeitsanweisung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorstehenden Ansprüche in einer räumlichen Einheit enthält, wobei der Kit mindestens ein oder mehrere ausgewählte Nukleoside und/oder Nukleotide enthält.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und/oder des oben genannten Kits zur Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips, vorzugsweise zur automatisierten und parallelisierten Herstellung von Oligonukleotiden.
  • Im Nachfolgenden werden die vorstehend wie auch nachstehend verwendeten Abkürzungen und Begriffe zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung erläutert:
    DCI: 5,6-Dicyanoimidazol
    DMT: Dimethoxytrityl-
    TsOH: Toluolsulfonsäure
    NPPOC: o-Nitrophenylpropyloxycarbonyl
    PYMOC: Pyrenylmethyloxycarbonyl
    MeNPOC: 3,4-Methylendioxy-o-nitrophenylethyloxycarbonyl
    NPS: o-Nitrophenylethylsulfonyl
    NPPS: o-Nitrophenylpropylsulfonyl
    NVOC: o-Nitroveratryloxycarbonyl
    NBOC: o-Nitrobenzyloxycarbonyl
    NPEOC: o-Nitrophenylethyloxycarbonyl
    MeNPPOC: 3,4-Methylendioxy-o-nitrophenylpropyloxycarbonyl
  • Die Begriffe Nukleosid und Nukleotid werden im Sinne der beispielsweise in dem Lehrbuch von B. Alberts et al. "Lehrbuch der molekularen Zellbiologie" Wiley VCH, Weinheim, New York 1999 angeführten Definitionen verstanden. Dabei umfasst der Begriff "Nukleotide", wie er vorliegend verwendet wird, sowohl Oligo- wie auch Polynukleotide.
    • Figuren
  • Fig. 1 zeigt beispielhaft ein nicht einschränkendes Syntheseschema zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • In Schritt (1) ist eine OH-Gruppe auf der Oberfläche eines frei wählbaren, dem Fachmann an sich bekannten Substrates angebracht. Dabei kann die OH-Gruppe ebenfalls Teil eines Nukleosids bzw. eines Nukleotids sein. Ebenso ist es jedoch möglich, dass schon die Oberfläche des Substrates mit OH-Gruppen versehen ist, wie es beispielsweise bei vielen keramischen Substraten der Fall ist. Ebenso kann die OH-Gruppe Teil eines organischen bzw. eines anorganischen Moleküls sein, beispielsweise eines Silikons bzw. von längeren aliphatischen bzw. araliphatischen Alkoholen sein, die auf der Substratoberfläche verankert sind.
  • In einem ersten Reaktionsschritt wird die freie(n) Hydroxygruppe(n) mit der Verbindung (2), d. h. mit einem Phosphitamidoester der angegebenen Formel umgesetzt. R' kann beispielsweise einen verzweigten oder unverzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 C Atomen, beispielsweise Ethyl oder Isopropyl, ein Cycloalkyl oder einen Heterozyklen, wie z. B. einen substituierten oder unsubstituierten Morpholinorest umfassen. Die Stickstoffsubstituenten R' und R" sind ebenfalls wie vorstehend definiert und können gleich oder verschieden sein. Im Falle, dass der Stickstoffsubstituent R' ungleich R" ist, sind Kombinationen der vorstehenden beispielhaft erwähnten Reste bevorzugt. Vor der Reaktion muss der Phosphitamidoester mit 1H-Tetrazol (TET) oder 5,6-Dicyanoimidazol (DCI) in Acetonitril aktiviert werden. Im Falle, dass statt eines Phosphitamidoesters beispielsweise ein H-Phosphonatsalz verwendet wird, wird dieses vor der Umsetzung mit der freien Hydroxygruppe mit Pivaloylchlorid oder Adamantoylchlorid in Triethylamin/Acetonitril aktiviert. Das Kopplungsprodukt wird gegebenenfalls nach Oxidation des dreiwertigen Phosphors als Verbindung (3) erhalten.
  • Das Kopplungs-Zwischenprodukt (3) wird mit einem geeigneten Schutzgruppenreagens (beispielsweise NPPOH und DMAP) umgesetzt, wobei anschließend die Verbindung (4) entsteht.
  • Die Abgangsgruppe (5) lässt sich mittels UV/VIS-Spektroskopie einfach quantitativ bestimmen. Damit ist es möglich, den Erfolg der Kopplungsreaktion entweder parallel zu oder nach dem Kopplungsschritt genau zu verfolgen und die Reaktion entsprechend zu optimieren.
  • In einem weiteren Schritt wird die NPPOC-Schutzgruppe der Verbindung (4) durch Bestrahlung mit geeigneter Wellenlänge abgespalten, so dass die NPPOC-Funktionen in eine Hydroxyfunktion der Verbindung (6) überführt wird. Verbindung (6) kann dann beispielsweise wieder von neuem für das erfindungsgemäße Verfahren als Ausgangsverbindung mit einer freien Hydroxygruppe verwendet werden.
  • Wie in Fig. 1 beispielhaft erläutert, können zur erfindungsgemäßen Durchführung des Verfahrens auch derivatisierte Hydroxyfunktionen bei Nukleosiden bzw. Nukleotiden vom Typ Phosphitamidoester bzw. H-Phosphonate oder H-Phosphonatsalze eingesetzt werden.
  • Jedoch sind auch lösliche oder an feste Phasen gebundene Nukleoside oder Polynukleotide denkbar, deren terminale 3'- bzw. 5'-Hydroxyfunktion als Phosphidamidoester oder Phosphonsäureester oder H-Phosphonat vorliegt.
  • Es ist auch möglich, dass anstelle der Verbindung (2) ein Nukleotidderivat mit der allgemeinen Formel (VI)


    verwendet wird,
    wobei B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4- carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
    R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann,
    R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA),
    Y = O oder S bedeutet,
    und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist,
    beziehungsweise ein Nukleotidderivat mit der allgemeinen Formel (VII)


    wobei B1 und B2 unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4- caboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2 ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
    R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Haloalkyl, Cyanoalkylrest sein kann,
    R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA)
    und Y = O oder S bedeutet.
  • Die Bedeutung der Substituenten R' und R" in den Formeln (VI) und (VI) entspricht derjenigen unter Formel (2) in Fig. 1 erläuterten Bedeutung.
  • Selbstverständlich ist bei den einzelnen Nukleosiden bzw. Nukleotiden sowohl der Einsatz von in 3'- wie auch in 5'-Stellung mit Phosphorderivaten geschützten Nukleosiden/Nukleotiden möglich. Der Einsatz von Dinukleotiden (VII) bzw. von Oligonukleotiden(VI) in dem erfindungsgemäßen Verfahren erlaubt einen schnellen und gezielten Aufbau längerer Polynukleotide auf derivatisierten Oberflächen bei höherer Selektivität und Ausbeute, da Zwischenschritte, wie sie bei den bisherigen Verfahren gemäß dem Stand der Technik bei der Verwendung von Mononukleotiden notwendig waren, nunmehr entfallen.
  • Geeignete Oberflächen umfassen Materialien, wie beispielsweise Folie bzw. Membranen aus Polypropylen, Nylon, Cellulose, Cellulosederivate, beispielsweise Celluloseacetat, Cellulosemischester, Polyethersulfone, Polyamide, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyester, Teflon oder Polyethylen.
  • Des Weiteren können die Oberflächen auch keramische Materialien sein, die in ihrer Oberfläche freie Hydroxygruppen aufweisen. Außerdem können die Oberflächen des weiteren Materialien wie Glas, Silikon und Metalle alleine oder als Beschichtung auf anderen Materialien umfassen.
  • Jedoch ist in einer weiteren allgemeinen Ausgestaltung des Verfahrens auch der Einsatz von Trägeroberflächen mit freien oder geschützten funktionellen Gruppen möglich, die beispielsweise Amino-, Carboxyl-, Carbonyl-, Thiol-, Amid- oder Phosphat-Gruppen aufweisen. Derartige funktionelle Gruppen können auch über ein Linkermolekül mit der Oberfläche verbunden sind.
  • Planare Trägeroberflächen finden Anwendung als Nukleinsäurechips. Unter dem Begriff "Nukleinsäurechips" werden erfindungsgemäß auf einem festen Träger aufgebaute Biomoleküle, wie DNA oder RNA, sowie Nukleinsäureanaloga wie PNA, LNA oder Chimären von diesen mit DNA, RNA oder Nukleinsäureanaloga verstanden.
  • Bevorzugt finden die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten und erhaltenen Oligonukleotidbibliotheken Verwendung zur Herstellung von Nukleinsäurechips, die beispielsweise sowohl für Hybridisierungsexperimente wie auch für bestimmte Enzymreaktionen (beispielsweise DNA-Ligase, DNA-Polymerase) eingesetzt werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders gut zur Durchführung in einem automatisierten Verfahren geeignet. Vorzugsweise ist ein solches automatisiertes Verfahren als Parallelsynthese zur Herstellung einer Nukleotidbibliothek ausgestaltet, bei der die ausgewählten Oligonukleotide und gegebenenfalls weitere Mononukleotide gezielt oder zufällig ausgewählt werden können.
    • Beispiele
  • Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung:
    • Beispiel 1 5'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin
  • Eine Lösung von 4-Nitrophenyl chloroformat (3.6 g, 18 mmol) in Dichlormethan (40 ml) wurde bei ca. -15°C zu einer Lösung von Thymidin (5.0 g, 20 mmol) in abs. Pyridin (50 ml) getropft. Die Reaktion wurde 16 Stunden bei ca. 4°C gerührt, mit Methanol versetzt (0.5 ml), mit Dichlormethan (350 ml) verdünnt, und mit Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde zur Entfernung von Pyridin mit Toluol co-evaporiert (2 × 20 ml) und durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Ethylacetat). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 3.3 g (45%) 5'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin als farblose amorphe Substanz. Durch Kristallisation aus Ethylacetat erhält man die analysenreine Verbindung vom Schmelzpunkt: 145-146°C. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 265 (4.28), 212 (4.19). 1H-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 11.35 (s, NH); 8.31 (d, 2H, ortho zu NO2); 7.56 (d, 2H, para zu NO2); 7.50 (s, H-C(6)); 6.21 (dd, H-C(1')); 5.50 (d, HO-C(3')); 4.40 (m, 3H, H-C(3') and 2H-C(5')); 3.99 (m, H-C(4')); 2.18 (m, 2H-C(2')); 1.75 (s, Me- C(5)).
    • Beispiel 2 3'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin
  • 4-Nitrophenylchloroformat (0.5 g, 2.48 mmol) wurde auf einmal zu einer Lösung von 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-thymidin (1.0 g, 1.83 mmol) in Pyridin/Dichlormethan 10 : 1 (11 ml) gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 h gerührt, danach mit Methanol (0.2 ml) versetzt, mit Dichlormethan (60 ml) verdünnt und mit Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde zur Entfernung von Pyridin mit Toluol co-evaporiert (2 × 20 ml) in Dichlormethan (15 ml) gelöst und diese Lösung langsam in n-Hexan (150 ml) eingetropft. Der Niederschlag wurde abfiltriert, in Dichloromethan (10 ml) gelöst und mit einer 2%-Lösung (w/v) p- Toluolsulfonsäure in Dichloromethan/Methanol 4 : 1 (20 ml) versetzt. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde mit Dichlormethan (60 ml) verdünnt, mit einer Lösung aus Natriumbikarbonat (168 mg) in Wasser (30 ml) und danach Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Ethylacetat). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.5 g (67%) 3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 265 (4.25), 212 (4.10). 1H-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 11.38 (s, NH); 8.32 (d, 2H, ortho zu NO2); 7.75 (s, H-C(6)); 7.61 (d, 2H, para zu NO2); 6.23 (dd, H- C(1')); 5.29 (m, 2H, H-C(3') and HO-C(5')); 4.22 (br.s, H-C(4')); 3.66 (br.s, 2H-C(5')); 2.37 (m, 2H-C(2')); 1.78 (s, Me-C(5)).
    • Beispiel 3 5'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin-3'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit]
  • 5'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin (1.0 g, 2.45 mmol) und 4,5-Dicyanoimidazol (0.13 g, 1.14 mmol) wurden in Dichlormethan (10 ml) gelöst und bis-(Diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphin (1.03 g, 3.43 mmol) unter Argon zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 h gerührt, danach mit Dichloromethan (100 ml) verdünnt und mit Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Aceton 4 : 1 und 3 : 2). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.8 g (54%) 5'-O- (4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin-3'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 265 (4.26), 211 (4.22). 1H-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 11.36 (s, NH); 8.31 (d, 2H, ortho zu NO2); 7.53 (d, 3H, para zu NO2 and H-C(6)); 6.20 (dd, H-C(1')); 4.51 (m, 3H, H-C(3') und 2H-C(5')); 4.18 (m, H-C(4')); 3.74 (m, 2H, POCH2CH2); 3.58 (m, 2H, CH(CH3)2); 2.79 (t, 2H, CH2CN); 2.38 (m, 2H- C(2')); 1.75 (s, Me-C(5)); 1.16 and 1.14 (2s, 12H, iPr). 31P-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 145.46.
    • Beispiel 4 3'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)thymidin-5'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit]
  • 3'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin (1.0 g, 2.45 mmol) und 4,5-Dicyanoimidazol (0.14 g, 1.22 mmol) wurden in Dichlormethan (10 ml) gelöst, und bis-(Diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphin (1.1 g, 3.67 mmol) unter Argon zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 h gerührt, danach mit Dichloromethan (100 ml) verdünnt und mit Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Aceton 4 : 1 und 3 : 2). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.7 g (47%) 3'-O- (4-Nitrophenyloxy-carbonyl)-thymidin-5'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit] als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 265 (4.31), 211 (4.30). 1H-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 11.42 (s, NH); 8.33 (d, 2H, ortho zu NO2); 7.60 (m, 3H, para zu NO2 und H-C(6)); 6.23 (m, H-C(1')); 5.29 (m, H-C(3')); 4.40 (br.s, H-C(4')); 3.85 (m, 2H, POCH2CH2); 3.77 (m, 2H-C(5')); 3.55 (m, 2H, CH(CH3)2); 2.77 (t, 2H, CH2CN); 2.54 und 2.38 (2 m, 2H-C(2')); 1.75 (s, Me-C(5)); 1.13 (m, 12H, iPr). 31P-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 145.50 und 145.44.
    • Beispiel 5 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-thymidylyl-(3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O-(4- nitrophenyloxycarbonyl)thymidin
  • 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-thymidin-3'-O-[(2- cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (0.83 g, 1.11 mmol), 3'-O-(4- nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin (0.35 g, 0.85 mmol) und 4,5-Dicyanoimidazol (0.65 g, 5.5 mmol) wurden in Acetonitril (8 ml) gelöst und unter Argon 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde eine Lösung von Iod (0.4 g) in Dichlormethan/Wasser/Pyridin 1 : 1 : 3 (v/v/v) (5 ml) zugegeben. In Lösung verbleibt eine bräunliche Färbung. Nach 20 Minuten wurde mit Dichlormethan (80 ml) verdünnt, mit einer gesättigten von Natriumthiosulfat (2 × 30 ml) und danach Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde zur Entfernung von Pyridin mit Toluol co-evaporiert (2 × 15 ml) und durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Dichlormethan, Dichlormethan/Methanol 50 : 1 und 20 : 1). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.65 g (71%) 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl)-thymidylyl-{3'-[OP -(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 265 (4.45), 236 (4.43), 213 (4.53). 1H-NMR (DMSO-d6, δ in ppm): 1.41 und 1.39 (2s, 2 NH); 8.30 und 8.29 (2d, 2H, ortho zu NO2); 7.59-6.81 (m, 17H, aromatisch und 2H-C(6)); 6.21 (m, 2H- C(1')); 5.27 und 5.10 (2 m, 2H-C(3')); 4.40-4.11 (m, 6H, 2H-C(4') und 4H-C(5')); 3.72 und 3.71 (2s, 6H, 2 OMe); 3.23 (m, 2H, POCH2CH2); 2.43 (m, 4H-C(2')); 1.74 (s, Me-C(6)); 1.41 und 1.39 (2s, Me-C(6)).
    • Beispiel 6 Thymidylyl-(3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O-(4-nitrophenyloxy-carbonyl)-thymidin
  • Eine Lösung von 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-thymidylyl-{3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O- (4-nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin (0.5 g, 0.47 mmol) in Dichloromethan (2 ml) wurde mit einer 2%-Lösung (w/v) p-Toluolsulfonsäure in Dichloromethan/Methanol 4 : 1 (4 ml) versetzt. Nach 8 Minuten bei Raumtemperatur wurde mit Dichlormethan (80 ml) verdünnt, mit einer Lösung aus Natriumbikarbonat (38 mg) in Wasser (30 ml) und danach Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Dichlormethan, Dichlormethan/Methanol 50 : 1 und 9 : 1). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.3 g (84%) Thymidylyl-{3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 265 (4.46), 211 (4.41).
    • Beispiel 7 2'-Deoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4- nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin
  • Eine Lösung von 4-Nitrophenylchloroformat (0.36 g, 1.8 mmol) in Dichlormethan (3 ml) wurde bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 2'-Deoxy- 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-cytidin (1.0 g, 1.39 mmol) in Pyridin (5 ml) zugetropft. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 h gerührt, danach mit Methanol (0.2 ml) versetzt, mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt und mit Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde zur Entfernung von Pyridin mit Toluol co-evaporiert (2 × 10 ml) und durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetat 3 : 1, 1 : 1 und 2 : 3). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 1.0 g (81%) of 2'-Deoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert- butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 239 (4.56), 211 (4.70), 300 sh (4.13).
    • Beispiel 8 2'-Deoxy-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin
  • Eine Lösung von 2'-Deoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'- O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin (0.7 g, 0.79 mmol) in Dichlormethan (4 ml) wurde mit einer 2%-Lösung (w/v) p-Toluolsulfonsäure in Dichloromethan/Methanol 4 : 1 (8 ml) versetzt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt, mit einer Lösung aus Natriumbikarbonat (84 mg) in Wasser (50 ml) und danach Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde mit n-Hexan behandelt und der Niederschlag abfiltriert und mit n-Hexan (3 × 20 ml) und Diethylether (3 × 15 ml) gewaschen. Man erhielt 0.33 g (72%) 2'-Deoxy-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4- nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin. Durch Kristallisation aus Ethylacetat/Ethanol 3 : 1 erhält man die analysenreine Verbindung vom Schmelzpunkt: 196-198°C. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 249 (4.32), 215 (4.42), 300 sh (4.05).
    • Beispiel 9 2'-Deoxy-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-5'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin
  • Eine Lösung von 4-Nitrophenyl chloroformat (1.74 g, 8.62 mmol) in Dichlormethan (40 ml) wurde bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 2'-deoxy-N4-(4-tert-butyloxyacetyl)-cytidin (3.0 g, 7.18 mmol) in Pyridin (30 ml) und Dichlormethan (3 ml) getropft. Die Reaktion wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit Methanol versetzt (0.1 ml), mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt, und mit Phosphat Puffer pH 7.0 (2 × 70 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde zur Entfernung von Pyridin mit Toluol co-evaporiert (2 × 25 ml) und durch Flash- Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Ethylacetat). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 1.9 g (45%) 2'-Deoxy-N4-(4-tert- butylphenyloxyacetyl)-5'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin als farblose amorphe Substanz1. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 248 (4.32), 216 (4.35), 300 sh (4.02).
    • Beispiel 10 2'-Deoxy-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin- 5'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit]
  • Bis-(diisopropylamino)-2- cyanoethoxyphosphan (0.19 g, 0.64 mmol) wurde auf einmal zu einer Lösung von 2'-deoxy- N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin (0.25 g, 0.43 mmol) und 4,5-Dicyanoimidazol (25 mg, 0.21 mmol) in Dichlormethan (3 ml) zugegeben. Es wurde bei Raumtemperatur 2 h unter Argon gerührt, danach mit Dichlormethan (60 ml) verdünnt und mit Phosphat Puffer pH 7,0 (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash- Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Aceton 4 : 1 und 3 : 2). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.17 g (51%) 2'-deoxy-N4-(4-tert- butylphenyloxyacetyl)-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin-5'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit] als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 249 (4.35), 215 (4.42), 300 sh (4.05).
    • Beispiel 11 2'-Deoxy-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-5'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin- 3'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit]
  • Bis-(diisopropylamino)-2- cyanoethoxyphosphan (0.77 g, 2.57 mmol) wurde auf einmal zu einer Lösung von 2'-deoxy- N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-5'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin (1.0 g, 1.71 mmol) und 4,5-Dicyanoimidazol (0.1 g, 0.85 mmol) in Dichlormethan (10 ml) zugegeben. Es wurde bei Raumtemperatur 3 h unter Argon gerührt, danach mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt und mit Phosphat Puffer pH 7,0 (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash- Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, n-Hexan/Aceton 4 : 1 und 2 : 1). Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Man erhielt 0.63 g (48%) 2'-deoxy-N4-(4-tert- butylphenyloxyacetyl)-5'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-cytidin-3'-O-[(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit] als farblose amorphe Substanz. UV (MeOH, λmax nm (log ε): 248 (4.35), 215 (4.46), 300 sh (4.06).
    • Beispiel 12 2'-Deoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O-[2-(2- nitrophenyl)propyloxycarbony]-cytidin
  • Eine Lösung aus 2-(2-Nitrophenyl)-propanol (266 mg, 1.46 mmol) und 4-(Dimethylamino)- pyridin (22 mg, 0.18 mmol) in Acetonitril (1 ml) wurde zu einer Lösung 2'-Deoxy-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert-butylphenyl-oxyacetyl)-3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)- cytidin (130 mg, 0.146 mmol) in Acetonitril (0.6 ml) auf einmal zugegeben. Es wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktionsmischung durch Flash- Säulenchromatographie (Kieselgel, n-Hexan/Ethylacetate 2 : 1 und dann 2 : 3) gereinigt. Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel verdampft. Man erhielt 120 mg (88%) 2'-Deoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-N4-(4-tert-butylphenyloxyacetyl)-3'-O- [2-(2-nitrophenyl)-propyloxycarbonyl]-cytidin als farblose amorphe Substanz, die in allen physikalischen Eigenschaften mit authentischem Vergleichsmaterial übereinstimmte.
    • Beispiel 13 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidylyl-{3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O-[2-(2- nitrophenyl)propyloxycarbonyl]thymidine
  • Eine Lösung aus 2-(2-Nitrophenyl)propanol (181 mg, 1 mmol) und 4-(Dimethylamino)pyridin (12 mg, 0.1 mmol) in Acetonitril (0.5 ml) wurde zu einer Lösung aus 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-thymidylyl-{3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}- 3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin (106 mg, 0.1 mmol) in Acetonitril (1 ml) auf einmal zugegeben. Nach 30 Minuten unter Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit Dichloromethan (20 ml) verdünnt, mit Wasser (2 × 20 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel Dichlormethan und dann Dichlormethan/Methanol 25 : 10) gereinigt. Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel verdampft. Man erhielt 80 mg (72%) of 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-thymidylyl-{3'-[OP-(2-cyanoethyl)]→5'}-3'-O-[2- (2-nitrophenyl)-propyloxycarbonyl]-thymidin als farblose amorphe Substanz. UV [MeOH, λmax nm (log ε)]: 264 (4.36), 236 (4.42), 212 (4.67).
    • Beispiel 14 Qualitative Umsetzungen von 3'-O-(4-Nitrophenyloxycarbonlyl)-thymidin Derivativen mit 2- (2-Nitrophenyl)propanol
  • Zu einer Mischung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3'-O-(4- nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin bzw. 3'-O-(4-nitrophenyloxycarbonyl)-thymidin (1 Aequivalent) und 2-(2-Nitrophenyl)propanol (circa 10 Aequivalente) in Acetonitril bzw. in Toluol wurden 4-(Dimethylamino)-pyridin oderr 1-Methylimidazol (circa 1.1-3.0 Aequivalente) zugegeben. Es wurde bei Raumtemperatur gerührt und der Fortschritt der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die Transformationen in die entsprechenden 3'-O-[2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl]-Derivative waren in wenigen Minuten quantitativ erfolgt.

Claims (24)

1. Verfahren zum Aufbringen von Nukleosiden und/oder Nukleotiden auf funktionalisierten Oberflächen, die mit reaktiven funktionellen Gruppen versehen sind, wobei die reaktiven funktionellen Gruppen in einem ersten Schritt mit geeigneten derivatisierten Nukleosiden und/oder Nukleotiden zur Reaktion gebracht werden, und in einem zweiten Schritt mit einem Schutzgruppenreagens umgesetzt werden, und dass ein Reaktionsprodukt des zweiten Schrittes mit elektromagnetischer Strahlung derart wechselwirkt, dass es quantitativ bestimmbar ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktiven funktionellen Gruppen im wesentlichen Hydroxygruppen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die freien Hydroxygruppen mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) umgesetzt werden:


wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein Phosphonsäureester, H-Phosphonat oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV):




wobei gilt: wenn sich in den terminalen Nukleosiden in den Formeln (II) bis (IV) PX in 3'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'-Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 3'- Stellung,
sowie B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann,
R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA = locked nucleic acid)
und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt die Abgangsgruppe (L) abgespalten wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an der Abgangsgruppe (L) quantitativ bestimmt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend folgende Schritte:
a) Umsetzung einer eine freie Hydroxygruppe aufweisenden Oberfläche mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)


wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein Phosphonsäurester, ein H-Phosphonat oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV):





wobei gilt: wenn sich in den entsprechenden terminalen Nukleosiden in den Formeln (II) bis (IV) PX in 3'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'- Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)- Einheit in 3'-Stellung,
sowie B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann
R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA)
und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
a) weitere Umsetzung des in Schritt a) erhaltenen Reaktionsproduktes mit einem Schutzgruppenreagens unter Abspaltung der Abgangsgruppe L,
b) Abspaltung der in Schritt b) eingeführten Schutzgruppe,
c) gegebenenfalls Wiederholung der Schritte a) bis c) unter Verwendung des Reaktionsproduktes der Schritte a) bis c) als Oberfläche,
und wobei die quantitative Bestimmung der Menge des in Schritt b) abgespaltenen Reaktionsproduktes (L) durch dessen Wechselwirkung mit elektromagnetischer Strahlung entweder nach den Schritten b) und/oder c) oder parallel dazu erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die freien Hydroxygruppen der Oberfläche in Schritt a) Bestandteile eines Nukleosids und/oder Nukleotids sind.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgangsgruppe L eine chromophore Gruppe ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe eine photolabile Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe NPPOC, MeNPOC, NVOC, PyMOC, NBOC, NPEOC, MeNPPOC, NPES, NPPS.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte in einem automatisierten Verfahren durchgeführt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das automatisierte Verfahren als Parallelsynthese zur Herstellung einer Nukleotidbibliothek ausgestaltet ist, bei dem die ausgewählten Nukleoside und/oder Nukleotide gezielt oder zufällig ausgewählt werden.
12. Verfahren zur Bestimmung von Kopplungsausbeuten bei der Synthese von Nukleotiden, umfassend die Schritte:
a) Umsetzung der freien 3'- oder 5'-Hydroxygruppe eines ausgewählten Nukleosids und/oder Nukleotids mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)


wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein H- Phosphonat, ein Phosphonsäureester oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV):


wobei gilt: wenn sich in den entsprechenden terminalen Nukleosiden in den Formeln (II) bis (IV) PX in 3'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'- Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)- Einheit in 3'-Stellung,
sowie B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann,
R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann, oder über C2'-C4 Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA),
und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
a) weitere Umsetzung des in Schritt a) erhaltenen Reaktionsproduktes mit einem Schutzgruppenreagens unter Abspaltung der Abgangsgruppe (L).
b) Abspaltung der im Schritt b) eingeführten Schutzgruppe,
wobei die quantitative Bestimmung der Menge des in Schritt b) abgespaltenen Abgangsgruppe (L) in Form ihres Anions (U) nach den Schritten b) und/oder c) oder parallel dazu erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Anion (U) mit elektromagnetischer Strahlung wechselwirkt.
14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die quantitative Bestimmung mittels UV/VIS und/oder Fluoreszenzspektroskopie erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte in einem automatisierten Verfahren durchgeführt werden.
16. Kit, der einen Teil oder alle Reagenzien und/oder Hilfsstoffe und/oder Lösungsmittel und/oder eine Arbeitsanweisung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder 12 bis 15 in einer räumlichen Einheit enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit mindestens ein oder mehrere ausgewählte Nukleoside und/oder Nukleotide enthält.
17. Kit nach Anspruch 16, weiter umfassend NPPOH, MeNPOH, PyMOH; MeNPPOH.
18. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder eines Kits gemäß Anspruch 16 und/oder 17 zur Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips.
19. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder 12 bis 15 zur automatisierten Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips.
20. Verwendung von NPPOH, MeNPOH, PyMOH; MeNPPOH in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder 12 bis 15 zur automatisierten Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips.
21. Verwendung eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 12 bis 15 und/oder eines Kits gemäß Anspruch 16 bei der Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips.
22. Nukleosidderivat der allgemeinen Formel (I)


wobei L eine übliche geeignete Abgangsgruppe ist, PX ein Phosphitamid, ein Phosphonsäureester, ein H-Phosphonat oder ein Phosphortriester ist, Y = O oder S bedeutet, N ein Nukleosid- oder ein Nukleotidderivat ist, ausgewählt aus den nachstehenden allgemeinen Formeln (II), (III), (IV):




wobei gilt: wenn sich in den Formeln (II) bis (IV) in den entsprechenden terminalen Nukleosiden PX in 3'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)-Einheit in 5'- Stellung, bzw. wenn sich PX in 5'-Stellung befindet, dann befindet sich die L-C(=Y)- Einheit in 3'-Stellung,
sowie B1, B2, Bi unabhängig voneinander H, Adeninyl, Cytosinyl, Guaninyl, Thyminyl, Uracilyl, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-carboxylimidazol-1-yl oder 5-Amino-4-carbamoylimidazol-1-yl sein kann, wobei im Falle von B1, B2, Bi ggf. vorhandene primäre Aminofunktionen gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweisen können bzw. Thyminyl oder Uracilyl an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweisen kann,
R = H, ein Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Cyanoalkyl, Haloalkylrest sein kann
R1 = H, OH, Halogen, Acylamino, Alkoxy oder substituiertes Alkoxy mit 1 bis 4 C- Atomen sein kann, oder über C2'-C4' Zyklisierung mit der Riboseeinheit einen Bicyclus ergeben kann (LNA),
und n = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
23. Verwendung eines Nukleosidderivates gemäß Anspruch 22 in einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 11.
24. Verwendung eines Nukleosidderivates gemäß Anspruch 22 in einem Kit gemäß Anspruch 16 und/oder 17.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2215102B1 (de) 2007-10-01 2016-02-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense-modulation der expression des fibroblasten-wachstumsfaktor-rezeptors 4
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69227793T2 (de) * 1991-03-06 1999-08-19 Polish Academy Of Sciences Verfahren und Verbindungen für die Festphase-Synthese von Oligonukleotiden und Analogen

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4444996A1 (de) * 1994-12-16 1996-06-20 Wolfgang Prof Dr Dr Pfleiderer Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen
US6022963A (en) * 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
DE19915867A1 (de) * 1999-04-08 2000-10-19 Deutsches Krebsforsch Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen
AU5059800A (en) * 1999-04-08 2000-11-14 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Nucleoside derivatives with photo-unstable protective groups
CA2421732A1 (en) * 2000-09-11 2002-03-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
EP1409505A1 (de) * 2001-07-09 2004-04-21 Chemogenix GmbH Multimer polynukleotidsynthese

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69227793T2 (de) * 1991-03-06 1999-08-19 Polish Academy Of Sciences Verfahren und Verbindungen für die Festphase-Synthese von Oligonukleotiden und Analogen

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