DE69732101T2

DE69732101T2 - Kombinatorische schutzgruppestrategie für multifunktionelle molekule

Info

Publication number: DE69732101T2
Application number: DE69732101T
Authority: DE
Inventors: Dr. Hubert KÖSTER; Eckart Leikauf
Original assignee: Koster Hubert Dr Cambridge
Current assignee: Caprotec Bioanalytics 12489 Berlin De GmbH
Priority date: 1996-04-17
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2017-04-18
Also published as: ATE286063T1; WO1997041139A2; US6828435B2; AU2462497A; EP0898575A2; US20030054410A1; WO1997041139A3; DE69732101D1; EP0898575B1; US20030194741A1

Description

1. Hintergrund der Erfindung
Herkömmlicherweise basierte Wirkstoffentwicklung nicht auf genetischer Information. Rationalere Ansätze sind derzeit möglich, jedoch, basierend auf dem gesammelten Wissen im Hinblick auf die molekularen Mechanismen infektiöser Teilchen (Viren, Bakterien, Hefe, Pilze und Protozoen) und die Zielstellen für Antibiotika im molekularen Bereich. Zwei neue Ansätze, welche eine rationalere Wirkstoffgestaltung versprechen, sind aus der kombinatorischen Chemie (Gordon, E. M., et al., J. Med. Chem. 1994, 37, 1385–1401; Alper, J., Science 1994, 264, 1399–1401) und Antisense (Cohen, J. S., et al., Scientific American international edition, Dezember 1994, Seiten 50–55).
In der kombinatorischen Chemie wird eine große Anzahl aller Varianten einer spezifischen Familie von Verbindungen synthetisiert und auf spezifische Affinität im Hinblick auf Zielmoleküle, d. h. Rezeptorbindungsstellen, untersucht. Der Antisense-Ansatz verwendet geeignet modifizierte Oligonukleotidsequenzen, welche so ausgebildet sind, um an essenzielle Regionen für Genexpression oder Viren oder zelluläre Replikation zu binden, was zu vollständiger Suppression der codierten Funktionen führt.
H-Phosphonat- oder Phosphoamidit-Chemie, die Festphasenverfahren in automatisierten DNA-Synthesevorrichtungen verwendet, ist am wirkungsvollsten für die Synthese von Oligonukleotiden. Das Phosphoramiditverfahren, das β-Cyanoethylphosphoramidite als reaktive Nukleotid-Bausteine verwendet, ist das vorherrschenste Syntheseverfahren aufgrund der quantitativen Kondensationsausbeuten trotz eines Oxidationsschritts in jedem Zyklus (Sinha, N. D. et al., Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843–46; Sinha, N. D. et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 4539–57; Froehler, B. C. et al., Nucleic Acids Res., 1984, 14, 5399–5407; Froehler, B. C. und Matteuci, M. D., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 469–72; Garegg, P. J. et al., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 4051–54; Sonveaux, E., Bioorg. Chem., 1986, 14, 274–325; Uhlmann, E. und Peyman, A., Chem. Rev., 1990, 90, 543–84).
Entsprechend dieses Verfahrens wird DNA typischerweise in der 3'-5'-Richtung synthetisiert, unter Verwendung temporärer Säure-labiler 4,4'-Dimethoxytrityl(DMTr)-Gruppen. Die Base (Acylamidbindungen) und Phosphatschutz (β-Cyanoethyl – entschützt über β-Eliminierung) und die Esterbindung an den Träger werden in einem einzelnen Schritt durch eine nichtselektive Reaktion mit konzentriertem wässrigem Ammoniak gespalten.
Um als Arzneimittel oder Wirkstoffe geeignet zu sein, müssen Oligonukleotide durch Zellwände und Kernmembranen dringen können, ohne enzymatischen Abbau einzugehen. Unmodifizierte Oligonukleotide sind im Allgemeinen für diesen Zweck nicht geeignet. Daher ist die Entwicklung modifizierter Oligonukleotide wesentlich für den Antisense/Triplex-DNA-Ansatz. Es sind verschiedene Modifikationen eingeführt worden, welche hauptsächlich die Internukleotidbindung (d. h. Methylphosphonate, Phosphorothioate und -dithioate, Phosphattriester, Phosphoamidate, Ersatz der Internukleotidbindung, umfassend keinen Phosphor enthaltende Reste, wie etwa PNAs), die Base, 2'-Deoxyribose oder Verbindungen verschiedener Moleküle an dem 3'- oder 5'-OH-Ende des Oligonukleotids verändern (Uhlmann, E. und Peyman, A., Chem. Rev., 1990, 90, 543–84; Nielsen, P. et al., Science, 1991, 254, 1497; Beaucage, S. L. und Iyer, R. P., Tetrahedron., 1993, 49, 6123; Nielsen, P. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 703–710).
Standardsyntheseverfahren führen typischerweise zur Guanidinabspaltung durch die Entfernungen der DMTR-Gruppe in jedem Verlängerungszyklus (Shabarova, Z., Bogdanov, A. in Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, Deutschland, 1994). Da die Synthese üblicherweise 3,-5'-gerichtet ist, sind Oligonukleotide, die an ihrem 3'-OH-Ende substituiert sind, nicht leicht verfügbar. Darüber hinaus ist nichtselektive Entschützung durch Ammoniak nachteilhaft für die Synthese modifizierter DNA, falls Schutzgruppen einen Teil der Modifizierungsstrategie von Oligonukleotiden sind.
Antisense/Triplex-Oligonukleotide weisen bestimmte Anforderungen auf. Die Hybridisierung muss spezifisch sein und stark genug sein, um ein ausreichendes Blockieren der mRNA oder der Kern-DNA-Zielsequenzen sicherzustellen. Zusätzlich sollten die Oligonukleotide modifiziert sein, um gegenüber enzymatischem Abbau (z. B. durch Exo- und Endonukleasen) zu schützen und den Durchgang durch die cytoplasmatische Membran (um auf mRNA-Sequenzen zuzugreifen) und die Kernmembran (auf Ziel-DNA-Sequenzen durch Bilden von dreifachen Helices) zu erleichtern. Um therapeutisch wertvoll zusein, müssen die modifizierten Oligonukleotide offensichtlich auch nichttoxisch sein und das Syntheseverfahren muss leicht anwendbar und kosteneffektiv einem Scale-up unterziebar sein.
Ob die Zielsequenzen der mRNAs für Hybridisierung zur Verfügung steht (d. h. lokalisiert in Schleifen- oder einzelsträngigen Bereichen und nicht in Stamm- oder tertiären Strukturen verborgen) steht, kann nicht mit absoluter Sicherheit vorhergesagt werden (Engels, J., Natur; Chem. Techn. Lab. 1991, 39, 1250–54). Zusätzlich kann eine synthetische DNA auch an nicht vorgesehene Ziele, wie etwa Proteine binden (Cohen, J. S. et al., Scientific American, international edition, Dezember 1994, Seiten 50–55), wie es in Gewebekultur beobachtet wird, die mit Phosphorothioatoligonukleotiden behandelt werden. Dies könnte zu weiteren Anforderungen und einer Feinabstimmung zur Modifizierung führen, da Verbesserungen in einer Hinsicht einen Nachteil in einer anderen Hinsicht bewirken könnten. Zum Beispiel kann die Einführung von polycyclischen aromatischen Verbindungen zu höherer Affinität für den komplementären Strang aufgrund der Interkalierungseigenschaften führen, jedoch gleichzeitig wird die verringerte Spezifität zu einer erhöhten Toxizität oder Mutagenität führen (Engels, J., Nachr. Chem. Techn. Lab., 1991, 39, 1250–54). In dem Dreifachhelixansatz besteht die Erfordernis spezieller Strukturen, wenn die Zielsequenzen nicht aus einer kontinuierlichen Strecke aus Purinresten bestehen, welche eine Voraussetzung für Dreifachhelixbildung ist (Cohen, J. S., et al., Scientific American international edition, Dezember 1994, Seiten 50–55).
Der Fortschritt bei der Synthese modifizierter Oligonukleotide ist bemerkenswert, jedoch nur einige der Anforderungen können in einem Syntheseverfahren erfüllt werden, da keines der Verfahren Flexibilität aufweist. Festphasenoligonukleotidsynthese, unter Verwendung von z. B. monomeren Phosphodimorpholinoamiditen, erlaubt die Bildung einer Vielzahl von Oligonukleotidphosphattriestern (Uznanski, B., et al., Tetrahedron Lett., 1987, 28, 3401–04). Jedoch ist die Modifizierungsvielfalt begrenzt auf Derivatisierungen der Phosphatgruppe bzw. des Phosphatrestes alleine. In einem anderen Beispiel führte Insertion von (R)- und (S)-3',4'-seco-Thymidin Oligodeoxynukleotide (Modifizierung der 2-Deoxyribose) (Nielsen, P., et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 703–10) nur zu Oligomeren mit guten Hybridisierungseigenschaften und Stabilität gegenüber 3'-Exonukleaseabbau. Alle derzeitigen Synthesemethoden und -strategien werden durch begrenzte Vielseitigkeit und Flexibiliät behindert, da die Einführung jeder Modifikationen einen separaten Oligonukleotidsyntheselauf erfordert. Die Entwicklung optimierter Modifikationsschemata ist daher zeitaufwändig und kostenintensiv.
Es besteht ein enormer Bedarf für Synthesestrategien und Methoden, die die Erzeugung einer nahezu unbegrenzten Menge von Sequenz-spezifischen Modifikationen erlauben, die aus einem Syntheselauf erhalten werden können. Zusätzlich erlaubt die Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken der gleichen Oligonukleotidsequenz in verschiedenen Schutz- und/oder Modifizierungsstufen die Auswahl von Molekülen mit Affinitäten für Nicht-Nukleinsäuremoleküle, wie etwa Rezeptorstellen, durch Verwendung des Oligonukleotidgrundgerüsts als ein oligomeres Gerüst, das verschiedene Funktionalitätsmuster zeigt, die für spezifische molekulare Erkennungsprozesse verfügbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die oben diskutierten Probleme, die durch diese Erfindung beseitigt werden können, können wie folgt zusammengefasst werden:

1) Unter Verwendung neuer Schutzschemata und Festphasensynthese werden Oligonukleotide in 5'- nach 3'-Richtung erhalten, unter Verwendung von Phosphoamiditen und Vermeidung von Depurinierung bzw. Guanidinabspaltung. Die verwendete 3'-OH-Schutzgruppe ist geeignet als eine Reinigungshandhabe für HPLC-Reinigung und kann nachgewiesen werden in dem sichtbaren Spektralbereich mit hoher Empfindlichkeit, um Kondensationsausbeuten zu bestimmen.
2) Jede Schutzgruppe des Oligonukleotids (inklusive des Träger-Spacer-Restes am 5'- oder 3'-OH-Ende des Oligonukleotids) ist selektiv entfernbar (Multiselektivität der Entschützung, Prinzip der Orthogonalität). Darüber hinaus können Phosphat- und Base-Schutzgruppen entfernt und ausgewählt werden an vorbestimmten Positionen. Durch Substitutionsreaktionen kann eine einfache und rasche Synthese einer Vielzahl von Derivaten für das Antisense/Triplex-Konzept verfügbar gemacht werden. Alle möglichen Derivatisierungen können mit nur einem Oligonukleotidsyntheselauf durchgeführt werden. Dieses vielseitige Syntheseverfahren ist daher für ein Scale-up anwendbar.
3) Darüber hinaus können die selektiven und orthogonalen Verfahren und Abwandlungen davon auf Strukturen angewendet werden, die von Oligonukleotiden verschieden sind. Dadurch werden verschiedene modifizierte Moleküle erzeugt, die hinsichtlich Wechselwirkungen mit einem spezifischen molekularen Ziel oder ein biologisches Erkennungsverfahren zu testen sind.

Daher liefert in einer Hinsicht die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines kombinatorischen Satzes von Molekülen der Kernstruktur M, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen mehrerer immobilisierter Moleküle der Kernstruktur M, worin die Moleküle mehrere reaktive Gruppen enthalten, wobei jede reaktive Gruppe durch eine Blockierungsgruppe blockiert ist, worin mindestens drei der Blockierungsgruppen unabhängig entfernbar sind unter mindestens drei verschiedenen Bedingungen; und
(b) Entfernung bestimmter Blockierungsgruppen und Derivatisieren der resultierenden reaktiven Gruppen auf eine vorbestimmte, regioselektive Art, worin jedes Element eines kombinatorischen Satzes einzigartig derivatisiert wird an mindestens einer reaktiven Gruppe mit einem einzigartigen Substituenten, wobei ein kombinatorischer Satz von Molekülen der Kernstruktur M erzeugt wird.

Die Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren zum Erzeugen eines kombinatorischen Satzes von Oligomeren, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen mehrerer immobilisierter Moleküle der Kernstruktur M und enthaltend mehrere reaktive Gruppen, wobei jede reaktive Gruppe blockiert wird durch eine Blockierungsgruppe, worin mindestens drei der Blockierungsgruppen unabhängig entfernbar sind unter mindestens drei verschiedenen Bedingungen; und
(b) Entfernen bestimmter Blockierungsgruppen und Derivatisieren der resultierenden reaktiven Gruppen auf eine vorbestimmte, regioselektive Art, worin mindestens eine reaktive Gruppe derivatisiert wird durch Zugeben eines vorab ausgewählten Monomers, und worin das Monomer mehrere reaktive Gruppen enthält, wobei jede reaktive Gruppe blockiert wird durch eine Blockierungsgruppe, worin mindestens eine der Blockierungsgruppen unabhängig entfernt werden kann unter mindestens einer der drei verschiedenen Bedingungen;
(c) aufeinanderfolgendes Durchführen von Schritt (b) für die geeignete Anzahl von Zyklen, um ein Oligomer zu erhalten, umfassend die gewünschte Anzahl Monomere, worin jedes Element eines kombinatorischen Satzes in einzigartiger Weise an mindestens einer reaktiven Gruppe mit einem einzigartigen Substituenten derivatisiert wird, wobei ein kombinatorischer Satz von Oligomeren erzeugt wird, welche aus der gleichen Anzahl von Monomeren bestehen, jedoch welche sich in der Zusammensetzung von mindestens einem Monomer oder in der Derivatisierung von mindestens einer reaktiven Gruppe innerhalb mindestens eines Monomers unterscheiden.

Die Erfindung liefert auch eine Zusammensetzung, umfassend ein Oligonukleotid der allgemeinen Formel 49a:
worin ➀, ➁, ➂, ➃ Positionen in dem Molekül sind, welche regioselektiv adressiert werden können und worin B eine natürliche oder modifizierte Nukleobase bedeutet, welche keine Schutzgruppe während der Synthese erfordert, BR^2A, BR^2B, eine natürliche oder modifizierte Nukleobase mit einer Schutzgruppe ist und R^2A und R^4A verschiedene Schutzgruppen bedeuten, die die Bildung eines kombinatorischen Satzes von Oligonukleotiden mit 16 möglichen Schutzzuständen oder nachfolgende Derivatisierung an den Positionen ➀–➃ erlauben, und R^2B, R^4B Schutzgruppen darstellen, welche während dem Entschützen und/oder nachfolgender Derivatisierung bei ➀–➃ stabil sind; R³ die 3'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Trityl, substituiertem Trityl, Triphenylmethoxyacetyl, Diphenyl-tert-butylsilyl, Succinyl, β-Benzoylpropionyl, Lävulinyl, tert-Butyl-dimethylsilyl, 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc), 3-{4-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methyl]-phenyl}-propionyl, 5-{3-[bis(4-Methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl, 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methoxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl oder die Bindung an einen festen Träger und R¹ die 5'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der gleichen Gruppe wie für R³, und worin R¹ und R³ verschieden sind.
Die Erfindung liefert auch einen kombinatorischen Satz von Verbindungen mit Kernstruktur M und mit mehreren reaktiven Resten, enthaltend Blockierungsgruppen, worin mindestens drei Gruppen unabhängig unter verschiedenen Bedingungen entfernbar sind, wobei selektive Derivatisierung nach Entblocken erlaubt wird und worin eine funktionelle Gruppe zur Immobilisierung verwendet wird.
Die obigen und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen deutlicher.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein HPLC-Chromatogramm eines Gemischs des Oligodeoxynukleotids d(TAGCT), erhalten durch 5'-3'- und 3'-5'-gerichtete Synthese.
2 ist ein HPLC-Chromatogramm eines Gemischs des Oligodeoxynukleotids d(TTTT), erhalten durch 5'-3'- und 3'-5'-gerichtete Synthese.
3 ist ein MALDI-TOF-Massenspektrum des Oligodeoxynukleotids d(TAGCT), erhalten durch 5'-3'-gerichtete Synthese.
4 ist ein MALDI-TOF-Massenspektrum des Oligonukleotids d(TTTT), erhalten durch 5'-3'-gerichtete Synthese.
5 ist ein MALDI-TOF-Massenspektrum des Oligonukleotids d(TAGCT), erhalten durch 3'-5'-gerichtete Synthese.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hier verwendet, besitzen die folgenden Ausdrücke und Beschreibungen die folgenden Bedeutungen:
"Monomer" oder "Baustein" soll ein Molekül mit einer Kernstruktur M und mehreren reaktiven Gruppen bzw. Resten betreffen, die leicht selektiv geschützt oder funktionalisiert werden können.
"Oligomer", "oligomere Verbindung" oder "Polymer" betrifft mehr als ein kovalent verbundenes Monomer oder kovalent gebundenen Baustein.
B/R^2A/B = B oder BR^2A oder BR^2B
R^4A/B = R^4A oder R^4B
"npeoc/npe-Schutz" bedeutet npeoc-Schutz oder npeoc- und npe-Schutz, wie in der Beschreibung von Schema 1 für die npeoc/npe-geschützten Basen gezeigt.
"Sequenz-spezifische Abwandlung" bedeutet Abwandlungen an definierten Basen und/oder Phosphatgruppen aufgrund der unterschiedlichen Baseart und Phosphatschutzgruppe (R^2A oder R^2B bzw. R^4A oder R^4B).
Im Allgemeinen zeigt die vorliegende Erfindung neue Strategien für chemische Polymersynthese, welche multiselektive Entschützung (z. B. über Sequenzabhängige vorbestimmte Selektion geeigneter Nukleotid- Bausteine erlaubt), um Polymere mit vorbestimmten Modifikationen und/oder Funktionalitäten zu entwickeln. Verschiedene Kombinationen dieser spezifisch modifizierten/funktionalisierten Monomere oder Oligomere können einen kombinatorischen Satz von Molekülen erzeugen, die für spezifische molekulare Wechselwirkungs- oder Erkennungsversuche verfügbar sind.
Das folgende Schema 1 zeigt eine verallgemeinerte 5'- nach 3'-gerichtete Oligonukleotidsynthese, die zu Oligomeren für Sequenz-spezifische selektive und orthogale Entschützungen und für nachfolgende Derivatisierungen führt. Der erste Schritt in dem Oligonukleotidsynthesezyklus ist die Entfernung von R³. Schema 1
R^4A = β-Cyanoethyl als Schutzgruppe für selektive und orthogonale Entschützung mit Reagenz II (Tabelle 1),
R^4B = eine Schutzgruppe, die stabil mit Reagenz 11 ist (Tabelle 1).
B = eine natürliche oder modifizierte Nukleobase, die keine Schutzgruppe während der Synthese erfordert,
B^R2A, B^R2B = eine natürliche oder modifizierte Nukleobase mit einer Schutzgruppe,
R^2A, R^2B = verschiedene Schutzgruppen, z. B. ist R^2A die nps-Schutzgruppe in: N⁴-nps-Cytosin (C^npS), N⁶-nps-Adenin (A^nps), N²-nps-Guanin (G^nps) für selektive und orthogonale Entschützung gemäß Tabelle 1 und z. B. ist R^2B der npeoc, npe-Schutz in: N⁴-npeoc-Cytosin (C^npeoc), N⁶-npeoc-Adenin (A^npeoc), N²-npeoc-O6-npe-Guanin (G^npeoc,npe), stabil unter Entschützungsbedingungen von Tabelle 1, npeoc = 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl, npe = 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl.
n: Anzahl von Kondensationsreaktionen; ➀, ➁, ➂, ➃: Schutzpositionen; CPG: Glas mit kontrollierten Poren (Controlled-Pore-Glass).
Wie in Schema 1 gezeigt, wird ein 2'-Deoxyoligonukleotid 3 z. B. synthetisiert durch das Phosphoamididverfahren (Sinha, N. D., Biernat, J., Köster, H. Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843–46; Sinha, N. D., Biernat, J., McManus, J., Köster, H. Nucleic Acids Res., 1984, 12, 4539–57; Sonveaux, E. Bioorg. Chem., 1986, 14, 274–325). Jedoch im Gegensatz zu der üblichen 3'- nach 5'-Addition wird die Synthese in der 5'- nach 3'-Richtung durchgeführt, unter Verwendung der Bausteine 1 und 2. Während eines Verlängerungszyklus wird die temporäre Schutzgruppe, R³, entfernt, z. B. unter Verwendung eines neutralen Hydrazinreagenz IV (Tabelle 1), vor dem Kondensationsschritt, und das angesäuerte Filtrat der Hydrazinolyselösung wird spektrophotometrisch gemessen, um die vorhergehende Kondensationsausbeute zu bestimmen. Auf diese Art ist ein Trityl-Assay, wie er typischerweise mit der 4,4'-Dimethoxytriylgruppe verwendet wird, möglich. Zusätzlich besteht geringe Gefahr einer Guanidinabspaltung bzw. Depurinierung, da saure Bedingungen während der Synthesezyklen nicht verwendet werden.
Selektive und orthogonale Entschützungen sind möglich, wenn an den Verbindungen ➀–➃ von Oligomer 3 Entschützungen selektiv durchgeführt werden, wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Selektive und orthogonale Entschützungen an Oligomer 3
Selektive Entschützungen erlauben die folgenden 16 Entschützungskombinationen von vollständig geschütztem Oligomer, vollständig entschütztem Oligomer (➀, ➁, ➂, ➃) oder teilweise entschützten Oligomeren nach den folgenden Kombinationen von Entschützungsreaktionen, entschützt an Positionen: (➀, ➀ + ➁, ➀ + ➁ + ➂, ➀ + ➂, ➀ + ➃, ➀ + ➂ + ➃, ➀ + ➁ + ➃, ➁, ➂, ➃, ➁ + ➂, ➁ + ➃, ➂ + ➃, ➁ + ➂ + ➃). Innerhalb der Kombinationen von Entschützungsreaktionen kann die Reihenfolge der Entschützung gewählt werden. Zusätzlich liefert die Verwendung verschiedener Base- und/oder Phosphor-geschützter Bausteine 1 und 2 (Schema 1) während der Oligonukleotidsynthese Sequenzen mit offenen spezifischen Base- und/oder Phosphat-Funktionalitäten. Nach jeder Entschützung kann die nukleophile Gruppe des Oligomers mit einem neuen Substituenten umgesetzt werden oder kann ungeschützt bleiben. Nur eine kleine Menge Träger ist erforderlich, um ein solches neu derivatisiertes Oligomer zu entwicklen, sodass eine große Vielzahl Derivatisierungen mit nur einem Oligomersyntheselauf möglich ist.
Schema 2 zeigt ein Beispiel eines immobilisierten vollständig geschützten Oligomers 3 für Sequenz-spezifische Derivatisierungen durch die Verwendung verschiedener Base- und/oder Phosphor-geschützter Bausteine 1 und 2 von Schema 1, unter Verwendung der Reagenzien von Tabelle 1.
Schema 2
Die selektiven und orthogonalen Entschützungen und die Derivatisierungen durch Einführen neuer Substituenten kann an den Positionen ➀–➃, an ➁ und ➂ in einer Sequenz-spezifischen Art durchgeführt werden. Während der Derivatisienangen an ➀–➃ bleibt nur der npeoc/npe-Baseschutz intakt. Im Gegensatz hierzu muss die Phosphatschutzgruppe R^4B intakt bleiben wenn Derivatisierungen an ➁ durchzuführen sind. Die npeoc/npe- und R^4B-Schutzgruppen dienen nur dazu Sequenz-spezifische Derivatisierungen an ➁ und/oder ➂ durchzuführen. Nach den Derivatisierungen sind zumindest die Basen, die mit npeoc/npe-Gruppen geschützt sind, zu entschützen, ohne gleichzeitig neue Substituenten an ➀–➃ zu entfernen. Die Entfernung der npeoc/npe-Gruppen ist erforderlich, um ausreichende Hybridisierungseigenschaften der derivatisierten Oligomere mit komplementären Nukleinsäurensequenzen zu garantieren.
Baseschutz
Der npeoc/npe-Schutz erwies sich als stabil während Entschützungsbedingungen der Verbindung 3 an den Positionen ➀–➃ (Schema 1 und 2) mit den Reagenzien I–IV (Tabelle 1). Während des npeoc/npe-Entschützens mit DBU-Reagenz ist keine Entfernung der neuen Substituenten ➀–➃ gewünscht. Diese neuen Substituenten sind z. B. gebunden an den Positionen ➀ und ➃ über (Trityl)ether- oder Carbonsäureesterbindungen, z. B., an ➁ über Phosphatesterbindungen z. B. und an ➂ über Amidbindungen an das Oligomer. Die Stabilität der Phosphatester, Carbonsäureester- und der Nukleosidbaseamid-Bindung während npeoc/npe-Entschützung ist beschrieben worden (Stengele, K. P., Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2549–52; Himmelsbach, F., Schulz, B. S., Trichtinger, T., Ramamurthy, C., Pfleiderer, W., Tetrahedron, 1984, 40, 59–72). Diese Entschützungsbedingungen erwiesen sich so, dass sie nicht die Trityletherbindung und den nps-Baseschutz beeinträchtigen. Andere Baseschutzgruppen, zusätzlich zu dem npeoc/npe-Schutz, sollten zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung geeignet sein.
Phosphatschutz
Die Stabilität von R^4B während des Entschützens an ➀, ➂ und ➃ ist nicht zwingend erforderlich. Wenn R^4B entfernt wird, z. B. während eines Entschützens an Position ➃ unter Verwendung von Reagenz IV, würde Reaktion der OH-Gruppe an Position ➃ mit einem Acylchlorid zu einem gemischten Anhydrid an der Phosphatgruppe führen, welches nachfolgend entweder in eine neu geschützte Funktion übergeführt werden könnte oder zu dem Phosphodiester hydrolysiert werden könnte. Natürlich sollte die Substitution an Position ➁ zuvor durchgeführt werden; R^4B muss mit Reagenz II stabil sein, um eine Sequenzspezifische Derivatisierung an Position ➁ zu garantieren.
Der Phosphatschutz mit der p-Chlorphenylgruppe ist z. B. stabil mit Reagenz 11, im Gegensatz zu der β-Cyanoethylgruppe (Hsiung, H. M., Tetrahedron Lett., 1982, 23, 5119–22). Der Phosphatschutz mit der o-Chlorphenylgruppe ist z. B. stabil mit 0,5 M Hydrazinreagenz (Watkins, B. E., Kiely, J. S., Rapoport, H., J. Am. Chem. Soc., 1982, 104, 5702–08). Der Phosphatschutz mit der 2,5-Dichlorphenylgruppe ist z. B. stabil mit starken Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure in Methylenchlorid/Methanol (Himmelsbach, F., Schulz, B. S., Trichtinger, T., Ramamurthy, C., Pfleiderer, W., Tetrahedron, 1984, 40, 59–72). Während des Entschützens von R^4B ist keine Entfernung der neuen Substituenten an ➀–➃ gewünscht. Die o-Chlorphenylgruppe erlaubt z. B. Entschützen mit 4-Nitrobenzaldoximat ohne Benzoesäurester- und nps-Amid-Bindungen zu beeinträchtigen (Heikkilä, J., Balgobin, N., Chattopadhyaya, J., Acta Chem. Scand., 1983, B37, 857–62). Weiterhin ist die o-Chlorphenylgruppe leicht entfernbar mit (n-Butyl)₄NF (Reese, C. B., Titmas, R. C., Yau. L., Tetrahedron Lett., 1978, 2727–30). Unter diesen Bedingungen bleiben Essigsäureester-, Tritylether-Bindungen und der Nukleosidbase-Schutz mit den Acetyl- oder Benzoylgruppen intakt (Ogilvie, K. K., Can. J. Chem, 1973, 51, 3799–3807).
Zusätzlich zu den beschriebenen 16 Entschützungskombinationen an den Positionen ➀–➃ könnten selektive und orthogonale Entschützungen an den verschiedenen nps-geschützten Basen (z. B. Entschützung an C^nps vor A^nps in Oligomer 3, Schema 1 und 2) zu einem Maximum von 64 Entschützungskombinationen führen. Die Rate der Baseentschützung in nps-Base-geschützten Nukleosiden erwies sich als wesentlich beeinflusst durch das Entschützungsreagenz (Thiocresolatkonzentration und Lösungsmittel). Die Entschützungsrate in 0,02 M Thiocresolat in Pyridin nimmt wie folgt ab: 2'-Deoxy-N²-nps-guanosin (G_d ^nps)>>2'-Deoxy-N⁴-nps-cytidin (C_d ^nps)>>2'-Deoxy-N⁶-nps-adenosin (A_d ^nps). Es hatte den Anschein, dass es schwierig wäre, Reagenzien zu identifizieren, die zu einer Reversion dieser Reihenfolge führen, um z. B. nps-geschütztes Cytosin und Guanin in der Gegenwart von nps-entschützten Adeninresten zu erhalten. Jedoch könnte ein solcher Entschützungszustand erreicht werden durch selektives Entschützen der C^nps- und G^nps-Gruppen, gefolgt durch erneutes Schützen mit Gruppen, die stabil mit Thiocresolatreagenz sind. Schließlich kann A^nps mit diesem Reagenz entschützt werden. In einem noch anderen Ansatz kann dieses Schutzschema erhalten werden durch Verwenden der geeigneten geschützten Nukleotid- Bausteine während der Oligomersynthese.
Verglichen mit derzeitigen Oligodeoxynukleotidsynthesen zur Verwendung in Antisense- und Triplex-DNA-Therapien (Cohen, J. S., Hogan, M. E., Scientific American. Int. Ed., Dezember 1994, Seiten 50–5514; Uhlmann, E., Peyman, A., Chem. Rev., 1990, 90, 543–84; Beaucage, S. L., Iyer, r. P. Tetrahedron, 1993, 49, 6123–94), zeigt die neue Strategie einen bemerkenswerten Vorteil. Alle möglichen Derivatisierungen können mit nur einem Oligonukleotidsyntheselauf durchgeführt werden.
Die oben dargestellte Strategie kann entsprechend anderer Oligonukleotidsyntheseschemata modifiziert werden. Zum Beispiel kann zusätzlich zu dem Phosphoramiditverfahren, das in Schema 1 gezeigt wird, die Strategie mit dem Phosphotriester- und anderen geeigneten Verfahren zur Oligonukleotidsynthese verwendet werden. Für das Phosphotriesterverfahren wurden Chlor-substituierte Phenylgruppen und die β-Cyanoethylgruppe erfolgreich als Phosphatschutzgruppen verwendet (Amarnath, V., Broom, A. D., Chem. Rev., 1977, 77, 183–217; Reese, C. B. Tetrahedron, 1978, 34, 3143–79). Der Lävulinsäureester- und der npeoc/npe-Baseschutz sind während der Reaktionsbedingungen des Phosphotriesterverfahrens stabil (Himmelsbach, F., Schulz, B. S., Trichtinger, T., Ramamurthy, C., Pfleiderer, W., Tetrahedron, 1984, 40, 59–72; van Boom, J. H., Burgers, P. M. J. Tetrahedron Lett., 1976, 4875–78). Der nps-Baseschutz ist erfolgreich verwendet worden während der Oligonukleotidsynthese durch den Phosphotriesteransatz (Heikkila, J., Balgobin, N, Chattopadhyaya, J., Acad. Chem. Scand., 1983, B37, 857–62). Die Struktur der auf diese Syntheseart erhaltenen Oligomere ist die gleiche wie für das Oligomer 3, das durch das Phosphoamiditverfahren erzeugt wird (Schema 1).
Zusätzlich, falls das Oligomer (z. B. 3 in Schema 1) an seiner 3'-OH- oder 5'-OH-Gruppe an das CPG über eine Lävulinsäureesterbrücke gebunden ist (Spaltung mit neutralem Hydrazinreagenz IV) würde anstelle der Trityletherbrücke in 3, eine vereinfachte 3'-5'- als auch eine 5'-3'-gerichtete DNA-Synthese verfügbar sein, die den Vorteil multiselektiver Entschützungen beinhaltet, wobei der Tritylrest leicht nachzuweisen ist und als ein "Reinigungshandhabungsmittel" vorliegt (Sinha, N. D. Biernat, J., Köster, H. Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843–46; Sinha, N. D., Biernat, J., McManus, J., Köster, H. Nucleic Acids Res., 1984, 12, 4539–57; Sonveaux, E. Bioorg. Chem., 1986, 14, 274–325). Zur Synthese durch das Phosphoamiditverfahren werden Amidite, deren 5'-OH- bzw. 3'-OH-Gruppen mit der 4,4'-Dimethoxytrityl (DMTr)-Gruppe geschützt sind, verwendet. Schema 3 zeigt eine allgemeine Betrachtung und die Schemata 4 bis 6 zeigen spezifische Beispiele.
Schema 3
a: selektiver 5'-OH-Schutz. b: Tritylierung mit DMTr-Chlorid. c: 5'-OH- Entschützung, z. B. mit tert-Butylaminreagenz II (Tabelle 1) oder z. B. mit Triethylaminreagenz. d: Phosphitylierung. e: Selektives 5'-OH-Schützen mit DMTr-Chlorid. f: Phosphitylierung. g: 5'-3'-gerichtete Oligonukleotidsynthese mit 11 und B. h: 3'-5'-gerichtete Oligonukleotidsynthese mit 13 und 10. R⁵: CPG ----- CH₂COCH₂CH₂CO- (Träger-verankerte Lävulinylgruppe); n, B, B/^R2A/B, R^4A/B: siehe Schema 1.
Schema 4
Beschreibung von Schema 4
Aromatische Substitution: ortho, meta oder para. a: Bildung von Säureanhydrid mit DCC. b: Aminolyse des gebildeten Anhydrids mit Aminopropyl CPG. c: Verseifung mit 32%-iger Ammoniaklösung (X = NH₄ ⁺) oder K₂CO₃/Methanol/Wasser (Verhältnis: 6,95 g/87,4 ml/69,5 ml; X = K⁺)¹). d: Reaktion mit 5-Brom-lävulinsäuremethylester in DMF²). e: Protonieren mit 2%-iger KHSO₄-Lösung, Deprotonieren mit Triethylamin. f, g: Reaktion mit Verbindung 7 bzw. 9 (Schema 3) in Ethylendichlorid, z. B. mit DCC³), cappen von nicht umgesetzten Carboxylfunktionen mit Methanol (Gupta, K. C. et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 3019–25). h, i: Oligonukleotidsynthese mit Amidit 8 bzw. 10 (Schema 3) zu den Oligomeren 22 oder 23 (vollständig geschützte Oligomere). Anmerkungen: 1) Waschen zum Entfernen alkalischer Lösung. 2) Waschen zum Entfernen von NH₄Br oder KBr, wobei andere Waschschritte nicht aufgeführt sind. 3) oder Reaktion des Imidazolids von Verbindung 19 mit z. B. Verbindung 7 oder 9 (Schema 3).
Schema 5
a: Bildung von Säureanhydrid von 24; Aminolyse mit z. B.: 2,2 mmol von Verbindung 24, 0,43 mmol DCC, 0,02 mmol 4-Dimethylaminopyridin in 4 ml Dioxan/Triethylamin 9/3 (V/V) und 1 g Aminopropyl CPG; Cappingreaktion mit 0,33 ml Essigsäureanhydrid; Waschen mit Dioxan, Methanol, DMF und Wasser. b: Reaktion mit K₂CO₃/Methanol/Wasser (Verhältnis: siehe Schema 4), Waschen mit Wasser. c: Protonieren mit 2%-iger KHSO₄-Lösung, Waschen mit Wasser, Ethanol und Ether. d: Reaktion mit Triethylamin zu Verbindung 25, Waschen mit Ethylendichlorid. Weitere Schritte entsprechen den Schritten f–i von Schema 4.
Schema 6
a: Reaktion von 26 (Johnson, W. S. und Hunt, R. H., J. Amer. Chem. Soc., 1950, 72, 935–39) mit DCC, z. B. zu dem Säureanhydrid. b: Aminolyse mit Aminopropyl CPG. c: Verseifung, Protonierung mit 2%-iger KHSO₄-Lösung, Deprotonierung mit Triethylamin. Weitere Schritte entsprechen den Schritten f–i von Schema 4.
Basierend auf den oben angegebenen Schemata kann der Fachmann in der Technik die Schemata modifizieren, um Phosphotriester und andere geeignete Verfahren anzupassen, um einen kombinatorischen Satz geschützter Moleküle herzustellen, die mehrere Gruppen bzw. Reste aufweisen, worin jede Gruppe einzeln entschützt und nachfolgend derivatisiert werden kann.
Die folgenden Erkenntniss zeigen die Durchführbarkeit dieses Umfanges der Synthesestrategie mit der Lävulinsäureesterbrücke. Der Baseschutz von Nukleosiden, die geschützt sind mit der 2-Nitrophenylsulfenyl (nps)-Gruppe ist ziemlich stabil mit starken Säurelösungen (Heikkila, J., Balgobin, N., Chattopadhyaya, J., Acta Chem. Scand, 1983, B37, 857–62). Wir fanden, dass die Stabilität gegenüber Guanidunabspaltung in 80%-iger Essigsäure wie folgt abnimmt: 2'-Deoxy-N⁶-nps-adenosin (A_d ^nps)>>2'-Deoxy-N²-nps-guanosin (G_d ^nps)>2'-Deoxy-N²-isobutynl-guanosin (G_d ^ib)>>2'-Deoxy-N⁶-benzoyl-adenosin (A_d ^bz); G_d ^ib und A_d ^bz werden starken Säuren in jedem Verlängerungszyklus in dem Standard-DNA-Syntheseverfahren unterzogen (Sinha, N. D., Biernat, J., Köster, H., Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843–46; Sinha, N. D., Biernat, J., McManus, J., Köster, H., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 4539–57; Sonveaux, E., Bioorg. Chem., 1986, 14, 274–325). Gemäß Heikkilä, J. et al., (Acta Chem. Scand., 1983, B37, 857–62), depuriniert A_d ^nps nicht mit 80%-iger Essigsäure, wenngleich das Hauptdepurinierungsproblem in der Standard-DNA-Synthese durch die A_d ^bz-Einheiten bewirkt wird. 2'-Deoxy-N⁴-nps-cytidin (C_d ^nps) ist mit 80%-iger Essigsäure stabil. Es wird kein Problem beobachtet, das durch Depurinierung mit npeoc/npe-Baseschutz bewirkt wird (Stengele, K. P., Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2549–52).
Um die neue Strategie zu testen, wurden d(TAGCT) und d(TTTT) durch eine 5'-3'-gerichtete DNA-Synthese synthetisiert mit Träger 1 (Schema 1, _B/R^2A/B = Thymin) und Amidite 2 (Schema 1, _B/R^2A/B = Thymin, npeoc/npe-geschützte Basen, R^4A/B = β-Cyanoethyl, entsprechend 2a–d von Schema 7). Der 3'-OH-Schutz wurde mit Hydrazinreagenz IV (Tabelle 1) nahe des neutralen pH-Werts entfernt, wobei eine heterocyclische Verbindung gebildet wird, welche in dem sichtbaren Spektralbereich mit hoher Empfindlichkeit nach Ansäuern nachgewiesen wurde (Leikauf, E., Köster, H., Tetradehron, 1995, 51, 5557–62). Um die gewünschten hohen Kondensationsausbeuten zu erhalten, musste der Zugabe der Amiditlösung die Aktivierung mit Tetrazol vorangehen. Das Oligomer konnte von dem Träger entfernt werden durch eine kurze Behandlung mit 80%-iger Essigsäure ohne den 3'-OH-Schutz zu beeinträchtigen. Die Eignung der 3'-OH-Schutzgruppe als "Reinigungshandhabemittel" (Sinha, N. D., Biernat, J., Köster, H., Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843–46; Sinha, N. D. Biernat, J., McManus, J., Köster, H., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 4539–57; Sonveaux, E., Bioorg. Chem, 1986, 14, 274–325) ist vergleichbar mit der DMTr-Gruppe. Die Entfernung der β-Cyanoethylgruppe wurde durchgeführt nach Synthese des geschützten d(TTTT) mit tert-Butylaminreagenz (Tabelle 1), nach Synthese des geschützten d(TAGCT) mit 0,5 M DBU in Acetonitril (Stengele, K. P., Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2549–52) (zusammen mit der Entfernung des Base- und 3'-OH-Schutzes). Aufgrund der Labilität des 3'-OH-Schutzes mit DBU-Reagenz sollte die Lävulinylgruppe substituiert werden durch eine Acylgruppe, die mit DBU-Reagenz stabil ist, vor Entfernung des Oligomers von dem Träger, falls eine Beibehaltung der Wirkung des Reinigungshandhabemittels gewünscht ist. Die 3-{4-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methyl]-phenyl}-propionyl-Gruppe der Verbindung 36 (Schema 8), die Triphenylmethoxyacetyl- (Werstiuk, E. S., Neilson, T., Can. J. Chem., 1972, 50, 1283–91) oder die Diphenyl-tert-butylsilylgruppe (Köster, H., Biernat, J., McManus, J., Sinha, N. D., 1985, Natural Products Chemistry), könnte eine solche Acylgruppe sein. Weitere experimentelle Schritte waren ähnlich der 3'-5'-gerichteten DNA-Synthese (Sinha, N. D., Biernat, J., Köster, H., Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843–46; Sinha, N. D., Biernat, J., McManus, J. Köster, H., Nucleic Acids, Res., 1984, 12, 4539–57; Sonveaux, E., Bioorg. Chem., 1986, 14, 274–325).
Um die Identität der synthetisierten Oligomere nachfolgend auf verschiedene Syntheserouten (3'-5'- gegenüber 5'-3'-Richtung) zu zeigen, wurden die Oligomere vollständig entschützt und durch HPLC analysiert. Simultane Analysen jedes der beiden d(TAGCT)- oder d(TTTT)-Oligomere führte zu einem einzelnen Signal, wodurch Identität bewiesen wird (1 und 2). Die vollständig entschützten Oligomere d(TAGCT) und d(TTTT) wurden weiterhin charakterisiert durch MALDI-TOF-Massenspektren (3 und 4). In 5 wird ein Spektrum von d(TAGCT), erhalten durch 3'-5'-gerichtete Synthese, gezeigt.
Das immobilisierte, vollständig geschützte d(TTTT) (Oligomer 3, _B/R^2A/B = Thymin, R^4A/B = β-Cyanoethyl) zeigt bereits acht verschiedene Kombinationen der Entschützung mit den Reagenzien 1, II, IV von Tabelle 1. Um die orthogonale Entschützung (16 Entschützungskombinationen) für das vollständig geschützte gemischte Oligomer 3 von Schema 1 zu zeigen (für Basen A, G, C die Schutzgruppe R^2A/B = R^2A = nps, R^4A/B = R^4A β-Cyanoethyl) mit den optimierten Entschützungsreagenzien I–IV von Tabelle 1, wurden zusätzliche Entschützungsversuche mit den immobilisierten Oligomeren 5'-O-R¹-d(TTTT)-3'-O-R³, 5'-O-R¹-d(TAGCT)-3'-O-R³ (R¹, R³ wie in Schema 1) und in Lösung mit den Modellverbindungen 5'-O-DMTr-2'-deoxythymidin [(DMTr)t_d], 28, 29a, 30a (Schema 10), G_d ^nps, A_d ^nps, C_d ^nps durchgeführt. Die Entschützungsreagenzien entfernten eine Schutzgruppe rasch, während die anderen Gruppen unter diesen Bedingungen für mindestens 24 h stabil waren. Dies wird durch die folgenden Ergebnisse gezeigt: 1) Reagenz I (80% Essigsäure): das 3'-O-geschützte d(TTTT) und d(TAGCT) werden von dem Träger nach 15 Minuten entfernt durch Detritylierung, in Verbindung 28 wird nur die DMTr-Gruppe abgespalten, Verbindung 30a wird nur in Verbindung 29a übergeführt, welche stabil ist, die nps-Gruppen der nps-geschützten Nukleoside werden nicht entfernt (nur an G_d ^nps wird Depurinierung beobachtet, jedoch langsamer als im Vergleich mit G_d ^ib); 2) Reagenz II (tert-Butylaminreagenz): Decyanoethylierung ist bei Verbindung 28 nach 40 Minuten abgeschlossen, (DMTr)T_d, Verbindungen 29a, 30a und die nps-geschützten Nukleoside sind stabil; 3) Reagenz III (Thiocresolatreagenz): nps-Gruppen werden an G_d ^nps, C_d ^nps nach 5 Minuten entfernt, an A_d ^nps nach 45–60 Minuten entfernt, die Verbindungen 28, 29a, 30a sind stabil; 4) die Reagenzien IVa, IVb (Hydrazinreagenzien): Delävulinisierung ist mit den Verbindungen 29a und 30a nach 8 Minuten abgeschlossen, Verbindung 28 und die nps-geschützten Nukleoside sind stabil.
G_d ^nps, A_d ^nps und C_d ^nps werden durch 0,02 M Jodreagenz, welches verwendet wird für die Oxidationsreaktion während Oligodeoxynukleotidsynthese, nicht beeinträchtigt. Versuche zu Base-spezifischen Entschützungen: G_d ^nps, C_d ^nps sind mit 0,5 M DBU in Acetonitril für 24 h stabil, A_d ^nps zeigt nur eine leichte Entschützung nach dieser Zeit. Die Verbindungen 30b–d waren mit den Reagenzien II und III für mindestens 24 h stabil, die Stabilität des npeoc/npe-Baseschutzes mit den Reagenzien I und IV wird z. B. durch die Synthese des Oligomers d(TAGCT) gezeigt.
Das folgende Schema 7 zeigt die Synthese des Bausteins 2, der für die Oligonukleotidsynthese von Schema 1 und 2 verwendet wird; und Schema 8 zeigt die Synthese des Baustein s 1, der für die Oligonukleotidsynthese von Schema 1 und 2 verwendet wird.
Schema 7
a: Kondensation von 31 mit DCC. b: Alkoholyse von 32. c: Detritylierung. d: Methylierung. e: Alkoholyse von [(CH₃)₂CH]₂NP(Cl)OCH₂CH₂CN mit 30a–d R^4A/B = β-Cyanoethyl
Schema 8
a: Hydrierung. b: Elektrophile aromatische Substitution mit Anisol. c: Veresterung. d: Oxidation. e: Chlorierung von 38. f. Alkoholyse mit 30a (Schema 7, B/^R2A/B: Thymin). g: Aminolyse mit Aminopropyl CPG zu Verbindung 1 (R¹, R³: siehe Schema 1).
Eine andere Ausführungsform der Erfindung verwendet die kombinatorische Schutzgruppenstrategie mit anderen multifunktionellen Molekülen. Das Oligomer 3 von Schema 1 besitzt vier geschützte Gruppen, die geeignet sind für selektives und orthogonales Entschützen mit den Reagenzien I–IV (Tabelle 1): 1) die β-Cyanoethyl-geschützte Phosphatgruppe, 2) die Tritylethergruppe, 3) die nps-geschützten Aminogruppen und 4) die Lävulinsäureestergruppe.
Selektive und orthogonale Entschützungen sind mit multifunktionellen Molekülen möglich, deren Kernstruktur M (Schema 9) verschieden von der Struktur von Oligomer 3 ist (d. h. multifunktionelle Moleküle mit niederem Molekulargewicht oder Biomoleküle, wie etwa Peptide, Lipide und Oligosaccharide). Die Verwendung des Verfahrens der Erfindung erleichtert die Entwicklung einer hohen Anzahl von Derivaten für kombinatorische Versuche (Gordon, E. M., Barrett, R. W., Dower, W. J., Fodor, S. P. A., Gallop, M. A., J. Med. Chem., 1994, 37, 1385–1401; Alper, J., Science, 1994, 264, 1399–1401). Multifunktionelle Moleküle müssen nicht auf das Vorliegen von Phosphat-, OH- und Amino-Funktionalitäten (wie in Oligonukleotiden) begrenzt sein, sondern könnten nur OH-Funktionalitäten oder andere Kombinationen funktioneller Gruppen enthalten. Die Fmoc-Gruppe in dem 5'-O-Fmoc-2'-deoxythymidin (Gioeli, C., Chattopadhyaya, J. B., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1982, 672–74) zeigten orthogonale Entschützungseigenschaften mit I–IV (Tabelle 1) und die 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps)-Gruppe in dem dnps-Ethylester (Kharasch, N., McQuarrie, D. P., Buess, C. M., J. Amer. Chem. Soc., 1953, 75, 2658–60) zeigt vergleichbare selektive Entschützungseigenschaften mit den Reagenzien I–IVa gegenüber der 2-Nitrophenylsulfenyl-(nps)-Gruppe in dem nps-Amidrest. Schema 9
X: NH₂ oder OH, X'R⁶:
R⁷: H oder CH₃
X'': protoniertes tertiäres Amin M: Kernstruktur
Beschreibung von Schema 9
a: Schützen von Verbindung 42 mit 32 (Schema 7), 39 (Schema 8), 2,4-Dinitro- oder 2-Nitrophenylsulfenylchlorid. b: Aminolyse mit Aminopropyl CPG, gefolgt durch Reaktion mit Fmoc-Chlorid. c: orthogonale Entschützungen der Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Gruppe und Gruppe R⁶ und Derivatisierung mit neuen Substituenten R⁸ bzw. R⁹, orthogonales Entschützen der Lävulinestergruppe. d: Reaktion mit Succinanhydrid. e: Reaktion der Verbindung 46 mit 47. Verbindung 47 ist (wie Verbindung 46) ein Derivat der Verbindung 44 jedoch anders derivatisiert (mit neuen Substituenten R¹⁰ und R¹¹ in Verbindung 47 im Gegensatz zu R⁸ und R⁹ in Verbindung 46). 47 wurde von dem Träger entfernt. Die Reaktion zu 48 kann wie von Gupta, K. C. et al., Nucl. Acids. Res., 1991, 19, 3019–25 beschrieben, durchgeführt werden. Die erfolgreiche Reaktion zu 48 kann durch Vis-Spektroskopie von 48 nach Behandlung mit Säure beobachtet werden.
Schema 9 zeigt einen allgemeinen Weg zum leichten Entwickeln einer hohen Anzahl von Derivaten. Verbindung 43 könnte z. B. erhalten werden durch sukkzessive Monosubstitutionen unter Verwendung eines wesentlichen Überschusses von Verbindung 42 bzw. ihrer Produkte mit 39 (Schema 8), 32 (Schema 7), 2,4-Dinitrophenylsulfenyl-(dnps)-Chlorid oder 2-Nitrophenylsulfenyl-(nps)-Chlorid (die Reihenfolge ist nicht zwingend). Ein Überschuss 42 kann anscheinend vermieden werden wenn regioselektive Mittel, wie etwa 39, verwendet werden. Wenn 42 eine Aminofunktion (X = NH₂) aufweist, sind ein vorübergehender Schutz der OH-Gruppen, z. B. mit Trimethylsilylchlorid, gefolgt durch Schützen der Aminofunktion mit nps-Chlorid die ersten Schritte. Ein großer Überschuss von 42 sollte in diesem Fall nicht erforderlich sein.
Die Struktur der Schutzgruppen ist sehr geeignet für die Reaktionssteuerung durch Dünnschichtchromatographie (TLC) während der Synthese von Verbindung 43. Jeder Reaktionsschritt kann durch einen spezifischen kolorimetrischen Effekt und UV-Detektion kontrolliert werden. Dies wird durch die folgende Beschreibung gezeigt. Wenn eine Verbindung 42 mit z. B. vier Hydroxylgruppen monosubstitutiert ist durch Verbindung 32 (Schema 7), führt Behandlung mit Säure zu einem orange-farbenen Produkt (Tritylkation), jedoch die kolorimetrische Tritylgruppe wird nicht abgespalten. Nach der zweiten Monosubstitution mit 39 (Schema 8), führt ein Nachweis mit Säure zu zwei orange-farbenen Produkten, da eine der Tritylgruppen nun abgespalten wird. Zusätzlich kann intensive gelbe Farbe durch Ammoniakgas (oder durch primäre und sekundäre Amine) beobachtet werden, aufgrund freigesetzter p-Nitrophenolationen. Das nach der dritten Monosubstitution mit dnps-Chlorid erhaltene Produkt zeigt bereits gelbe Farbe ohne ein Nachweisreagenz (und natürlich die anderen kolorimetrischen Effekte). Schutz der letzten freien Hydroxylgruppe mit Fmoc-Chlorid sollte nach der Reaktion von Verbindung 43 mit Aminopropyl-CPG durchgeführt werden, aufgrund der Empfindlichkeit von Fmoc-Estern in der Gegenwart von Aminogruppen. Nichtsdestotrotz kann die letzte freie Hydroxylgruppe einer Probe von Verbindung 43 durch ein Nukleosidderivat substituiert werden (die reaktive Form von 5'-O-DMTr-T_d-O3'-Succinmonoester z. B.). Durch Kontakt mit Zuckersprühreagenz und Erhitzen mit einem Fön kann ein zusätzliches grün gefärbtes Produkt mit TLC beobachtet werden (aufgrund der Überlagerung der blauen Farbe der Nukleosid- und der orangenen Farbe der Tritylgruppen). Dies zeigt die Möglichkeit vier aufeinanderfolgende Substitutionen durch verschiedene kolorimetrische Effekte zu kontrollieren.
Allgemein ausgedrückt, kann die Einführung von 39 (Schema 8), 32 (Schema 7) und 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps)-chlorid oder 2-Nitrophenylsulfenyl-(nps)-chlorid und die selektiven/orthogonalen Entschützungen der entsprechenden Schutzgruppen in einem ausgewählten multifunktionellen Molekül durch verschiedene kolorimetrische Effekte in jedem Schritt kontrolliert werden. Schema 10
T: Thymin
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
¹H-(400 und 250 MHz) und ¹³C-(101 und 63 MHz) NMR-Spektren wurden auf einem Bruker AMX 400 und einem AC 250-P-Instrument aufgezeichnet. Proben wurden in der Gegenwart von Tetramethylsilan als interner Standard gelöst, es sei denn, es ist anders angegeben. ³¹P-NMR-Spektren wurden auf einem Varian Gemini 200BB-Instrument aufgezeichnet. Externer Standard: 85% Phosphorsäure in dem Lösungsmittel, das für die Probe verwendet wird (δ = 0,00 ppm), chemische Verschiebungen sind in ppm angegeben. Massenspektren wurden auf einem Finnigan MAT 311A-Massenspektrometer unter EI-Bedingungen, einem VG Analytical 70-250S-Massenspektrometer unter FAB-Bedingungen (Matrix: 3-Nitrobenzylalkohol, Xenonbeschuss) und einem Finnigan MAT Vision 2000-Massenspektrometer unter MALDI-TOF-Bedingungen (Matrixlösung: 0,7 mol/l 3-Hydroxypicolinsäure und 0,07 mol/l Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser, 1/1, V/V) erhalten. Elementaranalysen wurden von der analytischen Abteilung des Institut für organische Chemie der Universität Hamburg durchgeführt. Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde auf 60 PF₂₅₄-Silikagel-beschichteten Aluminiumfolien (Merck, Darmstadt, Nr. 5562) durchgeführt. Trityl- und Zucker-enthaltende Verbindungen wurden mit Zuckersprühreagenz (0,5 ml 4-Methoxybenzaldehyd, 9 ml Ethanol, 0,5 ml konzentrierte Schwefelsäure und 0,1 ml Eisessig) durch Erhitzen mit einem Fön oder auf einer heißen Platte sichtbar gemacht. p-Nitrophenylester-enthaltende Verbindungen wurden durch Ammoniakdampf sichtbar gemacht. Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von Silikagel von Merck durchgeführt. HPLC-Ergebnisse wurden auf einem Waters-Chromatographie-System 625 LC mit einem Photodiodenarraydetektor 996 unter Verwendung von reverse Phase-Säulen (Waters Nova-Pak C18^TM, 60,4 μm Teilchen, 3,9 × 300 mm, Software: Millenium 2.0, Eluenten waren: 0,1 M Triethylammoniumacetat bei einem pH-Wert von 7,0 (A) und Acetonitril (B); die Säule wurde bei 30°C mit 1 ml pro min mit 95% A/5% B, V/V äquilibriert, bei Elution unter Verwendung eines linearen Gradienten von 5% bis 40% B in 40 min, beobachtet bei 254 nm) erhalten. Spektrometrische Messungen im UV/Vis-Bereich wurden auf einem Beckman-UV 35- und einem LKB Ultrospec Plus UV/Vis-Spektrometer durchgeführt. Die Lösungsmittel wurden vor ihrer Verwendung durch Standardverfahren getrocknet und gereinigt. Extraktionen wurden durch TLC überwacht, um den Abschluss der Extraktion zu optimieren.
Beispiel 1: 3'-O-Lävulinylester der Nukleoside 30a–d (Baustein 2)
Verbindung 32 wurde in situ hergestellt durch Umsetzen von Lävulinsäurederivat 31 (Leikauf, E., Köster, H., Tetrahedron, 1995, 51, 5557–62) (3,78 g, 8,39 mmol) mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,80 g, 8,74 mmol) in trockenem Dioxan (25 ml). N,N'-Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und mit Dioxan gewaschen. Die Lösung wurde in vier gleiche Teile aufgeteilt und die Lösungsmittel wurden im Vakuum verdampft. Zu jedem der vier Rückstände von Anhydrid 32 wurde eines der vier folgenden geschützten Nukleoside gegeben: 5'-O-DMTr-2'-Deoxythymidin, 5'-O-DMTr-N⁴-npeoc-2'-Deoxycytidin, 5'-O-DMTr-N⁶-npeoc-2'-Deoxyadenosin, 5'-O-DMTr-N²-npeoc-O⁶npe-2'-Deoxyguanosin (1,00 mmol jeweils; Base-geschützte Deoxynukleoside waren von Chemogen, Konstanz) (Stengele, K. P., Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2549–52) und 4-Dimethylaminopyridin (0,0100 g, 0,0819 mmol) in 1,64 ml Pyridin. Der Abschluss der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie überprüft. 30 Minuten nach der Zugabe eines Gemischs von 0,130 ml Eisessig mit 0,245 ml Pyridin wurden 0,046 ml Wasser zugegeben, 60 min später wurde ein Überschuss Ethylacetat zugegeben, der N,N'-Dicyclohexylharnstoff durch Filtration entfernt und mit Ethylacetat gewaschen. Das Gemisch wurde mit Wasser, 5%-igem Natriumhydrogencarbonat und Wasser extrahiert. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel verdampft, dann mit Toluol gemeinsam verdampft. Die Rückstände wurden direkt detrityliert mit 80%-iger Essigsäure und die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Die Lösungen wurden in einen Überschuss Wasser (etwa 10-fach) gegossen und die wässrigen Gemische wurden mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit 5%-igem wässrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel verdampft und dann mit Toluol gemeinsam verdampft (um verbleibende Essigsäure zu entfernen). Die Rückstände wurden direkt methyliert indem zu jedem eine Lösung von 200 ml Methanol und 1 ml Eisessig gegeben wurde. Wenn etwas unlösliches Material vorlag, wurde es in 5–10 ml Dichlormethan gelöst und ein Gemisch von 100 ml Methanol und 0,5 ml Eisessig wurde zugegeben. Überwachen durch Dünnschichtchromatographie zeigte den Abschluss der Reaktion. Die Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck verdampft, gefolgt durch gemeinsames Verdampfen mit Toluol (2–3 mal). Die Rückstände von 30a–d wurden durch Silikagelsäulenchromatographie gereinigt (30a: Silikagel 60H, Nr. 7736, 30b–d: Silikagel 60° A, Nr. 9385; Merck, Darmstadt). Pro Gramm Rohgewicht verwendetes Silikagel: 30a: 25 g, 30b: 51 g, 30c: 65 g, 30d: 51 g; unter Verwendung eines Stufengradienten von Dichlormethan zu Dichlormethan/Methanol 98/2 (V/V) in der Gegenwart von 0,1% Pyridin. Reine Fraktionen wurden zusammengeführt bzw. gepoolt, die Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt, die Rückstände in Dichlormethan (15 ml pro Gramm Rückstand) gelöst und die Lösungen in Hexan (315 ml pro Gramm Rückstand) präzipitiert. Ausbeuten: 30a: 68%, 30b: 63%, 30c: 62%, 30d: 52%.
Verbindung 30a: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 1,88 (s, 3H, CH ₃ von Thymin), 2,5–2,34 (m, 2H, H2^'a/H2^'b), 2,64 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-), 2,93 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-), 3,04 (s, 3H, R³, C-OCH ₃), 3,8 (s, 6H, Aryl-OCH ₃), 3,9 (m, 2H, H5^'a/H5^'b), 4,1 (m, 1H, H4'), 4,57 (s, 2H, -CO-CH ₂-O-), 5,38 (m, 1H, H3'), 6,26 (t, 1H, H1'), 7,34–6,7 (m, 12H, Aryl-H), 7,55 (s, 1H, H6), 8,93 (s, 1H, N-H von Thymin). – ¹³C-NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 12,51 (q, -CH₃ von Thymin), 27,43 (t, -CH₂-CH₂-), 33,79 (t, -CH₂-CH₂-), 37,27 (t, C2'), 51,92 (q, R₃C-OCH₃), 55,23 (q, Aryl-OCH₃), 62,39 (t, C5'), 72,77 (t, -CO-CH ₂-O-), 75,31 (d, C3'), 85,20 (d, C4'), 85,92 (d, C1'), 86,31 (s, R₃ C-OCH₃), 111,28 (s, C5 von Thymin), 112,37, 113,11, 114,59, 121,83, 128,95, 130,20 (d, C-H, Aryl), 135–63, 147,58 (s, R₂ C-CR₂-OCH₃, Aryl, quarternär), 136,34 (d, C6 von Thymin), 150,52 (s, C2 von Thymin), 157,32, 158,52 (s, R₂ C-OCH₃ und s, R₂ C-O-CH₂CO-, Aryl, Position nicht definiert), 163,69 (S, C4 von Thymin), 172,26 (s, -COOR), 206,02 (s, CO-). – ¹H¹H- und ¹H¹³C-2D-NMR-Spektren wurden bestimmt. – MS (FAB, positiver Modus): m/z (relative Intensität): m/z, berechnet für C₃₇H₄₀N₂O₁₁ (M⁺): 688; gefunden: 688 (7), 657 (74, M – OCH₃ ⁺), 391 (78), 307 (100). -Elementaranalyse (%): Gefunden: C, 64,99/64,73; H, 5,98/5,82; N, 4,02/3,99; C₃₇H₄₀N₂O₁₁ erfordert C, 64,53; H, 5,85; N, 4,07.
Verbindung 30b: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 2,38 (m, 1H, H2^'a), 2,65 (m, 1H, H2^'b, t, 2H, -CH ₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 2,9 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 3,04 (s, 3H, R₃C-OCH ₃), 3,1 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, Baseschutz), 3,8 (s, 6H, Aryl-OCH ₃), 3,99–3,88 (m, 2H, H5^'a/H5^'b), 4,19 (m, 1H, H4'), 4,44 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, Baseschutz) 4,55 (s, 2H, -CO-CH ₂-O-), 5,38 (m, 1H, H3'), 6,26 (m, 1H, H1'), 7,34–6,7 (m, 13H, Aryl-H und H5), 7,38 (d, 2H, O₂N-Aryl-H, meta), 8,17 (d, 2H, O₂N-Aryl-H, ortho), 8,3–8,2 (s, 1H, N-H und d, 1H, H6 von Cytosin). -¹³C-NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 27,43 (t, -CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 33,78 (t, -CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 34,97 (t, -CH₂-CH₂-, Baseschutz), 38,58 (t, C2'), 51,91 (q, R₃C-OCH₃), 55,23 (q, Aryl-OCH₃), 62,12 (t, C5'), 65,49 (t, CH₂-CH₂-, Baseschutz), 72,76 (t, -CO-CH₂-O-), 74,98 (d, C3'), 85,98 (d, C4' und d, C1'), 123,86 (d, C-H, O₂N-Aryl, ortho), 129,77 (d, C-H), O₂N-Aryl, meta), 112,35, 113,1, 114,58, 121,83, 128,95, 130,2 (d, C-H, Aryl, d, C5 und d, C6 von Cytosin, nicht definierte Position), 86,31 (s, R₃ C-OCH₃), 123,22, 135,64, 147,58, 149,14, 149,40, 149,67 (s, Aryl, quarternär, C2, C4 von Cytosin und -NH-CO- des Baseschutzes, nicht definierte Position), 157,32, 158,52 (s, R₂ COCH₃ und s, R₂ C-O-CH₂-CO-, Aryl, nicht definierte Position), 172,32 (s, -COOR), 205,97 (s, -CO-), ¹H¹H- und ¹H¹³C 2D-NMR-Spektren wurden bestimmt – MS (FAB, pos. Modus): m/z (relative Intensität): m/z berechnet für C₄₅H₄₆N₄O₁₄ (M⁺): 866; gefunden: 866 (9), 835 (100, M – OCH₃ ⁺), 307 (87).
Verbindung 30c: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 2,48 (m, 1H, H2^'a), 2,67 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 2,96 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 3,05 (s, 3H, R₃C-OCH ₃), 3,15 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, Baseschutz und m, 1H, H2^'b), 3,78 (s, 6H, Aryl-OCH ₃), 4,0–3,84 (m, 2H, H5'^a/H^5'b), 4,29 (m, 1H, H4', 4,55 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, Baseschutz und s, 2H, -CO-CH ₂-O), 5,58 (m, 1H, H3'), 6,35 (m, 1H, H1'), 7,34–6,7 (m, 12H, Aryl-H von DMTr), 7,42 (d, 2H, O₂N-Aryl-H, meta), 8,08 (s, 1H, H2 oder H8 von Adenin), 8,14 (d, 2H, O₂N-Aryl-H, ortho), 8,73 (s, 1H, H2 oder H8 von Adenin), 9,04 (-N-H von Adenin), ¹³C-NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 27,49 (t, CH₂-CH₂-, 3'-OH Schutzgruppe), 33,86 (t, -CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 35,01 (t, CH₂-CH₂-, Baseschutz), 37,85 (t, C2'), 51,91 (q, R₃C-OCH₃), 55,22 (q, Aryl-OCH₃), 63,16 (t, C5'), 65,52 (t, -CH₂-CH₂-, Baseschutz), 72,77 (t, -CO-CH₂-O-), 76,57 (d, C3'), 87,25 (d, C4'), 87,49 (d, C1'), 123,84 (d, C-H, O₂N-Aryl, ortho), 112,32, 113,11, 114,55, 121,87, 128,97, 130,21 (d, C-H, Aryl), 129,81 (d, C-H, O₂N-Aryl, meta), 86,30 (s, R₃ C-OCH₃) 135,57, 145,24, 147,02, 147,72, 149,18, 149,72, 150,04, 150,69 (s, Aryl quarternär, C4-C6 von Adenin und -NH-CO- des Baseschutzes, Position nicht definiert), 142,31 (d, C2 oder C8 von Adenin), 152,4 (d, C2 oder C8 von Adenin), 157,3, 158,54 (s, R₂-C-OCH₃ und s, R₂ C-O-CH₂-CO-, Aryl, Position nicht definiert), 171,98 (s, -COOR), 206,14 (s, -CO-), ¹H¹H- und ¹H¹³C 2D-NMR-Spektren wurden bestimmt. – MS (FAB, pos. Modus): m/z (rel. Intensität): m/z berechnet für C₄₆H₄₆N₆O₁₃ (M⁺): 890; gefunden: 859 (5, M – OCH₃ ⁺), 307 (100), – Elementaranalyse (%): Gefunden: C, 62,14/62,00; H, 5,26/5,17; N, 9,06/9,02; C₄₆H₄₆N₆O₁₃ erfordert C, 62,02; H, 5,20; N, 9,43.
Verbindung 30d: ¹H-NMR (400 MHz), (CDCl₃): δ = 2,44–2,40 (m, 1H, H2^'a), 2,67 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 2,96 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 3,04 (s, 3H, R₃C-OCH ₃), 3,12 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, npeoc- Baseschutz und m, 1H, H2^'b, 3,30 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, npe-Baseschutz), 3,8 (s, 6H, Aryl-OCH ₃), 3,99–3,82 (m, 2H, H5^'a/H5^'b), 4,23 (m, 1H, H4'), 4,49 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, npeoc-Schutzgruppe), 4,56 (s, 2H, -CO-CH ₂-O-), 4,82 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, npe-Baseschutz), 5,57 (m, 1H, H3), 6,24 (m, 1H, H1'), 7,7–6,7 (m, 16H, Aryl-H von DMTr, O₂N-Aryl-H, meta und s, 1H, -N-H von Guanin), 7,89 (s, 1H, H8 von Guanin). 8,81–8,13 (m, O₂N-Aryl-H, ortho, npe- und npeoc-Gruppe). ¹³C-NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 27,46 (t, -CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 33,86 (t, -CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 35,04 (t, -CH₂-CH₂-, npe- und npeoc-Baseschutz), 37,37 (t, C2'), 51,92 (q, R₃C-OCH₃), 55,23 (q, Aryl-OCH₃), 63,01 (t, C5'), 64,97 (t, -CH₂-CH₂-, npeoc-Baseschutz), 67,07 (t, -CH₂-CH₂-npe-Baseschutz), 72,77 (t, -CO-CH₂-O), 76,24 (d, C3'), 86,55 (d, C4'), 86,79, (d, C1'), 123,75, 123,82 (d, C-H, O₂N-Aryl, ortho, npe und npeoc-Baseschutz, Position nicht definiert), 141,33 (d, C8 von Guanin), 112,32, 113,11, 114,55, 121,87, 128,96, 129,77, 130,04, 130,21 (d, C-H, Aryl), 86,30 (s, R₃ C-OCH₃), 135,58, 145,58, 146,94, 147,7, 149,15, 149,42, 149,69, 151,13, 151,47, 152,06, 161,01 (s, Aryl, quarternär, C2, C4-C6 von Guanin und -NH-CO des Basenschutzes, Position nicht definiert), 157,31, 158,54 (s, R₂ C-OCH₃ und s, R₂ C-O-CH₂-CO-, Aryl, nicht definierte Position), 172,04 (s, -COOR), 206,10 (s, -CO-), ¹H¹H- und ¹H¹³C 2D-NMR-Spektren wurden bestimmt. – MS (FAB, pos. Modus): m/z (relative Intensität): m/z berechnet für C₅₄H₅₃N₇O₁₆ (M⁺): 1055, gefunden: 1024 (6, M -OCH₃ ⁺), 307 (100).
Beispiel 2: Phosphoamidite 2a–d (Baustein 2)
Alle Schritte wurden unter Intertatmosphäre (Argon) durchgeführt. Organische Lösungsmittel waren frei von Wasser und anderen Verureinigungen. Die Verbindungen 30a–d (0,5 mmol jeweils) wurden azeotrop mit kleinen Mengen Pyridin und Toluol getrocknet und in 2,43 ml Ethylacetat gelöst. Nach der Zugabe von N,N-Diisopropylethylamin (1,75 mmol, 0,226 g, entsprechend 0,30 ml bei Raumtemperatur) wurde der Reaktionskolben mit einem Septum verschlossen und mit einem Eisbad gekühlt. Chlor-β-cyanoethoxy-N,N-diisopropylaminophosphan (0,610 mmol, 0,144 g, entsprechend 0,117 ml bei Raumtemperatur, Biosyntech, Hamburg) wurde tropfenweise durch eine Spritze zugegeben. 15 min später ließ man die Reaktionstemperatur auf Raumtemperatur ansteigen. Überwachung durch Dünnschichtchromatographie (etwa 60 min nach Beginn der Reaktion) zeigte vollständige Umsetzungen in die Amidite 2a–d. Das präzipitierte Aminhydrochlorid wurde unter Verwendung eines Säulentypreaktors, ausgestattet mit einer gesinterten Glasfritte, filtriert und mit 1,5 ml Ethylacetat gewaschen. Die Lösung wurde in einem Scheidetrichter mit kaltem 5%-igem Natriumhydrogencarbonat (2 × 2,8 ml) extrahiert. Die organische Lösung wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Reaktors filtriert, welcher Natriumsulfat enthielt, gefolgt durch Waschen der Natriumsulfatschicht mit Ethylacetat (2 × 1,8 ml). Nach Verdampfen der Lösungsmittel des Filtrats wurde ein Schaum erhalten. Das Amidit wurde in 5 ml Ethylacetat (enthaltend 0,1% Pyridin) gelöst und in 120 ml Hexan präzipitiert (bei –20°C). Nach Filtrieren unter Verwendung des beschriebenen Reaktors wurde das Amidit mit 12 ml Hexan gewaschen, getrocknet und bei –20°C aufbewahrt. Ausbeuten: 2a: 86%, 2b: 72%, 2c: 78%, 2d: 80%. – ³¹P-NMR (81 MHz, CD₃CN/CH₃CN, 1/1, V/V und eine Spur N,N-Diisopropylethylamin): 2a: δ = 149,18, 149,35 (Diastereomere), 2b: δ = 149,25, 2c: δ = 149,02, 2d: δ = 148,89, 149,16 (Diastereomere).
Beispiel 3: 3-(4-Formylphenyl)-propionsäure (35) (Baustein 1)
Hydrierung der Verbindung 34 (Pohl, H., J. prakt. Chem., 1934, 141, 45–60, Skita, A, Ritter, H., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1910, 43, 3393–99; Paal, C., Harmann, W., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1909, 42, 3930–39) wurde in der Gegenwart von 5% Pd auf Aktivkohle durchgeführt. – ¹H NMR-(250 MHz, [D₆]DMSO): δ = 2,6 (t, 2H, –CH ₂-CH₂-), 2,95 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-), 7,45 (d, 2H, H-Aryl-CHO, meta), 7,85 (d, 2H, H-Aryl-CHO, ortho), 9,96 (s, 1H, -CHO), 12,16 (s, 1H, -COOH).
Beispiel 4: 3-{4-[Bis-(4-Methoxyphenyl)methyl]phenyl}-propionsäure (36) (Baustein 1)
Verbindung 35 (25,7 g, 144 mmol) und Methoxybenzol (36,8 g, 340 mmol) wurden in 450 ml Eisessig gerührt, um das meiste des Materials zu lösen. Das Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und unmittelbar konzentrierte Schwefelsäure (225 g, 2290 mmol) tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei Raumtemperatur gerührt bis Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol: 8/2, V/V) quantitative Umsetzung zeigte. Das Reaktionsgemisch wurde in 3 l Eis/Wasser gegossen. Nachfolgend wurde der Reaktionskolben mit Ether gewaschen und die Etherlösung wurde in das Eis/Wasser gegossen. Das orange-weiße Rohprodukt zwischen der wässrigen und organischen Schicht wurde durch Absaugen filtriert (wenn hierbei weiterhin eine beachtliche Menge des Rohprodukts unter der wässrigen und/oder gelöst in der Etherschicht vorlag, wurde ebenfalls aufgearbeitet). Das Rohprodukt wurde mit 200 ml Wasser verrieben, durch Absaugen filtriert, erneut verrieben mit Petrolether (Siedepunkt 60–70°C) und filtriert. Es wurde aus Ether umkristallisiert. Ausbeute: 22,3 g (41%). Anmerkung: Mehr Produkt 36 kann gereinigt werden aus dem kristallinen Rückstand der Mutterlauge durch Silikagelsäulenchromatographie oder durch Soxhlet-Extraktion mit Petrolether (Siedepunkt 30–50°C). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 2,65 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-), 2,92 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-), 3,78 (s, 6H, -OCH ₃), 5,40 (s, 1H, R₃C-H), 7,13–6,77 (m, 12H, Aryl-H). – ¹³C-NMR (63 MHz, CDCl₃, interner Standard CDCl₃ bei 77,00 ppm): δ = 30,1 (t, -CH₂-CH₂-), 35,48 (t, -CH₂-CH₂-), 54,8, 55,19 (q, Aryl-OCH₃ und d, R₃ C-H, nicht definierte Position), 113,63, 128,1, 129,41, 130,21 (d, C-H, Aryl), 136,46, 137,91, 142,7 (s, Aryl, quaternär), 157,93 (s, R₂ C-OCH₃, Aryl), 178,85 (s, -COOH). – MS (EI): m/z (rel. Intensität): m/z berechnet für C₂₄H₂₄O₄ (M⁺): 376, gefunden: 376 (100), 345 (9, M-OCH₃ ⁺), 227 (35, M-HOOC-CH₂-CH₂-C₆H₄ ⁺). –MS (FAB, pos. Modus): m/z (rel. Intensität): m/z berechnet für C₂₄H₂₄O₄ (M⁺): 376; gefunden: 376 (48), 345 (8, M-OCH₃ ⁺), 269 (53, M – C₆H₄-OCH₃ ⁺), 227 (38, M-HOOC-CH₂-CH₂-C₆H₄ ⁺). – Elementaranalyse (%): Gefunden: C, 76,55/76,35; H, 6,71/6,53; C₂₄H₂₄O₄ erfordert C, 76,57, H, 6,43.
Beispiel 5: p-Nitrophenyl-3-{4-[bis-(4-Methoxyphenyl)methyl]-phenyl}propionat (37) (Baustein 1)
Verbindung 36 (22,2 g, 59,0 mmol) und p-Nitrophenol (8,23 g, 59,2 mmol) wurden in trockenem Dioxan (272 ml) und trockenem Pyridin (14,7 ml) gelöst. Nach Zugabe einer Lösung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (13,9 g, 67,4 mmol) in trockenem Dioxan (66 ml) wurde das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt bis Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol: 9/1, V/V) quantitative Umsetzung (4–18 h) zeigte. N,N'-Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt, das Präzipitat wurde mit Dioxan gewaschen bis kein UV-absorbierendes Material mehr nachgewiesen werden konnte. Das Lösungsmittel wurde verdampft, der Rückstand azeotrop mit Toluol getrocknet, in Dichlormethan (70 ml) gelöst und verbleibender Dicyclohexylharnstoff durch Filtration entfernt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde direkt in Verbindung 38 umgesetzt. Verbleibendes DCC konnte mit einer kleinen Menge Hexan entfernt werden. Ausbeute: 29,1 g (99%) – ¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 2,90 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-), 3,14 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-), 3,78 (s, 6H, -OCH ₃), 5,43 (s, 1H, R₃C-H), 7,18–6,76 (m, 14H, Aryl-H), 8,22 (d, 2H, O₂N-Aryl-H-, ortho). – ¹³C NMR (63 MHz, CDCl₃): δ = 30,42 (t, -CH₂-CH₂-), 35,9, (t, -CH₂-CH₂-), 54,88 (d, R₃ C-H), 55,24 (q, Aryl-OCH₃), 113,69, 122,43, 125,17, 128,31, 129,57, 130,24 (d, C-H, Aryl), 136,39, 137,38, 143,14, 145,32, 155,35 (s, Aryl, quarternär), 158,02 (s, R₂ C-OCH₃, Aryl), 170,5 (s, -COOR), – MS (EI): m/z (relative Intensität): m/z berechnet für C₃₀H₂₇NO₆ (M⁺): 497, gefunden: 497 (16), 480 (3), 51 (100). – MS (FAB, positiver Modus): m/z (relative Intensität): m/z berechnet für C₃₀H₂₇NO₆ (M⁺): 497; gefunden: 497 (26), 466 (4, M-OCH₃ ⁺), 390 (45, M-C₆H₄-OCH₃ ⁺), 375 (24, M-O₂N-C₆H₄ ⁺), 227 (100, M – O₂N-C₆H₄-OOC-CH₂-CH₂-C₆H₄ ⁺).
Beispiel 6: p-Nitrophenyl-3-{4-[bis-(4-methoxyphenyl)-hydroxymethyl]phenyl}-propionat (38) (Baustein 1)
Verbindung 37 (29,1 g, 58,5 mmol) wurde gelöst in 670 ml Eisessig und frisch hergestelltes Bleidioxid (Rotermund, G. W., Methoden organischen Chemie (Houben-Weyl), Band IV/1b, Oxidation, Teil 2; Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1975, S. 176) (9,95 g, 41,6 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch in einem vorgeheizten Ölbad angeordnet bis eine klare Lösung erhalten wurde. Weitere 9,95 g (41,6 mmol) Bleidioxid wurden zugegeben und gelöst. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol 99/1, V/V) überwacht. Während der Reaktion trat ein Nebenprodukt auf, welches zwischen dem Edukt 37 und dem Produkt 38 lief. Die Reaktion wurde beendet als die UV-Intensität des Flecks für restliches 37 dem Nebenprodukt glich. Das Reaktionsprodukt wurde auf Eis/Wasser (3/1) gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser extrahiert und mit Na₂SO₄ getrocknet. Lösungsmittel wurden verdampft und etwas der verbleibenden Essigsäure durch gemeinsames Verdampfen mit Toluol entfernt. Das Rohprodukt (29,8 g) wurde in Dichlormethan gelöst und durch Silikagel 60H-Säulenchromatographie (Merck, Darmstadt; Nr. 7736, 1200 g) gereinigt; Elution wurde in der Gegenwart von 0,03% Pyridin unter Verwendung eines Stufengradienten von Dichlormethan nach Dichlormethan/Ethanol 99/1, V/V) durchgeführt. Fraktionen, die Verbindung 38 enthielten, wurden vereinigt und die Lösungsmittel verdampft. Der sirupartige Rückstand kristallisierte schrittweise unter einer Petroletherschicht nach Reiben mit einem Glasstab. Ausbeute: 15,1 g (50%). 2,15 g (7%) des Ausgangsmaterials 37 wurden zurückgewonnen. – ¹H NMR (250 MHZ, CDCl₃): δ = 2,70 (s, 1H, R₃C-OH), 2,94 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-), 3,1 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-), 3,78 (s, 6H, -OCH ₃), 7,28–6,78 (m, 14H, Aryl-H), 8,21 (d, 2H, O₂N-Aryl-H, ortho). – ¹³C NMR (63 MHz, CDCl₃): δ = 30,37 (t, -CH₂-CH₂-), 35,8 (t, -CH₂-CH₂-), 55,26 (q, Aryl-OCH₃), 81,27 (s, R₃ C-OH), 113,22, 122,41, 125,17, 127,87, 128,08, 129,08, (d, C-H, Aryl), 138,35, 139,41, 145,32, 145,85, 155,32 (s, Aryl, quaternär), 158,7 (s, R₂ C-OCH₃, Aryl), 170,45 (s, -COOR). – MS (EI): m/z (relative Intensität): m/z berechnet für C₃₀H₂₇NO₇ (M⁺): 513; gefunden: 513 (22), 496 (9, M – OH⁺), 406 (12, M -C₆H₄-OCH₃ ⁺), 243 (93, M- O₂N-C₆H₄-OOC-CH₂-CH₂-C₆H₄ ⁺), 135 (100). – MS (FAB, positiver Modus): m/z (relative Intensität): m/z berechnet für C₃₀H₂₇NO₇ (M⁺): 513; gefunden: 513 (19), 496 (90, M – OH⁺), 406 (16, M – C₆H₄-OCH₃ ⁺), 391 (11, M – O₂N-C₆H₄ ⁺), 375 (3, M – O₂N-C₆H₄-O-⁺), 243 (52, M – O₂N-C₆H₄-OOC-CH₂-CH₂-C₆H₄ ⁺), 135 (100). – Elementaranalyse (%): Gefunden: C, 70,47/70,78; H, 5,35/5,38; N, 2,75 (2,74; C₃₀H₂₇NO₇ erfordert C, 70,16; H, 5,3; N, 2,73.
Beispiel 7: p-Nitrophenyl-3-{4-[bis-(4-methoxyphenyl)-chlormethyl]-phenyl}propionat (39) (Baustein 1)
Verbindung 38 (0,600 g, 1,17 mmol) wurde auf Rückfluss in Acetylchlorid (6 ml) für 3 h erhitzt. Lösungsmittel wurden verdampft und verbleibende Spuren von Essigsäure oder/und Acetylchlorid durch gemeinsames Verdampfen mit Toluol entfernt. Der Rückstand wurde direkt in Verbindung 40 übergeführt.
Beispiel 8: Alkoholyse von Verbindung 39 mit 30a zu Verbindung 40 (Baustein 1)
Das sirupartige Rohprodukt von Verbindung 39 (max. 1,17 mmol) wurde in trockenem Pyridin (4,1 ml) gelöst und Verbindung 30a (0,450 g, 0,653 mmol) wurde zugegeben. Nach 19 h wurden weitere 0,140 g (0,203 mmol) 30a zugegeben. 24 h später zeigte Überwachung mit Dünnschichtchromatographie keine weitere Umsetzung. Pyridin (3 ml) und Ethanol (0,3 ml) wurden zugegeben und die Lösung nach 5 min. in einen Überschuss Wasser gegossen. Die Wasserlösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser extrahiert und mit Na₂SO₄ getrocknet. Lösungsmittel wurden verdampft und der Rückstand azeotrop mit Toluol getrocknet. Das Rohprodukt (1,38 g) wurde in Dichlormethan gelöst und durch Silikagel 60-Säulenchromatographie (Merck, Darmstadt; Nr. 9385, 80 g) gereinigt; Elution wurde in der Gegenwart von 0,1% Pyridin mit Dichlormethan/Ethanol (99/1, V/V durchgeführt). Fraktionen, die 40 enthielten, wurden kombiniert und die Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (11 ml) gelöst und in Hexan präzipitiert (220 ml). Ausbeute: 0,468 g (46%). – ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃ und eine Spur [D₅]Pyridin): δ = 1,36 (s, 3H, -CH ₃ von Thymin), 2,5–2,4 (m, 2H, H2^'a/H2^'b), 2,63 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 2,9 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 2,9 (t, 2H, -CH ₂-CH₂-, 5'-OH-Schutzgruppe), 3,04 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-, 5'-OH-Schutzgruppe), 3,04 (s, 3H, R₃C-OCH ₃), 3,45 (m, 2H, H5^'a/H5^'b), 3,77 (s, 12H, Aryl-OCH ₃), 4,14 (m, 1H, H4'), 4,54 (s, 2H, -CO-CH ₂-O-), 5,47 (m, 1H, H3'), 6,43 (t, 1H, H1'), 7,37–6,7 (m, 26H, Aryl-H), 7,6 (s, 1H, H6), 8,21 (d, 2H, O₂N-Aryl-H, ortho), 8,9 (s, 1H, N-H von Thymin). – ¹³C-NMR (101 MHz, CDCl₃ und eine Spur von [D₅]Pyridin): δ = 11,66 q, -CH₃ von Thymin), 27,4 (t-CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 30,26 (t, CH₂-CH₂-, 5'-OH-Schutzgruppe), 33,77 (t, -CH₂-CH₂-, 3'-OH-Schutzgruppe), 35,68 (t, -CH₂-CH₂-, 5'-OH-Schutzgruppe), 37,88 (t, C2'), 51,90 (q, R₃C-OCH₃), 55,21, 55,27 (q, Aryl-OCH₃, 3'-OH und 5'-OH-Schutzgruppe, nicht definierte Position), 63,74 (t, C5'), 72,74 (t, -CO-CH₂-O-), 75,69 (d, C3'), 83,96 (d, C4'), 84,38 (d, C1'), 86,29, 87,05 (s, R₃ C-OCH₂-, 5'-OH-Schutzgruppe), R₃ C-OCH₃, 3'-OH-Schutzgruppe, nicht definierte Position). 111,49 (C5 von Thymin), 112,29, 113,09, 113,37, 114,59, 121,81, 122,37, 128,07, 128,38, 128,93, 130,08, 130,18 (d, C-H, Aryl), 125,17 (d, C-H, O₂N-Aryl, ortho), 135,61 (d, C6 von Thymin), 135,06, 135,4, 138,55, 142,89, 145,33, 147,57, 155,28 (s, Aryl, quarternär), 150,37 (C2 von Thymin), 157,3, 158,51 (s, R₂ C-OCH₃ und s, R₂ C-O-CH₂-CO-: 3'-OH-Schutzgruppe, Aryl. nicht definierte Position), 158,84 (s, R₂ C-OCH₃, Aryl, 5'-OH-Schutzgruppe), 163,57 (s, C4 von Thymin), 170,35 (s, -COOR, 5'-OH-Schutzgruppe), 172,07 (s, -COOR, 3'-OH-Schutzgruppe), 205,94 (s, -CO-). – ¹H¹H- und ¹H¹³C 2D-NMR-Spektren wurden bestimmt (Daten nicht gezeigt). MS (FAB, pos. Modus): m/z (rel. Intensität): m/z berechnet für C₆₇H₆₅N₃O₁₇ (M⁺): 1183; gefunden: 1183 (4), 1152 (35, M – OCH₃ ⁺), 1137 (2, M – NO₂ ⁺), 496 (100, Fragment M – OH⁺ der Verbindung 38). – Elementaranalyse (%): Gefunden: C, 67,63/67,89; H, 5,63/5,69; N, 3,49/3,51; C₆₇H₆₅N₃O₁₇ erfordert C, 67,95; H, 5,53; N, 3,55.
Beispiel 9: Aminolyse von Verbindung 40 mit Aminopropyl CPG zu Baustein 1
Verbindung 40 (0,160 g, 0,135 mmol) wurde in trockenem Dioxan (0,311 ml) und trockenem Pyridin (0,032 ml) gelöst. Eine Suspension von Aminopropyl CPG (0,405 g, CPG-10-500, Biosyntech, Hamburg) in 1,27 ml trockenem N,N-Dimethylformamid und 0,160 ml (0,116 g, 1,15 mmol) trockenes Triethylamin wurden zugegeben und die Suspension während 21,5 h geschüttelt. Eine intensive gelbe Farbe, die durch freigesetzte p-Nitrophenolationen bewirkt wird, zeigte eine beginnende Reaktion an. Die Suspension wurde während 21,5 h geschüttelt. Ein Ninhydrintest in diesem Stadium zeigte das Vorliegen freier Aminogruppen auf dem Träger. Um diese Gruppen zu acylieren, zu "cappen", wurde trockenes Triethylamin (0,030 ml) und Essigsäureanhydrid (0,090 ml) zugegeben und die Suspension wurde für weitere 60 min geschüttelt. Nach dieser Zeit wurde ein negativer Ninhydrintest erhalten. Der Träger wurde aufeinanderfolgend mit N,N-Dimethylformamid, Ethanol, Dioxan, Ether (jeweils 100 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Analyse auf das Ausmaß von 3'-OH-geschütztem Nukleosid, das an den Träger gebunden ist, wurde spektrophotometrisch durchgeführt. Eine genau eingewogene Probe wurde behandelt mit entweder 5% Dichloressigsäure in Dichlormethan (V/V) oder mit Hydrazinreagenz IV (Tabelle 1), gefolgt durch Ansäuern der Lösung mit 40% Trichloressigsäure in Dichlormethan (Gewichtsprozent). Die flüssige Phase wurde bei 513 nm gemessen (Extinktionskoeffizient einer sauren Lösung des entfernten Tritylderivats: ε = 78600). Menge des an den Träger 1 gebundenen Nukleosids 1: 45,6 μmol/g.
Beispiel 10: Synthese der vollständig entschützten Oligonukleotide d(TTTT) und d(TAGCT)
Das Gerät zur manuellen Oligonukleotidsynthese bestand aus einem Reaktor des Säulentyps, ausgestattet mit einer gesinterten Glasfritte, einem Absperrhahn und einer Verbindung zu einer Vakuumpumpe, um Lösungsmittel durch Absaugen zu entfernen oder den Träger unmittelbar vor dem Kondensationsschritt (Schritt 3, Tabelle 2) zu trocknen. Nur dieser Schritt wurde unter Inertgasatmosphäre (Argon) durchgeführt. Das Inertgas wurde in die Vorrichtung über eine Injektionsnadel durch ein Septum an der Oberseite der Vorrichtung eingebracht. Eine andere Nadel durch das Septum sorgte für einen Ausgleich des Gasdrucks.
Anmerkungen und Beschreibungen der Reagenzien und Lösungsmittel

1) Zur Synthese wurden 0,0220 g des Trägers 1 mit etwa 1 μmol beladenem Nukleosid verwendet.
2) Zur Synthese von d(TTTT) wurden 0,146 g Amidit 2a in 1,4 ml Acetonitril (DNA-Qualität) gelöst. Zur Synthese von d(TAGCT) wurden jeweils 0,0800 g 2a–d in 0,8 ml Acetonitril (DNA-Qualität) gelöst.
3) Tetrazolreagenz: 31,8 g 1-H-Tetrazol in 1 l Acetonitril; GEN 905035.
4) Oxidationsreagenz: 4,3 g Jod in 1 l Wasser/Pyridin/Tetrahydrofuran (THF), 9,05/0,41/90,54, V/V; GEN 905028.
5) Cappingreagenz 1: N-Methylimidazol/Pyridin/Acetonitril, 12/10/78, V/V, GEN 905027; Cappingreagenz 2: Essigsäureanhydrid/Acetonitril, 12/88, V/V, GEN 905026. Das Tetrazol, Oxidations- und die Cappingreagenzien wurden von PerSeptive Biosystems GmbH, Hamburg bezogen.
6) Hydrazinreagenz: 0,5 M Hydrazinreagenz IVb (Tabelle 1). Reagenzien hoher Qualität sind zu verwenden: bidestilliertes Wasser, Essigsäure p. A. (Merck, Darmstadt Nr. 63), Hydraziniumhydrat (Merck, Darmstadt, Nr. 804608), Pyridin p. a. (Merck, Darmstadt, Nr. 7463).
7) TCA-Reagenz: 40% Trichloressigsäure in Dichlormethan (Gewichtsprozent).
8) Amidit- und Tetrazol-Lösungen und Acetonitril (DNA-Qualität) zum Lösen von Amiditen und zum Durchführen des letzten Waschens in Schritt 2 (Tabelle 2) vor der Kondensation wurden über einem 0,3 nm-Molekularsieb gehalten, das frisch in einem Mikrowellenofen aktiviert worden war, unter Argon aufbewahrt und über Septen durch Spritzen aufgenommen oder zugegeben.
9) Acetonitril für Waschschritte musste nur "HPLC-Qualität" aufweisen, ausgenommen für das letzte Waschen vor der Kondensation.

Tabelle 2. Schritte, die in einem Verlängerungszyklus während der Synthese umfasst sind
Ausreichender Kontakt zwischen Träger und Lösungsmittel oder Reagenz wurde durch gelegentliches vorsichtiges Schütteln sichergestellt, insbesondere nach Zugabe von Amiditlösung und während der tropfenweise Zugabe des Tetrazolreagenz.
1/3 der Lösung von Schritt 1 (0,233 ml) wurde in einen 25 ml-Standardkolben gegeben und bis zur Marke mit dem TCA-Reagenz aufgefüllt. Die Absorptionen der Lösungen der Verlängerungszyklen bzw. Elongationszyklen wurden spektrophotometrisch bei 513 nm gemessen, was zu der Nukleosidbeladung von Träger 1 und der Ausbeute der Kondensationsreaktionen führte.
Entschützen und Reinigungen der Oligomere:
A) d(TTTT)-Synthese
Der Träger mit dem gebundenen Oligomer wurde mit Pyridin gewaschen und die β-Cyanoethylgruppen wurden mit tert-Butylaminreagenz II (Tabelle 1) entfernt. Nach Waschen des Trägers mit Pyridin und Acetonitril und Trocknen im Vakuum wurde das Oligomer von dem Träger entfernt, indem er mit 80% Essigsäure für 15 min behandelt wurde. Nach Lyophilisieren der Lösung wurde das Oligomer durch HPLC gereinigt: die terminale 3'-OH-Schutzgruppe (entsprechend der Gruppe von Verbindung 29a in Schema 7) diente hier als Handhabungsmittel zur Reinigung. Behandlung mit 32% Ammoniak, gefolgt durch Lyophilisierung, führte zu dem vollständig entschützten Oligomer d(TTTT). HPLC: Retentionszeit (min): 8,57, UV-Detektion: λ max = 266,1 und 217,7 nm. – MS (MALDI-TOF): theoretische Masse: M + H⁺: 1155, Gefunden: 1154.
B) d(TAGCT)-Synthese
Das Oligomer wurde von dem Träger durch Behandeln mit 80%-iger Essigsäure für 15 min entfernt. Nach Lyophilisierung wurde die Base, das Phosphat und der 3'-OH-Schutz entfernt durch Behandeln mit 0,5 M DBU in Acetonitril, was direkt zu dem vollständig entschützem d(TAGCT) führte. Das Reagenz wurde im Vakuum eingedampft. – HPLC: Retentionszeit (min): 6,96. UV-Nachweis: λ max = 259,0 und 216,5 nm. – MS (MALDI-TOF): M + H⁺: theoretische Masse: 1478; gefunden: 1477.
Entschützungsversuche mit Modellverbindungen
Die Entschützungsversuche mit Modellverbindungen in Lösung wurden durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Die molaren Verhältnisse der Entschützungsreagenzien I–IV (Tabelle 1) zu den Modellverbindungen waren mindestens 100 : 1.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines kombinatorischen Satzes von Molekülen der Kernstruktur M, umfassend die Schritte: (a) Herstellen mehrerer immobilisierter Moleküle der Kernstruktur M, worin die Moleküle mehrere reaktive Gruppen enthalten, wobei jede reaktive Gruppe durch eine Blockierungsgruppe blockiert ist, worin mindestens drei der Blockierungsgruppen unabhängig entfernbar sind unter mindestens drei verschiedenen Bedingungen; und (b) Entfernung bestimmter Blockierungsgruppen und Derivatisieren der resultierenden reaktiven Gruppen auf eine vorbestimmte, regioselektive Art, worin jedes Element eines kombinatorischen Satzes einzigartig derivatisiert wird an mindestens einer reaktiven Gruppe mit einem einzigartigen Substituenten, wobei ein kombinatorischer Satz von Molekülen der Kernstruktur M erzeugt wird.
Verfahren zum Herstellen eines kombinatorischen Satzes von Oligomeren, umfassend die Schritte: (a) Herstellen mehrerer immobilisierter Moleküle der Kernstruktur M und enthaltend mehrere reaktive Gruppen, wobei jede reaktive Gruppe blockiert wird durch eine Blockierungsgruppe, worin mindestens drei der Blockierungsgruppen unabhängig entfernbar sind unter mindestens drei verschiedenen Bedingungen; und (b) Entfernen bestimmter Blockierungsgruppen und Derivatisieren der resultierenden reaktiven Gruppen auf eine vorbestimmte, regioselektive Art, worin mindestens eine reaktive Gruppe derivatisiert wird durch Zugeben eines vorab ausgewählten Monomers, und worin das Monomer mehrere reaktive Gruppen enthält, wobei jede reaktive Gruppe blockiert wird durch eine Blockierungsgruppe, worin mindestens eine der Blockierungsgruppen unabhängig entfernt werden kann unter mindestens einer der drei verschiedenen Bedingungen; (c) aufeinanderfolgendes Durchführen von Schritt (b) für die geeignete Anzahl von Zyklen, um ein Oligomer zu erhalten, umfassend die gewünschte Anzahl Monomere, worin jedes Element eines kombinatorischen Satzes in einzigartiger Weise an mindestens einer reaktiven Gruppe mit einem einzigartigen Substituenten derivatisiert wird, wobei ein kombinatorischer Satz von Oligomeren erzeugt wird, welche aus der gleichen Anzahl von Monomeren bestehen, jedoch welche sich in der Zusammensetzung von mindestens einem Monomer oder in der Derivatisierung von mindestens einer reaktiven Gruppe innerhalb mindestens eines Monomers unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin M eine multifunktionelle Verbindung mit niederem Molekulargewicht ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Saccharid, Aminozucker, Deoxyzucker, Nukleosid, Nukleotid, Coenzym, Aminosäure, Lipid, Steroid, Vitamin, Hormon, Alkaloid und einer Wirkstoffverbindung mit geringem Molekulargewicht.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die oligomere Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: einem Oligosaccharid, Oligopeptid und Oligonukleotid.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Oligonukleotid von einem 2'-Deoxyribonukleotid und/oder einem Ribonukleotid stammt.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Oligonukleotid in der 3' nach 5'- oder 5' nach 3'-Richtung synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Oligonukleotid entsprechend dem Phosphoamidit-, H-Phosphonat- oder Phosphotriesterverfahren synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Oligonukleotid eine natürliche oder modifizierte Base enthält, ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus: Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, 5-Fluoruracil, 5-Chloruracil, 5-Bromuracil, 5-Joduracil, 5-Fluormethyluracil, 5-Chlormethyluracil, 5-Brommethyluracil, 5-Jodmethyluracil, 5-Aminomethyluracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-Mercaptomethyluracil, 5-Fluorcytosin, 5-Chlorcytosin, 5-Bromcytosin, 5-Jodcytosin, 5-Azidocytosin, 5-Alkylcytosin, 5-ω-Aminoalkylcytosin, 5-Azidouracil, 5-Alkyluracil, 5-ω-Aminoalkyluracil, 5-Methylcytosin, 5-Aminocytosin, 5-Aminouracil, 4-Triazolouracil, 4-Triazolothymin, 4-Tetrazolouracil, 4-Tetrazolothymin, Hypoxanthin, Xanthin, 2,6-Diaminopurin, 6-Chlorpurin, 2,6-Dichlorpurin, 6-Thiopurin, 2-Thiopurin, 8-Fluoradenin, 8-Chloradenin, 8-Bromadenin, 8-Jodadenin, 8-Fluorguanin, 8-Chlorguanin, 8-Bromguanin, 8-Jodguanin, 8-Aminoadenin, 8-Aminoguanin, 8-Hydroxyadenin, 8-Hydroxyguanin, 8-Thioadenin, 8-Thioguanin, N7-Deazaadenin, N7-Deazaguanin, N3-Deazaadenin, N3-Deazaguanin, N9-Deazaadenin, N9-Deazaguanin.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die reaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: OH, SH, NH₂, CO₂H, SOH, SO₂H, SO₃H, CHO, Keto, Phosphat, Phosphit, Phosphoamidit, Halogen, CN, CNS, NCS, NCO und Derivaten davon.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Molekül durch Bindung an einen festen Träger immobilisiert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der feste Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Kügelchen, flachen Trägern, Siliciumwafern, mit oder ohne Löchern und/oder Kanälen, dem Boden einer Mikrotiterplatte oder den inneren Wänden einer Kapillare.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Kügelchen aus einem Material bestehen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polystyrol, Polyamid, Cellulose, Sephadex^®, Sepharose^®, Silikagel, Glas mit kontrollierten Poren (CPG) und Teflon^®.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Bindung gespalten werden kann unter sauren, alkalischen, neutralen oder photolytischen Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Bindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Triethylether, Ester, β-Benzoylpropionyl, Lävulinyl, Disulfid, Sulfenyl und Derivaten davon.
Zusammensetzung, umfassend ein Oligonukleotid der allgemeinen Formel
worin ➀, ➁, ➂, ➃ Positionen in dem Molekül sind, welche regioselektiv adressiert werden können und worin B eine natürliche oder modifizierte Nukleobase bedeutet, welche keine Schutzgruppe während der Synthese erfordert, BR^2A, BR^2B, eine natürliche oder modifizierte Nukleobase mit einer Schutzgruppe ist und R^2A und R^4A verschiedene Schutzgruppen bedeuten, die die Bildung eines kombinatorischen Satzes von Oligonukleotiden mit 16 möglichen Schutzzuständen oder nachfolgende Derivatisierung an den Positionen ➀–➃ erlauben, und R^2B, R^4B Schutzgruppen darstellen, welche während dem Entschützen und/oder nachfolgender Derivatisierung bei ➀–➃ stabil sind; R³ die 3'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Trityl, substituiertem Trityl, Triphenylmethoxyacetyl, Diphenyl-tert-butylsilyl, Succinyl, β-Benzoylpropionyl, Lävulinyl, tert-Butyl-dimethylsilyl, 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 3-{4-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methyl]-phenyl}-propionyl, 5-{3-[bis(4-Methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl, 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methoxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl oder die Bindung an einen festen Träger und R¹ die 5'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der gleichen Gruppe wie für R³, und worin R¹ und R³ verschieden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, welche die Formel:
aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, worin das Oligonukleotid zugänglich ist für Entschützung oder Derivatisierung in 64 verschiedenen regioselektiven Kombinationen, durch Verwendung von 2-Nitrophenylsulfenyl als R^2A für das Schützen von Adenin (A), Cytosin (C) oder Guanin (G).
Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, worin R^2A und R^2B eine Basenschutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Acylgruppe, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Acetyl, Benzoyl, Anisoyl, p-/o-Tolyl, Phenoxyacetyl, t-Butylphenoxyacetyl oder 2-Nitrophenylsulfenyl (nps), 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl (npeoc), 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl (npe), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Benzyloxycarbonyl, Benzylallyloxycarbonyl, N,N-Dimethylaminomethyliden (DMM) und Derivaten davon, p-Nitrobenzyliden, Lävulinyl, Verbindung 50 oder ein Derivat davon, Verbindung 51, Trityl, Monomethoxytrityl, Dimethoxytrityl, Trimethoxytrityl, 2,2,2-Trichlor-tert-butyloxycarbonyl (TCBOC), R^4A oder R^4B eine Phosphatschutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Alkyl, Aralkyl, Allyl, β-Cyanoethyl, o-/p-Chlorphenyl, 2,5-Dichlorphenyl, Trichlorethyl, Tribromethyl, Sulfonylethyl oder Derivaten davon, 4-tert-Butyl-2-chlorphenyl, Phenylmethylamino, 2,4-Dichlorphenyl, m-Chlorphenyl, o-Fluorphenyl, Benzyl, Benzhydryl, β,β,β-Trichlorethyl, 4-Nitro-2-chlormethylphenyl, 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl (npe), 4-Nitrophenyl, Verbindung 52 und 53, R³ die 3'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Trityl, substituiertem Trityl, Triphenylmethoxycetyl, Diphenyl-tert-butylsilyl, Succinyl, β-Benzoylpropionyl; Lävulinyl, tert-Butyldimethylsilyl, 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 3-(4-[bis(4-Methoxyphenyl)-methyl]-phenyl}-propionyl, 5-{3-[bis-4-methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl, 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methoxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl oder die Bindung an einen festen Träger und R¹ die 5'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der gleichen Gruppe wie für R³
Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin R^2A 2-Nitrophenylsulfenyl (nps)) ist, R^2B 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl(npeoc) oder 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl (npe) ist, R³ 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl oder 5-{3-[bis-Methoxyphenyl)-methoxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl ist, R^4A β-Cyanoethyl ist, R^4B o-/p-Chlorphenyl ist und R¹ eine Bindung an einen festen Träger ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19 worin R¹ eine Triethyletherbindung an Glas mit kontrollierten Poren (CPG) ist.
Kombinatorischer Satz von Bindungen mit Kernstruktur M und mit mehreren reaktiven Resten, enthaltend Blockierungsgruppen, worin mindestens drei Gruppen unabhängig unter verschiedenen Bedingungen entfernbar sind, wobei selektive Derivatisierung nach Entblocken erlaubt wird und worin eine funktionelle Gruppe zur Immobilisierung verwendet wird.
Kombinatorischer Satz von Verbindungen nach Anspruch 21, worin die reaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus OH, SH, NH₂, CO₂H, SOH, SO₂H, SO₃H, CHO, Keto, Phosphat, Phosphit, Phosphoamidit, Halogen, CN, CNS, NCS, NCO und Derivaten davon.
Kombinatorischer Satz von Verbindungen nach Anspruch 21, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Saccharid, Aminozucker, Deoxyzucker, Nukleosid, Nukleotid, Coenzym, Aminosäure, Lipid, Steroid, Vitamin, Hormon, Alkaloid und Wirkstoffverbindung mit geringem Molekulargewicht.
Kombinatorischer Satz oligomerer Verbindungen nach Anspruch 21, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem Oligosaccharid, Oligopeptid oder Oligonukleotid.
Kombinatorischer Satz oligomerer Verbindungen nach Anspruch 21, worin an einer oder mehreren Positionen in der Sequenz ein vorab ausgewählter Satz von Bausteinen eingebracht ist.
Kombinatorischer Satz oligomerer Verbindungen nach Anspruch 25, worin eine Ausrichtung auf verschiedene funktionelle Gruppen innerhalb jedes Bausteins in der Sequenz möglich ist, in einer Sequenz, die auf eine spezifische Art vorbestimmt wurde, und transformiert werden kann mit Schutz- oder Modifikationsmitteln auf eine regioselektive Art.
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 24, welcher von 2'-Deoxyribonukleosiden oder Ribonukleosiden abgeleitet ist.
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 27, bestehend aus natürlichen und/oder modifizierten Basen, ausgewählt aus den Gruppen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, 5-Fluoruracil, 5-Chloruracil, 5-Bromuracil, 5-Joduracil, 5-Fluormethyluracil, 5-Chlormethyluracil, 5-Brommethyluracil, 5-Jodmethyluracil, 5-Aminomethyluracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-Mercaptomethyluracil, 5-Fluorcytosin, 5-Chlorcytosin, 5-Bromcytosin, 5-Jodcytosin, 5-Azidocytosin, 5-Alkylcytosin, 5-ω-Aminoalkylcytosin, 5-Azidouracil, 5-Alkyluracil, 5-ω-Aminoalkyluracil, 5-Methylcytosin, 5-Aminocytosin, 5-Aminouracil, 4-Triazolouracil, 4-Triazolothymin, 4-Tetrazolouracil, 4-Tetrazolothymin, Hypoxanthin, Xanthin, 2,6-Diaminopurin, 6-Chlorpurin, 2,6-Dichlorpurin, 6-Thiopurin, 2-Thiopurin, 8-Fluoradenin, 8-Chloradenin, 8-Bromadenin, 8-Jodadenin, 8-Fluorguanin, 8-Chlorguanin, 8-Bromguanin, 8-Jodguanin, 8-Aminoadenin, 8-Aminoguanin, 8-Hydroxyadenin, 8-Hydroxyguanin, 8-Thioadenin, 8-Thioguanin, N7-Deazaadenin, N7-Deazaguanin, N3-Deazaadenin, N3-Deazaguanin, N9-Deazaadenin, N9-Deazaguanin.
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 28, wobei jedes Mitglied des Satzes dargestellt wird durch die allgemeine Formel
worin ➀, ➁, ➂, ➃ Positionen in dem Molekül sind, die regioselektiv adressiert werden können, und in welchen B eine natürliche oder modifizierte Nukleobase darstellt, welche keine Schutzgruppe während der Synthese benötigt, BR^2A, BR^2B, die natürliche oder modifizierte Nukleobase mit einer Schutzgruppe ist und R^2A und R^4A verschiedene Schutzgruppen darstellen, welche die Bildung eines kombinatorischen Satzes von Oligonukleotiden mit 16 möglichen Schutzzuständen oder nachfolgende Derivatisierung an ➀–➃ erlauben, und R^2B, R^4B Schutzgruppen bedeuten, welche stabil sind während dem Entschützen und/oder nachfolgender Derivatisierung an ➀–➃; R³ die 3'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Trityl, substituiertem Trityl, Triphenylmethoxyacetyl, Diphenyl-tert-butylsilyl, Succinyl, β-Benzoylpropionyl, Lävulinyl, tert-Butyl-dimethylsilyl, 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 3-{4-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methyl]-phenyl}-propionyl, 5-{3-[bis(4-Methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl, 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methoxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl oder die Bindung an einen festen Träger und R¹ die 5'-OH-Funktionalität ist, ausgewählt aus der gleichen Gruppe wie für R³, und worin R¹ und R³ verschieden sind.
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 29, worin R^2A oder R^2B eine Basenschutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acylgruppen, wie etwa Acetyl, Benzoyl, Anisoyl, p-/o-Tolyl, Phenoxyacetyl, t-Butylphenoxyacetyl oder 2-Nitrophenylsulfenyl (nps), 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl (npe), 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl (npeoc), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Benzyloxycarbonyl, Benzyl, Allyloxycarbonyl, N,N-Dimethylaminomethyliden (DMM) und Derivaten davon, p-Nitropbenzyliden, Lävulinyl, Verbindung 50 oder Derivate davon, Verbindung 51, Trityl, Monomethoxytrityl, Dimethoxytrityl, Trimethoxytrityl, 2,2,2-Trichlor-tert-butyloxycarbonyl (TCBOC), R^4A oder R^4B Phosphatschutzgruppen sind, wie etwa Alkyl, Aralkyl, Allyl, β-Cyanoethyl, o-/p-Chlorphenyl, 2,5-Dichlorphenyl, Trichlorethyl, Tribromethyl, Sulfonylethyl oder Derivate davon, 4-tert-Butyl-2-chlorphenyl, Phenylmethylamino, 2,4-Dichlorphenyl, m-Chlorphenyl, o-Fluorphenyl, Benzyol, Benzhydryl, β,β,β-Trichlorethyl, 4-Nitro-2-chlormethylphenyl, 2-(4-Nitrophenyl)-ethyl (npe), 4-Nitrophenyl, Verbindung 52 und 53, R³ die 3'-OH-Funktionalität ist, welche sein kann ein Trityl, substituiertes Trityl, Triphenylmethoxyacetyl, Diphenyl-tert-butylsilyl, Succinyl, β- Benzoylpropionyl; Lävulinyl, tert-Butyldimethylsilyl, 2,4-Dinitrophenylsulfenyl (dnps), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 3-{4-[bis(4-Methoxyphenyl)methyl]-phenyl}-propionyl, 5-{3-[bis-4-methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl, 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methoxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl oder die Bindung an einen festen Träger und R¹ die 5'-OH-Funktionalitäten sind, ausgewählt aus der gleichen Gruppe wie R³
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, worin R^2A die 2-Nitrophenylsulfenyl-(nps)-Gruppen sind, für R^2B das 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl (npeoc) und 2-(4-Nitrophenyl)ethyl (npe), für R³ die 5-{3-[bis-4-Methoxyphenyl)-hydroxymethyl]-phenoxy}-lävulinyl- oder 5-{3-[bis-(4-Methoxyphenyl)-methoxymethyl)]-phenoxy}-lävulinylgruppen, für R^4A die β-Cyanoethylgruppen, für R^4B die o-/p-Chlorphenylgruppen und R¹ eine Bindung an einen festen Träger ist.
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, worin R¹ eine Trityletherbindung an Glas mit kontrollierten Poren (CPG) ist.
Kombinatorischer Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, welche synthetisiert worden sind unter Verwendung des Phosphoamidit-, H-Phosphonat- oder Phosphotriestersyntheseverfahrens.