DE60124637T2

DE60124637T2 - Neues Reagens zur Markierung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60124637T2
Application number: DE60124637T
Authority: DE
Inventors: Dr. Dieter Heindl; Dr. Gregor Sagner; Heribert Maerz; Dr. Herbert von der Eltz
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-09-05
Also published as: DE10044373A1; US20020110691A1; DE60124637D1; EP1186613B8; EP1186613B1; JP3684182B2; EP1186613A1; ES2276733T3; CA2356552A1; ATE346079T1; JP2003012951A; US6875850B2; CA2356552C

Description

Die Erfindung ist von dem Gebiet der Markierung synthetisch hergestellter Nukleinsäuren hergeleitet.
Stand der Technik
Synthetische (Desoxy)-Oligonukleotide, die mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind, müssen eine breites Spektrum an diversen molekularen biologischen und Diagnoseverfahren ausführen können.
Synthetische (Desoxy)-Oligonukleotide werden gewöhnlich auf einer Festphase mit Hilfe der Phosphoramidit-Chemie hergestellt. Glaskügelchen mit Poren einer definierten Größe (abgekürzt im Folgenden als CPG = Glas mit gesteuerten Poren) werden gewöhnlich als feste Phase verwendet. Das erste Monomer ist über eine spaltbare Gruppe an den Träger gebunden, so dass das freie Oligonukleotid gespalten werden kann, nachdem die Festphasensynthese beendet ist. Das erste Monomer enthält zusätzliche eine geschützte Hydroxylgruppe, wobei Dimethoxytrityl (DMT) gewöhnlich als Schutzgruppe verwendet wird. Die Schutzgruppe kann durch Säurebehandlung entfernt werden. Dann werden 3'-Phosphoramidit-Derivate der (Desoxy)-Ribonukleoside, die ebenfalls mit einer DMT-Schutzgruppe versehen sind, in einem zyklischen Prozess an jede aufeinanderfolgende reaktive Gruppe gekuppelt, nachdem die DMT-Schutzgruppe davon entfernt wurde.
Gemäß dem Stand der Technik werden so genannte trifunktionelle Trägermaterialien zur Herstellung von Oligonukleotiden verwendet, die am 3'-Ende markiert sind. Dafür wird zuerst ein trifunktioneller Spacer mit zwei reaktiven Hydroxylgruppen und einer zusätzlichen reaktiven Gruppe, vorzugsweise einer Aminogruppe, hergestellt. Nach dem Einbringen einer DMT-Schutzgruppe an eine Hydroxylgruppe, wird die nachweisbare Markierung an die reaktive Aminogruppe des trifunktionellen Spacers in einer zweiten Stufe der Synthese gekuppelt. Alternativ wird die nachweisbare Markierung jedoch nicht nur über eine reaktive Aminogruppe an den trifunktionellen Spacer gekuppelt, sondern auch über eine dritte Hydroxylgruppe oder eine SH-Gruppe ( US 5,451,463 ; WO 92/11388).
In einem dritten Schritt wird der trifunktionelle Spacer über seine noch freie Hydroxylgruppe an die Verbindungsgruppe des Festphasenmaterials gebunden, das mit einer gesonderten Bindung versehen ist.
Alternativ wird die nachweisbare Markierung bis nach der eigentlichen Oligonukleotid-Synthese nicht gekuppelt ( US 5,141,837 ). Da dies jedoch mehrere unabhängige Kupplungsreaktionen erfordert, ist ein solches Produktionsverfahren arbeitsintensiv, teuer, und kann nicht automatisiert werden.
Markierte Phosphoramidite, in denen die Markergruppe an das Phosphoramidit über einen C_3-12-Linker gebunden ist, werden gewöhnlich zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet, die am 5'-Ende markiert sind.
Folglich können nachweisbare Markierungen ebenfalls durch die Phosphoramidit-Strategie eingebracht werden (Synlett 1999, 10, 1667-1678). Die gleichen trifunktionellen Spacer können dafür wie für die Synthese von CPG-Materialien verwendet werden. Statt für die Bindung von einer der Hydroxylgruppen an die Festphase wird diese Hydroxylgruppe in diesem Verfahren in ein Phosphoramidit umgewandelt. Das resultierende Phosphoramidit kann zur Oligonukleotid-Synthese wie ein Standard-Amidit verwendet werden. Im Prinzip können solche Phosphroamidite auch für eine interne Markierung verwendet werden, indem ein Standard-Nukleosid-Phosphoramidit während des Synthesezyklus durch ein fluorophormarkiertes Phosphoramidit ersetzt wird. Es wird jedoch vorzugsweise zur 5'-Markierung verwendet, da die interne Markierung die Basenpaarung im Strang unterbricht.
Oligonukleotide, die mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen sind, wie Fluorescein, werden in der Molekularbiologie oft verwendet, wie für die Echtzeitmessung von PCR-Reaktionen (WO 97/46707). Die Fluoreszenzfarbstoffe können an die Aminogruppe des trifunktionellen Spacers in zwei verschiedenen Wegen entsprechend dem Stand der Technik gekuppelt werden:
Einerseits wird der Fluoreszenzfarbstoff, der selbst gegebenenfalls mit spaltbaren Schutzgruppen zum Schutz während der Oligonukleotid-Synthese versehen ist, in der Form eines Isothiocyanates mit der Aminogruppe umgesetzt, so dass eine Thioharnstoff-Bindung gebildet wird. Dies hat jedoch den Nachteil, dass eine solche Thioharnstoff-Bindung während der Oligonukleotid-Synthese nicht stabil ist, und somit ist es nicht möglich, dass hohe Syntheseausbeuten fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide erzielt werden (Bioconjugate Chemistry 1998, 9, 627-632). Bei einem alternativen Verfahren wird der N-Hydroxysuccinimid-Ester (NHS-Ester) einer Fluorophor-Carbonsäure mit der freien Aminogruppe des Spacers umgesetzt, so dass man eine Amidbindung erhält. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass aufgrund der Elektronenakzeptorwirkung der Amidbindung die Spektraleigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe geändert werden, so dass das Emissionsspektrum eines amidgekuppelten Derivates zu höheren Wellenlängen verschoben wird, verglichen mit dem Emissionsspektrum eines thioharnstoffgekuppelten Derivates.
Folglich war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Markierungsreagenzien zur Synthese markierter Oligonukleotide bereitzustellen, in denen die Markierung keiner starken Elektronenakzeptorwirkung unterworfen wird und die während der Oligonukleotid-Synthese stabil bleibt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war insbesondere auch die Bereitstellung von Trägermaterialien für die Synthese von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden, die einerseits eine angemessene stabile Kupplung des Fluoreszenzfarbstoffs während der Oligonukleotid- Synthese gewährleisten und die andererseits die Spektraleigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs verglichen mit den Derivaten, die mit einem Thioharnstoff-Linker gekuppelt sind, nicht beeinflussen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Markierungsreagenz und einen markierten reaktiven Träger mit der Struktur
worin:

– M ein Fluoreszenzfarbstoff ist,
– L einen Linker mit der Struktur -(CH₂)_p- oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- veranschaulicht,
– Z entweder CH oder N ist,
– S eine spaltbare Schutzgruppe ist,
– n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind,
– O-K entweder ein Phosphoramidit ist, oder K = -V-T ist, so dass T ein Festphasenträgermaterial ist und
– V eine Verbindungsgruppe mit einer spaltbaren Bindung ist.

Somit ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung auch ein markierter reaktiver Träger mit der Struktur
worin:

– M ein Fluoreszenzfarbstoff ist,
– L einer Linker mit der Struktur -(CH₂)_p- oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- veranschaulicht,
– Z entweder CH oder N ist,
– n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind,
– S eine spaltbare Schutzgruppe ist, und
– T ein Festphasen-Trägermaterial ist.
Der Linker L hat vorzugsweise die Struktur: -(CH₂)p-CO-NH-, worin p eine natürliche Zahl von 1 bis 15 ist.

Poröse Glas- oder Polystyrolteilchen mit einer definierten Porengröße werden gewöhnlich als Festphasenträgermaterial verwendet. Die spaltbare Schutzgruppe S ist gewöhnlich Dimethoxytrityl (DMT), Pixyl oder eine photochemisch spaltbare Nitrobenzylgruppe, wie NPEOC (Tetrahedron 53, S. 4247-4264 (1997)).
Der reaktive Träger hat einen Fluoreszenzfarbstoff, wie Fluorescein, als nachweisbare Markierung. Enthält der Fluorophor reaktive Gruppen, wie Hydroxygruppen im Falle von Fluorescein, müssen diese Gruppen geschützt werden, damit eine ungewünschte Reaktion mit den Phosphoramiditen während der Oligosynthese verhindert wird. Pivaloyl ist beispielsweise eine geeignete Schutzgruppe, da sie durch Spaltung unter Standard-Bedingungen nach Beendigung der Oligosynthese entfernt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren, wobei ein Molekül der Struktur M-NH-CO-(CH₂)p-COOH worin p eine natürliche Zahl zwischen 1 und 15 darstellt und M eine nachweisbare Markierung ist, zur Herstellung eines erfindungsgemäßen reaktiven Trägers verwendet wird.
Diese Synthese erfolgt vorzugsweise durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen eines trifunktionellen Spacers, der zwei reaktive Hydroxylgruppen und eine reaktive Aminogruppe enthält,
b) Einbringen einer Schutzgruppe wie DMT an eine Hydroxylgruppe,
c) Umwandeln der Carbonsäuregruppe des oben beschriebenen Moleküls, in einen aktivierten Ester, vorzugsweise einen N-Hydroxysuccinimid-Ester,
d) Kuppeln des aktivierten Esters an die reaktive Aminogruppe des trifunktionellen Spacers,
e) Kuppeln der Hydroxylgruppe des noch freien trifunktionellen Spacers an das Trägermaterial.

Alternativ kann der erfindungsgemäße reaktive Träger hergestellt werden durch Verwendung eines trifunktionellen Spacers mit der Struktur
worin:

– L ein Linker mit der Struktur
– (CH₂)_p oder der Struktur
– (CH₂)_p-CO-NH- ist, und p eine natürliche Zahl zwischen 1 und 15 ist.

Ein solches Verfahren umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte:

a) Herstellen des beschriebenen trifunktionellen Spacers,
b) Einbringen der Schutzgruppe an eine Hydroxylgruppe,
c) Aktivieren der Carbonsäuregruppe des trifunktionellen Spacers in einen aktivierten Ester,
d) Umsetzen des aktiven Esters mit der freien Aminogruppe des nachweisbaren Moleküls,
e) Kuppeln der noch freien Hydroxylgruppe an das Trägermaterial

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen reaktiven Trägers zur Synthese von 3'-markierten Nukleinsäuren, wie (Desoxy)-Oligonukleotiden und 3'-markierten Nukleinsäure-Molekülen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Trägers synthetisiert wurden, und folglich eine neue chemische Struktur an ihrem 3'-Ende haben. Dies betrifft auch insbesondere Nukleinsäure-Moleküle, die an der 3'-Position der 3'-terminalen Ribose einen Substituenten aufweisen mit der Substruktur -CH₂-CO-NH-M wobei M ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
Die Erfindung betrifft auch Phosphoramidite mit der Struktur
worin:

– M ein Fluoreszenzfarbstoff ist;
– L einen Linker mit der Struktur -(CH₂)p- oder der Struktur -(CH₂)p-CO-NH- veranschaulicht,
– Z entweder CH oder N ist,
– S eine spaltbare Schutzgruppe ist,
– n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind, und
– O-K ein Phosphoramidit ist.

In diesem Zusammenhang versteht man unter dem Begriff "Phosphoramidit", dass sämtliche Verbindungen enthalten sind, die dem Fachmann als Phosphoramidite bekannt sind (Beaucage, Methods in Molecular Biology, Hrsg. S. Agrawal, Bd. 20, S. 33-61, 1993).
Die Markierung ist ein Fluoreszenzfarbstoff, wie Fluorescein, der gegebenenfalls mit Schutzgruppen versehen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Phosphoramiditen zur Synthese markierter Nukleinsäuren. Nukleinsäuren, die mit Hilfe dieser Phosphoramidite markiert wurden, sind ebenfalls eine Aufgabe der Erfindung. Solche Moleküle enthalten einen Substituenten mit dem Strukturelement -CH₂-CO-NH-M, worin M den Fluoreszenzfarbstoff bezeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Substituent kovalent an die 5'-Position der 5'-terminalen Ribose der markierten Nukleinsäure gebunden.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind einige der verwendeten Begriffe wie folgt definiert:
Reaktive Gruppe bezeichnet Gruppen eines Moleküls, die mit einem weiteren Molekül unter geeigneten Bedingungen reagieren können, so dass eine kovalente Bindung erhalten wird. Beispiele für reaktive Gruppen sind Hydroxylgruppen, Aminogruppen und Carbonsäuregruppen.
Schutzgruppe stehen für Moleküle, die mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen eines Moleküls in einer solchen Weise reagieren, dass in einer Mehrschritt-Synthesereaktion nur eine bestimmte nicht-geschützte reaktive Gruppe mit dem gewünschten Reaktionspartner reagieren kann. Beispiele für häufig verwendete Schutzgruppen sind Dimethoxytrityl (DMT), das vorzugsweise zum Schutz von Hydroxygruppen verwendet wird, und Fmoc, das vorzugsweise zum Schutz von Aminogruppen verwendet wird.
Trifunktionelle Spacer sind Moleküle, die ein zentrales Kohlenstoff- oder Stickstoffatom haben und die drei Seitenketten aufweisen, welche im Wesentlichen aus Kohlenstoff bestehen und die jeweils eine reaktive Gruppe am Ende aufweisen.
Festes Phasenträgermaterial betrifft polymere Substanzen, die eine feste Phase bilden, welche eine reaktive Gruppe bildet, auf der andere Moleküle immobilisiert werden können. Bei der Oligonukleotid-Synthese sind dies gewöhnlich poröse Glasperlen mit einer definierten Porengröße (CPG). Alternativ können auch Polystyrolharze und andere organische Polymere und Copolymere verwendet werden (J. Indian Chem. Soc. 1998, 75, 206-218). Sollte das Oligonukleotid auf dem Substrat nach der Synthese immobilisiert bleiben, können auch Glas- oder Halbleiter-Chips als Festphasenträgermaterial verwendet werden.
Unter einem markierten reaktiver Träger versteht man ein Festphasenträgermaterial, auf dem eine weitere Verbindung, die eine nachweisbare Markierung und eine noch ungeschützte reaktive Gruppe enthält, immobilisiert wird.
Kohlenstoffketten mit einer Länge von 1 bis 15 C-Atomen werden als Linker bezeichnet. Solche Linker-Ketten können zudem ein einzelnes Stickstoffatom oder mehrere Stickstoffatome aufweisen. Zudem können die Linker auch eine einzelne Ethylenglykoleinheit oder mehrere Ethylenglykoleinheiten enthalten.
Unter einer nachweisbaren Markierung versteht man Substanzen, die mit Hilfe von Analyseverfahren erfasst werden können. Diese können beispielsweise Substanzen sein, die mit Hilfe von Massenspektroskopie, immunologischen Tests oder mit Hilfe von NMR erfasst werden können. Besonders nachweisbare Markierungen enthalten auch Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fluoresceine oder Rhodamine.
Phosphoramidite steht für Moleküle mit einem dreiwertigen Phosphoratom, das an das 5'-terminale Ende eines Nukleosids oder Nukleosid-Derivates gekuppelt werden kann. Somit können Phosphoramidite zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden. Neben den (Desoxy)-Ribonukleotid-Phosphoramiditen, die zur Kettenverlängerung verwendet werden, gibt es auch Phosphoramidite, die mit einer Markierung derivatisiert sind, die in analogen Prozessen verwendet werden können, um das Oligonukleotid während oder am Ende der Oligonukleotid-Synthese zu markieren (Beaucage, Methods in Molecular Biology, Hrsg. S. Agrawal, Bd. 20, S. 33-61 (1993)), (Synlett 10, 1667-1678 (1999)).
Der Begriff "Oligonukleotid" umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht nur (Desoxy)-Oligoribonukleotide, sondern auch alle DNA- und RNA-Derivate, wie Methylphosphonate, Phosphothioate oder 2'-O-Alkyl-Derivate und DNA-Analoga, wie LNA, HNA (18, S. 1365-1370 (1999)) und Nukleinsäuren oder Analoga davon, die auch modifizierte Basen enthalten, wie 7-Deazapurine sowie Chimären, die verschiedene Arten von Nukleinsäuren und Analoga davon umfassen.
Ein markierter reaktiver Träger mit der Struktur
hat sich in der Vergangenheit als besonders geeignet für Oligonukleotid-Synthesen erwiesen. L ist in diesem Zusammenhang ein Linker. Gemäß dem Stand der Technik enthält dieser Linker eine Amidbindung, die das Kohlenstoffatom direkt an die Markierung bindet.
T steht für ein Festphasenträgermaterial, vorzugsweise CPG, das kommerziell erhältlich ist (beispielsweise Proligo, CPG Inc.). Die Oberfläche eines solchen kommerziellen Trägermaterials ist mit Aminogruppen modifiziert.
Der Träger T kann an den Rest des Moleküls über eine so genannte Verbindungsgruppe V gebunden sein, die eine spaltbare Bindung enthält. Verbindungsgruppen, die spaltbare Bindungen enthalten, verstehen sich im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung als Gruppen, die sich zwischen dem trifunktionellen Spacer und dem Festphasenträgermaterial befinden, das durch eine einfache chemische Reaktion gespalten werden kann. Diese können Succinyl- oder Oxalyl- oder andere Verbindungsgruppen sein, die eine spaltbare Esterbindung enthalten. Andere Verbindungsgruppen sind dem Fachmann bekannt (J. Indian. Chem. Soc. 1998, 75, 206-218).
Solche Verbindungsgruppen sind wesentlich für die Anwendung des Trägermaterials zur Synthese von Oligonukleotiden, die nach dem Beenden der Synthese in wässriger Lösung vorhanden sein sollen. In dem Fall, bei dem das Oligonukleotid auf der Oberfläche des Trägermaterials nach der Synthese bleiben sollte, beispielsweise bei der Herstellung von Nukleinsäure-Anordnungen ( US 5,624,711 , Nucl. Acids. Res. Bd. 25, S. 1155-1161 (1997)), ist dagegen eine spaltbare Verbindungsgruppe unnötig und es ist eher eine nichtspaltbare Verbindungsgruppe bevorzugt.
Das Trägermaterial ist über eine Kohlenstoffkette, die 1 bis 15 C-Atome umfasst, an ein trifunktionelles zentrales Atom Z gebunden, das vorzugsweise auch ein Kohlenstoff- oder alternativ ein Stickstoffatom ist. Eine weitere Kohlenstoffkette, die 1 bis 15 C-Atome enthält, an deren Ende sich eine spaltbare Schutzgruppe S, vorzugsweise DMT, an diesem zentralen C-Atom befindet. Diese Schutzgruppe kann vor dem Beginn der Oligonukleotid-Synthese durch schwache Säurebehandlung gespalten werden. Anschließend können 3'-Phosphoramidit-Derivate der (Desoxy)-Ribonukleoside an die freigesetzte reaktive Gruppe gekuppelt werden.
Die nachweisbare Markierung M ist ein Fluoreszenzfarbstoff. Wenn solche Markierungen reaktive Gruppen enthalten, die die Oligonukleotid-Synthese stören könnten, wird der Fluoreszenzfarbstoff mit einer Schutzgruppe versehen, die dem Fachmann bekannt ist, damit unspezifische Reaktionen im Verlauf einer Oligonukleotid-Synthese verhindert werden. Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fluorescein, können effizient mit Pivaloyl geschützt werden.
Die nachweisbare Markierung ist gewöhnlich an das Zentralatom über einen bestimmten Linker gebunden. Dieser Linker hat die folgende charakteristische erfindungsgemäße Struktur M-NH-CO-(CH₂)p-Z oder M-NH-CO-(CH₂)p-CO-NH-Z, wobei p eine natürliche Zahl zwischen 1 und 15 ist.
Dies bedeutet mit anderen Worten, dass die Orientierung der Amidbindung zwischen der Markierung M und dem Linker L oder dem Zentralatom Z verglichen mit den Verbindungen, die man von Stand der Technik kennt, umgekehrt ist.
Somit ist die Partialstruktur M-NH-CO charakteristisch für die erfindungsgemäße Struktur des Linkers.
Dies ermöglicht, dass die Elektronenakzeptorwirkung der gezeigten Amidbindung wesentlich niedriger ist als diejenige der Struktur des Standes der Technik M-CO-NH-.
Dies hat den Vorteil, dass beispielsweise im Fall einer Fluoreszenzfarbstoffmarkierung die Spektraleigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs, der erfindungsgemäß konjugiert ist, fast identisch sind zu den Spektraleigenschaften eines Farbstoffs, der durch das Thioharnstoffverfahren konjugiert wird, und zwar aufgrund der Orientierung der Amidbindung. Verglichen mit der Thioharnstoffkupplung führt die erfindungsgemäße Linkerstruktur jedoch zu einer viel stabileren Verbindung, die auch während der ligonukleotid-Synthese stabil bleibt.
Der erfindungsgemäße markierte reaktive Träger kann grundlegend durch zwei verschiedene Verfahren synthetisiert werden. In einer ersten Ausführungsform wird ein reaktiver trifunktioneller Spacer, der zwei reaktive Hydroxylgruppen und eine reaktive Aminogruppe enthält, mit einer NHS-aktivierten Carbonsäuregruppe einer nachweisbaren Markierung umgesetzt. Bei einem alternativen Verfahren wird zuerst ein trifunktioneller Spacer, der eine reaktive Carbonsäuregruppe enthält, in einen aktivierten Ester umgewandelt, und dann mit einer reaktiven Aminogruppe eines nachweisbaren Moleküls umgesetzt.
Beide Verfahren sind Teil der vorliegenden Erfindung und werden somit weiter im folgenden erläutert. Im Allgemeinen werden Herstellungsverfahren in der organischen Chemie, die dem Fachmann bekannt sind, zur Durchführung der einzelnen Schritte der Synthese verwendet. Die aufgeführten Verfahren stellen nur Beispiele für Alternativen dar und sind keine Einschränkung des erfindungsgemäßen Schutzbereichs.
a) Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers, ausgehend von einem trifunktionellen Spacer, der eine reaktive Aminogruppe enthält.
Serinol kann beispielsweise als kommerziell verfügbarer Spacer verwendet werden, der ein zentrales Kohlenstoffatom und ein freies Stickstoffatom enthält.
Ein trifunktioneller Spacer, der ein zentrales Stickstoffatom enthält, kann aus der kommerziell erhältlichen Verbindung 2-Hydroxyethylhydrazin und Oxiran erhalten werden.
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine Schutzgruppe an einer der reaktiven Hydroxylgruppen des trifunktionellen Spacers eingebracht, so dass diese Seitenkette nicht mit anderen Reaktionspartnern während der anschließenden Schritte der Synthese reagieren kann. Dimethoxytrityl (DMT) wird gewöhnlich als Schutzgruppe durch bekannte Verfahren eingebracht (J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 3821). Am Ende der Reaktion werden solche Moleküle, die nur eine Schutzgruppe haben, durch Säulenchromatographie-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert.
Nachweisbare Markierungssubstanzen M, die eine freie terminale Aminogruppe haben, können mit organischen Syntheseverfahren umgewandelt werden, die dem Fachmann auch bekannt sind, durch Umsetzung mit einer geeigneten aktivierten Dicarbonsäure, wie einem Dicarbonsäureanhydrid, in ein Molekül mit der Struktur M-NH-CO-(CH₂)p-COOH, während eine Amidbindung erzeugt wird, wobei die Länge p der CH₂-Kette mindestens 1 und höchstens 15 ist. Solche Verbindungen mit einem Carbonsäurerest können unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, durch Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid in einen N-Hydroxysuccinimid-Ester umgewandelt werden. Insbesondere können Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle auf diese Weise in ein entsprechendes NHS-Ester-Derivat umgewandelt werden. Enthält die Markierungsgruppe M freie reaktive Gruppen, wie Hydroxygruppen, müssen diese jedoch mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden, die dem Fachmann bekannt sind.
In einem weiteren Reaktionsschritt wird der markierte NHS-Ester durch Standard-Verfahren an die freie Aminogruppe des trifunktionellen Spacers gekuppelt. Anschließend wird die noch freie Hydroxylgruppe des trifunktionellen Spacers durch herkömmliche Verfahren auf dem Trägermaterial immobilisiert, das gewöhnlich CPG ist. Ein derivatisiertes Trägermaterial, das eine reaktive Gruppe, wie eine Hydroxyl-, Amino-, Thiol- oder Carboxylgruppe, hat, wird für diesen Zweck verwendet.
Nach dem Immobilisieren müssen die noch freien reaktiven Gruppen des Trägermaterials durch eine so genannte Capping-Reaktion, die dem Fachmann bekannt ist, deaktiviert werden (Pon, R.T. in Methods in Molecular Biology, Bd. 20, Hrsg. S. Agrawal, Humana Press Inc. New Jersey, Kap. 19, S. 481-482 (1993)). Somit werden beispielsweise die noch freien Aminogruppen durch eine Acylierungsreaktion deaktiviert.
Somit wird beispielsweise eine immobilisierte Verbindung mit dem Strukturelement M-NH-CO-(CH₂)p durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt und kann insbesondere zur Synthese von 3'-terminal markierten Nukleinsäuren als Folge der vorteilhaften Eigenschaften verwendet werden.
b) Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers, ausgehend von einem trifunktionellen Spacer, der eine reaktive Carbonsäuregruppe enthält.
Ausgehend von einem herkömmlichen trifunktionellen Spacer, der zwei freie Hydroxylgruppen und eine freie Aminogruppe enthält, wird zuerst eine Verbindung der allgemeinen Struktur
hergestellt durch Umsetzen mit einer Dicarbonsäure mit herkömmlichen Verfahren, während eine Amidbindung erzeugt wird, in der
Z entweder CH oder N ist und
L einen Linker der Struktur -(CH₂)p- oder der Struktur -(CH₂)p-CO-NH- veranschaulicht und zugleich m, n und p jeweils unabhängig voneinander eine natürliche Zahl zwischen 1 und 15 sind.
Eine Verbindung der folgenden Struktur ist bevorzugt:
wobei m, n und p jeweils unabhängig voneinander eine natürliche Zahl zwischen 1 und 15 sind.
Bei einer bevorzugten Art und Weise kann man auch mit einem Spacer mit zentralem Stickstoffatom beginnen:
wobei in diesem Fall m, n, und p auch jeweils unabhängig voneinander natürliche Zahlen zwischen 2 und 15 sind. Moleküle, wie das kommerziell erhältliche Bicin, bei dem n und m = 2 sind, sind besonders vorteilhaft. Der Grund ist, dass es für die Stabilität dieser Verbindungen vorteilhaft ist, wenn mindestens zwei C-Atome zwischen dem zentralen N-Atom und den zwei terminalen Hydroxylgruppen vorhanden sind.
Dann wird eine Schutzgruppe, wie DMT an eine der reaktiven Hydroxylgruppen eingebracht, so dass diese Schutzgruppe während der folgenden Syntheseschritte nicht mit anderen Reaktionspartnern reagieren kann. Am Ende der Reaktion werden solche Moleküle, die nur eine Schutzgruppe aufweisen, durch Verfahren der präparativen Säulenchromatographie isoliert, die dem Fachmann bekannt sind.
Anschließend wird die noch freie Carbonsäuregruppe unter Bedingungen aktiviert, die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere eine Aktivierung mittels Triphosgen und DMF hat sich als besonders geeignet erwiesen.
In einem weiteren Schritt kann ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül, das eine reaktive Aminogruppe enthält, an den trifunktionellen Spacer gekuppelt werden. Ein trifunktioneller Spacer wird auf diese Weise gebildet, indem wie unter a) beschrieben eine Hydroxylgruppe mit Dimethoxytrityl geschützt wird, das Zentralatom über einen Linker an die Markierungsgruppe gebunden wird, und der eine freie Hydroxygruppe enthält.
Schließlich wird die noch freie Hydroxylgruppe des trifunktionellen Spacers am Trägermaterial, meist CPG, durch Standardverfahren immobilisiert, die analog zu dem unter a) beschriebenen Verfahren sind. Wiederum müssen die noch freien reaktiven Gruppen des Trägermaterials nach dem Immobilisieren durch eine so genannte Capping-Reaktion, die dem Fachmann bekannt ist, deaktiviert werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Markierungsreagenz ein nichtnukleosidisches Phosphoramidit sein.
Entsprechend zu dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung reaktiver Träger wird zuerst ein Zwischenprodukt der folgenden allgemeinen Formel in einem ersten Schritt hergestellt:
wobei M einen Fluoreszenzfarbstoff veranschaulicht und Z entweder CH oder N ist. S steht für eine spaltbare Schutzgruppe, L veranschaulicht einen Linker mit der Struktur – (CH₂)p- oder der Struktur – (CH₂)p-CO-NH- und n, m und p stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen von 1 bis 15.
In dieser Ausführungsform ist die Schutzgruppe S vorzugsweise Dimethoxytrityl. Es ist gleichermaßen vorteilhaft, wenn die reaktiven Gruppen, die auf der Markierung zugegen sein können, auch bei den Schutzgruppen zugegen sein können.
Diese Vorstufen können dann in einem zweiten Schritt durch bekannte Verfahren in ein erfindungsgemäßes Phosphoramidit umgewandelt werden, durch Umsetzen der noch freien Hydroxylgruppe (beispielsweise B. Meyer, R.B. in Methods in Mol. Biol. Bd. 26, Hrsg. S. Agrawal, Humana Press Inc. 1994, Kapitel 2 S. 80).
Solche erfindungsgemäßen Phosphoramidite können zum Markieren von Nukleinsäuren und insbesondere zum Markieren von Oligonukleotiden verwendet werden. Die Markierung kann an dem 5'-Ende, am 3'-Ende oder intern als so genannte "abasische Stelle" in Oligonukleotide eingebracht werden.
Bei einer 5'-Markierung an der 5'-Stelle der Ribose des 5'-terminalen Nukleotids erfolgt der Einbau durch herkömmliche Verfahren am Ende der Oligonukleotid-Synthese (Beaucage, Methods in Molecular Biology, Hrsg. S. Agrawal, Bd. 20, S. 33-61 (1993)). Anschließend wird die Schutzgruppe, meist DMT, entfernt. Oligonukleotide werden auf diese Weise erhalten, die einen Substituenten aufweisen, der das Strukturelement -CH₂-CO-NH-M an der 5'-Position der 5'-terminalen Ribose aufweist.
Nach erneutem Entfernen der Schutzgruppe, die durch das Phosphoramidit eingebracht wurde, kann dann eine Kettenverlängerung in der 3'-5'-Richtung an der freien Hydroxylgruppe als Teil einer klassischen Oligonukleotid-Synthese durchgeführt werden. Ein intern markiertes Nukleinsäuremolekül, das eine so genannte interne "abasische Stelle" enthält, wird auf diese Weise gebildet.
Die Markierung am 3'-Ende erfolgt nach folgendem Prinzip: Kommerziell erhältliches 3'-Phosphat-CPG (beispielsweise Glenn Research) wird als Träger verwendet. Ein erfindungsgemäßes Phosphoramidit wird im ersten Synthesezyklus verwendet. Da dieser eine zusätzliche tritylierte Hydroxylgruppe enthält, kann die Standard-Oligonukleotid-Synthese nach dem Spalten der DMT-Schutzgruppe an der nun freien Hydroxylgruppe beginnen. Nach dem Spalten vom Träger werden dann Oligonukleotide erhalten, die einen Substituenten aufweisen, der das Strukturelement -CH₂-CO-NH-M an der 3'-Position der 3'-terminalen Ribose aufweist.
Die Erfindung wird weiter durch die nachstehenden Beispiele charakterisiert:
Beispiel 1
Herstellung eines Dipivaloylfluorescein-NHS-Esters
A) Dipivaloylnitrofluorescein
8 ml (65 mmol) Pivaloylchlorid (Merck 801276) wurden tropfenweise unter Kühlen auf Eis zu einer Suspension von 5 g (13 mmol) 4-Nitrofluorescein (TCI 199) in einem Gemisch aus 100 ml Dichlormethan, 8 ml Pyridin und 6 ml Dimethylformamid gegeben. Die resultierende klare gelbe Lösung wurde anschließend für 2,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt. In diesem Verfahren bildet sich ein weißer Niederschlag (Pyridiniumhydrochlorid), der durch Filtration beseitigt wurde. 20 ml Dichlormethan und 50 ml Wasser wurden zu dem Filtrat zugegeben, das in einen Trenntrichter überführt wurde. Die organische Phase wurde getrennt und einmal mit 50 ml Wasser gewaschen. Die getrennte organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockne in einem Vakuum in einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde aus 100 ml Diisopropylether umkristallisiert (Ausbeute: 6,5 g)
B) Dipivaloylaminofluorescein
6,5 g (11,9 mmol) Dipivaloylnitrofluorescein wurden in 100 ml Dioxan gelöst. Dann wurden 650 mg Palladium/Aktivkohle (Merck 807104), gelöst in 20 ml Ethanol, zugegeben, und Wasserstoff wurde für 2,5 Std. unter Schütteln eingeleitet. Anschließend wurde das Gemisch durch einen Doppelfilter (Rundfilter- + Seitz-Filter-Schichten) filtriert und anschließend bis zur Trockne in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde über einer Silicagel-60-Säule (Durchmesser = 8,5 cm, Höhe = 30 cm) getrennt. Ein Gemisch aus Ethylacetat/Hexan 2/1 (Vol./Vol.) wurde als mobiles Lösungsmittel verwendet (Ausbeute: 3,0 g).
C) Dipivaloyl-4-aminoglutarylfluorescein
Ein Gemisch aus 2,6 g (5 mmol) Dipivaloylaminofluorescein, 2,3 g (20 mmol) Glutarsäureanhydrid, 123 mg (1 mmol) Dimethylaminopyridin (Fluka 39405) und 1,4 ml (10 mmol) Triethylamin in 75 ml Chloroform wurde für 4 Std. unter Rückfluss gekocht. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurden 50 ml Wasser zugegeben, und es wurde für weitere 15 min gerührt. Die organische Phase wurde in einem Trenntrichter getrennt und zweimal mit jeweils 50 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde es bis zur Trockne in einem Vakuum in einem Rotationsverdampfer eingedampft.
Der Rückstand wurde über einer Silicagel-60-Säule (Durchmesser = 8,5 cm, Höhe = 30 cm) getrennt. Ein Gemisch aus Toluol/Ethylacetat/Methanol in einem Verhältnis von 4/1/2 (Vol./Vol./Vol.) wurde als mobiles Lösungsmittel verwendet (Ausbeute: 3,0 g).
D) Dipivaloyl-4-aminoglutarylfluorecein-NHS-Ester
1,4 g (12,2 mmol) N-Hydroxysuccinimid wurden unter Argon zu einer Lösung von 2,6 g (4,1 mmol) Dipivaloyl-4-aminoglutarylfluorescein in 250 ml wasserfreiem Dichlormethan (4,1 mmol) gegeben. Anschließend wurden 1,93 ml (14,0 mmol) Morpholinoethylisocyanid (14,0 mmol) dazu gegeben, und es wurde für 18 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum entfernt. Ein Gemisch aus 600 ml Ethylacetat und 100 ml Diethylether wurde zu dem Rückstand gegeben. Die organische Lösung wurde in einem Trenntrichter dreimal mit jeweils 150 ml 0,2 N HCl gewaschen und dann einmal mit 150 ml gesättigter Natriumchloridlösung. Die getrennte organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet. Nach der Filtration wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter einem Vakuum in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde für 0,5 Std. in einem Hochvakuum getrocknet (Ausbeute: 2,7 g).
Beispiel 2
Herstellung einer DMT-Fmoc-Verbindung als trifunktioneller Spacer
A) N-Fmoc 1,3-Dihydroxy-2-aminopropan
21,6 g Fmoc-NHS (Novabiochem. 01-63-001) (64 mmol) wurden in 300 ml Dioxan gelöst und nacheinander mit Serinol (Aldrich 35,7898) (60 mmol), 200 ml Wasser (VE) und 6,8 g Natriumhydrogencarbonat (80 mmol) gemischt. Das Gemisch wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration am darauf folgenden Tag entfernt.
1,2 l Wasser und 50 ml gesättigte NaCl-Lösung wurden zu dem Filtrat zum Fällen des Produktes gegeben. Nach Saugfiltration des Überstandes über einer Glasfritte wurde das Produkt über Nacht in einem Exsikkator über Calciumchlorid getrocknet. Anschließend wurde es über einer Silicagel-60-Säule (Durchmesser = 8,5 cm, Höhe = 30 cm) getrennt. Ein Ethylacetat-Methanol-Gemisch in einem Volumen-Verhältnis von 5/1 wurde als mobiles Lösungsmittel verwendet (Ausbeute: 12,35 g).
B) N-Fmoc 1-Dimethoxytrityloxy-3-hydroxy-2-aminopropan
Eine Lösung von 13,85 g (41 mmol) Dimethoxytritylchlorid in 55 ml wasserfreiem Pyridin wurde zu einer Lösung von 12,19 g (38,9 mmol) N-Fmoc 1,3-Dihydroxy-2-aminopropan in 60 ml wasserfreiem Pyridin unter Argon gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter einem Vakuum in einem Rotationsverdampfer entfernt, der Rückstand wurde in 500 ml Ethylacetat gelöst und einmal mit 250 ml Wasser/250 ml gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde getrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach der Filtration wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer entfernt.
Anschließend wurde es über Silicagel getrennt. Ein Gemisch aus Toluol/Ethylacetat/Methanol in einem Verhältnis von 4/1/0,5 (Vol./Vol./Vol.), zu dem 0,1% (Vol.) Triethylamin zugefügt wurden, wurde als mobiles Lösungsmittel verwendet (Ausbeute: 15 g).
C) 1-Dimethoxytrityloxy-3-hydroxy-2-aminopropan
14 g (22,7 mmol) N-Fmoc 1-Dimethoxytrityloxy-3-hydroxy-2-aminopropan wurden in 200 ml Ethylacetat gelöst, und anschließend wurden 200 ml Piperidin unter Rühren zugegeben. Nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde dies bis zur Trockne in einem Vakuum auf einem Rotationsverdampfer verdampft. Der Rückstand wurde auf Silicagel getrennt. Mobiles Lösungsmittel: Toluol/Ethylacetat/Methanol in einem Volumenverhältnis von 4/1/0,5, wozu 0,1% (Vol.) Triethylamin gegeben wurden (Ausbeute: 6,0 g).
Beispiel 3:
Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluorescein-CPG
A) Reaktion von Glutarylamino-bispivaloylfluorescein NHS-ester mit 1-Dimethoxytrityloxy-3-hydroxy-2-aminopropan
(Herstellung eines erfindungsgemäßen trifunktionellen Spacers, der mit Fluorescein und DMT substituiert ist).
2,7 g (3,7 mmol) Glutarylaminobispivaloylfluorescein-NHS-ester und 2,0 g (5,09 mmol) 1-Dimethoxytrityloxy-3-hydroxy-2-aminopropan wurden über Nacht in 2,5 ml Pyridin unter Ausschluss von Feuchtigkeit gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter einem Vakuum auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde auf Silicagel 60 getrennt. Ein Gemisch aus Ethylacetat/Methanol in einem Verhältnis von 8/1 (Vol./Vol.), wozu 0,1% (Vol.) Triethylamin gegeben wurden, diente als mobiles Lösungsmittel. Ausbeute: 2,4 g (DC: Silicagel 60 Merck 105735 Toluol/Ethylacetat/Methanol, 4/1/1 Rf: 0,45).
B) Succinylierung
(Herstellung eines trifunktionellen Spacers, der mit Fluorescein, DMT und einer reaktiven Carboxylgruppe substituiert ist).
Ein Gemisch aus 2,33 g (2,3 mmol) Produkt aus A und 0,49 g (5 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 61,5 mg (0,5 mmol) DMAP und 30,5 ml wasserfreiem Pyridin wurde über Nacht unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter einem Vakuum im Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde auf Silicagel 60 getrennt. Ein Gemisch aus Toluol/Ethylacetat/Methanol in einem Verhältnis von 4/1/1 (Vol./Vol./Vol.), wozu 0,1% (Vol.) Triethylamin gegeben wurden, diente als mobiles Lösungsmittel (Ausbeute: 2,2 g). (DC: Silicagel 60 Merck 105735 Toluol/Ethylacetat/Methanol, 4/1/1 Rf = 0,42).
C) Herstellung von Fluorescein-CPG mit der Struktur:
(Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluorescein-CPG).
Eine Suspension aus 2,2 g (2,0 mmol) Succinat aus Schritt B), 2,0 g (10,4 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und 200 mg (1,64 mmol) DMAP wurde unter Argon in einem Gemisch aus 80 ml wasserfreiem DMF und 44 ml wasserfreiem Pyridin in einem 500 ml Rundbodenkolben gerührt, bis das gesamte EDC gelöst war. Dann wurden 28 g Icaa – CPG 500 A (CPG-Inc) dazu gegeben. Die Suspension wurde anschließend vorsichtig für 16 Std. bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Feuchtigkeit geschüttelt.
Anschließend wurde dies über einer D3-Glasfritte vakuumfiltriert, wobei der Rückstand nacheinander mit 220 ml DMF, 220 ml THF und 150 ml Ether gewaschen und anschließend trocken gesaugt wurde.
Für das Capping wurden 80 ml Pyridin und 22 ml Acetanhydrid zu dem CPG in einem 500 ml-Kolben gegeben, und das Gemisch wurde vorsichtig für 1 Std. bei Raumtemperatur geschüttelt.
Es wurde dann über einer D3-Glasfritte vakuumfiltriert, und der Rückstand wurde nacheinander mit 440 ml THF und 125 ml Ether gewaschen. Das CPG-Material wurde anschließend für 4 Std. in einem Hochvakuum getrocknet (Ausbeute 28,4 g).
D) Untersuchung der Ladung mittels Tritylspaltung:
4,37 mg CPG-Material wurden in 25 ml DMT-Entfernungsreagenz (Roth 2257.2) suspendiert, und die Extinktion A bei 498 nm wurde gemessen (A = 0,51). Epsilon498 nm DMT = 14300 (L·/mol·cm)
Die Berechnung war wie folgt: 14,3(L·mmol–1·cm–1)·25 ml·A498nm/Gewicht(mg) = μmol/g CPG 14,3·25 ml·0,514/4,37 mg = 42,05 μmol/g CPG
Beispiel 4:
Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluorescein-CPG
A) Dimethoxytritylbicin
Eine Lösung von 3,38 g (10 mmol) Dimethoxytritylchlorid, gelöst in 50 ml Pyridin, wurde unter heftigem Rühren zu einem Gemisch aus 200 ml Pyridin und 6,56 g (40 mmol) wasserfreiem Bicin zugefügt. Es wurde dann für 18 Std. bei Raumtemperatur und unter Ausschluss von Feuchtigkeit gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter einem Vakuum im Rotationsverdampfer entfernt. Danach wurden 200 ml Ethylacetat zugegeben, und es wurde für 10 min geschüttelt. Diese Suspension wurde anschließend vakuumfiltriert. Der Rückstand wurde 10 min mit 200 ml Ethylacetat gerührt und wieder vakuumfiltriert. Die vereinigten Filtrate wurden bis zu 30 ml unter einem Vakuum auf einem Rotationsverdampfer eingeengt. 700 ml Hexan wurden dann tropfenweise unter Rühren zu der Lösung zugegeben. Dadurch flockt das Produkt aus. Anschließend wurde es saugfiltriert, erneut mit 200 ml Hexan gewaschen und in einem Hochvakuum getrocknet (Ausbeute: 1,1 g).
B) N-(2-Hydroxyethyl)-N-(2-dimethoxytrityloxyethyl)-5-(2-aminoethylcarboxamido)bispivaloylfluorecein
0,52 g (1,75 mmol) Bistrichlormethylcarbonat (Triphosgen) wurden in 30 ml wasserfreiem THF unter Argon und unter Rühren gelöst. Anschließend wurden 0,370 ml DMF unter Kühlen auf Eis zugegeben und für eine Std. bei 0°C gerührt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wurden 2,20 ml Triethylamin und dann ein Gemisch aus 2,33 g (5 mmol) Dimethoxytritylbicin und 2,60 g (5 mmol) Dipivaloyl-(4'-amino)-fluorescein, gelöst in 20 ml THF, zugefügt, und es wurde dann für 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter einem Vakuum in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde auf Silicagel 60 getrennt. Ein Gemisch aus Toluol/Ethylacetat/Methanol in einem Verhältnis von 4/1/1 (Vol./Vol./Vol), wozu 0,1% Triethylamin gegeben wurden, diente als mobiles Lösungsmittel (Ausbeute: 0,6 g).
Die Succinylierung und die Kupplung an den CPG-Träger wurden wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 5:
Synthese und Reinigung eines 3'-markierten Fluorescein-27mer-Oligonukleotids.
Die Synthese wurde durchgeführt mit Hilfe eines Automatik-DNA-Synthesegerätes (Applied Biosystems, Modell ABI 392-08). Der Synthesemaßstab betrug 1 μmol: Dazu wurden 24 mg Fluorescein-CPG-Material aus Beispiel 3 in eine leere Synthesesäule (Glenn Research) gefüllt, und die Säule wurde in der geeigneten Position auf dem Synthesegerät befestigt. Standard-3'-Phosphoramidite ([(MeO)₂Tr]ib²G_d, [(MeO)₂Tr]bz⁶A_d, [Meo)₂Tr]bz⁴C_d, [(MeO₂Tr]T_d) wurden zur Synthese verwendet.
Die Oligomersynthese folgte dem normalen Phosphoramidit-Protokoll für DNA-Synthesegeräte im Trityl-Off-Modus. Das Oligonukleotid wurde mit 25% NH₃/H₂O (8 Std. bei 55°C) gespalten oder seine Schutzgruppe entfernt. Eine Ionenaustauschchromatographie auf MonoQ (5,0 × 50 mm Säule von Amersham Pharmacia Biotech) wurde zur Reinigung verwendet (A: 10 mM Natriumhydroxid/Wasser B: 1M Natriumchlorid in 10 mM Natriumhydroxid/Wasser, Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min von 0% B bis 100% innerhalb von 30 min). Das markierte Oligomer wird durch Dialyse oder Gelfiltration entsalzt und lyophilisiert.
1 zeigt ein HPLC-Chromatogramm. Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt: Säule: RP18 Bischoff Hypersil ODS 5 μ NC (250 × 4,6 mm) Teil 25461805, Puffer A: 0,1 M Triethylammoniumacetat pH-Wert 6,8, Puffer B: 1 l A + 1 l Acetonitril, Gradient: 2 min von 0% B bis 100% B in 23 min, 100% B für 8 min, Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Nachweis bei 260 nm.
Die 2 zeigt ein MALDI-MS-Spektrum (Voyager DE, PerSeptive Biosystems, Matrix: 3-Hydroxypicolinsäure). Der Peak bei m/z = 8798,2 entspricht der Masse des Oligonukleotids, der Peak bei m/z = 10598,2 ist ein interner Standard.
Beide Figuren zeigen, dass ein erfindungsgemäßes 3'-markiertes Oligonukleotid mit hoher Reinheit synthetisiert werden kann.
Kurze Beschreibung der Figuren:
Es zeigt:
1 ein HPLC-Chromatogramm eines Oligonukleotids, das erfindungsgemäß synthetisiert wurde, mit einer Fluorescein-Markierung am 3'-Ende.
2 ein Massenspektrogramm des gleichen Oligonukleotids, das erfindungsgemäß synthetisiert wurde.

Claims

Markierungsreagenz mit der Struktur:
worin: – M ein Fluoreszenzfarbstoff ist, – L einen Linker mit der Struktur -(CH₂)_p- oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- veranschaulicht, – Z entweder CH oder N ist, – S eine spaltbare Schutzgruppe ist, – n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind, – O-K ein Phosphoramidit ist.
Markierter reaktiver Träger der Struktur:
worin: – M ein Fluoreszenzfarbstoff ist, – L einen Linker mit der Struktur -(CH₂)_p- oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- veranschaulicht, – Z entweder CH oder N ist, – S eine spaltbare Schutzgruppe ist, – n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind, – T ein Festphasen-Trägermaterial ist, und – V eine Linker-Gruppe ist, die eine spaltbare Bindung enthält.
Träger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial aus Glasteilchen mit einer definierten Porengröße besteht.
Träger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein ist.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Z = N oder CH ist und L = -(CH₂)_p-CO-NH- ist, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen eines trifunktionellen Spacers, der zwei reaktive Hydroxylgruppen und eine reaktive Aminogruppe enthält, b) Einbringen einer Schutzgruppe an eine Hydroxylgruppe, c) Umwandeln der Carbonsäuregruppe eines Moleküls, bestehend aus der Struktur M-NH-CO-(CH₂)_p-COOH, worin p eine natürliche Zahl zwischen 1 und 15 ist, und M ein Fluoreszenzfarbstoff ist, in einen aktivierten Ester, d) Kuppeln des aktivierten Esters an die reaktive Aminogruppe des trifunktionellen Spacers, e) Kuppeln der Hydroxylgruppe des noch freien trifunktionellen Spacers an das Trägermaterial.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach den Ansprüchen 2 bis 4, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen eines trifunktionellen Spacers, bestehend aus der Struktur
worin: – Z entweder CH oder N ist, – L ein Linker mit der Struktur -(CH₂)_p oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- ist – m, n und p jeweils unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 15 sind, b) Einbringen der Schutzgruppe an eine Hydroxylgruppe, c) Umwandeln der Carbonsäuregruppe des trifunktionellen Spacers in einen aktivierten Ester, d) Kuppeln eines nachweisbaren Fluoreszenzmoleküls, das eine freie Aminogruppe enthält durch Umsetzen des aktiven Esters mit der Aminogruppe, e) Kuppeln der noch freien Hydroxylgruppe an das Trägermaterial
Verwendung eines Trägers nach den Ansprüchen 2 bis 4 zur Synthese 3'-markierter Nukleinsäuren.
3'-Markiertes Nukleinsäuremolekül, das mit Hilfe eines Trägers nach den Ansprüchen 2 bis 4 hergestellt wird, wobei das markierte Nukleinsäuremolekül die Struktur
aufweist, worin: – M ein Fluoreszenzfarbstoff ist; – L einen Linker mit der Struktur -(CH₂)_p- oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- veranschaulicht, – Z entweder CH oder N ist, – S eine Nukleinsäure ist, – n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind, – K = H.
Markierungsreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass M Fluorescein ist.
Verwendung eines Markierungsreagenzes nach Anspruch 1 oder 9 zur Synthese markierter Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass während der Oligonukleotid-Synthese ein Standard-Nukleosid-Phosphoramidit ersetzt wird durch ein fluorophormarkiertes Phosphoramidit nach Anspruch 1 oder 9 während des Synthese-Zyklus.
Markiertes Nukleinsäuremolekül, hergestellt mit Hilfe des Markierungsreagenzes nach Anspruch 1 oder 9, wobei das Nukleinsäuremolekül die Struktur umfasst
worin: – Mein Fluoreszenzfarbstoff ist, – L einen Linker mit der Struktur -(CH₂)_p- oder der Struktur -(CH₂)_p-CO-NH- veranschaulicht, – Z entweder CH oder N ist, – S gleich H ist, – n, m und p unabhängig voneinander natürliche Zahlen von 1 bis 15 sind, – O-K an die 5'-Position der 5'-terminalen Ribose gebunden ist.