ES2276733T3

ES2276733T3 - Nuevos reactivos para marcar acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2276733T3
Application number: ES01121139T
Authority: ES
Inventors: Dieter Dr. Heindl; Gregor Dr. Sagner; Heribert Maerz; Herbert Dr. Von Der Eltz
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2021-09-04
Also published as: EP1186613A1; EP1186613B1; JP2003012951A; DE10044373A1; DE60124637T2; US20020110691A1; CA2356552A1; ATE346079T1; CA2356552C; US6875850B2; EP1186613B8; JP3684182B2; DE60124637D1

Abstract

Reactivo marcador que tiene la estructura M-NH-CO-L-Z-(CH2)n-O-S ¿ (CH2)m-O-K en la que - M es un colorante fluorescente, - L significa un engarce de estructura -(CH2)p o de la estructura -(CH2)p-CO-NH-, - Z es CH o N, - S es un grupo protector eliminable, - n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15, - O-K es una fosforamidita.

Description

Nuevos reactivos para marcar ácidos nucleicos.

La invención se refiere al ámbito del marcado de ácidos nucleicos obtenidos por síntesis.

El estado de la técnica

Para la ejecución de un amplio espectro de los más diversos métodos de biología molecular y de diagnóstico molecular se requieren (desoxi)oligonucleótidos de origen sintético, provistos de un marcador detectable.

La obtención de (desoxi)oligonucleótidos sintéticos se realiza en general en una fase sólida mediante la química de las fosforamiditas. Como fase sólida se emplean habitualmente esferillas de vidrio con poros de un tamaño definido (a continuación se abrevian por CPG = controlled pore glass). El primer monómero se fija sobre el soporte mediante un grupo eliminable de modo que al término de la síntesis en fase sólida puede separarse el oligonucleótido libre. El primer monómero contiene además un grupo hidroxilo protegido, empleándose normalmente como grupo protector el dimetoxitritilo (DMT). El grupo protector puede eliminarse por tratamiento con un ácido. En un proceso cíclico se unen sucesivamente los derivados de 3'-fosforamidita de los (desoxi)ribonucleósidos, también dotados de un grupo protector DMT, con diversos grupos reactivos después de haberse liberado de los grupos protectores DMT.

Según el estado de la técnica se emplean materiales de soporte llamados trifuncionales para obtener oligonucleótidos marcados en el extremo 3'. Para ello se prepara en primer lugar un espaciador trifuncional que tiene dos grupos hidroxilo reactivos y otro grupo reactivo adicional, con preferencia un grupo amino. Después de introducir un grupo protector DMT sobre un grupo hidroxilo se une el marcador detectable al grupo amino reactivo del espaciador trifuncional mediante un grupo amino reactivo, pero también mediante un tercer grupo hidroxilo o un grupo SH (US 5,451,463; WO 92/11388).

En un tercer paso se une el espaciador trifuncional mediante un grupo hidroxilo todavía libre al grupo de engarce del material de la fase sólida, provisto de un enlace separable.

Como alternativa, la unión del marcador detectable no se realiza hasta después de haberse completado la síntesis del oligonucleótido propiamente dicha (US 5,141,837). Por el hecho de esto requiere múltiples reacciones de unión independientes, semejante procedimiento de síntesis resulta laborioso, costoso y no apto para la automatización.

Para la síntesis de oligonucleótidos marcados en su extremo 5' se emplean normalmente fosforamiditas que están unidas a un marcador mediante un engarce C_{3-12}.

Por ello, los marcadores detectables pueden introducirse también con una estrategia de fosforamidita (Synlett 10, 1667-1678, 1999). Para ello pueden emplearse los mismos espaciadores trifuncionales, que se emplean para la obtención de materiales CPG. En este proceso en lugar de unir un grupo hidroxilo a la fase sólida, este grupo hidroxilo se convierte en una fosforamidita. La fosforamidita resultante puede emplearse como amidita estándar para la síntesis de oligonucleótidos. En principio, estas fosforamiditas pueden utilizarse también durante el ciclo de síntesis para el marcado interior mediante la sustitución de una fosforamidita de nucleósido estándar por una fosforamidita marcada con un fluoróforo. Sin embargo es preferible el marcado del extremo 5', ya que el marcado interior interrumpe el apareamiento de bases de la hebra.

Los oligonucleótidos provistos de un marcador fluorescente, por ejemplo la fluoresceína, se utilizan a menudo en biología molecular, por ejemplo para la medición en tiempo real de las reacciones PCR (WO 97/46707). Los colorantes fluorescentes pueden unirse al grupo amino del espaciador trifuncional de dos maneras distintas según la técnica anterior.

Por un lado, el colorante fluorescente, que eventualmente puede estar provisto de grupos protectores eliminables que lo protegen durante la síntesis de los oligonucleótidos, se hace reaccionar en forma de isotiocianato con el grupo amino para formar un enlace tiourea. No obstante, esto tiene el inconveniente de que semejante enlace tiourea no es estable durante la síntesis de oligonucleótidos y, por ello, no se pueden conseguir rendimientos elevados en la síntesis de oligonucleótidos provistos de marcadores fluorescentes (Bioconjugate Chemistry 9, 627-632, 1998). En un proceso alternativo puede hacerse reaccionar el éster de la N-hidroxisuccinimida (éster de NHS) de un ácido carboxílico fluoróforo con el grupo amino libre del espaciador para formar un enlace mida. Sin embargo, se ha constatado que, debido al efecto de aceptor de electrones del enlace amida, las propiedades espectrales del colorante fluorescente se alteran de tal manera que el espectro de emisión de un derivado con enlace amida se desplazan hacia longitudes de onda con respecto al espectro de emisión de un derivado provisto de un enlace tiourea.

Es, pues, un cometido de la presente invención el desarrollo de reactivos marcadores para la síntesis de oligonucleótidos marcados, en los que el marcador no está expuesto a ningún efecto aceptor de electrones intenso y permanece estable durante la síntesis de los oligonucleótidos.

Un objeto de la presente invención es en particular la producción de materiales de soporte para la obtención de oligonucleótidos provistos de marcadores fluorescentes, que por un lado garanticen una unión suficientemente estable del colorante fluorescente y por otro lado dejen invariables las propiedades espectrales del colorante fluorescente con respecto al derivado unido a un engarce de tipo tiourea.

Descripción breve de la invención

La presente invención se refiere por tanto a un reactivo marcador y a un soporte reactivo marcado que tiene la estructura

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en la que

-: M es un colorante fluorescente,

-: L significa un engarce de estructura -(CH_{2})p o de la estructura -(CH_{2})p-CO-NH-,

-: Z es CH o N,

-: S es un grupo protector eliminable,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: O-K es una fosforamidita o bien K = V-T, en el que T es un material de soporte de fase sólida y V es un grupo de unión que contiene un enlace eliminable.

Por ello, un objeto de la presente invención es también un soporte reactivo marcado de estructura:

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en la que:

-: M es un colorante fluorescente,

-: L significa un engarce de estructura -(CH_{2})p o de estructura -(CH_{2})p-CO-NH-,

-: Z es CH o N,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: S es un grupo protector eliminable,

-: T es un material de soporte de fase sólida.

El engarce L posee con preferencia la estructura

-(CH_{2})p-CO-NH-,

en la que p es un número entero de 1 a 15.

Como material de soporte de fase sólida se emplean normalmente el vidrio poroso o las partículas de poliestireno que tengan un tamaño de poro definido. El grupo protector eliminable S es habitualmente el dimetoxitritilo (DMT), el pixilo o un grupo nitrobencilo eliminable fotoquímicamente, por ejemplo el NPEOC (Tetrahedron 53, p. 4247-4264, 1997).

Para numerosas aplicaciones potenciales de la invención se proporciona el soporte reactivo con un colorante fluorescente, por ejemplo la fluoresceína, en calidad de marcador detectable. Si el fluoróforo contiene grupos reactivos, tales como grupos hidroxi en el caso de la fluoresceína, estos grupos hidroxi tendrán que protegerse con el fin de impedir una reacción no deseada con las fosforamiditas durante la síntesis de los oligonucleótidos. El pivaloílo es por ejemplo un grupo protector idóneo, porque puede eliminarse en condiciones estándar una vez finalizada la síntesis de oligonucleótidos.

Otro objeto de la invención es el uso de una molécula que tenga la estructura

M-NH-CO-(CH_{2})p-COOH

en la que p significa un número entero entre 1 y 15 y M significa un marcador detectable, para obtener un soporte reactivo según la invención.

Esta síntesis de lleva a cabo con preferencia por un proceso que consiste en los pasos siguientes:

a) preparar un espaciador trifuncional que contenga dos grupos hidroxilo reactivos y un grupo amino reactivo,

b) introducir un grupo protector, por ejemplo el DMT, sobre un grupo hidroxilo,

c) convertir el grupo ácido carboxílico de la molécula recién descrita en un éster activado, con preferencia un éster de N-hidroxisuccinimida,

d) hace reaccionar el éster activo con el grupo amino reactivo del espaciador trifuncional,

e) unir el grupo hidroxilo del espaciador trifuncional que queda libre con el material soporte.

Como alternativa, el soporte reactivo según la invención puede obtenerse empleando un espaciador trifuncional que tenga la estructura siguiente:

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en la que L indica un engarce que tiene la estructura

-(CH_{2})p-

o la estructura

-(CH_{2})p-CO-NH-

y p es un número entero entre 1 y 15.

Semejante proceso consta con preferencia de los pasos siguientes:

a) preparar un espaciador trifuncional descrito,

b) introducir un grupo protector sobre un grupo hidroxilo,

c) convertir el grupo ácido carboxílico del espaciador trifuncional para formar un éster activado,

d) hace reaccionar el éster activo con el grupo amino libre de la molécula detectable,

e) unir el grupo hidroxilo que todavía está libre con el material soporte.

Otro objeto de la invención es el uso de un soporte reactivo según la invención para sintetizar ácidos nucleicos marcados en su extremo 3', por ejemplo (desoxi)oligonucleótidos y moléculas de ácido nucleico marcadas en su extremo 3', que se sintetizan mediante un soporte según la invención y por consiguiente tienen una nueva estructura química en su extremo 3'. Esto se refiere en especial a moléculas de ácido nucleico que tienen un sustituyente en la posición 3' de la ribosa terminal 3', que tiene la subestructura

-CH_{2}-CO-NH-M

en la que M es un colorante fluorescente.

La invención se refiere también a fosforamiditas que poseen la estructura

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en la que

-: M es un colorante fluorescente,

-: L significa un engarce de estructura -(CH_{2})p- o de estructura -(CH_{2})p-CO-NH-,

-: Z es CH o N,

-: S es un grupo protector eliminable,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: O-K es una fosforamidita.

En este contexto, el término "fosforamidita" incluye a todos los compuestos conocidos como fosforamiditas por los expertos en la materia (Beaucage, Methods in Molecular Biology, coordinador: S. Agrawal, vol. 20, p. 33-61, 1993).

El marcador es con preferencia un colorante fluorescente, por ejemplo la fluoresceína, que está dotado opcionalmente de grupos protectores.

La presente invención se refiere además al uso de fosforamiditas según la invención para sintetizar ácidos nucleicos marcados. Los ácidos nucleicos mediante estas fosforamiditas son también objeto de la presente invención. Semejantes moléculas contienen un sustituyente que tiene el elemento estructural -CH_{2}-CO-NH-M, en el que M significa el marcador detectable, por ejemplo un colorante fluorescente. En una forma preferida de ejecución, el sustituyente está unido mediante un enlace covalente a la posición 5' de la ribosa terminal 5' del ácido nucleico marcado.

Descripción detallada de la invención

Dentro del alcance de la presente invención, algunos de los términos empleados tienen los significados siguientes:

Grupo reactivo significa grupos de una molécula, que son capaces de reaccionar con otro molécula en condiciones idóneas para formar un enlace covalente. Son ejemplos de grupos reactivos los grupos hidroxilo, los grupos amino y los grupos ácido carboxílico.

Grupo protector indica moléculas que reaccionan con uno o varios grupos reactivos de una molécula de tal manera que en una reacción multipaso de síntesis solamente pueda reaccionar un grupo reactivo no protegido con el reactivo recién introducido. Los ejemplos de grupos protectores empleados con frecuencia son el dimetoxitritilo (DMT), que se emplea con preferencia para proteger grupos hidroxilo y el Fmoc, que se emplea con preferencia para proteger grupos amino.

Los espaciadores trifuncionales son moléculas que tienen un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno central y constan de tres cadenas laterales que están compuestos esencialmente de átomos de carbono y cada una de ellas tiene un grupo reactivo en su extremo.

Un material soporte de fase sólida indica sustancias poliméricas que forman una fase sólida que contiene un grupo reactivo, sobre el que pueden inmovilizarse otras moléculas. En el caso de la síntesis de oligonucleótidos, estos soportes son habitualmente esferillas de vidrio poroso que tienen un tamaño de poro definido (CPG). Como alternativa pueden utilizarse también resinas de poliestireno y de otros polímeros y copolímeros orgánicos (J. Indian Chem. Soc. 75, 206-218, 1998). Si el oligonucleótido tiene que permanecer inmovilizado sobre el sustrato después de la síntesis, entonces podrán utilizarse también vidrio o virutas semiconductoras como material soporte de fase sólida.

Se entiende por soporte reactivo marcado un material de soporte de fase sólida sobre el que se inmoviliza otro compuesto que contiene un marcador detectable y un grupo reactivo todavía sin proteger.

Los engarces preferidos son las cadenas carbonadas que tienen una longitud de 1-15 átomos de C. Estas cadenas de engarce pueden tener además uno o varios átomos de nitrógeno. Por otro lado, los engarces pueden contener también una o varias unidades etilenglicol.

Un marcador detectable es una sustancia que puede detectarse mediante métodos analíticos. Estos marcadores pueden ser por ejemplo sustancias que se detectan mediante espectroscopía de masas; ensayos inmunológicos o por resonancia magnética nuclear (RMN). Se entiende que los marcadores detectables concretos incluyen a los colorantes fluorescentes, por ejemplo las fluoresceínas o las rodaminas.

Se entiende por fosforamiditas las moléculas que tienen un átomo de fósforo trivalente, que puede unirse al extremo 5' terminal de un nucleósido o derivado de nucleósido. De este modo, las fosforamiditas pueden utilizarse para sintetizar oligonucleótidos. Además, las fosforamiditas de (desoxi)-ribonucleótidos, que se emplean para prolongar la cadena, existen otras fosforamiditas derivatizadas con un marcador, que pueden utilizarse en procesos similares para marcar el oligonucleótido durante o al término de la síntesis de oligonucleótidos (Beaucage, Methods in Molecular Biology, coordinador: S. Agrawal, vol. 20, p. 33-61, 1993), (Synlett 10, 1667-1678, 1999).

En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleótido" abarca no solo los (desoxi)-oligo-ribonucleótidos sino también todos los derivados de DNA y RNA, por ejemplo los metilfosfonatos, fosfotioatos o derivados de 2'-O-alquilo y análogos de DNA, por ejemplo el LNA, HNA (18, p. 1365-1370, 1999) y ácidos nucleicos o derivados de los mismos, que contienen además bases modificadas, por ejemplo 7-desazapurinas, así como quimeras que contienen diferentes tipos de ácidos nucleicos y análogos de los mismos.

En el pasado, un suporte reactivo marcado que tiene la estructura

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ha demostrado ser especialmente idóneo para las síntesis de oligonucleótidos. En este contexto, L significa un engarce (linker). Según el estado de la técnica, este engarce contiene un enlace amida, que une directamente el átomo de carbono con el marcador.

T indica un material soporte de fase sólida, con preferencia un CPG que sea producto comercial (p.ej. Proligo, CPG Inc.). La superficie de dichos materiales soporte comerciales está modificada con grupos amino.

El soporte T puede unirse al resto de la molécula mediante un grupo de unión V que contiene un enlace eliminable. Los grupos de unión que contienen enlaces eliminables están comprendidos dentro del alcance de la presente invención en su condición de grupos situados entre el espaciador trifuncional y el material soporte de fase sólida que puede eliminarse mediante una simple reacción química. Estos pueden ser grupos succinilo u oxalilo u otros grupos de enlace que contengan un enlace éster eliminable. Otros grupos de enlace son también conocidos de los expertos en la materia (J. Indian Chem. Soc. 75, 206-218, 1998).

Estos grupos de enlace son esenciales para la aplicación del material soporte para la síntesis de oligonucleótidos que se pretende que estén presentes en solución acuosa una vez finalizada la síntesis. A diferencia del caso, en el que el oligonucleótido debe permanecer en la superficie del material soporte después de la síntesis, cuando se obtiene por ejemplo una serie de ácidos nucleicos (US 5,624,711, Nucl. Acids Res. vol. 25, p. 1155-1161, 1997), un grupo de enlace eliminable es innecesario y se prefiere un grupo de enlace no eliminable.

El material soporte se une mediante una cadena carbonada que tiene de 1 a 15 átomos de carbono al átomo trifuncional central Z, que es con preferencia carbono o, como alternativa, nitrógeno. Sobre este átomo central de carbono se coloca otra cadena carbonada que contiene de 1 a 15 átomos de C y en cuyo extremo está presente un grupo protector S eliminable, por ejemplo el DMT. Este grupo protector puede eliminarse por tratamiento con un ácido débil antes de iniciar la síntesis del oligonucleótido. A continuación los derivados 3'-fosforamidita de (desoxi)-ribonucleósidos pueden unirse al grupo reactivo liberado.

El marcador detectable M es con preferencia un colorante fluorescente. Si dichos marcadores contienen grupos reactivos, que pudieran interferir en la síntesis oligonucleótido, entonces el colorante fluorescente se dota de un grupo protector ya conocido de los expertos en la materia, con el fin de impedir reacciones inespecíficas durante el curso de la síntesis del oligonucleótido. Los colorantes fluorescentes del tipo fluoresceína pueden protegerse eficazmente con el pivaloílo.

El marcador detectable se une habitualmente al átomo central mediante un engarce especial. Este engarce tiene la siguiente estructura característica según la invención

M-NH-CO-(CH_{2})p-Z

o

M-NH-CO-(CH_{2})p-CO-NH-Z

en las que p es un número entero entre 1 y 15.

En otras palabras, estos significa que la orientación del enlace amida entre el marcador M y el engarce L o el átomo central M se invierte con respecto a los compuestos conocidos de la técnica anterior.

Por ello, la estructura parcial

M-NH-CO-

es característica de la estructura del engarce de la invención.

Esto asegura que el efecto aceptor de electrones del enlace amida indicado es sustancialmente menor que el de la estructura

M-CO-NH-

ya conocida de la técnica anterior.

Esto tiene la ventaja de que, por ejemplo, en el caso de un marcador de tipo colorante fluorescente, las propiedades espectrales del colorante fluorescente conjugado según la invención son casi idénticas a las propiedades espectrales de un colorante conjugado por el método de la tiourea, debido a la orientación del enlace amida. Sin embargo, en comparación con la unión de tipo tiourea, la estructura del engarce según la invención conduce a un compuesto mucho más estable, que continúa siendo estable durante la síntesis del oligonucleótido.

El soporte reactivo marcado según la invención puede sintetizarse básicamente por dos métodos diferentes. En una primera forma de ejecución se hace reaccionar un espaciador trifuncional reactivo, que contiene dos grupos hidroxilo reactivos y un grupo amino reactivo, con un grupo ácido carboxílico activado con NHS de un marcador detectable. En un método alternativo, se convierte en primer lugar un espaciador trifuncional, que contiene un grupo ácido carboxílico reactivo, en un éster activado y después se hace reaccionar con un grupo amino reactivo de una molécula
detectable.

Ambos métodos forman parte de la presente invención y por ello se describe con mayor detalle a continuación. En general se emplean métodos de obtención de química orgánica, que conocen todos los expertos en la materia, para efectuar los pasos individuales de la síntesis. Estos métodos establecidos constituyen únicamente ejemplos de alternativas y, con ellos, no se pretende limitar el alcance de la presente invención.

a) Preparación de un soporte según la invención partiendo de un espaciador trifuncional que contiene un grupo amino reactivo

Puede utilizarse por ejemplo el serinol como espaciador que es un producto comercial y contiene un átomo de carbono central y un átomo de nitrógeno libre. Un espaciador trifuncional que contiene un átomo de nitrógeno central puede obtenerse a partir de compuestos comerciales del tipo 2-hidroxietilhidrazina y oxirano.

En un primer paso del proceso se introduce un grupo protector sobre uno de los grupos hidroxilo reactivos del espaciador trifuncional, de modo que esta cadena lateral no pueda reaccionar con otros reactivos durante los pasos posteriores de la síntesis. Habitualmente se introduce el dimetoxitritilo (DMT) como grupo protector aplicando métodos ya conocidos (J. Am. Chem. Soc. 85, 3821, 1963). Una vea finalizada la reacción, estas moléculas, que solamente tiene un grupo protector, mediante cromatografía de columna, método ya conocido de los expertos en la materia.

Las sustancias marcadoras detectables M, que tienen un grupo amino terminal libre, pueden convertirse mediante métodos orgánicos de síntesis, que también conocen los expertos en la materia, por reacción con un ácido dicarboxílico activado apropiado, por ejemplo un anhídrido de ácido dicarboxílico, en una molécula que tenga la estructura

M-NH-CO-(CH_{2})p-COOH

al tiempo que se produce un enlace amida, en el que la longitud p de la cadena de CH_{2} es por lo menos de 1 y como máximo de 15. Semejantes compuestos que tienen un resto ácido carboxílico pueden convertirse en condiciones que los expertos ya conocen en un éster de N-hidroxisuccinimida por reacción con la N-hidroxisuccinimida. En concreto, las moléculas de colorantes fluorescentes pueden convertirse de esta manera en los correspondientes derivados éster de NHS. Si el grupo marcador M contiene grupos reactivos libres, por ejemplo grupos hidroxi, estos tendrán que dotarse previamente de los grupos protectores apropiados, ya conocidos de los expertos en la
materia.

En otro paso de la reacción, el éster de NHS marcado se une al grupo amino libre del espaciador trifuncional aplicando métodos estándar. A continuación se inmoviliza el grupo hidroxilo del espaciador trifuncional, que todavía queda libre, por métodos convencionales, por ejemplo habitualmente el CPG. Para este fin se emplea un material soporte derivatizado que tiene un grupo reactivo, por ejemplo un grupo hidroxilo, amino, tiol o carboxilo.

Después de la inmovilización de los grupos reactivos del material soporte, que todavía quedan libres, tienen que desactivarse por reacciones llamadas de bloqueo, que los expertos en la materia ya conocen (Pon R.T., en: Methods in Molecular Biology, vol. 20, coordinador: S. Agrawal, editorial Humana Press Inc., Nueva Jersey, cap. 19, pp. 481-482, 1993). Por ello, los grupos amino por ejemplo que todavía quedan libres se desactivan mediante una reacción de acilación.

De este modo, un compuesto inmovilizado que tenga el elemento estructural

M-NH-CO-(CH_{2})p-

se genera por el método de la invención y puede utilizarse en especial para la síntesis de ácidos nucleicos marcados en su extremo 3' como resultado de dichas propiedades ventajosas.

b) Preparación de un soporte según la invención partiendo de un espaciador trifuncional que contiene un grupo ácido carboxílico reactivo

Partiendo de un espaciador trifuncional convencional, que contiene dos grupos hidroxilo libres y un grupo amino libre de la estructura general

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se prepara en primer lugar por reacción con un ácido dicarboxílico aplicando métodos convencionales al tiempo que se genera el enlace amida, en el que

Z significa CH o N y

L significa un engarce que tiene la estructura -(CH_{2})p- o la estructura -(CH_{2})p-CO-NH- y al mismo tiempo m, n, y p con independencia entre sí son números enteros comprendidos entre 1 y 15.

Es preferido un compuesto que tiene la estructura siguiente:

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en la que m, n y p con independencia entre sí son números enteros comprendidos entre 1 y 15.

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En una manera preferida se puede partir de un espaciador que tenga un átomo central de nitrógeno:

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m, n y p en este caso también con independencia entre sí son números enteros comprendidos entre 2 y 15. Son particularmente ventajosas las moléculas del tipo bicina, producto comercial, en la que n y m = 2. La razón estriba en que es especialmente ventajoso para la estabilidad de tales compuestos que haya por lo menos dos átomos de C entre el átomo central de N y los dos grupos hidroxilo terminales.

Después se introduce el DMT sobre uno de los grupos hidroxilo reactivos, de modo que este grupo protegido no pueda reaccionar con otros reactivos introducido en la reacción en los pasos ulteriores de la síntesis. Una vez finalizada la síntesis se aíslan las moléculas que solo tienen un grupo protector por métodos de cromatografía de columna preparativa, ya conocidos de los expertos en la materia.

A continuación se activa el grupo ácido carboxílico que todavía está libre en condiciones, que los expertos en la materia ya conocen. Ha dado buenos resultados en particular la activación que emplea trifosgeno y DMF.

En otro paso se une al espaciador trifuncional una molécula detectable, que contiene un grupo amino reactivo, por ejemplo una molécula de colorante fluorescente. De esta manera se forma un espaciador trifuncional en el que, tal como se ha descrito en el apartado a), se protege un grupo hidroxilo con un dimetoxi-tritilo, el átomo central se une al grupo marcador mediante un engarce y que contiene un grupo hidroxi libre.

Finalmente se inmoviliza el grupo hidroxilo que todavía permanece libre en el espaciador trifuncional del material soporte, que es habitualmente CPG, por métodos estándar, de modo similar al proceso descrito en el apartado a). Una vez más, los grupos reactivos del material soporte que todavía quedan libres tienen que desactivar después de la inmovilización por una reacción llamada de bloqueo, ya conocida de los expertos en la materia.

En una forma de ejecución alternativa de la presente invención, el reactivo marcador puede ser un fosforamidita no nucleósida.

De manera similar al proceso de la invención para preparación de soportes reactivos se prepara en un primer paso un producto intermedio de la siguiente fórmula general:

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en la que M es un colorante fluorescente y Z es CH o N; S indica un grupo protector eliminable, L indica un engarce que tiene la estructura -(CH_{2})p- o la estructura -(CH_{2})p-CO-NH- y n, m y p con independencia entre sí indican números enteros de 1 a 15.

En esta forma de ejecución, el grupo protector S es con preferencia el dimetoxitritilo. Es igualmente ventajoso que los grupos reactivos, que pueden estar presentes en el marcador, estén también dotados de grupos protectores.

A continuación pueden convertirse estos compuestos previos en un segundo paso y por métodos ya conocidos en una fosforamidita según la invención mediante la reacción del grupo hidroxilo que todavía queda libre (p.ej. B. Meyer R.B., en: Methods in Mol. Biol., vol. 26, coordinador: S. Agrawal, editorial Humana Press Inc., capítulo 2, p. 80, 1994).

Estas fosforamiditas de la invención pueden utilizarse para marcar ácidos nucleicos y en particular para marcar oligonucleótidos. El marcador puede introducirse en el extremo 5', en el extremo 3' o internamente, en un sitio llamado "abásico" del oligonucleótido.

En el caso del marcador en 5' de la posición 5' de la ribosa del nucleótido 5'-terminal, la incorporación se efectúa por métodos convencionales al término de la síntesis del oligonucleótido (Beaucage, Methods in Molecular Biology, coordinador: S. Agrawal, vol. 20, p. 33-61, 1993). A continuación se elimina el grupo protector restante -normalmente el DMT-. De este modo se obtienen oligonucleótidos que tienen un sustituyente que contiene el elemento estructural -CH_{2}-CO-NH-M en la posición 5' de la ribosa 5'-terminal.

Una vez eliminado el grupo protector introducido por la fosforamidita puede efectuarse una prolongación de la cadena en la dirección 3'-5' sobre el grupo hidroxilo libre como parte de la síntesis clásica de oligonucleótidos. De esta manera se forma una molécula de ácido nucleico marcada internamente, que contiene un sitio interno llamado "abásico".

El marcado del extremo 3' se realiza con arreglo al principio siguiente: como soporte se emplea una 3'-fosfato-CPG que es un producto comercial (p.ej. Glenn Research). En el primer ciclo de la síntesis se emplea una fosforamidita según la invención. Dado que contiene un grupo hidroxilo tritilado adicional, la síntesis estándar de oligonucleótidos puede iniciarse, una vez eliminado el grupo protector DMT, por el grupo hidroxilo que ahora está libre. Una vez separados del soporte, se obtienen oligonucleótidos que tienen un sustituyente que contiene un elemento estructural -CH_{2}-CO-NH-M en la posición 3' de la ribosa 3'-terminal.

La invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes.

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Ejemplo 1

Obtención del éster NHS de la dipivaloilfluoresceína A) Dipivaloilnitrofluoresceína

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Se añaden por goteo 8 ml (65 mmoles) de cloruro de pivaloílo (Merck 801276) a una suspensión de 5 g (13 mmoles) de 4-nitro-fluoresceína (TCI 199) en una mezcla de 100 ml de diclorometano, 8 ml de piridina y 6 ml de dimetilformamida al tiempo que se enfría con hielo. A continuación se agita la solución amarilla transparente resultante a temperatura ambiente durante 2,5 h. En este proceso se forma un precipitado blanco (clorhidrato de piridinio), que se separa por filtración. Se añaden al líquido filtrado 20 ml de diclorometano y 50 ml de agua, que se había transferido a un embudo de decantación. Se separa la fase orgánica y se lava una vez con 50 ml de agua. Se seca la fase orgánica separada con sulfato sódico y se concentra a sequedad con vacío en un evaporador rotatorio. Se recristaliza el residuo resultante en 100 ml de éter de diisopropilo (rendimiento: 6,5 g).

B) Dipivaloilaminofluoresceína

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Se disuelven 6,5 g (11,9 mmoles) de dipivaloilnitrofluoresceína en 100 ml de dioxano. Después se les añaden 650 mg de paladio sobre carbón activo (Merck 807104) disueltos en 20 ml de etanol y se pasa una corriente de hidrógeno durante 2,5 h con agitación. Después se filtra la mezcla a través de un doble filtro (filtro redondo + capas de filtro Seitz) y seguidamente se concentra a sequedad en un evaporador rotatorio con vacío. Se separa el residuo a través de una columna de gel de sílice 60 (diámetro = 8,5 cm, altura = 30 cm). Como disolvente móvil se emplea una mezcla 2/1 (v/v) de acetato de etilo/hexano (rendimiento: 3,0 g).

C) Dipivaloil-4-aminoglutarilfluoresceína

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12

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Se mantiene en ebullición a reflujo durante 4 horas una mezcla de 2,6 g (5 mmoles) de dipivaloilaminofluoresceína, 2,3 g (20 mmoles) de anhídrido glutárico, 123 mg (1 mmol) de dimetilaminopiridina (Fluka 39405) y 1,4 ml (10 mmoles) de trietilamina en 75 ml de cloroformo. Después de enfriar a temperatura ambiente se añaden 50 ml de agua y se agita durante 15 min más. Se separa la fase orgánica en un embudo de decantación y se lava dos veces con 50 ml de agua cada vez. Después de secar con sulfato sódico se concentra a sequedad con vacío en un evaporador
rotatorio.

Se separa el residuo en una columna de gel de sílice 60 (diámetro = 8,5 cm, altura = 30 cm). Como disolvente móvil se emplea una mezcla de tolueno/acetato de etilo/metanol en proporción 4/1/2 (v/v/v) (rendimiento:
3,0 g).

D) Éster NHS de la dipivaloil-4-aminoglutarilfluoresceína

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13

\vskip1.000000\baselineskip

En atmósfera de argón se añaden 1,4 g (12,2 mmoles) de la N-hidroxisuccinimida a una solución de 2,6 g (4,1 mmoles) de la dipivaloil-4-aminoglutarilfluoresceína en 250 ml de diclorometano seco (4,1 mmoles). A continuación se añaden 1,93 ml (14,0 mmoles) de isocianuro de morfolino-etilo (14,0 mmoles) y se agita a temperatura ambiente durante 18 h. Se elimina el disolvente por destilación en un evaporador rotatorio con vacío. Al residuo se le añade una mezcla de 600 ml de acetato de etilo y 100 ml de éter de dietilo. Se lava la solución orgánica en un embudo de decantación 3 veces, con 150 ml de HCl 0,2 N cada vez y después una vez con 150 ml de una solución saturada de cloruro sódico. Se separa la fase orgánica y se seca con sulfato sódico. Después de la filtración se elimina el disolvente por destilación con vacío en un evaporador rotatorio. Se seca el residuo con alto vacío durante 0,5 h (rendimiento: 2,7 g).

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Ejemplo 2

Obtención de un compuesto DMT-Fmoc como espaciador trifuncional A) N-Fmoc-1,3-dihidroxi-2-aminopropano

14

Se disuelven 21,6 g de Fmoc - NHS (Novabiochem, 01-63-001) (64 mmoles) en 300 ml de dioxano y se mezclan sucesivamente con serinol (Aldrich 35,7898) (60 mmoles), 200 ml de agua (VE) y 6,8 g de hidrogenocarbonato sódico (80 mmoles). Después se agita la mezcla a temperatura ambiente durante una noche. Al día siguiente se separa el precipitado resultante por filtración.

Se añaden 1,2 l de agua y 50 ml de una solución saturada de NaCl al líquido filtrado para precipitar el producto. Se filtra con succión el líquido sobrenadante a través de una frita de vidrio, se seca el producto durante una noche en un desecador con cloruro cálcico. Seguidamente se separa en una columna de gel de sílice 60 (diámetro = 8,5 cm, altura = 30 cm). Como disolvente móvil se emplea una mezcla de acetato de etilo/metanol en una relación volumétrica de 5/1 (rendimiento: 12,35 g).

B) N-Fmoc-1-dimetoxitritiloxi-3-hidroxi-2-aminopropano

15

En atmósfera de argón se añade una solución de 13,85 g (41 mmoles) de cloruro de dimetoxitritilo en 55 ml de piridina seca a una solución de 12,19 g (38,9 mmoles) de N-Fmoc-1,3-dihidroxi-2-aminopropano en 60 ml de piridina seca y se agita a temperatura ambiente durante una noche. A continuación se elimina el disolvente con vacío en un evaporador rotatorio, se disuelve el residuo en 500 ml de acetato de etilo y se extrae una vez con 250 ml de agua/250 ml de una solución saturada de NaCl. Se separa la fase orgánica y se seca con sulfato sódico. Después de la filtración se elimina el disolvente por destilación con vacío en un evaporador rotatorio.

A continuación se separa a través de gel de sílice. Como disolvente móvil se emplea una mezcla de tolueno/acetato de etilo/metanol en proporción 4/1/0,5 (v/v/v) a la que se ha añadido un 0,1% (v) de trietilamina (rendimiento: 15 g).

C) 1-dimetoxitritiloxi-3-hidroxi-2-aminopropano

16

Se disuelven 14 g (22,7 mmoles) de N-Fmoc-1-dimetoxitritiloxi-3-hidroxi-2-aminopropano en 200 ml de acetato de etilo y después se les añaden con agitación 200 ml de piperidina. Se agita durante una noche a temperatura ambiente y se concentra a sequedad con vacío en un evaporador rotatorio. Se separa el residuo a través de gel de sílice. Disolvente móvil: tolueno/acetato de etilo/metanol en una proporción de 4/1/0,5 al que se ha añadido un 0,1% (v) de trietilamina (rendimiento: 6,0 g).

Ejemplo 3

Obtención de una fluoresceína-CPG según la invención A) Reacción del éster NHS de la glutarilamino-bispivaloilfluoresceína que contiene al 1-dimetoxitritiloxi-3-hidroxi-2-amino-propano

17

(Obtención del espaciador trifuncional de la invención sustituido por fluoresceína y DMT).

Se agitan durante una noche 2,7 g (3,7 mmoles) del éster NHS de la glutarilamino-bispivaloilfluoresceína y 2,0 g (5,09 mmoles) de 1-dimetoxitritiloxi-3-hidroxi-2-aminopropano en 2,5 ml de piridina al tiempo que se impide la entrada de humedad. A continuación se elimina el disolvente por destilación con vacío en un evaporador rotatorio. Se separa el residuo a través de gel de sílice 60. Como disolvente móvil se emplea una mezcla de acetato de etilo/metanol en una proporción de 8/1 (v/v) a la que se ha añadido un 0,1% (v) de trietilamina. Rendimiento: 2,4 g (CCF: gel de sílice 60 Merck 105735; tolueno/acetato de etilo/metanol, 4/1/1; Rf = 0,45).

B) Succinilación

(Obtención un espaciador trifuncional sustituido con fluoresceína, DMT y un grupo carboxilo reactivo).

18

En atmósfera de argón se agita a temperatura ambiente durante una noche una mezcla de 2,33 g (2,3 mmoles) del producto del paso A, 0,49 g (5 mmoles) de anhídrido succínico, 61,5 mg (0,5 mmoles) de DMAP y 30,5 ml de piridina seca. A continuación se elimina el disolvente con vacío en un evaporador rotatorio. Se separa el residuo a través de gel de sílice 60. Se emplea como disolvente móvil una mezcla de tolueno/acetato de etilo/metanol en una proporción de 4/1/1 (v/v/v) a la que se ha añadido un 0,1% (v) de trietilamina (rendimiento: 2,2 g). (CCF: gel de sílice 60, Merck 105735; tolueno/acetato de etilo/metanol, 4/1/1; Rf = 0,42).

C) Obtención de la fluoresceína-CPG que tiene la estructura

(obtención de una fluoresceína-CPG según la invención)

19

En un matraz de fondo redondo de 500 ml se agita en atmósfera de argón una suspensión de 2,2 g (2,0 mmoles) del succinato del paso B), 2,0 g (10,4 mmoles) del clorhidrato de la N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC) y 200 mg (1,64 mmoles) de DMAP en una mezcla de 80 ml de DMF seca y 44 ml de piridina seca hasta que se disuelve la totalidad del EDC. Después se añaden 28 g del Icaa - CPG 500 A (CPG-Inc.). Después se agita suavemente la suspensión a temperatura ambiente durante 16 h al tiempo que se impide la entrada de humedad.

Después se filtra con vacío a través de una frita de vidrio D3, se lava el residuo sucesivamente con 220 ml de DMF, 220 ml de THF y 150 ml de éter y después se seca con vacío.

Para el bloqueo, en un matraz de 500 ml se añaden 80 ml de piridina y 22 ml de anhídrido acético al CPG y se agita suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h.

Después se filtra con vacío a través de una frita de vidrio D3 y se lava el residuo sucesivamente con 440 ml de THF y 125 ml de éter. A continuación se seca el material CPG con alto vacío durante 4 h (rendimiento: 28,4 g).

D) Examen de la carga mediante la eliminación del tritilo

Se suspenden 4,37 mg del material CPG en 25 ml de reactivo de eliminación del DMT (Roth 2257.2) y se mide la absorbancia A a 498 nm (A = 0,51).

Epsilon_{498\ nm} DMT = 14300 (L*/mol*cm)

El cálculo es el siguiente:

14,3 (L*mmol^{-1}*cm^{-1}) *25 ml*A_{498\ nm}/peso (mg)= \mumol/g de CPG

14,3*25 ml* 0,514/4,37 mg = 42,05 \mumol/g de CPG

Ejemplo 4

Obtención de una fluoresceína-CPG según la invención A) Dimetoxitritil-bicina

20

Con agitación vigorosa se añade una solución de 3,38 g (10 mmoles) de cloruro de dimetoxitritilo disueltos en 50 ml de piridina a una mezcla de 200 ml de piridina y 6,56 g (40 mmoles) de bicina seca. Se agita a temperatura ambiente durante 18 horas al tiempo que se impide la entrada de la humedad. Después se elimina el disolvente por destilación con vacío en un evaporador rotatorio. Seguidamente se añaden 200 ml de acetato de etilo y se agita durante 10 min. Se filtra la suspensión con vacío. Se agita el residuo con 200 ml de acetato de etilo durante 10 min y después se vuelve a filtrar con vacío. Se reúnen los líquidos filtrados, se concentran a 30 ml con vacío en un evaporador rotatorio. Se añaden por goteo y con agitación 700 ml de hexano a la solución. Esto provoca la floculación del producto. Después se filtra con succión, se lava de nuevo con 200 ml de hexano y se seca con alto vacío (rendimiento: 1,1 g).

B) N-(2-hidroxietil)-N-(2-dimetoxitritiloxietil)-5-(2-amino-etilcarboxamido)-bispivaloilfluoresceína

21

En atmósfera de argón y con agitación se disuelven 0,52 g (1,75 mmoles) de carbonato de bistriclorometilo (trifosgeno) en 30 ml de THF seco. Después se añaden 0,370 ml de DMF enfriando con hielo y se agita a 0ºC durante una hora. Después de calentar a temperatura ambiente se añaden 2,20 ml de trietilamina y luego una mezcla de 2,33 g (5 mmoles) de dimetoxitritil-bicina y 2,60 g (5 mmoles) de dipivaloil-(4'-amino)-fluoresceína disueltos en 20 ml de THF y se agita a temperatura ambiente durante 16 horas.

A continuación se elimina el disolvente por destilación con vacío en un evaporador rotatorio. Se separa el residuo a través de gel de sílice 60. Como disolvente móvil se emplea una mezcla de tolueno/acetato de etilo/metanol en proporción 4/1/1 (v/v/v) a la que se ha añadido un 0,1% de trietilamina (rendimiento: 0,6 g).

La succinilación y la reacción con el soporte de CPG se realizan del modo descrito en el ejemplo 3.

Ejemplo 5

Síntesis y purificación un oligonucleótido 27mer marcado con fluoresceína en el extremo 3'

Se efectúa la síntesis en un sintetizador automático de DNA (Applied Biosystems, modelo ABI 392-08). La escala para la síntesis es de 1 \mumol: para ello se introducen en una columna vacía de síntesis (Glenn Research) 24 mg del material fluoresceína-CPG del ejemplo 3 y se monta la columna en una posición apropiada en el sintetizador. Para la síntesis se emplean 3'-fosforamiditas estándar ([(MeO)_{2}Tr]ib^{2}G_{d}, [(MeO)_{2}Tr]bz^{6}A_{d}, [(MeO)_{2}Tr]bz^{4}C_{d}, [(MeO_{2}Tr]T_{d}).

Para la síntesis del oligómero se sigue la norma habitual de las fosforamidita para el sintetizador de DNA con el modo tritilo desactivado (off). Se rompe el oligonucleótido o se desprotege con NH_{3} al 25% en H_{2}O (8 h a 55ºC). Para la purificación se realiza una cromatografía de intercambio iónico en MonoQ (columna de 5,0 x 50 mm suministrada por Amersham Pharmacia Biotech) (A: 10 mM hidróxido sódico/agua B: 1 M cloruro sódico en 10 mM hidróxido sódico/agua, caudal: 1 ml/min del 0% de B al 100% de B en 30 min). Por diálisis o por filtración a través de gel se desaliniza el oligómero marcado y se liofiliza.

En la figura 1 se representa un cromatograma HPLC. Las condiciones de la HPLC son las siguientes: columna: RP18 Bischoff Hypersil ODS 5 \mu NC (250 x 4,6 mm) pieza 25461805, tampón A: 0,1 M acetato de trietilamonio, pH = 6,8; tampón B: 1 l de A + 1 l de acetonitrilo, gradiente: 2 min, desde un 0% de B al 100% de B en 23 min, 100% de B durante 8 min, caudal: 1 ml/min. Detección a 260 nm.

En la figura 2 se representa un espectro EM de MALDI (Voyager DE, PerSeptive Biosystems, matriz: ácido 3-hidroxipicolínico). El pico de m/z = 8798,2 corresponde a la masa del oligonucleótido, el pico de m/z = 10598,2 es el patrón interno.

Ambas figuras ponen de manifiesto que puede sintetizarse con gran pureza un oligonucleótido marcado en el extremo 3' de la invención.

Breve descripción de las figuras:

Figura 1

Cromatograma HPLC de un oligonucleótido sintetizado con arreglo a la invención con un marcador fluoresceína en el extremo 3'.

Figura 2

Espectro de masas del mismo oligonucleótido sintetizado según la invención.

Claims

1. Reactivo marcador que tiene la estructura

22

en la que

-: M es un colorante fluorescente,

-: Z es CH o N,

-: S es un grupo protector eliminable,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: O-K es una fosforamidita.

2. Un soporte reactivo marcado que tiene la estructura:

23

en la que:

-: M es un colorante fluorescente,

-: Z es CH o N,

-: S es un grupo protector eliminable,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: T es un material de soporte de fase sólida y

-: V es un grupo de unión que contiene un enlace eliminable.

3. Soporte reivindicado en la reivindicación 2, caracterizado porque el material de soporte consta de partículas de vidrio que tienen un tamaño de poro definido.

4. Soporte reivindicado en la reivindicación 3, caracterizado porque el colorante fluorescente es una fluoresceína.

5. Proceso para la producción de un soporte reivindicado en las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque Z = N o CH y L = -(CH_{2})p-CO-NH-, que consta de los pasos siguientes:

b) introducir un grupo protector en un grupo hidroxilo,

c) convertir el grupo ácido carboxílico de un molécula

M-NH-CO-(CH_{2})p-COOH

en la que p significa un número entero entre 1 y 15 y M es un colorante fluorescente, en un éster activado,

6. Proceso para la producción de un soporte reivindicado en las reivindicaciones 2-4, que consta de los pasos siguientes:

a) preparar un espaciador trifuncional que tiene la estructura:

24

en la que

-: Z es CH o N,

-: L es un engarce que tiene la estructura -(CH_{2})p- o la estructura -(CH_{2})p-CO-NH- y

-: m, n y p son números enteros entre 1 y 15;

b) introducir un grupo protector sobre un grupo hidroxilo,

c) convertir el grupo ácido carboxílico del espaciador trifuncional en un éster activado,

d) unir una molécula fluorescente detectable, que contiene un grupo amino libre, por reacción del éster activo con el grupo amino libre de la molécula detectable,

e) unir el grupo hidroxilo que todavía está libre con el material soporte.

7. Uso de un soporte reivindicado en las reivindicaciones 2-4 para sintetizar ácidos nucleicos marcados en el extremo 3'.

8. Molécula de ácido nucleico marcado en el extremo 3', obtenida mediante un soporte reivindicado en las reivindicaciones 2-4, dicha molécula de ácido nucleico tiene la estructura

25

en la que

-: M es un colorante fluorescente,

-: Z es CH o N,

-: S es un ácido nucleico,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: K = H.

9. Reactivo marcador reivindicado en la reivindicación 1, caracterizado porque M es la fluoresceína.

10. Uso de un reactivo marcador reivindicado en las reivindicaciones 1 ó 9 para sintetizar ácidos nucleicos marcados, caracterizado porque durante la síntesis de los oligonucleótidos se sustituye una fosforamidita nucleósida estándar por una fosforamidita marcada con un fluoróforo reivindicada en las reivindicaciones 1 ó 9 durante el ciclo de síntesis.

11. Molécula de ácido nucleico marcado, obtenida mediante un reactivo marcador reivindicado en las reivindicaciones 1 ó 9, dicha molécula de ácido nucleico tiene la estructura:

26

en la que

-: M es un colorante fluorescente,

-: Z es CH o N,

-: S es H,

-: n, m y p con independencia entre sí son números enteros de 1 a 15,

-: O-K está unido a la posición 5' de una ribosa 5'-terminal.