DE19745708A1 - Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden mit spezifischen Sequenzen.

Synthetisch hergestellte, spezifische Oligonucleotide können z. B. als DNA- bzw. mRNA-Sonden, als Primer für PCR-Verfahren oder auch als sogenannte "Antisense"-Regulatoren für die Genexpression eingesetzt werden, um nur einige Anwendungszwecke zu nennen.

Ihr genereller Aufbau entspricht der in Fig. 1 angegebenen Formel, wobei B für eine der Basen Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, deren Analoga bzw. modifizierte Formen (z. B. durch Didesoxyribose, Fluoreszenzlabel, Histidin Tail) und R1 für H oder OH (auch in Verbindung mit Schutzgruppen) steht.

Bei der Herstellung von Oligonucleotidsequenzen werden schrittweise einzelne Monomere oder Nucleotidsequenzen über 3'5' oder 5'3' Phosphatverknüpfung zunächst mit z. B. einem trägergebundenen Startnucleosid und dann in weiteren Schritten mit der wachsenden bereits synthetisierten Sequenz verbunden.

Als Monomere können Nucleoside oder Nucleotide zum Einsatz kommen.

Durch Auswahl der in den einzelnen Schritten hinzugefügten Monomere, in Abhängigkeit von den z. B. jeweils gebundenen Basen -Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U) bzw. der Nucleotidsequenzen und durch Festlegung der Schrittanzahl kann man den Aufbau des gewünschten spezifischen Oligonucleotids steuern.

Die Synthese kann an einem Festphasenträger aber auch in Lösung erfolgen. Bevorzugt wird die Festphasensynthese, da hier die bei Synthese in Lösung erforderlichen zeitaufwendigen Reinigungsschritte durch einfache Spülvorgänge ersetzt werden können.

In der Regel werden für die Synthese Monomere eingesetzt, die im Hinblick auf die gewünschte Phosphatverknüpfung in der 3' Position eine aktivierbare Phosphorverbindung enthalten. Bevorzugt ist in diesem Zusammenhang die sogenannte Phosphitamidmethode, bei der säureaktivierbare Nucleosid-3- Phosphitesteramide kondensiert und anschließend zur Bildung einer stabilen Phosphorsäuretriesterbindung oxidiert werden.

Bei allen chemischen Synthesemethoden ist zu beachten, daß die eingesetzten Monomere bzw. Nucleotidsequenzen eine ganze Reihe reaktiver Zentren aufweisen. Um die Snythese auf die gewünschte Phosphatverknüpfung zu beschränken, ist es erforderlich, die reaktiven Zentren mit unterschiedlichen Schutzgruppen zu blockieren. So wird gängigerweise die 5'OH-Gruppe mit säurelabilen Tritylether- gruppen geschützt, während als Phosphatschutzgruppe z. B. eine mittels β- Eliminierung abspaltbare Cyanoethylgruppe vorgesehen sein kann. Die heterozyklischen Aminofunktionen der Basen Adenin, Guanin, Cytosin können dagegen mit basenlabilen Acylgruppen geschützt werden. Die Basen Thymin und Uracil weisen keine Aminofunktion auf, die geschützt werden müßte.

Zum Entschützen des fertigen Oligonucleotids können die Schutzgruppen nach Beendigung der Synthese durch entsprechende Behandlung mit Säure, Base bzw. β-Eliminierung abgespalten werden.

Wie oben erwähnt, werden als Aminoschutzgruppen durch Behandlung mit Basen abspaltbare Gruppen eingesetzt. Ebenfalls basenlabil sind die Esterbindungen, die bei der bevorzugt durchgeführten Festphasensynthese in aller Regel zur Verknüpfung des Oligonucleotids mit einem Träger dienen können. Während des Entschützens der Aminofunktionen kommt es daher bei herkömmlichen Verfahren parallel zu einer Abtrennung des Oligonucleotids von dem Träger, was in einigen Fällen, z. B. bei Verwendung der Oligonucleotidsequenzen als Sonde, unerwünscht sein kann.

Ein weiterer Nachteil ist, daß die Abspaltung der herkömmlichen Aminoschutzgruppen relativ zeitaufwendigt ist, und deswegen insbesondere die Herstellung größerer Oligonucleotidmengen langwierig und mit hohen Kosten verbunden ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen bereitzustellen, mit dem sich wunschweise entschützte, aber noch feststoffträgergebundene Oligonucleotidsequenzen in kurzer Zeit herstellen lassen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. Danach ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß als Schutzgruppe für mindestens eine der Aminofunktionen der als Synthesebausteine eingesetzten Nucleoside bzw. Nucleotidsequenzen eine Cyanoethoxycarbonylgruppe eingesetzt wird. Die erfindungsgemäß einsetzbare Schutzgruppe läßt sich im Wege der β-Eliminierung abspalten. Ihre Abspaltung kann daher unter Bedingungen erfolgen, die die Bindung des Oligonucleotids an einem eventuellen Träger nicht berühren.

Die Verwendung der Cyanoethylgruppe als Schutzgruppe ist bereits bekannt. Allerdings wurde sie bislang nur als β-eliminierbare Phosphatschutzgruppe eingesetzt. Die Verwendung als Aminoschutzgruppe ist für die erfindungsgemäß eingesetzte Gruppe bislang nicht bekannt bzw. beschrieben.

In den Beispielen 1 und 2 ist die Herstellung einer geeigneten Cyanoethoxycarbonylgruppe beschrieben.

Beim erfindungsgemäßen und auch bei herkömmlichen Verfahren werden Monomere bzw. seltener auch kurze Nucleotidsequenzen schrittweise miteinander zum gewünschten Oligonucleotid verknüpft. Üblicherweise arbeiten Syntheseverfahren mit Vorratsbehältern, die jeweils unterschiedliche Monomeren enthalten, in aller Regel vier Vorratsbehälter, in denen jeweils Monomere mit einer der Basen A, T, G oder C enthalten sind. In jedem Syntheseschritt werden Monomere aus einem der Vorratsbehälter an die wachsenden Ketten synthetisiert. Man erhält so mehrere synchron wachsende Oligonucleotide mit übereinstimmenden Sequenzen.

Der Begriff Monomere ist weit auszulegen. Es fallen darunter alle Einzelbausteine, Nucleoside bzw. Nucleotide, die im Rahmen einer Kondensationsreaktion und gegebenenfalls späteren Oxydation eine Nucleotidsequenz aufbauen können.

In jüngster Zeit hat sich neben den klassischen Phosphordiester- und Phosphortriestermethode insbesondere die Phosphitamidmethode durchgesetzt. Danach ist vorgesehen, daß Nucleosid 3-Phosphitamide als Synthesebaustein zum Einsatz kommen. Nucleosid 3-Phosphitamide (oder auch 2'Desoxyribonucleosid 3-Phosphitamide) weisen eine hohe Labilität gegen Hydrolyse und Luftoxydation auf. Ihr Hauptvorteil ist jedoch, daß sie nahezu nebenreaktionsfrei durch Säure z. B. Tetrazol aktivierbar sind. Fig. 2 erläutert die Phosphitamidmethode, wobei (a) die Herstellung des Desoxyribonucleosid 3-Phosphitamids, (b) die durch Tetrazol aktivierte Kondensation eines Phosphitamids mit dem 5'-Ende eines Nucleosids und (c) die Oxidation zum stabilen Phosphortriester zeigt.

Von den fertigen Oligonucleotiden müssen wie oben erwähnt dann noch die unterschiedlichen Schutzgruppen abgespalten werden. Die Abspaltung der erfindungsgemäß als Aminoschutzgruppe vorgesehenen Cyanethoxycarbonylgruppe kann z. B. mittels DBU-Behandlung (Behandlung mit 1,8-Diazabicyclo-(5.4.0.)- undec-7-en) erfolgen. Hierauf wird später noch einmal genauer eingegangen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Aminoschutzgruppen weisen eine ganze Reihe von Vorteilen auf. Ein wesentlicher Vorteil ist, daß mit ihnen die Entschützung des fertigen Oligonucleotids wesentlich schneller (in 1-2 Stunden bei Raumtemperatur) erfolgen kann als bei herkömmlichen Schutzgruppen, die mehrere Stunden und Temperaturen bis 55∘C erfordern. Die Herstellungszeiten lassen sich also deutlich verkürzen, was z. B. bei Produktion großer Mengen von Oligonucleotiden interessant ist. Insbesondere "Antisense"-Methoden, bei denen viel Oligonucleotidematerial eingesetzt werden muß, könnten so deutlich preisgünstiger als bisher durchgeführt werden.

Von Vorteil ist die Erfindung weiterhin, wenn die Synthese trägergebunden (Festphasensynthese) erfolgen soll und die hergestellten Oligonucleotide auch in entschütztem Zustand an dem Träger gebunden bleiben sollen. Solche trägergebundenen Oligonucleotide eignen sich besonders als Sonden zum Detektieren und Isolieren spezifischer DNA- bzw. mRNA-Abschnitte.

Bei der trägergebundenen Synthese wird zunächst ein Startnucleosid mit seinem 3'-Ende über einen Linker, z. B. Succinat oder ein Oxalat, kovalent an einem Träger gebunden. Die genannten Linker führen zu einer Esterbindung am Kohlenhydratrest des Nucleosids und zu einer Amidbindung mit der zweiten Carboxylgruppe zum Trägermaterial.

Von dem 5'-Ende des Starternucleosides aus wird dann das gewünschte Oligonucleotid schrittweise unter erfindungsgemäßer Verwendung der im Anspruch 1 genannten Aminoschutzgruppen an dem Träger aufgebaut.

Bei dem Träger kann es sich z. B. um Silikagel, poröses Borsilikat-Glas (ePG) oder vernetztes Polystyrol handeln. Es ist allerdings zusätzlich noch zu beachten, daß der Träger vor seinem Einsatz mit einem Spacer, z. B. einem Glyceryl- oder Aminoalkyl-Rest kovalent modifiziert wird, um eine kovalente Bindung des Startnucleosids über einen Linker zu ermöglichen.

Insbesondere, wenn trägergebundene Oligonucleotide als Sonde eingesetzt werden sollen, ist es weiterhin erforderlich, daß diese, um eine ausreichende Bewegungsfreiheit der Sequenzen zu gewährleisten, nicht direkt, sondern über einen längeren Spacer an den Träger gebunden sind. Typischerweise gehören solche Spacer zur Gruppe der Aminoalkyl- und N-Alkylaminoalkylderivate.

Beim Einsatz der Aminoalkyl-Spacer muß allerdings beachtet werden, daß in Gegenwart starker Basen wie z. B. DBU für die Entschützung eine intramolekulare Ringbildung zum Succinimid stattfinden kann und so die Bindung zwischen Träger und Oligonucleotid aufgehoben wäre (was in manchen Fällen nicht stört bzw. sogar gewünscht sein kann).

Im folgenden soll die Erfindung anhand einiger Beispiele und dem Formelschema der Fig. 3 näher erläutert werden.

Beispiel 1 Herstellung der β-Cyanoethoxycarbonylschutzgruppe als Chlorkohlensäure(β- cyanoethyl)ester (CEOC-CL) (2)

11,5 ml (150 mmol; 14,85 g) Phosgen werden bei -50∘ kondensiert und dann mit 34 ml absolutem Tetrahydrofuran (THF) verdünnt. Dann wird über einen Zeitraum von 1,5 Stunden eine Lösung von 6,82 g β-Cyanoethanol in 140 ml absoluten THF unter kontinuierlichem Stickstoffstrom zugetropft. Die Lösung wird 1,5 Stunden bei -30∘C und weitere drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Phosgen wird zusammen mit THF abkondensiert und ausgefroren. Anschließend wird das Produkt im Vakuum fraktioniert destilliert. Man erhält ca. 11 g einer farblosen viskosen Flüssigkeit, die den im Titel genannten Chlorkohlensäureester in ausreichender Reinheit enthält.

Beispiel 2 Herstellung einer β-Cyanoethoxycarbonyl enthaltenden Reagenzes in Form von 1-β-Cyanoethoxycarbonyl-3-methylimidazoliumchlorid (3)

Zu einer Lösung von 3,66 ml Chlorkohlensäure-β-(cyanoethyl)ester (siehe Beispiel 1) in 30 ml absolutem Dichlormethan werden unter Kühlung und Feuchtigkeitsausschluß 2,87 mg 1-Methylimidazol in 2,5 ml absoluten Dichlormethan innerhalb von 5 Minuten zugetropft. Die Reaktionsmischung wird 10 Minuten bei 0∘C und weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag wird abgesaugt, dreimal mit absolutem Dichlormethan gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 94%.

Als weitere Schutzgruppe für Amidfunktionen käme 2-Cyanoethyljodid in Frage. Diese Schutzgruppe könnte z. B. wie von W.S. Schulz, W. Pfleiderer, in Tetrahedron LETT., 24, Seite 3587 (1983) beschrieben, hergestellt werden.

Beispiel 3 Herstellung von N⁴-β-Cyanoethoxycarbonyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrithyl)-2'- desoxycytidin-3'-O-(β-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosphitamid (8)

2,64 g (10 mmol) 2'-Desoxycytidinhydrochlorid und 2,59 g (12 mmol) 1-β- Cyanoethoxycarbonyl-3-methylimidazoliumchlorid werden in 100 ml absolutem Dimethylformamid suspendiert. Dazu werden 1,7 ml (10 mmol) Ethyldiisopropylamin gegeben und geschüttelt, bis eine klare Lösung erhalten wird. Die Lösung wird dann 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel bei 30∘ Badtemperatur im Hochvakuum abrotiert. Der Rückstand wird mittels Kieselgelflashchromatografie (70 g Kieselgel, Querschnitt 3,5 cm) und einem Gradienten von 0 bis 20% Methanol in Dichlormethan bei einer Gesamtmenge von 200 ml gereinigt. Das in dieser Reinigungsstufe erhaltene Produkt wird durch Umkristallisation aus Isopropanol weiter gereinigt. Man erhält in diesem Schritt N⁴-Cyanoethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin (6) als Zwischenprodukt in ausreichend reiner Form.

2,57 g (7,93 mmol) N⁴-β-Cyanoethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin werden zweimal mit je 7 ml absolutem Pyridin koevapoiert, in 30 ml absolutem Pyridin gelöst, mit 2,9 g (8,7 mmol) Dimethoxytritylchlorid versetzt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Es werden dann 2 ml Methanol zugegeben und auf ein Drittel des Volumens einrotiert. Dann wird mit 200 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit je 200 ml gesättigter Natriumhydrogenkarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Der Rückstand wird aus Essigsäureethylester umkristallisiert, wobei nur das monotritylierte Nucleosid auskristallisiert. Das restliche N⁴-β- Cyanoethoxycarbonyl-5'-O(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (7) wird durch Kieselgelflashchromatografie des Filtrates (20 g Kieselgel, Querschnitt 2,5 cm) mit einem Gradienten von Toluol/EtOAC/MEOH bei einer Gesamtmenge von 500 ml Lösungsmittel als farblose Kristalle erhalten.

1 g (1,59 mmol) N⁴-β-Cyanoethoxycarbonyl-5'-O(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'- desoxycytidin werden zweimal mit 10 ml absolutem Dichlormethan koevapoiert und in 10 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung werden 54 mg (0,775 mmol) Tetrazol und als Phosphitilierungsreagenz 980 mg (3,25 mmol) Bis(N,N'-diisopropylamino (β-cyanoethoxy)phosphan (4) gegeben. Die Reaktionslösung wird mit Stickstoff geflutet und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird mit 40 ml Dichlormethan verdünnt und einmal mit 40 ml 5%iger Natriumhydrogenkarbonatlösung ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird noch zweimal mit je 40 ml Dichlormethan extrahiert und dann die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet. Nach Einrotieren der organischen Phase wird mittels Kieselgelflashchromatografie (17 g Kieselgel, Querschnitt 2,5 cm) gereinigt. Die Säule wird mit Toluol/EtOAC/l und bei ca. 150 ml (Gesamtmenge 500 ml Lösungsmittel) das Produkt N⁴-β-Cyanoethoxycarbonyl- 5'-O-(4,4'-dimethoxytrithyl)-2'-desoxycytidin-3'-O-(β-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl)phosphitamid (8) eluiert.

Beispiel 4 Herstellung von N⁶-β-Cyanoethoxycarbonyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-des-oxyadenosin-3'-O-(β-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphitamid (12)

0,5 g (2 mmol) 2'-Desoxyadenosin (9) werden in 8 ml u Hexamethyldisilazan und 8 ml absolutem Dioxan suspendiert und nach Zugabe einer Spatelspitze Ammoniumsulfat 5 Stunden am Rückfluß gekocht. Dann wird das HMDS/Dioxan-Gemisch abrotiert, der Rückstand mit 5 ml absolutem Toluol koevapoiert und in 40 ml absolutem Dichlormethan aufgenommen. Zu dieser Lösung werden 0,538 g (2,5 mmol) 1-β-Cyanoethoxycarbonyl-3-methyl- imidazoliumchlorid (3) gegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der Niederschlag abgesaugt und dreimal mit 5 ml absolutem Dichlormethan nachgewaschen. Die Dichlormethanlösung wird einrotiert und der Rückstand in 10 ml Methanol und 10 ml Wasser gelöst, dann für 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wird das Lösungsmittel abrotiert und jeweils zweimal mit 5 ml Toluol, 5 ml Methanol und 5 ml Dichlormethan koevapoiert. Nach Reinigung mittels Kieselgelflashchromatografie (15 g Kieselgel, Querschnitt 2,5 cm) mit einem Gradienten von 0-10% Methanol in Dichlormethan (Gesamtlösungsmittelmenge 800 ml) erhält man in ausreichender Reinheit N⁶-β- Cyanoethoxycarbonyl-2'-desoxyadenosin (10).

3,8 g (10,9 mmol) N⁶-β-Cyanoethoxycarbonyl-2'-desoxyadenosin werden zweimal mit 15 ml absolutem Pyridin koevapoiert, in 40 ml absolutem Pyridin gelöst und nach Zugabe von 4 g (12 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird auf ein Drittel des Volumens einrotiert, mit 300 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit je 300 ml gesättigter Natriumhydrogenkarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, einrotiert und zweimal mit je 15 ml Toluol, zweimal mit je 15 ml Methanol und zweimal mit je 15 ml Dichlormethan koevapoiert. Nach Reinigung mittels Kieselgelflashchromatografie erhält man ca. 6,5 g (10 mmol, 92%) N⁶-β-Cyanoethoxycarbonyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-des-oxyadenosin (11) in Form eines farblosen Schaumes.

1,5 g (2,3 mmol) N⁶-β-Cyanoethoxycarbonyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'- desoxyadenosin werden zweimal mit je 10 ml absolutem Dichlormethan koevapoiert und in 12 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Zu der Lösung werden 80 mg (1,15 mmol) Tetrazol und als Phosphytilierungsreagenz 1,38 g (4,58 mmol) Bis(N,N'-diisopropylamino (β-cyanoethoxy)phosphin gegeben. Die Reaktionslösung wird mit Stickstoff geflutet und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird mit 50 ml Dichlormethan verdünnt und einmal mit 50 ml 5%iger Natriumhydrogenkarbonatlösung ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird noch zweimal mit je 50 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet. Nach Einrotieren der organischen Phase wird mittels Kieselgelflashchromatographie (30 g Kieselgel, Querschnitt 3,5 cm) gereinigt. Die Säule wird mit Toluol/EtOAC 2 : 3 gepackt. Nach 200 ml wird das gewünschte Produkt N⁶-β-Cyanoethoxycarbonyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2- desoxyadenosin-3'-O-(β-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)-phosphitamid (12) eluiert (Gesamtmenge 600 ml Lösungsmittel).

Beispiel 5 Herstellung von O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N²-β-cyanoethoxycarbonyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin-3'-O-(β-Cyanoethyl-N,N-diisopropyl)-phosphitamid (16)

900 mg (2,16 mmol) O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-2-desoxyguanosin (13) werden zweimal mit 5 ml absolutem Pyridin koevapoiert und anschließend in 8,5 ml absolutem Pyridin und in 11 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Hierzu werden 1,6 ml (12,8 mmol) Trimethylsilylchlorid gegeben. Es wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein Pyridiniumniederschlag bildet. Dann werden 0,325 ml (3,1 mmol, 0,414 g) Chlorkohlensäure(β-cyanoethyl)ester (2) in 2 ml absolutem Dichlormethan zugegeben. An der Eintropfstelle bildet sich ein Niederschlag, nach 20 Sekunden entsteht eine klare Lösung, in der eine gallertartige Masse schwimmt, die sich nach weiteren 20minütigem Rühren bei Raumtemperatur auflöste. Nach weiterem Rühren über 4 Stunden bei Raumtemperatur werden 20 ml Methanol zur Hydrolyse der Trimethylsilylgruppen hinzugegeben, die Lösung nach weiteren 20 Minuten einrotiert und in 40 ml Wasser und 40 ml Essigsäureethylester wieder aufgenommen. Die Wasserphase wird noch dreimal mit je 40 ml Essigsäureethylester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden dann einrotiert und zweimal mit je 15 ml Toluol, zweimal mit je 15 ml Methanol und dreimal mit je 15 ml Dichlormethan bis zum Aufschäumen koevaporiert. Nach Digerieren in Dichlormethan, Absaugen und Trocknen erhält man O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N²-β-cyanoethoxycarbonyl-2'-desoxyguanosin (14) in 75% Ausbeute.

0,4 mmol O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N²-β-cyanoethoxycarbonyl-2'-Desoxyguanosin werden zweimal mit absolutem Pyridin koevaporiert und anschließend in 1,5 ml absolutem Dichlormethan und 0,5 ml absolutem Pyridin gelöst. Hierzu gibt man 171,8 mg (0,51 mmol) Dimethoxytritylchlorid und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Es werden dann 0,5 mg Methanol hinzugegeben, und die Lösung wird einrotiert und in 4 ml Dichlormethan wieder aufgenommen. Dann wird zweimal mit 5 ml gesättigter Natriumhydrogenkarbonatlösung ausgeschüttelt, die organische Phase einrotiert und zweimal mit 5 ml Toluol, zweimal mit 5 ml Methanol und zweimal mit 5 ml Dichlormethan koevapoiert. Nach Reinigung mittels Kieselgelflaschchromatografie (8 g Kieselgel, Querschnitt 2,5 cm) erhält man als leicht gelblichen Schaum O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N²-β- cyanoethoxycarbonyl-5'-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin (15) mit einer Ausbeute von ca. 80%.

800 mg (0,98 mmol) O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N²-β-cyanoethoxycarbonyl-5'- (4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin werden zweimal mit 3 ml absolutem Dichlormethan koevaporiert und in 5,2 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Hierzu werden 35 mg (0,49 mmol) Tetrazol und 591 mg (1,95 mmol) Bis(N,N'- diisopropylamino (β-cyanoethoxy)phosphan (4) als Phosphitylierungsreagenz gegeben und die Reaktionslösung mit Stickstoff geflutet. Es wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird mit 20 ml Dichlormethan verdünnt und 20 ml 5%iger Natriumhydrogenkarbonatlösung ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird noch zweimal mit je 20 ml Dichlormethan extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und einrotiert. Das gewünschte Produkt O⁶-[2-(4-Nitrophenyl)ethyl]-N²-β-cyanoethoxy-carbonyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrithyl)-2'-desoxyguanosin-3'-O-(β-Cyanoethyl-N,N- diisopropyl)phosphitamid wird nach Kieselgelflashchromatografie (18 g Kieselgel, Querschnitt 2,5 cm), mit 400 ml Toluol/EE, 2/3 erhalten.

Beispiel 6 Herstellung von Oligonucleotiden

Die Synthese von Oligonucleotiden wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesizers Modell 392 von Applied Biosystems durchgeführt. Zur Oligonucleotid- Synthese wurden die gemäß der Beispielen 3-5 hergestellten Phosphoramidite als 0,1 M-Lösung in CH₃CN eingesetzt. Als Träger dient ein mit Thymidin derivatisierter LCAMHA-CPG-(long chain methylaminohexylamino controlled pore glass) Träger. Die Synthese erfolgte mit den Reaktionsschritten des Standardzyklusses einer automatisierten Oligonucleotid-Synthese:

A. Detritylierung

Hierbei wurde die Schutzgruppe der 5'-Hydroxylfunktion abgespalten. Die Abspaltung erfolgte mittels Behandlung mit 3%iger Trichloressigsäure in Dichlormethan über einen Zeitraum von ca. 60 Sekunden.

B. Kondensation

Im nächsten Schritt wurde das eingesetzte Phosphitamid aktiviert. Die Aktivierung erfolgte mittels 0,5 M 1H-Tetrazol in Acetonitril über einen Zeitraum von ca. 67 Sekunden.

C. Capping

Bei diesem Schritt wurden verbleibende, nicht abreagierte 5'-Hydroxylgruppen blockiert. Die Blockierung erfolgte durch Acetylierung mit Acetanhydrid, 2,6-Lutidin, Tetrahydrofuran destilliert (1 : 1 : 8) und N-Methyl-imidazol/Tetrahydrofuran (16 : 84).

D. Oxidation

Hierbei wurde der Phosphidtriester zum Phosphorsäuretriester oxidiert. Die Oxidation erfolgte mit 0,05 N Jodlösung in Tetraohydrofuran/Pyridin/H₂ O (7 : 1 : 2) (18 Sekunden).

E. Entschützung des Oligonucleotids, d. h. Abspaltung der β- Cyanoethoxycarbonyl-/2-(4-Nitrophenyl)-ethyl-Gruppen

Die Entschützung erfolgte mittels 1 N DBU-Lösung in Acetonitril, wobei das DBU purum-Qualität hat (Dauer 4, 11 oder 12 Minuten). Es wurden hierzu die Programme DBU fast 5, DBU fast 4, DBU fast 2 und DBU fast verwendet.

F. Trägerabspaltung

Abspaltung der gebildeten Oligonucleotide von dem Träger mittels Behandlung mit 25%iger wäßriger Ammoniaklösung über einen Zeitraum von 60-80 Minuten.

Auf diese Weise ließen sich mit guten Kondensationsausbeuten DC-DA und DG- Oligonucleotide herstellen.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotid-Sequenzen, bei dem

• a) das freie 3'- oder 5'-Ende eines Nucleosides bzw. Nucleotides mit dem freien 3'- oder 5'-Ende eines Nucleosids oder eines Nucleotids über eine Phosphorverbindung verknüpft wird,
• b) der Schritt mehrfach mit gegebenenfalls jeweils unterschiedlichen Nucleosiden/Nucleotiden wiederholt wird, bis das gewünschte Oligonucleotid erhalten wird, wobei als Schutzgruppe für mindestens eine der Aminofunktionen der Nucleoside bzw. Nucleotide eine Cyanoethoxycarbonylgruppe eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Nucleoside Desoxyribonucleosid- oder Ribonucleosid-3'-Phosphitamide sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein Startnucleosid mit seinem 3'-Ende kovalent mit einem Feststoffträger gebunden wird und dann vom 5'-Ende des Startnucleosids aus die gewünschte Oligonucleotidsequenz schrittweise aufgebaut wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein kovalent modifiziertes Silikatgel ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Startnucleosid und Träger ein Spacer vorgesehen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer ein Alkylaminoalkylderivat ist.