DE69828076T2 - Synthese von sulfurierten oligonukleotiden - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Synthetisieren von geschwefelten Oligonucleotiden und Analoga davon. Die Verfahren schließen Phenylacetyldisulfidreagens in einem vereinfachten Lösungsmittelsystem ein und erzeugen Oligonucleotide mit Phosphorothioatgruppen mit großer Effizienz und verbesserten Ausbeuten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Modifizierte Oligonucleotide sind von großem Wert in der molekularbiologischen Forschung und den Anwendungen wie antiviraler Therapie. Modifizierte Oligonucleotide, können die RNA-Translation blockieren können, und Nukleaseresistent sind, sind nützlich als Antisense-Reagenzien. RNA geschwefelte Oligonucleotide, die Phosphorothioat-Verknpüfungen (P-S) enthalten, sind in diesen Bereichen von Interesse. Phosphorothioat enthaltende Oligonucleotide sind auch nützlich bei der Bestimmung von stereochemischen Stoffwechselwegen einiger Enzyme, die Nukleinsäuren erkennen.
  • Standardtechniken zur Schwefelung von Phosphor enthaltenden Verbindungen sind auf die Synthesen geschwefelter Oligonucleotide angewandt worden. Beispiele von Schwefelungsreagenzien, die verwendet worden sind, um Oligonucleotide zu erzeugen, die Phosphorothioatbindungen haben, schließen ein elementaren Schwefel, Dibenzoyltetrasulfid, 3-H-1,2-Benzodithiol-3-on 1,1-Dioxid (auch bekannt als Beaucage-Reagens), Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) und bis-(O,O-Diisopropoxyphosphinothioyl)-Disulfid (bekannt als Stec-Reagens). Die meisten der bekannten Schwefelungsreagenzien haben hingegen einen oder mehrere signifikante Nachteile.
  • Elementarer Schwefel zeigt Probleme und ist nicht geeignet zur Automatisierung auf Grund seiner Unlöslichkeit in den meisten organischen Lösungsmitteln. Weiterhin hat Kohlenstoffdisulfid eine bevorzugte Schwefelquelle, ungewünschte Flüchtigkeit und einen ungewünscht niedrigen Flammpunkt. Ungewünschte Nebenprodukte werden oft mit der Verwendung von Dibenzyltetrasulfid beobachtet. Beaucage-Reagens, während es ein relativ effizientes Schwefelungsreagens ist, ist schwierig zu synthetisieren und nicht besonders stabil. Weiterhin bildet die Verwendung von Beaucage-Reagens ein Reaktionsnebenprodukt, welches ein potenzielles Oxidationsmittel ist (R.P. lyer et al., J.Am. Chem. Soc. 112, S. 1253–1254 (1990): R.P. lyer et al. J. Org. Chem. 55, 4693–4699 (1990). Dies kann weiterhin zu ungewünschten Nebenprodukten führen, welche schwer von dem gewünschten Reaktionsprodukt zu trennen sein können. Tetraethylthiuramdisulfid, während es relativ billig und stabil ist, hat eine Schwefelungsreaktionsgeschwindigkeit, die ungewünscht niedrig sein kann.
  • Ein Verfahren zum Erzeugen eines Phosphorothioatesters durch Reaktion eines Phosphitesters mit Acyldisulfid ist offenbart in der holländischen Patentanmeldung Nr. 8902521. Das offenbarte Verfahren wird angewandt auf ein gereinigtes Phosphotriesterdimer unter Verwendung einer Lösungsphasenchemie. Das Verfahren ist zeit- und arbeitsintensiv darin, dass man lediglich gezeigt hat, in einem komplexen Schema zu arbeiten, welches das Ausführen einer Erststufensynthese (Bildung eines Phosphits) in Acetonitril, Entfernung des Acetonitrils, Reinigen des Zwischenprodukts Phosphortriester und Fortfahren mit der Schwefelung in einem Lösungsmittelgemisch von Dichlorethan (DCE) und 2,4,6-Collidin involviert. Weiterhin wurde das Verfahren nur mit einem Dinucleotid gezeigt. Es gab kein Naheliegen, dass das holländische Verfahren mit größeren Nukleinsäurestrukturen eingesetzt werden könnte, das dieses ein gemeinsames Lösungsmittel über alle Synthesestufen verwenden könnte, das verbesserte Ausbeuten erhalten werden könnten oder dass das Verfahren für konventionelle automatisierte Synthesen ohne teure Modifikation des Automatisierungsschemas ausgelegt werden könnte. Obwohl Acetonitril als eines von mehreren möglichen Lösungsmitteln erwähnt ist, wurde die Nützlichkeit des Verfahrens zur Durchführung aller Syntheseschritte in Acetonitril als gemeinsames Lösungsmittel nicht gezeigt. Während andere Publikationen (Kamer et al., Tetrahedron Letters 30(48), S. 6757–6760 (1989); Roelen et al., Rech. Trav. Chim. Pays-Bas 110, S. 325–331 (1991) die Schwefelung von Oligomeren mit bis zu 6 Nucleotiden zeigen, sind die obigen Mängel nicht durch in diesen Referenzen offenbarte Verfahren zu überwinden.
  • Daher verbleibt ein Bedürfnis nach verbesserten Verfahren und Reagenzien zur Herstellung von Schwefel enthaltenden Phosphorgruppen wie Phosphorothioatverbindungen in Oligonucleotiden und anderen organischen Verbindungen. Die vorliegende Erfindung ist sowohl auf diese gerichtet als auch auf andere wichtige Enden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ergibt Verfahren zur Synthese von Phosphorothioatoligonucleotiden mit verbesserten Ausbeuten verglichen mit jenen, die mit früheren Verfahren erhalten werden. Darüber hinaus sind die vorliegenden Verfahren anwendbar zur Synthese von nicht nur Phosphorothioat-Oligonucleotiden mit relativ großen Anzahlen von Nucleotid- und/oder Nucleosideinheiten darin, zum Beispiel von etwa 6 bis etwa 50 und sogar mehr und speziell von etwa 8 bis etwa 30 Nucleotid- und/oder Nucleosideinheiten. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung setzen ein weit vereinfachtes Lösungsmittelsystem ein und eines, welches kompatibel mit automatisierten Synthesereaktionsschemata und kommerziellen Synthetisierern ist. Die resultierende Verbesserung bei Synthesemöglichkeiten ermöglicht eine weite Anwendung der vorliegenden Verfahren über die Nukleinsäurechemie.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Phosphorothioatoligonucleotiden, wobei das Verfahren umfasst: Phosphorylieren der 5'-Hydroxylgruppe einer Nukleinsäureeinheit in Acetonitril, um ein Phosphitzwischenprodukt zu bilden, wobei die Nukleinsäureeinheit an einen Träger gebunden ist; und
    Oxidieren des Phosphitzwischenprodukts mit Acetyldisulfid in einem Lösungsmittelsystem, das Acetonitril und Pyridin ein schließt, sterisch gehindertes Pyridin oder ein Gemisch davon für eine Dauer, die ausreichend ist, um die Umwandlung des Phosphitzwischenprodukts in das Phosphorothioat zu bewirken. Phosphorothioatoligonucleotide mit einer vorbestimmten Länge und einer Sequenz können durch Wiederholen der Phosphitylierungs- und Oxidierungsschritte hergestellt werden.
  • Unter weiteren Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Synthese von Phosphorothioatoligonucleotidanaloga offenbart, umfassend die Substitution von modifizierten Nucleotiden, Nucleosiden, Oligonucleotiden und Oligonucleosiden für Nucleotide, Nucleoside, Oligonucleotide oder Oligonucleoside. Modifikationen an Oligonucleotiden, Nucleosiden, Oligonucleotiden und Oligonucleosiden sind im Stand der Technik wohl bekannt. Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "Phosphorothioatoligonucleotid" gemeint als wie oben definierte Analoga umfassend.
  • Der Ausdruck „Phosphiteinheit" wie hierin verwendet, ist gemeint als Phosphiteinheiten in Nucleosiden, Nucleotiden, Oligonucleosiden und Oligonucleotiden umfassend. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Phosphiteinheiten in einem aktivierten Zustand so wie ein Dimethoxytritylphosphoramidit. Die Ausdrücke „Nucleotid, Oligonucleotid, oder ein Oligonucleosid" wie hierin verwendet, sind gemeint als beide natürlich vorkommende Spezies und nicht an natürlich vorkommenden Spezies umfassend, die natürlich vorkommen oder modifizierte Spezies, wie sie Fachleuten bekannt sind. Gewöhnliche Modifikationen schließen ein Zuckermodifikationen wie 2'-Modifikationen und Basemodifikationen oder die Verwendung von Substituentenbasen. Wenn ein Oligonucleotid oder modifiziertes Oligonucleotid als Phosphiteinheit verwendet wird, werden die modifizierten Verknüpfungen, wie allgemein im Stand der Technik bekannt, auch vorliegen können.
  • Die vorliegenden Verfahren zeigten geringere Niveaus von Verunreinigungen und höhere Ausbeuten im Vergleich dazu als wenn DCE als Lösungsmittel für den Oxidationsschritt verwendet wird. Die vorliegenden Verfahren haben auch gezeigt, unerwarteter Weise, dass Ausbeuten von etwa 99% in Acetonitril/Picolin erhalten werden können. Acetonitril/Picolin ist vollständig kompatibel mit automatisierter Synthese ohne extensive Modifikation der Syntheseroutine, so dass die vorliegenden Methoden vorteilhaft in einem automatisierten Synthetisierer verwendet werden können. Extensive Waschungen sind beispielsweise nicht erforderlich, da ein einziges Lösungsmittels oder ein Gemischs mit einem gemeinsamen Lösungsmittel in allen automatisierten Syntheseschritten verwendet wird. Daher kann man Lösungsmittel-Entfernung und Waschschritte eliminieren. Es ist auch überraschenderweise entdeckt worden, dass hohe Ausbeuten erzielt werden können, wenn Phosphorothioatoligonucleotide oder Oligonucleotidanaloga mit etwa 8 bis etwa 30 Nucleotiden synthetisiert werden.
  • Geeignete Lösungsmittelsysteme zum Gebrauch bei der Oxidation von dem Phosphitintermediat der vorliegenden Erfindung schließen Gemische von zwei oder mehr Lösungsmitteln ein. Bevorzugt ein Gemisch eines aprotischen Lösungsmittels mit einem protischen oder basischen Lösungsmittel. Bevorzugte Lösungsmittelgemische schließen ein Acetonitril/Picolin und Acetonitril/Lutidin. Geeignete aprotische Lösungsmittel schließen ein Pyridin und gehinderte Pyridine wie Lutidin, Collidin und Picolin. Lösungsmittelgemische können einschließen zum Beispiel zwei Lösungsmittel wie Acetonitril und Picolin oder Acetonitril und Lutidin in einem Volumenverhältnis von etwa 1:1,5 bis etwa 1,5:1, vorzugsweise etwa 1:1.
  • Schwefelung (Oxidieren unter Verwendung eines Schwefelungsreagens) gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch Kontaktieren eines Oligonucleotids oder Analogas ausgeführt mit Acetyldisulfid für eine Dauer, die ausreichend ist, um die Bildung einer phosporothioatfunktionellen Gruppe zu bewirken. Bevorzugte Reagenzien schließen ein Phenylacetyldisulfid, Arylacetyldisulfid und arylsubstituierte Phenylacetyldisulfide.
  • Kontaktieren der Phosphiteinheit mit Acetyldisulfid kann gemacht werden unter Verwendung von Verfahren und Ausrüstungen, die Fachleuten bekannt sind. Zum Beispiel kann ein Glasreaktor wie ein Kolben geeignet eingesetzt werden. Die Festphasesyntheseverfahren werden bevorzugt eingesetzt und ein fester Träger wie ein Glas mit kontrollierten Poren. Noch bevorzugter können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von automatisierten DNA-Synthetisierern durchgeführt werden. Geeignete Festphasentechniken, einschließlich automatisierter Techniken, sind beschrieben in F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, New York (1991).
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können geeignet bei Raumtemperatur ausgeführt werden. „Raumtemperatur" schließt Umgebungstemperatur von etwa 20°C bis etwa 30°C ein. Die Reaktionszeiten sind in der Größenordnung von Minuten wie zum Beispiel 2, 3, 4 oder 5 Minuten oder sogar so kurz wie etwa 100 Sekunden.
  • Allgemein umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung Phosphitylierung der 5'-Hydroxylgruppe einer Nukleinsäureeinheit, um ein Phosphitzwischenprodukt zu bilden, und Oxidieren des Phosphitzwischenprodukts mit einem Acetyldisulfid für eine Dauer, die ausreichend ist, um die Umwandlung des Phosphitzwischenprodukts zu Phosphorothioat zu bewirken. Das Phosphitzwischenprodukt kann zum Beispiel ein phosphitverknüpftes Dinucleotid sein oder ein Oligonucleotid oder Oligonucleosid mit wenigstens einer Phosphitverknpüfung hierin. Die Phosphitylierung und Oxidationsschritte des Verfahrens werden beide in einem System durchgeführt, das Acetonitril umfasst. Die Widerholung der Phosphitylierungs- und Oxidationsschritte wird Phosphorothioatoligonucleotid mit einer vorbestimmten Länge ergeben. Der Reaktionsfortschritt kann durch bekannte Techniken wie 31P-NMR verfolgt werden. Das Reaktionsprodukt kann mit einer Base behandelt werden wie zum Beispiel Ammoniumhydroxidlösung in einer Konzentration von etwa 30%. Das gewünschte Produkt kann sofort zum Beispiel durch Standardfiltrationstechniken isoliert werden.
  • Die folgenden Beispiele sind eher veranschaulichend für die vorliegende Erfindung und sollten nicht als die Reichweite der vorliegenden Erfindung irgendwie begrenzend betrachtet werden. Diese Beispiele und Äquivalente davon werden Fachleuten im Lichte der vorliegenden Offenbarung und anliegenden Ansprüche deutlicher werden.
  • Beispiel 1
  • Synthese von 5'-TTTTTTT'-3'-Phosphorothioat-Heptamer:
  • 50 Milligramm (2μmol) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an CPG (Glas mit kontrollierten Poren) über Esterverknüpfung wird aufgenommen in einem Glasreaktor und Dichlormethanlösung von 2% Dichloressigsäure (Volumen/Volumen) wird zugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen. Dann wird eine 0,2M-Lösung von 5'-O-(4,4'-Dimethyoxytrityl)Thymidin-3'-O-(2-Cyanoethyl N,N-Diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren gelassen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) zugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Minuten reagieren gelassen. Die Schwefelungsstufe wird ein weiteres Mal für 3 Minuten wiederholt. Der Träger wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine Lösung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/ THF (1:1:8) und N-Methylimidazol/THF zugegeben, um jegliche unreagierte 5'-Hydroxylgruppe abzukappen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen.
  • Beispiel 2
  • Synthese von 5'-d(GACT)-3'-Phosphorothioat-Tetramer:
  • 50 Milligramm (2×106 mol (2μmol)) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an CPG (Glas mit kontrollierten Poren) über Esterverknüpfung wird aufgenommen in einem Glasreaktor und Dichlormethanlösung von 2% Dichloressigsäure (Volumen/Volumen) wird zugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen. Dann wird eine 0,2M-Lösung von 5'-O-(4,4'-Dimethyoxytrityl)Thymidin-3'-O-(2-Cyanoethyl N,N-Diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren gelassen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) zugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Minuten reagieren gelassen. Die Schwefelungsstufe wird ein weiteres Mal für 3 Minuten wiederholt. Der Träger wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine Lösung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/ THF (1:1:8) und N-Methylimidazol/THF zugegeben, um jegliche unreagierte 5'-Hydroxylgruppe abzukappen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen.
  • Eine Lösung von 2% Dichloressigsäure (Volumen/Volumen) wird zugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen. Dann wird eine 0,2M-Lösung von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-Dimethyoxytrityl)-2'-Deoxycytidin-3'-O-(2-Cyanoethyl N,N'-Diisopropylphosphoramidit). in Acetonitril und eine 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren gelassen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) zugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Minuten reagieren gelassen. Die Schwefelungsstufe wird ein weiteres Mal für 3 Minuten wiederholt. Der Träger wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine Lösung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/ THF (1:1:8) und N-Methylimidazol/THF zugegeben, um jegliche unreagierte 5'-Hydroxylgruppe abzukappen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen.
  • Eine Lösung von 2% Dichloressigsäure (Volumen/Volumen) wird zugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen. Dann wird eine 0,2M-Lösung von N6-Benzoyl-5'-O-(4,4'-Dimethyoxytrityl)-2'-Deoxyadenosin-3'-O-(2-Cyanoethyl N,N'-Diisopropylphosphoramidit) in wasserfreiem Acetonitril und eine 0,4 M-Lösung von IH-Tetrazol in Acetonitril zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren gelassen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) zugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Minuten reagieren gelassen. Die Schwefelungsstufe wird ein weiteres Mal für 3 Minuten wiederholt. Der Träger wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine Lösung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/ THF (1:1:8) und N-Methylimidazol/THF zugegeben, um jegliche unreagierte 5'-Hydroxylgruppe abzukappen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen.
  • Eine Lösung von 2% Dichloressigsäure (Volumen/Volumen) wird zugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen. Dann wird eine 0,2M-Lösung von N2-Isobutyryl-5'-O-4,4'-Dimethyoxytrityl-Deoxyguanosin-3'-O-(2-Cyanoethyl N,N'-Diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril zugegeben und bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren gelassen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) zugegeben und bei Raumtemperatur für 3 Minuten reagieren gelassen. Die Schwefelungsstufe wird ein weiteres Mal für 3 Minuten wiederholt. Der Träger wird mit Acetonitril gewaschen und dann wird eine Lösung von Essigsäureanhydrid/Lutidin/ THF (1:1:8) und N-Methylimidazol/THF zugegeben, um jegliche unreagierte 5'-Hydroxylgruppe abzukappen. Das Produkt wird mit Acetonitril gewaschen.
  • Das Vehikel bzw. Carrier, das die Verbindung enthält, wird mit 30% wässriger Ammoniumhydroxidlösung für 90 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und wird dann bei 55°C für 24 Stunden inkubiert. Die wässrige Lösung wird filtriert, konzentriert unter vermindertem Druck, um ein Phosphorothioattetramer von 5'-dG-dA-dC-T-3' zu ergeben.
  • Beispiel 3
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TCC-CGC-CTG-TGA-CAT-GCA-TT)-3'-Phosphorothioat-20-mers
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 620μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • Beispiel 4
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'd(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat-20-mers
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 620μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 5
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'-d(GCG-TTT-GCT-CTT-CTT-CTT-GCG)-3'-Phosphorothioat-21-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 620μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 6
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'd(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3'-Phosphorothioat-20-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 620μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,2M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 7
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'd(TCC-GCG-CTG-TGA)-2'-Methoxyethyl-(CAU-GCA-UU)-3'-Phosphorothioat-20-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Milligen 8800-Synthetisierer auf einem 282μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,4M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 6 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 8
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'd(TCC-CGC-CTG-TGA)2'-Methoxyethyl-(CAU-GCA-UU)-3'-Phosphorothioat-20-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 250μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,4M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 10 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 9
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'-[2'-Methoxyethyl(GCGUUUG)-d[CTCTTCT]-[2'-methoxyethyl-(UCUUGC)-dG-3'-Phosphorothioat-21-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 250μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,4M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 6 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 10
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC)-2'-Methoxyethyl-(AUC-CGU-CA)-3'-Phosphorothioat-20-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Milligen 8800-Synthetisierer auf einem 565μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,4M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 6 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • BEISPIEL 11
  • Synthese von vollständig modifiziertem 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC)-2'-Methoxyethyl-(AUC-CGU-CA)-3'-Phosphorothioat-20-mer
  • Die Synthese der obigen Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot-II-Synthetisierer auf einem 680μmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidite und Pharmacia's primar support durchgeführt. Die Schwefelung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 0,4M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 6 Minuten. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen, gespalten, entschützt und gereinigt wie vorher oben veranschaulicht worden ist.
  • Fachleute werden wissen, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen an den bevorzugten Ausführungen der Erfindung gemacht werden können und dass solche Änderungen und Modifikationen, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen, gemacht werden können. Es ist daher vorgesehen, dass die anliegenden Ansprüche alle solche äquivalenten Variationen abdecken, wie sie innerhalb dem wahren Geist und Bereich der Erfindung fallen.
  • Zahlreiche Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu solchen hier beschriebenen werden Fachleuten aus der obigen Beschreibung offensichtlich sein. Solche Modifikationen sind vorgesehen als in den Schutzbereich der anliegenden Ansprüche fallend.

Claims (11)

  1. Ein Verfahren für die Herstellung von Phosphorothioat-Oligonukleotiden, genanntes Verfahren umfassend: Phosphitylierung der 5' Hydroxylgruppe eines Nukleinsäureabschnittes in Acetonitril, um ein Phosphit-Intermediärprodukt zu bilden, wobei genannter Nukleinsäureabschnitt an einem festen Träger gebunden ist; und Oxidierung des genannten Phosphit-Intermediärproduktes durch ein Acetyl-disulfid in einem Lösungssystem bestehend aus Acetonitril, Pyridin, sterisch gehindertem Pyridin oder einer Mischung daraus, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, die Umwandlung des genannten Phosphit-Intermediärproduktes in das genannte Phosphorothioat zu bewirken.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Oxidierung in Gegenwart von Acetonitril:Lutidin in einem Verhältnis von 1:1 bezogen auf das Volumen stattfindet.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte sterisch gehinderte Pyridin Collidin, Lutidin oder Picolin ist.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 1, das das Wiederholen der genannten Phosphitylierung und der genannten Oxidierung umfasst, um dem genannten Phosphorothioat-Oligonukleotid eine vorbestimmte Länge zu geben.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Phosphit-Intermediärprodukt ein Dinukleotid ist.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Phosphit-Intermediärprodukt ein Oligonukleotid ist.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Phosphitylierung unter Verwendung eines Phosphit-Restes durchgeführt wird.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der genannte Phosphit-Rest ein Phosphoramidit ist.
  9. Das Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genannte Acetyl-disulfid ein Arylacetyl-disulfid ist.
  10. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das genannte Arylacetyl-disulfid ein Arylsubstituiertes Phenyl-disulfid ist.
  11. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das genannte Arylacetyl-disulfid Phenylacetyl-disulfid ist.
DE69828076.8T 1997-10-15 1998-10-13 Synthese von sulfurierten oligonukleotiden Expired - Lifetime DE69828076T3 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/950,779 US6114519A (en) 1997-10-15 1997-10-15 Synthesis of sulfurized oligonucleotides
US950779 1997-10-15
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