DE60216416T2

DE60216416T2 - Verfahren zum nachweis von chloralhydrat in dichloressigsäure

Info

Publication number: DE60216416T2
Application number: DE60216416T
Authority: DE
Inventors: Patrick Carlsbad WHEELER; C. Daniel Encinitas CAPALDI
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2001-01-30
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2022-01-30
Also published as: US20050113569A1; ATE346957T1; EP1356115B1; KR20030071870A; US20070196847A1; ES2276914T3; US7446193B2; CN1489633A; EP1356115A4; DE60216416D1; US20020119483A1; WO2002061138A1; US7173123B2; US6645716B2; EP1356115A1

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein neue Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden, welche das Nachweisen von Chloralhydrat in Dichloressigsäure umfassen.
Es ist bekannt, dass die meisten körperlichen Zustände in mehrzelligen Organismen, einschließlich der meisten Krankheitszustände, von Proteinen bewirkt werden. Solche Proteine, die entweder direkt oder durch deren enzymatische Funktionen oder andere Funktionen wirken, tragen einen Hauptanteil an vielen Erkrankungen und regulatorischen Funktionen. Bezüglich Krankheitszuständen hat sich die klassische Therapie im Allgemeinen auf die Wechselwirkungen mit solchen Proteinen in dem Bemühen konzentriert, deren krankheitsverursachende oder krankheitspotenzierende Funktionen zu mäßigen. In neueren therapeutischen Ansätzen ist die Modulierung der tatsächlichen Erzeugung solcher Proteine erwünscht. Durch die Störung der Erzeugung von Proteinen kann der maximale therapeutische Effekt mit minimalen Nebenwirkungen erhalten werden. Es ist daher eine allgemeine Aufgabe solcher therapeutischen Ansätze, die Genexpression, welche zu einer unerwünschten Proteinbildung führen würde, zu stören oder in anderer Weise zu modulieren.
Ein Verfahren zur Inhibierung der spezifischen Genexpression umfasst die Verwendung von Oligonukleotiden, insbesondere von Oligonukleotiden, die zu einer spezifischen Zielmessenger-DNA-Sequenz (mRNA-Sequenz) komplementär sind. Mit mehreren Oligonukleotiden werden klinische Versuche für solche Anwendungen durchgeführt. Oligonukleotide können auch als kompetetive Inhibitoren von Transkriptionsfaktoren dienen, welche mit doppelsträngiger DNA während der Regulierung der Transkription eine Wechselwirkung eingehen, so dass deren Wirkung moduliert wird. Mehrere neuere Berichte beschreiben solche Wechselwirkungen (vgl. z.B. A. Bielinska et al., Science, 250 (1990), 997-1000, und H. Wu et al., Gene, 89, (1990), 203-209).
Zusätzlich zu einer solchen Verwendung sowohl als indirekte als auch als direkte Regulatoren von Proteinen wurden Oligonukleotide und deren Analoga auch in diagnostischen Tests verwendet. Solche diagnostischen Tests können unter Verwendung von biologischen Fluiden, Geweben, intakten Zellen oder isolierten zellulären Komponenten durchgeführt werden. Wie bei der Inhibierung der Genexpression nutzen diagnostische Anwendungen das Vermögen von Oligonukleotiden und deren Analoga, mit einem komplementären Strang einer Nukleinsäure zu hybridisieren.
Oligonukleotide und deren Analoga werden auch verbreitet als Forschungsreagenzien verwendet. Sie sind für das Verständnis der Funktion vieler anderer biologischer Moleküle sowie bei der Herstellung anderer biologischer Moleküle nützlich. Beispielsweise hat die Verwendung von Oligonukleotiden und deren Analoga als Primer in PCR-Reaktionen zu einer expandierenden kommerziellen Industrie geführt. Die PCR ist zu einer Hauptstütze kommerzieller Laboratorien und Forschungslaboratorien geworden und die Anwendungen der PCR haben sich vervielfacht. Beispielsweise wird die PCR-Technologie heutzutage in den Gebieten der Forensik, der Paläontologie, bei Evolutionsstudien und bei der genetischen Beratung eingesetzt. Die Kommerzialisierung hat zur Entwicklung von Kits geführt, die Personal, das keine Ausbildung in Molekularbiologie hat, bei der Anwendung der PCR unterstützen. Oligonukleotide und deren Analoga, und zwar sowohl natürliche als auch synthetische, werden als Primer bei einer solchen PCR-Technologie verwendet.
Oligonukleotide und deren Analoga werden auch in anderen Laborverfahren eingesetzt. Mehrere dieser Anwendungen sind in üblichen Laborhandbüchern beschrieben, wie z.B. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, J. Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; und in Current Protocols In Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg., Current Publications, 1993. Solche Anwendungen umfassen synthetische Oligonukleotidsonden, das Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern und oligomeren Verbindungen, die DNA-Sequenzierung, die in vitro-Amplifizierung von DNA durch die Polymerasekettenreaktion und die ortsspezifische Mutagenese klonierter DNA, vgl. das Buch 2 von Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vorstehend. Vgl. auch „DNA-protein interactions and The Polymerase Chain Reaction" im Band 2 von Current Protocols In Molecular Biology, vorstehend. Oligonukleotide und deren Analoga wurden in der Molekularbiologie auch in verschiedenen Verfahren als Sonden, Primer, Linker, Adaptoren und Genfragmente entwickelt und verwendet.
Die weit verbreitete Verwendung solcher Oligonukleotide hat den Bedarf für schnelle, billige und effiziente Verfahren für deren Modifizierung und Synthese erhöht. Frühe synthetische Ansätze für die Oligonukleotidsynthese umfassten eine Phosphodiester- und Phosphotriesterchemie, vgl. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72 (1972), 209; Reese, Tetrahedron Lett. 34 (1978), 3143-3179. Diese Ansätze haben schließlich zu effizienten modernen Verfahren geführt, wie z.B. der Verwendung der populären Phosphoramidittechnik (vgl. z.B. Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach, S. L. Beaucage; R. P. Iyer, Tetrahedron, 48 (1992), 2223-2311, und darin zitierte Literatur), bei der ein Nukleosid oder Oligonukleotid mit einer freien Hydroxylgruppe mit einem geschützten Cyanoethylphosphoramiditmonomer in der Gegenwart einer schwachen Säure unter Bildung einer Phosphit-verknüpften Struktur umgesetzt wird. Die Oxidation der Phosphit-Verknüpfung gefolgt von einer Hydrolyse der Cyanoethylgruppe führt zu der gewünschten Phosphodiester- oder Phosphorothioatverknüpfung.
Festphasentechniken spielen weiterhin eine wichtige Rolle bei Oligonukleotidsyntheseansätzen. Typischerweise wird das am meisten 3' befindliche Nukleosid an einem festen Träger verankert, der mit Hydroxyl- oder Aminoresten funktionalisiert ist. Die zusätzlichen Nukleoside werden anschließend schrittweise zugesetzt, so dass die gewünschten Verknüpfungen zwischen der 3'-funktionellen Gruppe des eintretenden Nukleosids und der 5'-Hydroxylgruppe des trägergebundenen Nukleosids gebildet werden. Bei diesem schrittweisen Zusammenbau ist die Verwendung einer Schutzgruppe implizit, um die 5'-Hydroxygruppe des eintretenden Nukleosids unreaktiv zu machen. Nach der Kopplung wird die 5'-Hydroxygruppe durch die zweckmäßige Auswahl eines Entschützungsreagenzs entfernt.
Dichloressigsäure (DCA) ist ein gebräuchlich verwendetes Reagenz zum Entschützen von Nukleotiden während der Oligonukleotidsynthese (vgl. z.B. US 5,959,099 ). Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Dichloressigsäure bekannt. DE 610317 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Dichloressigsäure durch Umsetzen von Pentachlorethan mit Schwefelsäure. DE 852997 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Dichloressigsäure durch Umsetzen von Chloressigsäure mit Chlor. US 5,292,928 beschreibt die Herstellung von Dichloressigsäure durch Umsetzen von Dichloracetylchlorid mit Wasser. Korte und Fuchs (Chemische Berichte 1953, Band 86, Seiten 114-116) beschreiben die Herstellung von Dichloressigsäure unter Verwendung von Chloralhydrat als Ausgangsmaterial.
Da das Hinzufügen von neuen Nukleosiden die wiederholte Verwendung von Dichloressigsäure zum Entschützen der 5'-Hydroxygruppe umfasst, ist es wichtig, dass dieses Reagenz möglichst frei von kontaminierenden Substanzen ist, die Verunreinigungen verbreiten und ungeeignete Sequenzen des Zieloligonukleotids erzeugen können.
Demgemäß besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Nachweisen solcher Verunreinigungen in Dichloressigsäure. Die vorliegende Erfindung ist auf diese und auch auf andere wichtige Ziele gerichtet.
Es wurde gefunden, dass Chloralhydrat eine übliche kontaminierende Substanz in technisch hergestellter Dichloressigsäure ist. Es wurde ferner gefunden, dass Chloralhydrat mit der 5'-Hydroxygruppe von Nukleosiden während des Verlaufs einer Oligonukleotidsynthese unter Bildung unerwünschter Nebenprodukte reagiert, die, wenn überhaupt, nur unter großen Schwierigkeiten entfernt werden können. Es wurde ferner gefunden, dass Chloralhydrat in Dichloressigsäure dadurch nachgewiesen und dessen Konzentration genau gemessen werden kann, dass das Integral eines magnetischen Kernresonanz-Peaks des CH-Protons von Chloralhydrat mit einer bekannten Menge eines internen Standards verglichen wird.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden bereitzustellen, die frei von der Verunreinigung sind, die durch Chloralhydrat verursacht wird, das in Dichloressigsäure vorliegt.
Andere wichtige Aufgaben werden durch die folgende detaillierte Beschreibung deutlich.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden bereit, umfassend:

(a) Berechnen einer Konzentration von Chloralhydrat in einer Probe von Dichloressigsäure, und
(b) Inkontaktbringen eines Oligonukleotids, welches mindestens eine Schutzgruppe trägt, mit der Dichloressigsäure.

In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein analytisches Verfahren bereit, umfassend Bestimmen, ob oder ob nicht ein von einer Dichloressigsäure-Probe aufgenommenes magnetisches Kernresonanzspektrum einen mit einem CH-Proton von Chloralhydrat verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peak einschließt. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Vergleichen eines Integrals des mit einem CH-Proton von Chloralhydrat verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peaks mit einem Integral des mit mindestens einem Proton der Dichloressigsäure verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peaks. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Berechnen der Konzentration von Chloralhydrat in der Dichloressigsäure auf der Basis des Vergleichs von Integralen von magnetischen Kernresonanz-Peaks. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die berechnete Konzentration von Chloralhydrat weniger als 15 ppm. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die berechnete Konzentration von Chloralhydrat weniger als 10 ppm. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die berechnete Konzentration von Chloralhydrat weniger als 1 ppm.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner umfassen: Zugeben von mindestens einem organischen Lösungsmittel zu der Probe und Vergleichen eines Integrals des mit einem CH-Proton von Chloralhydrat verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peaks mit einem Integral des mit mindestens einem Proton des mindestens einen organischen Lösungsmittels verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peaks. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Lösungsmittel Toluol. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Berechnen der Konzentration von Chloralhydrat in der Dichloressigsäure auf der Basis des Vergleichs von Integralen von magnetischen Kernresonanz-Peaks. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die berechnete Konzentration von Chloralhydrat weniger als 15 ppm. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die berechnete Konzentration von Chloralhydrat weniger als 10 ppm. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die berechnete Konzentration von Chloralhydrat weniger als 1 ppm. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Dichloressigsäure als Entschützungsmittel in einer Oligonukleotidsynthese zur Herstellung eines Oligonukleotids der Formel (d(TpCpCpGpTpCpApTpCpGpCpTpCpCpTpCpApGpGpGp);worin P = P(O)S^–Na⁺ ist, verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, umfassend Bestimmen, ob oder ob nicht ein von einer Dichloressigsäure-Probe aufgenommenes magnetisches Kernresonanzspektrum einen mit einem CH-Proton von Chloralhydrat verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peak einschließt, welches das Inkontaktbringen eines Oligonukleotids, welches mindestens eine Schutzgruppe trägt, mit der Dichloressigsäure umfasst. In bestimmten Ausführungsformen bewirkt das Inkontaktbringen die Entfernung der mindestens einen Schutzgruppe von dem Oligonukleotid. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Oligonukleotid, von dem die Schutzgruppe entfernt worden ist, keine Gruppe mit der Formel 5'-O-CH(OH)(CCl₃). In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Oligonukleotid, von dem die Schutzgruppe entfernt worden ist, keine Gruppe mit der Formel 5'-O-CH(CCl₃)-O-.
Diese sowie andere Gegenstände sind ein Ergebnis der Erkenntnis der Erfinder, dass Chloralhydrat eine übliche Kontamination in technisch hergestellter Dichloressigsäure ist. Der hier verwendete Begriff „Chloralhydrat" soll für eine chemische Verbindung mit der Struktur Cl₃CH(OH)₂ stehen.
Der hier verwendete Begriff „Dichloressigsäure" (DCA) soll für eine chemische Verbindung mit der Struktur Cl₂HCC(=O)OH stehen.
Es ist bekannt, dass Dichloressigsäure (DCA) ein gebräuchlich verwendetes Reagenz zum Entschützen von Nukleotiden während der Oligonukleotidsynthese ist. Insbesondere umfasst die Oligonukleotidsynthese die wiederholte Verwendung von Dichloressigsäure als Entschützungsmittel zum Entschützen von 5'-Hydroxyschutzgruppen (Prot) (Schema 1):
Schema 1
Der hier verwendete Begriff „Hydroxylschutzgruppe" (Prot) soll für eine chemische Gruppe stehen, die unter bestimmten Bedingungen stabil ist, jedoch unter anderen Bedingungen entfernt werden kann. Im Allgemeinen machen Schutzgruppen chemisch-funktionelle Gruppen für spezifische Reaktionsbedingungen inert und können an solche funktionellen Gruppen in einem Molekül gebunden und von diesen entfernt werden, ohne den Rest des Moleküls wesentlich zu beschädigen. Repräsentative Hydroxylschutzgruppen sind von Beaucage et al., Tetrahedron (1992), 48, 2223-2311, und auch in Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Kapitel 2, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1991, beschrieben worden, die jeweils in ihrer Gesamtheit unter Bezugnahme einbezogen werden. Bevorzugte Schutzgruppen umfassen Dimethoxytrityl (DMT), Monomethoxytrityl, 9-Phenylxanthen-9-yl (Pixyl) und 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl (Mox).
Aufgrund der wiederholten Verwendung von DCA zur Entfernung der Oligonukleotidschutzgruppen ist es von kritischer Bedeutung, dass das DCA frei von kontaminierenden Substanzen ist, die Verunreinigungen verbreiten und ungeeignete Sequenzen des Zieloligonukleotids erzeugen können. Die Erfinder haben gefunden, dass die spezifische Verunreinigung Chloralhydrat, wenn sie in Dichloressigsäure vorliegt, unter Bildung von Nebenprodukten reagiert, die hier als Trichlorethanoladdukte 1 und 2, die nachstehend gezeigt sind (Schema 2), bezeichnet werden.
Schema 2
Die Trichlorethanoladdukte sind extrem schwierig zu entfernen, sobald sie sich gebildet haben, und wenn dahingehend keine Überprüfung durchgeführt wird, verbreiten sie sich durch jeden Syntheseschritt. Die Erfinder haben gefunden, dass variierende Konzentrationen von Chloralhydrat in Dichloressigsäure abhängig von dem bei deren Herstellung verwendeten Verfahren vorliegen können. Folglich besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart und der Konzentration von Chloralhydrat vor deren Verwendung bei der Oligonukleotidsynthese. Dabei können dann Spezifikationen für die maximalen Konzentrationen von Chloralhydrat festgelegt werden, die in einem Oligonukleotidherstellungsverfahren toleriert werden können. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die tolerierte Chloralhydratkonzentration weniger als 15 ppm, vorzugsweise weniger als 10 ppm, mehr bevorzugt weniger als 1 ppm. Insbesondere liegt die Chloralhydratkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung zum Teil ein Verfahren zum Testen von Dichloressigsäure bezüglich der Gegenwart von Chloralhydrat. Das Verfahren umfasst vorzugsweise das Aufnehmen eines magnetischen Kernresonanzspektrums (NMR-Spektrums) einer Probe der Dichloressigsäure vor deren Verwendung in einem Herstellungsverfahren. Vorzugsweise enthält die Probe eine vorgegebene Konzentration eines internen Standards. Der hier verwendete Ausdruck „interner Standard" oder „Standard" soll für jedwede Verbindung stehen, vorzugsweise für ein Lösungsmittel, das Protonen enthält, deren magnetischer Kernresonanz-Peak mit demjenigen des CH-Protons von Chloralhydrat verglichen werden kann, um die Konzentration des vorhandenen Chloralhydrats zu bestimmen. Es ist daher bevorzugt, dass die Protonen des internen Standards eine Resonanz an einer Position zeigen, die vorzugsweise hochfeld oder tieffeld von derjenigen von Chloralhydrat verschieden ist. Folglich sollte beachtet werden, dass in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung des Integrals des Peaks, der mit dem CH-Proton von Dichloressigsäure selbst verbunden ist, als der interne Standard vorgesehen ist. Wenn der interne Standard von Di-chloressigsäure verschieden ist, wird der interne Standard vorzugsweise aus geeigneten flüssigen Lösungsmitteln ausgewählt. Solche flüssigen Lösungsmittel umfassen unter anderem halogenierte Lösungsmittel, Kohlenwasserstofflösungsmittel, Etherlösungsmittel, protische oder aprotische Lösungsmittel.
Geeignete halogenierte Lösungsmittel umfassen unter anderem Bromdichlormethan, Dibromchlormethan, Bromoform, Chloroform, Bromchlormethan, Dibrommethan, Butylchlorid, Dichlormethan, Trichlorethylen, 1,1,1-Trichlorethan, 1,1,2-Trichlorethan, 1,1-Dichlor-ethan, 2-Chlorpropan, 1,2,4-Trichlorbenzol, o-Dichlorbenzol, Chlorbenzol, Fluorbenzol, Dichlorfluormethan, Chlordifluormethan und Trifluormethan.
Geeignete Kohlenwasserstofflösungsmittel umfassen unter anderem Acetonitril, Benzol, Cyclohexan, Pentan, Hexan, Toluol, Cycloheptan, Methylcyclohexan, Heptan, Ethylbenzol, m-, o-oder p-Xylol, Octan, Indan und Nonan.
Geeignete Etherlösungsmittel umfassen unter anderem Dimethoxymethan, Tetrahydrofuran, 1,3-Dioxan, 1,4-Dioxan, Furan, Diethylether, Ethylenglykol, Dimethylether, Ethylenglykoldiethylether, Diethylenglykoldimethylether, Diethylenglykoldiethylether, Triethylenglykoldi-isopropylether, Anisol oder t-Butylmethylether.
Geeignete polar-protische Lösungsmittel umfassen unter anderem Methanol, Ethanol, 2-Nitroethanol, 2-Fluorethanol, 2,2,2-Trifluorethanol, Ethylenglykol, 1-Propanol, 2-Propanol, 2-Methoxyethanol, 1-Butanol, 2-Butanol, i-Butylalkohol, t-Butylalkohol, 2-Ethoxyethanol, Diethylenglykol, 1-, 2- oder 3-Pentanol, Neopentylalkohol, t-Pentylalkohol, Cyclohexanol, Benzylalkohol, Phenol und Glycerin.
Geeignete polar-aprotische Lösungsmittel umfassen unter anderem Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMAC), 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon (DMPU), 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon (DMI), N-Methylpyrrolidinon (NMP), Formamid, N-Methylacetamid, N-Methylformamid, Acetonitril (ACN), Dimethylsulfoxid, Propionitril, Ethylformiat, Methylacetat, Hexachloraceton, Aceton, Ethylmethylketon, Ethylacetat, Isopropylacetat, t-Butylacetat, Sulfolan, N,N-Dimethylpropionamid, Nitromethan, Nitrobenzol, Hexamethylphosphoramid.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der interne Standard bezüglich einer Säure stabil. Der interne Standard ist auch vorzugsweise ein Lösungsmittel, das relativ nicht-flüchtig ist, wodurch die Möglichkeit einer Konzentrationsänderung während der Standardherstellung oder der NMR-Aufnahme minimiert wird. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der interne Standard ein aprotisches Lösungsmittel. In anderen bevorzugten Ausführungsformen weist der interne Standard ein relativ einfaches NMR-Spektrum mit vorzugsweise weniger als 4 Signalen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Lösungsmittel Toluol.
Als allgemeine Anleitung kann ein bekanntes Volumen an Dichloressigsäure (DCA) in einem bekannten Volumen an deuteriertem NMR-Lösungsmittel gelöst werden. Wenn eine zusätzliche Verbindung als interner Standard verwendet wird, d.h. eine Verbindung, die dem NMR-Röhrchen zum Zwecke des Vergleichens des Integrals des Standards mit dem Integral von Chloralhydrat zugesetzt wird, kann sie in einer Konzentration von z.B. etwa 40 ppm zugesetzt werden. Das ¹H-NMR kann dann unter Verwendung jedweden NMR-Spektrometers aufgenommen werden, das Bedingungen bereitstellen kann, die für die Erfassung eines Resonanzsignals für jede Komponente geeignet sind. Das Verhältnis von Chloralhydrat zu Di-chloressigsäure wird vorzugsweise durch Vergleichen des Integrals (der Fläche) des CH-Protons am Chloralhydrat mit dem Integral des internen Standards erhalten. Dem Fachmann ist klar, dass die Konzentration von Chloralhydrat in Dichloressigsäure dann unter Verwendung des Verhältnisses berechnet werden kann, das mittels eines Integralvergleichs, der Konzentration von Dichloressigsäure und der Konzentration von jedwedem verwendeten internen Standard erhalten worden ist. Die Dichloressigsäure kann dann entsprechend verwendet werden.
Sobald die Reinheit der Dichloressigsäure mit den hier beschriebenen Verfahren bestimmt worden ist, kann sie anschließend für nahezu jegliche Zwecke verwendet werden. Insbesondere kann die Dichloressigsäure in einer Oligonukleotidsynthese zur Herstellung eines Oligonukleotids verwendet werden.
„Oligonukleotid" bezieht sich hier auf Verbindungen, die eine Mehrzahl von monomeren Untereinheiten enthalten, die durch Phosphor-enthaltende Verknüpfungen, wie z.B. Phosphit-Phosphodiester-, Phosphorothioat- und/oder Phosphorodithioat-Verknüpfungen, verbunden sind. Die monomeren Untereinheiten können sowohl natürlich vorkommende (d.h. „natürliche") als auch nicht-natürlich vorkommende synthetische Reste enthalten, wie z.B. nukleosidische Untereinheiten, die modifizierte Zucker- und/oder Nukleobaseabschnitte enthalten. Folglich umfasst der Begriff Oligonukleotid Oligonukleotide, deren Analoga und synthetische Oligonukleotide. Solche Oligonukleotidanaloga sind typischerweise strukturell von natürlich vorkommenden oder synthetischen Wildtyp-Oligonukleotiden unterscheidbar und dennoch funktionell damit austauschbar. Folglich umfassen Oligonukleotidanaloga alle diejenigen Strukturen, die dahingehend effektiv wirken, die Struktur und/oder die Funktion eines gewünschten RNA- oder DNA-Strangs nachzuahmen, z.B. durch die Hybridisierung an ein Ziel. Der Begriff synthetisches Nukleosid bezieht sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auf ein modifiziertes Nukleosid. Repräsentative Modifizierungen umfassen die Modifizierung eines heterocyclischen Basenabschnitts eines Nukleosids, so dass eine nicht natürlich vorkommende Nukleobase erhalten wird, eines Zuckerabschnitts eines Nukleosids oder von beiden gleichzeitig.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hat das Oligonukleotid, das unter Verwendung von Dichloressigsäure als Entschützungsmittel hergestellt worden ist, welches gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung getestet worden ist, die Formel: (d(TpCpCpGpTpCpApTpCpGpCpTpCpCpTpCpApGpGpGp);worin P = P(O)S^–Na⁺ ist.
„Oligonukleotidsynthese" soll hier die in der Fachwelt anerkannte Bedeutung haben, wobei dadurch ein Oligonukleotid unter Verwendung von Syntheseverfahren hergestellt wird, die dem Fachmann bekannt sind. Als allgemeine Anleitung kann das am meisten 3' liegende Nukleosid an einem festen Träger verankert werden, der mit Hydroxyl- oder Aminoresten funktionalisiert ist. Die zusätzlichen Nukleoside können anschließend schrittweise hinzugefügt werden, so dass die gewünschten Verknüpfungen zwischen der 3'-funktionellen Gruppe des eintretenden Nukleosids und der 5'-Hydroxylgruppe des trägergebundenen Nukleosids gebildet werden. In jedem Fall nutzt die ausgewählte Oligonukleotidsynthese vorzugsweise eine Schutzgruppe, um bestimmte Gruppen, wie z.B. die 5'-Hydroxygruppe des eintretenden Nukleosids, unreaktiv zu machen. Nach dem Koppeln kann die 5'-Hydroxyschutzgruppe dann durch die Zugabe von Dichloressigsäure, die bezüglich des Chloralhydratgehalts getestet worden ist, entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung von Oligonukleotiden, die frei von Nebenprodukten sind, die durch die Verwendung von Dichloressigsäure, die mit Chloralhydrat kontaminiert ist, verursacht werden. Ein solches Nebenprodukt ist ein Trichlorethanoladdukt, welches das Ergebnis der Reaktion des Chloralhydrats mit der 5'-Hydroxygruppe ist (Schema 2). Folglich soll der Begriff „Trichlorethanoladdukt" hier für ein Nukleosid stehen, bei dem die 5'-Hydroxygruppe mit Chloralhydrat mit dem Rest HOCH(CCl₃)-O-CH₂-* unter Bildung einer Verunreinigung reagiert hat, wobei * den Bindungspunkt an die 5'-Position eines Nukleosids angibt. Es sollte beachtet werden, dass nach der Reaktion mit einem eintretenden Nukleosid zur Bildung eines Oligonukleotids das Ethanoladdukt die Struktur P-O-CH(CCl₃)-O-CH₂* in einem Oligonukleotid aufweisen wird, wobei P das Phosphoratom des eintretenden Nukleosids ist.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotids bereit, das frei von dem Trichlorethanoladdukt ist. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren das Testen von Dichloressigsäure bezüglich der Gegenwart von Chloralhydrat vor der Verwendung als Entschützungsmittel. Wenn Chloralhydrat vorliegt, kann die Konzentration durch Aufnehmen eines NMR und Vergleichen des Integrals des magnetischen Kernresonanz-Peaks des CH-Protons von Chloralhydrat mit dem Integral des magnetischen Kernresonanz-Peaks von Protonen eines internen Standards zur Bestimmung der Konzentration von Chloralhydrat, die in der Dichloressigsäure vorliegt, bestimmt werden, und die Dichloressigsäure wird verwendet, wenn die Konzentration des Chloralhydrats unterhalb einer akzeptablen Schwellenkonzentration liegt. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die akzeptable Konzentration von Chloralhydrat in der Dichloressigsäure weniger als 15 ppm, vorzugsweise weniger als 10 ppm, mehr bevorzugt 5 ppm und noch mehr bevorzugt weniger als 1 ppm. Insbesondere liegt die Konzentration des Chloralhydrats unterhalb der Nachweisgrenze.
Die hier beschriebenen Oligonukleotide können unter Verwendung eines festen Trägers synthetisiert werden. Feste Träger sind Substrate, die als Festphase bei Festphasensyntheseverfahren dienen können, wie sie z.B. in den US-Patenten 4,415,732, 4,458,066, 4,500,707, 4,668,777, 4,973,679 und 5,132,418 von Caruthers und den US-Patenten 4,725,677 und Re. 34,069 von Koster beschrieben sind. Linker sind in dem Fachgebiet als kurze Moleküle bekannt, die dazu dienen, einen festen Träger mit funktionellen Gruppen (z.B. Hydroxylgruppen) anfänglicher Synthonmoleküle in Festphasensynthesetechniken zu verbinden. Geeignete Linker sind z.B. in Oligonucleotides And Analogues, A Practical Approach, F. Ekstein, Hrsg., IRL Press, N.Y., 1991, Kapitel 1, Seiten 1-23, beschrieben.
Geeignete Träger gemäß der Erfindung umfassen diejenigen, die in dem Fachgebiet allgemein dafür bekannt sind, dass sie zur Verwendung in Festphasenverfahren geeignet sind, einschließlich z.B. Glas mit eingestellter Porengröße (CPG), Oxalyl-Glas mit eingestellter Porengröße (vgl. z.B. Alul et al., Nucleic Acids Research (1991), 19, 1527), TantaGel Support – ein Aminopolyethylenglykol-derivatisierter Träger (vgl. z.B. Wright et al., Tetrahedron Letters (1993), 34, 3373, und Poros – ein Copolymer von Polystyrol/Divinylbenzol.
Nach der Reaktion mit einem eintretenden Nukleosid kann das Phosphoratom geschwefelt werden. Schwefelungsmittel, die während der Oxidation zur Bildung von Phosphorothioat- und Phosphorodithioat-Verknüpfungen verwendet werden, umfassen Beaucage-Reagenz (vgl. z.B. R. P. Iyer et al., J. Chem. Soc. (1990) 112, 1253-1254, und R. P. Iyer et al., J. Org. Chem. (1990) 55, 4693-4699); Tetraethylthiuramdisulfid (vgl. z.B. H. Vu, B. L. Hirschbein, Tetrahedron Lett. (1991) 32, 3005-3008); Dibenzoyltetrasulfid (vgl. z.B. M. V. Rao et al., Tetrahedron Lett. (1992) 33, 4839-4842); Di(phenylacetyl)disulfid (vgl. z.B. P. C. J. Kamer, Tetrahedron Lett., 1989, 30, 6757-6760); Bis(O,O-diisopropoxyphosphinothioyl)disulfide (vgl. Stec et al., Tetrahedron Lett., 1993, 34, 5317-5320); 3-Ethoxy-1,2,4-dithiazolin-5-on (vgl. Nucleic Acids Research, 1996, 24, 1602-1607, und Nucleic Acids Research (1996) 24, 3643-3644); Bis(p-chlorbenzolsulfonyl)disulfid (vgl. Nucleic Acids Research (1995) 23, 4029-4033); Schwefel, Schwefel in einer Kombination mit Liganden, wie z.B. Triaryl-, Trialkyl-, Triaralkyl- oder Trialkarylphosphinen.
Andere geeignete Oxidationsmittel, die zur Bildung der Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Verknüpfungen verwendet werden, umfassen Iod/Tetrahydrofuran/Wasser/Pyridin oder Wasserstoffperoxid/Wasser oder tert-Butylhydroperoxid oder jedwede Persäure, wie z.B. m-Chlorperbenzoesäure. In dem Fall der Schwefelung wird die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen unter Ausschluss von Luft, insbesondere Sauerstoff, durchgeführt, wohingegen die Reaktion in dem Fall der Oxidation unter wässrigen Bedingungen durchgeführt werden kann.
Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga, die unter Verwendung von Dichloressigsäure hergestellt worden sind, die gemäß der vorliegenden Erfindung getestet worden ist, können an ein spezifisches Ziel hybridisierbar sein und umfassen vorzugsweise etwa 5 bis etwa 50 Monomeruntereinheiten. Es ist mehr bevorzugt, dass solche Verbindungen etwa 10 bis etwa 30 Monomeruntereinheiten umfassen, wobei 15 bis 25 Monomeruntereinheiten besonders bevorzugt sind. Wenn sie als Aufbaueinheiten beim Aufbau größerer oligomerer Verbindungen verwendet werden, sind kleinere oligomere Verbindungen bevorzugt. Bibliotheken von dimeren Verbindungen, trimeren Verbindungen oder Verbindungen höherer Ordnung können zur Verwendung als Synthons in den Verfahren der Erfindung hergestellt werden. Die Verwendung kleiner Sequenzen, die mittels Lösungsphasenchemie synthetisiert worden sind, in der automatisierten Synthese größerer Oligonukleotide erhöht die Kopplungseffizienz und die Reinheit der Oligonukleotid-Endprodukte, vgl. z.B. K. Miura et al., Chem. Pharm. Bull. (1987), 35, 833-836; G. Kumar und M. S. Poonian, J. Org. Chem. (1984) 49, 4905-4912; W. Bannwarth, Helvetica Chimica Acta (1985) 68, 1907-1913; A. Wolter et al., Nucleosides and nucleotides, 1986, 5, 65-77.
Es sollte beachtet werden, dass die Oligonukleotide, die unter Verwendung von Dichloressigsäure, die erfindungsgemäß getestet worden ist, hergestellt worden sind, in der Diagnostik, in der Therapie und als Forschungsreagenzien und Kits verwendet werden können. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Einbeziehen eines geeigneten pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels oder Trägers verwendet werden. Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Nachweis von Chloralhydrat in Dichloressigsäure
Eine Testprobe von Dichloressigsäure (DCA, 0,15 ml) wurde in deuteriertem Acetonitril (0,5 ml), das 40 ppm Toluol enthielt, gelöst. ¹H-NMR-Spektren wurden unter Verwendung eines Varian Unity 400 NMR-Spektrometers unter den folgenden Bedingungen aufgenommen: 30°-Puls, Abtastbreite von 6997,9 Hz, 32k komplexe Punkte und 45 Sekunden Gesamtrezyklierungsverzögerung. Für jede Probe wurden etwa 1000 Übergänge durchgeführt. Die Daten wurden durch „zero filling" bis 64k komplexe Punkte mit einer exponentiellen Linienverbreiterung von 0,3 Hz verarbeitet. Die ersten zwei Punkte wurden durch „linear prediction" zu einer glatten Grundlinie reproduziert und nach der FFT durch eine Kurvenanpassung weiter geglättet.
Die Konzentration von Chloralhydrat wurde durch Vergleichen des Peaks, der mit dem CH-Proton von Chloralhydrat verbunden ist, mit dem Peak der CH₃-Gruppe von Toluol gemessen. Dichloressigsäure wurde dann verwendet, um das 20mer gemäß dem Verfahren herzustellen, das im Beispiel 2 beschrieben ist.
Beispiel 2
Herstellung von (d(TpCpCpGpTpCpApTpCpGpCpTpCpCpTpCpApGpGpGp); wobei P = P(O)S^–Na⁺
Ein 5'-O-DMT-N²-Isobutyryl-2'-desoxyguanosin-derivatisierter Primer HL30-Träger wurde in einen Stahlreaktorbehälter eingebracht. Eine Lösung von Dichloressigsäure in Toluol (10 %, v/v) wurde zugesetzt, um die geschützte Hydroxygruppe zu entschützen und das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen. Eine Lösung von 5'-O-DMT-N²-Isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit (0,2 M) und eine Lösung von 1-H-Tetrazol in Acetonitril (0,45 M) wurden zugesetzt und 5 min bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Eine Lösung von Phenylacetyldisulfid in 3-Picolin-Acetonitril (0,2 M, 1:1, v:v) wurde zugesetzt und 2 min bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das Produkt wurde mit Acetonitril (1:4, v/v) und N-Methylimidazol-Pyridin-Acetonitril (2:3:5, v/v/v) gewaschen. Nach 2 min wurde das Cappinggemisch durch Waschen des Produkts mit Acetonitril entfernt.
Eine Lösung von Dichloressigsäure in Toluol (3 %, v/v) wurde zugesetzt, um die 5'-Hydroxygruppe zu entschützen, und das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen. Eine Lösung von 5'-O-DMT-N²-Isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit (0,2 M) und eine Lösung von 1-H-Tetrazol in Acetonitril (0,45 M) wurden zugesetzt und 5 min bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Eine Lösung von Phenylacetyldisulfid in 3-Picolin-Acetonitril (0,2 M, 1:1, v:v) wurde zugesetzt und 2 min bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das Produkt wurde mit Acetonitril und dann mit einem Cappinggemisch (1:1, v/v) aus Essigsäureanhydrid-Acetonitril (1:4, v:v) und N-Methylimidazol-Pyridin-Acetonitril (2:3:5, v/v/v) gewaschen. Nach 2 min wurde das Cappinggemisch durch Waschen des Produkts mit Acetonitril entfernt.
Das Verfahren des Entschützens der 5'-Hydroxylgruppe, des Zugebens eines Phosphoramidits und eines Aktivierungsmittels, des Schwefelns und des Capping mit dazwischenliegenden Waschzyklen wurde für 17 zusätzliche Zyklen wiederholt, um das 20mer herzustellen. Das resultierende Träger-gebundene Oligonukleotid wurde 12 Stunden bei 60°C mit wässrigem Ammoniumhydroxid (30 %) behandelt und die Produkte wurden filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und eine Lösung des Rückstands in Wasser wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Eine Lösung des Rückstands in Wasser wurde 45 min mit einer wässrigen Natriumacetatlösung (pH 3,5) behandelt. Das in der Überschrift genannte 2'-Desoxyphosphorothioat-20mer-Oligonukleotid wurde nach dem Ausfällen durch Zugeben von Ethanol gesammelt.
Dem Fachmann ist klar, dass die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vielfältig verändert und modifiziert werden können.

Claims

Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden, umfassend (a) Berechnen einer Konzentration von Chloralhydrat in einer Probe von Dichloressigsäure, und (b) Inkontaktbringen eines Oligonukleotids, welches mindestens eine Schutzgruppe trägt, mit der Dichloressigsäure, wenn die berechnete Konzentration von Chloralhydrat geringer ist als die maximal tolerierbare Konzentration.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend (a) Bestimmen, ob oder ob nicht ein von einer Dichloressigsäure-Probe aufgenommenes magnetisches Kernresonanzspektrum einen mit einem CH-Proton von Chloralhydrat verbundenen magnetischen Kernresonanz-Peak einschließt, (b) Berechnen einer Konzentration von Chloralhydrat in der Dichloressigsäure, und (c) Inkontaktbringen eines Oligonukleotids, welches mindestens eine Schutzgruppe trägt, mit der Dichloressigsäure.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Inkontaktbringen das Entfernen der mindestens einen Schutzgruppe von dem Oligonukleotid bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid, von welchem die Schutzgruppe entfernt worden ist, keine Gruppe mit der Formel 5'-O-CH(OH)(CCl₃) einschließt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid, von welchem die Schutzgruppe entfernt worden ist, keine Gruppe mit der Formel 5'-O-CH(CCl₃)-O- einschließt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Dichloressigsäure als Entschützungsmittel in einer Oligonukleotid-Synthese verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schutzgruppe eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die berechnete Konzentration von Chloralhydrat geringer als 15 ppm ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die berechnete Konzentration von Chloralhydrat geringer als 10 ppm ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die berechnete Konzentration von Chloralhydrat geringer als 1 ppm ist.
Verfahren nach Anspruch 8, Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei das Oligonukleotid die Formel d(TpCpCpGpTpCpApTpCpGpCpTpCpCpTpCpApGpGpGp) aufweist, wobei P = P(O)S^–Na⁺.
Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Oligonukleotide durch die Verwendung eines festen Tägers synthestisiert werden.