RU2011141720A

RU2011141720A - Молекулярное обнаружение, основанное на абскрипции

Info

Publication number: RU2011141720A
Application number: RU2011141720/10A
Authority: RU
Inventors: Мишель М. ХАННА; Дэвид МАККАРТИ
Original assignee: Рибомед Байотекнолоджиз, Инк.
Priority date: 2009-03-15
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2013-04-27
Also published as: EP2408935A2; EP2408935A4; WO2010107716A2; JP2012520086A; CA2755668A1; US20100233709A1; IL215164A0; AU2010225937A1; WO2010107716A3; ZA201107560B; AU2010225937B2; US8263339B2; MX2011009736A; CN102421914A; KR20120007002A

Abstract

1. Способ обнаружения, по крайней мере, одного полинуклеотида-мишени в образце, включающий:a) приведение в контакт образца, содержащего, по крайней мере, один полинуклеотид, с парой праймеров, которая специфически гибридизуеся и амплифицирует последовательность-мишень, по крайне мере, одного полинуклеотида, где пара праймеров состоит из:i) первого праймера, включающего(1) 3′-последовательность, комплементарную первой последовательности, фланкирующей последовательность-мишень полинуклеотида, и(2) 5′-метку захвата;иii) второго праймера, включающего:(1) 3′-последовательность, комплементарную второй последовательности, фланкирующей последовательность-мишень полинуклеотида, и(2) 5′-последовательность, которая обеспечивает средства для направления абскрипции;b) амплификацию последовательности-мишень с помощью первого и второго праймеров;c) приведение в контакт амплифицированной последовательности-мишени с иммобилизованной молекулой, которая связывает 5′-метку захвата, тем самым захватывая амплифицированную последовательность-мишень полинуклеотида;d) транскрипцию, по крайней мере, одного абскрипта со средства для направления абскрипции;иe) обнаружение, по крайне мере, одного абскрипта, транскрибированного на стадии d).2. Способ по п.1, в котором несвязанные реагенты, праймеры и полинуклеотиды вымывают из иммобилизованных и захваченных полинуклеотидов перед последующей стадией.3. Способ по п.1, в котором амплификация состоит в проведении полимеразной цепной реакции.4. Способ по п.3, в котором полимеразную цепную реакцию проводят с, по крайней мере, одной из термостабильной ДНК-полимеразы и термостабильной РНК-полим�

Claims

1. Способ обнаружения, по крайней мере, одного полинуклеотида-мишени в образце, включающий:

a) приведение в контакт образца, содержащего, по крайней мере, один полинуклеотид, с парой праймеров, которая специфически гибридизуеся и амплифицирует последовательность-мишень, по крайне мере, одного полинуклеотида, где пара праймеров состоит из:

i) первого праймера, включающего

(1) 3′-последовательность, комплементарную первой последовательности, фланкирующей последовательность-мишень полинуклеотида, и

(2) 5′-метку захвата;

и

ii) второго праймера, включающего:

(1) 3′-последовательность, комплементарную второй последовательности, фланкирующей последовательность-мишень полинуклеотида, и

(2) 5′-последовательность, которая обеспечивает средства для направления абскрипции;

b) амплификацию последовательности-мишень с помощью первого и второго праймеров;

c) приведение в контакт амплифицированной последовательности-мишени с иммобилизованной молекулой, которая связывает 5′-метку захвата, тем самым захватывая амплифицированную последовательность-мишень полинуклеотида;

d) транскрипцию, по крайней мере, одного абскрипта со средства для направления абскрипции;

и

e) обнаружение, по крайне мере, одного абскрипта, транскрибированного на стадии d).

2. Способ по п.1, в котором несвязанные реагенты, праймеры и полинуклеотиды вымывают из иммобилизованных и захваченных полинуклеотидов перед последующей стадией.

3. Способ по п.1, в котором амплификация состоит в проведении полимеразной цепной реакции.

4. Способ по п.3, в котором полимеразную цепную реакцию проводят с, по крайней мере, одной из термостабильной ДНК-полимеразы и термостабильной РНК-полимеры.

5. Способ по п.1, в котором 5′-метка захвата представляет собой биотин, и молекула, которая связывается с 5′-меткой захвата, представляет собой стрептавидин.

6. Способ по п.1, в котором молекула, которая связывается с 5′-меткой захвата, является иммобилизованной на твердой подложке, выбранной из магнитного шарика и микротитровального планшета.

7. Способ по п.1, в котором детектируемо меченный нуклеотид включают в, по крайне мере, один абскрипт в ходе стадии d).

8. Способ по п.7, в котором детектируемо меченный нуклеотид представляет собой флуоресцентный нуклеотид.

9. Способ по п.1, в котором обнаружение, по крайней мере, одного абскрипта включает масс-спектрометрию, капиллярный электрофорез или тонкослойную хроматографию.

10. Способ по п.1, в котором, по крайней мере, один абскрипт имеет 3-20 нуклеотидов в длину.

11. Способ по п.10, в котором, по крайней мере, один абскрипт имеет 3 нуклеотида в длину.

12. Способ по п.1, в котором средство для направления абскрипции включает APC.

13. Способ по п.1, в котором средство для направления абскрипции включает:

i) 5′-последовательность α-TAP, которая идентифицирует уникальный CpG-островок; и

ii) синтетический нуклеотид между 5′-последовательностью α-TAP и 3′-последовательностью, комплементарной второй последовательности, фланкирующей последовательность-мишень;

и стадия d) включает:

i) гибридизацию зонда с амплифицированной последовательностью мишенью, в которой зонд включает 5′-последовательность TAP, комплементарную последовательности α-TAP и 3′ APC;

ii) транскрипцию, по крайней мере, одного абскрипта с APC.

14. Способ по п.13, в котором синтетический нуклеотид предотвращает репликацию α-TAP в ходе амплификации, и, таким образом, последовательность α-TAP остается одноцепочечной в ходе стадий от a) до c).

15. Способ по п.14, в котором синтетический нуклеотид представляет собой этено-дезоксиаденозин.

16. Способ по п.1, в котором, по крайней мере, один полинуклеотид-мишень включает множество различных полинуклеотидов-мишеней, и стадии от a) до e) проводят одновременно с множеством пар первого и второго праймеров, причем каждая пара праймеров специфически гибридизуется с отличной мишенью.

17. Способ по п.16, в котором средство для направления абскрипции производит уникальный абскрипт для каждой из множества мишеней.

18. Способ по п.17, в котором уникальные APC являются отличимыми друг от друга по молекулярной массе или нуклеотидной последовательности.

19. Способ по п.16, в котором множество различных мишеней включает, по крайней мере, 10 различных мишеней.

20. Способ по п.1, в котором, по крайней мере, один полинуклеотид-мишень представляет собой метилированный CpG-островок, и образец включает изолированные фрагменты метилированной геномной ДНК.

21. Способ по п.20, в котором фрагменты метилированной геномной ДНК изолируются путем:

a) расщепления образца геномной ДНК, содержащего, по крайней мере, один метилированный полинуклеотид-мишень, ферментом рестрикции, который не расщепляет CpG-островок полинуклеотида-мишени;

b) приведение в контакт расщепленной геномной ДНК с иммобилизованным MBD, тем самым иммобилизуя метилированную геномную ДНК из образца; и

c) при необходимости выделения метилированной геномной ДНК из иммобилизованного MBD,

тем самым, изолируя фрагменты метилированной геномной ДНК.

22. Способ по п.21, в котором MBD представляет собой слитый белок GST-MBD2.

23. Способ по п.22, в котором слитый белок GST-MBD2 является иммобилизованным на содержащей глутатион твердой подложке.