MX2011009736A - Deteccion molecular basada en tecnologia abscript. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para detectar biomarcadores basados en la tecnología de transcripción abortiva, Tecnología Abscript. Particularmente, la presente invención proporciona métodos libres de bisulfato para detectar la mutilación de las islas de CpG de pequeñas muestras de ADN. Los métodos son apropiados para proceso múltiplex y pueden usarse para analizar múltiples islas de CpG de una muestra simple a corto tiempo.

Description

DETECCIÓN MOLECULAR BASADA EN ABSCRIPTION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a proporcionar métodos para detectar biomarcadores basados en la tecnología de transcripción abortiva, Abscription®. También proporciona métodos libres de bisulfato para detectar la metilación de las islas de CpG de pequeñas muestras de ADN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer se evita activamente a través de la expresión de numerosos genes supresores de tumores que regulan el ciclo de división celular y median las interacciones entre las células. Los estudios de tumores benignos y malignos muestran que el cáncer se desarrolla a través de un proceso de múltiples etapas en donde los cambios aleatoriamente acumulados mejoran la expresión de los proto-oncogenes o reducen la expresión o función de los genes reparadores del ADN. Las mutaciones somáticas cuentan para algunos de estos cambios en los genes reparadores del ADN y supresores de tumores. Sin embargo, ha llegado a ser recientemente aparente que los cambios epigenéticos, tales como la hipometilación e hipermetilación del ADN, también juegan un gran rol en el desarrollo del cáncer a través de la inactivación o mejora de los supresores de tumores o proto-oncogenes. La hipermetilación de las islas del promotor CpG ocurre en una etapa temprana del desarrollo del cáncer y se encuentra en virtualmente todos los tumores haciéndolo potencialmente muy útil como un marcador diagnóstico, permitiendo que el cáncer sea detectado no invasivamente en las etapas tempranas cuando el tratamiento es más efectivo. Por ejemplo, la hipermetilación de la región promotora de los genes tales como quínasa DAP, p16 y MGMT se ha detectado en el esputo de los fumadores por más de 3 años antes del diagnóstico de carcinoma de pulmón de células escamosas (Belinsky et a ' l. (2006). Cáncer Res. 66:3338-44, Palmisano eí al. 2000. Cáncer Res. 60:5954-8). Similarmente, la hipermetilación de un panel pequeño de genes puede ser un indicador de detección temprana valuable para el cáncer de pulmón de células pequeñas. La hipermetilación de un panel pequeño de genes se detectó en las etapas tempranas del cáncer de mama pero no se detectó en el tejido de la mama normal o normal benigno Krassenstein ef al. (2004). Clin Cáncer Res. 10:28-32.

La metilación de las citoquinas en las islas CpG es un evento temprano en la mayoría de los cánceres que conducen a la expresión reducida de muchos genes, incluyendo los genes supresores de tumores. Las encuestas de la metilación de la isla CpG en el ADN de la célula tumoral sugieren que este cambio epigenético es común, lo suficiente para competir con el impacto de la mutación en el progreso de tumores. La detección temprana de la metilación anormal puede conducir al análisis regular y diagnóstico temprano cuando el tratamiento es más efectivo. Los cambios epigenéticos tempranos son comúnmente detectables en el suero de la sangre u otros fluidos corporales (orina, esputo, saliva), no justo en el tejido tumoral por sí mismo, que significa que la prueba de diagnóstico epigenético puede hacerse en forma no invasiva usando estos fluidos. Las pruebas de diagnóstico basadas en la metilación de la isla CpG también pueden usarse para el desarrollo de fármacos, identificación de poblaciones de pacientes que responderán a estos fármacos y monitoreo post tratamiento.

Las mejoras recientes en la sensibilidad de la detección y elucidación de las firmas de metilación para cánceres específicos se han hecho factibles para la determinación de tumores mediante el muestreo del ADN de los fluidos corporales. Las células tumorales liberan el ADN en la sangre de un estado relativamente temprano de la enfermedad. De 3% a más del 90% del ADN en la sangre de pacientes con cáncer se ha encontrado que es de origen tumoral (Kim ef al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:2363-70. El desarrollo de las pruebas de metilación basadas en PCR ha hecho posible detectar la presencia de tumores no invasivos en la sangre, esputo y orina. En un estudio, la detección de metilación fue más sensible que la citología de orina en detectar las células pre malignas aberrantes. Las sensibilidades clínicas (la proporción de los casos confirmados detectados) son típicamente bajas en las pruebas de muestras sanguíneas usando un solo marcador de metilación. Sin embargo, la especificidad clínica (la proporción de controles normales que prueban lo negativo) de muestras sanguíneas alcanza 100%. Las sensibilidades clínicas deben incrementarse con las pruebas de metilación que valoran más de una sola isla CpG.

La apariencia de ADN anormalmente metilado en los fluidos corporales por sí mismo no ayudan a señalar que órgano se afecta por un tumor. Sorpresivamente, se necesita poca información para establecer el origen del tejido de un tumor. Numerosos estudios de análisis de metilación han establecido las firmas de metilación, colecciones de islas de CpG metilado que se asocian fuertemente con los cánceres de órganos particulares. En una prueba, la metilación aberrante de 3 a 4 islas CpG candidatas fue suficiente para identificar del 70-90% de los tipos de cáncer (Esteller et al. (2001 ) Cáncer Res. 61 :3225-9). Los perfiles de metilación desarrollados para tumores primarios podrían aplicarse a las líneas celulares tumorales para identificar exactamente el origen del tejido de sus tumores madre (Graziano eí al. (2004) Clin. Cáncer Res. 10:2784). Este resultado sugiere que las firmas de metilación de diferentes tipos de tumor no son grandemente afectadas por las presiones selectivas asociadas con el crecimiento en el cultivo. La disponibilidad de los perfiles de metilación grandemente mejorará la habilidad para detectar el cáncer en órganos inaccesibles a través de una prueba de sangre simple.

La detección de la metilación en muestras clínicas habilitaría la detección temprana de cáncer. El desarrollo de pruebas de detección múltiples sensibles y simples permitiría las muestras clínicas pequeñas para ser perfiladas para el estado de islas CpG múltiples. Esta clase de información será valiosa en el diagnóstico y tratamiento.

Métodos para la Detección de la Metilación del ADN Un número de métodos se han usado para detectar el CpG metilado (mCpG) en el ADN blanco. Los tres métodos primarios en el uso corriente se detallan posteriormente.

Métodos de Bisulfito. Los métodos de detección de metilación más comúnmente usados se basan en la modificación de bisulfito del ADN, resultando en la desaminación de los residuos de citoquina a uracilo mientras se dejan las citoquinas metiladas sin cambio. En la amplificación PCR, la citoquina metilada se copia a la citoquina y el uracilo se copia ala timina. Como un resultado, la retención de citoquina en una posición específica indica la metilación. El ADN modificado posteriormente se analiza, por ejemplo, mediante análisis de secuencia, el PCR de metilación específica (MSP) (Hermán et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93:9821-26), o hibridación {por ejemplo, una micro prueba o transferencia). En MSP, un par de iniciadores de oligonucleótidos de metilación específica se agrega al ADN tratado con bisulfito y la PCR se realiza para amplificar el ADN blanco. La PCR cuantitativa de tiempo real basada en fluorescencia también puede realizarse en el ADN modificado con bisulfito (Eads ef al. (2000) Nucí. Acids Res. 28:E32; Zeschnigk et al. (2004) Nucí. Acids Res. 32:e125).

Las variantes basadas en fluorescencia, calibradas de PCR en tiempo real de explotación MSP para proporcionar la cuantificación de la cantidad de ADN metilado en una muestra. Una suposición subyacente importante de estos métodos basados en PCR es que los pocos sitios CpG que se reconocen por los iniciadores/sondas reflejan el estado total de la isla CpG blanco. Mientras esto es usualmente verdadero para las islas completamente no metiladas o pesadamente metiladas, los blancos parcialmente metilados no son probablemente rápidamente marcados en las reacciones específicas no metiladas o metiladas.

Una ventaja de la modificación de bisulfito es que diferenciálmente marca los sitios no metilados contra los metilados permitiendo los métodos de secuenciación para detectar los patrones de metilación. La secuenciación del ADN tratado con bisulfito clonado es el método más comúnmente usado para la detección de la metilación. Proporciona información en el suceso del tratamiento del bisulfito además de muestrear un mayor número de sitios CpG que los métodos basados en MSP. Debido a su complejidad y gasto, sin embargo la secuenciación de bisulfito es mejor adecuada para el descubrimiento de marcadores que los diagnósticos iniciales. El tratamiento de bisulfito destruye un gran porcentaje del ADN de entrada, resultando en sensibilidad limitada y un requerimiento para grandes cantidades de ADN. Las valoraciones de control de calidad del ADN tratado con bisulfito son necesarias antes de realizar una prueba de detección para evitar los resultados engañosos. Existe un potencial de resultados falsos-positivos para las pruebas basadas en MSP debido a la desaminación de citoquina incompleta durante el tratamiento con bisulfito. La amplificación del ADN tratado con bisulfito se afecta por la inclinación de PCR favoreciendo el ADN no metilado. Mientras este problema puede corregirse usualmente mediante optimizar las condiciones de alineación del iniciador, puede complicar la prueba y el diseño del iniciador. Las inclinaciones de la plantilla pueden eliminarse con el uso de PCR de bisulfito digital. La dilución de la muestra de ADN a un promedio de menos que una copia por reacción elimina la competición entre las plantillas. Las moléculas individuales pueden secuenciarse sin inclinaciones introducidas por la clonación.

Los equipos comerciales, los reactivos y los sistemas que emplean el tratamiento de bisulfito para analizar el mCpG están disponibles. Los epigenéticos (Berlín) ofrecen dos variantes de la prueba Meti Luz, las adaptaciones de PCR en tiempo real cuantitativa, llamado Meti Luz Cuantitativo (QM) y Metilo Pesado (HM). El QM usa sondas Taqman® para generar una señal fluorescente. Durante el curso de amplificación, el flúor se penetra desde la sonda Taqman® resultando en fluorescencia que puede detectarse en tiempo real (Wojdacz & Dobrovic (2007) Nucí. Acids Res. 35:e41 ). HM es una adaptación de QM en el cual los oligonucleótidos bloqueadores se agregan a la reacción. Estos oligonucleótidos bloqueadores previenen la amplificación del ADN no metilado, resultando en sensibilidad de la prueba incrementada (Cottrell et al. (2004) Nucí. Acids Res. 32:e10). Pyrosequencing® también se usa para la cuantificación de metilación del ADN modificado con bisulfito, como se ejemplifica por el sistema Pyro Q-CpG™ de Biotage (Uppsala, Sweden; Tost ef al. (2003) Biotechniques 35:152-56). ' Aunque la modificación de bisulfito es ampliamente usada, la degradación del ADN extensiva causa que pueda introducir errores de muestreo cuando pocas moléculas son lo suficientemente largas para ser amplificadas (Ehrich et al. (2007) Nucí. Acids Res. 35:e29). Por lo tanto, las pruebas son de consumo del tiempo, requieren una etapa de desnaturalización y tienen una alta probabilidad de resultados falsos-positivos debido a la desaminación de citoquina incompleta durante el tratamiento de bisulfito.

Métodos de Digestión de Enzima de Restricción Sensible a la Metilación. Un segundo tipo de método para detectar mCpG en el ADN confía en la penetración diferencial mediante las endonucleasas de restricción. El ADN se trata con un MSRE, por sus siglas en inglés (endonucleasa de restricción sensible a la metilación) o un MDRE (endonucleasa de restricción dependiente de la metilación), amplificada y posteriormente analizada por la micro serie o electroforesis de gel. Los MSREs tal como Hpall y Acil cortan una secuencia de ADN solamente si está no metilada. Los MDREs son endonucleasas de restricción^que requieren metilación de una secuencia de ADN para la penetración. Mediante el tratamiento de una muestra de ADN con cualquiera de estas enzimas y la comparación subsecuente para una muestra de control, el estado de metilación de la muestra de ADN puede determinarse. Si la digestión de una muestra de ADN específico ocurre después del tratamiento con MDRE, entonces el ADN puede asumirse para ser metilado. Por el contrario, si eí ADN no está cortado cuando se trata con un MSRE, entonces la muestra puede asumirse para ser metilada. Mediante comparar la cantidad de cortes en contra del ADN no cortado, el nivel de metilación puede estimarse. Una lectura común de este tipo de análisis de metilación es la amplificación subsecuente y el mareaje fluorescente del ADN digerido. Los fragmentos pueden posteriormente hibridarse a una microserie de biblioteca y analizarse o simplemente resolverse mediante electroforesis Los sistemas basados en endonucleasa de restricción comercialmente disponibles incluyen MetiIScope de Orion, que usa una lectura de micro serie (Lippman eí al. (2004) Nature 430:471-76), y MetiScreen, que emplea PCR en tiempo real cuantitativa (Ordway ef al. (2006) Carcinogenesis 27:2409-23).

Una ventaja de la digestión MSRE/MDRE es que no es necesario el pre-tratamiento del ADN, aunque se realiza comúnmente junto con el tratamiento de bisulfito del ADN en un procedimiento llamado COBRA (Xiong & Laird (1997) Nucí. Acids Res. 25:2532-34). Algunas desventajas con este procedimiento son que es muy largo dependiendo de la presencia de las secuencias de reconocimiento MSRE/MDRE dentro de un ADN blanco. Por lo tanto, este avance es relativamente ineficiente, que puede reducir la confiabilidad de los resultados. Los únicos sitios CpG que se valoran son aquellos dentro de un número pequeño de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción y el estado de aquellos sitios no puede reflejar el estado de la isla CpG total en el cual reside el sitio. La digestión incompleta conduce a falsos positivos frecuentes, especialmente cuando las reacciones de penetración se someten a un etapa de amplificación subsecuente. Las pruebas de penetración de endonucleasa de restricción tienen pobre sensibilidad comparada con los métodos de bisulfito, tales como MSP, permitiendo la detección de no menos del 10% de ADN metilado en una muestra (Singer-Sam ef al. Nucleic Acids Res, 1990. 18:687; Yegnasubramanian ef al. Nucleic Acids Res. (2006) 34:e19).

Métodos de Inmunoprecipitación de Cromatina: Un tercer método que se emplea comúnmente para detectar el mCpG es inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Típicamente, las células se fijan y posteriormente el ADN metilado se inmunoprecipita por el uso de anticuerpos específicos para las proteínas de enlace de metilo. El ADN resultante se amplifica, se marca y analiza mediante hibridación en una prueba de microserie. Las ventajas de este método son que la prueba puede realizarse de células vivas con poco o sin purificación de ADN requerida. La prueba también tiene sensibilidad incrementada, como el ADN contaminante e indeseado se remueve antes del análisis. Sin embargo, el procedimiento ChIP es muy consumidor del tiempo, involucra varias etapas y requiere reactivos caros. Algunas pruebas pueden tomarse tanto como cinco días para completarse.

Métodos usando Proteínas de Unión de Metilo. Un avance más sensible y alterno para separar los ADNs no metilados de los metilados involucra el uso de proteínas de dominio de unión metil-CpG (MBD) o anticuerpos en contra de 5-metil-C. Las proteínas MBD tienen alta afinidad para los sitios CpG metilados y muy poca afinidad para el ADN no metilado (Fraga ef al. Nucleic Acids Res. (2003) 31 :1765-74). Las muestras se incuban con proteína MBD inmovilizada en una variedad de formatos (lechos magnéticos, columnas, las partes o los tubos PCR). La captura del ADN metilado usualmente se sigue mediante la amplificación del ADN capturado. La detección del ADN basado en MBD tiene la mayor ventaja que todos los sitios metilados puedan contribuir para la unión, por lo tanto permitiendo que una isla completa sea muestread para metil-CpGs. Esta característica hace la prueba de unión menos vulnerable a los falsos negativos que afectan MSP y las pruebas basadas en endonucleasa de restricción cuando los sitios no metilados en una isla parcialmente metilada corresponden a los sitios de sonda/iniciación (Yegnasubramanian ef al. Nucleic Acids Res. (2006) 34:e19). Esta situación es probablemente común en las muestras clínicas que contienen células tumorales en etapa temprana que contienen islas CpG parcialmente metiladas. Las pruebas de unión basadas en MBD son muy sensibles, permitiendo la detección de tan poco como 160 pg de ADN metilado (equivalente a -25 células) o 1 molécula metilada en 500 moléculas no metiladas (Gebhard eí al. Nucleic Acids Res. (2006) 4:e8256). Esto es cercano a la sensibilidad de MSP (1 molécula metilada/1 ,000 moléculas no metiladas). La prueba COMPARE MBD puede ser tan sensible como el MSP en tiempo real (1 molécula metilada/10,000 moléculas no metiladas) mediante incluir la digestión con Hpall (un MSRE) antes de la etapa de unión. La penetración de los ADNs no metilados en una ubicación entre los sitios de iniciación PCR proporciona alta sensibilidad con las mezclas de ADN que contienen ADNs artificialmente metilados que son completamente metilados (Yegnasubramanian eí al. Nucleic Acids Res. (2006) 34:e19). Sin embargo, esta estrategia podría sufrir la desventaja asociada con el uso de endonucleasas de restricción en que algunas islas parcialmente metiladas se valorarían como no metiladas en muestras clínicas (Yegnasubramanian, et al. supra).

Dada la importancia de la metilación CpG en el desarrollo y progreso del cáncer, una prueba sensible y confiable para el ADN CpG metilado proporcionaría una herramienta útil e importante para la detección del cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para detectar polinucleótidos blanco en una muestra. Los métodos generalmente involucran contactar una muestra que contiene un polinucleótido blanco con un par inicial que específicamente híbrida a y amplifica una secuencia blanco del polinucleótido. Para esta etapa, el par inicial incluye un primer iniciador con una secuencia 3' complementaría con una primera secuencia flanqueando la secuencia de polinucleótidos blanco y una etiqueta 5' de captura. El segundo iniciador del par tiene una secuencia 3' complementaria para una segunda secuencia flanqueando la secuencia blanco de polinucleótido en la hebra opuesta, y una secuencia 5' que proporciona un medio para dirigir la Abscription. Siguiendo la amplificación (por ejemplo, PCR) usando el par iniciador, la secuencia blanco amplificada se contacta con una molécula inmovilizada que une la etiqueta 5' de captura, para capturar la secuencia blanco amplificada. Al menos un Abscript posteriormente se transmite por los medios para dirigir la Abscription y el Abscript detectado como una indicación de la presencia del polinucleótido blanco.

La captura típicamente será vía un reactivo de afinidad o par de enlace unido o capaz de ser unido a un soporte sólido. Por ejemplo, la etiqueta de captura 5' puede ser biotina, que puede incorporarse rápidamente dentro de los iniciadores de oligonucleótido y la molécula que une a la etiqueta de captura 5' puede ser estreptavidina inmovilizada en un soporte sólido. Una amplia variedad de soportes sólidos está disponible para usarse en los métodos de la presente invención, tales como lechos, tubos o placas de microtitulación. Convenientemente, la esteptavidina y otras moléculas del par de unión pueden unirse a los lechos magnéticos que permiten la separación rápida de la fase sólida de los reactivos no unidos en solución. En ciertas modalidades de la invención, los reactivos no unidos, los iniciadores y los polinucleótidos pueden lavarse de polinucleótidos capturados e inmovilizados antes de las etapas subsecuentes en el procedimiento, que puede incrementar la eficiencia del método. Sin embargo, no es necesario como el método completo puede realizarse en un solo tubo u olla sin etapas de separación.

La PCR se usa típicamente para la etapa de amplificación, usando por ejemplo, una polimerasa del ADN termoestable o una polimerasa de ARN termoestable. Sin embargo, una variedad de métodos de amplificación de blanco conocidos en la técnica pueden ser apropiados para usarse en los métodos de la presente invención.

Una variedad de métodos están disponible para detectar los Abscripts como se describen en este documento, incluyendo pero no limitadas a espectrometría de masa, electroforesis capilar o cromatografía de capa delgada. En ciertos aspectos, un nucieótido detectablemente marcado u otra etiqueta pueden incorporarse en las señales de Abscript generadas por los métodos de la invención para incrementar la sensibilidad o expansión de las técnicas de detección que pueden usarse. Por ejemplo, el nucieótido detectablemente marcado puede ser un nucieótido fluorescente.

Los abscripts generadas por la presente invención generalmente son cortos, por ejemplo, 3-20 nucleótidos en longitud. Los abscripts tan pequeños como 3 nucleótidos en longitud son típicamente usados en los métodos descritos en este documento.

El segundo iniciador del par usado durante la amplificación tiene una secuencia 3' complementaria para una secunda secuencia flanqueando la secuencia blanco del polinucleótido en la hebra opuesta y una secuencia 5' que proporciona medio para dirigir la Abscription.

En ciertas modalidades, los medios se proporcionan por una secuencia a-TAP (Sonda de Unión Blanco) que se usa para etiquetar o identificar el blanco. La a-TAP se designa para ser complementaria a una secuencia TAP y permite la unión de un APC, por sus siglas en inglés (Cinta Promotora Abortiva). Para mantener la a-TAP como una hebra simple que por lo tanto está disponible para la hibridación a una secuencia TAP, un nucieótido no natural puede incluirse entre la secuencia 5' a-TAP y la secuencia 3' complementaría-a la secuencia flanqueando el blanco en el iniciador. Los nucleótidos no naturales, tales como eteno-deoxiadenosina, no se reconocen por las polimerasas durante la amplificación. Además, las secuencias descendentes del nucleótido no natural en un iniciador no se replican y aquellas secuencias de hebra simple restantes.

Una vez que el APC se une al blanco amplificado a través del híbrido TAP-a-TAP que se forma, las Abscripts se transcriben del APC como una indicación o señal para detectar la presencia del blanco. El APC que se une es una región de doble hebra o se hace de doble hebra mediante hibridación de una sonda.

En ciertas modalidades de la invención, un APC completamente doble puede generarse durante la reacción de amplificación desde una secuencia iniciadora que incluye una hebra del APC. Convenientemente, la Abscription puede realizarse durante la amplificación mediante incluir una polimerasa de ADN termoestable y nucleótidos en la reacción. Además, en estas modalidades, el segundo iniciador para la reacción de amplificación incluye una secuencia APC. Como los APCs dobles se generaron (por ejemplo por PCR), las Abscripts se transcribieron del APC y pueden detectarse como ellas se producen (por ejemplo, en tiempo real) o analizarse en un tiempo posterior por los métodos de detección de Abscript descritos en este documento.

La invención proporciona métodos rápidos, sensibles y específicos para la detección de una variedad de variedades de polinucleótidos blanco de interés, incluyendo los blancos ADN y ARN, con un repertorio expandido de técnicas de detección como se compara a PCR. Diferente a la PCR, los métodos también están disponibles para detectar los blancos de polinucleótido que se modifican, tal como los blancos de ADN metilados. De acuerdo a dichos métodos, los fragmentos de ADN genómicos metilados se aislan primero mediante penetrar una muestra de ADN genómico conteniendo un polinucleótido blanco metilado (tal como una isla CpG), con una enzima de restricción que no penetre el polinucleótido blanco, . o genera fragmentos apropiadamente representativos del blanco durante la penetración. El ADN genómico penetrado posteriormente se contacta con un dominio de unión de metilo inmovilizado, tal como la proteína de fusión GST-MBD2 descrita en este documento. En esta forma, los fragmentos de ADN genómico metilado se inmoviliza y por lo tanto se aisla de los fragmentos de ADN no metilados en la muestra. Opcionalmente, los fragmentos de ADN genómicos metilados pueden eludirse del MBD inmovilizado y recuperado antes del análisis. Por ejemplo, en donde la proteína de fusión GST- MBD2 se usa para la inmovilizar los blancos de isla CpG metilados, la porción GST de la proteína de fusión puede unirse a una resina glutatión (antes o después de la interacción con el ADN) y los fragmentos de ADN metilados unidos pueden eludirse con glutatión.

Los métodos de la invención también son apropiados para la multiplexión. De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, la pluralidad de polinucleótidos blanco diferentes, se procesan simultáneamente mediante incluir una pluralidad de primeros y segundos pares de iniciador en las reacciones, cada par iniciador siendo designado para hibridar específicamente a un polinucleótido blanco diferente. Mediante el diseño diferente, los APCs únicos para cada blanco que se unen al blanco a través de la amplificación iniciada (como parte del iniciador conteniendo APC o vía el híbrido TAP-a-TAP, como se describió en este documento), la presencia de cada pluralidad de blanco puede identificarse a través de una señal APC que se genera. Por ejemplo, cada APC puede designarse para ser distinguible en la base del peso molecular o la secuencia de nucleótido. De acuerdo con estas modalidades de la invención, al menos 5, 10, 20, 50, 100 o más blancos pueden detenerse en una sola prueba.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra el proceso de transcripción abortiva (abortive transcription). que se explica por los métodos de Abscription® de la invención. La transcripción abortiva ocurre en la mayoría de los promotores cuando la polimerasa ARN (ARNP) se atrapa en el promotor repetidamente haciendo transcripciones abortivas cortas (típicamente 2 a 12 nt de largo). Durante la transcripción abortiva, el ARNP no se transloca o deja al promotor. Durante la transcripción normal, ARNP eventualmente padece de un cambio complejo de prolongación en progreso, • estable, un proceso llamado escape del promotor y entonces continua la transcripción hasta que una señal de terminación se alcanza. Los promotores artificiales o las Cintas Promotoras Abortivas (APCs) se han desarrollado en el ARNP atrapado en un complejo abortivo, miles reiterativamente sintetizados de oligonucleótidos cortos idénticos por minuto. Cada APC se diseña para fabricar una Abscript diferente de longitud y secuencia específicas que pueden separar o cuantificarse.

. Las Figuras 2, 2A y 2B ilustran la detección de la proteína, los blancos ARN y ADN usando Abscription®. Los APCs se unen a una Sonda de Unión Blanco (TAP, por sus siglas en inglés), que específicamente une al blanco molecular (Figura 2). Para la detección de ADN y ARN, las TAPs incluyen oligonucleótidos que hibridan específicamente a o las proteínas que se unen específicamente al blanco del ácido nucleico (Figura 2A). La detección de proteína, los APCs pueden unirse a cualquier molécula que se une al blanco proteína, tal como un anticuerpo o un ligando. La Figura 2B ilustra una modalidad de la invención en donde el APC se une a un anticuerpo. La proteína blanco puede "intercalarse" entre un complejo de anticuerpo APC y un segundo anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido, para capturar y detener los blancos proteínas similares a estrategias usadas en las pruebas de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA).

La Figura 3 ilustra la iniciación de binucleótidos de Abscription® y la terminación después de la adición de un NTP. La longitud de abscript puede limitarse mediante la inclusión de la terminación de cadena NTPs (3-O-Me-NTPs en R3) como se representa o mediante omitir uno o más NTPs de la reacción. R1 = etiqueta de afinidad, Etiqueta de Fluorescencia; R2 = OH, OMe, H; R3 = OH, OMe, H; R4 = OH, OMe, H.

Las Figuras 4 y 4A ilustran la detección de Abscripts mediante espectrometría de masa. Una reacción de Abscription® que incluyó el GpA iniciador y el GTP se fraccionó mediante HPLC de fase inversa. La salida de la columna se introdujo en un espectrómetro de masa. La Figura 4 muestra el perfil de columna en términos de conteo de ión total como una función del tiempo de retención. La Figura 4A muestra el espectro de ión para el pico GAG Abscript de trinucleótidos (tiempo de retención 5.4 min). Las especies GAG doblemente y simplemente cargadas tienen valores m/z de 956.1 y 477.6, respectivamente. El aducto de sodio de las piezas dobles cargadas tiene un m/z de 978.2.

Las Figuras 5, 5A, 5B y 5C son una ilustración de la estructura de una Proteína GST-MBD usada en los métodos de detección de metilación de la invención. La Figura 5 muestra la unión de un dominio MBD al extremo carboxilo de un dominio GST. La secuencia de aminoácido uniendo los dominios (SEQ ID NO:1 ) contiene un sitio de penetración de trombina indicado por la flecha. La Figura 5A muestra la secuencia de aminoácido para el dominio de unión de ADN de MBD2b de ratón (SEQ ID NO:2). Los aminoácidos subrayados corresponden a residuos conservados entre los dominios de enlace ADN de las proteínas MBD (Ohki et al. (1999) EMBO J. 18:6653-61 ). La Figura 5B muestra los resultados del fraccionamiento de ADN metilado usando el GST-MBD inmovilizado. La fracción S (sobrenadante) contiene ADN de isla SNRPN no metilado amplificado. E1 contiene ADN de isla SNRPN CpG metilado amplificado que se eluyó de la proteina inmovilizada. Las fracciones E2 y E3 son dos eluciones seriales adicionales de la misma proteína inmovilizada. La Figura 5C muestra el fraccionamiento del ADN PTGS2, que no se metila, en las células HeLa. Todo del ADN PTGS2 se recupera en la fracción S del sobrenadante no unido.

Las Figuras 6, 6A, 6B son un diagrama de flujo que ilustra la estrategia para la detección de metilación CPG basada en Abscription® a-TAP incluyendo el enlace un TAP-APC para un fragmento amplificado de una isla CpG blanco. Las etapas en el proceso se indican por los numerales. La Figura 6 ilustra la captura inicial del ADN conteniendo CpG metilado. Etapa 1 : Los fragmentos de ADN metilado se liberan por el tratamiento o exposición al calor a la proteasa o glutatión. La Figura 6A muestra la etiquetación de amplificación y la captura de los fragmentos de ADN etiquetados. Etapa 3: Una isla CpG blanco se etiqueta con una etiqueta de afinidad como (biotina (B), como se muestra) y una extensión de hebra simple durante PCR, a través de la incorporación de un iniciador biotinilado y un iniciador conteniendo un nucleótido de no codificación entre la secuencia del iniciador y una secuencia anti-TAP (a-TAP). Etapa 4: El amplicón biotinilado se une a los lechos magnéticos de estreptavidina. Etapa 5: El APC se une al amplicón mediante hibridización entre la secuencia TAP y la secuencia a-TAP. La Abscription® se realiza mediante contactar una polimerasa de ARN (ARNP) con los complejos inmovilizados en lecho conteniendo APCs.

Las Figuras 7-7B ilustran las interacciones entre los iniciadores de la amplificación blanco específica ejemplarizadora y las sondas/iniciador anti-TAP (a-TAP). La Figura 7 ilustra los iniciadores PCR usados en la amplificación de isla CpG y sus ubicaciones relativas en el amplicón. Las Figuras 7A y 7B ilustran la prueba desfavorable resultante por las sondas/iniciador a-TAO pobremente designadas.

Las Figuras 8, 8A muestran las sensibilidades relativas de la detección de ADN por PCR TaqMan® en contra del método de Abscription®/PCR representado en la Figura 6. Un fragmento de la isla GSTP1 CpG del ADN HeLa metilado no fraccionado se amplificó desde iniciar los números de copia/PCR de 9000 a 30. La Figura 8 muestra los resultados PCR TaqMan®. Los iniciadores PCR TaqMan® fueron la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:4. La detección de las 9000 copias requirió 28 ciclos de PCR. La Figura 8A muestra los resultados de la detección PCR/Abscription® siguiendo los 29 ciclos de PCR. Los iniciadores PCR/Abscription® fueron SEQ ID NO:12 y SEQ NO:13. El TAP-APC se realizó mediante el templado de la SEQ ID NO:28 y la SEQ ID NO:32. El APC codificó el GAG Abscript. Los Abscripts fueron detectados usando cromatografía de capa delgada (TLC) y sombreado con UV. El área se refiere al área del pico cromatográfico conteniendo el Abscript.

La Figura 9 muestra la detección de los Abscripts marcados CY5™ usando TLC después de la amplificación PCR de, las cantidades indicadas del ADN de entrada seguido por 2 horas y 8 horas de Abscription®.

La Figura 10 muestra un diagrama de flujo que muestra la estrategia para la detección de ADN metilado usando incorporación directa de un APC dentro de los amplicones con el uso de un iniciador APC. Los numerales indican las etapas en la estrategia. Las etapas 1 y 2 representan el fraccionamiento del ADN metilado usando proteína GST- BD como se ilustra en la Figura 6. La Etapa 3 muestra la relación entre la secuencia blanco y los iniciadores que se usan para unir un APC al amplicón. El iniciador hacia la izquierda es un iniciador PCR convencional. El iniciador hacia la derecha tiene una secuencia de cebado 3' y un APC de una hebra en el extremo 5'. Las etapas 4 y 5 representan la amplificación PCR del blanco. La etapa 6 representa la etapa de Abscription® siguiendo el PCR. La reacción PCR se suplementa con la polimerasa ARN, el iniciador y uno o más NTPs.

Las Figuras 11 y 11A ilustran la validación de un par promotor de APC para la isla CpG GAPDH, la Figura 11 muestra la evaluación de la señal de fondo debido al auto cebado mediante el iniciador APC C443 y el fondo debido a la formación de los dímeros iniciadores entre C443 (SEQ ID N0.33) y el iniciador inverso C446 (SEQ ID NO:34). Las reaccione de PCR careciendo de ADN conteniendo C443 solo o en combinación de C443 y C446 se realizaron en un rango de temperaturas de templado de 56.4°C a 68.5°C seguidos por 1 hora de Abscription®. La producción de Abscripts se evaluó por sombreado TLC-UV. Solamente el control positivo conteniendo ADN HeLa produjo la Abscript GAG. La Figura 11 A muestra los resultados de la detección LC-MS de los Abscripts de los mismos juegos de muestra.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Se entenderá que tanto la descripción general precedente y la siguiente descripción detallada son ejemplarizadoras y explicativas solamente y no son restrictivas de la invención reclamada. Como se usa en este documento, el uso del singular incluye el plural a menos que específicamente se establezca de otra manera. Como se usa en este documento, "o" significa "y/o" a menos que se establezca de otra manera. Como se usa en este documento, los términos "comprende", "comprendiendo", "incluye" e "incluyendo" o cualquier otra variación de los mismos, se intenta que cubra una inclusión no exclusiva de manera que un proceso, método, composición, mezcla de reacción, juego u aparato que comprende una lista de elementos no incluye solamente aquellos elementos, sino puede incluir otros elementos no expresivamente listados o inherentes a dicho proceso, método, composición, mezcla de reacción, juego o aparato. Los encabezados de sección usados en este documento son para propósitos de organización solamente y no se construyen como limitantes de la materia sujeto descrita.

A menos que se proporciones las definiciones específicas, las nomenclaturas usadas en conexión con y los procedimientos y técnicas de laboratorio de biología molecular, bioquímica y química orgánica descritos en este documento son aquellos conocidos en la técnica. Los símbolos y abreviaciones biológicos y químicos se usan intercambiablemente con los nombres completos mediante dichos símbolos y abreviaciones. Además, por ejemplo, los términos "ácido desoxirribonucleico" y "ADN" se entiende que tienen significado idéntico. Las técnicas estándares pueden usarse por ejemplo, para las síntesis químicas, análisis químicos, metodología de ADN recombinante y síntesis de oligonucleótidos. Las técnicas de reacción y purificación pueden realizarse, por ejemplo, usando juegos de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se llevan a cabo comúnmente en la técnica o como se describen en este documento. Las técnicas y procedimientos precedentes pueden realizarse generalmente de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales o más específicas que se citan y divulgan a través de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook eí al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da. ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989)); Ausubel eí al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons Inc., N.Y. (2003)), los contenidos de las cuales se incorporan en este documento en su totalidad como referencia para cualquier propósito.

"Aproximadamente" como se usa en este documento significa que un número referido como "aproximadamente" comprende el número enumerado más o menos 1-10% de ese número enumerado. Por ejemplo, "aproximadamente" 50 nucleótidos pueden significar 45-55 nucleótidos o tan poco como 49-51 nucleótidos dependiendo de la situación. En cualquier momento que aparezca en este documento, un rango numérico, tal como "45-55" se refiere a cada número entero en el rango dado, por ejemplo, "45-55 nucleótidos" significa que el ácido nucleico puede contener 45 nucleótidos, 46 nucleótidos, hasta e incluyendo 55 nucleótidos.

"Transcripción" como se usa en este documento, se refiere a la síntesis enzimática de una copia de ARN de una de las hebras de ADN (es decir, plantilla) catalizada por una polimerasa de ARN (por ejemplo, una polimerasa de ARN dependiente de ADN).

"Transcripción Abortiva" es un proceso mediado con polimerasa de ARN que sintetiza reiteradamente y termina la síntesis de oligonucleótidos que corresponde a al menos una porción de una secuencia de plantilla de ácido nucleico complementaria. Los oligonucleótidos abortivos sintetizados in vivo varían en longitud de nucleótidos y son complementarios a una secuencia en o cerca del sitio de iniciación de transcripción.

"Abscription®" es una forma de transcripción abortiva optimizada para el uso analítico in vitro para producir reiterativamente transcripciones o "abscripts" de ARN uniformes, cortas de las secuencias del promotor de ocurrencia natural en alta frecuencia in vitro. El término "Abscripts" (en mayúsculas), se usa en este documento para distinguir transcripciones sintéticas optimizadas producidas en una reacción o prueba de Abscription®, del término más general "abscripts" que también contempla las transcripciones cortas abortivas que se producen durante el curso normal de transcripción como ocurre en la naturaleza.

"Reiterativo" se refiere a la síntesis repetitiva de copias sustancialmente idénticas o idénticas múltiples de una secuencia de interés.

"Terminador" o "terminador de transcripción" como se usa en este documento se refiere a un compuesto, complejo o proceso de terminación de cadena ARN. Un terminador de la invención puede, por ejemplo ser un análogo nucleótido, que puede incorporarse en una cadena de ARN durante la síntesis de ARN para prevenir la adición de los nucleótidos adicionales para la cadena de ARN.

"Amplificación" como se usa en este documento, se refiere al proceso para elaborar copias idénticas de un polinucleótido, tal como un fragmento o región de ADN. La amplificación generalmente se lleva a cabo mediante la reacción de cadena de polimerasa (PCR) pero otros métodos conocidos en la técnica pueden ser apropiados para amplificar los fragmentos de ADN de la invención.

Una "secuencia de ADN blanco" o "ADN blanco" es una secuencia de ADN de interés para la cual la detección, caracterización o cuantificación se desea. La secuencia de nucleótidos actual del ADN blanco puede conocerse o no conocerse. Los ADNs blanco son ADNs típicamente para los cuales el estado de metilación CpG se interroga. Un "fragmento de ADN blanco" es un segmento de ADN que contiene la secuencia de ADN blanco. Los fragmentos de ADN pueden producirse por cualquier método incluyendo, por ejemplo, sonicación o trasquilación, pero más típicamente se generan mediante la digestión con una o más endonucleasas de restricción.

Como se usa en este documento, una "plantilla" es un polinucleótido del cual una copia de oligo o polinucleótido complementario se sintetiza.

"Síntesis" generalmente se refiere al proceso de producir un ácido nucleico, vía medios enzimáticos o químicos. La síntesis química se usa típicamente para producir hebras simples de un ácido nucleico que puede usarse e iniciadores y sondas. La "síntesis" medida por enzima comprende tanto la descripción como la replicación de una plantilla. La síntesis incluye hacer una copia simple o copias múltiples del blanco. Las "copias múltiples" significan al menos 2 copias. Una "copia" no significa necesariamente identidad o complementariedad de secuencia perfecta con la secuencia de plantilla. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótidos, alteraciones de secuencia intencional (tal como alteraciones de secuencia introducidas a través de un iniciador que comprende una secuencia que es hibridizable pero no complementaria a la plantilla) y/o errores de secuencia que ocurren durante la síntesis.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico (molécula)" se usan intercambiablemente para referirse a las formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden modificarse o no modificarse y tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función conocida o no conocida. El término "polinucleótido" incluye moléculas de hebra simple, doble hebra y triple hebra helicoidales. Las siguientes modalidades no limitante de polinucleótidos: un ge o fragmento de gen, exones, intrones, mA N, tARN, rARN, ribosimas, cADN, polinucleótidos recombinántes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado o cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico e iniciadores.

"Oligonucleótido" se refiere a polinucleótidos de entre 2 y aproximadamente 100 nucleótidos de ácido nucleico de simple o doble hebra, típicamente ADN. Los oligonucleótidos también se conocen como oligómeros u oligos y pueden aislarse de genes y otros materiales biológicos o químicamente sintetizados por los métodos conocidos en la técnica. Un "iniciador" se refiere a un oligonucleótido que contiene al menos 6 nucleótidos usualmente de hebra simple, que proporciona un extremo 3-hidroxilo para la iniciación de la síntesis de ácido nucleico mediado con enzima. Una "sonda de polinucleótido" o "sonda" es un polinucleótido que híbrida específicamente a una secuencia de polinucleótidos complementaria. Como se usa en este documento, "unirse específicamente" o "específicamente híbrida" se refiere a la unión, diplexado o hibridación de una molécula a otra molécula bajo las condiciones dadas. Además, una sonda o iniciador "específicamente híbrida" solamente su polinucleótido blanco intentado bajo las condiciones de unión dadas, y un anticuerpo se "une específicamente" solamente a su antígeno blanco intentado bajo las condiciones de unión dadas. Las condiciones dadas son aquellas indicadas para la unión o hibridación e incluyen estabilización, resistencia iónica y otros factores que son bien conocidos dentro del conocimiento de las personas expertas. La persona experta también conocerá las condiciones bajo las cuales la unión específica puede interrumpirse o disociarse, además eluyendo o fundiendo, por ejemplo combinaciones de polinucleótido blanco-iniciado, anticuerpo-antígeno, y receptor-ligando.

La "secuencia de ácido nucleico" se refiere a la secuencia de bases de nucleótidos en un oligonucleótido o polinucleótido, tal como ADN o ARN. Para moléculas de doble hebra, una hebra simple puede usarse para representar ambas hebras, la hebra complementaria siendo inferida por el emparejamiento de base Watson-Crick.

Los términos "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a un primer polinucleótido (que puede ser un oligonucleótido) que está en "asociación antiparalelo" con un segundo polinucleótido (que también puede ser un oligonucleótido). Cómo se usa en este documento, el término "asociación antiparalelo" se refiere a la alineación de dos polinucleótidos de manera que los nucleótidos individuales o bases de los dos polinucleótidos asociados se emparejan sustancialmente de acuerdo con las reglas de pares de base Watson-Crick. Complementariamente puede ser "parcial" en la cual solamente algunas de las bases de los polinucleótidos se igualan de acuerdo con las reglas de emparejado de base. O puede "completarse" o complementarse en forma "total" entre los polinucleótidos. Aquellos expertos en la técnica de la tecnología del ácido nucleico pueden determinar la estabilidad empíricamente dúplex mediante considerar un número de variables, incluyendo por ejemplo, la longitud del primer polinucleótido, que puede ser un oligonucleótido, la composición base y la secuencia del primer polinucleótido y la resistencia iónica e incidencia de los pares base desemparejados.

Como se usa en este documento, el término "hibridación" se usa en referencia al emparejamiento de base de los ácidos nucleicos complementarios, incluyendo polinucleótidos y oligonucleótidos que contienen 6 o más nucleótidos. La hibridación y la resistencia a la hibridación (es decir, resistencia de la asociación entre los ácidos nucleicos) se imparte por dichos factores como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la severidad de las condiciones de reacción involucradas, la temperatura de fusión (Tm) del híbrido y la proporción G:C dentro del ácido nucleico dúplex. Generalmente, los métodos de "hibridación" involucran el templado de un polinucleótido complementario para un ácido nucleico blanco (es decir, la secuencia a detectarse por los medios directos o indirectos). La habilidad de dos polinucleótidos y/u oligonucleótidos que contienen secuencias complementarias para localizarse una con la otra y templar una con la otra a través de las interacciones de emparejado es un fenómeno bien reconocido.

Un "complejo" es un ensamble de componentes. Un complejo puede o no puede ser estable y puede ser directa o indirectamente detectado. Por ejemplo, como se describe en este documento, ciertos componentes dados de una reacción y el tipo de producto (s) de la reacción, la existencia de un complejo puede inferirse. Por ejemplo, en el método de transcripción abortiva descrito en este documento, un complejo generalmente s un intermediario con respecto a un producto de síntesis reiterativa final, tal como una transcripción abortiva final o producto de replicación.

La "metilación" se refiere a la adición de un grupo metilo (-CH3) para una molécula, típicamente a una base de nucleótido en ADN o ARN. "mCpG" se refiere a un dinucleótido 5'-CG-3' en el cual C está metilado en la posición 5 (5-metilcitoquina o 5- e C). Las "islas CpG" son regiones de genómicos que contienen una alta frecuencia de CpG dinucleótidos. Las islas CpG están en o cerca de aproximadamente 40% de los promotores de los genes de mamíferos y aproximadamente 70% de los promotores de humanos que tienen un contenido CpG alto. Ver, por ejemplo, Fatemi eí al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:e176. doi:10.1093/nar/gn¡180. PMID 16314307.

"Promotor" como se usa en este documento, se refiere a una región de ADN que facilita la transcripción de un gen adyacente. Los promotores son típicamente 5' y próximos al sitio de inicio de la iniciación de la transcripción en un gen y directos a una polimerasa de ARN y asociados a factores de transcripción para la ubicación correcta de la transcripción de un gen.

"Microserie" y "serie", se usan intercambiablemente para referirse a una colocación de una colección de compuestos, muestras o moléculas tales como oligo u polinucleótidos. Las series se "dirigen" típicamente de manera que los miembros individuales de la colección tienen una posición identificable única dentro del arreglo. Las series pueden formarse en un sustrato sólido, tales como un portaobjetos de cristal o en un sustrato semi-sólido tal como membrana nitrocelulosa o en recipientes tales como tubos o pozos de placas de micro titulación. Un arreglo típico para una serie es una configuración de 8 filas por 12 columnas, tal como una placa de micro titulación, sin embargo, otros arreglos apropiados para usarse en los métodos de la presente invención estarán bien adaptados dentro del conocimiento del experto.

El término "soporte sólido" se refiere a cualquier fase sólida que puede usarse para inmovilizar por ejemplo, una sonda de captura u otro oligo o polinucleótido, un polipéptido, un anticuerpo u otra molécula deseada o complejo. Los soportes sólidos apropiados serán bien conocidos en la técnica e incluirán pero no se limitarán a, las paredes de pozos de una bandeja de reacción, tales como una placa de micro titulación, las paredes de los tubos de prueba, los lechos de poliestireno, los lechos no magnéticos o paramagnéticos, los porta objetos de cristal, las membranas nitrocelulosas, las membranas de nylon y las micropartículas tales como partículas de látex. Los materiales típicos para los soportes sólidos incluyen pero no se limitan a cloruro de polivinilo (PVC), poliestireno, celulosa, agarosa, dextrano, cristal, nylon, látex y derivados de los mismos. Además, el soporte sólido puede cubrirse, derivarse o de otra manera modificarse para promover la adhesión de las moléculas deseadas, y/o para impedir la unión no específica y otras interacciones indeseadas. La selección de una "fase sólida" especifica no es usualmente crítica y puede seleccionarse por un experto en la técnica dependiendo de los métodos y pruebas empleados. Convenientemente, el soporte sólido puede seleccionarse para acomodar varios métodos de detección. Por ejemplo, placas de 96 o 384 pozos pueden usarse para las pruebas que serán automatizadas, por ejemplo mediante estaciones de trabajo robóticas, y/o aquellas que se detectarán usando, por ejemplo, un lector de placas. Para los métodos de la presente invención que pueden involucrar, por ejemplo, una etapa de detección autoradiográfica usando una visualización basada en película, el soporte sólido puede ser una membrana delgada, tal como una membrana de nylon o de nitrocelulosa, un gel o una placa de cromatografia.de capa delgada. Los métodos apropiados para inmovilizar las moléculas en las fases sólidas incluyen interacciones covalentes hidrofóbicas, iónicas y las similares y combinaciones de las mismas. Sin embargo, el método de inmovilización no es típicamente importante y puede involucrar los mecanismos de absorción no caracterizados. Un "soporte sólido" como se usa en este documento, además puede referirse a cualquier material que es insoluble o puede hacerse insoluble por una reacción subsecuente. El soporte sólido puede seleccionarse por su habilidad intrínseca e inmovilizar un reactivo de captura. Alternativamente, el soporte sólido puede retener moléculas adicionales que tienen la habilitad de atraer e inmovilizar, por ejemplo, un reactivo de "captura".

"Anticuerpo" o "anticuerpos" como se usan en este documento, incluyen especies de ocurrencia natural tales como anticuerpos policlonales y monoclonales así como cualquier porción de antígeno de enlace, fragmento o subunidad de una molécula de ocurrencia natural, tal como por ejemplo fragmentos Fab, Fab' y F(ab)2 de un anticuerpo. También se contempla el uso en los métodos de la invención de anticuerpos recombinantes, truncados, de cadena simple, quiméricos e híbridos incluyendo pero no limitados a anticuerpos primatizados e humanizados y otras formas de anticuerpos de ocurrencia no natural.

La presente invención se basa en una tecnología de detección molecular llamada Abscription® que es a su vez basada en el fenómeno natural conocido como transcripción abortiva [abortive transcription] (Figura 1 ). La Abscription® es un método isotérmico robusto para la detección y cuantificación de un amplio rango de blancos incluyendo proteínas, ácidos nucleicos, SNP's y metilación CpG (Solicitudes de Patentes Estadounidenses Nos.10/602,045, 10/790,766, y 10/488,971 ; Patentes Estadounidenses Nos. 7,045,319, y 7,226,738). La Abscription® ocurre durante la fase de iniciación de la transcripción en la cual, la polimerasa de ARN (ARNP) reiterativamente genera ARNs cortos, o transcripciones abortadas (Abscripts), mientras permanecen herméticamente unidas al promotor (Hsu, Biochim. Bíophys. Acta (2002) 1577:191- 207; Hsu et al. Biochemistry (2003) 42:3777-86; Vo eí al. Biochemistry (2003) 42:3798-81 1 ; Vo et al. Biochemistry (2003) 42:3787-97; Hsu eí al. Biochemistry (2006) 45:8841 -54). Las secuencias del promotor y el segmento inicialmente transcrito tienen efectos significantes en las longitudes de los Abscripts predominantes, así como sus proporciones de síntesis (Hsu et al. Biochemistry (2006) 45:8841 -54.28). Los promotores altamente abortivos óptimos múltiples, llamados Cintas del Promotor Abortivo (APCs, por sus siglas en Inglés) se han desarrollado y optimizado para hacer las Abscripts de diferentes secuencias y longitudes (entre 3 y 12 mt) en proporciones extremadamente altas.

La generación de Abscripts cortos es muy eficiente porque el ARNP no se disocia del promotor entre los ciclos de la síntesis de ARN truncada, como se hace después de producir cada transcripción de longitud completa y continuará para producir Abscripts en proporciones de alto rendimiento hasta que los sustratos se agotan. Esto resulta en la producción muy rápida de cuentos de Abscripts por APC cada minuto. La Abscription® es una amplificación de señal, más que un proceso de amplificación de blanco.

La presente invención proporciona métodos sensibles y simples para la detección de la metilación de CpG en ADN vía sondas de sitio blanco mCpG que incluyen los polipéptidos del dominio de unión de metilo optimizado (MBD). Las sondas de sitio blanco mCpG pueden acoplarse directamente o indirectamente a un generador de señales, que produce una señal detectable que puede medirse como un indicador de la metilación CpG.

En ciertas modalidades de la invención, la generación de señal se basa en un proceso de Abscription® en el cual los generadores de señal de las Cintas Promotoras Abortivas (APCs) se unen a los sitios mCpG blancos vía las sondas específicas blanco mCpG. La polimerasa ARN produce moléculas de ARN cortas uniformes de promotores abortivos de ocurrencia natural o sintéticos en las APCs como señales (indicadores) de la presencia de CpGs metilados. En otras modalidades de la invención, las cintas generadoras de señales pueden producir ARN detectable o señales de ADN a través de PCR u otros métodos de replicación y/o amplificación.

Los métodos de la invención ofrecen ventajas significantes sobre los métodos de detección de metilación CpG reales porque el tratamiento con bisulfito no se requiere. Además la degradación de ADN extensiva y la reducción de la complejidad de secuencia asociada con el tratamiento químico del ADN blanco pueden evitarse completamente en ciertas modalidades de la invención. Los métodos de la invención son rápidos y pueden realizarse típicamente en un solo día. Por lo tanto, la invención puede adaptarse a aplicaciones automáticas y múltiples.

Ciertas pruebas de detección de metilación basadas en Abscription® de la presente invención ofrecen la capacidad única de acoplamiento de un proceso de amplificación de señales robustas lineales (Abscription®) con un proceso de amplificación de blanco (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa o PCR). Esto se proporciona para la sensibilidad altamente extrema y permite que la prueba use solamente cantidades pequeñas de material inicial. Además, a pesar de que otros métodos de amplificación de señales, tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, que generan la misma molécula de señal de cada blanco en una muestra, la amplificación basada en Abscription® puede formatearse para generar una señal diferente de cada blanco. Estas señales, en la forma de oligonucleótidos cortos, pueden entonces detectarse por una variedad de métodos. Las pruebas basadas en Abscription® requieren menos horas de trabajo que otras pruebas de detección de la metilación de ADN, el costo del reactivo es muy competitivo, y el costo de instrumentación es bajo. Además, estas pruebas, mediante incluir plantillas de control negativas y positivas, resultan en la detección altamente específica y menor falsos positivos que otros métodos para la detección blanco.

Tecnología de Abscription® La tecnología de Abscription® se basa en la observación que antes de la iniciación de la transcripción de ARN de longitud completa, un gran número de transcripciones cortas abortivas se sintetizan por las polimerasas de ARN antes de que se hagan las transcripciones de ARN de longitud completa. Como se describe posteriormente, las transcripciones abortivas son un producto normal del proceso de transcripción, aún siendo distinguibles de las transcripciones de ARN de longitud completa (que son el producto funcionalmente informativo del proceso de transcripción) en tanto el tamaño y en la manera en la cual se hacen.

Proceso de Transcripción. La transcripción es un proceso altamente regulado y complejo usado por ambas las eucariotas y las procariotas para sintetizar selectivamente las transcripciones de ARN y las plantillas de ADN (es decir, genes) (revisado en Record et al. (1996) Escherichia coli and Salmonella, (Neidhart, ed.; ASM Press, Washington, DC); deHaseth et al. (1998) J. Bact. 180:3019-25; Hsu (2002) Biochim. Biophys. Acta. 1577:191 -207; Murakami & Darst (2003) Curr. Opin. Struct. Biol. 13:31 -39; Young et al. (2002). Cell. 109:417-420). La transcripción en un ambiente celular incluye 5 etapas: 1. Pre-iniciación, durante la cual la maquinaria transcripcional (por ejemplo, polimerasa de ARN (ARNP) y factores de transcripción) se reclutan a un promotor, 2. Iniciación, durante la cual la síntesis de ARN inicia. 3. Escape del Promotor, durante el cual la polimerasa de ARN deja al promotor y las detecciones de iniciación abortivas (usualmente después de la síntesis de aproximadamente 12-mer ARNs); 4. Prolongación, durante la cual el ARNP viaja progresivamente a lo largo de la hebra de ADN de la plantilla, por lo tanto sintetizando una transcripción de ARN de longitud completa, y 5. Terminación, durante la cual la síntesis de ARN cesa y el ARNP se disocia del ADN de la plantilla.

Producción de Transcripciones Abortivas Antes de la Transcripción de ARN de Longitud Completa. Típicamente, los ARNP fallan en escapar del promotor en su primer intento y en su lugar se acopla en múltiples ciclos abortivos de síntesis y liberación de productos de ARN cortos llamados transcripciones abortivas. Solamente cuando el ARNP prospera en sintetizar un producto de ARN de una longitud de inicio el ARNP irrevocablemente rompe sus interacciones con el ADN del promotor e inicia para translocarse a lo largo de la plantilla de ADN, progresivamente sintetizando una transcripción de ARN de longitud completa ( er Hsu (2002) Biochim. Biophys. Acta. 1577:191-207; Hsu et al. (2003) Biochemistry 42: 3777-86; Vo ef al. (2003) Biochemistry 42:3787-97; Vo ef al. (2003) Biochemistry: 42:3798-1 1 ). Antes de que el promotor escape en (etapa 3, anterior), el ARNP permaneces unido a la plantilla de ADN en o cerca de la región del promotor, por lo tanto permitiendo ciclos múltiples de la síntesis abortiva en corto tiempo.

Tecnología de Abscription®. La tecnología de Abscription® explota el fenómeno natural de la síntesis de ARN abortiva para producir grandes números de transcripciones abortivas detectables (Abscripts). La abscription® es un sistema de generación de señales lineales robustas isotérmicas basadas en transcripción abortivas. En un método de Abscription®, las Cintas del Promotor Abortivo (APCs) se unen a las moléculas blanco vía las Sondas de Sitio Blanco (TSPs). Una polimerasa de ARN, tal como la polimerasa de ARN £. coli, posteriormente usa el APC como una plantilla para generar grandes números de señales por blanco en la forma de moléculas de ARN uniformes o Abscripts (transcripciones abortivas).

Los métodos de detección de Abscription® tienen tres etapas básicas que pueden adaptarse para detectar una amplia variedad de moléculas de interés (es decir, blancos). Primero, un APC se localiza en una molécula blanco de interés a través de una Sonda de Sitio Blanco (TSP). Segundo, los Abscripts se sintetizan de los APCs localizados. Finalmente, los abscripts se detectan como un medio de detección blanco y pueden cuantificarse como una indicación de la cantidad de una molécula blanco presente. El proceso es muy eficiente porque el ARNP no se mueve fuera o se disocia del promotor entre los ciclos de síntesis de ARN abortivo, como produciendo cada transcripción de longitud completa. Por lo tanto, solamente las señales de ARN cortas uniformes se sintetizan, las cuales pueden producirse más rápidamente y con menos esfuerzo que los oligo y polinucleótidos más grandes.

Aunque los factores y las condiciones requeridas para el escape del promotor (y aquí el final de la síntesis abortiva), son incompletamente entendidos, el conocimiento suficiente está disponible para crear un ambiente sintético que favorece la síntesis de transcripción abortiva y excluye la producción de ARN de longitud completa. En una modalidad, la Abscription® se controla en el estado de síntesis para producir los Abscripts que se inician con un iniciador dinucleótido definido y posteriormente terminan después de la adición de uno o más NTPs como se ilustra en él ejemplo no limitante mostrado en la Figura 3. La longitud del abscript puede limitarse tan corta como 3 nucleótidos (nt) con el uso de los NTPs con terminación de cadena (por ejemplo, 3'-0-Me-NTPs) o mediante omitir uno o más NTPs de la reacción.

En otras modalidades, la longitud de Abscript se controla en la etapa de la plantilla/promotor, mediante proporcionar plantillas sintéticas que tienen un número limitado, discreto de nucleótidos disponible para la transcripción antes de que se alcance una señal de detección. La uniformidad de la producción de Abscript de un solo APC en una sola reacción de Abscription® resulta én señales Abscript que son directamente proporcionales a la cantidad de blanco presente. Además, la Abscription® es un sistema tanto cualitativo y cuantitativo para medir un blanco tal como mCpG.

Los promotores abortivos pueden incorporarse en los blancos de ADN a través de los procesos de amplificación del blanco o formarse en blancos de ADN de doble o hebra simple mediante hibridación de una segunda hebra. Más generalmente, sin embargo, la Abscription® puede usarse para detectar una amplia variedad de moléculas blanco mediante unir los APCs a aquellos blancos (Figura 2, 2A, 2B). Para la detección de proteína, el ARN o ADN, los APCs se conectan a una Sonda de Unión Blanco (TAP) que unirá el blanco molecular (Figura 2). Para la detección del ADN y ARN, los TAPs incluyen oligonucleótidos o proteínas que se unen específicamente al blanco del ácido nucleico (Fig. 2A). Para la detección de proteínas, los APCs pueden unirse a cualquiera que se una a la proteína blanco. Vahas pruebas se han desarrollado las cuales emplean dos anticuerpos dirigidos al mismo blanco, similar a ELISA, uno para la captura del blanco y uno para la unión del APC (Fig. 2B), Síntesis de Trinucleótidos Los Abscripts de trinucleótidos pueden hacerse exclusivamente con la inclusión de los NTPs del terminador de cadena o mediante omitir uno o más NTP. Los abscripts pueden marcarse para la detección y captura mediante la incorporación de los dinucleótidos modificados (Dissinger & Hanna, J. Biol. Chem (1990) 265:7662-8: Dissinger & Hanna, J. Mol. Biol. (1991 ) 219: 1 1 -25; Hanna, Meth. Enzymol., (1989) 180:383-409; Hanna ef al. Biochemistry (1989) 28:5814-20; Hanna & Meares, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, (1983) 80:4238-42; Hanna & Meares, Biochemistry (1983) 22:3546-51 .29-34), o NTPs (Harma, ef al. Nucleic Acids Res. (1999) 27:1369-76; He et al, Nucleic Acids Res (1995) 23: 1231 -8) durante la Abscription®. "Etiqueta" como se usa en este documento se refiere a una porción, la presencia de la cual en una molécula puede detectarse y distinguirse directamente o indirectamente. Las etiquetas típicamente son más fácilmente detectadas, con mayor eficiencia y/o especificidad que la detección de una especie no marcada nativa. La etiqueta apropiada para usarse en los métodos de la presente invención incluye grupos fluorescentes, etiquetas de afinidad (tal como biotina) y carga o masa de nucleótidos modificados.

En una modalidad, las pruebas descritas en este documento involucran la producción de diferentes Abscripts trinucleótidos que difieren por la movilidad o peso molecular. Los trinucleótidos se fabrican por el ARNP en proporciones de 1000 a 2000 por minuto en APCs mediante unir un iniciador dinucleótido y un trifosfato nucleósido. Los abscripts trinucleótidos pueden detectarse sin marcación mediante la espectrometría de masa o el sombreado de UV y TLC rápido. Alternativamente, los abscripts pueden detectarse a través de una etiqueta (por ejemplo, porción fluorescente) incorporada en un iniciador dinucleótido.

La presente invención proporciona métodos para detectar un polinucleótido en una muestra mediante contactar una muestra conteniendo el polinucleótido con un par iniciador que específicamente híbrida a y amplifica una secuencia blanco del polinucleótido. El par iniciador incluye un primer iniciador que es complementario al polinucleótido, flanquea la secuencia blanco y contiene la etiqueta 5' de captura. El segundo iniciador tiene tres regiones: una secuencia 3' complementaria para el polinucleótido que flanquea la secuencia blanco en el lado opuesto de la secuencia blanco desde el primer iniciador; una primera secuencia iniciadora 5' a-TAP que se usa para unir el APC siguiendo la amplificación y un nucleótido no natural entre las secuencias 3' y 5' que es típicamente una eteno-desoxiadenosina.

La secuencia blanco del polinucleótido es posteriormente amplificada (por ejemplo, mediante la reacción de cadena de polimerasa) usando el primero y segundo iniciadores y la secuencia blanco amplificada se captura en un soporte sólido conteniendo una molécula que une la etiqueta 5' de captura. Cualquier técnica de PCR disponible o el método de amplificación del ácido nucleico apropiado puede emplearse para esta etapa, tal como los métodos de PCR qué usan polimerasa de ADN termoestable y/o enzimas de polimerasa de ARN. Por ejemplo, la etiqueta de captura puede ser biotina y el soporte sólido puede ser lechos de estreptavidina, tales como lechos magnéticos. Los amplicones capturados posteriormente pueden lavarse para remover los iniciadores no unidos y si se desea, eludirse del soporte sólido.

Para detección de la secuencia de polinucleótidos blanco, una sonda se híbrido para el amplicón. Esta sonda incluye una secuencia 5' TAP complementaria a la secuencia a-TAP. Debido a la inclusión del. nucleótido no natural en el segundo iniciador PCR, la secuencia a-TAP no se copia durante la PCR y permaneces en una o doble hebra durante la amplificación por lo tanto permitiendo que la secuencia TAP de la sonda se híbride sin desnaturalización del blanco amplificado. La eteno-deoxiadenosina puede usarse como el nucleótido no natural pero el experto estará alerta de los nucleótidos no naturales apropiados adicionales (por ejemplo, análogos de nucleótidos) que terminan en la replicación y además pueden sustituirse por eteno-deoxiadenosina. La sonda también incluye un APC, que proporciona la plantilla para sintetización de los Abscripts usando los métodos de Abscription® como se describió anteriormente. Finalmente, los abscripts se detectan por cualquier método apropiado, particularmente los métodos descritos en este documento para la detección de Abscript tales como espectrometría de masa, electroforesis capilar o cromatografía de capa delgada. Típicamente los Abscripts tendrán una longitud de desde 3 a 20 nucleótidos y pueden marcarse mediante la incorporación de un nucleótido detectablemente marcado (por ejemplo, fluorescente) durante la Abscription®.

En otras modalidades de la invención, la etapa TAP/a-TAP puede eliminarse mediante incluir una secuencia APC en el extremo 5' del segundo iniciador de amplificación y omitiendo el nucleótido de ocurrencia no natural. En dichas modalidades, un APC de doble hebra se genera durante la amplificación adyacente para la secuencia blanco amplificada que dirigirá la Abscription® en la adición de ARNP y los nucleótidos. Si estos reactivos de Abscription® están presentes durante la amplificación, la Abscription® y la amplificación pueden realizarse simultáneamente en el mismo tubo.

Estos métodos de la invención pueden adaptarse para multiplexación (es decir, detección de una pluralidad de polinucleótidos simultáneamente) mediante incluir pares iniciadores específicos a cada polinucleótido en la reacción. De acuerdo a esta modalidad de la invención, cada par iniciador se designa para hibridar específicamente a y amplificar una secuencia blanco única de un polinucleótido. La secuencia a-TAP para cada par iniciador también es única, por lo tanto actuando como un identificador para la secuencia blanco. Mediante hibridar una secuencia TAP complementaria que incluye un APC de identificación único siguiendo la amplificación PCR, la presencia de cada polinucleótido puede interrogarse con base en los Abscripts producidos en la reacción múltiple. Además, un APC único se une a cada polinucleótido blanco amplificado y la señal Abscript distinguible producida del APC puede detectarse y medirse como una indicación de la presencia del polinucleótido blanco. Por ejemplo, cada APC puede designarse para generar un Abscript distinguible en la base del peso de la molécula o la secuencia de nucleótidos. En una sola reacción, 5, 10, 20 o más secuencias blanco únicas pueden detectarse.

La presente invención también proporciona métodos para determinar el estado de metilación de las islas CpG sin el uso de la desaminación con bisulfito. Dicho método combina la amplificación blanco con un proceso de amplificación de señal línea, la Abscription® haciéndola extremadamente sensible.

En ciertas modalidades de la invención, el polinucleótido blanco es una isla CpG metilada -o una pluralidad de islas CpG (es decir, multiplexión). En estas modalidades, el ADN genómico conteniendo islas CpG metiladas primero se penetra usando una enzima de restricción predeterminada que no corta la isla o ninguna de las islas en una prueba de multiplexión. Los fragmentos de ADN metilado posteriormente se capturan del ADN genómico usando un reactivo MBD inmovilizado y los fragmentos de captura interrogados para las secuencias de CpG específico de interés. De acuerdo con un método de la invención, el proceso inicia mediante el aislamiento del ADN metilado de ADN genómico fragmentado usando un proceso de enriquecimiento de ADN. En un aspecto de la invención, el método de enriquecimiento usa una proteína de fusión de S-transferasa-glutatión que contiene el dominio de unión de metilo de ratón MBD2, que es altamente específico para el ADN metilado. El ADN metilado unido a la proteína de fusión MBD2 se captura rápidamente mediante los lechos magnéticos de glutatión y eludidos directamente en el estabilizador para la amplificación por la reacción de cadena de polimerasa. Las islas CpG de interés se amplifican usando un par de iniciadores PCR modificados. La primera contiene un grupo biotina para la captura subsecuente de la isla CpG blanco para los lechos magnéticos de estreptavidina. El segundo iniciador contiene una secuencia de isla específica que "marca" el amplicón para la unión de un APC específico. Una vez amplificado, las islas se capturan para los lechos de estreptavidina; los APCs únicos se unen mediante hibridación y la Abscription® se inicia. Cada isla CpG por lo tanto genera un Abscript diferente, por lo tanto múltiples islas CpG pueden interrogarse en cada reacción.

Alternativamente, una secuencia APC puede incorporarse en el segundo iniciador de amplificación, y un APC doble generado durante la amplificación. Este avance permite la amplificación y la Abscription® a realizarse al mismo tiempo mediante incluir el ARNP y los nucleótidos en la reacción de amplificación. Porque este método acopla la amplificación blanco con la amplificación de señales, menos el ADN inicial que se requiere con la mayoría de los métodos de detección de ADN metilados y menos de 2 ng de ADN genómico es suficiente para la etapa inicial de aislamiento del ADN metilado. La prueba completa es muy rápida, requiriendo menos tiempo del operador que la mayoría de las pruebas de competición. La prueba puede usarse como se describe con los lechos magnéticos y también puede formatearse para alto análisis completo en un formato de placa de mitro titulación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Métodos de Abscription® La Abscription® se ha descrito previamente, ver por ejemplo, la Solicitud de Patente Estadounidense No. 09/984,664 (presentada el 30 de Oct, 2001 ) ahora la Patente Estadounidense No. 7,045,319; 10/425,037 (presentada el 29 de Abril, 2003); 10/600,581 (presentada el 23 de Junio, 2003), 10/602,045 (presentada el 24 de Junio, 2003); 10/607,136 (presentada el 27 de Junio, 2003), ahora la Patente Estadounidense No. 7,226,738; 10/686,713 (presentada el 17 de Oct, 2003); 10/976,240 (presentada el 29 de Oct., 2004 ); 10/790,766 (presentada el 3 de Marzo, 2004); 10/488,971 (presentada el 18 de Oct., 2004); y 10/551 ,775 (presentada el 14 de Sep., 2006) los contenidos de cada una. de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

EJEMPLO 2. Detección de Espectrometría de Masa de Abscripts Los Abscripts de trinucleótidos se detectan mediante espectrometría de masa siguiendo su fraccionamiento de iniciadores dinucléotidos por la HPLC. La salida del fraccionamiento se trama como el conteo total de ión en contra del tiempo de retención cromatográfica como se ilustra en la Figura 4. El perfil cromatográfico para cualquier ión puede tramarse similarmente. Las contribuciones de m/z especies particulares en un tiempo de retención específico pueden resumirse para dar la cantidad de Abscript como el área bajo el pico cromatográfico. La Figura 4A muestra el espectro de ión asociado con el Abscript GAG (tiempo de retención de 5.4 min). La producción de GAG sería la suma de especies con valores m/z de 477.6, 956.1 y 978.2. Estas especies cuentan por ser doblemente cargadas, cargadas una vez y por causar aducción de sodio respectivamente.

EJEMPLO 3. Preparación de la Proteína GST-MBD Una proteina de fusión GST que contiene el dominio de unión de metilo (MBD) del ratón MBD2 se construyó como se ilustra en la Figura 5. Los codones para el dominio MBD se optimizaron para la expresión en E. Coli. La construcción contiene un sitio de penetración de trombina entre los dominios GST y MBD. La proteína GST también contiene cuatro residuos de superficie de cisteína que se usaron para la unión de los APCs o la Biotina. Los detalles de la proteína GST-MBD se proporcionan en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 61/053,648 presentada el 15 de Mayo, 2008 los contenidos de la cual se incorporan en este documento como referencia y en particular, los Ejemplos 2-1 1 describiendo la preparación y uso de las proteínas de fusión MBD.

El dominio GST permite la proteína de fusión o sus complejos con el ADN metilado para aislarse en las resinas o los lechos de Glutatión y eludirse con glutatión, o para capturarse o detectarse con los anticuerpos que reconocen GST.

MBD de la proteína MBD2b se seleccionó para las construcciones finales porque el MBD2b tiene la afinidad más alta entre las proteínas de unión CpG de metilo conocidas para los sitios Me-CpG y la reactividad cruzada más baja con los CpGs no metilados. Tiene entre una afinidad mayor de 25 a 100 veces para los sitios Me-CpG que el MeCP2 y una preferencia mayor de 9.7 a 43 veces para el ADN metilado que el MeCP2 (Fraga ef al. (2003) Nucleic Acids Res., 31 :1765-74). Adicionalmente, no existen efectos de contexto de secuencia en el reconocimiento de CpG MBD2, como existe para MeCP2, que requiere una carrera de 4 A-Ts cerca de un sitio CpG. Por lo tanto un número mayor de sitios mCpG se reconocen por MDB2 que por MeCP2.

EJEMPLO 4. GST-MBD2 Inmovilizada retiene Alta Especificidad para el ADN Metilado incluso con 2 mg o menos del ADN de Salida La proteína GST-MBD se unió a los lechos magnéticos de glutatión y usada para aislar cantidades variantes de ADN metilado para determinar el tamaño de muestra de ADN inicial mínimo que podría recuperarse con alta especificidad. El ADN genómico HeLa artificialmente metilado con Sssl metilasa se incubó con lechos magnéticos de GST-MBD por 1 hora a 22°C con mezclado giratorio horizontal en 1000 rpm. El ADN unido se eluyó de los lechos después de la remoción del sobrenadante conteniendo el ADN no unido, mediante incubación a 80°C por 10 minutos con mezclado giratorio horizontal en 1000 rpm. Las muestras de ADN eluidas se probaron para la presencia de PTGS2 (GenBank Gl:34576917) ADN por qPCR usando el par iniciador 5'-ggtacgaaaaggcggaaaga-3' (SEQ ID NO:6) y 5'-tgtgggaaagctggaatatc-3' (SEQ ID NO:7) con tinte verde SYBR® para la detección. PTGS2 es nó metilado en HeLa y se esperó que permaneciera en el sobrenadante de la reacción de unión. Una recuperación de 94% de una entrada de 2 ng de ADN genómico de ADN artificialmente metilado se observó en la fracción eluída mientras 100% del ADN PTGS2 no modificado de HeLa se recuperó en la fracción sobrenadante como se espera. En una entrada de 1 ng de ADN HeLa metilado, 73% de ADN PTGS2 se unió y se recupero con elución con calor. Ninguna unión de la versión no metilada de HeLa no modificada se detectó. La cantidad de ADN más baja (2 ng) que podría visualizarse por el manchado de electroforesis de gel de agarosa corresponde a aproximadamente 300 células. Incluso menos ADN puede aislarse y detectarse usando Abscription® para la detección del amplicón.

EJEMPLO 5. Abscription® basada en la Prueba de Metilación CpG La Figura 6 ilustra un protocolo total para determinar el estado de metilación de las islas CpG múltiples. Brevemente, el ADN metilado fragmentado de una muestra de ADN genómico se aisla, seguido por la amplificación de las islas CpG específicas cuyo estado de metilación está bajo investigación. Para la amplificación, un iniciador contiene una etiqueta de afinidad, tal como biotina, que permite la recuperación e inmovilización de la isla. El segundo iniciador contiene una secuencia para la unión de la Cinta Promotora Abortiva.

Este método permite la amplificación y el aislamiento de cómo muchas islas CpG en una muestra como iniciadores PCR compatibles puede designarse. Porque el ADN no se desamina con el tratamiento de bisulfito, que resulta en la conversión de "C"s a "dU", se evitan los objetivos problemáticos para la multiplexión de alto nivel asociada con la pérdida de la heterogeneidad de secuencia causada por la desaminación. Dado que los sitios del iniciador no se limitan rígidamente a las secuencias especificas en el blanco, existe suficiente flexibilidad en la colocación del iniciador para permitir el diseño de juegos de iniciadores compatibles múltiples (Henegariu ef al. Biotechniques (1997) 23:504-1 1 ; Onishi ef al. J. Agrie. Food Chem. (2005) 53:9713). Un APC diferente se une a cada isla CpG blanco, por lo tanto generando una señal Abscript diferente para cada una. Además, la detección simultánea de islas CpG múltiples de una sola muestra pueden lograrse.

Brevemente, el ADN genómico nativo se fragmenta y posteriormente se une a los lechos de glutatión conteniendo la proteína de fusión de Dominio de Unión de Metilo (MBD) de Glutatión-S-Transferasa (GST) anteriormente descrita en el EJEMPLO 3. Solamente el ADN metilado se une (Figura 6, Etapa 1 ). Después del lavado, el ADN metilado se eluyó de los lechos (Figura 6, Etapa 2) y las islas a interrogarse se amplificaron por PCR (Figura 6A. Etapa 3). Uno de los iniciadores contiene una etiqueta de captura (por ejemplo, biotina) en el extremo 5' (Figura 7). El segundo iniciador contiene 2 regiones. La primera es una secuencia de polinucleótido complementaria para el ADN blanco. La segunda región es una secuencia arbitraria disimilar para el ADN blanco u otras islas (Figura 7). Esta segunda secuencia es complementaria a una secuencia de la Sonda de Unión Blanco (TAP) que se une a un Promotor Abortivo (APC). El complemento para la secuencia TAP se llama secuencia anti-TAP (a-TAP). La secuencia a-TAP permanece en una hebra-doble hebra durante la amplificación de PCR del ADN blanco debido al blanco y a la secuencia a-TAP (el nucleótido e? en la Figura 7). Después de la amplificación, las islas se inmovilizan, por ejemplo en los lechos de estreptavidina (Figura 6A, Etapa 4) y el ADN genómico restante y los iniciadores se lavan aparte. El polinucleótido TAP-APC posteriormente se contacta con el ADN blanco amplificado e híbrida a la secuencia anti-TAP de simple o doble hebra (Figura 6B, etapa 5). El TAP-APC libre se lava aparte y los reactivos de Abscription® se agregan para generar las señales Abscript (Figura 6B, Etapa 5). Los detalles adicionales del método se proporcionan posteriormente.

Etapa 1 : Corte del ADN genómico La etapa de digestión inicial se designó para generar los fragmentos que contienen las islas CpG o las porciones grandes de los mismos. Los sitios de restricción se seleccionan para caer fuera de la región a analizarse y son ni dependientes de la metilación ni sensibles a la metilación. Las enzimas de restricción con las secuencias de reconocimiento de base 4 se usan. La Tabla 1 lista los tamaños de fragmento generados por Msel o Ddel para una muestra de las 6 islas CpG reportadas para ser metiladas diferencialmente. Más de 3 pg de ADN genómico se digestaron con 20 unidades de Msel (NEB, Beverly, MA) en el estabilizador de restricción del vendedor (estabilizador NEB 4). Las reacciones de penetración se incubaron por al menos 8 horas a 37°C. La medida de penetración se mide mediante el funcionamiento de PC en una muestra del digesto usando un iniciador que contiene la secuencia Msel. Los controles positivos son ADN genómico no tratado con Msel y una reacción de amplificación del ADN tratado con Msel usando iniciadores que no se afectan por la digestión Msel.

„ El propósito de la digestión es no unirse a las islas blanco de las secuencias CpG cercanas que pueden ser normalmente metiladas y por lo tanto causan la transferencia de una isla no metilada para la fracción de ADN metilado. En la mayoría de los casos el Msel o Dde I producen un solo fragmento que cuenta para el volumen de la secuencia de isla sin incluir muchas secuencias cercanas. La excepción fue la penetración excesiva de MGMT con Ddel. En este caso, la enzima alterna produjo resultados satisfactorios. En los casos en donde una isla CpG se fragmenta en varios fragmentos, cada segmento puede analizarse con su propio juego de iniciadores.

TABLA 1. Plantillas de la Penetración de la Isla CpG Etapa 2: Aislamiento y recuperación del ADN metilado La etapa de captura del ADN metilado se formatea para los lechos magnéticos soportando la glutatión. La proteína GST-MBD se precargó en los lechos suspendidos en la muestra de ADN después de la remoción de la proteína GST-MBD en exceso. La unión del ADN se realizó por 1 hora a temperatura ambiente (22-24°C) con el mezclado para mantener los lechos en un estado suspendido (Termomezclador Eppendorf, 1000 rpm). Las muestras de ADN típicamente contienen entre 1 ng a 50 ng de ADN genómico en un volumen de 50 pl de estabilizador de enlace. Al término de la etapa de unión, los lechos se aglomeraron al lado del tubo con un imán de tierra rara y el sobrenadante conteniendo ADN no metilado se removió. Los lechos se lavaron dos veces con 40 µ? de un estabilizador de lavado conteniendo la misma concentración de NaCI como el estabilizador de enlace (160 mM). Cada lavado se incubó por 5 min a temperatura ambiente con mezclado (1000 rpm). Un lavado final se realizó con el estabilizador TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Los lechos se suspendieron en 400 µ? de TE e inmediatamente se aglomeraron con el imán. El estabilizador de lavado SE TE desechó y los lechos se suspendieron en 50 µ? de estabilizador de elusión (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).

El ADN metilado puede eludirse de los lechos con varios métodos alternos. Los lechos en el estabilizador TE pueden incubarse por 10 minutos a 80°C con mezclado (1000 rpm). Los lechos se aglomeran con el imán y el ADN eluído se recupera. En un método alterno, los lechos se suspenden en el estabilizador de elución que contiene 0.1 % de SDS. La elución completa del ADN metilado unido se logró con una incubación simple de 20 minutos en 50°C. El ADN eluído está listo para PCR sin procesamiento adicional proporcionando un detergente no iónico tal como Tween-20 que está incluido en el estabilizador PCR {ver Goldenberger eí al. PCR Methods Appl. (1995) 4:368-70). La elución también puede realizarse con la exposición de los lechos por 10 minutos al estabilizador de elución conteniendo un mínimo de 20 mM de glutatión reducido en pH 8. La Figura 5B muestra los resultados del fraccionamiento de la isla CpG SNRPN del ADN HeLa. El ADN metilado se liberó con tratamiento con calor. El SNRPN es un gen impreso. Una copia se metilo completamente y la otra copia no se metilo normalmente. Una mitad esperada de las copias SNRPN se encontró en el sobrenadante (Figura 5B,' fracción S, fracción no metilada) y la mitad de las copias se eluyeron de los lechos eri la primera elución (Figura 5B, fracción E1 , fracción metilada). Todo del ADN metilado se extrajo en la primera elución. Dos eluciones seriales después de la primera elución (E2 y E3) no contienen SNRP ADN. La isla CpG del gen PTGS2 (no metilado en HeLa) se usó como un control negativo (Figura 5C). Todo del ADN PTGS2 apareció en la fracción del sobrenadante.

Etapa 3: Amplificación de PCR con iniciadores marcados Los segmentos de isla CpG se amplificaron y se marcaron con una etiqueta de afinidad de biotina y una secuencia de oligonucleótidos de una hebra que se usa para unir una cinta del promotor abortivo (APC). Las reacciones PCR contuvieron 1 x del estabilizador de Inicio en Calor (Fermentas) 0.8 m de dNTPs (0.2 mM cada uno), 2 mM de MgCI2 y 5% (volumen/volumen) de DMSO. El iniciador con biotina y el iniciador a-TAP estuvieron presentes en 1 µ? cada uno. Las amplificaciones se realizaron con 2 unidades/20 µ? de reacción de polimerasas de ADN de etiqueta de inicio en calor TrueStart™ (Fermentas). Una unidad igual a la incorporación de 10 nmol de dNTPs en 30 minutos a 74°C. Las condiciones para el ciclo fueron 95°C por 1 minuto, seguido por más de 32 ciclos de 95°C por 30 segundos, 62°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos. Una etapa de prolongación final fue en 72°C por 5 minutos. Las reacciones completas se sostuvieron a 4°C. Las Figuras 5B y 5C muestran la detección de los ADNs amplificados, fraccionados por la electroforesis de gel de agarosa.

Diseño de la secuencia del iniciador a-TAP Los iniciadores se optimizaron para la alta intensidad de señal mediante minimizar las interacciones entre las tres secuencias a-???/iniciador del oligonucleótido que están presentes en la reacción PCR. El iniciador PCR biotinilado y el extremo 3' del a-TAP se usaron para la síntesis del ADN del iniciador durante la amplificación y fueron diseñados para usar el programa del iniciador (Oligo Explorer 1.2) para minimizar las interacciones iniciadoniniciador y la formación de los rizos de horquilla del iniciador. El a-TAP en el extremo 5' del segundo iniciador se diseño para ser incorporado dentro del amplicón y permanecer en una sola hebra debido a la presencia de un nucleótido no codificado, etenoA (e?), que separa la secuencia del iniciador del a-TAP. La mayoría de las polimerasas de ADN incluyendo la polimerasa Taq que no puede incorporarse a una síntesis terminal y dNTP e? opuesto (Figura 7) (ver Patel et al. J. Biol. Chem. (2001 ) 276:5044-51 ). El análogo nucleótido previene que la secuencia a-TAP sea copiada durante el PCR: Las interacciones potenciales entre la secuencia a-TAP y la secuencia del iniciador se minimizan para evitar la inhibición de PCR y los resultados falsos positivos resultan de la inmovilización no específica de un a-TAP completamente de una hebra.

El diseño de iniciador pasó a través de 3 etapas. Primero las secuencias de iniciación se optimizaron dentro del siguiente criterio: 1 ) una longitud de iniciador entre 16 a 20 nt; 2) un Tm cerca a 60°C; 3) las interacciones iniciador-iniciador con los extremos 3' emparejados base fueron eliminadas; 4) otras interacciones de iniciador-iniciador deben tener un Tm de < 16°C y 5) estructuras de horquilla con Tm > 8°C se rechazaron. Los pares iniciadores para las 6 islas CpG se desarrollaron exitosamente usando este criterio.

La segunda etapa en la optimización del iniciador fue para eliminar las estructuras de horquilla en el oligonucleótido del iniciador a-TAP que interferiría con PCR o la unión de un TAP-APC. Una colección de 6 secuencias a-TAP candidatas se designan con base en el fago MS2 ARN, fr y secuencias ?ß. Cada a-TAP candidato se probó in silico y aquellos que formaron horquillas con un Tm>26°C bajo nuestras condiciones de alineación TAP se modificaron para eliminar la horquilla y se volvió a probar (Zuker, Nucleic Acids Res. (2003) 31 :3406-15). La sola limitación en modificar las secuencias a-TAP fue que no adquirieron complementariedad significante con las secuencias iniciadoras. Las interacciones de horquilla potenciales entre un a-TAP y una secuencia de iniciador unida se probaron in silico y si es necesario la secuencia a-TAP fue cambiada para minimizar la estabilidad de la horquilla y/o prevenir la extensión del iniciador de una horquilla. Un iniciador ejemplarizador a-TAP oligonucleótido (SEQ ID NO:42) tiene, una estructura de horquilla con un Tm de 40°C bajo condiciones de PCR usadas, pero el ADN CDKN2A amplificado como eficientemente como el iniciador careciendo de la extensión a-TAP en combinación con el iniciador inverso SEQ ID NO:43. Finalmente las interacciones entre a-TAP y el iniciador biotinilado se probaron en el programa de diseño de iniciadores usando una fila de la secuencia de la isla CpG con el a-TAP en el apéndice en el extremo de la fila y seleccionándolo como su iniciador junto con la secuencia del iniciador biotinilado. a-TAP y los pares de iniciador inversos se desarrollan para las islas CpG como se listan posteriormente en la Tabla 2.

Tabla 2. Pares Iniciadores Inversos y a-TAP Isla CpG Iniciador a -TAP Iniciador Inverso 5'- DAPK1 cacaggtcaaaggtcataaaaatg[6A]TTt 5'-Biotina-gtcctcctcacactccg-3' (SEQ ID NO:44) cccataccaagcaccgt-3' (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:8) 5'-cgaaaatgcatctgagtagc[6Al SNRPN 5'-Biotina-ggtatcctgtccgctcgca- acctccg 3' (SEQ ID NO:49) cctaaaatccctatg-3" (SEQ ID NO:19).

(SEQ ID NO:18) Diseño TAP-APC Los TAP-APCs se hicieron mediante la hibridación de las hebras de no plantilla TAP-APC para las hebras de plantilla APC complementarias. Las porciones APC fueron de hebras dobles y los segmentos TAP fueron de una hebra extendiéndose desde las hebras no plantillas. TAP-APCs fueron designados de manera que una colección de APCs codificó el mismo abscript para usarse en las reacciones de plex simple o una colección de TAP-APCs cada uno codificó un abscript diferente permitiendo la detección múltiple. Los TAP-APCs de un plex simple y de hebra simple se designaron para los a-TAPs como se indica posteriormente en la Tabla 3.

Tabla 3. TAP APCs de Plex Simple Isla CpG TAP APC DAPK1 5'-catttttatgacctttgacctgtggctgttgacacagaataaacgctcaatgtacaatgggatggag (SEQ ID NO:44) aggtgctttagta gtgtt-3' GSTP1 5'-gtcgtgtggcttcttgggctgttgacacagaataaacgctcaatgtacaatgggatggagaggtg (SEQ ID NO:47) ctttagtagtgtt-3' Los TAP-APCs de un solo plex y de una sola hebra se templan a una hebra de plantilla común codificando el mismo abscript (SEQ ID NO:32).

Los TAP-APCs compatibles múltiples fueron cada uno en pares con su propia hebra de plantilla codificando un abscript único. Una colección de TAP-APCs múltiples (Tabla 4) podría usarse junta para detectar las islas CpG listadas en la Tabla 4.

TABLA 4. TSP-APCs Compatibles Múltiples Isla CpG TAP APC 5'-catttttatgacctttgacctgtgaaatttatgtttgacagatcttacaatgcatgctataataccacta DAPK1 acggtgctttaaaattccg-3' (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO:20) 5'-cggaattttaaagcaccgttagtggtattatagcatgcattgtaagatctgtcaaacataaattt-3' (SEQ ID N0:21 ) 5'-gtcgtgtggcttcttggaaatttatgtttgacagatcttacaatgcatgctataataccactgaaggt GSTP1 gatataaaattccg-3' 5'-tactttgggatggagggctgctggaggcgggtataatttagccagcaccgaatagttacggtcg-3' GMT (SEQ ID NO:24) (SEQ ID NO:46) 5'-cgaccgtaactattcggtgcttagggcagcgcccccgcctccacgagc-3' (SEQ ID NO:25) Etapas 4 y 5. Unión de amplicones a los lechos de estreptividina y unión de TAP-APCs Los amplicones biotinilados se unieron a los lechos de estreptavidina para remover las sondas libres y los APCs no unidos en las etapas subsecuentes de la prueba.

En experimentos de optimización, la unión completa de amplicones para los lechos magnéticos de estreptavidina en la presencia de 10 pmol del iniciador biotinilado se observó con una capacidad de unión total de 40 pmol del oligonucieótido biotinilado. El tiempo de unión se optimizó para minimizar el curso del tiempo de la prueba usando la electroforesis del gel de agarosa para medir la remoción de los amplicones desde la fase de estabilización de la reacción de unión. La unión cuantitativa de los amplicones biotinilados se observó en 5 minutos de mezclado de los lechos y las muestras de ADN.

La unión de TAP-APC al amplicón se realizó exitosamente libre en solución antes de la adición de los lechos de estreptavidina o después de la unión de los amplicones a los lechos seguido por una etapa de lavado para remover los oligonucleótidos a-TAP del iniciador libre. Los Tms para los TAPs oscila entre 55.8-64°C bajo las condiciones de templado usadas (150 mM Na+). El TAP APC se agregó a 0.5 µ? y se incubó a 51 °C para un mínimo de 15 min. No se requirió alta severidad para lograr el enlace eficiente. El análisis de TAPs y a-TAPs indicó que la formación de la horquilla fue insignificante bajo estas condiciones de templado. La complejidad de secuencia de la reacción fue incluso baja en las preparaciones sujetas a PCR múltiple. Al menos 3 pares de a-TAPs y TAPs están presentes en una reacción triple y estas secuencias pueden cambiarse arbitrariamente para prevenir la hibridación cruzada. Esta etapa de templado se optimizó con respecto a la temperatura en un termociclador de gradiente y el tiempo más corto de templado se determinó usando el intercambio de movilidad electroforética del amplicón como un punto terminal.

Las reacciones de PCR se diluyeron 1 :1 en el estabilizador de enlace de ADN para proporcionar una concentración final de NaCI de 150 mM. El TAP-APC apropiado se agregó a cada muestra de ADN para una concentración final de 0.5 µ?, seguidos por una incubación a 51 °C por un mínimo de 15 min.

Los lechos magnéticos de estreptavidina fueron sometidos a alícuotas para tubos de PCR. Los lechos se lavaron con 10 µ? de 50% de estabilizador de unión (volumen/volumen). Los lechos lavados se suspendieron en las muestras de ADN seguidas por la incubación a 51 °C por un mínimo de 5 min.

La reacción de unión se terminó mediante la granulación de los lechos con un imán y remover el estabilizador de unión. Los lechos se sometieron a 2 lavados en 180 pl de estabilizador de lavado conteniendo la misma concentración de NaCI 50% (volumen/volumen) como el estabilizado de unión (150 mM). Cada etapa de lavado incluyó una incubación de 5 min en 51 °C para replicar la severidad de la reacción de unión y posteriormente los lechos se granularon rápidamente con .el imán. Un tercer lavado fue en 40 mM HEPES pH 7.5, 40 mM KC1. Los lechos podrían almacenarse refrigerados o podrían someterse inmediatamente a Abscription®.

Etapa 6: Abscription® Los lechos conteniendo el amplicón de unión: TAP-APCs se granularon con un imán para remover el estabilizador de almacenaje y se suspendieron en 10 µ? de estabilizador de Abscription® conteniendo 1 mM de iniciador de dinucleótido (GpA), 1 mM de NTP (GTP) y 0.4 unidades de polimerasa de ARN. Una unidad cataliza la incorporación de 1 mmol de NTP en 60 min a 65°C. Las reacciones de Abscription® se incubaron por 1 hora a 77°C.

Los abscripts se detectaron mediante sombreado de UV mediante la división de muestras de 1.5 µ? en una placa TLC de gel de sílice conteniendo un flúor. Los TLCs conteniendo 100 mi de solvente (lsopropanol:hidróxido de amonio:solución activadora, 6:3:1 ). Los Abscripts fueron detectados como puntos oscuros bajo la luz UV de onda corta como se ilustra en la Figura 8 (oscurecimiento UV).

Para la detección LC-MS, 10 µ? de la reacción de Abscription® se diluyeron en 20 µ? de agua grado HPLC en una placa de 384 pozos. Diez micro litros se procesaron y cuantificaron por LC-MS como se ilustra en la Figura 8A.

Tabla 5. Sensibilidades de Taq an® y Pruebas de Abscription® „ Abscription® (1.5 hr) TaqMan® TLC LC-MS LOD LOD Copias Ct Ciclos Ciclos (copias) (copias) 9000 28 29 100 29 30 3000 30 1000 32 300 34 100 35 La Figura 8 muestra los resultados de la detección basada en Abscription® a-TAP de HeLa titulado comparado con PCR TaqMan® usando los mismos sitios de iniciación para ambos métodos. 5'-gcgggaccctccagaa-3' (SEQ ID NO:3) y 5'-actcactggtggcgaagact-3' (SEQ ID NO:4) se usaron para la amplificación qPCR. 5'-FA -accacccttataaggctcggaggcc-lowa Black™ FQ templador-3' (SEQ ID NO:5) fue la sonda fluorescente. 5'-actcactggt ggcgaagact-3' (SEQ ID NO: 13) y 5'-cctccatcccaaagta[eA]gcgggaccctccagaa -3' (SEQ ID NO: 12) fueron el par iniciador a-TAP. La Figura 8 muestra los resultados de la detección TLC. Los iniciadores de Abscription/PCR fueron SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13. El TAP-APC se hizo mediante el templado de la SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32. El APC codificó el Abscript GAG. Los Abscripts se detectaron usando cromatografía de cada delgada (TLC) y sombreado UV. El límite de la detección (LOD) en 29 ciclos usando sombreado de UV fue 100 copias. La Figura 8A muestra la detección de LC-MS resulta para las mismas muestras analizadas en la Figura 8. Las entradas de ADN para las reacciones PCR variaron de 30 a 9000 copias genómicas. El LOD para LC-MS en 29 ciclos fue 30 copias. El área se refiere al área del pico cromatográfico conteniendo el Abscript (GAG).

PCR TaqMan® requirió 35 ciclos para la detección de 100 copias y 37 ciclos de detección de 30 copias (Figura 8 y Tabla 5). La detección basada en Abscription® fue más sensible que TaqMan® incluso con TLC y sombreado UV.

La detección basada en TLC es más sensible si el sombreado UV se reemplaza con la detección de los Abscripts fluorescentes. El ADN genómico que se metilo en la isla CpG CDKN2A se amplificó con los iniciadores conteniendo un grupo biotina (SEQ ID NO:43) y una secuencia anti-TAP (SEQ ID NO:42). Las cantidades de ADN genómico inicial fueron 10 ng, 2.5 ng, 640 pg y 160 pg. Este corresponde a 3000, 750, 188 o 47 copias de ADN genómico. Después de la adición de TAP-APC codificando AUC, la Abscription® se llevó a cabo en la presencia de ApU dinucleótido marcado Cy5™ y CTP en 45C. Las muestras se retiraron (1 µ?) y se analizaron por TLC rápida. Los abscripts de 2.5 ng de ADN inicial podrían visualizarse después de 2 hrs de Abscription® y 47 copias podrían detectarse fácilmente después de 8 horas de Abscription® como se muestra en la Figura 9.

En este experimento, el producto de Abscription® fue el trinucleótido AUC Cy5 marcado. CY5™ es realmente un iniciador pobre comparado con varios otros tintes fluorescentes, reduciendo el rendimiento para la síntesis de trinucleótido por aproximadamente 8% de aquel con los dinucleótidos no marcados. Por esta razón, Cy5™ puede no ser el tinte de selección para estas pruebas, pero puede reemplazarse con otros tintes, tal como fluoresceína o DyLight (Pierce), ambos de los cuales proporcionan rendimientos cercanos al 35% de esos obtenidos con iniciadores no marcados. Mediante usar tintes con aproximadamente 4 veces mayor de eficiencia, las veces pueden reducirse correspondientemente, permitiendo la detección de menos de 50 copias de ADN inicial en 2 horas. La fluoresceína tiene la ventaja adicional de ser detectable con un bajo costo, luz UC de longitud de onda larga.

EJEMPLO 6. Detección de la metilación de la isla CpG de dos etapas con iniciadores APC Usando un método de detección de dos etapas, los ADNs metilados se aislaron de una muestra de ADN genómico fragmentado como en el método a-TAP de tres etapas (Ejemplo 5). Los fragmentos de ADN metilado se unieron a la proteína GST-MBD inmovilizada (Figura 10, Etapa 1 ) como se describió anteriormente. Los fragmentos metilados se liberaron medíante la exposición el calor a glutationa después de los lavados para remover el ADN no metilado (Figura 10, Etapa 2).

Las islas CpG blanco se amplificaron y marcaron usando un iniciador que contiene una secuencia de APC en su extremo 5' (Figura 10, Etapa 3). La forma de hebra simple del APC és inactiva pero llega a ser activa cuando se convierte en una forma de doble hebra durante la amplificación del blanco (Figura 10, Etapa 4). Además, la Abscription® puede realizarse durante la reacción de PCR si los iniciadores NTP(s) y ARNP se incluyen (Figura 10, Etapa 6).

EJEMPLO 7. Diseño y Validación de los iniciadores APC Los iniciadores APC se designaron para evitar la auto iniciación y la formación de los dímeros iniciadores con el iniciador invertido. Al menos algunos de estos eventos son probables para producir los promotores dobles activos que podrían crear altos niveles de Abscription® de fondo. Las secuencias del iniciador potenciales se analizaron como se describe en el EJEMPLO 5 para el potencial para formar los dímeros iniciadores y para la auto iniciación. La porción APC del iniciador APC es 44 nt de grande de este 33 nt que puede cambiar sin afectar significativamente la actividad de Abscription®. En la mayoría de los casos la auto iniciación o las interacciones de dímero iniciador potenciales podrían eliminarse mediante cambiar la secuencia del segmento de APC del iniciador APC.

Los pares iniciadores que se predice sean libres de interacciones potenciales se probaron mediante realizar las reacciones PCR en la ausencia de ADN sobre un rango de temperaturas de templado para determinar si los iniciadores solos podrían producir la señal de fondo. Primero, el iniciador APC se probó para determinar el nivel de auto iniciación. Después, las reacciones de PCR sin ADN se realizaron con ambos el iniciador APC y el iniciador inverso para probar los efectos del dímero iniciador. Las reacciones de PCR completadas se suplementaron con 1 mM de iniciador dinucleótido, 1 mM de NTP, 0.4 unidades de polimerasa de ARN y se analizaron mediante Abscription®. La Figura 1 1 muestra los resultados de la Abscription® para un par de iniciador designado por pozo (SEQ ID NO:33 y SEQ ID NO:34) que señala la isla GAPDH CpG. La Figura 11 muestra los datos de TLC para el iniciador APC solo (SEQ ID NO:34) y para el par iniciador junto con un control positivo que incluye el ADN genómico HeLa. El Abscript GAG codificado solamente podría detectarse en el control positivo. La Figura 11A muestra los datos LC-MS para las mismas muestras. Solamente el control positivo produjo el Abscript, mientras las reacciones careciendo de ADN no producen señal significante sobre un amplio rango de temperaturas de templado. Los pares iniciadores inversos/iniciador APC se desarrollaron para las islas CpG como se proporcionan en la siguiente Tabla 6.

Tabla 6. Pares del Iniciador Inverso/Iniciador APC Isla CpG Iniciador APC Iniciador Inverso GAPDH 5 -agagaattttttcataaacattaaatgtacaatgggaacgag 5'-ctgcctagggagagaga-3' (SEQ ID NO:45) aaccgtgtgcccaagacc-3' SEQ ID NO:34) SEQ ID NO:33 MGMT 5'-gctgttgacaattaataaacgctcaatgtacaatgggactg 5'-cctgtggtgggcgatgc-3' (SEQ ID NO:46) agactcttaggcttctggtggc-3' (SEQ ID NO:36) (SEQ ID NO:35) PTGS2 5'-tgcgaaccttgactataaaaattcaatgtacaatgggacgg 5'-tgtgggaaagctggaatatc-3' (SEQ ID NO:48) agaaggtacgaaaaggcggaaaga-3' (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:37) SNRPN 5'-gctgttgacacagttcaaacgctcaatgtaaaatgggaca 5'-cttgctgttgtgccgttctg-3' (SEQ ID NO:50) atcacctccgcctaaaatccctatg-3' (SEQ ID NO:40) (SEQ ID NO:39) GSTP1 5'-gctgaagacacagaataaacgatcaatgtataatgggact 5'-actcactggtggcgaagact- (SEQ ID NO:47) gagagcgggaccctccagaa-3' 3" (SEQ ID NO:41) (SEQ ID NO: 4) EJEMPLO 8. Comparación de la Detección de ADN metilado de las líneas celulares tumorales con a-TAP y los métodos del iniciador APC Las reacciones de PCR se realizaron con 0.4 unidades de Etiqueta de Inicio en Calor (Fermentas) en el estabilizador IX del vendedor conteniendo 2 mM de MgCI2, 0.8 mM de dNTPs (0.2 mM, cada uno) y 5% (volumen/volumen) de DMSO. Una unidad de Etiqueta de Inicio en Calor incorpora 10 mmol de dNTPs en 30 min. a 74°C. El iniciador APC y el iniciador inverso estuvieron a 1 µ? cada uno. Las condiciones de ciclado fueron 95°C por 1 minuto seguidas por más de 32 ciclos de 95°C para 30 seg, 62°C para 30 seg, y 72°C para 30 seg. Una etapa de prolongación final estuvo en 72°C por 5 minutos. Las reacciones completadas se sostuvieron a 4°C. Las reacciones PCR completadas (10 µ?) se suplementaron con 1 mM de iniciador dinucleótido, 1 mM de NTP y 0.4 unidades de polimerasa de ARN. La Abscription® posteriormente se realizó por más de 1 hora a 77°C.

La Abscription® podría realizarse durante PCR si el iniciador dinucleótido y el NTP se incluyen en la reacción PCR en 1 mM cada una. Una polimerasa de ARN termoestable se agregó a 0.4 unidades por 20 µ? de reacción. Una unidad cataliza la incorporación de 1 nmol de NTP en 60 m'in a 65°C. Las reacciones de Abscription® se incubaron por 1 hora a 77°C. Los abscripts podrían detectarse como se describe en los Ejemplos 2 y 5.

Tabla 7. Porcentaje de Metilación de los ADNs Celulares Tumorales Porcentaje de Metilación ± SD Muestra de ADN Método de Detección DAPK1 MGMT GSTP1 PTGS2 GAPDH SNRPN LNCaP (Próstata) 81 19 100 0.8±0.3 49± .5 Detección a-TAP 60 n=2 n=2 n=2 n=3 n=3 LNCaP 99±1.1 3.3±3.6 49±2.9 Detección del iniciador APC n=4 n=3 n=3 MDA-PCA-2C- (Próstata) Detección a-TAP 66 0 HeLa (cervical) 96.5±3.

Iniciador APC 0 48±2.9 0 4.8 n=2 ' n=7 n=5 La Tabla 7 muestra los resultados de la detección basada en Abscription® del ADN metilado de líneas celulares tumorales. La mayoría de las mediciones del replicado se hicieron con muestras medidas una vez de experimentos de fracciones múltiples. La isla GAPDH CpG fue no metilada lo cual se esperaba si los tumores mantenían el estado de metilación normal en esta isla. La isla SNRPN CpG ajusto la predicción para un gen impreso. Las otras islas fueron consistentes con los resultados publicados excepto para DAPK1 en LNCaP para el cual existen conclusiones divergentes en su estado de metilación (Yegnasubramanian et al. (2004) Cáncer Res. 64:1975-86; Lin er a/. (2001 ) Am J. Pathol. 159:1815-26; Paz et al. (2003) Cáncer Res. 63:1 1 14-21 ; Toyota ef al. (2000) Cáncer Res. 60-4044-48; Lodygin eí al. (2005) Cáncer Res. 65:4218-27J.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar al menos un polinucleótido blanco en una muestra que comprende: a) contactar una muestra que contiene al menos un polinucleótido con un par de iniciadores que específicamente hibridan a y amplifican una secuencia blanco de al menos un polinucleótido, en donde el par de iniciadores consiste de: i) un primer iniciador comprendiendo (1 ) una secuencia 3' complementaria a una primera secuencia flanqueando la secuencia blanco del polinucleótido y (2) una etiqueta de captura 5' y ii) un segundo iniciador comprendiendo (1 ) una secuencia 3' complementaria para una segunda secuencia flanqueando la secuencia blanco del polinucleótido y (2) una secuencia 5' que proporciona un medio para dirigir la Abscription; b) amplificar la secuencia blanco del primero y segundo iniciadores; c) contactar la secuencia blanco amplificada con una molécula inmovilizada que une la etiqueta de captura 5', por lo tanto capturando la secuencia blanco amplificada del polinucleótido; d) transcribir al menos un Abscript de los medos para dirigir la Abscription y e) detectar al menos un Abscript descrito en la etapa d).

2.. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los reactivos no unidos, los iniciadores y polinucleótidos se lavan de los polinucleótidos capturados e inmovilizados antes de la siguiente etapa.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la amplificación consiste de realizar una reacción de cadena de polimerasa.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la reacción de cadena de polimerasa se realiza con al menos uno de una polimerasa de ADN termoestable y una polimerasa de ARN termoestable.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la etiqueta de captura 5' es biotina y la molécula que une a la etiqueta de captura 5' es estreptavidina.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la molécula que une a la etiqueta de captura 5' se inmoviliza en un soporte sólido seleccionado de un lecho magnético y una placa de micro titulación.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde un nucleótido detectablemente marcado se incorpora en al menos un Abscript durante la etapa d).

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde el nucleótido detectablemente marcado es un nucleótido fluorescente.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde detectar al menos un Abscript comprende espectrometría de masa, electroforesis capilar o cromatografía de capa delgada.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde al menos un Abscript es 3-20 nucleótidos en longitud.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde al menos un Abscript es 3 nucleótidos en longitud.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los medios para dirigir la Abscription comprende un APC.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los medios para dirigir la Abscription comprenden: i) una secuencia 5' a-TAP que identifica la isla CpG única y ii) un nucleótido no natural entre la secuencia 5' a-TAP y la secuencia 3' complementaria para la segunda secuencia que flanquea la secuencia blanco; y la etapa d) comprende: i) hibridar una sonda a la secuencia blanco amplificada, en donde la sonda comprende una secuencia 5' TAP complementaria para la secuencia a-TAP y una 3' APC; y ii) transcribir al menos un Abscript del APC.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el nucleótido no natural previene la replicación de a-TAP durante la amplificación y por lo tanto la secuencia a-TAP permanece en hebra simple durante las etapas a) hasta c).

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el nucleótido no natural es eteno-deoxiadenosina.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde al menos un polinucleótido blanco comprende una pluralidad de diferentes polinucleótidos blanco, y las etapas a) hasta e) se llevan a cabo simultáneamente con una pluralidad de primeros y seguros pares iniciadores, cada par iniciador especialmente hibridando a un diferente blanco.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde los medios para dirigir la Abscription producen un Abscript único para cada una de las pluralidades de blancos.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde los APCs únicos son distinguibles uno del otro en base del peso molecular o la secuencia de nucleótidos.

19. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la pluralidad de diferentes blancos comprende al menos 10 diferentes blancos.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde al menos un polinucleótido blanco es una isla CpG metilada y la muestra comprende fragmentos de ADN genómicos metilados aislados.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde los fragmentos de ADN genómico metilado se aislan por: a) penetración de un ADN genómico conteniendo al menos un polinucleótido blanco metilado con una enzima de restricción que no penetra la isla CpG del polinucleótido blanco; b) contactar el ADN genómico penetrado con un MBD inmovilizado, por lo tanto inmovilizando el ADN genómico metilado de la muestra y c) opcionalmente, recuperar el ADN genómico metilado del MBD inmovilizado por lo tanto aislando los fragmentos de ADN genómicos metilados.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21 , en donde el MBD es una proteína de fusión GST-MBD2.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde la proteina de fusión GST-MBD2 se inmoviliza en un soporte sólido que contiene glutationa.