CN105112508A - 一种基于连接的dna甲基化快速荧光法高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于连接的DNA甲基化快速荧光法高通量检测方法,首先对基于荧光信号强度的比值进行的位点甲基化比率进行检测;然后是基于毛细管进行的检测;用不同颜色的荧光以及不同长度的待检测片段来同时进行多重检测;先将待检测的片段进行等效率扩增,得到与原始比率相同的放大产物,然后对放大产物进行检测,检测结果反应出原始模板的比率关系;最后基于高温连接法对放大后的产物进行检测。本发明的检测方法可以精确定量待检测位点的甲基化比率,可以经理论推导得出结论。检测特异性高,可以在同一个反应体系中进行多重检测,大幅提高检测效率,降低检测费用。易于标准化,针对特定的疾病检测,可以经过优化,做成标准试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体的说是涉及一种基于连接的DNA甲基化快速荧光法高通量检测方法。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学研究领域的热点,也是癌症等多种疾病的表观遗传学标记。DNA甲基化是最常见的复制后及转录后的修饰方式之一,在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用。甲基化是指在哺乳动物细胞中,由DNA甲基转移酶介导,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一个甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。基因组正常甲基化模式改变与某些遗传病和肿瘤的发生密切相关,是目前的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入,各种各样的甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。DNA甲基化检测是表观遗传学检测的重要内容,但是现有技术中已有的各种检测方法均存在一定的问题,在成本、准确性、通量等方面到现在为止还没有一个比较完美的解决方案。目前检测甲基化的方法主要有以下几种比较实用的方案,使用相对比较广泛。
1、直接测序法(bisulfitesequencingPCR、BSP),DNA在重亚硫酸盐的作用下未发生甲基化的胞嘧啶(C)转变成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶保持不变,PCR扩增后,尿嘧啶转化成胸腺嘧啶(T),对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断CpG位点是否发生甲基化。此方法过程繁杂,耗时,检测费用高且结果准确性受到测序数量的限制,精确度不好。
2、甲基化特异性PCR法(MethylationSpecificPCR、MSP),重亚硫酸盐可以使胞嘧啶转化为尿嘧啶,在甲基化位点设计引物,每个基因设计两对引物,分别为:甲基化引物M、非甲基化引物U,对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段,使用不同的退火温度进行PCR扩增,判断CpG位点是否发生甲基化。该方法除检测费用较低外,过程繁杂,耗时,难度更大,准确性更差。
3、甲基化敏感性解链曲线分析法(MS-HighResolutionMeltingCurve、MS-HRM),亚硫酸氢盐处理后甲基化DNA与非甲基化DNA之间的碱基差异,会引起产物熔解温度变化及熔解曲线差异,结合梯度甲基化标准品,可绘制标准梯度曲线。对比待检样品的热变性曲线在标准曲线中的区域,即可得出该样品的甲基化水平区间。该方法过程更加繁杂,且容易出现重亚硫酸盐处理不完全的问题以及假阴性。
4、荧光法(Methylight),荧光法是基于荧光定量PCR的甲基化检测技术。用重亚硫酸盐处理待测DNA片段,设计一个能与待测位点区互补的探针,随后采用MSP方法进行实时定量PCR。如果探针上只有一个CpG位点发生甲基化该方法由于受到引物特异性的问题,检出的灵敏度会降低。
5、焦磷酸测序法(Pyrosequencing),通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。重亚硫酸盐处理后,通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析。该方法检出结果更为准确,适合于高通量实验。
6、质谱法(Massspectrometry),重亚硫酸盐处理DNA样品后,通过酶促反应等将DNA降解后,经液相色谱-串联质谱法检测全基因组甲基化率。该方法检出全基因组甲基化情况,结果准确,但是不能检测具体位点的甲基化情况。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的不足,主要针对MSP检测方法的技术升级,提供一种基于连接的DNA甲基化快速荧光法高通量检测方法,本发明的检测方法是针对某一特定的位点进行的。
本发明是通过以下技术方案实现的:一种基于连接的DNA甲基化快速荧光法高通量检测方法,其包括如下步骤:
a、首先对基于荧光信号强度的比值进行的位点甲基化比率进行检测;
b、然后是基于毛细管进行的检测;
c、用不同颜色的荧光以及不同长度的待检测片段来同时进行多重检测;
d、先将待检测的片段进行等效率扩增,得到与原始比率相同的放大产物,然后对放大产物进行检测,检测结果反应出原始模板的比率关系;
e、最后基于高温连接法对放大后的产物进行检测。
DNA的甲基化在遗传印记、胚胎发育以及维持正常细胞功能等方面发挥着重要作用。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用,是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。
研究甲基化的方法之多,从一个方面说明了甲基化研究难度之大,也从另一个方面说明这些方法都存在着一定的限制。面对具体问题,选择最合适的解决方法就显得尤为重要。首先,根据研究目的选择合适方法:是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化,或是要发现全基因组中新的甲基化位点;其次,根据客观条件筛选方法,如目标的序列是否已知,是定量研究还是定性研究,样本来源及数量如何,是否需要高通量的样本检测方法;最后,全面分析,选取敏感、可靠、经济、简便的方法,以达到理想的效果。随着甲基化研究的不断深入,甲基化分析技术将逐步完善。完善的研究技术将提供强有力的技术支持,从而为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供一些新的思路。
本发明的有益效果是:现有技术中的MSP法对比BSP法,虽然成本上占有优势,但是存在着理论上的缺陷,不能准确定量,只能定性,并且每个位点至少要进行两个反应。而且,由于引物设计方面的限制,不能够保证每个位点都能够进行MSP方法检测,以及检测假阳性问题。本发明从理论上确保了可以进行定量检测,而且采用毛细管电泳法进行检测,可以同时并行检测多个位点,检测效率大幅度提高。由于一些疾病相关的甲基化检测,通过前期的研究,只要检测一些特定位点的甲基化情况即可,并不需要将一个区域的每个位点的甲基化情况都进行检测,本发明特别适用这类检测,可以将待检测的相关位点进行优化后,形成试剂盒,从而可以进行很好的产业化。
本发明的检测方法还具有如下优点:1、与MSP法进行终点检测,只能定性检测相比,本发明的检测方法可以精确定量待检测位点的甲基化比率,可以经理论推导得出结论。2、检测特异性高。3、可以在同一个反应体系中进行多重检测,大幅提高检测效率,降低检测费用。4、易于标准化,针对特定的疾病检测,可以经过优化,做成标准试剂盒。
验证实验一共做了两个比值系列,每个系列做两个重复,共四组结果。
第一组两个重复的结果:
y=0.9844x-0.0072R2=0.9976
y=0.9424x+0.0024R2=0.9992
第二组两个重复的结果:
y=0.984x+0.0064R2=0.9993
y=1.0039x+0.0059R2=0.9996
以上结果所拟合的公式中,X轴代表理论的比例,Y轴代表实际检测的数值。对于所得公式,常数项=0,X的系数=1,R2=1代表着数据完全吻合。
从上面的公式可以看出,所得的结果已经很完美了,比测序10个克隆所统计出的数据的精确度高。同时,3730XL测序仪扫描数据时,扫描的面积比较大,比起微观检测的焦磷酸测序法和质谱检测法,理论上精确度要高。
综上所述,本发明是一个很实用的技术,可以比较好地解决在甲基化检测过程中遇到的一系列问题。由于3730XL可以同时进行多重荧光检测,并且毛细管电泳也可以将不同大小的片段进行分离,故每一个毛细管一次至少可以检测十几个位点,检测效率大幅度提高。3730XL测序仪的市场保有量比起焦磷酸测序和质谱检测所用的专用仪器要多得多,该技术得到推广应用后,可以大幅度提高甲基化检测的效率,经济价值很高。
另外,一些疾病,尤其是一些癌症,明显受相关基因调控序列的甲基化状态发生了变化。一些被深入研究的疾病已经有了明确的待检测的甲基化位点。针对这些疾病待检测的位点,完全可以优化出系统的检测方案,以试剂盒的形式将所有的试剂打包,形成标准化的检测方案。现有的DNA甲基化检测技术,还没有一种方法能够平衡检测的精确度、成本和速度,均存在一定的弱势。该技术一经推广,很可能促进一些癌症相关基因甲基化检测的标准化。
附图说明
图1是本发明检测方法第一组验证实验重复1的比值图;
图2是本发明检测方法第一组验证实验重复2的比值图。
图3是本发明检测方法第二组验证实验重复1的比值图;
图4是本发明检测方法第二组验证实验重复2的比值图;
图5是本发明检测方法第二组验证实验重复2中9-12类的峰型图;
图6是本发明检测方法第二组验证实验重复2中13-16类的峰型图;
图中:X轴代表理论的比例,Y轴代表实际检测的数值。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述。
如图1至图4所示,一种基于连接的DNA甲基化快速荧光法高通量检测方法,其特征在于:所述检测方法包括如下步骤:
a、首先对基于荧光信号强度的比值进行的位点甲基化比率进行检测;
b、然后是基于毛细管进行的检测;
c、用不同颜色的荧光以及不同长度的待检测片段来同时进行多重检测;
d、先将待检测的片段进行等效率扩增,得到与原始比率相同的放大产物,然后对放大产物进行检测,检测结果反应出原始模板的比率关系;
e、最后基于高温连接法对放大后的产物进行检测。
为验证实验的技术可行性及准确度,特意选择了两个经亚硫酸氢盐处理后克隆的片段,其中待检测的位点分别为T和C,扩增含这两种碱基类型的片段,并纯化。然后构建待检测的样品,方案如下:
初步定量,将T(Template_T)和C(Template_C)两种类型的模板浓度调成等量的,固定T模板的含量,将C模板的含量按照0%、15%、30%、45%、60%、75%、90%、100%比例,配制8种混合模板。同样固定C模板,变化T模板,同样配制8种混合模板。检测这些混合模板中两种类型的模板的比例,看检测结果与实际结果的差别,来确认实验结果的可行性。
待检测的模板DNA序列(经亚硫酸氢盐处理后的实际序列)如下,其中方框标记的T/C为待检测的位点,下划线标记的部分为检测引物结合区域。
TATTTTTTTGATGTTTAAAGGAGGAGTAAAATTTGTTTTTTATTATTAAAATGTTAAATATAGGTTTAGGATATAAGTTTGTTTTAATATTGGATTGTATTGTAATGTGTATTTATTGAATTAAGTTTTGTTTGTTTAAGGGTATAGGTATAAATTTAATTTTTTAAGGTTAT/CGAGTGTATTGTTTATTATTTTTTTTTTTGTTGTGATCTTTTTATTATTTTGATTTGGTTTGTAATTAGTTTTGATTATATATAAAGAGAAATTTTTGGGTTTGTGTAGA
下面两条引物用于扩增标准模板序列:
PrimerF:TATTTTTTTGATGTTTAAAGGAGGAGT
primerR:TCTACACAAACCCAAAAATTTCTCT
下面三条引物一组,用于进行连接检测:
For_T:tatAGGTATAAATTTAATTTTTTAAGGTTAT
For_C:AGGTATAAATTTAATTTTTTAAGGTTAC
fMSP:p_GAGTGTATTGTTTATTATTTTTTTTTT_FAM3’标记FAM,5’标记磷酸化。
分别以Template_T和Template_C为模板,用PrimerF和primerR一对引物进行扩增,得到PCR_T和PCR_C。用试剂盒对扩增的PCR产物进行纯化,采用电泳法做粗略定量。
按计划配制浓度梯度的混合模板,做连接反应,反应体系如下:
模板 | 2ul |
10xBuffer | 1ul |
Taq连接酶 | 0.05ul |
fMSP标记探针 | 0.02ul |
For_T引物 | 0.02ul |
For_C引物 | 0.02ul |
水 | 至10ul |
连接产物在3730XL测序仪上进行检测,操作按照3730XL的操作规程即可,用DataCollection软件进行原始数据收集,用PeakScannerversion1.0软件分析原始结果,导出相应数据。所有操作参照软件说明进行。将导出的数据转换到excel文件中,进行分析。
最后应当说明的是,以上内容仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换,均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (1)
1.一种基于连接的DNA甲基化快速荧光法高通量检测方法,其特征在于:所述检测方法包括如下步骤:
a、首先对基于荧光信号强度的比值进行的位点甲基化比率进行检测;
b、然后是基于毛细管进行的检测;
c、用不同颜色的荧光以及不同长度的待检测片段来同时进行多重检测;
d、先将待检测的片段进行等效率扩增,得到与原始比率相同的放大产物,然后对放大产物进行检测,检测结果反应出原始模板的比率关系;
e、最后基于高温连接法对放大后的产物进行检测。
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
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CN102421914A (zh) * | 2009-03-15 | 2012-04-18 | 里伯米德生物技术公司 | 基于流产转录的分子检测 |
CN103958696A (zh) * | 2012-09-10 | 2014-07-30 | 天昊生物医药科技(苏州)有限公司 | 多重核酸分析 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101553577A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-10-07 | 达雅高生物科技有限公司 | 快速基因分型分析和分析设备 |
CN102421914A (zh) * | 2009-03-15 | 2012-04-18 | 里伯米德生物技术公司 | 基于流产转录的分子检测 |
CN103958696A (zh) * | 2012-09-10 | 2014-07-30 | 天昊生物医药科技(苏州)有限公司 | 多重核酸分析 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
顾婷婷等: "DNA甲基化研究方法的回顾与评价", 《中国妇幼健康研究》 * |
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