DE69726276T2

DE69726276T2 - In situ herstellung von nukleosid-phosphoramiditen und ihre verwendung in der oligonukleotidsynthese

Info

Publication number: DE69726276T2
Application number: DE1997626276
Authority: DE
Inventors: Zhaoda Zhang; Jin-Yan Tang
Original assignee: Avecia Biotechnology Inc
Current assignee: Nitto Denko Avecia Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2017-04-29
Also published as: CA2226111A1; EP0901500B1; DE69726276D1; AU2739797A; CA2226111C; ATE254627T1; EP0901500A1; ES2212097T3; WO1997042208A1

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die chemische Oligonukleotidsynthese und chemische Substanzen, welche bei einer derartigen Synthese nützlich sind.
Kurzfassung des Stands der Technik
Oligonukleotide sind unverzichtbare Werkzeuge in der modernen Molekularbiologie geworden, welche bei einer breiten Vielfalt von Verfahren verwendet werden, welche von diagnostischen Untersuchungsverfahren über PCR bis zur Antisense-Inhibition von Genausprägungen reicht. Diese weitreichende Verwendung von Oligonukleotiden hat zu einem steigenden Bedarf an schnellen, preiswerten und wirksamen Verfahren zur Oligonukleotidsynthese geführt.
Die Oligonukleotidsynthese für Antisense- und diagnostische Anwendungen kann heute routinemäßig erzielt werden. Man siehe z. B. Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Seiten 165 bis 189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Seiten 87 bis 108 (F. Eckstein, Ed., 1991); und Uhlmann und Peyman, oben, Agrawal und Iyer, Curr. Op. in Biotech, 6: 12 (1995); und Antisense Research and Applications (Crooke und Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993). Frühe Syntheseansätze umfassten die Chemie der Phosphodiester und Phosphotriester. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) offenbart eine Phosphodiester-Chemie für eine Oligonukleotidsynthese. Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143 bis 3179 (1978), offenbart eine Phosphotriester-Chemie für eine Synthese von Oligonukleotiden und Polynukleotiden. Diese frühen Ansätze haben überwiegend den wirksameren Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Syntheseansätzen Platz gemacht. Von diesen ist der Phosphoramidit-Ansatz für die meisten Anwendungen der beliebteste geworden. Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859 bis 1862 (1981), offenbart die Verwendung von Desoxynukleosidphosphoramiditen bei der Polynukleotidsynthese. Der Phosphoramidit-Ansatz wurde verwendet, um Oligonukleotide zu synthetisieren, welche verschiedene modifizierte Internukleosidbindungen aufweisen. Agrawal und Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539 bis 3542 (1987), lehrt eine Synthese von Oligonukleotidmethylphosphonaten unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie. Connolly et al., Biochemistry 23: 3443 (1984), offenbart eine Synthese von Oligonukleotidphosphorthioaten unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie. Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988), offenbart eine Synthese von Oligonukleotidphosphoramidaten unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie. Eine Oligonukleotidsynthese in fester Phase durch den Phosphoramidit-Ansatz kann für verschiedene Anwendungen abgewandelt werden, umfasst jedoch gewöhnlich das gleiche, generalisierte Verfahren. Kurz gesagt, umfasst dieser Ansatz das Verankern des der 3'-Position am nächsten gelegenen Nukleosids an einem festen Träger, welcher mit Amino- und/oder Hydroxyl-Gruppierungen funktionalisiert ist, und das nachfolgende, schrittweise Anlagern der zusätzlichen Nukleoside. Es werden gewünschte Internukleosidbindungen zwischen der 3'-Phosphoramiditgruppe des ankommenden Nukleosids und der 5'-Hydroxylgruppe des der 5'-Position am nächsten gelegenen Nukleosids des naszierenden, trägergebundenen Oligonukleotids ausgebildet.
Ein Verfeinern der Verfahrensweise ist jedoch noch erforderlich, insbesondere wenn ein Übergang zu einer Synthese im großen Maßstab (10 μmol auf 1 mmol und mehr) durchgeführt wird. Man siehe Padmapriya et al., Antisense Res. Dev. 4: 185 (1994). Mehrere Modifikationen der Standard-Phosphoramidit-Verfahren wurden schon berichtet, um die Synthese und die Isolation der Oligonukleotide zu erleichtern. Man siehe z. B. Padmapriya et al., oben; Ravikumar et al., Tetrahedron 50: 9255 (1994); Theisen et al., Nucleosides & Nucleotides 12: 43 (1994); und Iyer et al., Nucleosides & Nucleotides 14: 1349 (1995) (Kuijpers et al., Nucl. Acids Res. 18: 5197 (1990); und Reddy et al., Tetrahedron Lett. 35: 4311 (1994).
Ein einschränkender Hauptfaktor für eine kosteneffiziente Oligonukleotidsynthese sind die erforderliche Zeit und die erforderlichen Kosten, um die monomeren Nukleosidphosphoramidite herzustellen und zu reinigen. Bodepudi et al., Chem. Res. Toxicol. 5: 608 bis 617, offenbart, dass die Herstellung von Phosphoramiditen aus 2'-Desoxy-7,8-dihydro-8-oxoguanosin und 2'-Desoxy-7,8-dihydro-8-oxoadenosin gemäß dem Standard-Verfahren aufgrund ihrer Instabilität und Empfindlichkeit gegenüber Wasser während der Reinigung zu einem erheblichen Zerfall der Phosphoramidite führt. Ein potenzieller Ansatz, diese Probleme zu überwinden, ist das Erzeugen der Phosphoramidite in situ bei der Durchführung des Oligonukleotidsyntheseverfahrens. Bedauerlicherweise waren die zahlreichen Versuche mit diesem Ansatz enttäuschend. Moore und Beaucage, J. Org. Chem. 50: 2019 bis 2025 (1985) lehrt eine in situ Herstellung von Phosphoramiditen durch Umsetzen von Desoxyribonukleosiden mit Bis-(pyrrolidino)methoxyphosphin, aktiviert durch 4,5-Dichlorimidazol in 1-Methyl-2-pyrrolidinon. Dieses Verfahren war jedoch durch eine schlechte Chemoselektivität, mit ungefähr 8 bis 10% (3'-3')-Dinukleosidmethylphosphittriester eingeschränkt, welches sich als ein Nebenprodukt bildet. Barone et al., Nucleic Acids Res. 12: 4051 bis 4061 (1984) und Lee und Moon, Chem. Lett. 1229 bis 1232 (1984) offenbaren eine bessere Chemoselektivität bei einer in situ Herstellung von Phosphoramiditen durch Umsetzen von Desoxyribonukleosiden mit Bis-(N,N,-dialkylamino)alkoxyphosphinen und 1H-Tetrazol oder seinem N,N-Diisopropylammoniumsalz. Bedauerlicherweise kann das Tetrazol-N,N-diisopropylammoniumsalz, welches entweder zugegeben oder in situ hergestellt wird, innerhalb des Syntheseautomaten Niederschläge bilden. Helinski et al., Tetrahedron Lett. 32: 4981 bis 4984 (1991) und 34: 6451 bis 6454 (1993) offenbart eine selektive Aktivierung bifunktioneller, phosphitylierender Reagenzien, welche eine p-Nitrophenoxygruppe enthalten. Diese Verfahrensweise ist jedoch nicht an gegenwärtige Phosphoramidit-Ansätze anpassbar, weil die p-Nitrophenoxygruppe durch Verwenden einer starken Base aktiviert werden muss. Schließlich offenbaren Fourrey et al., Tetrahedron Lett. 22: 729 bis 732 (1981) und Cao et al., Tetrahedron Lett. 24: 1019 bis 1020 (1983) als reaktive, bifunktionelle, phosphitylierende Agenzien Phosphordichlorit und das entsprechende Ditetrazolit und Ditriazolit. Bedauerlicherweise ist die Anwendung dieser Agenzien bei der Oligonukleotidsynthese im Allgemeinen aufgrund ihrer extrem hohen Reaktivität und schlechten Chemoselektivität problematisch. Weitere Methoxyphosphine werden in WO-A-8 673 62 offenbart.
Es gibt auch Berichte über eine Verwendung von Methylphosphordiamiditen, um Nukleosidmethylphosphonamidite für eine Oligonukleotidsynthese herzustellen. Engels et al., Nucl. Acids Res. Symposium Series Nr. 24, Seiten 83 bis 86 (1991), offenbart die Verwendung von Methylphosphordiamiditen, um Nukleosidmethylphosphonamidit-Monomere für eine stereoselektive Synthese von Oligonukleosidmethylphosphonaten herzustellen. Die Monomere wurden jedoch vor ihrer Verwendung bei der Synthese gereinigt, anstatt dass sie in situ hergestellt wurden, und eine ausreichende Chemoselektivität wurde für den letzteren Ansatz nicht gezeigt.
Es gibt darum einen Bedarf an neuen bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien und an ihrer Anwendung bei einer in situ Herstellung von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramiditen und P-substituierten Phosphonamiditen und einer nachfolgenden Oligonukleotidsynthese ohne vorherige Reinigung der Nukleosidphosphoramidite oder der P-substituierten Phosphonamidite. Idealerweise sollten derartige Reagenzien selektiv aktiviert sein und schnell mit Nukleosiden reagieren, sollten chemoselektiv die entsprechenden Nukleosidphosphoramidite oder die P-substituierten Phosphonamidite in situ herstellen und sollten relativ stabil und leicht zu handhaben sein.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt neuartige, bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien und neuartige Verfahren für eine in situ Herstellung von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramiditen und P-substituierten Phosphonamidit-Monomeren und eine Oligonukleotidsynthese bereit. Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß der Erfindung reagieren unter schwach sauren Bedingungen schnell mit Nukleosiden. Zusätzlich stellen die bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien gemäß der Erfindung chemoselektiv die entsprechenden Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomere in situ her, ohne die Notwendigkeit, die Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomere vor ihrer Verwendung bei der Oligonukleotidsynthese zu reinigen. Schließlich sind die bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien gemäß der Erfindung relativ stabil und leicht zu handhaben.
Bei einem ersten Gesichtspunkt stellt die Erfindung bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien bereit, welche für eine in situ Herstellung von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomeren und für eine Oligonukleotidsynthese nützlich sind. Zum Zwecke der Erfindung ist ein Nukleosid-P-substituiertes Phosphonamidit ein Nukleosidphosphonamidit, bei welchem ein Nicht-Brücken-sauerstoffatom des entsprechenden Phosphoramidits durch eine organische Substitutionsgruppe ersetzt wurde. Organische Substitutionsgruppen weisen zwischen einem und 20 Kohlenstoffatome auf und umfassen Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppen, welche alle nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert sein können. Besonders bevorzugte organische Substitutionsgruppen umfassen CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S-Gruppen, wobei Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist. Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung weisen die allgemeine Struktur (II) auf:
wobei R eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppe ist, welche zwischen einem und 20 Kohlenstoffatome aufweist und entweder nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert ist und besonders bevorzugt CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S- ist, wobei Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist;
und wobei X und Y sich voneinander unterscheiden und unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus
ausgewählt sind.
Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung reagieren in Gegenwart einer schwachen Säure mit 5'-geschützten Nukleosiden, um chemoselektiv 5'-geschützte Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierte Phosphonamidit-Monomere herzustellen.
Bei einem zweiten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Herstellungsverfahren von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomeren bereit, ohne einen Niederschlag zu erzeugen und ohne eine Reinigung der Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomere vor ihrer Verwendung bei einer Oligonukleotidsynthese zu erfordern. Beim Verfahren gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung werden die bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung mit 5'-geschützten Nukleosiden in Gegenwart einer schwachen Säure umgesetzt, um 5'-geschützte Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierte Phosphonamidit-Monomere herzustellen.
Bei einem dritten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein verbessertes Oligonukleotidsyntheseverfahren bereit. Beim Verfahren gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung umfasst die Verbesserung den Schritt des in situ Erzeugens der Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomere statt dem Zufügen gereinigter Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierter Phosphonamidit-Monomere am entsprechenden Punkt bei einem herkömmlichen Oligonukleotidsyntheseverfahren. Die in situ Herstellung verwendet vorzugsweise die phosphitylierenden Agenzien gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung.
Die Reagenzien und Verfahren gemäß der Erfindung sind nützlich zum Herstellen einer breiten Vielfalt von Oligonukleotid- oder P-substituierten Oligonukleotidverbindungen oder von radiomarkierten Oligonukleotid- oder P-substituierten Verbindungen, welche hier alle allgemein als „Oligonukleotide" bezeichnet werden. Die Reagenzien und Verfahren gemäß der Erfindung können in einem Maßstab verwendet oder praktiziert werden, welcher von einem kleinen Labormaßstab bis zu einem großen kommerziellen Maßstab reicht.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt 13 besonders bevorzugte Ausführungsformen bifunktioneller, phosphitylierender Reagenzien gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung betrifft die chemische Oligonukleotidsynthese und die chemischen Substanzen, welche bei einer derartigen Synthese nützlich sind. Die Patente und Schriften, welche in dieser Patentschrift genannt werden, liegen im Rahmen des Wissens von Durchschnittsfachleuten und sind hiermit in ihrer Gänze durch Verweis aufgenommen.
Die Erfindung stellt neuartige, bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien und neuartige Verfahren für eine in situ Herstellung von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomeren und eine Oligonukleotidsynthese bereit. Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß der Erfindung reagieren unter schwach sauren Bedingungen schnell mit Nukleosiden. Zusätzlich stellen die bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien gemäß der Erfindung chemoselektiv die entsprechenden Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidit-Monomere in situ her, ohne die Notwendigkeit, die Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidit-Monomere vor ihrer Verwendung bei der Oligonukleotidsynthese zu reinigen. Schließlich sind die bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien gemäß der Erfindung relativ stabil und leicht zu handhaben.
Bei einem ersten Gesichtspunkt stellt die Erfindung bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien bereit, welche für eine in situ Herstellung von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomeren und für eine Oligonukleotidsynthese nützlich sind. Zum Zwecke der Erfindung ist ein Nukleosid-P-substituiertes Phosphonamidit ein Nukleosidphosphonamidit, bei welchem ein Nicht-Brückensauerstoffatom des entsprechenden Phosphoramidits durch eine organische Substitutionsgruppe ersetzt wurde. Organische Substitutionsgruppen weisen zwischen einem und 20 Kohlenstoffatome auf und umfassen Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppen, von denen beliebige nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert sein können. Besonders bevorzugte organische Substitutionsgruppen umfassen CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S-Gruppen, wobei Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist. Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung weisen die allgemeine Struktur (II) auf:
wobei R eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppe ist, welche zwischen einem und 20 Kohlenstoffatome aufweist und entweder nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert ist und besonders bevorzugt CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S- ist, wobei Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist; und wobei X und Y sich voneinander unterscheiden und unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus
ausgewählt sind, vorausgesetzt, dass, wenn R eine Methoxygruppe ist, es sich bei X bzw. Y nicht um eine Diisopropylaminogruppe handelt, wenn der andere Rest eine Morpholingruppe ist.
Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung können, wie in den Beispielen 1 bis 13 nachfolgend beschrieben oder durch einfache Anpassung dieser Beispiele, synthetisiert werden. Bifunktionelle, phosphitylierende Reagenzien gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung reagieren in Gegenwart einer schwachen Säure mit 5'-geschützten Nukleosiden, um chemoselektiv 5'-geschützte Nukleosid-P-substituierte Phosphonamidit-Monomere herzustellen. Zum Vermeiden der Bildung eines Nukleosid-3'-3'-dimer- Nebenprodukts wird die in situ Aktivierung unter Verwendung dieser Reagenzien vorzugsweise unter Verwendung von 0,25 bis 0,3 Äquivalenten Tetrazol oder 4,5-Dichlorimidazol als eine schwache Säure ausgeführt.
Bei einem zweiten Gesichtspunkt stellt die Erfindung Herstellungsverfahren von 5'-geschützten Nukleosidphosphoramiditen oder von P-substituierten Phosphonamiditen bereit, ohne einen Niederschlag zu erzeugen und mit ausreichender Chemoselektivität, um die Notwendigkeit zur Reinigung der so gebildeten Nukleosidphosphoramidite oder der P-substituierten Phosphonamidite zu eliminieren. Beim Verfahren gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung werden die bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenzien gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung mit 5'-geschützten Nukleosiden in Gegenwart einer schwachen Säure umgesetzt, um ein 5'-geschütztes Nukleosidphosphoramidit oder ein P-substituiertes Phosphonamidit herzustellen. Bevorzugte 5'-geschützte Nukleoside umfassen Adenosin, Guanosin, Cytosin, Uridin, Inosin und Thymidin sowie modifizierte Nukleoside (man siehe z. B. Sanghvi, in Antisense Research and Applications, Seiten 273 bis 288 (Crook und Lebleu, Eds.) CRC Press (1993) und die darin zitierten Verweise). Die 5'-Position des Nukleosids kann durch eine der Standard-Schutzgruppen geschützt werden (man siehe z. B. Sonveaux in Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Seiten 1 bis 72 (S. Agrawal, Ed.), Humana Press (1994)) oder mit einer beliebigen Schutzgruppe, welche für eine Oligonukleotidsynthese geeignet ist. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die 5'-Position des Nukleosids durch eine Dimethoxytritylgruppe (DMT) geschützt.
Die Reaktion zwischen dem bifunktionellen, phosphitylierenden Reagenz und dem 5'-geschützten Nukleosid kann durch herkömmliche ³¹P-NMR-Spektroskopie überwacht werden. Die am meisten bevorzugten bifunktionellen Phosphitylierungsreagenzien gemäß der Erfindung werden vollständig innerhalb von ungefähr 10 Minuten mit dem 5'-geschützten Nukleosid umgesetzt.
Beim Verfahren gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung wird zur Erhaltung der Chemoselektivität der Reaktion für das gewünschte 5'-geschützte, Nukleosid-P-substituierte Phosphonamidit die Konzentration und Eigenschaft des Aktivierungsmittels kontrolliert. Die Aktivierung wird deshalb vorzugsweise unter Verwendung von ungefähr 0,25 bis 0,3 Äquivalenten Tetrazol oder 4,5-Dichlorimidazol als eine schwache Säure durchgeführt. In diesem Zusammenhang bedeutet „ungefähr" näherungsweise plus oder minus 3%. Diese Bedingungen führen zur Schnellsynthese des gewünschten 5'-geschützten Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidits bei einem Kontaminierungsniveau durch 3'-3'-Dimere des Nukleosids von nur 3% oder weniger.
Bei einem dritten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Oligonukleotidsyntheseverfahren bereit. Beim Verfahren gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung umfasst die Verbesserung den Schritt des in situ Erzeugens der Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierten Phosphonamidit-Monomere statt dem Zufügen gereinigter Nukleosidphosphoramidit- oder P-substituierter Phosphonamidit-Monomere am entsprechenden Punkt bei einem herkömmlichen Oligonukleotidsyntheseverfahren. Die in situ Herstellung verwendet vorzugsweise die phosphitylierenden Agenzien gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung. Manche der Oligonukleotide, welche gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung synthetisiert werden, sind P-substituierte Oligonukleotide. Für die Zwecke der Erfindung ist ein P-substituiertes Oligonukleotid ein Oligonukleotid, bei welchem zwischen einem und bis zu etwa allen der Internukleosidphosphoratome ein Nicht- Brückensauerstoffatom aus dem entsprechenden Phosphodiester aufweisen, welches mit einer organischen Substitutionsgruppe substituiert ist. Organische Substitutionsgruppen weisen zwischen einem und 20 Kohlenstoffatome auf und umfassen Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppen, von denen beliebige nicht substituiert oder mit Halogen- und oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert sein können. Besonders bevorzugte organische Substitutionsgruppen umfassen CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S-Gruppen, wobei Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein anderes Nicht-Brückensauerstoffatom aus dem entsprechenden Phosphodiester durch ein Schwefelatom ersetzt.
Für die Zwecke der Erfindung ist vorgesehen, dass der Begriff in situ „ohne Zwischenreinigung" bedeutet. Folglich findet das in situ Erzeugen von 5'-geschützten, Nukleosid-P-substituierten Phosphonamiditen immer dann statt, wenn wenigstens eines der 5'-geschützten, Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidite erzeugt und dann für eine Oligonukleotidsynthese ohne Zwischenreinigung der 5'-geschützten, Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidite verwendet wird. Folglich umfasst das verbesserte Syntheseverfahren von P-substituierten Oligonukleotiden gemäß der Erfindung das in situ Herstellen eines 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidits oder eines P-substituierten Phosphonamidits und das Koppeln des P-substituierten Phosphonamidits oder des 5'-geschützten, Nukleosid-P-substituierten Phosphoramidits mit einem ungeschützten 5'-Ende eines Nukleosids, welches vorzugsweise kovalent an einen festen Träger gebunden ist und welches das 5'-endständige Nukleosid eines naszierenden Oligonukleotids sein kann. Die Herstellung der 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidite oder P-substituierten Phosphonamidite und die Oligonukleotidsynthese können im gleichen Reaktionskessel stattfinden wie die Nukleosid-Kopplungsreaktionen, oder sie kann in unterschiedlichen Reaktionskesseln stattfinden. Darüberhinaus kann die Herstellung der 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidite oder der P-substituierten Phosphonamidite entweder vor oder gleichzeitig mit der Oligonukleotidsynthese stattfinden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung wird das biphosphitylierende Agenz, welches verwendet wird, um die Nukleosidphosphoramidite oder die P-substituierten Phosphonamidite in situ herzustellen, aus den biphosphitylierenden Agenzien ausgewählt, welche in 1 gezeigt werden. Das bevorzugte Nukleosid-P-substituierte Phosphonamidit wird in situ hergestellt, gefolgt vom Koppeln ohne Zwischenreinigung des Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidits.
Die Verbesserung gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung kann in jede Standard-Phosphoramidit-Synthesevorschrift unter Verwendung jedes beliebigen Syntheseautomaten aufgenommen werden.
Die Vielseitigkeit der Verbesserung gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung lässt es zu, für die Synthese einer breiten Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotiden verwendet zu werden. Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Begriff „Oligonukleotid" Polymere aus zwei oder mehr Desoxyribonukleotid- oder 2'-O-substituierten Ribonukleotid-Monomeren oder jeder Kombination davon. Derartige Monomere können miteinander durch beliebige der zahlreichen bekannten Internukleosidbindungen verkoppelt werden. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können diese Internukleosidbindungen Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphorthioat-, Phosphordithioat-, Methylphosphonat- oder Phosphoramidatbindungen oder Kombinationen davon sein. Der Begriff Oligonukleotid umfasst auch Polymere, welche chemisch modifizierte oder radioisotopisch markierte Basen oder Zucker aufweisen und/oder welche zusätzliche Substituenten aufweisen, u. a. zum Beispiel lipophile Gruppen, Einlagerungsagenzien, Diamine und Adamantan. Für die Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff „2'-O-substituiert" eine Substitution der 2'-Position der Pentose-Komponente mit einer -O-Alkylgruppe, welche zwischen 1 und 6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffatome enthält, oder mit einer -O-Aryl- oder -Allyl-Gruppe, welche zwischen 2 und 6 Kohlenstoffatome aufweist, wobei eine derartige Alkyl-, Aryl- oder Allyl-Gruppe nicht substituiert sein kann oder z. B. mit Halogen-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxyl- oder Amino-Gruppen substituiert sein kann; oder eine derartige 2'-Substitution kann eine mit einer Hydroxy-Gruppe (um ein Ribonukleosid herzustellen), einer Amino- oder einer Halogen-Gruppe, jedoch nicht mit einer 2'-H-Gruppe sein.
Die folgenden Beispiele sind dazu vorgesehen, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weiter zu illustrieren und sind ihrem Wesen nach nicht einschränkend gedacht. Außer wenn es anders vermerkt ist, wurden die Reagenzien bei jedem der folgenden Beispiele von folgenden Quellen bezogen. Wasserfreies Acetonitril wurde von J. T. Baker Inc. (Phillipsburg, NJ) bezogen. dT-CPG, 5'-DMT-Desoxyadenosin-(Bz)-cyanoethylphosphoramidit, 5'-DMT-Desoxycytidin-(Bz)-cyanoethylphosphoramidit, 5'-DMT-Desoxyguanosin-(ibu)-cyanoethylphosphoramidit, 5'-DMT-ThymidinCyanoethylphosphoramidit, Cap A, Cap B, Aktivierungsvorrichtung, Oxidations- und Entblock-Lösungen wurden von PerSeptive Biosystems, (Framingham, MA) bezogen. Ammoniak-Lösung in Methanol (ca. 7N) wurde von ACROS ORGANIC (Pittsburgh, PA) bezogen. Alle anderen Chemikalien wurden von Aldrich bezogen. ³¹P-NMR- Spektren (121,65 MHz) und ¹H-NMR-Spektren (300 MHz) wurden auf einem Varian UNITY 300 aufgenommen (die chemische Verschiebung wurde auf 85%-ige HP₃O₄ bzw. auf Tetramethylsilan bezogen). Die Oligonukleotidsynthese wurde auf einem 8909 Expedite DNA-Syntheseautomaten (Millipore) durchgeführt. Fett gedruckte Verbindungsnummern beziehen sich auf die in 1 gezeigten Verbindungen.
Beispiel 1
Synthese von 2-Cyanoethoxy(N,N-diisopropylamino)pyrrolidinophosphin (1)
Zu einer Lösung von Chlor(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phosphin (12,9 g, 54,56 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) wurde tropfenweise 1-(Trimethylsilyl)pyrrolidin (10,0 ml, 8,21 g, 57,29 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgelbes Öl (13,3 g, 95%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 133,9.
Beispiel 2
Synthese von 2-Cyanoethoxy(N,N-diisopropylamino)(N,N-dimethylamino)phosphin (2)
Zu einer Lösung von Chlor(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phosphin (19,22 g, 81,2 mmol, 18,1 ml) in CH₂Cl₂ (100 ml) wurde tropfenweise N,N-Dimethyltrimethylsilylamin (10,0 g, 85,3 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein farbloses Öl (18,7 g, 94%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 126,3.
Beispiel 3
Synthese von 2-Cyanoethoxy(N,N-diethylamino)(N,N-diisopropylamino)phosphin (3)
Zur Lösung von Chlor(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phosphin (5,95 g, 25,13 mmol, 5,61 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise N,N-Diethyltrimethylsilylamin (3,84 g, 26,4 mmol, 5,0 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein farbloses Öl (6,5 g, 94%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 127,2.
Beispiel 4
Synthese von 2-Cyanoethoxy(N,N-diisopropylamino)morpholinophosphin (4)
Zu einer Lösung von Chlor(2-cyanoethoxy)N,N-diisopropylamino)phosphin (10,61 g, 44,82 mmol, 10,0 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (8,76 ml, 7,86 g, 49,31 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein farbloses Öl (12,5 g, 97%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 125,2.
Beispiel 5
Synthese von 2-Cyanoethoxy(morholino)pyrrolidinophosphin (5)
Zu einer Lösung von 2-Cyanoethoxy(dichlor)phosphin (7,16 g, 41,61 mmol, 5,3 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 1-(Trimethylsilyl)pyrrolidin (7,26 ml, 5,96 g, 41,61 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um Chlor(2-cyanoethoxy)pyrrolidinophosphin als ein farbloses Öl zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 177,5.
Zu der Lösung von Chlor(2-cyanoethoxy)pyrrolidinophosphin in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (8,13 ml, 7,29 g, 45,77 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgelbes Öl (9,8 g, 92%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 134,2
Beispiel 6
Synthese von 2-Cyanoethoxy(N,N-dimethylamino)morpholinophosphin (6)
Zu einer Lösung von 2-Cyanoethoxy(dichlor)phosphin (4,29 g, 24,97 mmol, 3,2 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise N,N-Dimethyltrimethylsilylamin (2,93 g, 24,97 mmol, 4,0 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um Chlor(2-cyanoethoxy)N,N-dimethylamino)phosphin als ein farbloses Öl zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 174,7.
Zu der Lösung von Chlor(2-cyanoethoxy)(N,N-dimethylamino)phosphin in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (4,86 ml, 4,36 g, 27,39 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgelbes Öl (5,0 g, 93%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 133,5.
Beispiel 7
Synthese von N,N-Diisopropylamino(methyl)pyrrolidinophosphin (7)
Zu einer Lösung von Chlor(N,N-diisopropylamino)methylphosphin (5,0 g, 27,53 mmol) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 1-(Trimethylsilyl)pyrrolidin (5,3 ml, 4,34 g, 30,3 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein farbloses Öl (5,5 g, 93%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 48,7.
Beispiel 8
Synthese von N,N-Diisopropylamino(methyl)N,N-dimethylamino)phosphin (8)
Zu einer Lösung von Chlor(N,N-diisopropylamino)methylphosphin (6,2 g, 34,1 mmol, 6,2 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise N,N-Dimethyltrimethylsilylamin (4,39 g, 37,45 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein farbloses Öl (4,3 g, 90%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 50,6.
Beispiel 9
Synthese von N,N-Diethylamino(N,N-diisopropylamino)methylphosphin (9)
Zu einer Lösung von Chlor(N,N-diisopropylamino)methylphosphin (5,0 g, 27,53 mmol) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise N,N-Diethyltrimethylsilylamin (4,4 g, 30,28 mmol, 5,7 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein farbloses Öl (5,0 g, 83%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 56,6.
Beispiel 10
Synthese von N,N-Diisopropylamino(methyl)morpholinophosphin (10)
Zu einer Lösung von Chlor(N,N-diisopropylamino)methylphosphin (5,0 g, 27,53 mmol, 5,0 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (5,4 ml, 4,8 g, 30,28 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgelbes Öl (6,1 g, 96%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 58,8.
Beispiel 11
Synthese von Methyl(morpholino)pyrrolidinophosphin (11)
Zu einer Lösung von Methyldichlorphosphin (5,0 g, 42,76 mmol) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 1-(Trimethylsilyl)pyrrolidin (7,5 ml, 6,1 g, 42,8 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um Chlor(methyl)pyrrolidinophosphin als ein farbloses Öl zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 144,8.
Zu der Lösung von Chlor(methyl)pyrrolidinophosphin in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (8,3 ml, 7,5 g, 43,0 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgelbes Öl (8,2 g, 95%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 72,5.
Beispiel 12
Synthese von Methyl(N,N-dimethylamino)morpholinophosphin (12)
sZu einer Lösung von Methyldichlorphosphin (5,0 g, 42,76 mmol, 3,8 ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise N,N-Dimethyltrimethylsilylamin (5,0 g, 42,76 mmol, 6,9 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um Chlor(methyl)(N,N-dimethylamino)phosphin als ein farbloses Öl zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 151,3.
Zu der Lösung von Chlor(methyl)(N,N-dimethylamino)phosphin in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (8,3 ml, 7,5 g, 43,0 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck zugegeben, um ein blassgelbes Öl (7,1 g, 94%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 81,6.
Beispiel 13
Synthese von N,N-Diethylamino(methyl)morpholinophosphin (13)
Zu einer Lösung von Methyldichlorphosphin (10 g, 85, 5 mmol, ml) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise N,N-Diethyltrimethylsilylamin (12,43 g, 16,2 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um Chlor(methyl)(N,N-dimethylamino)phosphin als ein farbloses Öl zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 147,8.
Zu der Lösung von Chlor(methyl)(N,N-dimethylamino)phosphin (11,4 g, 81,77 mmol) in CH₂Cl₂ (50 ml) wurde tropfenweise 4-(Trimethylsilyl)morpholin (17,43 ml, 15,63 g, 98,12 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgelbes Öl (14,8 g, 89%) als ein Produkt zu erhalten. ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 81,4.

Claims

Bifunktionelles, phosphitylierendes Reagens mit der allgemeinen Struktur (II):
wobei R eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppe mit zwischen einem und 20 Kohlenstoffatomen und entweder nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert ist; und wobei X und Y sich voneinander unterscheiden und unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus
ausgewählt sind, vorausgesetzt, dass, wenn R eine Methoxygruppe ist, es sich bei X bzw. Y nicht um eine Diisopropylaminogruppe handelt, wenn der andere Rest eine Morpholingruppe ist.
Bifunktionelles, phosphitylierendes Reagens nach Anspruch 1, wobei R CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂S- ist, worin Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist.
Verfahren zum Herstellen 5'-geschützter Nukieosidphosphoramidite oder P-substituierter Phosphonamidite, wobei das Verfahren das Umsetzen eines bifunktionellen, phosphitylierenden Reagens mit der allgemeinen Struktur (II)
umfasst, wobei R eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppe mit zwischen einem und 20 Kohlenstoffatomen und entweder nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert ist; und wobei X und Y sich voneinander unterscheiden und unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus
ausgewählt sind, vorausgesetzt, dass, wenn R eine Methoxygruppe ist, es sich bei X bzw. Y nicht um eine Diisopropylaminogruppe handelt, wenn der andere Rest eine Morpholingruppe ist; mit einem 5'-geschützten Nukleosid in Gegenwart einer schwachen Säure, um ein 5'-geschütztes Nukleosidphosphoramidit oder P-substituiertes Phosphonamidit herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 3, worin R CH₃O-, NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S- ist, worin Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist.
Verfahren zum Synthetisieren eines Oligonukleosids, das eine oder mehrere P-substituierte Internukleosidbindungen enthält, wobei die Verbesserung das Herstellen eines 5'-geschützten Nukleosidphosphoramidits oder Nukleosid-P-sub stituierten Phosphonamidits in situ durch Umsetzen eines bifunktionellen, phosphitylierenden Reagens mit der allgemeinen Struktur (II)
umfasst, wobei R eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aroxy-, Aralkoxy-, Thioalkyl-, Thioaryl- oder Thioaralkylgruppe mit zwischen einem und 20 Kohlenstoffatomen und entweder nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert ist; und wobei X und Y sich voneinander unterscheiden und unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus
ausgewählt sind; mit einem 5'-geschützten Nukleosid in Gegenwart einer schwachen Säure, um ein 5'-geschütztes Nukleosidphosphoramidit oder ein 5'-geschütztes Nukleosid-P-substituiertes Phosphonamidit herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 5, worin R CH₃O- , NCC₂H₄O-, CH₃-, NCC₂H₄S- oder PhCOSCH₂CH₂S- ist, worin Ph Phenyl oder 2,4-Dichlorphenyl ist.
Verfahren nach Anspruch 5 zum Synthetisieren von P-substituierten Oligonukleotiden, umfassend das Herstellen eines 5'-geschützten Nukleosid-P-sub stituierten Phosphonamidits in situ und Koppeln des P-substituierten Phosphonamidits des 5'-geschützten Nukleosid-P-substituierten Phosphonamidits mit einem ungeschützten 5'-Ende eines Nukleosids, dadurch gekennzeichnet, dass das 5'-geschützte Nukleosid-P-substituierte Phosphonamidit aus einer Verbindung nach Anspruch 1 hergestellt ist, worin R eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe mit zwischen einem und 20 Kohlenstoffatomen und entweder nicht substituiert oder mit Halogen- und/oder Stickstoffbestandteilen bis zu vollständig substituiert ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 für die Synthese von Oligonukleotiden.