ES2212097T3 - Preparacion in situ de fosforamiditos de nucleosidos y su uso en sintesis de oligonucleotidos. - Google Patents

Preparacion in situ de fosforamiditos de nucleosidos y su uso en sintesis de oligonucleotidos.

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Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA NUEVOS REACTIVOS BIFUNCIONALES FOSFITILANTES Y SU APLICACION EN LA PREPARACION IN SITU DE FOSFORAMIDITAS DE NUCLEOSIDO 5'' - PROTEGIDOS Y LA SINTESIS DE OLIGONUCLEOTIDOS. LOS REACTIVOS FOSFITILANTES BIFUNCIONALES SEGUN LA INVENCION REACCIONAN RAPIDAMENTE CON LOS NUCLEOSIDOS EN CONDICIONES ESCASAMENTE ACIDAS. ADEMAS, LOS REACTIVOS FOSFITILANTES BIFUNCIONALES SEGUN LA INVENCION GENERAN QUIMIOSELECTIVAMENTE LAS FOSFORAMIDITAS DE NUCLEOSIDO CORRESPONDIENTES IN SITU, SIN NECESIDAD DE PURIFICAR LAS FOSFORAMIDITAS DE NUCLEOSIDO ANTES DE UTILIZARLAS EN LA SINTESIS DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS. FINALMENTE, LOS REACTIVOS FOSFITILANTES BIFUNCIONALES SEGUN LA INVENCION SON RELATIVAMENTE ESTABLES Y FACILES DE MANIPULAR.

Description

Preparación in situ de fosforamiditos de nucleósidos y su uso en síntesis de oligonucleótidos.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La invención se refiere a la síntesis química de oligonucleótidos y a entidades químicas útiles en tales síntesis.
Sumario de la técnica relacionada
Los oligonucleótidos se han convertido en herramientas indispensables en la biología molecular moderna, siendo usados en una amplia variedad de técnicas, que oscilan desde métodos de diagnóstico hasta PCR pasando por la inhibición antisentido de la expresión génica. Este uso ampliamente extendido de oligonucleótidos ha conducido a una demanda creciente de métodos rápidos, baratos y eficaces para sintetizar oligonucleótidos.
Ahora se puede lograr, de forma rutinaria, la síntesis de oligonucleótidos para aplicaciones antisentido y de diagnóstico. Véase, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs p. 165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, p. 87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); y Uhlmann y Peyman, supra. Agrawal e Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); y Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds. CRC Press, Boca Raton, 1993). Los primeros enfoques sintéticos incluyeron las químicas de fosfodiésteres y fosfotriésteres. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972), describen la química de fosfodiésteres para la síntesis de oligonucleótidos. Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978), describen la química de fosfotriésteres para la síntesis de oligonucleótidos y polinucleótidos. Estos primeros enfoques han dado paso mayormente a enfoques más eficaces con fosforamiditos y H-fosfonatos para la síntesis. De estos, el enfoque con fosforamiditos se ha convertido en el más popular para la mayoría de las aplicaciones. Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), describen el uso de fosforamiditos desoxinucleosídicos en la síntesis de polinucleótidos. El enfoque con fosforamiditos se ha usado para sintetizar oligonucleótidos que tienen una variedad de enlaces internucleosídicos modificados. Agrawal y Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987), muestran la síntesis de metilfosfonatos de oligonucleótidos usando la química de fosforamiditos. Connolly et al., Biochemistry 23: 3443 (1984), describe la síntesis de fosforotioatos de oligonucleótidos usando la química de fosforamiditos. Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988), describe la síntesis de fosforamidatos de oligonucleótidos usando la química de fosforamiditos. La síntesis en fase sólida de oligonucleótidos mediante el enfoque con fosforamiditos se puede variar para diferentes aplicaciones, pero normalmente implica el mismo protocolo generalizado. Brevemente, este enfoque comprende anclar el mayor nucleósido en 3' a un soporte sólido, funcionalizado con restos amino y/o hidroxilo, y añadir subsiguientemente por etapas los nucleósidos adicionales. Los enlaces internucleosídicos deseados se forman entre el grupo fosforamidito en 3' del nucleósido entrante y el grupo hidroxílico en 5' del mayor nucleósido en 5' del oligonucleótido naciente, unido al soporte.
Sin embargo, aún se necesita el refinamiento de metodologías, particularmente cuando se realiza una transición a una síntesis de mayor escala (10 \mumoles a 1 mmoles y superior). Véase Padmapriya et al., Antisense Res. Dev. 4: 185 (1994). Ya se han dado a conocer varias modificaciones de los métodos estándares con fosforamiditos, para facilitar la síntesis y aislamiento de oligonucleótidos. Véase, por ejemplo, Padmapriya et al., supra; Ravikumar et al., Tetrahedron 50: 9255 (1994); Theisen et al., Nucleosides & Nucleotides 12: 43 (1994); e Iyer et al., Nucleosides & Nucleotides 14: 1349 (1995) (Kuijpers et al., Nucl. Acids Res. 18: 5197 (1990); y Reddy et al., Tetrahedron Lett. 35: 4311 (1994).
Un factor principal limitante de la síntesis económicamente eficiente de oligonucleótidos es el tiempo y el coste requeridos para obtener y purificar los fosforamiditos nucleosídicos monómeros. Bodepudi et al., Chem. Res. Toxicol. 5: 608-617, describe que la preparación de fosforamiditos a partir de 2'-desoxi-7,8-dihidro-8-oxoguanosina y 2'-desoxi-7,8-dihidro-8-oxoadenosina, según el procedimiento estándar, da como resultado una amplia descomposición de los fosforamiditos durante la purificación debido a su inestabilidad y sensibilidad al agua. Un enfoque potencial para superar estos problemas es generar el fosforamidito in situ a medida que se lleva a cabo el proceso de síntesis de oligonucleótidos. Desafortunadamente, los numerosos intentos de este enfoque han sido desalentadores. Moore y Beaucage, J. Org. Chem. 50: 2019-2025 (1985) enseña la preparación in situ de fosforamiditos haciendo reaccionar desoxirribonucleósidos con bis-(pirrolidino)-metoxifosfina activada mediante 4,5-dicloroimidazol en 1-metil-2-pirrolidinona. Sin embargo, este método estaba limitado por la mala quimioselectividad, formándose como subproducto alrededor de 8-10% de triéster de metilfosfito de (3'-3')-dinucleósido. Barone et al., Nucleic Acids Res. 12. 4051-4061 (1984) y Lee y Moon, Chem. Lett. 1229-1232 (1984) describen una mejor quimioselectividad en la preparación de fosforamiditos in situ, haciendo reaccionar desoxirribonucleósidos con bis-(N,N-dialquilamino)alcoxifosfinas y 1H-tetrazol o su sal N,N-diisopropilamónica. Desafortunadamente, la sal N,N-diisopropilamónica del tetrazol, añadida o bien generada in situ, puede formar precipitados dentro del sintetizador. Helinski et al., Tetrahedron Lett. 32: 4981-4984 (1991) y 34: 6451-6454 (1993) describe la activación selectiva de reactivos fosfitilantes bifuncionales que contienen un grupo p-nitrofenoxi. Sin embargo, esta metodología no es adaptable a los actuales enfoques con fosforamiditos debido a que el grupo p-nitrofenoxi ha de ser activado usando una base fuerte. Finalmente, Fourrey et al., Tetrahedron Lett. 22: 729-732 (1981) y Cao et al., Tetrahedron Lett. 24: 1019-1020 (1983) describen, como agentes fosfitilantes bifuncionales reactivos, fosforodiclorito y los correspondientes ditetrazolito y ditriazolito. Desafortunadamente, la aplicación de estos agentes a la síntesis de oligonucleótidos generalmente es problemática, debido a su reactividad extremadamente elevada y a su mala quimioselectividad. En el documento WO-A-867362 se describen otras metoxifosfinas.
Ha habido también conocimiento del uso de metilfosforodiamiditos para producir metilfosfonamiditos nuleosídicos para la síntesis de oligonucleótidos. Engels et al., Nucl. Acids Res. Symposium Series No. 24, p. 83-86 (1991), describe el uso de metilfosforodiamiditos para producir monómeros de metilfosfonamiditos de nucleósidos para la síntesis estereoselectiva de metilfosfonatos de oligonucleósidos. Sin embargo, los monómeros se purificaron antes de su uso en síntesis, en vez de ser preparados in situ, y no se demostró la suficiente quimioselectividad para este último enfoque.
Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos reactivos fosfitilantes bifuncionales y su aplicación en la preparación in situ de fosforamiditos, y fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos protegidos en 5',y en la síntesis subsiguiente de oligonucleótidos sin purificación previa de los fosforamiditos, o fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos. Idealmente, tales reactivos se deben activar selectivamente y deben reaccionar rápidamente con nucleósidos, deben generar quimioselectivamente in situ los correspondientes fosforamiditos, o fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos, y deben ser relativamente estables y fáciles de manipular.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona nuevos reactivos fosfitilantes bifuncionales y nuevos procesos para la preparación in situ de monómeros de fosforamiditos, y de fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos protegidos en 5', y para la síntesis de oligonucleótidos. Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según la invención reaccionan rápidamente con nucleósidos en condiciones débilmente ácidas. Además, los reactivos fosfitilantes bifuncionales según la invención generan quimioselectivamente in situ los correspondientes monómeros de fosforamiditos, o de fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos, sin la necesidad de purificar los monómeros de fosforamiditos, o de fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos, antes de usarlos en la síntesis de oligonucleótidos. Finalmente, los reactivos fosfitilantes bifuncionales según la invención son relativamente estables y fáciles de manipular.
En un primer aspecto, la invención proporciona reactivos fosfitilantes bifuncionales que son útiles para la preparación in situ de monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5', y para la síntesis de oligonucleótidos. Para los fines de la invención, un fosfonamidito sustituido en P de nucleósido es un fosfonamidito de nucleósido en el que se ha sustituido un átomo de oxígeno que no forma puente del fosforamidito correspondiente por un grupo sustituyente orgánico. Los grupos sustituyentes orgánicos tienen de 1 a 20 átomos de carbono, e incluyen grupos alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo, o tioaralquilo, cualquiera de los cuales puede estar no sustituido o sustituido, hasta incluso totalmente, con constituyentes de halógeno y/o nitrogenados. Los grupos sustituyentes orgánicos particularmente preferidos incluyen los grupos CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}CH_{2}S-, en los que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo. Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según este aspecto de la invención tienen la estructura general (II):
1
en la que R es un grupo alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, aroxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo, o tioaralquilo, que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, y que no está sustituido o está incluso totalmente sustituido con constituyentes de halógeno y/o nitrogenados, más preferiblemente son CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}CH_{2}S-, en los que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo;
y en la que X e Y son diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consta de:
2
Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según este aspecto de la invención reaccionan en presencia de un ácido débil con nucleósidos protegidos en 5' para producir quimioselectivamente monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos protegidos en 5'.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para generar monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos protegidos en 5', sin producir un precipitado y sin requerir purificación de los monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P del nucleósido antes de su uso en la síntesis de oligonucleótidos. En el proceso según este aspecto de la invención, los reactivos fosfitilantes bifuncionales según el primer aspecto de la invención se hacen reaccionar con nucleósidos protegidos en 5' en presencia de un ácido débil para producir monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P, de nucleósidos protegidos en 5'.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un proceso mejorado para sintetizar oligonucleótidos. En el proceso según este aspecto de la invención, la mejora comprende la etapa de generar in situ los monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P del nucleósido, en vez de añadir monómeros purificados de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P del nucleósido, en el momento apropiado en un procedimiento convencional de síntesis de oligonucleótidos. La generación in situ utiliza preferiblemente los agentes fosfitilantes según el primer aspecto de la invención.
Los reactivos y procedimientos según la invención son útiles para producir una amplia variedad de compuestos oligonucleotídicos u oligonucleotídicos sustituidos en P, o compuestos oligonucleotídicos u oligonucleotídicos sustituidos en P marcados radiactivamente, todos los cuales se denominan aquí generalmente como "oligonucleótidos". Los reactivos y procedimientos según la invención se pueden usar o practicar en una escala que oscila desde una escala pequeña de laboratorio hasta una gran escala comercial.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra 13 realizaciones particularmente preferidas de reactivos fosfitilantes bifuncionales según el primer aspecto de la invención.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La invención se refiere a la síntesis química de oligonucleótidos y a entidades químicas útiles en tal síntesis. Las patentes y publicaciones identificadas en esta memoria descriptiva están dentro del conocimiento de los expertos en este campo, y se incorporan de ese modo como referencia en su totalidad.
La invención proporciona nuevos reactivos fosfitilantes bifuncionales y nuevos procedimientos para la preparación in situ de monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5', y para la síntesis de oligonucleótidos. Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según la invención reaccionan rápidamente con nucleósidos en condiciones débilmente ácidas. Además, los reactivos fosfitilantes bifuncionales según la invención generan quimioselectivamente in situ los correspondientes monómeros de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos, sin la necesidad de purificar los monómeros de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos antes de usarlos en la síntesis oligonucleotídica. Finalmente, los reactivos fosfitilantes bifuncionales según la invención son relativamente estables y fáciles de manipular.
En un primer aspecto, la invención proporciona reactivos fosfitilantes bifuncionales que son útiles para la preparación in situ de monómeros de fosforamiditos o de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5', y para la síntesis de oligonucleótidos. Para los fines de la invención, un fosfonamidito sustituido en P de nucleósido es un fosfonamidito de nucleósido en el que se ha sustituido un átomo de oxígeno que no forma puente, del fosforamidito correspondiente, por un grupo sustituyente orgánico. Los grupos sustituyentes orgánicos tienen de 1 a 20 átomos de carbono, e incluyen grupos alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo, o tioaralquilo, cualquiera de los cuales puede estar no sustituido o sustituido, hasta incluso totalmente, con constituyentes de halógeno y/o nitrogenados. Los grupos sustituyentes orgánicos particularmente preferidos incluyen los grupos CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}CH_{2}S-, en los que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo. Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según este aspecto de la invención tienen la estructura general (II):
3
en la que R es un grupo alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, aroxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo, o tioaralquilo, que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, y que no está sustituido o está incluso totalmente sustituido con constituyentes de halógeno y/o nitrogenados, siendo más preferiblemente CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}CH_{2}S-, en los que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo;
y en la que X e Y son diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consta de:
4
con la condición de que, cuando R es metoxi, X o Y no sean diisopropilamino cuando el otro es morfolino.
Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según este aspecto de la invención se pueden sintetizar como se describe en los Ejemplos 1-13, a continuación, o mediante simple adaptación de estos Ejemplos. Los reactivos fosfitilantes bifuncionales según este aspecto de la invención reaccionan en presencia de un ácido débil, con nucleósidos protegidos en 5', para producir quimioselectivamente monómeros de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5'. Para evitar la formación de un subproducto dimérico 3'-3' nucleosídico, la activación in situ usando estos reactivos se lleva a cabo preferiblemente usando como ácido débil 0,25-0,3 equivalentes de tetrazol o 4,5-dicloroimidazol.
En un segundo aspecto, la invención proporciona procedimientos para generar fosforamiditos o fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5', sin producir un precipitado y con quimioselectividad suficiente para eliminar la necesidad de purificación de los fosforamiditos o fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos así formados. En el procedimiento según este aspecto de la invención, los reactivos fosfitilantes bifuncionales según el primer aspecto de la invención se hacen reaccionar con nucleósidos protegidos en 5', en presencia de un ácido débil, para producir un fosforamidito o fosfonamidito sustituido en P de nucleósido protegido en 5'. Los nucleósidos protegidos en 5' preferidos incluyen adenosina, guanosina, citosina, uridina, inosina y timidina, así como nucleósidos modificados (véase, por ejemplo, Sanghvi, en Antisense Research and Applications, p. 273-288 (Crook y Lebleu, eds.) CRC Press (1993), y las referencias citadas allí). La posición 5' del nucleósido se puede proteger mediante cualquiera de los grupos protectores estándares (véase, por ejemplo, Sonveaux en Protocols for Oligonucleotide Conjugates, p. 1-72 (S. Agrawal, ed.), Humana Press (1994)), o con cualquier grupo protector adecuado para la síntesis de oligonucleótidos. En ciertas realizaciones preferidas, la posición 5' del nucleósido se protege mediante un grupo dimetoxitritilo (DMT).
La reacción entre el reactivo de fosfitilación bifuncional y el nucleósido protegido en 5' se puede monitorizar mediante espectroscopía convencional de RMN de ^{31}P. Los reactivos de fosfitilación bifuncionales más preferidos, según la invención, reaccionarán hasta su terminación con el nucleósido protegido en 5' en alrededor de 10 minutos.
En el procedimiento según este aspecto de la invención, para obtener quimioselectividad de la reacción para el fosfonamidito sustituido en P de nucleósido protegido en 5' deseado, se controla la concentración y la naturaleza del activador. De este modo, la activación se lleva a cabo preferiblemente usando como ácido débil alrededor de 0,25-0,3 equivalentes de tetrazol o 4,5-dicloroimidazol. En este contexto, "alrededor de" significa aproximadamente más o menos 3%. Estas condiciones conducen a la síntesis rápida del fosfonamidito sustituido en P deseado del nucleósido protegido en 5', con contaminación por el dímero 3'-3' nucleosídico en una cantidad de sólo 3% o menos.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para sintetizar oligonucleótidos. En el procedimiento según este aspecto de la invención, la mejora comprende la etapa de generar in situ los monómeros de fosforamidito o de fosfonamidito sustituido en P del nucleósido, en vez de añadir monómeros purificados de fosforamidito o de fosfonamidito sustituido en P del nucleósido, en el punto apropiado en un procedimiento convencional de síntesis de oligonucleótidos. La generación in situ utiliza preferiblemente los agentes fosfitilantes según el primer aspecto de la invención. Algunos de los oligonucleótidos sintetizados según este aspecto de la invención serán oligonucleótidos sustituidos en P. Para los fines de la invención, un oligonucleótido sustituido en P es un oligonucleótido en el que de uno a alrededor de todos los átomos de fósforo internucleosídicos tienen un átomo de oxígeno no formador de puente procedente del fosfodiéster correspondiente sustituido con un grupo sustituyente orgánico. Los grupos sustituyentes orgánicos tienen de 1 a 20 átomos de carbono, e incluyen grupos alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, aroxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo o tioaralquilo, cualquiera de los cuales puede estar no sustituido o sustituido incluso completamente con constituyentes de halógeno y/o nitrogenados. Los grupos sustituyentes orgánicos particularmente preferidos incluyen grupos CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}CH_{2}S-, en los que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo. En otra realización preferida, otro átomo de oxígeno no formador de puente, procedente del fosfodiéster correspondiente, se sustituye por un átomo de azufre.
Para los fines de la invención, la expresión "in situ" pretende significar "sin que intervenga purificación". De este modo, la generación in situ de fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5' tiene lugar siempre que al menos uno de los fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5' se generen y se usen entonces para la síntesis de oligonucleótidos sin que intervenga la purificación de los fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5'. De este modo, el procedimiento mejorado según la invención para sintetizar oligonucleótidos sustituidos en P comprende generar in situ un fosforamidito o fosfonamidito sustituido en P de nucleósido protegido en 5', y acoplar el fosfonamidito sustituido en P, del fosfonamidito sustituido en P del nucleósido protegido en 5', con un extremo 5' sin proteger de un nucleósido que está unido covalentemente de forma preferible a un soporte sólido y que puede ser el nucleósido 5'-terminal de un oligonucleótido naciente. La generación de los fosforamiditos o fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5', y la síntesis de oligonucleótidos, puede tener lugar en la misma vasija de reacción que la de las reacciones de acoplamiento de los nucleósidos, o puede tener lugar en diferentes vasijas de reacción. Además, la generación de fosforamiditos o fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5' puede tener lugar antes o contemporáneamente con la síntesis de oligonucleótidos.
En una realización particularmente preferida del proceso según este aspecto de la invención, el agente bifosfitilante usado para producir in situ los fosforamiditos o fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos se selecciona de los agentes bifosfitilantes mostrados en la Figura 1. El fosfonamidito sustituido en P preferido de nucleósido se genera in situ, seguido de acoplamiento sin que intervenga la purificación del fosfonamidito sustituido en P del nucleósido.
La mejora según este aspecto de la invención se puede incorporar en cualquier protocolo estándar de síntesis de fosforamiditos, usando cualquier sintetizador automatizado.
La versatilidad de la mejora según este aspecto de la invención permite que sea usado para la síntesis de una amplia variedad de oligonucleótidos diferentes. Para los fines de la invención, el término "oligonucleótido" incluye polímeros de dos o más monómeros desoxirribonucleotídicos o ribonucleotídicos sustituidos en 2'-O, o cualquier combinación de los mismos. Tales monómeros se pueden acoplar entre sí mediante cualquiera de los numerosos enlaces internucleosídicos conocidos. En ciertas realizaciones preferidas, estos enlaces internucleosídicos pueden ser enlaces de tipo fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato o fosforamidato, o combinaciones de los mismos. El término oligonucleótido también engloba polímeros que tienen bases o azúcares químicamente modificados o que están marcados con radioisótopos, y/o que tienen sustituyentes adicionales, incluyendo pero sin limitación grupos lipófilos, agentes intercalantes, diaminas y adamantano. Para los fines de la invención, la expresión "sustituido en 2'-O" significa sustitución, en la posición 2' del resto de pentosa, con un grupo -O-alquilo que contiene 1-6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo o alilo que tiene 2-6 átomos de carbono, en los que tal grupo alquilo, arilo o alilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido, por ejemplo, con halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo, o grupos amino; o tal sustitución en 2' puede ser con un grupo hidroxi (para producir un ribonucleósido), o un grupo amino o halo, pero no con un grupo 2'-H.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones preferidas de la invención, y no pretenden limitarla en su naturaleza. Excepto que se indique de otro modo, en cada uno de los siguientes ejemplos, los reactivos procedieron según lo siguiente. El acetonitrilo anhídro se compró de J. T. Baker Inc. (Phillipsburg, NJ). El dT-CPG, el cianoetilfosforamidito de 5'-DMT-desoxiadenosina (Bz), cianoetilfosforamidito de 5'-DMT-desoxicitidina (Bz), cianoetilfosforamidito de 5'-DMT-desoxiguanosina (ibu), cianoetilfosforamidito de 5'-DMT-timidina, Cap A, Cap B, las disoluciones de activador, oxidante y de desbloqueo se obtuvieron de PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). La disolución de amoníaco en metanol (aprox. 7 N) se obtuvo de ACROS ORGANIC (Pittsburgh, PA). Todos los otros productos químicos se obtuvieron de Aldrich. Los espectros de RMN ^{31}P (121,65 MHz) y espectros de RMN ^{1}H (300 MHz) se registraron en un Varian UNITY 300 (el desplazamiento químico se correlacionó con H_{3}PO_{4} al 85% y tetrametilsilano, respectivamente). La síntesis de oligonucleótidos se realizó en un sintetizador de ADN 8909 Expedite^{TM} (Millipore). Los números de los compuestos, mostrados en cursiva, se refieren a los compuestos mostrados en la Figura 1.
Ejemplo 1 Síntesis de 2-cianoetoxi-(N,N-diisopropilamino)-pirrolidinofosfina (1)
A una disolución de cloro(2-cianoetoxi) (N,N-diisopropilamino)fosfina (12,9 g, 54,56 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) se añadió gota a gota 1-(trimetilsilil)pirrolidina (10,0 ml, 8,21 g, 57,29 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (13,3 g, 95%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 133,9.
Ejemplo 2 Síntesis de 2-cianoetoxi(N,N-diisopropilamino) (N,N-dimetilamino)fosfina (2)
A una disolución de cloro(2-cianoetoxi) (N,N-diisopropilamino)fosfina (19,22 g, 81,2 mmoles, 18,1 ml) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) se añadió gota a gota N,N-dimetiltrimetilsililamina (10,0 g, 85,3 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite incoloro (18,7 g, 94%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 126,3.
Ejemplo 3 Síntesis de 2-cianoetoxi(N,N-dietilamino) (N,N-diisopropilamino)fosfina (3)
A una disolución de cloro(2-cianoetoxi) (N,N-diisopropilamino)fosfina (5,95 g, 25,13 mmoles, 5,61 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota N,N-dietiltrimetilsililamina (3,84 g, 26,4 mmoles, 5,0 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite incoloro (6,5 g, 94%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 127,2.
Ejemplo 4 Síntesis de 2-cianoetoxi(N,N-diisopropilamino)morfolinofosfina (4)
A una disolución de cloro(2-cianoetoxi) (N,N-diisopropilamino)fosfina (10,61 g, 44,82 mmoles, 10,0 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)morfolina (8,76 ml, 7,86 g, 49,31 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite incoloro (12,5 g, 97%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 125,2.
Ejemplo 5 Síntesis de 2-cianoetoxi(morfolino)pirrolidinofosfina (5)
A una disolución de (2-cianoetoxi) (dicloro)fosfina (7,16 g, 41,61 mmoles, 5,3 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 1-(trimetilsilil)pirrolidina (7,26 ml, 5,96 g, 41,61 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar cloro(2-cianoetoxi)pirrolidinofosfina como un aceite incoloro. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 177,5.
A una disolución de cloro(2-cianoetoxi)-pirrolidinofosfina en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)morfolina (8,13 ml, 7,29 g, 45,77 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (9,8 g, 92%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 134,2.
Ejemplo 6 Síntesis de 2-cianoetoxi(N,N-dimetilamino)morfolinofosfina (6)
A una disolución de (2-cianoetoxi) (dicloro)fosfina (4,29 g, 24,97 mmoles, 3,2 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota N,N-dimetiltrimetilsililamina (2,93 g, 24,97 mmoles, 4,0 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar cloro(2-cianoetoxi) (N,N-dimetilamino)fosfina como un aceite incoloro. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 174,7.
A una disolución de cloro(2-cianoetoxi) (N,N-dimetilamino)fosfina en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)morfolina (4,86 ml, 4,36 g, 27,39 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (5,0 g, 93%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 133,5.
Ejemplo 7 Síntesis de (N,N-diisopropilamino) (metil)pirrolidinofosfina (7)
A una disolución de cloro(N,N-diisopropilamino)-metilfosfina (5,0 g, 27,53 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 1-(trimetilsilil)pirrolidina (5,3 ml, 4,34 g, 30,3 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite incoloro (5,5 g, 93%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 48,7.
Ejemplo 8 Síntesis de (N,N-diisopropilamino) (metil) (N,N-dimetilamino)fosfina (8)
A una disolución de cloro(N,N-diisopropilamino)-metilfosfina (6,2 g, 34,1 mmoles, 6,2 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota N,N-dimetiltrimetilsililamina (4,39 g, 37,45 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite incoloro (4,3 g, 90%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 50,6.
Ejemplo 9 Síntesis de (N,N-dietilamino) (N,N-diisopropilamino)metilfosfina (9)
A una disolución de cloro(N,N-diisopropilamino)-metilfosfina (5,0 g, 27,53 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota N,N-dietiltrimetilsililamina (4,4 g, 30,28 mmoles, 5,7 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite incoloro (5,0 g, 83%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 56,6.
Ejemplo 10 Síntesis de (N,N-diisopropilamino) (metil)morfolinofosfina (10)
A una disolución de cloro(N,N-diisopropilamino)-metilfosfina (5,0 g, 27,53 mmoles, 5,0 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)morfolina (5,4 ml, 4,8 g, 30,28 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (6,1 g, 96%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 58,8.
Ejemplo 11 Síntesis de metil(morfolino)pirrolidinofosfina (11)
A una disolución de metildiclorofosfina (5,0 g, 42,76 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 1-(trimetilsilil)pirrolidina (7,5 ml, 6,1 g, 42,8 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar cloro(metil)pirrolidinofosfina como un aceite incoloro. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 144,8.
A la disolución de cloro(metil)pirrolidinofosfina en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)-morfolina (8,3 ml, 7,5 g, 43,0 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (8,2 g, 95%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 72,5.
Ejemplo 12 Síntesis de metil(N,N-dimetilamino)morfolinofosfina (12)
A una disolución de metildiclorofosfina (5,0 g, 42,76 mmoles, 3,8 ml) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota N,N-dimetil-(trimetilsilil)amina (5,0 g, 42,76 mmoles, 6,9 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar cloro(metil) (N,N-dimetilamino)fosfina como un aceite incoloro. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 151,3.
A la disolución de cloro(metil) (N,N-dimetilamino)-fosfina en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)morfolina (8,3 ml, 7,5 g, 43,0 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (7,1 g, 94%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 81,6.
Ejemplo 13 Síntesis de (N,N-dietilamino) (metil)morfolinofosfina (13)
A una disolución de metildiclorofosfina (10 g, 85,5 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota N,N-dietil-(trimetilsilil)amina (12,43 g, 16,2 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar cloro(metil) (N,N-dietilamino)fosfina como un aceite incoloro. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 147,8.
A la disolución de cloro(metil) (N,N-dietilamino)-fosfina (11,4 g, 81,77 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se añadió gota a gota 4-(trimetilsilil)morfolina (17,43 ml, 15,63 g, 98,12 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (14,8 g, 89%) como producto. ^{31}P NMR (CDCl_{3}) \delta 81,4.

Claims (8)

1. Un reactivo fosfitilante bifuncional que tiene la estructura general (II):
5
en la que R es un grupo alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, aroxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo o tioaralquilo, que tiene de uno a 20 átomos de carbono y que está no sustituido o que está sustituido incluso completamente con constituyentes halogenados y/o nitrogenados;
y en la que X e Y son diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consta de:
6
con la condición de que, cuando R es metoxi, X o Y no sea diisopropilamino cuando el otro es morfolino.
2. El reactivo fosfitilante bifuncional según la reivindicación 1, en el que R es CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-,
NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}CH_{2}S-, en el que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo.
3. Un procedimiento para generar fosforamiditos o fosfonamiditos sustituidos en P de nucleósidos protegidos en 5', comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un reactivo fosfitilante bifuncional que tiene la estructura general (II):
7
en la que R es un grupo alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, aroxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo o tioaralquilo, que tiene de uno a 20 átomos de carbono, y que está no sustituido o que está sustituido incluso completamente con constituyentes halogenados y/o nitrogenados;
y en la que X e Y son diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consta de:
8
con la condición de que, cuando R es metoxi, X o Y no sea diisopropilamino cuando el otro es morfolino;
con un nucleósido protegido en 5', en presencia de un ácido débil, para producir un fosforamidito o fosfonamidito sustituido en P de un nucleósido protegido en 5'.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que R es CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}
CH_{2}S-, en el que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo.
5. Un procedimiento para sintetizar un oligonucleótido que contiene uno o más enlaces internucleosídicos sustituidos en P, comprendiendo la mejora generar in situ un fosforamidito de nucleósido protegido en 5' o fosfonamidito sustituido en P de nucleósido haciendo reaccionar un reactivo fosfitilante bifuncional que tiene la estructura general (II):
9
en la que R es un grupo alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, aroxi, aralcoxi, tioalquilo, tioarilo o tioaralquilo, que tiene de uno a 20 átomos de carbono y que está no sustituido o que está sustituido incluso completamente con constituyentes halogenados y/o nitrogenados;
y en la que X e Y son diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consta de:
10
con un nucleósido protegido en 5', en presencia de un ácido débil, para producir un fosforamidito de nucleósido protegido en 5'o fosfonamidito sustituido en P de un nucleósido protegido en 5'.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que R es CH_{3}O-, NCC_{2}H_{4}O-, CH_{3}-, NCC_{2}H_{4}S-, o PhCOSCH_{2}
CH_{2}S-, en el que Ph es fenilo o 2,4-diclorofenilo.
7. Un procedimiento según la reivindicación 5, para sintetizar oligonucleótidos sustituidos en P, que comprende generar in situ un fosfonamidito sustituido en P de un nucleósido protegido en 5', y acoplar el fosfonamidito sustituido en P, del fosfonamidito sustituido en P del nucleósido protegido en 5', con un extremo 5' sin proteger de un nucleósido, caracterizado porque el fosfonamidito sustituido en P del nucleósido protegido en 5' se prepara a partir de un compuesto según la reivindicación 1 en el que R es un grupo alquilo, arilo o aralquilo que tiene de uno a 20 átomos de carbono y que está no sustituido o está incluso completamente sustituido con constituyentes halogenados y/o nitrogenados.
8. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 ó 2 para la síntesis de oligonucleótidos.
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