DE60209128T2 - Aktivatoren für die oligonukleotidsynthese - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Synthetische Oligonukleotide sind wichtige diagnostische Werkzeuge für den Nachweis von Erb- und Viruskrankheiten. Darüber hinaus sind Oligonukleotide und modifizierte Oligonukleotide als therapeutische Kandidatenmoleküle bekannt, die die Genexpression oder Proteinfunktion hemmen. Die Synthese im Großmaßstab von Oligonukleotiden zur Verwendung als therapeutische Kandidatenmoleküle erhielt zunehmende Bedeutung, seit der Zulassung eines Oligonukleotidanalogs zur Behandlung des Cytomegalovirus (CMV) durch die FDA, wobei sich mehrere andere Oligonukleotidanaloge gegenwärtig im klinischen Versuchsstadium befinden. Dabei werden für jede klinische Versuchsreihe Kilogrammengen eines gereinigten Oligonukleotidanalogs benötigt.
  • Die Herstellung eines Oligonukleotids unter Verwendung der Phosphoramiditmethodik beinhaltet die Kondensation eines Nukleosidphosphoramidits sowie eines Nukleosids oder eines wachsenden Oligonukleotids. Die Kondensationsreaktion (die vorliegend auch als Kupplungsreaktion bezeichnet wird) benötigt einen Aktivator (alternativ als Kupplungsmittel bekannt), der die Reaktion erleichtert. Der am häufigsten verwendete Aktivator ist der nukleophile Aktivator 1H-Tetrazol. Allerdings ist 1H-Tetrazol explosiv und kann daher bei Verwendung in Synthesen im Großmaßstab eine Gefahr darstellen.
  • Bei 1H-Tetrazol handelt es sich um eine schwache Säure, die während des ersten Schritts der Aktivierung den dreiwertigen Phosphor des Phosphoramidits protoniert. Anschließend verdrängt ein Tetrazolidanion die Dialkylamingruppe (z.B. N,N-Diisopropylamin) des Phosphoramidits während eines zweiten langsameren Schritts unter Bildung einer Tetrazolyl-Zwischenstufe, die dann schnell mit der primären 5'-Alkoholgruppe eines Nukleosids oder eines wachsenden Oligonukleotids abreagiert. Werden für die Oligonukleotidsynthese sterisch gehinderte Phosphoramidite, wie beispielsweise t-Butyldimethylsilyl-geschützte Ribonukleosidphosphoramidite oder 2'-O-Methylnukleosidphosphoramidite, verwendet, so werden häufig alternative Aktivatoren benötigt, um die Geschwindigkeit der Kupplungsreaktion zu erhöhen. Alternative Aktivatoren, wie beispielsweise 5-Ethylthio-1H-tetrazol, 5-(p-Nitrophenyl)-1H-tetrazol und Benzimidazoliumtriflat, sind häufig saurer als Tetrazol und beschleunigen somit die Geschwindigkeit der Protonierung des dreiwertigen Phosphors, wodurch die Kondensationsgeschwindigkeit erhöht wird.
  • Allerdings können Tetrazol, 5-Ethylthio-1H-tetrazol, 5-(p-Nitrophenyl)-1H-tetrazol und Benzimidazoliumtriflat, da sie sauer sind, zu einer vorzeitigen Entschützung der 5'-Hydroxy-Schutzgruppe eines Phosphoramiditmonomers, bei der es sich typischerweise um eine säurelabile Gruppe handelt, führen. Die vorzeitige Entschützung kann Oligonukleotidverunreinigungen erzeugen, die eine Basis länger als das gewünschte Produkt sind (vorliegend als "N + 1-Verunreinigungen" bezeichnet) und schwer vom gewünschten Produkt zu trennen sind. Die für die RNA-Synthese sowie die Synthese im Großmaßstab allgemein notwendigen längeren Kupplungszeiten führen zu einem Anstieg der vorzeitigen Entschützung von Phosphoramiditen.
  • Daher werden nichtexplosive Aktivatoren, die die Kondensation eines Nukleosidphosphoramidits mit einem Nukleosid oder einem wachsenden Oligonukleotid fördern und die ohne ein Ansteigen von Nebenprodukten eingesetzt werden können, benötigt, um Oligonukleotide für die diagnostische und therapeutische Verwendung leichter verfügbar zu machen. Aus der WO 99/62922 sind Aktivatoren für die Oligonukleotidsynthese bekannt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurde festgestellt, daß ein 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on die Kondensation eines Nukleosidphosphoramidits und eines Nukleosidmonomers oder eines wachsenden Oligonukleotids fördert. Das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on läßt sich durch die Strukturformel I:
    Figure 00030001
    darstellen, in der p gleich 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist. R steht jeweils für einen Substituenten, vorzugsweise jeweils unabhängig für ein Halogen, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -NR11R12, -OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, Cyano, ein gegebenenfalls substituiertes Aryl, ein gegebenenfalls substituiertes Heterocyclyl, -CHO, -COR13, -NHCOR13, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl, halogeniertes Alkyl (z.B. Trifluormethyl und Trichlormethyl) oder -SR13. Vorzugsweise steht R für Halogen, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -NR11R12, -OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13 oder Cyano. Als Alternative bilden zwei benachbarte Gruppen R zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten Ring. Dabei handelt es sich bei dem gebildeten sechsgliedrigen Ring vorzugsweise um einen aromatischen Ring. R11 und R12 stehen jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, oder sie bilden zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe. R13 steht für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe. X7 steht für O oder S. Vorzugsweise steht X7 für O. Besonders bevorzugt steht X7 für O und p ist gleich 0.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich zur effizienten Förderung der Kondensation eines Nukleosidphosphoramidits und eines Nukleosidmonomers oder wachsenden Oligonukleotids ein Salzkomplex aus dem 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und einer organischen Base verwenden.
  • In Gegenwart einer organischen Base weist 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on eine gute Löslichkeit auf, insbesondere in organischen Lösungsmitteln, die typischerweise für die Oligonukleotidsynthese verwendet werden. Daher wird in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Aktivatorlösung eingesetzt, die ein organisches Lösungsmittel, eine organische Base sowie ein durch die Strukturformel I dargestelltes 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on enthält. Die Konzentration des 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons und der organischen Base in der Aktivatorlösung kann bis zur Löslichkeit des 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons im betreffenden Lösungsmittel betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und die organische Base in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,01 M bis etwa 2 M, beispielsweise von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M, vor. Üblicherweise liegen das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und die organische Base in einer Konzentration von bis zu 0,25 M, wie beispielsweise von etwa 0,1 M bis etwa 0,25 M, vor. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform liegen das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und die organische Base in der gleichen molaren Konzentration vor. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das organische Lösungsmittel Azitonitril.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das organische Lösungsmittel ein organisches Amid, wie beispielsweise Dimethylformamid, 1-Methyl-2-pyrrolidinon oder 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon.
  • In einer weiteren Ausführungsform läßt sich ein Oligonukleotid mit Phosphoramiditchemie synthetisieren, bei der es sich bei dem Kupplungsmittel um ein durch die Strukturformel I dargestelltes 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on handelt. Das Kupplungsmittel fördert die Kondensation zwischen einem Nukleosid oder einem wachsenden Oligonukleotid mit einer freien Hydroxy- oder Thiolgruppe und einem Phosphoramidit. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt während der Kupplungsreaktion eine organische Base zusammen mit dem 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on vor. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform liegt die organische Base in der gleichen molaren Konzentration wie das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on vor.
  • Bei dem Nukleosidphosphoramidit kann es sich um ein Monomer oder ein Oligomer, wie beispielsweise ein Dimer oder ein Trimer, handeln. Handelt es sich bei dem Nukleosidphosphoramidit um ein Monomer, so läßt sich dieses durch die Strukturformel IIa:
    Figure 00050001
    darstellen, in der X1 jeweils unabhängig für -O- oder -S- steht. Vorzugsweise steht X1 jeweils für -O-. X2 steht jeweils unabhängig für -O-, -S- oder -NR-. Vorzugsweise steht X2 jeweils für -O-. X3 steht jeweils unabhängig für -O-, -S-, -CH2- oder -(CH2)2-.
  • Vorzugsweise steht X3 jeweils für -O-. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform stehen X1, X2 und X3 jeweils für -O-. R1 steht für eine Alkoholschutzgruppe oder eine Thioschutzgruppe. Vorzugsweise steht R1 für eine säurelabile Schutzgruppe. R2 steht jeweils unabhängig für -H, -F -OR6, -NR7R8, -SR9 oder eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, wie beispielsweise Methyl oder Allyl. R3 steht jeweils unabhängig für -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3 oder -S-CH2CH2-C6H4-NO2. R4 und R5 stehen jeweils unabhängig für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl. Als Alternative bilden R4 und R5 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe. R6 steht jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe (z.B. Methyl, Ethyl, Methoxyethyl oder Allyl), eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl, eine Alkoholschutzgruppe oder -(CH2)q-NR18R19. R7 und R8 stehen jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine Aminschutzgruppe. Als Alternative bilden R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe. R9 steht jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine Thioschutzgruppe. R10 steht jeweils unabhängig für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe. R18 und R19 stehen jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Heteroarylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Heteroaralkylgruppe oder eine Aminschutzgruppe. Als Alternative bilden R18 und R19 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe. q ist eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6. B steht für -H, eine natürliche oder nicht natürliche Nukleobase, geschützte Nukleobase, geschützte natürliche oder nicht natürliche Nukleobase, einen Heterocyclus oder einen geschützten Heterocyclus.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei dem Phosphoramidit um ein Oligomer, wie beispielsweise ein Dimer oder Trimer, handeln. Verfahren zur Herstellung und Nutzung von Nukleosidphosphoramiditdimeren und -trimeren in der Phosphoramiditsynthese von Oligonukleotiden sind aus der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO02/20543 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB01/03973) bekannt.
  • Die Zuckergruppierung des Nukleosidphosphoramidits kann entweder eine D-Konfiguration, wie in natürlich vorkommender DNA und RNA sowie in der Strukturformel IIa, oder eine L-Konfiguration aufweisen. Die Strukturformel IIb stellt ein L-Nukleosidphosphoramidit dar:
  • Figure 00070001
  • In der Strukturformel IIb besitzen X1, X2, X3, R1, R2, R3, R4, R5 und B die oben angegebene Bedeutung.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Phosphoramiditgruppe des Nukleosidphosphoramidits in 5'-Stellung des Zuckerrings gebunden sein. In dieser Ausführungsform läßt sich das Nukleosidphosphoramidit durch die Strukturformeln IIIa und IIIb:
    Figure 00080001
    darstellen, in denen X1, X2, X3, R1, R2, R3, R4, R5 und B die oben angegebene Bedeutung besitzen.
  • In einer weiteren Ausführungsform läßt sich das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zur Förderung der Kondensation eines wachsenden n-meren Oligonukleotids (d.h. eines Oligonukleotids mit n Nukleobasen) sowie eines Nukleosidphosphoramidits unter Bildung eines (n + 1)-meren Oligonukleotids verwenden. Vorzugsweise kann das Nukleosidphosphoramidit dabei durch die Strukturformel IIa dargestellt werden. Das wachsende Oligonukleotid läßt sich durch die Strukturformel IV:
    Figure 00080002
    darstellen, in der X1, X2, X3, R2, R3 und B die oben angegebene Bedeutung besitzen. Dabei steht jedes X4 jeweils unabhängig für O oder S. X5 steht jeweils unabhängig für -OH oder -SH. Vorzugsweise steht X5 für -OH. R16 steht für eine Hydroxyschutzgruppe, eine Thioschutzgruppe, eine Aminoschutzgruppe, -(CH2)q-NR18R19, einen festen Träger oder einen an einen festen Träger gebundenen spaltbaren Linker, wie etwa eine Gruppe der Formel -Y2-L-Y2-R15. Dabei steht Y2 jeweils unabhängig für eine Einfachbindung, -C(O)-, -C(O)NR17-, -C(O)O-, -NR17- oder -O-. L steht für einen Linker, bei dem es sich vorzugsweise um eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine gegebenenfalls substituierte aromatische Gruppe handelt. Stärker bevorzugt steht L für eine Ethylengruppe. R17 steht für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine gegebenenfalls substituierte aromatische Gruppe. Bei R15 handelt es sich um einen beliebigen festen Träger, der sich für die dem Fachmann bekannte Festphasen-Oligonukleotidsynthese eignet. Zu geeigneten festen Trägern gehören beispielsweise "Controlled-pore glass", Polystyrol, mikroporöses Polyamid, wie z.B. Poly(dimethylacrylamid) sowie mit Polyethylen beschichtetes Polystyrol. In vielen Ausführungsformen stellt R16 einen spaltbaren Linker, wie beispielsweise einen Succinyl- oder Oxaloyl-Linker, dar, der an einen festen Träger gebunden ist. n ist gleich 0 oder eine positive ganze Zahl.
  • Das wachsende Oligonukleotid wird mit dem Phosphoramidit sowie einem durch die Strukturformel I dargestellten 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on in Kontakt gebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist auch eine organische Base vorhanden, wenn das wachsende Oligonukleotid mit dem 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on in Kontakt gebracht wird. Stärker bevorzugt liegt die organische Base in der gleichen molaren Konzentration vor wie das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on. Das wachsende Oligonukleotid reagiert mit dem Phosphoramidit unter Bildung eines (n + 1)-Oligonukleotids mit einer 5'-terminalen Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor, dargestellt durch die Strukturformel V:
  • Figure 00100001
  • In der Strukturformel V besitzen X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R16, B und n die oben angegebene Bedeutung.
  • Das durch die Strukturformel v dargestellte Oligonukleotid kann dann mit einem Oxidationsmittel oder einem Sulfurierungsmittel in Kontakt gebracht werden, so daß ein ein Rückgrat mit fünfwertigem Phosphor aufweisendes Oligonukleotid gebildet wird, das durch die Strukturformel VI:
    Figure 00110001
    dargestellt ist, in der X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R16, B und n die oben angegebene Bedeutung besitzen.
  • Nach der Oxidation oder Sulfurierung des (n + 1)-Oligonukleotids können X5-Gruppen, die keine Reaktion mit dem Phosphoramidit eingegangen sind, mit im Fachgebiet bekannten herkömmlichen Capping-Techniken einem Capping unterzogen werden. So können beispielsweise die nicht umgesetzten X5-Gruppen mit einem Säurechlorid oder einem Anhydrid in Gegenwart einer Base umgesetzt werden. Typischerweise werden X5-Gruppen einem Capping mit Acetylchlorid oder Essigsäureanhydrid in Pyridin unterzogen.
  • Nach dem Oxidations- oder Sulfurierungsschritt bzw. nach dem Capping-Schritt kann das (n + 1)-Oligonukleotid durch Umsetzen mit einem Reagenz zur Entfernung von R1 entschützt werden. Handelt es sich bei R1 um eine säurelabile Schutzgruppe, so wird das (n + 1)-Oligonukleotid mit einer Säure behandelt, um R1 abzuspalten. Handelt es sich bei R1 um eine Trialkylsilylgruppe, wie beispielsweise eine t-Butyldimethylsilyl-Gruppe oder eine Triisopropylsilyl-Gruppe, so kann das (n + 1)-Oligonukleotid mit Fluoridionen behandelt werden, um R1 abzuspalten. Typischerweise werden t-Butyldimethylsilyl und ein Triisopropylsilyl durch Behandlung mit einer Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF oder mit Hydrogenfluorid und einer konjugierten Base, wie z.B. (C2H5)3N·3HF, abgespalten. Verfahren zur Abspaltung von t-Butyldimethylsilyl finden sich bei Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc., S. 77–83. Die obigen Reaktionsschritte bzw. der obige Reaktionszyklus können bzw. kann ein- oder mehrmals wiederholt werden, so daß ein Oligonukleotid der gewünschten Länge gebildet wird. Falls die Gewinnung eines Oligonukleotidprodukts, bei dem die 5'-Endgruppe geschützt ist, erwünscht ist, kann es sich bei dem letzten Schritt des Reaktionszyklus um den Capping-Schritt, falls ein Capping-Schritt durchgeführt wird, oder um einen Oxidations- oder Sulfurierungsschritt handeln, falls kein Capping-Schritt durchgeführt wird. Handelt es sich bei dem Oxidations- oder Sulfurierungsschritt bzw. dem Capping-Schritt um den letzten Schritt, so läßt sich das Oligonukleotid durch die Strukturformel VII:
    Figure 00120001
    darstellen, in der X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R16 und B die oben angegebene Bedeutung besitzen. m ist eine positive ganze Zahl.
  • Alternativ kann es sich bei dem letzten Schritt des Reaktionszyklus um die Abtrennung von R1 handeln, falls die Gewinnung eines Oligonukleotids erwünscht ist, das keine 5'-Schutzgruppe aufweist. Handelt es sich bei der Abspaltung von R1 um den letzten Reaktionsschritt, so läßt sich das Oligonukleotid durch die Strukturformel VIII:
    Figure 00130001
    darstellen, in der X1, X2, X3, X4, X5, R1, R2, R3, R16, B und m die oben angegebene Bedeutung besitzen.
  • Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Oligonukleotide können entschützt und gegebenenfalls von einem festen Träger abgespalten werden, wobei für die gegebenen Schutzgruppen und/oder den festen Träger im Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden.
  • 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-one fördern in Gegenwart einer organischen Base Phosphoramiditkondensationsreaktionen mit wenigstens der gleichen Effizienz wie Tetrazol, allerdings werden bei Verwendung eines 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons anstelle von Tetrazol weniger unerwünschte Nebenprodukte produziert. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Komplexe nicht explosiv und daher sicherer zu verwenden als Tetrazol, insbesondere bei der Synthese von Oligonukleotiden im Großmaßstab.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Zu aliphatischen Gruppen, wie sie hier verwendet werden, gehören geradkettige oder verzweigte C1-C18-Kohlenwasserstoffe, die vollständig gesättigt sind oder die eine oder mehrere nichtkonjugierte Doppelbindungen enthalten, oder cyclische C3-C18-Kohlenwasserstoffe, die vollständig gesättigt sind oder die eine oder mehrere nichtkonjugierte Doppelbindungen enthalten. Bei Alkylgruppen handelt es sich um geradkettige oder verzweigte C1-C8-Kohlenwasserstoffe oder cyclische C3-C8-Kohlenwasserstoffe, die vollständig gesättigt sind. Bei aliphatischen Gruppen handelt es sich vorzugsweise um Alkylgruppen.
  • Zu Arylgruppen gehören carbocyclische aromatische Ringsysteme (z.B. Phenyl) sowie carbocyclische aromatische Ringsysteme, die an einen oder mehrere carbocyclische aromatische Ringe kondensiert sind (z.B. Naphthyl und Anthracenyl) oder ein aromatisches Ringsystem, das an einen oder mehrere nichtaromatische Ringe kondensiert ist (z.B. 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl).
  • Zu heterocyclischen Gruppen, wie sie hier verwendet werden, gehören Heteroarylgruppen und Heteroalicyclylgruppen. Zu Heteroarylgruppen, wie sie hier verwendet werden, gehören aromatische Ringsysteme, die ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus Schwefel, Stickstoff oder Sauerstoff, im aromatischen Ring aufweisen. Vorzugsweise handelt es sich bei Heteroarylgruppen um 5- oder 6-gliedrige Ringsysteme mit einem bis vier Heteroatomen. Bei einer Heteroalicyclylgruppe, wie sie hier verwendet wird, handelt es sich um ein nichtaromatisches Ringsystem, das vorzugsweise fünf bis sechs Atome aufweist und wenigstens ein Heteroatom, ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, beinhaltet. Zu heterocyclischen Gruppen gehören beispielsweise Morpholinyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Thiomorpholinyl, Pyrrolidinyl, Thiazolidinyl, Tetrahydrothienyl, Azetidinyl, Tetrahydrofuryl, Dioxanyl und Dioxepanyl, Thienyl, Pyridyl, Thiadiazolyl, Oxadiazolyl, Indazolyl, Furane, Pyrrole, Imidazole, Pyrazole, Triazole, Pyrimidine, Pyrazine, Thiazole, Isoxazole, Isothiazole, Tetrazole, Oxadiazole, Benzo(b)thienyl, Benzimidazol, Indol, Tetrahydroindol, Azaindol, Indazol, Chinolin, Imidazopyridin, Purin, Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin und Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin.
  • Zu Azaheterocyclylverbindungen, wie sie hier verwendet werden, gehören Heteroarylgruppen, die ein oder mehrere Stickstoffatome im aromatischen Ringe aufweisen, sowie Heteroalicyclylgruppen, die wenigstens ein Stickstoffatom im nichtaromatischen Ringsystem aufweisen. Vorzugsweise weisen Azaheteroarylverbindungen fünf- oder sechsgliedrige aromatische Ringe mit einem bis drei Stickstoffatomen im aromatischen Ring auf. Vorzugsweise handelt es sich bei Azaheteroalicyclylverbindungen um fünf- oder sechsgliedrige Ringe, die üblicherweise ein oder zwei Stickstoffatome im Ring umfassen. Bevorzugte Azaheterocyclylverbindungen sind organische Basen. Zu Azaheterocyclylverbindungen, bei denen es sich um organische Basen handelt, gehören beispielsweise Pyrimidine, 1-Alkylpyrazole, vor allem 1-(C1-4-Alkyl)pyrazole, 1-Arylpyrazole, 1-Benzylpyrazole, Pyrazine, N-Alkylpurine, vor allem N-(C1-4-Alkyl)purine, N-Arylpurine, N-Benzylpurine, N-Alkylpyrrole, vor allem N-(C1-4-Alkyl)pyrrole, N-Arylpyrrole, N-Benzylpyrrole, Pyridine, N-Alkylimidazole, vor allem N-(C1-4-Alkyl)imidazole, N-Arylimidazole, vor allem N-Phenylimidazol, N-Benzylimidazole, Chinoline, Isochinoline, Chinoxaline, Chinazoline, N-Alkylindole, vor allem N-(C1-4-Alkyl)indole, N-Arylindole, N-Benzylindole, N-Alkylbenzimidazole vor allem N-(C1-4-Alkyl)benzimidazole, N-Arylbenzimidazole, N-Benzylbenzimidazole, Triazin, Thiazol, 1-Alkyl-7-azaindole, vor allem 1-(C1-4-Alkyl)-7-azaindole, 1-Aryl-7- azaindole, 1-Benzyl-7-azaindole, Pyrrolidine, Morpholine, Piperidine und Piperazine. Als Azaheterocyclylverbindungen ganz besonders bevorzugt sind Pyridine, wie beispielsweise Pyridin und 3-Methylpyridin, sowie N-(C1-4-Alkyl)imidazole, wie beispielsweise N-Methylimidazol.
  • Bei einer Aralkylgruppe, wie sie hier verwendet wird, handelt es sich um einen aromatischen Substituenten, der mit einer Gruppierung über eine Alkylgruppe verknüpft ist. Zu bevorzugten Aralkylgruppen gehören Benzylgruppen.
  • Bei einer Heteroaralkylgruppe, wie sie hier verwendet wird, handelt es sich um einen Heteroarylsubstituenten, der mit einer Gruppierung über eine Alkylgruppe verknüpft ist.
  • Bei einer organischen Base handelt es sich um eine organische Verbindung, die dazu neigt, bei pH 7 Protonen aufzunehmen. Zu bevorzugten organischen Basen gehören sekundäre Amine, tertiäre Amine oder Azaheterocyclylverbindungen, die jeweils gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein können. Bei einer aprotischen organischen Base handelt es sich um eine organische Base, deren chemische Struktur vor Aufnahme eines Protons keine Wasserstoffbrückenprotonen aufweist. Aprotische organische Basen, wie beispielsweise tertiäre Amine und aprotische Azaheterocyclylverbindungen, werden vorzugsweise in Verbindung mit 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-one, wie hier beschrieben, zur Förderung von Kondensationsreaktionen verwendet.
  • Bei tertiären Aminen handelt es sich um organische Basen, die ein Stickstoffatom aufweisen, das an drei Kohlenstoffatome gebunden ist, und zwar häufig an drei Aryl-, üblicherweise Phenyl- und/oder Alkylgruppen, üblicherweise an drei Alkylgruppen, einschließlich beispielsweise Trialkylaminen, wie z.B. Trimethylamin, Triethylamin und Diisopropylethylamin. Darüber hinaus kann es sich bei tertiären Aminen um Azaheterocyclylgruppen handeln, wobei das Stickstoffatom aprotisch ist. Azaheterocyclylgruppen sind als tertiäre Amine bevorzugt. Zu tertiären Azaheterocyclylaminen gehören beispielsweise N-Alkylpyrrolidine, N-Arylpyrrolidine, N-Alkylpyrrole, N-Arylpyrrole, N-Alkylmorpholine, N-Arylmorpholine, N-Alkylpiperidine, N-Arylpiperidine, N,N-Dialkylpiperazine, N,N-Diarylpiperazine, N-Alkyl-N-arylpiperazine, Chinuclidine und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene. Bei tertiären Aminen kann es sich auch um Azaheteroaryl- oder Azaheteroalicyclylverbindungen handeln.
  • Bei sekundären Aminen handelt es sich um organische Basen, die ein an ein einzelnes Wasserstoff- und an zwei Kohlenstoffatome gebundenes Stickstoffatom umfassen. Das Stickstoffatom ist dabei häufig an zwei Alkyl- oder Arylgruppen gebunden oder ist Teil einer azaheterocyclischen Gruppe. Zu sekundären Aminverbindungen gehören beispielsweise Diethylamin und Diisopropylamin.
  • Zu geeigneten Substituenten für aliphatische Gruppen, Arylgruppen, Aralkylgruppen, Heteroarylgruppen, Azaheteroarylgruppen und Heteroalicyclylgruppen gehören Arylgruppen, halogenierte Arylgruppen, Alkylgruppen, halogeniertes Alkyl (z.B. Trifluormethyl und Trichlormethyl), aliphatische Ether, aromatische Ether, Benzyl, substituiertes Benzyl, Halogene, insbesondere Chlor- und Fluorgruppen. Cyano, Nitro, -S-(aliphatische oder substituierte aliphatische Gruppe) und -S-(aromatische oder substituierte aromatische).
  • Amin-, Hydroxy- und Thiolschutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Für Beispiele für Aminschutzgruppen sei auf Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc., S. 309–405 verwiesen. Amine werden vorzugsweise als Amide oder Carbamate geschützt. Für Beispiele für Hydroxyschutzgruppen sei auf Id., S. 10–142, verwiesen. Eine bevorzugte Hydroxyschutzgruppe ist die t-Butyldimethylsilylgruppe. Für Beispiele für Thiolschutzgruppen sei auf Id., S. 277–308, verwiesen.
  • Bei einer säurelabilen Schutzgruppe handelt es sich um eine Schutzgruppe, die durch Inkontaktbringen der Gruppe mit einer Bronsted- oder einer Lewis-Säure abgespalten werden kann. Säurelabile Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Zu üblichen säurelabilen Schutzgruppen gehören beispielsweise gegebenenfalls substituierte Tritylgruppen (Id., S. 60–62), gegebenenfalls substituierte Tetrahydropyranylgruppen (Id., S. 31–34), gegebenenfalls substituierte Tetrahydrofuranylgruppen (Id., S. 36–37) oder Pixylgruppen (Id., S. 65). Tritylgruppen sind üblicherweise mit Elektronen liefernden Substituenten, wie beispielsweise Alkoxygruppen, substituiert. Eine bevorzugte säurelabile Schutzgruppe ist ein gegebenenfalls substituiertes Trityl, beispielsweise 4,4'-Dimethoxytrityl (nachfolgend "DMT").
  • Nukleosidbasen umfassen natürlich vorkommende Basen, wie z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil, sowie modifizierte Basen, wie z.B. 7-Deazaguanin, 7-Deaza-8-azaguanin, 5-Propynylcytosin, 5-Propynyluracil, 7-Deazaadenin, 7-Deaza-8-azaadenin, 7-Deaza-6-oxopurin, 6-Oxopurin, 3-Deazaadenosin, 2-Oxo-5-methylpyrimidin, 2-Oxo-4-methylthio-5-methylpyrimidin, 2-Thiocarbonyl-4-oxo-5-methylpyrimidin, 4-Oxo-5-methylpyrimidin, 2-Aminopurin, 5-Fluoruracil, 2,6-Diaminopurin, 8-Aminopurin, 4-Triazolo-5-methylthymin und 4-Triazolo-5-methyluracil.
  • Bei einer geschützten Nukleosidbase handelt es sich um eine Nukleosidbase, bei der reactive funktionelle Gruppen der Base geschützt sind. In ähnlicher Weise handelt es sich bei einem geschützten Heterocyclus um einen Heterocyclus, bei dem reaktive Substituenten des Heterocyclus geschützt sind. Typischerweise weisen Nukleosidbasen bzw. Heterocyclen Aminogruppen auf, die mit einer Aminschutzgruppe, wie beispielsweise einem Amid oder einem Carbamat, geschützt werden können. So werden beispielsweise die Amingruppen von Adenin und Cytosin typischerweise mit Benzoylschutzgruppen geschützt, und die Amingruppen des Guanins werden typischerweise mit einer Isobutyrylgruppe, einer Acetylgruppe oder t-Butylphenoxyacetylgruppe geschützt. Es besteht jedoch die Möglichkeit, andere Schutzanordnungen zu verwenden. So werden beispielsweise zur schnellen Entschützung die Amingruppen von Adenin und Guanin mit Phenoxyazetylgruppen geschützt, und die Amingruppe des Cytosins wird mit einer Isobutyrylgruppe oder einer Acetylgruppe geschützt. Die Bedingungen für die Abspaltung der Nukleobasen- oder Heterocyclusschutzgruppe hängt von der verwendeten Schutzgruppe ab. Wird eine Amidschutzgruppe verwendet, so kann diese durch Versetzen des Oligonukleotids mit einer Basenlösung, wie beispielsweise einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung, n-Methylaminlösung oder einer Lösung von t-Butylamin in Ammoniumhydroxid, abgespalten werden.
  • Unter dem Begriff "Oligonukleotid", wie er hier verwendet wird, fallen natürlich vorkommende Oligonukleotide, beispielsweise 2'-Desoxyribonukleinsäuren (nachfolgend "DNA") und Ribonukleinsäuren (nachfolgend "RNA"), sowie modifizierte Zuckergruppierungen, modifizierte Phosphatgruppierungen oder modifizierte Nukleobasen enthaltende Nukleinsäuren. Die Modifikation der Zuckergruppierung beinhaltet den Austausch des Riboserings gegen einen Hexose-, Cyclopentyl- oder Cyclohexylring. Als Alternative kann der D-Ribosering einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure gegen einen L-Ribosering oder das b-Anomer einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure gegen das a-Anomer ausgetauscht werden. Das Oligonukleotid kann auch eine oder mehrere abasische Gruppierungen umfassen. Zu modifizierten Phosphatgruppierungen gehören Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Methylphosphonate, Methylphosphate und Phosphoramidate. Derartige Nukleinsäureanaloge sind dem Fachmann bekannt. Es können Gemische aus zwei oder mehreren der oben genannten Verbindungen umfassende Oligonukleotide hergestellt werden, beispielsweise Oligonukleotide, die Gemische aus Desoxyribo- und Ribonukleosiden, insbesondere Gemische aus Desoxyribonukleosiden und 2'-O-substituierten Ribonukleosiden, wie z.B. 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Methoxyethylribonukleoside, umfassen. Zu Nukleosidgemische umfassenden Oligonukleotiden gehören beispielsweise Ribozyme.
  • Bei einem chimärischen Oligonukleotid handelt es sich um ein Oligonukleotid, das sowohl Phosphordiester- als auch Phosphorothioatverknüpfungen aufweist.
  • Ein synthetisches Oligonukleotid weist vorzugsweise 2 bis etwa 100 Nukleobasen auf. Stärker bevorzugt weist ein synthetisches Oligonukleotid 2 bis etwa 75 Nukleobasen auf. Viele synthetische Oligonukleotide, die zur Zeit von therapeutischem Interesse sind, umfassen 8 bis 40 Nukleobasen.
  • Die Synthese des Oligonukleotids kann in Lösung oder an einem festen Träger erfolgen. Wird die Synthese in Lösung durchgeführt, so steht R16 für eine Alkohol-, Amin- oder Thiolschutzgruppe. Nach Synthese des Oligonukleotids kann die Alkohol-, Amin- oder Thiolschutzgruppe abgespalten werden. Wird das Oligonukleotid an einem festen Träger synthetisiert, so bedeutet R16 einen festen Träger oder vorzugsweise einen an einen festen Träger gebundenen spaltbaren Linker, wie z.B. eine Gruppe der Formel -Y2-L-Y2-R15. Im allgemeinen wird die Lösungsphasensynthese oder die Festphasensynthese von Oligonukleotiden unter Verwendung einer 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on-Verbindung anstelle von Tetrazol zur Förderung der Kondensation eines wachsenden Oligonukleotids und eines Phosphoramiditmonomers auf ähnliche Weise durchgeführt wie Verfahren, die für die Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung von Tetrazol als Aktivator entwickelt wurden. Beispiele für typische Bedingungen für die Lösungsphasensynthese und Festphasensynthese Oligonukleotiden unter Verwendung einer 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on-Verbidnung zur Förderung der Kondensationsreaktion sind unten angegeben.
  • Der erste Schritt der Herstellung des Oligonukleotids umfaßt das Kuppeln eines Nukleosidphosphoramidits, wie z.B. des durch die Strukturformel IIa dargestellten Phosphoramidits, mit einem Nukleosid oder wachsenden Oligonukleotid, das eine freie Hydroxy- oder Thiolgruppe aufweist, wie z.B. ein 5'-entschütztes Nukleosid oder wachsendes Oligonukleotid, dargestellt durch die Strukturformel IV. Während der Kupplungsreaktion reagiert die Hydroxy- oder Thiolgruppe des Nukleosids oder wachsenden Oligonukleotids mit dem Nukleosidphosphoramidit, indem sie die -NR4R5-Gruppe verdrängt. Wird die Synthese in Lösung durchgeführt, so liegt das Nukleosid oder wachsende Oligonukleotid häufig in einer Konzentration von etwa 0,001 M bis etwa 1,0 M vor, wobei das Nukleosid oder wachsende Oligonukleotid vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,025 M bis etwa 0,5 M vorliegt. Das Nukleosidphosphoramidit liegt vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1,1 Äquivalenten bis etwa 2 Äquivalenten im Hinblick auf das Nukleosid oder wachsende Oligonukleotid vor. Zur Förderung der Kondensationsreaktion werden im Hinblick auf das Nukleosid oder wachsende Oligonukleotid etwa 0,5 Äquivalente, häufig etwa 2,5 Äquivalente, bis etwa 5,0 Äquivalente eines 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons zugegeben. Vorzugsweise wird dabei das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on in Form eines Salzkomplexes mit einer organischen Base, wie z.B. eines Pyridiniumsalzes, eines 3-Picoliniumsalzes oder eines N-Methylimidazoliumsalzes, zugegeben. Die Reaktionszeit beträgt üblicherweise etwa 20 min. bis etwa 60 min., wobei ein wachsendes (n + 1)-Oligonukleotid mit einer endständigen Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor gebildet wird, wie beispielsweise das durch die Strukturformel V dargestellte wachsende Oligonukleotid.
  • Ein zweiter Schritt zur Herstellung eines Oligonukleotids beinhaltet die Oxidation oder Sulfurierung der endständigen dreiwertigen Phosphorgruppe des wachsenden Oligonukleotids. In einer Lösungsphasensynthese erfolgt die Oxidationsreaktion häufig dadurch, daß man das Oligonukleotid mit einem Oxidierungsmittel, wie z.B. I2, in Gegenwart von Wasser oder einem Peroxid, wie z.B. t-Butylwasserstoffperoxid, in einem organischen Lösungsmittel versetzt. Werden I2 und Wasser verwendet, so enthält die Oxidationslösung typischerweise etwa 1,1 bis etwa 1,8 Äquivalente I2 in Gegenwart einer Base sowie eine Spur Wasser. Die Reaktion wird in einem aprotischen polaren Lösungsmittel, wie z.B. THF, in Kombination mit einer Base, wie z.B. einem tertiären Alkylamin, sowie etwa 1% Wasser durchgeführt. Das Verhältnis von aprotischem Lösungsmittel zu Base beträgt etwa 4:1 (v/v) bis etwa 1:4 (v/v). Nach etwa 5 min. bis etwa 20 min. gießt man das Reaktionsgemisch in eine wäßrige Lösung von Natriumbisulfit, um das überschüssige Iod zu quenchen, und extrahiert es anschließend in ein organisches Lösungsmittel.
  • Als Alternative läßt sich die endständige dreiwertige Phosphorgruppe mit einem beliebigen, dem Fachmann auf dem Gebiet der Oligonukleotidsynthese bekannten schwefelübertragenden Reagenz sulfurieren. Zu schwefelübertragenden Reagenzien zählen beispielsweise 3H-Bezodithiol-3-on-1,1-dioxid (auch "Beaucage-Reagenz" genannt), Dibenzoyltetrasulfid, Phenylacetyldisulfid, N,N,N',N'-Tetraethylthiuramdisulfid, elementarer Schwefel sowie 3-Amino-[1,2,4]dithiazol-5-thion (siehe US-Patent Nr. 6,096,881). Reaktionsbedingungen zur Sulfurierung eines Oligonukleotids mit den obigen Reagenzien finden sich bei Beaucage, et al., Tetrahedron (1993), 49: 6123. Ein bevorzugtes schwefelübertragendes Reagenz ist 3-Amino-[1,2,4]dithiazol-5-thion. Im allgemeinen wird ein Oligonukleotid mit einer Lösung von 3-Amino-[1,2,4]dithiazol-5-thion in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. einem Pyridin/Acetonitril-Gemisch (1:9) oder Pyridin, mit einer Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,2 M in Kontakt gebracht. Die Sulfurierungsreaktion ist üblicherweise nach etwa 30 s bis etwa 2 min. vollständig.
  • Nach der Oxidation unter Sulfurierung des Oligonukleotids können nichtumgesetzte freie Hydroxy- oder Thiolgruppen einem Capping unterzogen werden, so daß sie in nachfolgenden Kupplungsschritten nicht umgesetzt werden können. Durch das Capping von Ausfallsequenzen können diese leichter von dem Vollängen-Oligonukleotidprodukt getrennt werden. Als Capping-Reagenz können alle Reagenzien, die mit einer Hydroxy- oder Thiolgruppe reagieren und diese an einer Umsetzung mit einem Phosphoramidit hindern, verwendet werden. Typischerweise wird als Capping-Reagenz ein Anhydrid, wie z.B. Essigsäureanhydrid oder Isobuttersäureanhydrid, oder ein Säurechlorid, wie z.B. Acetylchlorid oder Isobutyrylchlorid, in Gegenwart einer Base verwendet.
  • Nach vollständigem Ablaufen der Capping-Reaktion wird die R1-Schutzgruppe abgespalten. Handelt es sich bei R1 um eine säurelabile Schutzgruppe, so wird R1 durch Versetzen des Oligonukleotids mit einer Säure abgespalten. Vorzugsweise steht R1 für eine Tritylgruppe, wie z.B. 4,4'-Dimethoxytrityl. Handelt es sich bei R1 um eine Tritylgruppe, so kann diese durch Versetzen des Oligonukleotids mit einer Lösung von Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Dichlormethan oder Toluol, abgespalten werden.
  • Nach dem Abspalten der R1-Schutzgruppe kann der Reaktionszyklus (z.B. Kupplungsschritt, Oxidations- oder Sulurierungsschritt, Capping-Schritt (optional) und Entschützungsschritt) gegebenenfalls ein- oder mehrmals wiederholt werden, um ein Oligonukleotid der gewünschten Länge zu erhalten.
  • Ein chimärisches Oligonukleotid läßt sich herstellen, indem man die endständige dreiwertige Phosphorgruppe in einem oder mehreren Reaktionszyklen oxidiert und in einem oder mehreren davon verschiedenen Reaktionszyklen sulfuriert. Als Alternative kann ein chimärisches Oligonukleotid durch Auswählen von Phosphoramiditmonomeren, bei denen es sich bei einigen der R3-Gruppen um geschützte Hydroxylgruppen, wie z.B. -OCH2CH2CN, und bei einigen der R3-Gruppen um geschützte Thiolgruppen, wie z.B. -SCH2CH2CN, handelt, hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird das Oligonukleotid in jedem Reaktionszyklus jeweils nach dem Kupplungsschritt oxidiert.
  • Möchte man ein Oligonukleotidprodukt erhalten, bei dem die R1-Gruppe noch vorhanden ist, so kann es sich bei dem letzten Schritt des Reaktionszyklus um den Capping-Schritt handeln, falls ein Capping-Schritt durchgeführt wird, oder es kann sich dabei um einen Oxidations- oder Sulfurierungsschritt handeln, falls kein Capping-Schritt durchgeführt wird. Falls ein R1-entschütztes Oligonukleotid gewünscht wird, kann der Reaktionszyklus mit dem Entschützungsschritt enden. Üblicherweise handelt es sich bei dem gewünschten Produkt um ein R1-geschütztes Oligonukleotid, wenn das Oligonukleotid über Umkehrphasen-HPLC (high performance liquid chromatography) gereinigt werden soll. Soll das Oligonukleotid über eine Ionenaustauschchromatographie oder eine Elektrophorese gereinigt werden, so ist das gewünschte Produkt üblicherweise ein R1-geschütztes Oligonukleotid.
  • Bei der Festphasensynthese eines Oligonukleotids unter Verwendung eines 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons und vorzugsweise einer organischen Base zur Förderung der Kondensation eines Nukleosidphosphoramidits mit einem trägergebundenen Nukleosid oder wachsenden Oligonukleotid mit einer freien Hydroxygruppe einer Thiolgruppe werden im allgemeinen der gleiche Reaktionszyklus und die gleichen Reagenzien wie bei der Lösungsphasensynthese verwendet. Dabei wird üblicherweise der feste Träger zunächst mit dem Nukleosid bis zum für das jeweilige verwendete Harz geeigneten Maximum beladen. Beispielsweise können etwa 50 μmol bis etwa 700 μmol pro Gramm Träger aufgetragen werden. Im Kondensationsschritt wird eine Lösung von Nukleosidphosphoramidit mit einer Konzentration von typischerweise etwa 0,01 m bis etwa 1 m, vorzugsweise etwa 0,1 M, in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Acetonitril, mit dem trägergebundenen Nukleosid unter Ausbildung eines wachsenden Oligonukleotids mit einer endständigen Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor umgesetzt. Wird ein entweder durch die Strukturformel IIa oder IIb dargestelltes Nukleosidphosphoramidit verwendet, so besitzt das wachsende Oligonukleotid nach Beendigung der Kupplungsreaktion eine 5'-terminale Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor. Wird ein entweder durch die Strukturformeln IIIa oder IIIb dargestellten Nukleosidphosphoramidit verwendet, so besitzt das wachsende Oligonukleotid nach Beendigung der Kupplungsreaktion eine 3'-terminale Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor. Vorzugsweise lassen sich die verwendeten Nukleosidphosphoramidite mit der Strukturformel IIa darstellen. Eine Lösung des 1,1- Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons mit einer Konzentration von etwa 0,015 M bis etwa 1,5 M, häufig von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M, vorzugsweise von 0,1 bis 0,25 M, wird üblicherweise mit der das Phosphoramiditmonomer enthaltenden Lösung unmittelbar vor oder während der Kondensationsreaktion gemischt. Vorzugsweise liegt in der Lösung auch eine organische Base mit einer Konzentration von etwa 0,015 M bis etwa 1,5 M, häufig von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M, vorzugsweise von 0,1 bis 0,25 M, vor. Dabei liegt die organische Base vorzugsweise in der gleichen molaren Konzentration wie das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on vor. Das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on kann in einem Molverhältnis zum Nukleosidphosphoramidit, das katalytisch ist, welches substöchiometrisch ist, oder in einem Molverhältnis, das stöchiometrisch oder mehr als stöchiometrisch ist, eingesetzt werden. In vielen Ausführungsformen liegt das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu Nukleosidphosphoramidit im Bereich von etwa 0,2:1 bis 5:1, häufig von 0,25:1 bis 4:1, vorzugsweise von etwa 0,3:1 bis 2:1, beispielsweise etwa 1:1. Anschließend wird das trägergebundene 5'-entschützte Nukleosid mit dem Gemisch etwa 2 min. bis etwa 10 min., vorzugsweise etwa 5 min., in Kontakt gebracht.
  • Falls die endständige Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor nach Beendigung der Kupplungsreaktion oxidiert werden soll, wird der das wachsende Oligonukleotid enthaltende feste Träger mit einem Oxidierungsmittel, wie beispielsweise einem Gemisch aus I2 und Wasser oder einem Peroxid, wie z.B. t-Butylhydroperoxid, in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Acetonitril oder Toluol, in Kontakt gebracht. Als Oxidierungsmittel bevorzugt ist ein Gemisch aus I2 und H2O. Wird ein Gemisch aus I2 und Wasser verwendet, so können auch andere mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel vorhanden sein. Typischerweise kann das Internukleotid verknüpfungen über dreiwertigen Phosphor enthaltene, an einen festen Träger gebundene Oligonukleotid mit einer Lösung von I2 in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, einem aprotischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und einer Base in Kontakt gebracht werden. Eine typische Oxidationslösung besteht beispielsweise aus etwa 0,05 M bis etwa 1,5 M I2 in einer 2:80:20-Lösung aus Wasser/Tetrahydrofuran/Lutidin (v/v/v). Der feste Träger wird typischerweise etwa 30 Sekunden bis etwa 1,5 min. mit der I2-Lösung behandelt.
  • Als Alternative kann das an einen festen Träger gebundene wachsende Oligonukleotid mit einer Lösung eines schwefelübertragenden Reagenz in einem organischen Lösungsmittel zur Sulfurierung der dreiwertigen Phosphorgruppen in Kontakt gebracht werden. So kann beispielsweise das trägergebundene Oligonukleotid etwa 30 s bis etwa 2 min. mit einer Lösung von 3-Amino-[1,2,4]-dithiazol-5-thion (etwa 0,05 M–0,2 M) in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Acetonitril oder Pyridin, in Kontakt gebracht werden.
  • In der Festphasen-Oligonukleotidsynthese kann das an einen festen Träger gebundene wachsende Oligonukleotid gegebenenfalls mit einer Lösung des Capping-Reagenz etwa 30 s bis etwa 1 min. in Kontakt gebracht werden. Nach dem Capping-Schritt erfolgt der Entschützungsschritt, indem man das trägergebundene Oligonukleotid mit einer Säurelösung etwa 1 min. bis etwa 3 min. in Kontakt bringt. Der Reaktionszyklus läßt sich dann gegebenenfalls ein- oder mehrmals wiederholen, bis ein Oligonukleotid der gewünschten Menge synthetisiert ist. Wie bei der Lösungsphasensynthese erhält man ein R1-geschütztes Oligonukleotid, wenn der Reaktionszyklus entweder mit dem Cypping-Schritt oder dem Oxidations- oder Sulfurierungsschritt endet. Ein R1-entschütztes Oligonukleotid erhält man, wenn der Reaktionszyklus mit dem Entschützungsschritt endet.
  • Nach der vollständigen Festphasensynthese läßt sich das Oligonukleotid vom festen Träger mit Standardverfahren abspalten. Dabei wird der feste Träger im allgemeinen mit einer Lösung von konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 25°C–60°C etwa 0,5 Stunden bis etwa 16 Stunden oder länger, je nach der Oligonukleotidsequenz und je nachdem, ob die Abspaltung der Nukleobasenschutzgruppen während dieses Schritts erwünscht ist, behandelt. Die Oligonukleotide werden vorteilhafterweise mit im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z.B. einem oder mehreren Verfahren aus der Gruppe Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Fällung aus einem geeigneten Lösungsmittel, gereinigt. Ebenso kann eine weitere Bearbeitung des Produkts, beispielsweise durch Ultrafiltration, erfolgen.
  • Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids, wobei man in dem Verfahren ein Nukleosidphosphoramidit, vorzugsweise ein Nukleosid-3'-Phosphoramidit, mit einem Nukleosid oder wachsenden Oligonukleotid, das eine freie Hydroxygruppe, vorzugsweise eine freie 5'-Hydroxygruppe umfaßt, in Gegenwart eines Aktivators kuppelt, wobei der Aktivator ein Gemisch aus einem 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und einem N-Alkylimidazol, vorzugsweise N-Methylimidazol, umfaßt.
  • In dieser besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Phosphoramidit üblicherweise eine Gruppierung der Formel -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2. In dieser Ausführungsform beträgt die Konzentration des 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons und des N-Alkylimidazols üblicherweise jeweils 0,1 bis 0,25 M, wobei das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu N-Alkylimidazol vorzugsweise etwa 1:1 bis etwa 1:1,5:1, am stärksten bevorzugt 1:1, beträgt. In dieser besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu Phosphoramidit vorzugsweise 0,5:1 bis 2:1.
  • Die vorliegende Erfindung wird, ohne darauf beschränkt zu sein, durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiel 1: Herstellung eines Salzkomplexes aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und Pyridin
  • 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on wurde in Acetonitril suspendiert und 1,1 Äquivalente Pyridin, bezogen auf das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on wurden zu der Suspension getropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Lösung klar, wobei sich ein Salzkomplex aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und Pyridin als feinkristallines Material aus der Lösung abschied. Die Kristalle wurden entweder mit Ether oder Hexan gewaschen, um Spuren von Pyridin und Acetonitril zu entfernen. Chemische Verschiebungen in der 1H-NMR (DMSO) in ppm: 8,8 (2H, s), 8,2 (1H, q), 8,0 (1H, q) und 7,6–7,9 (6H, m).
  • Beispiel 2: Herstellung eines Salzkomplexes aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und 3-Picolin
  • Ein Salzkomplex aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und 3-Picolin wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Chemische Verschiebungen in der 1H-NMR (DMSO) in ppm: 8,8 (1H, s), 8,72 (1H, d), 8,27 (1H, d), 8,0 (2H, d), 7,77–7,93 (6H, m). und 2,45 (3H, s).
  • Beispiel 3: Herstellung eines Salzkomplexes aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und N-Methylimidazol
  • 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on wurde in Acetonitril suspendiert und 1,1 Äquivalente N-Methylimidazol, bezogen auf das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on, zu der Suspension getropft. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt, so daß das kristalline Salz gebildet wurde, welches entweder mit Ether oder Hexan gewaschen wurde, um Spuren von N-Methylimidazol und Acetonitril zu entfernen. Chemische Verschiebungen in der 1H-NMR (DMSO) in ppm: 13,9 (1H, s), 9,03 (1H, s), 7,59–7,75 (6H, m) und 3,88 (3H, s).
  • Beispiel 4: Synthese von Desoxyribooligonukleotiden unter Verwendung eines Salzkomplexes aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und einer organischen Base
  • Die Synthese des Oligonukleotids wurde an einem DNA-Syntheseapparat vom Typ Oligo Pilot II (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt. Dabei wurde bei der Synthese der Standardvorschrift für Phosphoramiditchemie mit leichten Modifikationen gefolgt. Die Konzentration der Phosphoramiditmonomere betrug 0,1 M in Acetonitril. Anstelle von Tetrazol wurde der Salzkomplex aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und Pyridin, 3-Picolin oder N-Methylimidazol als Aktivator während des Kondensationsschritts verwendet. Die Konzentration des Salzkomplexes betrug 0,25 M in Acetonitril. Die für die Kettenverlängerung unter Verwendung des 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on-Salzkomplexes gebrauchte Kupplungszeit war ähnlich wie die bei Tetrazol als Aktivator gebrauchten Kupplungszeiten. Nach dem Kondensationsschritt wurde die Phosphittriesterverknüpfung entweder mit Iodlösung in einen stabilen Phosphattriester oder mit Beaucage-Reagenz oder 3-Amino-1,2,4-dithiazol-5-thion in einen stabilen Phosphorothioattriester umgewandelt. Am Ende der Synthese wurden mit vollständig geschütztem Oligonukleotid verknüpfte feste Träger 16–20 Std. bei 50°C mit 10% t-Butylamin in konzentriertem Ammoniumhydroxid behandelt, um das Oligonukleotid freizusetzen und die β-Cyanoethylschutzgruppen sowie die Nukleobasenschutzgruppen abzuspalten. Die rohen Oligonukleotide wurden mit Ionenaustausch-HPLC, Kapillarelektrophorese und MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert und mit unter Verwendung von Tetrazol als Aktivator hergestellten Oligonukleotiden verglichen. In Tabelle 1 sind die zur Synthese der Phosphorothioat-Oligonukleotidsequenz 5'TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT3' (SEQ ID NO 1) verwendeten Bedingungen und in Tabelle 2 die aus den verschiedenen Synthesen erhaltenen Ergebnisse beschrieben. Bei dem in den Tabellen 1 und 2 dargestellten Salzkomplex handelt es sich um 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und N-Methylimidazol.
  • Tabelle 1: Syntheseparameter für die Synthese von SEQ ID NO 1.
    Figure 00310001
  • Tabelle 2: Analyse und Ergebnisse von SEQ ID NO 1.
    Figure 00320001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00320002

Claims (37)

  1. Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids mittels Phosphoramiditchemie, wobei man ein Nukleosid oder 5 ein wachsendes Oligonukleotid mit einer freien Hydroxy- oder Thiolgruppe sowie ein Nukleosidphosphoramidit in Gegenwart eines Kupplungsmittels kuppelt, wobei es sich bei dem Kupplungsmittel um ein 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00330001
    handelt, in der: p gleich 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X7 für O oder S und R jeweils für einen Substituenten steht.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R jeweils unabhängig für Halogen, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -NR11R12, -OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, Cyano, ein gegebenenfalls substituiertes Aryl, ein gegebenenfalls substituiertes Heterocyclyl, -CHO, -COR13, -NHCOR13, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl oder -SR13 steht; oder zwei benachbarte Gruppen R zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten Ring bilden; wobei: R11 und R12 jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe stehen oder zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden; und R13 für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe steht.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine organische Base zusammen mit dem Kupplungsmittel während der Kupplungsreaktion vorhanden ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei der organischen Base um ein Amin handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Amin um ein tertiäres Amin handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das tertiäre Amin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Trialkylamin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylpyrrolidin, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylpyrrolidin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylpyrrol, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylpyrrol, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylmorpholin, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylmorpholin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylpiperidin, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylpiperidin, einem gegebenenfalls substituierten N,N-Dialkylpiperazin, einem gegebenenfalls substituierten N,N-Diarylpiperazin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkyl-N-arylpiperazin, einem gegebenenfalls substituierten Chinuclidin sowie einem gegebenenfalls substituierten 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Amin um eine gegebenenfalls substituierte Azaheterocyclylverbindung handelt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Azaheterocyclylverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem gegebenenfalls substituierten Pyrimidin, einem gegebenenfalls substituierten 1-Alkylpyrazol, einem gegebenenfalls substituierten 1-Arylpyrazol, einem gegebenenfalls substituierten Pyrazin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylpurin, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylpurin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylpyrrol, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylpyrrol, einem gegebenenfalls substituierten Pyridin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylimidazol, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylimidazol, einem gegebenenfalls substituierten Chinolin, einem gegebenenfalls substituierten Isochinolin, einem gegebenenfalls substituierten Chinoxalin, einem gegebenenfalls substituierten Chinazolin, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylindol, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylindol, einem gegebenenfalls substituierten N-Alkylbenzimidazol, einem gegebenenfalls substituierten N-Arylbenzimidazol, einem gegebenenfalls substituierten Triazin, einem gegebenenfalls substituierten Thiazol, einem gegebenenfalls substituierten 1-Alkyl-7-azaindol, einem gegebenenfalls substituierten 1-Aryl-7-azaindol, einem gegebenenfalls substituierten Pyrrolidin, einem gegebenenfalls substituierten Morpholin, einem gegebenenfalls substituierten Piperidin sowie einem gegebenenfalls substituierten Piperazin.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Azaheterocyclylverbindung um Pyridin, 3-Methylpyridin oder N-Methylimidazol handelt.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nukleosidphosphoramidit ein Monomer ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Nukleosidphosphoramidit ein Dimer ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Phosphoramidit um ein 3'-Phosphoramidit, dargestellt durch eine der folgenden Strukturformeln:
    Figure 00360001
    handelt, in der: X1 jeweils unabhängig für -O- oder -S-, X2 jeweils unabhängig für -O-, -S- oder -NR14, X3 jeweils unabhängig für -O-, -S-, -CH2- oder -(CH2)2-, R1 für eine Alkoholschutzgruppe oder eine Thioschutzgruppe, R2 für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -F, -OR6, -NR7R8 oder -SR9, R3 für -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3 oder -S-CH2CH2-C6H4-NO2 steht; R4 und R5 jeweils unabhängig für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl stehen oder R4 und R5 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden und R6 für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl, eine Hydroxyschutzgruppe oder -(CH2)q-NR18R19 steht; R7 und R8 jeweils unabhängig für H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine Aminschutzgruppe stehen oder R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden und R9 für H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine Thioschutzgruppe steht; R10 jeweils unabhängig für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, R14 für -H, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe steht; R18 und R19 jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Heteroarylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Heteroaralkylgruppe oder eine Aminschutzgruppe stehen oder R18 und R19 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden; und q eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 ist und B jeweils unabhängig für -H, eine natürliche oder nicht natürliche Nukleobase, eine geschützte natürliche oder nicht natürliche Nukleobase, einen Heterocyclus oder einen geschützten Heterocyclus steht.
  13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X7 für O steht und p gleich 0 ist.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu Nukleosidphosphoramidit im Bereich von etwa 0,2:1 bis 5:1 liegt.
  15. Verfahren zur Kondensation eines N-meren Oligonukleotids oder eines Nukleosids, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00380001
    in der: X1 jeweils unabhängig für -O- oder -S-, X2 jeweils unabhängig für -O-, -S- oder -NR14, X3 jeweils unabhängig für -O-, -S-, -CH2- oder -(CH2)2-, X4 jeweils unabhängig für O oder S, X5 für -OH oder -SH, R2 jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -F, -OR6, -NR7R8 oder -SR9, R3 jeweils unabhängig für -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2- CH2CH3 oder -S-CH2CH2-C6H4-NO2, R6 jeweils unabhängig für H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl, eine Hydroxyschutzgruppe oder -(CH2)q-NR18R19 steht; R7 und R8 jeweils unabhängig für H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine Aminschutzgruppe stehen oder R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden und R9 für H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe oder eine Thioschutzgruppe steht; R10 jeweils unabhängig für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, R14 jeweils unabhängig für -H, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe steht; R18 Für eine Hydroxyschutzgruppe, eine Thioschutzgruppe, eine Aminoschutzgruppe, -(CH2)9-NR18R19, einen fester Träger oder einen an einen festen Träger gebundenen spaltbaren Linker steht; R18 und R19 jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Heteroarylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Heteroaralkylgruppe oder eine Aminschutzgruppe stehen oder R18 und R19 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden; und q eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 ist und B jeweils unabhängig für -H, eine natürliche oder nicht natürliche Nukleobase, eine geschützte natürliche oder nicht natürliche Nukleobase, einen Heterocyclus oder einen geschützten Heterocyclus steht, und n gleich null oder eine positive ganze Zahl ist, an ein Nukleosidphosphoramidit, dargestellt durch die folgende Formel:
    Figure 00400001
    in der R2, R3, X1, X2, X3 und B die oben angegebene Bedeutung haben; R1 für eine Alkoholschutzgruppe oder eine Thioschutzgruppe steht; und R4 und R5 jeweils unabhängig für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl stehen oder R4 und R5 zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden, wobei man in einem Verfahrensschritt das Oligonukleotid oder Nukleosid mit dem Nukleosidphosphoramidit sowie einem 1,1-Dioxo-1,2- dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00410001
    in der: p gleich 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X7 für O oder S und R jeweils für einen Substituenten steht, in Kontakt bringt, wodurch ein eine 5'-terminale Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor aufweisendes (n + 1)-Oligonukleotid, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00410002
    gebildet wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei R jeweils unabhängig für Halogen, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, -NR11R12, -OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, Cyano, ein gegebenenfalls substituiertes Aryl, ein gegebenenfalls substituiertes Heterocyclyl, -CHO, -COR13, -NHCOR13, ein gegebenenfalls substituiertes Aralkyl oder -SR13 steht; oder zwei benachbarte Gruppen R zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen sechsgliedrigen gesättigten oder ungesättigten Ring bilden; wobei: R11 und R12 jeweils unabhängig für -H, eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe stehen oder zusammen mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, eine Heterocyclylgruppe bilden; und R13 für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Gruppe, eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe steht.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Oligonukleotid oder Nukleosid mit dem Phosphoramidit und dem 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on in Gegenwart einer organischen Base in Kontakt gebracht wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Konzentration der organischen Base und des 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on etwa 0,01 M bis etwa 2 M beträgt.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu Nukleosidphosphoramidit im Bereich von etwa 0,2:1 bis 5:1 liegt.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das ferner die folgenden Schritte umfaßt: a) Inkontaktbringen des eine 5'-terminale Verknüpfung über dreiwertigen Phosphor aufweisenden (n + 1)-Oligonukleotids mit einem Oxidations- oder Sulfurierungsmittel, wodurch ein ein Rückgrat mit fünfwertigem Phosphor aufweisendes Oligonukleotid, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00430001
    gebildet wird; b) gegebenenfalls Capping von X5-Gruppen, die keine Reaktion mit dem Phosphoramidit eingegangen sind, durch Umsetzen der X5-Gruppen mit einem Säurechlorid oder einem Anhydrid; c) Entschützen des ein Rückgrat mit fünfwertigem Phosphor aufweisenden (n + 1)-Oligonukleotids, indem dieses mit einem Reagens zur Abspaltung von R1 umgesetzt wird; d) gegebenenfalls ein- oder mehrmaliges Wiederholen des Kupplungsschritts, des Oxidations- oder Sulfurierungsschritts, des Capping-Schritts und des Entschützungsschritts.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Oxidations- oder Sulfurierungsschritt um den letzten Schritt handelt und das Oligonukleotid durch die folgende Strukturformel dargestellt wird:
    Figure 00440001
    in der: m eine ganze Zahl größer n ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Entschützungsschritt um den letzten Schritt handelt und das Oligonukleotid durch die folgende Strukturformel dargestellt wird:
    Figure 00440002
    in der: m eine ganze Zahl größer n ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei es sich bei R18 um einen an einen festen Träger gebundenen spaltbaren Linker handelt.
  24. Verfahren nach Anspruch 20, wobei man: a) das Oligonukleotid nach jedem Kupplungsschritt oxidiert und es sich bei dem Oligonukleotid um ein Phosphodiester-Oligonukleotid handelt; b) das Oligonukleotid nach jedem Kupplungsschritt sulfuriert und es sich bei dem hergestellten Oligonukleotid um ein Phosphorothioat-Oligonukleotid handelt; oder c) das Oligonukleotid nach mindestens einem Kupplungsschritt oxidiert und nach mindestens einem Kupplungsschritt sulfuriert und es sich bei dem hergestellten Oligonukleotid um ein chimäres Oligonukleotid handelt.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei X7 für O steht und p gleich 0 ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei das Oligonukleotid anschließend gereinigt wird.
  27. Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids, wobei man ein Nukleosidphosphoramidit mit einem eine freie Hydroxygruppe umfassenden Nukleosid oder wachsenden Oligonukleotid in Gegenwart eines Aktivators kuppelt, wobei der Aktivator ein Gemisch aus 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on und einem N-Alkylimidazol umfaßt.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Nukleosidphosphoramidit um ein Nukleosid-3'-phosphoramidit handelt und das Nukleosid oder wachsende Oligonukleotid eine freie 5'-Hydroxygruppe umfaßt.
  29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei es sich bei dem N-Alkylimidazol um N-Methylimidazol handelt.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei das Phosphoramidit eine Gruppierung der Formel -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2 umfaßt.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei die Konzentration des 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons und des N-Alkylimidazols jeweils 0,1 M bis 0,25 M beträgt.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu N-Alkylimidazol etwa 1:1 bis etwa 1:1,5:1 beträgt.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei das Molverhältnis von 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on zu Phosphoramidit 0,5:1 bis 2:1 beträgt.
  34. Salzkomplex, umfassend ein N-Alkylimidazol und ein 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00460001
    in der: p gleich 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X7 für O oder S und R jeweils für einen Substituenten steht.
  35. Salzkomplex nach Anspruch 34, wobei p gleich 0 ist, X7 für O steht und es sich bei dem N-Alkylimidazol um N-Methylimidazol handelt.
  36. Verwendung eines 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-ons, dargestellt durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00470001
    in der: p gleich 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X7 für O oder S und R jeweils für einen Substituenten steht, zur Synthese eines Oligonukleotids mittels Phosphoramiditchemie.
  37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei das 1,1-Dioxo-1,2-dihydro-1λ6-benzo[d]isothiazol-3-on als ein ein N-Alkylimidazol umfassender Salzkomplex mit X7 gleich O und p gleich 0 eingesetzt wird.
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